JP2023544174A - 核酸増幅システムおよびその方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ナノ粒子上の標的核酸がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または恒温核酸増幅反応（等温増幅反応）を行うことができるように、外部エネルギー源を使用してゾーン熱変換を用いてナノ粒子を駆動し、エネルギー反応を発生させる核酸増幅システムおよびその方法を開示する。反応空間内の液体を利用して急速な温度調節を実現し、ナノ粒子の表面に蓄積された標的核酸を増幅します。 ナノ粒子は、遠心分離、磁気捕捉、ラテラルフロークロマトグラフィーなどによって濃縮、捕捉、収集できます。 その後、増幅後の蛍光強度解析や層色変化を解析することで検出できます。【選択図】図3
Description
本発明の核酸増幅システムは、ナノ粒子の表面でポリメラーゼ連鎖反応または等温増幅反応を行う光熱加熱を統合することにより、外部エネルギーを局所熱エネルギーに変換することができる磁性または非磁性ナノ粒子を使用し、特定の核酸断片を迅速に増幅する。さらに、磁気捕捉、遠心分離、ラテラルフロークロマトグラフィーなどの単一分子濃縮手順を使用して、増殖後の核酸断片を核酸マーカーまたは抗体によって識別し、酵素反応を共役さて比色法によって迅速な検出を実現します。
迅速な核酸増幅と検出は、分子バイオテクノロジーによる微量の生物学的サンプルの検出において常に困難に直面しています。 過去 10 年間で、数分以内に完了することができる第二世代の DNA ポリメラーゼの開発により、迅速なポリメラーゼ連鎖反応が迅速な核酸増幅反応を実行することが検証されました。 ただし、このタイプの技術には、アンプリコン収量の低さ、プラットフォームのスケーラビリティ、プラットフォームの熱管理など、多くの問題も伴います。 従来の PCR マシンと比較して、迅速な核酸増幅技術はポイントオブケア(POC) 診断のコア技術です。 マイクロ流体ポリメラーゼ連鎖反応は、技術的に優れていることが証明されており、小さな生物学的サンプルの検出にも広く使用されています。 MEMS技術は、従来のポリメラーゼなどの恒温核酸増幅法に比べて、PCRの小型化、急速加熱・冷却操作を実現し、反応に必要な試薬やサンプルの量を削減します。 この技術は携帯型の分析装置を実現するが、そのようなシステムは精密な温度制御と流体操作を必要とするため、設計、プロセス、操作の難易度が相対的に高くなり、簡単な即時診断アプリケーションの開発には適していません。 さらに、ほとんどのバックエンド核酸分子検出技術は、吸光度、蛍光、濃度、電気インピーダンス、流体粘度などの物理的または化学的表現に依存しています。
さらに、細胞、細菌またはウイルスの識別、あるいはは血液循環系における非常に小さな循環腫瘍細胞の存在などの癌細胞のスクリーニングに関して、細胞表面上の特殊な抗原によって細胞マーカーの同定に非常に重要な役割を果たします。ただし、循環腫瘍細胞を例にとると、EpCAM や CKs などの細胞マーカーがすべての循環腫瘍細胞に現れるわけではありません。 さらに、一部の RNA ウイルスの同定では、構造タンパク質の変異が多いため、従来の抗体検出法を使用すると、標的マーカーのモノクローナル抗体をスクリーニングするのに多くの時間がかかります。 したがって、核酸検出は、抗体検出よりも設計が容易です。 さらに、スクリーニングされたサンプルがその後の検出反応を受ける場合でも、核酸検出は、その後の生物学的検出のために特定の核酸フラグメントを増幅することにより、サンプルの濃度を向上させることができます。
