CN108977447A - 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子a53及其筛选方法和应用 - Google Patents

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子a53及其筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53及其筛选方法和应用，所述核酸适配子A53序列为：5’‑AGCAGCACAGAGGTCAGATGGCGCTGGATAGCAAGATCAC GTTATCATCG TAAACCCTAT GCGTGCTACC GTGAA‑3’；该核酸适配子A53可应用于分析检测NGAL的非疾病诊断中、制备中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的纯化试剂中以及研制治疗中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白相关疾病药物中。

Description

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53及其筛 选方法和应用
技术领域
本发明涉及一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53及其筛选方法和应用。
背景技术
急性肾损伤(Acute Kidney Injury，AKI)是一种肾小球滤过率急剧下降所导致的临床常见疾病，临床表现包括血清尿素氮和血清肌酐水平突然并持续升高，同时伴有盐水失衡。AKI是各种严峻条件下的一种最为常见的综合症，住院患者中的发病率为5％-7％，而危重患者中高达30％，并且患有AKI的危重患者的死亡率高达50％。此外，AKI与不良转归密切相关，包括死亡率增加、住院时间延长、危重患者的机械通气持续时间延长，及发展为慢性肾脏疾病风险增加等。
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(Neutrophil gelatinase associatedlipocalin，NGAL)，又名脂质运载蛋白2、噬铁蛋白或癌基因24p3，分子量25kD，在体内以多种形式存在，单体、46kD的同源二聚体、与金属蛋白酶9(Matrix Metalloproteinase 9，MMP-9)结合形成的135kD的异源二聚体。NGAL在各种损伤后合成增加，尤其是肾脏疾病，被认为是最有前景的肾脏内科临床标志物。研究表明NGAL与AKI密切相关，在AKI患者的血清和尿液中NGAL水平显著升高，并且升高程度与肾脏损伤严重程度相关，因此NGAL是早期诊断AKI 的强有力的指标，在各类疾病诱发的AKI的早期诊断、预测及治疗后肾功能恢复情况的监测中有着明显的优势和临床价值，具有巨大的应用前景，运用好 NGAL检测，将大大降低AKI发病率和死亡率。
核酸适配子是一类具有特殊的三维立体结构(发卡，假结，凸环，G-四聚体等)，可以高特异性高亲和性结合靶标的单链DNA(Single stranded DNA， ssDNA)或RNA。核酸适配子通过指数富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment，SELEX)筛选获得，核酸适配子具有稳定性好、生产周期短、费用低、可化学合成大量生产、进行各种功能化修饰等优点，因此，核酸适配子在检测诊断方面具有广阔的前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高亲和力、高特异性的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53及其筛选方法和应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53，其特征在于：它的序列如下所示：
AGCAGCACAG AGGTCAGATG GCGCTGGATA GCAAGATCAC 40
GTTATCATCG TAAACCCTAT GCGTGCTACC GTGAA 75；
在25℃，0.1M Na+，0.001M Mg2+条件下其二级结构为茎环结构，其分子结构如下：
所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53的筛选方法，基于核酸适配子的体外SELEX筛选技术，利用羧基磁珠作为固相介质，以NGAL 为靶标，通过NGAL羧基磁珠从ssDNA库中筛选得到与NGAL特异性结合的核酸适配子。
所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53的应用，在分析检测NGAL的非疾病诊断中的应用。
所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53的应用，在制备中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的纯化试剂中的应用。
