CN107918021A - 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒 - Google Patents

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，包括七个储存组件，分别用于储存NGAL校准品、NGAL质控品、酶结合物工作液、磁珠工作液、清洗液、底物溶液和前处理试剂；磁珠工作液包括标记有NGAL抗体的羧基磁珠，酶结合物工作液包括碱性磷酸酶标记的抗NGAL抗体。本发明还公开了检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的检测方法。本发明公开的检测试剂盒，最低检测限为1ng/ml；线性范围为1‑300ng/ml，检测灵敏度高，线性范围宽，检测时长缩短至15分钟，并简化了检测步骤。

Description

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒。
背景技术
急性肾损伤(Acutekidneyinjury，AKI)是由多种原因引起的，可发生在各种临床情况下的一种复杂的肾功能减退综合征。它可以表现为血肌酐水平的轻微升高，也可以表现为急性肾衰竭。研究发现，AKI的发生与病死率的增加密切相关。这就要求医师在临床工作中能早期诊断，最好在肾小球滤过率开始下降，或者仅有组织损伤而肾小球滤过率尚正常的阶段及时发现并干预，以改善预后、降低病死率。血肌酐和尿量是目前AKI的诊断指标，但受到很多因素影响，敏感性和特异性都不高。因AKI诊断滞后，常贻误治疗的最佳时期。寻求具有高敏感性、特异性、易检测的新的生物标志物已经成为当前研究热点之一。
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(Neutrophil gelatinase-associatedlipoealin，NGAL)是迄今研究最多的AKI早期标志物之一。它最初在人类中性粒细胞中被发现，共价结合于源自中性粒细胞的明胶酶，是脂质运载蛋白超家族成员之一。正常情况下，NGAL只在肾脏、肝脏、胃和结肠等组织中以极低水平表达。当炎症发生或上皮细胞受到损伤性刺激时，NGAL才被诱导而发生高表达。早期动物实验发现，NGAL是通过微阵列基因表达谱分析检测到的最早、最稳定出现的蛋白质之一。并且，在AKI发生不在一项前瞻性研究中，对635例分别患有AKI、肾前性氮质血症、慢性肾疾病者或肾功能正常者测量NGAL及其他多种标志物。NGAL诊断AKI的敏感度为90％、特异度为99.5％，均优于其他标志物。另外，它在肾毒性(如使用顺铂、抑肽酶,冠状动脉造影术后)、肾血管病(如溶血尿毒综合征)及自身免疫病(如狼疮性肾炎)等所致的AKI中亦具早期诊断价值。目前认为，NGAL不仅是诊断AKI敏感的标志物，还有助于AKI与肾前性氮质血症、慢性肾疾病和正常肾功能的鉴别。AKI的发生与否，对脓毒症患者病情转归至关重要。研究发现，血NGAL水平在伴或不伴有AKI的全身炎性反应综合征、严重脓毒症及脓毒症休克患者都有升高，可能因为它是由活化的中性粒细胞所释放的，所以多种其他疾病及其并发症也可能使重症患者的NGAL测值升高，故特异性不高，而尿NGAL更有利于诊断，因为在脓毒症患者中，未发生AKI的患者其尿NGAL水平并不高。NGAL也是对AKI患者疾病严重程度和预后的评价指标。对需要接受肾替代治疗的AKI患者的研究发现，NGAL可作为其28d病死率的独立预测指标。以上研究表明，NGAL可作为AKI早期诊断的生物标志物。
中国专利CN104880562A)公开了用于检测肾小管细胞损伤和早发的方法和试剂盒，该试剂盒包括与尿样接触的介质，介质上附加有对作为肾小管细胞损伤生物标志物的NGAL特异且能够与NGAL复合的捕获抗体。检测方法为：尿样与NGAL捕获抗体结合，形成抗体-NGAL复合物，抗体-NGAL复合物与第二抗体结合，形成第二抗体复合物，检测第二抗体复合物中的第二抗体，第二抗体的量与尿样中NGAL的量成正比关系。该方法检测NGAL的检测时长需要数个小时，无法满足目前临床上需要快速得到患者NGAL含量的要求。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题是现有技术中检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测时长太长。进而提供一种检测快速且灵敏度高的检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的检测试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，包括
