CN105510591A - 一种利用抗体修饰免疫pcr反应的检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于免疫学检测方法领域，目的在于提供一种利用抗体修饰免疫PCR反应的检测试剂盒及检测方法，该方法包括DIBO标记ssDNA的合成、Insulin单克隆抗体的生物素修饰、Insulin单克隆抗体的ssDNA修饰Immuno-PCR微孔板的制备、Insulin的Immuno-PCR标准曲线的制定等步骤。本发明通过抗体修饰技术在免疫PCR反应中的应用，可以进行超低浓度生物素标志物的检测，可以超过传统ELISA方法1000倍的灵敏度可以允许检测浓度极低的生物标志物。
Description
技术领域
本发明属于免疫学检测方法领域，具体涉及一种利用抗体修饰免疫PCR反应的检测试剂盒及检测方法。
背景技术
ELISA检测技术从其发明之日起就在临床和科研市场中得到越来越广泛的应用(Lequin,R.M.(2005).EnzymeImmunoassay(EIA)/Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay(ELISA).ClinicalChemistry51,2415–2418.)。随着越来越精细的检测需求，终端用户在体外诊断的灵敏度、动态范围和多通道检测能力等方面有了越来越高的要求。基于抗体检测的技术也越来越多样化，出现了很多新技术。根据技术路线和需求的不同分为以下几类：
1.灵敏度的提升。经过多年的技术升级和成熟，目前ELISA技术的灵敏度已经达到极限。现有的尝试也都是基于检测方法的改进来提升灵敏度，比如采用创新型微孔板技术的SiloamBiosciences公司(http://siloambio.com/)和应用微珠技术的Quanterix公司(http://www.quanterix.com/)。
2.多通道检测。Luminex公司发明的像xMAPMultiplexing技术理论上可以最多支持500种分析物的同时检测(http://www.luminexcorp.com/TechnologiesScience/xMAPTechnology/)。这种技术也是利用barcode的微珠标记上不同抗体来检测样本中的多种分析物。实际开发中可以达到20种左右的生物标志物同时检测。
3.液相ELISA技术(Bidinosti,M.,Shimshek,D.R.,Mollenhauer,B.,Marcellin,D.,Schweizer,T.,Lotz,G.P.,Schlossmacher,M.G.,andWeiss,A.(2012).Novelone-stepimmunoassaystoquantifyá-synuclein:applicationsforbiomarkerdevelopmentandhigh-throughputscreening.J.Biol.Chem.287,33691–33705.)。
将检测抗原的两种单抗分别标记不同的微珠或者荧光基团，利用抗体和抗原结合时将两种不同的微珠靠近或者荧光基团发生共振能量转移(FRET)可以实现被检标志物的液相检测。这种检测方法不再需要多步清洗而直接检测，减少了检测时间和自动化的难度。
4.ELISA技术微型化(Ng,A.H.C.,Uddayasankar,U.,andWheeler,A.R.(2010).Immunoassaysinmicrofluidicsystems.AnalBioanalChem397,991–1007.)。很多研究将ELISA微型化至微流体芯片上从而实现ELISA实验的微型化和便携性。
上述ELISA的改进都是在现有原理的基础上进行优化，因此也很难带来本质性的性能提升。Immuno-PCR的工作原理如图1所示。Immuno-PCR(免疫PCR)技术自1992年Sano等人发明以来(Sano,T.,Smith,C.L.,andCantor,C.R.(1992).Immuno-PCR:verysensitiveantigendetectionbymeansofspecificantibody-DNAconjugates.Science258,120–122.)，曾经一度被认为是可以像PCR一样检测蛋白质的技术，可惜受制于抗体修饰技术而一直未能获得商业上的成功。多年来抗体修饰一直依赖于间接修饰技术和直接化学修饰技术。前一种技术利用生物素Biotin随机修饰抗体表面，然后在通过链亲和素(Streptavidin)将Biotin修饰的DNA和抗体以非共价键的方式耦联。后一种是通过将抗体或者DNA活化之后与DNA或者抗体上的自由氨基反应达到共价耦联。