CN1952659B

CN1952659B - 一种亲和素/链亲和素磁性复合微粒及其制备方法与用途

Info

Publication number: CN1952659B
Application number: CN2005100962125A
Authority: CN
Inventors: 崔亚丽; 陈超; 张志锋; 崔婷; 唐一通; 张彩峰
Original assignee: SHAANXI BEIMEI GENE CO Ltd
Current assignee: Shaanxi Lifegen Co Ltd; Xi'an Goldmag Nanobiotech Co Ltd
Priority date: 2005-10-19
Filing date: 2005-10-19
Publication date: 2011-09-14
Anticipated expiration: 2025-10-19
Also published as: CN1952659A

Abstract

一种亲和素/链亲和素磁性复合微粒及其制备方法与用途。其产品由内层的组装型金磁复合微粒和包覆于外层的亲和素/链亲和素生物分子构成。制备时用平衡盐溶液对组装型金磁复合微粒进行平衡；加入高生物素结合活性的亲和素/链亲和素生物分子，恒温下振荡混匀，反应；磁性分离，清洗即可。本发明解决了背景技术中通用性较差，标记量少，易使生物分子变性失活的技术问题。本发明可直接用于标记生物素化生物分子及生物素化非生物材料，标记后用于生物分子及非生物分子的富集、分离、纯化及检测等。本发明产品具有高生物素结合活性，可提高生物分析检测的灵敏度和特异性。制备方法简捷，可节省大量昂贵的生物试剂。检测过程更为简便。

Description

一种亲和素/链亲和素磁性复合微粒及其制备方法与用途

技术领域

本发明涉及一种亲和素/链亲和素磁性复合微粒及其制备方法与用途。具体涉及一种用于标记生物素化核酸、抗原、抗体、酶、多肽、多糖等任何生物素化分子，标记后用于多种生物及非生物分子的富集、分离及检测的亲和素/链亲和素磁性复合微粒的制备与应用；或用于蛋白、核酸、细胞等的磁性标记物，作为快速富集手段，用于多种生物及非生物分子的分离、纯化及检测的亲和素/链亲和素磁性复合微粒的制备与应用。

背景技术

2003年8月14日的中国专利“一种组装型磁性复合微粒及其制备方法与应用”，专利申请号03153486.4，公告号CN1580765A，是一种组装型Fe3O4/Au超顺磁性复合微粒，用于生物分子标记。这种组装型金磁复合微粒粒度较均一，单分散性好，稳定性好，有较好的磁响应性和对生物分子的可修饰性。其缺点或不足是：组装型Fe3O4/Au超顺磁性复合微粒不能直接用于多种生物分子的标记，标记量少，对生物分子的富集能力相对较低，从而使检测的灵敏度相对较低；且生物分子的直接标记易使生物分子部分变性失活。

发明内容

本发明的目的在于提供一种亲和素/链亲和素磁性复合微粒及其制备方法与用途，其解决了背景技术中标记量少，对生物分子的富集能力相对较低，从而使检测的灵敏度相对较低，且生物分子的直接标记易使生物分子部分变性失活的技术问题。