所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53的应用，在研制治疗中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白相关疾病药物中的应用。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：本发明通过SELEX方法筛选获得的核酸适配子A53能高亲和力、高特异性地与NGAL结合，其中Kd值为 32.52nM，其在AKI诊断方面具有应用前景。该核酸适配子A53能够用于建立 ELAA检测方法(酶联核酸适配子分析)，利用核酸适配子A53建立的ELAA检测方法能够特异性检测NGAL，且线性范围为125ng/mL-4000ng/mL，灵敏度为 30.45ng/mL，板内和板间变异系数CV值均小于15％，回收率在80％-110％之间。
附图说明
图1为核酸适配子A53的二级结构模拟图。
图2为qPCR法比较候选适配子与NGAL结合量结果图。
图3为核酸适配子A53的特异性分析结果。
图4为核酸适配子A53的亲和力检测结果。
图5为基于核酸适配子A53所建立的ELAA检测方法的特异性分析结果。
图6为基于核酸适配子A53所建立的ELAA检测方法的标准曲线。
图7为基于核酸适配子A53所建立的ELAA检测方法的灵敏度分析结果。
图8为基于核酸适配子A53所建立的ELAA检测方法检测尿液样本的结果图。
图9为核酸适配子A53的SELEX筛选策略图。
图10为ELAA检测方法的检测策略图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53，它的序列如下所示：
5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGGCGCTGGATAGCAAGATCAC
GTTATCATCG TAAACCCTAT GCGTGCTACC GTGAA-3’
如图1所示：所述核酸适配子A53的结构为：以茎环结构为基础，连接大小不一的环。
所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53，对所述核酸适配子A53的5'端或3'端进行FAM、Biotin或氨基化学修饰。
所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53的筛选方法，基于核酸适配子的体外SELEX筛选技术，利用羧基磁珠作为固相介质，以 NGAL为靶标，通过NGAL羧基磁珠从ssDNA库中筛选得到与NGAL特异性结合的核酸适配子。
所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53的筛选方法，它包括以下步骤(核酸适配子A53的SELEX筛选策略图见图9)：
①包被NGAL的磁珠与ssDNA库孵育进行SELEX筛选，并从第三轮开始在每轮筛选之前加入裸磁珠进行前反筛，以此去除与磁珠非特异结合的ssDNA；
②孵育洗涤后的磁珠进行热洗脱，洗脱下来的ssDNA作为模板，加入带荧光修饰的上游引物P3与带PolyA尾的下游引物P4进行PCR扩增；
③PCR扩增产物用正丁醇浓缩后经10％7M尿素变性PAGE胶电泳，使得带荧光修饰的75nt的目的链与PolyA修饰的95nt的互补链分离；
④切取75nt位置带荧光的目的链条带进行胶回收、乙醇纯化，作为进行下一轮SELEX筛选的次级ssDNA库；
⑤将步骤④所得的次级ssDNA文库，作为下一轮筛选的次级文库，进行循环筛选；第8轮筛选后，以第8轮SELEX筛选后的产物库8ssDNA为模板，用P1 和P2进行扩增、纯化，得纯化后的PCR扩增产物；接着对纯化后的PCR扩增产物进行TA克隆，之后随机挑取克隆菌落，进行测序；
其中，所述ssDNA库，两端为20nt的固定引物序列，中间35nt为随机序列，其序列为：
5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N35-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’；
所述引物P1、P2、P3、P4分别为：
引物P1：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’，
引物P2：5’-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’，
引物P3：5’-FAM-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’，
引物P4：
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-link-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’。
所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53的应用，在分析检测NGAL的非疾病诊断中的应用。
所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53的应用，利用所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53建立ELAA检测方法。