たとえば、特定のがん細胞、細菌、またはウイルスをスクリーニングするために、多分の技術は、複雑な方法で抗原を含む可能性のあるさまざまなターゲットまたは核酸を放出する必要があります。 また、核酸や抗原が放出された後でも、バイオチップなどのデバイスがその役割を果たせるように、サンプル濃度が低すぎるため、反応を増幅するのに長い時間がかかる場合があります。
したがって、関連する生物学的検査は、通常、スクリーニング、培養、サンプル濃度の制御に必要なステップの数に依存し、適切な検査機器の選択して最終的なデータ分析し、このように多くの複雑なステップが困難な状況につながります。 現在、検出精度を失うことなく、上記の問題を迅速に解決できるシステムおよび方法が必要とされています。
従来技術で前記問題を解決するために、本発明は核酸増幅システムおよびその方法を提供する。 特に、本発明の熱サイクル核酸増殖反応は、金属製の加熱担体や冷却ファンを使用せず、熱伝導方式で熱サイクル反応を行う。
本発明の核酸増幅システムは、主に、反応空間、サンプル、複数の粒子、酵素、少なくとも１つのエネルギー供給モジュール、少なくとも１つの温度平衡物質、および制御モジュールを含む。
サンプルは少なくとも１つのアナライトを含み、サンプルは反応空間に置かれる。 複数の粒子はサンプルと混合され、各粒子は本体、少なくとも１つの第１のリガンド、および少なくとも１つの第２のリガンドを含む。 少なくとも１つの第１のリガンドが本体上に配置され、少なくとも１つの第１のリガンドが少なくとも１つの分析物と一致する。 少なくとも１つの第２のリガンドは、本体上に配置され、特定のマークを含む。
サンプルは少なくとも１つのアナライトを含み、サンプルは反応空間に置かれる。 複数の粒子はサンプルと混合され、各粒子は本体、少なくとも１つの第１のリガンド、および少なくとも１つの第２のリガンドを含む。 少なくとも１つの第１のリガンドが本体上に配置され、少なくとも１つの第１のリガンドが少なくとも１つの分析物と一致する。 少なくとも１つの第２のリガンドは、本体上に配置され、特定のマークを含む。
ポリメラーゼもサンプルと混合され、少なくとも１つのエネルギー供給モジュールが外部エネルギー源を複数の粒子に提供する。反応空間内の複数の粒子を制御するために、制御モジュールは使用される。複数の粒子の温度を均衡させるために、反応空間は少なくとも１つの温度均衡物質をさらに含む。
また、本発明の核酸増幅システムの方法は、主に以下の７つのステップを含む。 ステップ（ａ）では、複数のナノ粒子が少なくとも１つの分析物を捕捉するように、サンプルを複数のナノ粒子と混合する。 次に、工程（ｂ）において、制御モジュールを用いて反応空間内でサンプルを濃縮し、サンプルは少なくとも１つの分析物を含み、少なくとも１つの分析物は遊離の核酸物質である場合は、ステップ（ｅ）に入り、そうでない場合は、ステップ (c) に進む。
ステップ（ｃ）では、少なくとも１つのエネルギー供給モジュールが複数の粒子に外部エネルギー源を提供し、それにより、複数のナノ粒子の周囲の微小環境が爆発温度まで上昇する。 次に、ステップ（ｄ）が実行され、少なくとも１つの検体(いわゆる分析物)が破裂して、少なくとも１つの生物学的物質を放出する。 次いで、ステップ（ｅ）において、少なくとも１つのエネルギー供給モジュールは、複数のナノ粒子が少なくとも１つの生物学的物質または遊離核酸物質と結合するように、結合温度まで外部エネルギー源を複数の粒子に提供し、操作モジュールを介して複数の粒子を濃縮する。 次に、ステップ（ｆ）において、少なくとも１つのエネルギー供給モジュールは、増幅温度まで外部エネルギー源を複数の粒子に提供し、少なくとも１つの生物学的物質または複数の粒子上の遊離核酸物質をインサイチュで増幅する。増幅された少なくとも１つの生物学的物質または遊離核酸物質を複数の粒子と接触させる。 この反応では、少なくとも１つの温度平衡物質が複数の粒子を急速に冷却し、それによって急速な温度循環を達成する。 最後に、ステップ（ｇ）において、検出モジュールを使用して、増幅された生物学的物質または遊離核酸物質上の特定のマーカーよるの色の変化、発光、またはそれぞれの組み合わせを識別し、濃縮後の生物学的物質または遊離核酸物質を検出する。 蛍光または分光光度検出装置 (例えば、蛍光光度計や蛍光スキャナーなど) を使用して蛍光強度の違いを分析するか、特定の DNA フラグメントまたは抗体結合酵素反応を使用して、ポリメラーゼ標識によって増幅された生物学的物質上の特定のマーカーを識別します。