本发明的技术解决方案是：

一种亲和素/链亲和素磁性复合微粒，包括组装型金磁复合微粒1，其特殊之处在于：所述组装型金磁复合微粒1的外层包覆有亲和素/链亲和素生物分子2。

上述亲和素/链亲和素生物分子2为高生物素结合活性的亲和素/链亲和素生物分子。

上述组装型金磁复合微粒1的粒径以0.05-100μm为宜，在外层包覆蛋白亲和素/链亲和素后，其粒径变化不大。

一种制备上述亲和素/链亲和素磁性复合微粒的方法，其特殊之处在于：该方法的实现步骤如下

1)取组装型金磁复合微粒；

2)用平衡盐溶液进行平衡

(1)将平衡盐溶液放入离心管，使组装型金磁复合微粒分散于平衡盐溶液中；

(2)用磁性分离器进行磁性分离，弃上清；具体可平衡三次；

3)加入1mg/ml 300μl的高生物素结合活性的亲和素/链亲和素生物分子；恒温下，一边振荡、混匀，一边进行反应；

4)进行磁性分离，弃上清；以缓冲液清洗三次；

5)加入封闭剂，封闭20-120分钟；

6)以500μl 0.02M的磷酸盐缓冲液pH＝7.4清洗三次即可。

上述平衡盐溶液可采用0.02-0.2M的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，pH＝7.0-7.6；或0.02-0.2M的磷酸盐缓冲液，pH＝7.0-7.6；或0.02-0.2M的N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸盐缓冲液，pH＝7.0-7.6；上述清洗的缓冲液可采用500μl 0.02M的三羟甲基氨基甲烷-盐酸pH＝7.4含有10mM的乙二胺四乙酸二钠盐和0.15M的NaCl的缓冲液。

上述平衡盐溶液中以加入0.1-1.0M的NaCl为佳。

上述封闭剂可采用1-10％的脱脂奶粉，或1-5％的牛血清白蛋白BSA，或0.2-2.0％的明胶等。

上述恒温振荡反应的温度为室温至37℃，以37℃为宜；反应时间10-30分钟，以20分钟为宜。

一种如上所述的亲和素/链亲和素磁性复合微粒的用途，其特殊之处在于：该亲和素/链亲和素磁性复合微粒用于标记生物素化生物分子及生物素化非生物材料。标记后用于生物分子及非生物分子的富集、分离、纯化及检测。生物素化生物分子可为生物素化核酸、抗原、抗体、酶、多肽、多糖等。

一种如上所述的亲和素/链亲和素磁性复合微粒的应用，其特殊之处在于：该亲和素/链亲和素磁性复合微粒用于标记蛋白、核酸、细胞；标记后用于抗原-抗体、DNA-DNA、DNA-寡核苷酸、配体-受体生物分子相结合的反应；或用于微生物的生物分子富集、分离、纯化及检测；或用于食品污染、细胞分离、mRNA纯化的生物分子富集、分离、纯化剂检测。

本发明具有以下优点：

1.本发明的亲和素/链亲和素磁性复合微粒生物素结合容量高。其游离生物素结合活性可达700-5000pmol。例如，每毫克链亲和素磁性复合微粒可结合高达5000pmol的游离生物素，每毫克链亲和素磁性复合微粒可结合的生物素化寡核苷酸探针大于800pmol。

2.以亲和素/链亲和素生物分子作为组装型金磁复合微粒的包覆物，具有高生物素结合活性，可减少生物分子的变性失活，并可起到偶联放大的作用，为检测提高灵敏度，增强其生物分子富集能力。

3.本发明的亲和素/链亲和素磁性复合微粒可直接用来标记生物素化核酸、抗原、抗体、酶、多肽、多糖等任何生物素化分子，是一种通用性磁性复合载体，可避免对不同标记物的固定化方法的选择。

4.本发明以组装型金磁复合微粒为载体，固定化链亲和素后，利用链亲和素与生物素化配基之间强的相互作用，可将核酸、抗原、抗体、酶、多肽、多糖等生物分子通过简单的生物素化，一步固定于金磁复合微粒上，制备方法简便、快捷，一般只需20分钟即可完成。

5.本发明的亲和素/链亲和素磁性复合微粒采用一步固定法制备，可节省大量昂贵的生物试剂。

6.本发明的亲和素/链亲和素磁性复合微粒可用于标记生物素化核酸、抗原、抗体、酶、多肽、多糖等任何生物素化分子，用作蛋白、核酸、细胞等的磁性标记物，非常适用于：核酸、蛋白质等生物及非生物样品的富集与分离，核酸杂交于检测，抗原-抗体免疫学检测等生物体的检测，以及环境监测、食品安全检测等。