不过不论哪种方法都是通过抗体上自由的氨基(比如Lysine)来实现的。这种耦联技术不但需要抗体在非活性的缓冲液中进行耦联，而且耦联的位点也充满随机性，常常由于抗原抗体结合区附近被耦联的DNA屏蔽从而导致了抗体特异性和亲和力的下降。这也是Immuno-PCR这么多年来在实例中灵敏度难以突破1000倍而且提升程度不一的原因。因此，科研和生产中均需要一种利用抗体修饰技术应用于Immuno-PCR反应的、灵敏度大大提高的检测试剂盒和检测方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用抗体修饰免疫PCR反应的检测试剂盒及检测方法，该方法通过抗体修饰技术在免疫PCR反应中的应用，可以进行超低浓度生物素标志物的检测。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种利用抗体修饰免疫PCR反应检测试剂盒，包括：带DIBO标记的核酸修饰的检测抗体、包被有带DIBO标记的生物素修饰的捕捉抗体的Immuno-PCR微孔板、用于扩增核酸的引物对、荧光定量染料混合体系。
进一步地，所述核酸为ssDNA；该ssDNA的DNA序列包括SEQIDNo.1，用于扩增该ssDNA的引物对的DNA序列包括SEQIDNo.2和SEQIDNo.3。
进一步地，所述荧光定量染料混合体系包括：耐热聚合酶反应缓冲液、镁离子、dNTP、参考染料、PCR扩增用DNA聚合酶、DNA结合染料。
本发明的目的是通过以下另一技术方案实现的：
一种利用抗体修饰免疫PCR反应检测方法，包括如下步骤：
DIBO标记ssDNA的合成步骤：先通过DNA序列随机合成网站生产ssDNA序列(SEQIDNo.1)，再合成带DIBO标记的ssDNA；
捕捉抗体的生物素修饰步骤：将捕捉抗体利用带DIBO标记的生物素进行生物素修饰，得到带DIBO标记的生物素修饰的捕捉抗体；
检测抗体的ssDNA修饰步骤：将检测抗体利用所述带DIBO标记的ssDNA进行ssDNA修饰，得到带DIBO标记的ssNDA修饰的检测抗体；
Immuno-PCR微孔板的制备步骤：用所述带DIBO标记的生物素修饰的捕捉抗体包被链亲和素PCR微孔板，再将该微孔板经过孵育、清洗，得到Immuno-PCR微孔板；
待测样品的Immuno-PCR定量步骤：
将待测样品和所述带DIBO标记的ssNDA修饰的检测抗体混合之后，加入所述Immuno-PCR微孔板中；再经过孵育、清洗，加入能够特异扩增ssDNA的引物对(SEQIDNo.2和3)进行荧光定量PCR反应，再完成ssDNA的PCR定量。
进一步地，所述捕捉抗体为Insulin单克隆抗体3A6，所述检测抗体为Insulin单克隆抗体8E2，所述待测样品为Insulin。
进一步地，所述捕捉抗体的生物素修饰步骤中，先将捕捉抗体进行第一轮纯化处理，再加入修饰酶进行修饰反应，再进行第二轮纯化处理，得到第二轮纯化后的捕捉抗体；再将所述第二轮纯化后的捕捉抗体与于DIBO标记的生物素进行生物素标记反应，再进行亲和纯化处理，得到所述带DIBO标记的生物素修饰的捕捉抗体。
进一步地，所述检测抗体的ssDNA修饰步骤中，先将检测抗体进行第一轮纯化处理，再加入修饰酶进行修饰反应，再进行第二轮纯化处理，得到第二轮纯化后的检测抗体；再将所述第二轮纯化后的检测抗体与于DIBO标记的ssDNA进行ssDNA标记反应，再进行亲和纯化处理，得到所述带DIBO标记的ssDNA修饰的检测抗体。
进一步地，所述待测样品的Immuno-PCR定量步骤中，所述荧光定量PCR反应的条件是：95℃10分钟；95℃15秒，60℃60秒，共40个循环。
本发明的目的是通过以下另一技术方案实现的：
一种用于标记抗体的ssDNA，其DNA序列包括SEQIDNo.1。
本发明的目的是通过以下另一技术方案实现的：
一种用于扩增ssDNA的PRC引物对，其序列包括SEQIDNo.2和SEQIDNo.3。
本发明的Immuno-PCR检测方法的工作原理图如图1所示。
本发明的Immuno-PCR试剂盒的制备、使用流程图如图2所示。
本发明相比现有技术具有以下有益效果：
本发明公开了一种超高灵敏度免疫诊断方法及其应用，属于临床诊断试剂开发领域。
1、本发明用于科研和临床诊断，食品安全，农残检测等市场。超过传统ELISA方法1000倍的灵敏度可以允许检测浓度极低的生物标志物，农药残留。或者可以对已有的样本进行100-1000倍稀释之后再进行检测，从而极大程度地节省珍贵的样本，比如小儿血清或者临床PKPD(药代动力学)研究中的珍贵血清。