所述ELAA检测方法包括以下步骤(ELAA检测方法的检测策略图如图10 所示)：
①将NGAL抗体包被于96孔板上，用3％BSA封闭；
②在96孔板上再加入NGAL溶液孵育，洗涤；
③在96孔板上再加入生物素标记的NGAL核酸适配子A53孵育后洗涤，形成抗体-NGAL-核酸适配子A53夹心复合物三明治模型；
④在96孔板上再加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素孵育洗涤后，加入显色底物TMB使其显色，酶标仪450nM波长测OD值以反映NGAL的浓度。
所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53的应用，在制备中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的纯化试剂中的应用。
所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53的应用，在研制治疗中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白相关疾病药物中的应用。
以下结合实施例对体外筛选NGAL核酸适配子A53以及利用NGAL核酸适配子A53建立的ELAA检测方法等进行详细说明。
实施例1体外筛选NGAL核酸适配子
1)体外合成单链DNA库，两端为20nt的固定引物序列，中间35nt为随机序列：
5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N35-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’，库容量1021。
引物P1：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’，
引物P2：5’-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’，
引物P3：5’-FAM-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’，
引物P4：
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-link-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’；
以上核酸序列均委托上海生工生物工程技术有限公司合成并经HPLC纯化。
2)包被NGAL：参考 Plus Carboxyl Protein Coupling Kit说明书将45μgNGAL包被于1mg羧基磁珠上，重悬于储存液中待用。
3)用Binding Buffer(Tris·HCl 50mM、NaCl 100mM、MgCl2 1mM、KCl 5mM， pH8.0)将随机ssDNA库溶解于EP管，沸水浴(100℃)5min，冰水浴3min。将ssDNA库与包被NGAL的磁珠混匀，室温，摇床孵育1h，吸弃上清。Binding Buffer洗去未结合的ssDNA，加入ddw，沸水浴5min，吸取上清。从第三轮开始筛选之前，先将ssDNA库与裸磁珠孵育30min，400r/min摇床转速进行前反筛后，取上清进行筛选。
4)将从NGAL磁珠上热洗脱的上清液作为模板，以P3和P4作为引物进行PCR扩增。其中，PCR反应体系(1000μL，分装为50μL进行PCR扩增)如下：
PCR反应条件为:95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，进行20个循环，72℃再延伸5min。
5)将PCR扩增产物移置1.5mL EP离心管中加入1mL的正丁醇，震荡混匀，离心，弃上清，将PCR扩增产物浓缩至200μL。
6)浓缩PCR扩增产物中加入2×TBE/Urea Sample Buffer，沸水浴10min，冰浴3min，经10％7M尿素变性PAGE胶电泳后，用干净的刀片将发绿色荧光的目的条带切下，碎胶，乙醇沉淀后，加入100μL Binding Buffer溶解沉淀，测定其浓度，得到下一轮库，进行下一轮SELEX筛选。
7)第8轮筛选后，将筛选产物(库8ssDNA)以P1、P2为引物进行PCR扩增；其中，PCR反应体系(50μL)如下：
PCR反应条件为:95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，进行20个循环，72℃再延伸5min。
之后将扩增产物进行纯化，用pEASY-T1Simple Cloning Kit进行TA克隆。其中，TA连接反应的反应体系为：
TA克隆具体方法为：轻轻混合TA连接反应体系，37℃，反应5min。待反应结束后，立即将EP离心管置于冰上。之后，加入50μL Trans1-T1感受态细胞，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热激45秒后，置于冰上2min；加入250μL LB 液体培养基，37℃，200r/min，孵育1h；取8μL500mM IPTG，40μL 20mg/mL X-gal 混合后，均匀铺在LB固体培养基上，待其被完全吸收；取200μL菌液均匀铺于培养基上，培养过夜；最后，用一次性接种环随机挑取55个培养基上的白色菌落于1mL含1/1000Amp抗生素的LB液体培养基，37℃摇菌过夜，送博尚生物工程技术有限公司测序。
