CN113567685B - 基于核酸适配体探针的hgfr识别方法及检测hgfr的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于核酸适配体探针的HGFR识别方法：使样本中的HGFR与核酸适配体探针发生免疫反应，核酸适配体探针的核苷酸序列包括SEQ ID NO.1所示序列。核苷酸序列包括SEQ ID NO.1所示序列的核酸适配体对HGFR展现出突出的特异性和亲和力，以包括了SEQ ID NO.1所示序列的核酸适配体作为靶向HGFR的核酸适配体探针，能够灵敏、准确、快速地识别HGFR抗原蛋白并与其稳定地结合，能够避免假阳性的情况出现。

Description

基于核酸适配体探针的HGFR识别方法及检测HGFR的试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种基于核酸适配体探针的HGFR识别方法及检测HGFR的试剂盒。

背景技术

肝细胞生长因子受体(Hepatocyte Growth Factor Receptor，HGFR)，是由原癌基因c-met编码的一类位于细胞表面的单次跨膜受体酪氨酸激酶。HGFR信号通路的激活可促进细胞增殖，增强细胞迁移能力，诱导表皮细胞形态发生，以及抑制细胞凋亡，因此该信号通路被认为参与组织的修复与再生。目前为止已知HGFR的唯一配体是肝脏增殖因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)，HGF通过结合并诱导HGFR二聚化激活HGFR信号通路，进而行使其功能。国内外研究表明，HGFR的表达通常与人体多种恶性肿瘤的发生、发展及转移有关。

目前，HGFR的常用识别方法为酶联免疫分析技术(ELISA)，这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。

核酸适配体是能够和靶标分子特异性结合的人工合成的核酸，具有稳定的二级结构。核酸适配体识别分子的模式与抗体类似，但与蛋白质类抗体相比，核酸适配体具有更多的优越性，如不受免疫条件和免疫原性限制，可体外人工合成，制备简单快捷，变性与复性可逆，可修饰并易于长期保存和室温运输等。更重要的是，核酸适配体的靶分子更为广泛，可以是蛋白质、核酸、小肽、氨基酸、有机物甚至金属离子等。此外，核酸适配体还具有以下优势，如：化学性质稳定、至今未见报道存在免疫原性或毒性、亲和力高、特异性强、易于进行改造修饰。这些特性使得核酸适配体在生物医药研究领域得到广泛应用，成为不可缺少的有力工具。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于核酸适配体探针的HGFR识别方法及检测HGFR的试剂盒，以提高HGFR检测的灵敏度和准确度。

根据本发明的一个方面，提供一种基于核酸适配体探针的HGFR识别方法，：使样本中的HGFR与核酸适配体探针发生免疫反应，核酸适配体探针的核苷酸序列包括SEQ IDNO.1所示序列。

优选地，使样本中的HGFR分别依次与抗体、核酸适配体探针发生免疫反应，形成抗体-蛋白-核酸适配体的夹心结构。

优选地，在形成夹心结构后，洗去未与HGFR结合的过量核酸适配体探针，对参与构建夹心结构的核酸适配体探针进行PCR扩增，利用PCR扩增结果表征样本中的HGFR。

根据本发明的另一个方面，提供一种检测HGFR的试剂盒，其配备的物料包括固相载体和核酸适配体探针，固相载体的表面包被了靶向HGFR的捕获抗体，核酸适配体探针的核苷酸序列包括SEQ ID NO.1所示序列。

优选地，其配备的物料还包括洗涤液，洗涤液为含0.5％吐温20、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。

优选地，洗涤液含有0.05％叠氮化钠。

优选地，洗涤液的pH=7.2。

优选地，其配备的物料还包括Taq-DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP和引物，引物与核酸适配体的部分核苷酸序列互补。

本发明采用核酸适配体作为探针应用于HGFR的识别检测，与靶向HGFR的蛋白质类抗体相比，上述核酸适配体探针基于DNA的结构特征：具有的制备简单快捷、分子量小、化学性质稳定、易于进行改造修饰的优异性能；适用于PCR扩增，通过使其进行PCR扩增从而对抗原蛋白进行定性定量检测，由此使得检测方案比传统的采用蛋白质类检测抗体更为多样、便捷。在研发过程中，发现靶向HGFR的相当一部分核酸适配体不仅会与抗原蛋白结合，还会与捕获抗体或用于固定捕获抗体的固相载体向结合，出现假阳性的情况。然而，在筛选得到的核酸适配体中，核苷酸序列包括SEQ ID NO.1所示序列的核酸适配体对HGFR展现出突出的特异性和亲和力，以包括了SEQ ID NO.1所示序列的核酸适配体作为靶向HGFR的核酸适配体探针，能够灵敏、准确、快速地识别HGFR抗原蛋白并与其稳定地结合，能够避免假阳性的情况出现。

