CN102269759A - 一种基于免疫pcr和dna熔解曲线分析的多重检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于免疫PCR和DNA熔解曲线分析的多重检测方法。其原理是用一组可通过PCR高效扩增且扩增产物的熔解温度相差较大的DNA分子分别标记免疫PCR检测中使用的检测物质如抗体或抗原。将DNA标记的检测物质混合成一个检测试剂进行免疫PCR。PCR产物再通过熔解曲线分析来分辨扩增产物中包含哪几种标记DNA。如果某一个DNA标记的特征熔解曲线峰存在，表明该DNA所标记的检测物质所检测的对象在样本中存在。各个峰的面积可用来计算所检测到的物质的相对含量。该方法特别适合10种以内病原体或其它抗原抗体的多重高灵敏度检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体为一种多重检测方法。其特点为可以在一个反应体系中同时检测多种物质。这里所指的物质是可以通过特异性作用而相互识别的物质，如抗体与抗原，受体与配体，酶与底物，凝集素与多糖。因原理相同，为方便叙述，这里以检测蛋白质为例对本发明的多重检测方法进行说明。
背景技术
免疫检测通常是指通过抗体与抗原的特异性识别而用抗体(或抗原)来检测抗原(或抗体)的检测方法。这种通过特异性相互识别的检测方法也可以推广到其它物质的检测，如受体与配体，酶与底物，凝集素与多糖。免疫检测的最经典方法是酶联免疫吸附法(ELISA)。该方法简单，经济，而且已广泛采用自动化操作。ELISA的局限一是灵敏度低，二是无法进行多重检测。为了增强ELISA的灵敏度，免疫PCR运用而生。免疫PCR是ELISA和PCR的结合。整个流程的前面步骤是ELISA，完成抗体抗原的专一性结合。与经典的ELISA不同的是，免疫PCR的检测抗体不是用酶标记的，而是用DNA标记的。标记的DNA随后通过PCR进行扩增，并用生物素标记，扩增产物通过标记的生物素检测。标记的DNA也可通过实时荧光PCR直接定量。免疫PCR比ELISA灵敏度高10-10000倍，解决了ELISA灵敏度低的问题。本发明通过巧妙设计标记在检测抗体或抗原的DNA序列，并将免疫PCR与DNA熔解曲线分析结合，组成一种新颖的多重免疫PCR检测技术。这种新颖的多重免疫PCR技术具备以下几个优点。(1)DNA熔解曲线分析可以在PCR后极为方便的完成。如果使用实时荧光PCR仪，熔解曲线分析可以整合到PCR程序中，PCR和DNA熔解曲线分析一气呵成，操作人员无需做任何事，达到PCR和熔解曲线分析的无痕结合。如果使用常规PCR仪，PCR扩增后，也无需打开PCR反应管盖做任何事，仅仅需要把PCR管转移至熔解曲线分析仪进行熔解曲线分析即可。这不仅方便了操作，而且大大减少了PCR污染。(2)DNA熔解曲线分析是非破坏性，非消耗性检测。分析结束，样本恢复原样。(3)DNA熔解曲线分析不需要在PCR时对PCR产品进行标记，化学反应简单，也减少了成本。由此可见，这种基于DNA熔解曲线分析的多重免疫PCR比基于DNA固体芯片技术，液体芯片技术，或凝胶电泳分析的多重免疫PCR简便，快速，经济，抗PCR污染能力强。本专利描述的多重免疫PCR特别适用于十种以内物质的高灵敏度多重检测。
发明内容
本发明通过巧妙设计标记DNA序列，并将免疫PCR与DNA熔解曲线分析结合，实现对多种物质的高灵敏度多重检测。这里所指的物质是可以通过特异性作用而相互识别的物质，如抗体与抗原，受体与配体，酶与底物，凝集素与多糖。因原理相同，为方便叙述，下文以被检测物均为抗原为例。图一显示同时检测三种抗原的原理。
1.设计一组互不相同的用于标记检测抗体的DNA序列，数目与需检测的抗原数相同。如需要同时检测三种抗原，设计三个DNA序列。如图一中10，11，12。设计的DNA标记具备如下特点：
(1)DNA长度在40个碱基以上；
(2)设计的一组标记DNA，每个标记DNA都可以用PCR高效率扩增。扩增每个标记DNA的引物可以相同，也可以不同。如果不同，这些引物对必须能在同一个PCR反应体系中在相同的循环条件下高效率的扩增各自的模板。
(3)设计的一组标记DNA，各个标记的PCR产物熔解温度(即Tm值)不同，彼此差别至少0.5摄氏度。具体差值可视反应体系的多重度和熔解曲线的分析仪器的精度确定。如只需对六种或少于六种蛋白质同时检测，可设计成DNA标记的PCR扩增产物彼此之间的熔解温度差在2摄氏度以上。这样，市场上的几种主流实时荧光PCR仪能可靠的分辨每个DNA标记的熔解曲线，反应体系的微小波动对熔解温度的影响将不会对结果的判断造成困难，体系抗干扰的能力强。这也为使用分辨率低但价格低廉的熔解曲线分析仪提供可能，为降低检测成本创造空间。
2.用合成的DNA(单链或双链均可)分别标记检测抗体，一种检测抗体标记一种DNA序列。
3.将DNA标记的检测抗体混合在一起。混合的浓度由抗体的滴度确定，要求是当加入一定体积的混合检测抗体时，每个抗体的浓度在其最佳工作浓度范围。
4.将每个被检抗原的捕获抗体混合，固定在反应基质表明，如酶联免疫吸附板反应孔或微球表面，如图一中13。
5.加入样本(如样本需预处理，先作预处理)，恒温培育一定时间，让抗原抗体充分结合。培育结束充分洗涤后，加入DNA标记的检测抗体混合物，恒温培育。