2、本发明不但可以用于Insulin的检测，而且可以适用于所有生物大分子，半抗原，以及化学小分子的检测。检测形式不但可以适用于夹心法ELISA，还可以应用于直接ELISA和竞争ELISA法。酶学方法修饰抗体属于位点特异性修饰反应，有别于传统氨基耦联方法产生的非均一性，随机位点修饰。随机修饰会经常屏蔽抗原抗体结合区，改变抗体亲和力和特异性。定量PCR检测方法的引入不但可以简化检测流程，还可以提供更加宽广的动态范围和检测灵敏度。Insulin的实例研究表明动态范围可以提升至至少7个数量级，检测灵敏度可以比传统ELISA提高10000倍左右。
3、本发明采用最新的一种酶学修饰抗体的方法(Boeggeman,E.,Ramakrishnan,B.,Pasek,M.,Manzoni,M.,Puri,A.,Loomis,K.H.,Waybright,T.J.,andQasba,P.K.(2009).SitespecificconjugationoffluoroprobestotheremodeledFcN-glycansofmonoclonalantibodiesusingmutantglycosyltransferases:Applicationforcellsurfaceantigendetection.BioconjugChem20,1228–1236.)对抗体进行位点特异性修饰，使得修饰的基团，比如核酸片段，可以特异地被嫁接到抗体的非抗原结合区，极大地减少了影响抗原抗体结合特异性和亲和力的可能性。修饰之后的抗体可用于通常的Immuno-PCR的检测，检测灵敏度可以稳定地提高1000倍以上。通过对Insulin的检测结果以及其与传统ELISA方法的对比结果表明，经过酶学修饰方法标记DNA的抗体可以成功地用于Immuno-PCR，灵敏度提升接近10000倍。
4、本发明可以成为一种新一代超高灵敏度的免疫诊断定量方法，可以适用于科研和临床市场，为这些领域的客户开展超低浓度的生物标志物的检测，或者对珍贵样本进行大量稀释之后再采用本发明的Immuno-PCR方法来检测。
附图说明
图1：Immuno-PCR检测方法的工作原理示意图。
图2：Immuno-PCR检测试剂盒的制备、使用流程示意图。
图3：实施例3中Insulin的免疫PCR检测中的7种标准品的实时荧光数据。7种标准品的浓度分别为33ng/ml，3.3ng/ml，0.33ng/ml，0.03ng/ml，0.003ng/ml，0.0003ng/ml，0.00003ng/ml。
图4：实施例4中Insulin传统ELISA和免疫PCR的标准曲线对比图。传统ELISA的标准曲线各浓度分别是6.9ng/ml，3.75ng/ml，1.25ng/ml，0.5ng/ml，0.188ng/ml。
具体实施方式
一种利用抗体修饰免疫PCR反应检测试剂盒，包括：带DIBO标记的ssNDA修饰的检测抗体、包被有带DIBO标记的生物素修饰的捕捉抗体Immuno-PCR微孔板、用于扩增ssDNA的引物对、荧光定量染料混合体系；上述ssNDA的DNA序列为SEQIDNo.1，用于扩增ssDNA的引物对的序列为SEQIDNo.2和SEQIDNo.3。
上述荧光定量染料混合体系包括：710μL的无核酸酶无蛋白酶的双蒸水；200μL的耐热聚合酶反应缓冲液(含镁离子)，是PCR扩充反应需要的缓冲液体系；25μL的dNTPmix(各10mM)；40μL的参考染料，定量PCR荧光信号参考；10μL的PCR扩增用DNA聚合酶；10μL的DNA结合染料，用于定量PCR反应产生的DNA量。该荧光定量染料混合体系也可以直接购买成品，如Fermentas公司的SybrGreen2XMasterMix产品。
一种利用抗体修饰免疫PCR反应检测方法，包括如下步骤：
步骤一、DIBO标记ssDNA的合成：先通过DNA序列随机合成网站生产ssDNA序列(SEQIDNo.1)，再合成带DIBO标记的ssDNA；
具体地说，本步骤通过DNA序列随机合成网站(http://www.facmlty.ucr.edu/～mmaduro/random.htm)生产一段长度100bp的随机序列：
5’-ATGGGGCTGGATAAAACTGCCCTGGTGACCGCCATCAACAACCCGAATACGTGGCATTTCAGGAGGCGGCCGGAGGGGGGATGTTTTCTACTATTCGAGG-3’(SEQIDNo.1)。再通过blastn检索程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)确定该序列没有任何已知序列与其同源，以保证后续PCR反应检测信号是来自抗体结合量的特异信息；确定ssDNA的序列之后，通过IDT(www.idtdna.com)来合成DIBO标记ssDNA。
步骤二、捕捉抗体的生物素修饰：将捕捉抗体利用带DIBO的生物素进行生物素修饰，得到带DIBO标记的生物素修饰的捕捉抗体；