第一储液组件，用于储存NGAL校准品；
第二储液组件，用于储存酶结合物工作液；
第三储液组件，用于储存磁珠工作液；
第四储液组件，用于储存清洗液；
第五储液组件，用于储存底物溶液；
第六储液组件，用于储存前处理试剂；
第七储液组件，用于存储NGAL质控品。
可选的，所述磁珠工作液包括标记有NGAL抗体的羧基磁珠；所述磁珠的粒径为1-5μm。
可选的，所述标记有NGAL抗体的羧基磁珠的浓度为0.1-1mg/ml。
可选的，所述酶结合物工作液包括碱性磷酸酶标记的抗NGAL抗体。
可选的，所述碱性磷酸酶标记的抗NGAL抗体的浓度为0.5～2μg/ml。
可选的，所述NGAL校准品和所述NGAL质控品是含有NGAL抗原的Tris缓冲液。
可选的，所述底物溶液为酶促化学发光底物溶液。
可选的，所述前处理试剂是包括NaCl、蔗糖、甘油、吐温20以及防腐剂的缓冲液。
本发明提供一种检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的方法，使用所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒检测，包括如下步骤：
(1)将待测样本、NGAL校准品以及NGAL质控品分别加入到前处理试剂中，混匀后加入磁珠工作液、酶结合物工作液，混匀后37℃-42℃反应5min-10min，得到第一反应液；
(2)将所述第一反应液进行磁分离，收集磁珠；通过清洗液清洗所述磁珠；
(3)在清洗后的所述磁珠中加入底物溶液，得到混合液；检测所述混合液的发光强度。
可选的，所述待测样本、所述NGAL校准品或所述NGAL质控品与所述前处理试剂的比例为1:1。
可选的，所述磁珠工作液、所述酶结合物工作液与所述底物溶液的比例为1:1:2。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
1.本发明实施例提供的检测试剂盒使用化学发光法技术与磁珠结合检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，通过前处理试剂，酶结合物工作液、磁珠工作液以及底物溶液的配合，使得检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的最低检测限为1ng/ml；线性范围为1-300ng/ml，线性相关系数为r>0.99；；灵敏度高，线性范围宽。与现有技术相比，检测时间只有15min，大大缩短了检测时长。
2.本发明实施例提供的检测试剂盒包括前处理试剂，酶结合物工作液和磁珠工作液，无需对尿液样本进行过滤、离心或稀释等处理，加入前处理试剂，直接加入酶结合物工作液和磁珠工作液，简化了检测步骤，提高了检测效率。
3.本发明实施例提供的检测试剂盒提供了NGAL校准品和NGAL质控品，保证了检测结果的准确性。
4.本发明实施例提供的检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的方法，操作简单，检测时间短，灵敏度高，线性范围宽。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术。
实施例1
本实施例提供一种制备酶结合物的方法，包括以下步骤：
1.称取适量Traut′s试剂，用抗体活化缓冲液(100mM三乙醇胺缓冲液，pH8.5)配成成1.376mg/mL溶液。
2.称取适量Sulfo-SMCC试剂，用二甲基甲酰胺DMF配成浓度为17.5mg/mL溶液。
3.将NGAL标记抗体保存在抗体活化缓冲液(100mM三乙醇胺缓冲液，pH8.5)，浓度为2mg/mL；向该溶液中加入步骤1配制的Traut′s溶液，NGAL标记抗体与Traut′s试剂摩尔比为1:15，立刻混匀，25℃静置反应15分钟。
4.向碱性磷酸酶溶液(AP溶液，浓度为20mg/ml)中加入步骤2配制的Sulfo-SMCC溶液，碱性磷酸酶与Sulfo-SMCC摩尔比1：10，立刻混匀，25℃静置反应15分钟。