8)将测序获得的核酸适配子序列用DNAMAN8.0软件对其一级结构进行多序列比对，并进行同源性分析，网页The mfold Web Server模拟核酸适配子的二级结构(http:// unafold.rna.albany.edu/？q＝mfold/DNA-Folding-Form)。
9)qPCR法验证适配子：
(1)取1μL回收的适配子质粒稀释100倍作为模板进行PCR扩增。
PCR反应体系(50μL)如下：
PCR反应条件为:95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，进行20个循环，72℃再延伸5min。
(2)按体外筛选NGAL核酸适配子中的步骤6)分离适配子单链，得到200μL 核酸适配子ssDNA，测其浓度，调整适配子浓度，使其浓度一致(20nM)。
(3)取1μL NGAL磁珠和裸磁珠，各加50μL适配子，震荡混匀，室温孵育 60min，置于磁力架上至液体澄清(约3min)，弃上清。
(4)加入100μL Binding Buffer，震荡混匀，置于磁力架上至液体澄清(约 3min)，弃上清，重复2次。
(5)加入100μL ddw重悬磁珠后取1μL作为模板进行qPCR。
qPCR反应体系(15μL)如下：
qPCR反应条件为:95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸10s，进行20个循环，72℃再延伸5min。
(6)选取NGAL磁珠与裸磁珠ΔCt值大于4个循环且同源性不高的核酸适配子A10、A36、A42、A53这4个序列及测序结果中存在相同序列的A21作为候选适配子。
10)候选核酸适配子的比较：
①将筛选出的候选核酸适配子A10、A36、A42、A53、A21交由上海生工生物技术有限公司合成；
其中，核酸适配子A10的序列为：
5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGTGCTGGAATCAACACGATCG
CATCCCGGAT GGGCTCCTAT GCGTGCTACC GTGAA-3’；
核酸适配子A36的序列为：
5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGCCCATATGCTACTTTGCACA
CATCCTGGAT AGGCTCCTAT GCGTGCTACC GTGAA-3’；
核酸适配子A42的序列为：
5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGCCGTGCGGATGTACAGGGAC
TTGGATAGTT TCTGACCTAT GCGTGCTACC GTGAA-3’；
核酸适配子A21的序列为：
5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGCAACGGGTATAACCAGATGA
TTTGGCGCCA CGTAACCTAT GCGTGCTACC GTGAA-3’；
②接着，用Binding Buffer将所合成的候选适配子稀释成浓度200nM；
③取1μL NGAL磁珠和裸磁珠，各加50μL 200nM适配子，震荡混匀，室温孵育60min，置于磁力架上至液体澄清(约3min)，弃上清；
④之后，加入100μL Binding Buffer，震荡混匀，置于磁力架上至液体澄清 (约3min)，弃上清，重复4次；
⑤加入20μL ddw重悬磁珠后稀释100倍，取1μL进行qPCR。其中，qPCR反应体系(15μL)如下：
qPCR反应条件为:95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸10s，进行20个循环，72℃再延伸5min。
⑥之后，将核酸适配子A53 10倍倍比稀释成：1nM、10-1nM、10-2nM、10-3nM、 10-4nM、0nM 6个浓度梯度，作标准曲线。计算每微升磁珠所结合的适配子量用于候选适配子的比较。
通过qPCR比较候选适配子与靶标的结合情况。发现适配子A53(参见附图 2)具有的较强结合力，图2显示的结果为采用t检验进行统计分析的结果，其中，***表示P<0.001。
实施例2 qPCR法检测适配子A53与NGAL的特异性
1)体外化学合成核酸适配子A53稀释为200nM，沸水浴(100℃)5min，冰水浴3min。
2)按NGAL包被步骤制备正常人血清磁珠，正常人血清蛋白投入量为 500μg。将包被NGAL及正常人血清的磁珠分别与核酸适配子A53孵育1h，以裸磁珠作为空白对照，用结合缓冲液洗5遍，将洗涤后的磁珠作为模板进行 qPCR。
3)将核酸适配子A53 10倍倍比稀释成：1nM、10-1nM、10-2nM、10-3nM、 10-4nM、0nM 6个浓度梯度，作标准曲线。
4)计算每微升磁珠所结合的适配子A53量。
将所得每微升磁珠所结合的适配子A53量通过GraphPad Prism v5.0软件作出结果分析图，如图3所示，NGAL磁珠上的适配子量显著高于裸磁珠与正常人血清磁珠，图3显示的结果为采用t检验进行统计分析的结果，其中，***表示P<0.001。