上記の本発明の簡単な説明の目的は、本発明のいくつかの態様および技術的特徴の基本的な説明を行うことである。 発明の概要は、発明の詳細な説明ではないため、発明の重要な要素や重要な要素を具体的に列挙することを意図したものではなく、発明の範囲を定義するために使用されるものではなく、発明のいくつかの概念を簡潔に提示することだけです。
以下、本発明の実施の形態を、詳細に説明する。なお、本発明の目的、特徴、利点、および、そのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
まず、本発明の一実施形態による核酸増幅システム１０の概略図である図１を参照されたい。 図１に示すように、本実施形態の核酸増幅システム１０は、主に、反応空間１００、サンプル２００、複数の粒子、酵素、エネルギー供給モジュール５００、および制御モジュールを含む。 この実施形態では、制御モジュールは磁性要素６００であり、複数の粒子は複数の磁性ナノ粒子３００であり、酵素は核酸増幅システム方法の実施形態におけるポリメラーゼ４００である。
この実施形態では、サンプル２００、複数の粒子、およびポリメラーゼ４００はすべて反応空間１００内に配置され、反応空間１００内のサンプル２００は温度平衡物質２０３をさらに含む。温度平衡物質２０３は、例えば、大容量（例えば、１００μｌを超える）の核酸増殖反応溶液、または反応空間１００に外部から接続された冷却アイスパックである。 冷却アイスパックの内容物は、例えば、氷またはカルボキシメチルセルロース（Carboxymethyl Cellulose）等の重合吸水性樹脂である。 上記物質の大きな比熱特性により、光から熱への変換による磁性ナノ粒子３００の周囲の微小環境の急速に上昇する温度を急速に冷却して、核酸増幅反応の急速な熱サイクルを達成することができる。この実施形態では、エネルギー供給モジュール５００は、複数のナノ粒子上に行われる核酸増幅反応を急速に加熱するために、光熱効果によって複数のナノ粒子およびそれらの周囲の微小環境を急速に加熱する。 また、サンプル２００中の温度平衡物質２０３により、ナノ粒子上の核酸増幅反応の温度が急速に冷却され、インサイチューで核酸増幅反応の温度サイクルが効率的に形成される。
この実施形態では、サンプル２００は、少なくとも１つの分析物２０１を含み、反応空間１００に配置される。具体的には、この実施形態におけるサンプル２００は、血清、血漿、尿、リンパ液、咽頭スワブ、鼻咽頭スワブ、気管支肺胞洗浄液、喀痰、糞便、脳脊髄液、皮膚小胞液体、外皮などの生体サンプル、またはそれらの組み合わせ、などの生物学的検出を必要とする任意の生体液またはその上清である。他の実施形態では、サンプル２００は、食品または加工農産物の事前抽出サンプル、またはそれらの組み合わせである。本実施形態において、サンプル２００は、例えば、精製されたサンプル２００、または予備精製および前処理が施されていないサンプル２００である。 サンプル２００の状態に関係なく、この実施形態の核酸増幅システム１０は、分析物２０１を局所的な熱エネルギーで溶解させる(cell lysis)ために使用することができる。この実施形態では、分析物２０１は、例えば、少なくとも１つの細胞、少なくとも１つの細菌、少なくとも１つの藻類、少なくとも１つの原生動物または真菌のような原生生物、少なくとも１つの真菌、少なくとも１つのウイルスまたはバクテリオファージ、少なくとも１つの原生生物、少なくとも１つの遊離核酸物質、またはそれらの組み合わせを含む任意の微生物個体、組織または細胞である。この実施形態では、少なくとも１つの遊離核酸物質は、少なくとも１つの体液を含まない核酸物質、少なくとも１つの腫瘍を含まない核酸物質、またはそれらの組み合わせであってもよいが、本発明では限定されない。