5.向步骤3活化反应结束得到的抗体溶液中加入1M的甘氨酸溶液，甘氨酸与Traut′s试剂的摩尔比为1:10，立刻混匀，25℃静置反应10分钟。
6.向步骤4活化反应结束得到的AP溶液中加入1M的甘氨酸溶液，甘氨酸与Sulfo-SMCC试剂的摩尔比为1:10，立刻混匀，25℃静置反应10分钟。
7.将步骤5反应结束的抗体溶液立刻脱盐，置换到交联缓冲液中(100mM三乙醇胺缓冲液，pH7.3)，紫外分光光度法测得抗体浓度；
8.将步骤6反应结束的AP溶液立刻脱盐，置换到交联缓冲液中(100mM三乙醇胺缓冲液，pH7.3)，紫外分光光度法测得AP浓度；
9.将步骤7活化好的抗体溶液与步骤8活化好的AP溶液混合，活化的NGAL标记抗体与活化的碱性磷酸酶的摩尔比为1：1，充分混匀，2～8℃静置反应18小时。
10.称取适量NEM试剂，用抗体活化缓冲液(100mM三乙醇胺缓冲液，pH7.3)配成成12.5mg/mL溶液。
11.向步骤9交联反应结束的溶液中加入百分之一体积步骤10配制的NEM溶液，充分混匀，25℃静置反应30分钟以封闭多余的巯基。
12.将步骤11终止反应结束的交联物溶液通过透析、脱盐或超滤浓缩等方式纯化。
13.将纯化后酶结合物浓缩液测定浓度，添加等体积甘油，充分混匀，-20℃保存备用。
实施例2
本实施例提供一种制备酶结合物的方法，包括以下步骤：
1.称取适量Traut′s试剂，用抗体活化缓冲液(100mM三乙醇胺缓冲液，pH8.5)配成成1.376mg/mL溶液。
2.称取适量Sulfo-SMCC试剂，用二甲基甲酰胺DMF配成浓度为17.5mg/mL溶液。
3.将NGAL标记抗体保存在抗体活化缓冲液(100mM三乙醇胺缓冲液，pH8.5)，浓度为5mg/mL；向该溶液中加入步骤1配制的Traut′s溶液，NGAL标记抗体与Traut′s试剂摩尔比为1:30，立刻混匀，25℃静置反应15分钟。
4.向碱性磷酸酶溶液(AP溶液，浓度为20mg/ml)中加入步骤2配制的Sulfo-SMCC溶液，碱性磷酸酶与Sulfo-SMCC摩尔比1：15，立刻混匀，25℃静置反应15分钟。
5.向步骤3活化反应结束得到的抗体溶液中加入1M的甘氨酸溶液，甘氨酸与Traut′s试剂的摩尔比为1:20，立刻混匀，25℃静置反应10分钟。
6.向步骤4活化反应结束得到的AP溶液中加入1M的甘氨酸溶液，甘氨酸与Sulfo-SMCC试剂的摩尔比为1:20，立刻混匀，25℃静置反应10分钟。
7.将步骤5反应结束的抗体溶液立刻脱盐，置换到交联缓冲液中(100mM三乙醇胺缓冲液，pH7.3)，紫外分光光度法测得抗体浓度；
8.将步骤6反应结束的AP溶液立刻脱盐，置换到交联缓冲液中(100mM三乙醇胺缓冲液，pH7.3)，紫外分光光度法测得AP浓度；
9.将步骤7活化好的抗体溶液与步骤8活化好的AP溶液混合，活化的NGAL标记抗体与活化的碱性磷酸酶的摩尔比为1：2，充分混匀，2～8℃静置反应24小时。
10.称取适量NEM试剂，用抗体活化缓冲液(100mM三乙醇胺缓冲液，pH7.3)配成成12.5mg/mL溶液。
11.向步骤9交联反应结束的溶液中加入百分之一体积步骤10配制的NEM溶液，充分混匀，25℃静置反应30分钟以封闭多余的巯基。
12.将步骤11终止反应结束的交联物溶液通过透析、脱盐或超滤浓缩等方式纯化。
13.将纯化后酶结合物浓缩液测定浓度，添加等体积甘油，充分混匀，-20℃保存备用。
实施例3
本实施例提供一种磁珠包被的方法，包括以下步骤
1.将NGAL包被抗体保存在pH5.0的100mMMES缓冲液，浓度为1mg/mL；
2.取100倍抗体重量的羧基磁珠溶液，羧基磁珠粒径为3μm，磁分离弃上清；
3.洗涤：用pH5.0的100mMMES缓冲液重新溶解上述步骤得到的磁珠，磁分离弃上清。
4.重复步骤3一次
5.加入适量100mMMES缓冲液溶解步骤4得到的磁珠。
6.称取适量NHS试剂，用pH5.0的100mMMES缓冲液溶解成浓度为10mg/mL的溶液；
7.称取适量EDC试剂，用pH5.0的100mMMES缓冲液溶解成浓度为10mg/mL的溶液；
8.向步骤5得到的磁珠溶液加入0.23倍磁珠重量的步骤6的NHS溶液和入0.1倍磁珠重量的步骤7的EDC溶液，在混匀仪上室温反应30分钟。
9.反应结束后的磁珠溶液磁分离，弃上清。
10.加入适量100mMMES缓冲液溶解步骤9得到的磁珠。