本步骤中，先将捕捉抗体进行第一轮纯化处理，再加入修饰酶进行修饰反应，再进行第二轮纯化处理，得到第二轮纯化后的捕捉抗体；再将所述第二轮纯化后的捕捉抗体与于DIBO标记的生物素进行生物素标记反应，再进行亲和纯化反应，得到所述带DIBO标记的生物素修饰的捕捉抗体。
步骤三、检测抗体的ssDNA修饰：将检测抗体利用所述带DIBO标记的ssDNA进行ssDNA修饰，得到带DIBO标记的ssNDA修饰的检测抗体；
本步骤中，先将检测抗体进行第一轮纯化处理，再加入修饰酶进行修饰反应，再进行第二轮纯化处理，得到第二轮纯化后的检测抗体；再将所述第二轮纯化后的检测抗体与于DIBO标记的ssDNA进行ssDNA标记反应，再进行亲和纯化反应，得到所述带DIBO标记的ssDNA修饰的检测抗体。
具体地说，上述步骤二和步骤三将来自Abcam公司的两种Insulin单克隆抗体8E2(ab1967)和3A6(ab1965)，分别进行ssDNA修饰和生物素修饰。抗体修饰采用LifeTechnologies公司的SiteClick系列标记试剂盒(S10467)，该试剂盒基于的实验原理来自Boeggeman等人的发现(Boeggeman,E.,Ramakrishnan,B.,Pasek,M.,Manzoni,M.,Puri,A.,Loomis,K.H.,Waybright,T.J.,andQasba,P.K.(2009).SitespecificconjugationoffluoroprobestotheremodeledFcN-glycansofmonoclonalantibodiesusingmutantglycosyltransferases:Applicationforcellsurfaceantigendetection.BioconjugChem20,1228–1236.)；DIBO-Biotin也来自LifeTechnologies公司。修饰反应在按照试剂盒说明书的条件下进行；所有抗体的纯化采用的是Roche公司的ProteinAAgarose；洗脱抗体用的是250mM甘氨酸(Glycine)溶液(该溶液已用HCl溶液调整pH值至1.8)，之后用1.5M的Tris缓冲液(该缓冲液已用HCl溶液调整pH值至11)中和。
步骤四、Immuno-PCR微孔板的制备：
用所述带DIBO标记的生物素修饰的捕捉抗体包被链亲和素PCR微孔板，再将该微孔板经过孵育、清洗，得到Immuno-PCR微孔板；
具体地说，本步骤经过生物素修饰的抗体3A6包被在链亲和素PCR微孔板(Pierce公司，CatNo.15500)上：经过过夜12小时抗体孵育的微孔板经过三次PBST缓冲液(1xPBS，0.1％Tween20)清洗，再用PBST-BSA缓冲液(1×PBS，0.1％Tween20，5％BSA)孵育过夜，之后再用PBST缓冲液清洗三次。
步骤五、待测样品的Immuno-PCR定量：
将待测样品Insulin和所述带DIBO标记的ssNDA修饰的检测抗体混合之后，加入所述Immuno-PCR微孔板中；再经过孵育、清洗，加入能够特异扩增ssDNA的引物对(SEQIDNo.2和3)进行荧光定量PCR反应，反应的条件是95℃10分钟；95℃15秒，60℃60秒，共40个循环；再完成ssDNA的PCR定量。
ssDNA的PCR定量可以如此实现：先用梯度稀释的待测样品的标准品制定Immuno-PCR标准曲线，之后在该标准曲线上读取该待测样品对应的数值。
具体地说，本步骤中将梯度稀释的人Insulin标准品(10mg/mL,Sigma公司)和ssDNA修饰的抗体8E2混合之后加入包被了抗体3A6的微孔板，室温900rpm孵育1.5小时。标准品的浓度从33ng/ml到3.3x10E-5ng/ml10倍等比稀释，共有7个不同的浓度。孵育之后用PBST缓冲液清洗6遍；然后加入SybrGreen2XMasterMix(Fermentas公司)和能够特异扩增ssDNA的引物对(SEQIDNo.2和3)；之后微孔板进入StepOne荧光定量PCR仪(LifeTechnologies公司)完成ssDNA的PCR定量。
上述荧光定量染料混合体系包括：710μL的无核酸酶无蛋白酶的双蒸水；200μL的耐热聚合酶反应缓冲液(含镁离子)，是PCR扩充反应需要的缓冲液体系；25μL的dNTPmix(各10mM)；40μL的参考染料，定量PCR荧光信号参考；10μL的PCR扩增用DNA聚合酶；10μL的DNA结合染料，用于定量PCR反应产生的DNA量。该荧光定量染料混合体系也可以直接购买成品，如Fermentas公司的SybrGreen2XMasterMix产品。
上述荧光定量PCR反应的条件是：95℃10分钟；95℃15秒，60℃60秒，共40个循环。