7.由于亲和素/链亲和素具有较高的磁响应性和较大的生物分子固定化容量，通过简单的磁分离装置，就可对捕获至复合微粒表面的物质进行富集、分离和纯化，或用于核酸纯化和细胞分离。

8.本发明的亲和素/链亲和素磁性复合微粒用于生物分析检测，可提高生物分析检测的灵敏度和特异性，使检测过程更为简便。无需借助昂贵的检测仪器，大大降低了检测成本。

附图说明

图1为组装型金磁复合微粒的剖面结构模式图；

图2为本发明亲和素/链亲和素磁性复合微粒的剖面模式图；

图3为本发明链亲和素包被容量的曲线图；

图4为本发明链亲和素磁珠结合生物素化寡核苷酸探针前后的紫外吸收曲线图。

附图标号说明：1-组装型金磁复合微粒，2-亲和素/链亲和素生物分子。I-代表结合前寡核苷酸探针紫外吸收OD260nm处的光密度值，II-代表结合后寡核苷酸探针紫外吸收OD260nm处的光密度值，III-代表磁粒清洗后洗涤液的光吸收曲线。

具体实施方式

本发明的亲和素/链亲和素磁性复合微粒由内层的组装型金磁复合微粒1和包覆于其外层的亲和素/链亲和素生物分子2构成。亲和素/链亲和素生物分子2为高生物素结合活性的亲和素/链亲和素生物分子。组装型金磁复合微粒1的粒径采用0.05-100μm，在外层包覆亲和素/链亲和素生物分子2后，其粒径变化不大。

本发明的亲和素/链亲和素生物分子2通过简单的物理吸附一步法固定于组装型金磁复合微粒1上。亲和素/链亲和素磁性复合微粒制备方法的步骤如下

1.取100μl、5mg的组装型金磁复合微粒，粒径为0.05-100μm。

2.用平衡盐溶液进行平衡

1)将平衡盐溶液放入离心管，使组装型金磁复合微粒分散于平衡盐溶液中；

2)用磁性分离器进行磁性分离，弃上清。

平衡盐溶液可采用0.02-0.2M的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液Tris-HCl，pH＝7.0-7.6；或0.02-0.2M的磷酸盐缓冲液PBS，pH＝7.0-7.6；或N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸盐缓冲液HEPES等。在平衡盐溶液中以加入0.1-1.0M的NaCl为佳。具体以平衡三次为宜。

3.加入lmg/ml的高生物素结合活性的亲和素/链亲和素生物分子300μl，在恒温下，一边振荡混匀，一边进行反应。具体可采用恒温振荡器，温度为室温至37℃，以37℃为宜；反应时间为10-30分钟，一般以20分钟为宜。

4.用磁性分离器进行磁性分离，弃上清。以500μl 0.02的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，pH＝7.4含有10mM的乙二胺四乙酸二钠盐和0.15M的NaCl清洗。

5.加入封闭剂，封闭20-120分钟。封闭剂可采用1-10％的脱脂奶粉，或1-5％的BSA，或0.2-2.0％的明胶等。

6.以500μl 0.02M的磷酸盐缓冲液pH＝7.4清洗三次备用。

本发明亲和素/链亲和素磁性复合微粒的用途：

该亲和素/链亲和素磁性复合微粒用于标记生物素化生物分子及生物素化非生物材料。生物素化生物分子可为生物素化核酸、抗原、抗体、酶、多肽、多糖等。

该亲和素/链亲和素磁性复合微粒用于抗原-抗体、DNA-DNA、DNA-寡核苷酸、配体-受体等生物分子相结合的反应；或用于细菌、病毒等临床致病微生物的生物分子富集、分离、纯化及检测；或用于食品污染、细胞分离、mRNA纯化的生物分子富剂、分离、纯化剂检测。