この実施形態では、複数の磁性ナノ粒子３００がサンプル２００と混合される。 次に、図２を参照すると、図２は、本発明の一実施形態による磁性ナノ粒子３００の概略構造図である。 この実施形態によると、複数の磁性ナノ粒子３００は、磁性金ナノシェルでできていてもよい。
図２に示すように、この実施形態の各磁性ナノ粒子３００は、本体３０１、少なくとも１つの第１のリガンド３０２または特定のアプタマー３０５、および少なくとも１つの第２のリガンド３０３を含む。本発明の概念によれば、磁性ナノ粒子３００の本体３０１の他の可能な形態は、例えば、金属または複合材料で形成された球、短棒、異方性突起（例えば、ナノメートルなど）である。ナノシェル、ナノケージ、二重三角錐などの形態が挙げられるが、本発明はこの形態に限定されない。この実施形態では、本体３０１の材料は、金、銀、パラジウム（アラジウム）、プラチナ、またはそれらの組み合わせなどの少なくとも１つの貴金属を含む。この実施形態では、本体３０１の表面は、金、銀、パラジウム、プラチナなどの前述の貴金属の少なくとも１つの層で被覆または構成されている。 他の実施形態では、本体３０１は、近赤外線（ＮＩＲ）吸収スペクトルを有するシアニン、ポリピロール、またはグラフェンなどの材料をさらに含む。他の実施形態では、本体３０１は、鉄、コバルトなどの遷移金属も含む。具体的に、前述の遷移金属には、酸化第一鉄 (FeO)、酸化鉄 (Fe2O3)、酸化第二鉄 (Fe3O4)、酸化鉄 (水酸化物) (FeO(OH))、水酸化第一鉄 (Fe) などの酸化物も含まれる必要があります。(OH)2)、水酸化第二鉄(Fe(OH)3)、一酸化コバルト(CoO)、オキシ(水酸化)酸化コバルト(CoO(OH))、四三酸化コバルト(Co3O4)およびその誘導体、混合物からなる群。しかし、本発明はこれに限定されない。 本体３０１が光熱変換特性または磁気熱変換特性を含むことができ、または必要に応じて磁気特性および関連する技術的手段をさらに有することができる限り、それは本発明の実施形態の条件を満たしている。
図２を参照すると、本発明の一実施形態では、本体３０１上の少なくとも１つの第１のリガンド３０２は、例えば、抗体、アプタマー３０５、オリゴヌクレオチドまたはそれらの組み合わせであるが、これは意図されていない本発明を限定するため。この実施形態における少なくとも１つの第１のリガンド３０２は、前述の少なくとも１つの少なくとも１つの分析物２０１と一致することができる。 第１のリガンド３０２は、分析物２０１と特異的に結合することにより、本体３０１上のサンプル２００の表面を吸着する。この実施形態では、少なくとも１つの第２のリガンド３０３が本体３０１上に配置され、例えば、抗体、アプタマー、オリゴヌクレオチドまたはそれらの組み合わせであるが、本発明を限定することを意図しない。 さらに、各第２のリガンド３０３は、蛍光基３０６１または核酸マーク３０６２などの特定のマークを含む。この実施形態では、第２のリガンド３０３は、例えば、一本鎖核酸配列であり、高温により放出された分析物２０１の生体物質（核酸サンプルなど）は、ナノ粒子の表面によって機能化され得る。第２のリガンド３０３は、増幅反応のために特定の遺伝物質を捕捉するために使用される。 したがって、本実施形態における各磁性ナノ粒子３００の表面は、少なくとも２回の表面処理手順を経ており、したがって非常に高い特異性を有している。この実施形態では、官能化された特異的な第１のリガンド３０２および第２のリガンド３０３を、少量のサンプル２００について分析することができる。