优选地，引物包括上游引物和下游引物，上游引物的序列为如SEQ ID NO.2所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

可选地，其配备的物料还包括HGFR蛋白标准品、底物显色液、终止液和显色底物标记的链霉亲和素，核酸适配体探针为被生物素标记的核苷酸序列。

附图说明

图1为实施例1获得的核酸适配体的二级结构图；

图2为实施例2中构建标准曲线的实验图示；

图3为实施例2中梯度浓度标准样品和对照样品所对应的Ct值；

图4为实施例2所构建的标准曲线图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。

实施例1

HGFR核酸适配体的获取

核酸适配体的的筛选过程采用毛细管电泳SELEX技术(Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment ）进行核酸适配体的筛选：

使核酸与HGFR抗原混合，由此形成的混合溶液在CE（高效毛细管电泳-激光诱导荧光检测）上运行，分离并收集与HGFR抗原结合的核酸分子（DNA-蛋白质复合物）；使DNA-蛋白质复合物以不同的速率通过毛细管，当DNA-蛋白质复合物通过毛细管中的一个窗口时，利用荧光检测技术可以对DNA-蛋白质复合物进行识别，通过复合峰收集DNA并PCR 扩增；然后我们使用 Lambda 核酸外切酶生成 ssDNA；将上述过程重复 3-10 次。使用非特异性蛋白质以类似方式进行阴性选择，但收集的是没有与抗原结合的DNA。选择后，使用 NGS 对 DNA进行测序以识别单个序列。最终找到结合HGFR的核酸适配体。

本实施例所得到的核酸适配体的序列为：

GAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTC （SEQ ID NO.1），

其二级机构如图1所示。

实施例2

1.组建检测HGFR的试剂盒

检测HGFR的试剂盒配置以下物料：

酶标板：表面包被有捕获抗体，捕获抗体为抗HGFR单抗，利用pH=7.2、含5％脱脂奶粉的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液作封闭液封闭；

核酸适配体探针：核酸适配体探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；

捕获抗体稀释液：含有0.5％酪蛋白、2~4％蔗糖、150mMNaCl、0.2％吐温20的15mM磷酸盐缓冲液，pH=7.4；

样本稀释液：含有2~4％蔗糖、150mMNaCl、0.2％吐温20的15mM磷酸盐缓冲液，pH=6.5；

洗涤液：含0.5％吐温20，0.05％叠氮化钠，的0.1 M磷酸盐缓冲液，pH=7.2。

Taq-DNA聚合酶；

PCR反应缓冲液；

dNTP；

引物：上游引物的序列为GAAAAGTTATCAGGCTG（SEQ ID NO.2），下游引物的序列为GAGTACTCCAAAACTAAT（SEQ ID NO.3）。

SYBR Green Mix

HGFR蛋白标准品溶液。

2. 检测HGFR的试剂盒的使用

利用本实施提供的检测HGFR的试剂盒进行HGFR的定量检测，按照以下步骤进行：

步骤一：向酶标板的微孔中分别加入梯度稀释的HGFR蛋白标准品与待检测样品，每孔加样100μL，每个样品做两个重复，于37℃反应40分钟，洗涤酶标板。

步骤二：向酶标板的微孔中加入核酸适配体探针，孵育40分钟，洗涤酶标板。

上述步骤一和步骤二过程中所涉及的洗涤酶标板的操作均为利用所配置的洗涤液于洗板机上洗涤酶标板5次，共10分钟。在其他实施例中，也可以根据实际情况利用酶联免疫试剂盒所配置的洗涤液实施本领域内通用的洗板操作，而不限于采用洗板机洗板。

步骤三：标准品的PCR扩增

（1）取 5 μL与HGFR蛋白标准品结合的核酸适配体探针进行PCR扩增, 反应体系总体积 50 μL，扩增条件为：先94 ℃ 3 mins, 再循环扩增 30次 94 ℃ 10 s，55 ℃ 25 s；