本发明的具体实施例中，还可以采用以下步骤将本发明的检测方式与传统ELISA检测方法进行比较，包括以下步骤：
Insulin传统ELISA检测的标准曲线制定步骤：
具体地说，本步骤采用Alpco公司的MouseUltrasensitiveInsulinELISA试剂盒进行Insulin的ELISA标准曲线的制定。按照试剂盒说明书准备标准品与微孔板孵育，然后再清洗加入显色底物，最终在InfiniteM200(Tecan)上读取OD450nm的数据。
标准曲线的分析步骤：
具体地说，本步骤ELISA标准曲线采用Logistic5parameter在R软件的packagedrc中进行分析，绘制标准曲线。定量PCR原始数据导出之后也在R软件中用drc进行logistic5parameter拟合，计算5％最大响应值时的PCR循环数作为Ct。
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照试剂制造厂家所建议的条件。
实施例1：Insulin抗体3A6的生物素修饰
来自Abcam公司的Insulin单克隆抗体3A6(ab1965)需要经过生物素修饰，才能够特异性地包被到链亲和素PCR96well微孔板中(Pierce公司，CatNo.15500)，用于Immuno-PCR检测。抗体修饰采用LifeTechnologies公司的SiteClick系列标记试剂盒(S10467)和DIBO标记的生物素(C10412)。
(1)、首先进行抗体的纯化和修饰。
第一轮纯化：先将0.5mg/ml250μL的3A6抗体溶液加入试剂盒附带的抗体浓缩器(一种截留分子量未知的超滤离心管)中，该浓缩器可以对抗体进行浓缩和缓冲液置换；再向该浓缩器中加入500μL抗体置换缓冲液(bufferA)在6000×g下4℃离心5分钟，离心完成之后用移液器吸取剩余溶液清洗膜表面；重复该离心和清洗过程一次，便可以获得大约50μL的经过浓缩和缓冲液置换之后的抗体溶液，即为第一轮纯化后的抗体3A6溶液；
修饰反应：收集该第一轮纯化后的抗体3A6溶液总体积为50μL，并向其中加入10μLβ-半乳糖苷酶(β-galactosidase)(componentD)，在37℃反应4个小时；之后进一步加入80μLGalT酶(componentH)和110μLUDP-GalNAz(componentE)，并在30℃反应过夜，得到修饰后的抗体3A6溶液；
第二轮纯化：反应完成之后继续用抗体浓缩器纯化修饰后的抗体3A6溶液，约得到100μL的抗体溶液，即为第二轮纯化后的抗体3A6溶液。具体的第二轮纯化过程如下：先收集总体积约250μL的修饰后的抗体3A6溶液，再将该溶液加入试剂盒附带的抗体浓缩器(一种截留分子量未知的超滤离心管)中，再向该浓缩器中加入500μL抗体置换缓冲液(bufferA)在6000×g下4℃离心5分钟，完成离心之后用移液器吸取剩余溶液清洗膜表面；重复该离心和清洗过程一次，便可以获得大约100μL的经过浓缩和缓冲液置换之后的抗体溶液，即为第二轮纯化后的抗体3A6溶液。
(2)、经过第二轮纯化的抗体就可以于DIBO标记的生物素(即DIBO-Biotin)直接反应从而带上生物素标记。具体操作为：
将DIBO-Biotin溶解在50μLBufferA中，然后加入到上述第二轮纯化后的抗体3A6溶液中在25℃反应过夜，得到最终的抗体溶液；最终的抗体纯化采用Roche公司的ProteinAAgarose进行亲和纯化：将上述最终的抗体溶液与50μLProteinAAgarose混合，4℃旋转孵育半个小时后，用1mLPBST缓冲液(1×PBS，0.1％Tween20)清洗3次，每次用2000rpm离心1分钟去除上清；最后抗体洗脱中，用100μL的250mM的Glycine溶液(该溶液已用HCl溶液调整pH值至1.8)孵育5分钟之后离心取上清，将该上清迅速用50μL的1.5M的Tris缓冲液(该缓冲液已用HCl溶液调整pH值至11)中和，得到带DIBO标记的生物素修饰的Insulin抗体3A6溶液。
实施例2：Insulin抗体的ssDNA修饰
(1)、带DIBO标记(dibenzocyclooctyne)ssDNA的合成：
a、通过DNA序列随机合成网站(http://www.facμLty.ucr.edu/～mmaduro/random.htm)生产一段长度100bp的随机序列
5’-ATGGGGCTGGATAAAACTGCCCTGGTGACCGCCATCAACAACCCGAATACGTGGCATTTCAGGAGGCGGCCGGAGGGGGGATGTTTTCTACTATTCGAGG-3’(SEQIDNo.1)。