实施例3 qPCR法检测适配子A53的亲和力
1)将候选适配子A53 2倍倍比稀释成浓度为200nM、100nM、50nM、25nM、 12.5nM、6.25nM、3.125nM、0nM 8个浓度梯度，沸水浴(100℃)5min，冰水浴3min。
2)分别与裸磁珠(空白对照)、NGAL磁珠进行孵育1h，用结合缓冲液洗5 遍，将洗涤后的磁珠作为模板进行qPCR。
3)将适配子A53 10倍倍比稀释成：1nM、10-1nM、10-2nM、10-3nM、10-4nM、 0nM 6个浓度梯度，作标准曲线。
4)计算每微升磁珠所结合的适配子A53量，用软件GraphPad Prism 5作图并计算Kd值。
如图4所示，A53Kd值为32.52nM。
实施例4 ELAA检测方法的建立
1)ELAA基本操作步骤(所有检测均做复孔)：
①包被抗体：96孔板加入50μL包被液润湿，弃掉液体，在纸上拍干，加入50μL NGAL抗体(300ng)，4℃过夜。弃掉液体，在纸上拍干，加入350μL Wash Buffer洗涤孔板，洗涤3次，每次震荡5min。
②加入350μL 3％BSA 37℃封闭4h。弃掉液体，在纸上拍干，加入350μL WashBuffer洗涤孔板，洗涤3次，每次震荡5min。
③加入50μL 4000ng/mL NGAL，室温孵育1h。弃掉液体，在纸上拍干，加入350μLWash Buffer洗涤孔板，洗涤3次，每次震荡5min。
④加入100μL 200nM生物素标记的适配子A53(Bio-A53)室温孵育1h。弃掉液体，在纸上拍干，加入350μL Wash Buffer洗涤孔板，洗涤3次，每次震荡5min。
⑤加入100μL 1：2000辣根过氧化物标记的链霉亲和素(HRP-SA)，室温孵育45min。弃掉液体，在纸上拍干，加入350μL Wash Buffer洗涤孔板，洗涤 3次，每次震荡5min。
⑥加入100μL TMB室温避光孵育20min后，加入50μL终止液，混匀。用酶标仪测波长450nm的OD值。
2)ELAA特异性分析：用ELAA检测方法同时检测NGAL(4μg/mL)、白蛋白(400μg/mL)、球蛋白(400μg/mL)及空白对照Binding Buffer吸光度OD值。
ELAA特异性分析的具体方法为：
(1)收集多发性骨髓瘤的病人血清，将其稀释10倍，不做变性处理，直接加入6×蛋白上样Buffer经12％SDS PAGE胶电泳。
(2)将SDS PAGE取下，置于4℃预冷的0.25M KCl溶液中，至出现白色蛋白条带。
(3)分别切下66KD附近的蛋白条带(主要为白蛋白)和大于150KD的蛋白条带(主要为球蛋白)，放置ddw中浸泡直至条带无色透明。
(4)将胶取出后进行碎胶处理，置于1.5mL EP管，4℃过液，12000r，离心1min，吸取管中液体。
(5)用 BCA Protein Assay Kit测定所回收的蛋白溶液的浓度。
(6)按ELAA基本操作步骤操作，具体加样如下：
ELAA特异性分析主要是评估最为常见的白蛋白和球蛋白对于该方法是否存在交叉反应和干扰影响。用ELAA检测方法同时检测NGAL(4μg/mL)、白蛋白(400μg/mL)、球蛋白(400μg/mL)及空白对照Binding Buffer吸光度OD值。 ELAA特异性分析结果如图5所示，图5中，BB为空白对照，NGAL 4μg/mL，白蛋白400μg/mL、球蛋白400μg/mL；NGAL OD值为2.05，而白蛋白和球蛋白与空白对照的OD值均在0.05左右，说明该方法可以特异性检测NGAL，不与白蛋白和球蛋白产生交叉反应，不受其干扰。
3)ELAA检测范围的确定及标准曲线的制作：将NGAL标准液2倍倍比稀释成浓度4000、2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0ng/mL，用 ELAA进行检测。NGAL浓度取对数作为横坐标，所对应的OD值作为纵坐标， EXCEL做出散点图，并截取OD值变化较陡直的浓度范围作为检测范围，做三次方程拟合，ELAA检测的标准曲线如图6所示。
4)ELAA灵敏度分析：通过检测范围的确定及标准曲线的制作实验发现该检测方法在NGAL浓度为0-62.5ng/mL范围时，浓度与所对应的OD值呈线性趋势。因此，取NGAL浓度0、15.625、31.25、62.5ng/mL作为横坐标，所对应的OD值作为纵坐标，EXCEL做出散点图并进行线性拟合，所得到的方程式为 y＝0.0003x+0.0509，R2＝0.9863(图7A)。检测15个空白OD值(图7B)，计算均值+两倍SD所对应的浓度即最低检出限，计算NGAL的最低可检测浓度为30.45ng/mL。ELAA灵敏度分析结果如图7所示，图7中，A图为NGAL浓度在0-62.5ng/mL范围内的线性方程；B图为15个空白的OD值。
5)ELAA精密度分析：
3个已知浓度(250、1000、2000ng/mL)的NGAL溶液酶标板内做3个复孔检测，评估板内精密度。
3个已知浓度(250、1000、2000ng/mL)的NGAL溶液酶标板内重复检测2 次，每次2个复孔，评估板间精密度。
板内3个浓度做3个复孔所得到的结果如表1-1，变异系数CV值均小于10％；板间3个浓度做2个复孔，3次重复所得到的结果如表1-2，变异系数CV值均小于 15％。