6.恒温培育结束后，洗涤。如果采用了可同时做ELISA和PCR的管子，可直接加入PCR混合液进行扩增。否则需通过物理如加热或化学的处理破坏抗原—抗体—DNA标记复合物，然后将DNA或含有DNA的部分转移至PCR管进行PCR扩增。PCR扩增混合液含有引物，DNA聚合酶，荧光染料SYBRI或其它用于高分辨率熔解曲线分析的荧光染料，和其它辅助成分。
7.PCR扩增后对PCR产物进行熔解曲线分析。如果PCR时使用实时荧光PCR仪，PCR扩增和扩增后的熔解曲线分析在同一仪器上完成，完全达到PCR扩增与PCR产物的融解曲线分析无痕连接。如果使用专门的熔解曲线分析仪，PCR可以在常规PCR仪上进行。PCR结束后，不需要打开PCR反应管，仅仅需要将PCR管从PCR仪转移至DNA熔解曲线分析仪。如果某一个DNA标记的特征熔解曲线峰存在，表明该DNA所标记的抗体或抗原所检测的蛋白质在样本中存在。如图2所示，融解曲线分析显示三个峰，对应的熔解温度分别为Tm1，Tm2，Tm3，表明熔解温度为Tm1，Tm2，Tm3的DNA所标记的抗体所检测的抗原在样品中存在。各个峰的面积可用来计算所检测到的蛋白质的相对含量。
附图说明
图一：基于DNA熔解曲线分析的多重免疫PCR原理图。该图以检测三种抗原为例。图中，4，5，6分别代表三种需要检测的抗原。1，2，3分别为抗原4，5，6的捕获抗体。7，8，9分别为4，5，6的检测抗体。10，11，12为分别标记在检测抗体8，9，10上的标记DNA。13为捕获抗体吸附的基质。
图二：基于DNA熔解曲线分析的多重免疫PCR熔解曲线分析示意图。该图以样品中存在三种检测抗原为例。图中Tm1，Tm2，Tm3分别为DNA标记10，11，12的熔解温度。
具体实施方式
下面以常检致病性食品微生物沙门氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌的同时检测为例说明具体实施方式。需要特别强调的是本专利不是描述和寻求保护沙门氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌的同时检测体系，而是以此例说明基于免疫PCR和DNA熔解曲线的多重分析方法。因而本专利不详细描述沙门氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌应用本技术检测的细节。
设计4个DNA序列A，B，C，D，4对PCR引物a，b，c，d。引物a，b，c，d分别专一性扩增A，B，C和D。A，B，C和D的PCR扩增产物的熔解温度互不相同，相临的两个熔解温度相差约3摄氏度。用A，B，C，D分别通过化学共价连接标记抗沙门氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌特异抗原的检测抗体。将标记的四个抗体混合组成混合检测抗体。将沙门氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌各自特异性抗原的捕获抗体混合成一个混合捕获抗体，通过表面吸附固定在酶联免疫和PCR两用反应管中。用屏蔽缓冲液屏蔽非专一性结合位点后，加入处理过的样本，培育。培育结束，充分洗涤，加入混合检测抗体，培育。培育结束，充分洗涤。加入含有SYBR I的PCR扩增混合液，将PCR管转移至一实时荧光PCR仪(如LightCycler 480)进行PCR扩增和扩增后DNA熔解曲线分析。根据熔解曲线分析出现的峰和每个峰的面积判定四种致病微生物是否存在和相对定量。
Claims (9)
1.一种多重免疫PCR检测方法，其特征是：将免疫PCR与DNA熔解曲线分析有机的结合起来，实现在单管内对多种物质的高灵敏度检测。
2.如权利要求书1所述的物质，其特征是：可以通过物质与物质的特异性作用而相互识别的物质，如抗体与抗原，受体与配体，酶与底物，凝集素与多糖。
3.如权利要求书1所述的多重免疫PCR检测方法，其特征是：固定在反应基质(如酶联免疫吸附板反应孔或微球表面)的捕获试剂为被检测的各物质的特异性识别物质的混合物。
4.如权利要求书1所述的多重免疫PCR检测方法，其特征是：在样品中的被检测物质被权利要求书3所述的捕获试剂捕获后，加入的检测试剂为被检测的各物质的特异性识别物质的混合物。
5.如权利要求书4所述的检测试剂，其特征是：每个被检测物质的特异性识别物质用不同序列的DNA分子通过化学共价键直接标记或通过其它桥接分子(如亲和素)间接标记。
6.如权利要求书5所述的标记DNA分子，其特征是：它们是长度在40个碱基以上的DNA单链或双链。
7.如权利要求书5所述的标记DNA分子，其特征是：所有标记DNA可以用PCR高效扩增，而且它们的PCR扩增产物的熔解温度(即Tm值)不同，彼此差别至少0.5摄氏度。
8.如权利要求书1所述的多重免疫PCR，其特征是：PCR扩增后再对PCR产物进行熔解曲线分析来鉴别PCR产物中存在哪些标记DNA以及它们的相对量，进而推断样品中存在哪些被检物质以及它们的相对量。
9.如权利要求书8所述的PCR扩增和熔解曲线分析可以在实时荧光PCR中进行，也可以在常规PCR仪中进行PCR扩增，扩增结束后在专门的熔解曲线分析仪中进行熔解曲线分析。
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