11.将步骤1的NGAL包被抗体加入到步骤10得到的磁珠中，NGAL包被抗体与羧基磁珠溶液质量比为1:100，在混匀仪上室温交联反应16小时)。
12.交联结束后，磁分离，上清收集测交联率。重复步骤3两次。
13.向步骤12得到的磁珠加入磁珠封闭液，混匀仪上室温反应16小时。
14.上述反应结束后的磁珠溶液磁分离，弃上清。
15.用磁珠清洗液洗涤磁珠3次。
16.洗涤后的磁珠重悬于磁珠保存液中，2～8℃保存备用。
实施例4
本实施例提供一种磁珠包被的方法，包括以下步骤：
1.将NGAL包被抗体保存在pH5.0的100mMMES缓冲液，浓度为5mg/mL；
2.取200倍抗体重量的羧基磁珠溶液，羧基磁珠粒径为1.5μm，磁分离弃上清；
3.洗涤：用pH5.0的100mMMES缓冲液重新溶解上述步骤得到的磁珠，磁分离弃上清。
4.重复步骤3一次
5.加入适量100mMMES缓冲液溶解步骤4得到的磁珠。
6.称取适量NHS试剂，用pH5.0的100mMMES缓冲液溶解成浓度为10mg/mL的溶液；
7.称取适量EDC试剂，用pH5.0的100mMMES缓冲液溶解成浓度为10mg/mL的溶液；
8.向步骤5得到的磁珠溶液加入0.23倍磁珠重量的步骤6的NHS溶液和入0.1倍磁珠重量的步骤7的EDC溶液，在混匀仪上室温反应30分钟。
9.反应结束后的磁珠溶液磁分离，弃上清。
10.加入适量100mMMES缓冲液溶解步骤9得到的磁珠。
11.将步骤1的NGAL包被抗体加入到步骤10得到的磁珠中，NGAL包被抗体与羧基磁珠溶液质量比为1:200，在混匀仪上室温交联反应24小时。
12.交联结束后，磁分离，上清收集测交联率。重复步骤3两次。
13.向步骤12得到的磁珠加入磁珠封闭液，混匀仪上室温反应24小时。
14.上述反应结束后的磁珠溶液磁分离，弃上清。
15.用磁珠清洗液洗涤磁珠3次。
16.洗涤后的磁珠重悬于磁珠保存液中，2～8℃保存备用。
实施例5
本实施例提供一种检测试剂盒，包括第一储液组件、第二储液组件、第三储液组件、第四储液组件、第五储液组件、第六储液组件、第七储液组件。其中，第一储液组件用于储存NGAL校准品，第二储液组件用于储存酶结合物工作液，第三储液组件用于储存磁珠工作液，第四储液组件用于储存清洗液，第五储液组件用于储存底物溶液，第六储液组件用于储存前处理试剂，第七储液组件用于存储NGAL质控品。
作为本发明的一个实施例，磁珠工作液包括标记有NGAL抗体的羧基磁珠；磁珠的粒径为3μm，标记有NGAL抗体的羧基磁珠的浓度为0.5mg/ml；酶结合物工作液包括碱性磷酸酶标记的抗NGAL抗体，碱性磷酸酶标记的抗NGAL抗体的浓度为2μg/ml；NGAL校准品和NGAL质控品是含有NGAL抗原的HEPES溶液；底物溶液为酶促化学发光底物溶液；前处理试剂是包括NaCl、蔗糖、甘油、吐温20以及防腐剂的缓冲液。
本实施例提供一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒组分配置方法，具体如下：
1.校准品及质控品配置
将NGAL抗原通过溯源确定浓度，用校准品稀释液稀释配制NGAL校准品和NGAL质控品。例如校准品的浓度分别为：5，10，20，40，80，160ng/ml，质控品浓度为100ng/ml。
校准品稀释液的具体成分为：50mMHEPES,250mmol/LNaCl、1％BSA和1％防腐剂，pH为7.5；防腐剂优选为Proclin-300。
2.前处理试剂
前处理试剂是缓冲液,含有100mMTris；150mMNaCl；5％蔗糖；5％甘油；0.1％BSA和0.15％防腐剂；防腐剂优选为Proclin-300。
3.酶结合物工作液
将实施例1或实施例2中的酶结合物浓缩液用酶结合物稀释液稀释，配制成适宜浓度的试剂盒用酶结合物工作液，酶结合物工作液浓度为2μg/ml。酶结合物稀释液具体成分为：50mMMES、250mmol/L NaCl、1％BSA、5％蔗糖、5％甘油、0.1％吐温20、0.15mmol/LZnCl2、0.15mmol/LMgCl2和0.15％防腐剂，pH为pH6.5；防腐剂优选为Proclin-300。
4.磁珠工作液(M)
将实施例3或实施例4中的磁珠保存液用磁珠稀释液稀释，配制成适宜浓度的试剂盒用磁珠工作液，磁珠工作液浓度为0.5mg/ml。磁珠稀释液具体成分为：50mM的HEPES、250mmol/LNaCl、1％BSA、1％蔗糖、1％明胶、0.1％吐温20、1％PVP360和3％防腐剂，pH为8.0；防腐剂优选为Proclin-300。