通过blastn检索程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)确定该序列没有任何已知序列与其同源，以保证后续PCR检测信号是来自抗体结合的特异信息。
确定ssDNA的序列之后，通过IDT(www.idtdna.com)来合成5’端DIBO标记ssDNA(SEQIDNo.1)以及扩增该片段的两个PCR引物：
5’-ATGGGGCTGGATAAAACTGC-3’(SEQIDNo.2)和
5’-CCTCGAATAGTAGAAAACATCCCC-3’(SEQIDNo.3)。
(2)、修饰ssDNA的抗体是来自Abcam公司的Insulin单克隆抗体8E2(ab1967)。抗体修饰采用LifeTechnologies公司的SiteClick系列标记试剂盒(S10467)。修饰后，得到带DIBO标记的ssNDA修饰的抗体8E2。来自Abcam的Insulin单克隆抗体8E2(ab1967)需要经过ssDNA修饰才能够用作Immuno-PCR检测。抗体修饰采用LifeTechnologies公司的SiteClick系列标记试剂盒(S10467)和定制合成的DIBO标记ssDNA。
a、首先进行抗体的纯化和修饰：
第一轮纯化：先将0.5mg/ml250μL的8E2抗体溶液加入试剂盒附带的抗体浓缩器(一种截留分子量未知的超滤离心管)中，该浓缩器可以对抗体进行浓缩和缓冲液置换；再向该浓缩器中加入500μL抗体置换缓冲液(bufferA)在6000×g下4℃离心5分钟，离心完成之后用移液器吸取剩余溶液清洗膜表面；重复该离心和清洗过程一次，便可以获得大约50μL的经过浓缩和缓冲液置换之后的抗体溶液，即为第一轮纯化后的抗体8E2溶液；
修饰反应：收集为第一轮纯化后的抗体8E2溶液总体积为50μL，并向其中加入10μLβ-半乳糖苷酶(β-galactosidase)(componentD)，在37℃反应4个小时；之后进一步加入80μLGalT酶(componentH)和110μLUDP-GalNAz(componentE)，并在30℃反应过夜，得到修饰后的抗体8E2溶液；
第二轮纯化：反应完成之后继续用抗体浓缩器纯化第一轮纯化后的抗体3A6溶液，约得到100μL的抗体溶液，即为第二轮纯化后的抗体8E2溶液。具体的第二轮纯化过程如下：先收集总体积约250μL的第一轮纯化后的抗体8E2溶液，再将该溶液加入试剂盒附带的抗体浓缩器(一种截留分子量未知的超滤离心管)中，再向该浓缩器中加入500μL抗体置换缓冲液(bufferA)在6000×g下4℃离心5分钟，完成离心之后用移液器吸取剩余溶液清洗膜表面；重复该离心和清洗过程一次，便可以获得大约100μL的经过浓缩和缓冲液置换之后的抗体溶液，即为第二轮纯化后的抗体8E2溶液。
b、第二轮纯化后的抗体8E2就可以于DIBO标记的ssDNA(即DIBO-ssDNA)直接反应从而带上ssDNA标记。具体的操作为：
将1μLDIBO-ssDNA母液(100μM)溶解在49μLBufferA中(终浓度)，然后加入到第二轮纯化后的抗体8E2溶液中在25℃反应过夜，得到最终的抗体溶液；最终的抗体纯化采用Roche公司的ProteinAAgarose进行亲和纯化：将上述最终的抗体溶液与50μLProteinAAgarose混合，4℃旋转孵育半个小时候，用1mLPBST缓冲液(1×PBS，0.1％Tween20)清洗3次，每次用2000rpm离心1分钟去除上清；最后抗体洗脱用的是100μL的250mM的Glycine溶液(该溶液已用HCl溶液调整pH值值至1.8)，孵育5分钟之后离心取上清，迅速用50μL的1.5MTris缓冲液(该缓冲液已用HCl溶液调整pH值至11)中和，得到带DIBO标记的ssDNA修饰的Insulin抗体8E2溶液。
实施例3：Insulin免疫PCR标准曲线的制作
(1)、Immuno-PCR微孔板的制备：
将实施例1得到的带DIBO标记的生物素修饰的Insulin抗体3A6溶液，包被在链亲和素PCR微孔板(Pierce公司，CatNo.15500)上：经过过夜12小时，4℃孵育之后，包被了抗体的微孔板经过三次PBST缓冲液(1×PBS，0.1％Tween20)清洗，再用PBST-BSA缓冲液(1×PBS，0.1％Tween20，5％BSA)于4℃孵育微孔板过夜，之后再用PBST缓冲液清洗微孔板三次备用，得到Immuno-PCR微孔板。
(2)、InsuLin的Immuno-PCR标准曲线的制定：