表1-1 ELAA板内精密度
表1-2 ELAA板间精密度
6)ELAA准确性分析(回收实验)
血清NGAL和尿NGAL都可以用于AKI的诊断和预测，而尿NGAL对于AKI 的诊断特异性更高，是无创指标，且样本成分较为简单，干扰因素较少。因此，本研究的ELAA检测方法主要用于检测尿液中的NGAL含量，取5例正常体检者尿液混合液作为本回收实验的基础值，分别加入不同浓度的NGAL蛋白作为回收样本，通过公式回收率＝回收浓度/加入浓度×100％，计算回收率。结果如表2所示，2个NGAL浓度的回收率均在80％-110％之间。
其中，5个正常健康体检者尿液混合液为基础样本，按ELAA基本操作步骤操作，具体加样如下：
表2 ELAA回收实验
7)检测临床样本
收集正常健康体检者及诊断为AKI患者的尿液各10例，用ELAA检测其 NGAL浓度，Mann-Whitney U检验进行单侧统计分析，结果如图8所示，AKI 患者NGAL水平显著高于正常健康体检者，P<0.001(图8中***表示P<0.001)。
基于NGAL适配子A53建立的抗体-NGAL-适配子A53夹心复合物三明治模型的酶联适配子分析(enzyme-linked aptamer assay，ELAA)检测方法，并进行性能验证，结果如图5，6，7所示，该检测方法可以特异性检测NGAL，不与人白蛋白、球蛋白发生交叉反应，不受其干扰；检测线性范围为 125ng/mL-4000ng/mL，标准曲线为y＝-0.6507x3+5.9876x2-16.593x+14.556， R2＝0.9993；灵敏度为30.45ng/mL；板内和板间变异系数均小于15％，回收率在80％-110％之间。性能验证表明该检测方法有希望应用于临床诊断。
本发明实施例所涉及的相关配方如下：
(1)Binding Buffer(pH 8.0)：Tris·HCl 50mM、NaCl 100mM、MgCl2 1mM、 KCl5mM。
(2)Wash Buffer：Binding Buffer+1％吐温。
(3)12％SDS PAGE胶(7mL)：
分离胶：ddw 1.60mL、30％丙烯酰胺2.00mL、1.5mol/L Tris(pH8.8)1.30mL、 10％SDS 0.05mL、10％APS 0.05mL、TEMDED 0.01mL；
浓缩胶：ddw 1.60mL、30％丙烯酰胺2.00mL、1.5mol/L Tris(pH8.8)1.30mL、 10％SDS 0.05mL、10％APS 0.05mL、TEMDED 0.01mL。
(4)10％7M尿素变性PAGE胶(10mL)：尿素4.20g、ddw 2.00mL、5×TBE 2.00mL、40％丙烯酰胺2.50mL、10％APS 0.075mL、TEMDED 0.01mL。
(5)LB液体培养基(100mL)：胰蛋白胨1g、酵母粉0.5g、NaCl 1g。
LB固体培养基(100mL)：胰蛋白胨1g、酵母粉0.5g、NaCl 1g、琼脂1.5g。
所涉及的试剂盒如下：
本发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明的精神和原则下进行的任何等同替换或局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国人民解放军南京军区福州总医院
<120> 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53及其筛选方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
agcagcacag aggtcagatg gcgctggata gcaagatcac gttatcatcg taaaccctat 60
gcgtgctacc gtgaa 75
<210> 2
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
agcagcacag aggtcagatg tgctggaatc aacacgatcg catcccggat gggctcctat 60
gcgtgctacc gtgaa 75
<210> 3
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
agcagcacag aggtcagatg cccatatgct actttgcaca catcctggat aggctcctat 60
gcgtgctacc gtgaa 75
<210> 4
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
agcagcacag aggtcagatg ccgtgcggat gtacagggac ttggatagtt tctgacctat 60
gcgtgctacc gtgaa 75
<210> 5
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
agcagcacag aggtcagatg caacgggtat aaccagatga tttggcgcca cgtaacctat 60
gcgtgctacc gtgaa 75

Claims (9)