5.底物溶液
准确称取3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(AMPPD)0.5g、三羟甲基氨基甲烷18g、NaCl100g、十六烷基三甲基氯化铵0.02g、水定容至1000mL，调整化学发光底物溶液pH为9.4±0.05；本化学发光底物为针对碱性磷酸酶的环二氧乙烷类底物，需要再2～8℃条件下避光保存，用时缓慢混匀。
6.清洗液
依次向容器内加入三羟甲基氨基甲烷1211.4mg，NaCl9g，吐温201g，水900mL，混匀至各组分溶解，用氢氧化钠溶液调节溶液pH至8.0±0.5，补加水定容至1000mL，混匀30分钟，0.22μm过滤即得到清洗液。
实施例6
本实施例提供一种检测试剂盒，包括第一储液组件、第二储液组件、第三储液组件、第四储液组件、第五储液组件、第六储液组件、第七储液组件。其中，第一储液组件用于储存NGAL校准品，第二储液组件用于储存酶结合物工作液，第三储液组件用于储存磁珠工作液，第四储液组件用于储存清洗液，第五储液组件用于储存底物溶液，第六储液组件用于储存前处理试剂，第七储液组件用于存储NGAL质控品。
作为本发明的一个实施例，磁珠工作液包括标记有NGAL抗体的羧基磁珠；磁珠的粒径为3μm，标记有NGAL抗体的羧基磁珠的浓度为0.1mg/ml；酶结合物工作液包括碱性磷酸酶标记的抗NGAL抗体，碱性磷酸酶标记的抗NGAL抗体的浓度为0.5μg/ml；NGAL校准品和NGAL质控品是含有NGAL抗原的HEPES溶液；底物溶液为酶促化学发光底物溶液；前处理试剂是包括NaCl、蔗糖、甘油、吐温20以及防腐剂的缓冲液。
本实施例提供一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒组分配置方法，具体如下：
1.校准品及质控品配置
将NGAL抗原通过溯源确定浓度，用校准品稀释液稀释配制NGAL校准品和NGAL质控品。例如校准品的浓度分别为：1，10，20，40，80，160ng/ml，质控品浓度为100ng/ml。
校准品稀释液的具体成分为：50mMHEPES,250mmol/LNaCl、1％BSA和1％防腐剂，pH为7.5；防腐剂优选为Proclin-300。
2.前处理试剂
前处理试剂是缓冲液,含有100mMTris；150mMNaCl；5％蔗糖；5％甘油；0.1％BSA和0.15％防腐剂；防腐剂优选为Proclin-300。
3.酶结合物工作液
将实施例1或实施例2中的酶结合物浓缩液用酶结合物稀释液稀释，配制成适宜浓度的试剂盒用酶结合物工作液，酶结合物工作液浓度为0.5μg/ml。酶结合物稀释液具体成分为：20mMMES、250mmol/L NaCl、1％BSA、5％蔗糖、5％甘油、0.1％吐温20、0.15mmol/LZnCl2、0.15mmol/LMgCl2和0.15％防腐剂，pH为pH6.5；防腐剂优选为Proclin-300。
4.磁珠工作液(M)
将实施例2中的磁珠保存液用磁珠稀释液稀释，配制成适宜浓度的试剂盒用磁珠工作液，磁珠工作液浓度为0.1mg/ml。磁珠稀释液具体成分为：20mM的HEPES、250mmol/LNaCl、1％BSA、1％蔗糖、1％明胶、0.1％吐温20、1％PVP360和3％防腐剂，pH为8.0；防腐剂优选为Proclin-300。
5.底物溶液
准确称取3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(AMPPD)0.5g、三羟甲基氨基甲烷18g、NaCl100g、十六烷基三甲基氯化铵0.02g、水定容至1000mL，调整化学发光底物溶液pH为9.4±0.05；本化学发光底物为针对碱性磷酸酶的环二氧乙烷类底物，需要再2～8℃条件下避光保存，用时缓慢混匀。
6.清洗液
依次向容器内加入三羟甲基氨基甲烷1211.4mg，NaCl9g，吐温201g，水900mL，混匀至各组分溶解，用氢氧化钠溶液调节溶液pH至8.0±0.5，补加水定容至1000mL，混匀30分钟，0.22μm过滤即得到清洗液。
实施例7