a、首先准备人源Insulin标准品(母液，10mg/mL,Sigma公司)，标准品的浓度从33ng/ml到3.3x10E-5ng/ml10倍等比稀释，共有7个不同的浓度；将梯度稀释的人源Insulin标准品各5μL和5μLssDNA修饰的抗体8E2(即实施例2得到的带DIBO标记的ssNDA修饰的Insulin抗体8E2溶液)混合之后再加入10μLPBST溶液，然后再一起加入包被了抗体3A6的微孔板(即上述Immuno-PCR微孔板)，室温900rpm孵育1.5-2小时；孵育完成之后再次用200μLPBST缓冲液清洗6遍，尽量用移液器去除清洗液，也避免孔间交叉污染。
b、清洗完成的微孔板便可以进入下一步PCR定量扩增，从而计算微孔板中结合了多少ssDNA修饰的抗体8E2。SybrGreen染料被用来定量实时PCR反应过程中产生的双链DNA量。将10μL的荧光定量染料混合体系，和10μL能够特异扩增ssDNA的引物对(SEQIDNo.2和SEQIDNo.3)溶液(引物浓度为250nM)充分混合加入到每一个微孔中；微孔板经过离心之后便进入StepOne荧光定量PCR仪(LifeTechnologies公司)完成ssDNA的荧光定量PCR反应；PCR反应的条件是95℃，10分钟；95℃15秒，60℃60秒，共40个循环。
1ml的上述荧光定量染料混合体系包括以下成分：
710μL的无核酸酶无蛋白酶的双蒸水；200μL的ThermopolBuffer(10x母液，含镁离子)(NEB公司)；25μL的dNTPmix(各10mM)；40μL的ROXdye；10μL的TaqDNAPolymerase(NEB公司)；10μL的SYBRGreenII。
上述荧光定量染料混合体系也可以直接购买成品，如Fermentas公司的SybrGreen2XMasterMix产品。
c、上述PCR反应完成之后，原始数据被导出，然后在导入到R(版本3.1.0，http://cran.r-project.org/)中利用packagedrc(http://cran.r-project.org/web/packages/drc/index.html)进行5参数logistic模型分析，计算5％EffectiveDosage(ED)时的PCR循环数，并作为Ct(ThreshholdCycle)和指数变换后的标准品浓度形成线性的标准曲线(参见图3和图4)。图3是不同浓度Insulin标准品在Immuno-PCR微孔板中的定量PCR扩增曲线。从图3可以看出不同浓度对应的曲线都是典型的S型扩增曲线，而且在线性增长区域在X轴(定量PCR循环数Cycle)上的间距相当，与浓度的对数差成线性相关。经过drc软件包对所有标准曲线经过5参数logistic模型拟合之后便可以计算不同ED时的PCR循环数。测试中取5％，10％，50％的ED得到的PCR循环数具有接近1的线性正相关，因此在最终计算作图中采用5％的ED对应的循环数作为不同浓度标准曲线的Ct值。通过Ct值与标准品浓度对数作图(图4)可以发现Ct值与浓度对数之间有很好的线性相关性，线性拟合的R2为0.9984。
实施例4：InsμLin传统ELISA方法的标准曲线制作
本实施例通过与传统ELISA方法的比较，说明本发明的Immuno-PCR检测方法具有较高的灵敏度。
InsuLin的ELISA标准曲线采用Alpco公司的MouseUltrasensitiveInsulin试剂盒。按照试剂盒说明书准备标准品，浓度分别是6.9ng/ml，3.75ng/ml，1.25ng/ml，0.5ng/ml，0.188ng/ml和0ng/ml；将上述标准品加入10μL标准品到微孔板中，然后加入75μLConjugatesolution，室温下孵育微孔板两个小时，同时保持900rpm的旋转。之后用350μL的清洗液清洗微孔板6次；然后加入100μLTMB溶液，并室温孵育15分钟，保持900rpm旋转；再然后加入100μLStopsolution使得显色反应停止并从蓝色转变为黄色；最终微孔板在InfiniteM200(Tecan)上被读取OD450nm的数据，用于标准曲线的拟合和绘制。
标准曲线的拟合和绘制都在R(版本3.1.0，http://cran.r-project.org/)中利用packagedrc(http://cran.r-project.org/web/packages/drc/index.html)进行logistic5parameter模型分析，拟合出S型标准曲线(参见图4)。通过对Insulin的Immuno-PCR标准曲线，以及ELISA标准曲线测定可以发现本发明改进的Immuo-PCR方法相比传统的ELISA方法，在灵敏度和动态范围上有了革命性的突破和提高。传统ELISA的检测极限大约是0.1ng/ml，而本发明实施例3中提供的Immuno-PCR检测灵敏度至少可以达到3.3x10E-5ng/ml，而且未来还可以优化抗体亲和力提高抗体和抗原的结合强度，以减少在清洗过程中从抗原上解离的抗体比例来进一步提高灵敏度。