实施例1，本发明链亲和素磁性复合微粒的制备方法

1.取0.02M的Tris-HCl缓冲液，其中加有0.15M的NaCl。

2.用缓冲液对100μl、5mg组装型金磁复合微粒平衡三次。

平衡过程：将组装型金磁复合微粒分散于平衡盐溶液中，磁性分离后，弃上清。

3.加入0.5mg/ml高生物素结合活性的链亲和素生物分子300ul，振荡混匀，37℃恒温下，反应20分钟。

4.磁性分离弃上清，以500μl 0.02的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，pH＝7.4含有10mM的乙二胺四乙酸二钠盐和0.15M的NaCl清洗

实施例2，本发明链亲和素磁性复合微粒用于连结生物素化寡核苷酸探针

1)取500μl的0.01M Tris-Hcl含1M NaCl的缓冲液，

2)对500μg链亲和素磁性复合微粒进行平衡。平衡三次，磁性分离后，弃上清。

3)加入生物素化寡核苷酸探针200μl，即1.5nmol，以同等量探针为空白以测定结合前溶液的OD值，室温放置20分钟；

4)磁性分离留上清测定结合后溶液的OD值，用0.01M Tris-Hcl含0.15M NaCl的缓冲液清洗三次，分别磁性分离留上清测定清洗后的OD值。

实施例3，本发明链亲和素磁性复合微粒表面连结生物素化羊抗人IgG，用于免疫检测

1)取0.01M Tris-HCl含0.15M NaCl缓冲液100μl，

2)对100μl链亲和素磁性复合微粒进行平衡。平衡三次，磁性分离后弃上清。

3)加入100μl生物素化羊抗人IgG。

4)37℃恒温下反应30分钟，用0.01M的PBS洗涤三次，备用

5)加入HRP标记的兔抗羊IgG，37℃恒温下反应30分钟。

6)磁性分离，用0.01M的PBS清洗2-3次。

7)加入50μl四甲基联苯胺和50μl过氧化氢，反应后以100μl2M的硫酸终止，测定可见区450nm处的光密度值(OD450nm值)。

Claims

1.一种亲和素/链亲和素磁性复合微粒的制备方法，该方法的实现步骤如下

1)取组装型金磁复合微粒；

2)用平衡盐溶液进行平衡

(2)用磁性分离器进行磁性分离，弃上清；

4)进行磁性分离，弃上清；以缓冲液清洗三次；

5)加入封闭剂，封闭20-120分钟；

6)以500μl 0.02M的磷酸盐缓冲液pH＝7.4清洗三次即可；

步骤2)所述的平衡盐溶液为0.02-0.2M的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，pH＝7.0-7.6；或0.02-0.2M的磷酸盐缓冲液，pH＝7.0-7.6；或0.02-0.2M的N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸盐缓冲液，pH＝7.0-7.6；且平衡盐溶液中还加有0.1-1.0M的NaCl；

步骤4)所述清洗的缓冲液为500μl 0.02M的三羟甲基氨基甲烷-盐酸pH＝7.4含有10mM的乙二胺四乙酸二钠盐和0.15M的NaCl的缓冲液。

2.根据权利要求1所述亲和素/链亲和素磁性复合微粒的制备方法，其特征在于：所述的封闭剂为1-10％的脱脂奶粉，或1-5％的牛血清白蛋白BSA，或0.2-2.0％的明胶。

3.根据权利要求2所述亲和素/链亲和素磁性复合微粒的制备方法，其特征在于：所述恒温振荡反应的温度为室温至37℃，反应时间10-30分钟。

4.一种权利要求1所述制备方法制得的亲和素/链亲和素磁性复合微粒的用途，其特征在于：该亲和素/链亲和素磁性复合微粒用于标记蛋白、核酸、细胞；标记后用于抗原-抗体、DNA-DNA、DNA-寡核苷酸、配体-受体生物分子相结合的反应；或用于微生物的生物分子富集、分离、纯化及检测；或用于食品污染、细胞分离、mRNA纯化的生物分子富集、分离、纯化剂检测。