この実施形態では、第１のリガンド３０２および第２のリガンド３０３のそれぞれは、安定化構造３０４を介して本体３０１に接続される。この実施形態では、安定化構造３０４は、任意に、熱安定結合、接触防止コーティング、またはそれらの組み合わせである。さらに、熱安定結合は、ビオチン(biotin)とストレプトアビジン(streptavidin)または架橋剤(cross linker)との間の結合、または熱安定特性を有する他の共有結合である。ストレプトアビジンとビオチンの結合は、飽和状態で非常に高い熱安定性 (>105 度) を持ち、調製方法が簡単であるため、ストレプトアビジン(streptavidin)とビオチン(biotin)の間の高強度と高親和性結合(Biotin-streptavidin interaction)を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応(polymerase chain reaction, PCR)の高温環境下で安定した反応環境を形成します。従来技術では、チオール(thiol)によってジスルフィド共有結合が形成されるため、PCR反応溶液中にジチオスレイトール(dithiothreitol, DTT)または他の還元剤が出現する。上記物質の存在下では、もともと形成されていたジスルフィド共有結合がチオールへ（-S-H結合）容易に還元され、ポリメラーゼ連鎖反応におけるプライマー(primer)がナノ粒子の表面から脱離する原因となります。さらに、鎖状アビジンタンパク質は、ナノ粒子の表面にタンパク質コーティング層を形成して、ナノ粒子の非特異的吸着を低減することができる。
さらに、この実施形態では、ポリメラーゼ４００もサンプル２００と混合される。また、本実施形態におけるポリメラーゼ４００は、例えば、デオキシリボ核酸ポリメラーゼ(DNA Polymerase)、リボ核酸ポリメラーゼ(RNA Polymerase)、またはこれらの組み合わせであり、検出する核酸の種類または第２のリガンド３０３の種類に応じて交換され、本発明を限定するものではない。 また、この実施形態において、酵素は、例えば、逆転写酵素(reverse transcriptase, RT)、リボヌクレアーゼ(ribonuclease, RNase)、ヘリカーゼ(helicases)、ＤＮＡリガーゼ、またはそれらの組み合わせである。 特に、本実施形態では、サンプル２００の種類や核酸増幅反応の種類に応じて酵素の種類を変更する。
さらに、ナノ粒子の本体３０１の表面とデオキシリボース核酸ポリメラーゼ(DNA Polymerase)またはリボ核酸ポリメラーゼ(RNA Polymerase)との間の接触阻害を低減するために、この実施形態では、本体３０１の表面は、必要に応じて、接触抑制コーティング。接触抑制コーティング層は、例えば、シリカコーティング(silica coating)、ポリエチレングリコール(Polyethylene glycol, PEG)、またはそれらの組み合わせであり、ナノ粒子の本体３０１の表面上の充填分子(filling molecule)として使用され、ナノ粒子の間の沈殿(aggregate)効果を減少させ、ナノ粒子表面の安定性を向上させる。