1.一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53，其特征在于：它的序列如下所示：
AGCAGCACAG AGGTCAGATG GCGCTGGATA GCAAGATCAC 40
GTTATCATCG TAAACCCTAT GCGTGCTACC GTGAA 75；
在25℃，0.1M Na+，0.001M Mg2+条件下其二级结构为茎环结构，其分子结构如下：
2.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53，其特征在于：对所述核酸适配子A53的5'端或3'端进行FAM、Biotin或氨基化学修饰。
3.根据权利要求1或2所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53的筛选方法，其特征在于：基于核酸适配子的体外SELEX筛选技术，利用羧基磁珠作为固相介质，以NGAL为靶标，通过NGAL羧基磁珠从ssDNA库中筛选得到与NGAL特异性结合的核酸适配子。
4.根据权利要求3所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53的筛选方法，其特征在于：它包括以下步骤：
①包被NGAL的磁珠与ssDNA库孵育进行SELEX筛选，并从第三轮开始在每轮筛选之前加入裸磁珠进行前反筛，以此去除与磁珠非特异结合的ssDNA；
②孵育洗涤后的磁珠进行热洗脱，洗脱下来的ssDNA作为模板，加入带荧光修饰的上游引物P3与带PolyA尾的下游引物P4进行PCR扩增；
③PCR扩增产物用正丁醇浓缩后经10％7M尿素变性PAGE胶电泳，使得带荧光修饰的75nt的目的链与PolyA修饰的95nt的互补链分离；
④切取75nt位置带荧光的目的链条带进行胶回收、乙醇纯化，作为进行下一轮SELEX筛选的次级ssDNA库；
⑤将步骤④所得的次级ssDNA文库，作为下一轮筛选的次级文库，进行循环筛选；第8轮筛选后，以第8轮SELEX筛选后的产物库8ssDNA为模板，用P1和P2进行扩增、纯化，得纯化后的PCR扩增产物；接着对纯化后的PCR扩增产物进行TA克隆，之后随机挑取克隆菌落，进行测序；
其中，所述ssDNA库，两端为20nt的固定引物序列，中间35nt为随机序列，其序列为：
5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N35-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’；
所述引物P1、P2、P3、P4分别为：
引物P1：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’，
引物P2：5’-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’，
引物P3：5’-FAM-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’，
引物P4：
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-link-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53的应用，其特征在于：在分析检测NGAL的非疾病诊断中的应用。
6.根据权利要求5所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53的应用，其特征在于：利用所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53建立ELAA检测方法。
7.根据权利要求6所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53的应用，其特征在于：所述ELAA检测方法包括以下步骤：
①将NGAL抗体包被于96孔板上，用3％BSA封闭；
②在96孔板上再加入NGAL溶液孵育，洗涤；
③在96孔板上再加入生物素标记的NGAL核酸适配子A53孵育后洗涤，形成抗体-NGAL-核酸适配子A53夹心复合物三明治模型；
④在96孔板上再加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素孵育洗涤后，加入显色底物TMB使其显色，酶标仪450nM波长测OD值以反映NGAL的浓度。
8.根据权利要求1-4任意一项所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53的应用，其特征在于：在制备中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的纯化试剂中的应用。
9.根据权利要求1-4任意一项所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53的应用，其特征在于：在研制治疗中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白相关疾病药物中的应用。
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