本实施例提供一种检测试剂盒，包括第一储液组件、第二储液组件、第三储液组件、第四储液组件、第五储液组件、第六储液组件、第七储液组件。其中，第一储液组件用于储存NGAL校准品，第二储液组件用于储存酶结合物工作液，第三储液组件用于储存磁珠工作液，第四储液组件用于储存清洗液，第五储液组件用于储存底物溶液，第六储液组件用于储存前处理试剂，第七储液组件用于存储NGAL质控品。
作为本发明的一个实施例，磁珠工作液包括标记有NGAL抗体的羧基磁珠；磁珠的粒径为3μm，标记有NGAL抗体的羧基磁珠的浓度为1mg/ml；酶结合物工作液包括碱性磷酸酶标记的抗NGAL抗体，碱性磷酸酶标记的抗NGAL抗体的浓度为1μg/ml；NGAL校准品和NGAL质控品是含有NGAL抗原的HEPES溶液；底物溶液为酶促化学发光底物溶液；前处理试剂是包括NaCl、蔗糖、甘油、吐温20以及防腐剂的缓冲液。
本实施例提供一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒组分配置方法，具体如下：
1.校准品及质控品配置
将NGAL抗原通过溯源确定浓度，用校准品稀释液稀释配制NGAL校准品和NGAL质控品。例如校准品的浓度分别为：1，10，20，40，80，160ng/ml，质控品浓度为100ng/ml。
校准品稀释液的具体成分为：50mMHEPES,250mmol/LNaCl、1％BSA和1％防腐剂，pH为7.5；防腐剂优选为Proclin-300。
2.前处理试剂
前处理试剂是缓冲液,含有100mMTris；150mMNaCl；5％蔗糖；5％甘油；0.1％BSA和0.15％防腐剂；防腐剂优选为Proclin-300。
3.酶结合物工作液
将实施例1或实施例2中的酶结合物浓缩液用酶结合物稀释液稀释，配制成适宜浓度的试剂盒用酶结合物工作液，酶结合物工作液浓度为1μg/ml。酶结合物稀释液具体成分为：30mMMES、250mmol/LNaCl、1％BSA、5％蔗糖、5％甘油、0.1％吐温20、0.15mmol/L ZnCl2、0.15mmol/LMgCl2和0.15％防腐剂，pH为pH6.5；防腐剂优选为Proclin-300。
4.磁珠工作液(M)
将实施例2中的磁珠保存液用磁珠稀释液稀释，配制成适宜浓度的试剂盒用磁珠工作液，磁珠工作液浓度为1mg/ml。磁珠稀释液具体成分为：30mM的HEPES、250mmol/LNaCl、1％BSA、1％蔗糖、1％明胶、0.1％吐温20、1％PVP360和3％防腐剂，pH为8.0；防腐剂优选为Proclin-300。
5.底物溶液
准确称取3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(AMPPD)0.5g、三羟甲基氨基甲烷18g、NaCl100g、十六烷基三甲基氯化铵0.02g、水定容至1000mL，调整化学发光底物溶液pH为9.4±0.05；本化学发光底物为针对碱性磷酸酶的环二氧乙烷类底物，需要再2～8℃条件下避光保存，用时缓慢混匀。
6.清洗液
依次向容器内加入三羟甲基氨基甲烷1211.4mg，NaCl9g，吐温201g，水900mL，混匀至各组分溶解，用氢氧化钠溶液调节溶液pH至8.0±0.5，补加水定容至1000mL，混匀30分钟，0.22μm过滤即得到清洗液。
实施例8
本实施例提供利用实施例5-7任一试剂盒检测尿液中中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的含量，具体步骤如下：
1.分别加25μlNGAL校准品、NGAL质控品和尿液样本至对应的试管中；
2.每个试管中加入25μl前处理试剂混匀；
3.每个试管中加入50μl酶结合物工作液和50μl磁珠工作液后混匀；42℃反应5min，得到第一反应液；
4.将上述第一反应液进行磁分离，收集磁珠；每个试管中加入300μl清洗液清洗磁珠，重复3-5次，去除清洗液；
5.每个试管中加入100μl底物溶液，混匀后检测发光值。
实施例9
本实施例提供利用实施例5-7任一试剂盒检测尿液中中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的含量，具体步骤如下：
1.分别加25μlNGAL校准品、NGAL质控品和尿液样本至对应的试管中；
2.每个试管中加入25μl前处理试剂混匀；
3.每个试管中加入50μl酶结合物工作液和50μl磁珠工作液后混匀；37℃反应10min，得到第一反应液；