或者采用其他和抗原结合亲和力更高的非抗体类结合蛋白，比如基于Fibronectin或者ArmadilloRepeat骨架的高亲和力结合蛋白。通过图4我们也可以看出，相比传统ELISA不到100倍的动态范围(0.188-6.9ng/ml)，Immuno-PCR可以提供超过107的动态范围。如此高的动态范围正是利用定量PCR反应的单分子级别灵敏度来实现抗原分子的超高灵敏度检测。在低浓度范围，即便Immuno-PCR微孔板表面结合的抗原分子数量远远低于ELISA检测中的结合量(约106个分子)，也可以通过PCR反应扩增来指数放大信号，而非传统ELISA实验中采用耦联HRP来线性放大信号。在高浓度范围，Immuno-PCR也不容易出现饱和，虽然扩增曲线很快进入饱和(如图3)，但是还可以通过计算Ct值来达到和浓度对数之间的线性相关。
Claims (10)
1.一种利用抗体修饰免疫PCR反应检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括：带DIBO标记的核酸修饰的检测抗体、包被有带DIBO标记的生物素修饰的捕捉抗体的Immuno-PCR微孔板、用于扩增核酸的引物对、荧光定量染料混合体系。
2.根据权利要求1所述利用抗体修饰免疫PCR反应检测试剂盒，其特征在于：所述核酸为ssDNA；该ssDNA的DNA序列包括SEQIDNo.1，用于扩增该ssDNA的引物对的DNA序列包括SEQIDNo.2和SEQIDNo.3。
3.根据权利要求1或2所述利用抗体修饰免疫PCR反应检测试剂盒，其特征在于：所述荧光定量染料混合体系包括：耐热聚合酶反应缓冲液、镁离子、dNTP、参考染料、PCR扩增用DNA聚合酶、DNA结合染料。
4.一种利用抗体修饰免疫PCR反应检测方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
DIBO标记ssDNA的合成步骤：先通过DNA序列随机合成网站生产ssDNA序列(SEQIDNo.1)，再合成带DIBO标记的ssDNA；
捕捉抗体的生物素修饰步骤：将捕捉抗体利用带DIBO标记的生物素进行生物素修饰，得到带DIBO标记的生物素修饰的捕捉抗体；
检测抗体的ssDNA修饰步骤：将检测抗体利用所述带DIBO标记的ssDNA进行ssDNA修饰，得到带DIBO标记的ssNDA修饰的检测抗体；
Immuno-PCR微孔板的制备步骤：
用所述带DIBO标记的生物素修饰的捕捉抗体包被链亲和素PCR微孔板，再将该微孔板经过孵育、清洗，得到Immuno-PCR微孔板；
待测样品的Immuno-PCR定量步骤：
将待测样品和所述带DIBO标记的ssNDA修饰的检测抗体混合之后，加入所述Immuno-PCR微孔板中；再经过孵育、清洗，加入能够特异扩增ssDNA的引物对(SEQIDNo.2和3)进行荧光定量PCR反应，再完成ssDNA的PCR定量。
5.根据权利要求4所述利用抗体修饰免疫PCR反应检测方法，其特征在于：所述捕捉抗体为Insulin单克隆抗体3A6，所述检测抗体为Insulin单克隆抗体8E2，所述待测样品为Insulin。
6.根据权利要求4或5所述利用抗体修饰免疫PCR反应检测方法，其特征在于：所述捕捉抗体的生物素修饰步骤中，先将所述捕捉抗体进行第一轮纯化处理，再加入修饰酶进行修饰反应，再进行第二轮纯化处理，得到第二轮纯化后的捕捉抗体；再将所述第二轮纯化后的捕捉抗体与于DIBO标记的生物素进行生物素标记反应，再进行亲和纯化处理，得到所述带DIBO标记的生物素修饰的捕捉抗体。
7.根据权利要求4或5所述利用抗体修饰免疫PCR反应检测方法，其特征在于：所述检测抗体的ssDNA修饰步骤中，先将所述检测抗体进行第一轮纯化处理，再加入修饰酶进行修饰反应，再进行第二轮纯化处理，得到第二轮纯化后的检测抗体；再将所述第二轮纯化后的检测抗体与于DIBO标记的ssDNA进行ssDNA标记反应，再进行亲和纯化处理，得到所述带DIBO标记的ssDNA修饰的检测抗体。
8.根据权利要求4或5所述利用抗体修饰免疫PCR反应检测方法，其特征在于：所述待测样品的Immuno-PCR定量步骤中，所述荧光定量PCR反应的条件是：95℃10分钟；95℃15秒，60℃60秒，共40个循环。
9.一种用于标记抗体的ssDNA，其特征在于：所述ssDNA的DNA序列包括SEQIDNo.1。
10.一种用于扩增ssDNA的PRC引物对，其特征在于：所述用于扩增ssDNA的引物对的序列包括SEQIDNo.2和SEQIDNo.3。
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