（2）取第1次扩增完成的PCR反应液 5 μL，加入到新的体系中，重复第1次的PCR扩增操作；

（3）回收核酸适配体探针。

步骤四：样品的PCR扩增

（1）取 5 μL与样品中的HGFR蛋白结合的核酸适配体探针进行PCR扩增, 反应体系总体积 50 μL，扩增条件为：先94 ℃ 3 mins, 再循环扩增 30次 94 ℃ 10 s，55 ℃ 25s；

（2）取第1次扩增完成的PCR反应液 5 μL，加入到新的体系中，重复第1次的PCR扩增操作；

（3）回收核酸适配体探针。

标准曲线的构建方式如下：

（1）设置含有浓度梯度抗原的标准样品以及不含有抗原的对照样品，标准样品的设置方式为将40 μL VEGF标准品添加到含有 360 μL稀释剂的洁净离心管中以制备 1000pg/ml 标准溶液，稀释1000 pg/ml 标准溶液以进一步配制其他浓度的标准样品，最后分别向标准样品和对照样品中加入等量的核酸适配体（SEQ ID NO.1）。

（2）使用 qPCR 收集数据，通过输出Ct值以表征每个样本中包含的抗原量，其中，较低的 Ct 值表示较高的抗原浓度；当 DNA 被放大时，会产生额外的荧光信号，每个循环都会导致 DNA 大约加倍，而Ct值代表样品通过荧光阈值所需的循环数；因此，较高水平的DNA（与样品中的抗原量直接相关）会导致较低的 Ct 值。

（3）计算每组一式三份标准样品、对照样品的平均 Ct；从对照中减去每个样品的Ct 值，得到对照和样品之间的Ct值差值；依据上述步骤得到分别对应梯度浓度的标准样品和对照样品的Ct值如图3所示，在图3中，纵坐标的强度即为样品所对应的Ct值。以浓度为x坐标，以Ct值差值作为y坐标拟合标准曲线，由此拟合得到的线性关系如图4所示。

由此计算出HGFR核配体的最低检测限是6 pg/mL，低于 6 pg/mL 的水平可能会在定量范围之外被检测到。而现有的关于HGFR检测的ELISA 试剂盒的最低检测限通常为 60pg/mL，如RayBio Human HGFR ELISA KIT(https://www.raybiotech.com/human-hgf-r-c-met-elisa-kit/ ; https://www.raybiotech.com/mouse-hgfr-elisa/)。由此说明，本发明所提供的HGFR识别方法能够有效地提高HGFR的检测灵敏性，而基于该识别方法所涉及的试剂盒能够达到相对于目前针对HGFR检测的试剂盒明显更低的最低检测限。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 瑞博奥（广州）生物科技股份有限公司

<120> 基于核酸适配体探针的HGFR识别方法及检测HGFR的试剂

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaaaagttat caggctggat ggtagctcgg tcggggtggg tgggttggca agtctgatta 60

gttttggagt actc 74

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaaaagttat caggctg 17

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gagtactcca aaactaat 18

Claims (7)

1.基于核酸适配体探针的HGFR非诊断目的识别方法，其特征在于：使样本中的HGFR分别依次与抗体、核酸适配体探针发生免疫反应，形成抗体-蛋白-核酸适配体的夹心结构，所述核酸适配体探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示序列，并且具有以下二级结构：

；

在形成所述夹心结构后，采用洗涤液洗去未与HGFR结合的过量所述核酸适配体探针，所述洗涤液为含0.5％吐温20、0.05％叠氮化钠的0.1 M磷酸盐缓冲液且pH=7.2；

对参与构建所述夹心结构的所述核酸适配体探针进行PCR扩增，利用PCR扩增结果表征所述样本中的HGFR。

2.一种检测HGFR的试剂盒，其特征在于：其配备的物料包括固相载体和核酸适配体探针，所述固相载体的表面包被了靶向HGFR的捕获抗体，所述核酸适配体探针的核苷酸序列包括SEQ ID NO.1所示序列。

3.如权利要求2所述检测HGFR的试剂盒，其特征在于：其配备的所述物料还包括洗涤液，所述洗涤液为含0.5％吐温20、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。

4.如权利要求3所述检测HGFR的试剂盒，其特征在于：所述洗涤液含有0.05％叠氮化钠。

5.如权利要求4所述检测HGFR的试剂盒，其特征在于：所述洗涤液的pH=7.2。

6.如权利要求3所述检测HGFR的试剂盒，其特征在于：其配备的所述物料还包括Taq-DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP和引物，所述引物与所述核酸适配体的部分核苷酸序列互补。

7.如权利要求6所述检测HGFR的试剂盒，其特征在于：所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

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