4.将上述第一反应液进行磁分离，收集磁珠；每个试管中加入300μl清洗液清洗磁珠，重复3-5次，去除清洗液；
5.每个试管中加入100μl底物溶液，混匀后检测发光值。
实验例1线性验证
取试剂盒中标准品或者质控品，每点测定3次，取平均值，结果与预期浓度作回归直线，计算得到回归系数r＞0.99，说明本发明提供的试剂盒的稀释线性好。
实验例2精密度验证
取具有溯源性的尿液高值质控品、低值质控品各一份，对每份质控品进行10次检测，将共10次检测结果计算平均值、标准值。根据变异系数CV＝(标准偏差/平均值)×100％，计算得到：CV1(100ng/mL)＝3％，CV2(20ng/mL)＝3％。由此可知，本发明提供的试剂盒具有较高的精密度。
实验例3灵敏度验证、
取具有溯源性的质控品稀释至检测范围下限(1ng/mL)附近进行测定，重复测定3次，计算平均值，后与质控品靶值进行对照。结果显示，本发明的试剂盒检测值与靶值接近，说明本发明提供的试剂盒具有较高的灵敏度。
实验例4检测范围验证
取具有溯源性的标准品，稀释不同的倍数后分别检测是否有发光现象，结果显示，在浓度为1-300ng/ml的范围内，均有发光现象，表明本发明的试剂盒检测范围为1-300ng/ml。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (11)

1.一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，包括
第一储液组件，用于储存NGAL校准品；
第二储液组件，用于储存酶结合物工作液；
第三储液组件，用于储存磁珠工作液；
第四储液组件，用于储存清洗液；
第五储液组件，用于储存底物溶液；
第六储液组件，用于储存前处理试剂；
第七储液组件，用于存储NGAL质控品。
2.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述磁珠工作液包括标记有NGAL抗体的羧基磁珠；所述磁珠的粒径为1-5μm。
3.根据权利要求2所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述标记有NGAL抗体的羧基磁珠的浓度为0.1～1mg/ml。
4.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述酶结合物工作液包括碱性磷酸酶标记的抗NGAL抗体。
5.根据权利要求4所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记的抗NGAL抗体的浓度为0.5～2μg/ml。
6.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述NGAL校准品和所述NGAL质控品是含有NGAL抗原的Tris缓冲液。
7.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述底物溶液为酶促化学发光底物溶液。
8.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述前处理试剂是包括NaCl、蔗糖、甘油、吐温20以及防腐剂的缓冲液。
9.一种检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的方法，其特征在于，使用权利要求1-8任一项所述的检测试剂盒检测，包括如下步骤：
(1)将待测样本、NGAL校准品以及NGAL质控品分别加入到前处理试剂中，混匀后加入磁珠工作液、酶结合物工作液，混匀后37℃-42℃反应5min-10min，得到第一反应液；
(2)将所述第一反应液进行磁分离，收集磁珠；通过清洗液清洗所述磁珠；
(3)在清洗后的所述磁珠中加入底物溶液，得到混合液；检测所述混合液的发光强度。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述待测样本、所述NGAL校准品或所述NGAL质控品与所述前处理试剂的比例为1:1。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述磁珠工作液、所述酶结合物工作液与所述底物溶液的比例为1:1:2。
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