この実施形態では、少なくとも１つのエネルギー供給モジュール５００は、例えば、外部エネルギーＢを複数の磁性ナノ粒子３００に提供するためのレーザーエミッター、ＬＥＤダイオード光源または磁場発生器である。 外部エネルギーＢは、例えば、光エネルギーまたは交番磁場である。本実施形態における外部エネルギーＢ（先に図７参照）は、レーザー光のエネルギーである。この実施形態では、制御モジュールは、反応空間１００内の複数のナノ粒子を制御するために使用される。この実施形態では、制御モジュールは磁気要素６００であるが、磁気要素６００、遠心分離装置、またはそれらの組み合わせは、異なるタイプのナノ粒子または後続の検出ステップおよび要件に従ってさらに選択することができる。制御モジュールが磁気素子６００である場合、ナノ粒子は、磁気素子６００が反応空間１００内で複数の磁性ナノ粒子３００を操作できるように、磁力を有する磁性ナノ粒子３００として設計されるべきである。他の実施形態では、磁気要素６００は、例えば、永久磁石、電磁石、またはそれらの組み合わせであるが、これは本発明を限定することを意図していない。
本発明の一実施形態では、核酸増幅システム１０は、制御モジュールによって濃縮して凝集された第２のリガンド３０３上の蛍光基３０３１によって放出された蛍光を検出するための検出モジュールをさらに含み、光Ｆは、定量化に使用される。ナノ粒子の表面上の分析物２０１の増幅された生体物質２０２。この実施形態では、生体物質２０２は、例えば、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)であるが、これは本発明を限定するものではない。生体物質２０２が核酸である場合、インサイチューポリメラーゼ連鎖反応(in-situ PCR)、逆転写反応または等温増幅を受ける。本発明の実施形態において、恒温増幅反応は、操作温度が37度を超える技術の選択を指し、例えば恒温環状増幅(LAMP)、鎖置換増幅(SDA)、ヘリカーゼ鎖置換増幅(HDA)、核酸の上場廃止に基づく増幅反応(NASBA)および転写媒介増幅反応(TMA)、ニッキング酵素増幅反応(Nicking Enzyme Amplification Reaction, NEAR)、恒温組換えポリメラーゼ核酸増幅反応(Recombinase polymerase amplification, RPA)である。
本発明の一実施形態による増幅核酸配列断片とは、分析物２０１の溶解されること(cell lysis)により放出された生体物質２０２が核酸増幅反応により増幅された後のアンプリコン（アンプリコン）をいう。
図３を参照すると、図３は、本発明の実施形態による核酸増幅システム１０の方法のフローチャートである。図３に示されるように、この実施形態で説明される核酸増幅システム１０の方法は、主に以下の７つのステップを含む。 ステップ（ａ）では、複数のナノ粒子３００が少なくとも１つの分析物２０１を捕捉するように、サンプル２００を複数のナノ粒子３００と混合する。 次に、工程（ｂ）において、制御モジュールを用いて反応空間１００内でサンプル２００を濃縮し、サンプル２００は少なくとも１つの分析物２０１を含み、少なくとも１つの分析物２０１は遊離の核酸物質である場合は、ステップ（ｅ）に入り、そうでない場合は、ステップ (c) に進む。
ステップ（ｃ）では、少なくとも１つのエネルギー供給モジュール５００が複数の粒子３００に外部エネルギー源を提供し、それにより、複数のナノ粒子３００（例えば、磁性ナノ粒子）の周囲の微小環境が爆発温度まで上昇する。 次に、ステップ（ｄ）が実行され、少なくとも１つの検体(いわゆる分析物)が破裂して、少なくとも１つの生物学的物質を放出する。 次いで、ステップ（ｅ）において、少なくとも１つのエネルギー供給モジュール５００は、複数の磁性ナノ粒子３００が少なくとも１つの生物学的物質または遊離核酸物質と結合するように、結合温度まで外部エネルギー源Bを複数の磁性ナノ粒子３００に提供し、操作モジュールを介して複数の粒子を濃縮する。 次に、ステップ（ｆ）において、少なくとも１つのエネルギー供給モジュール５００は、増幅温度まで外部エネルギー源を複数の磁性ナノ粒子３００に提供し、ポリメラーゼ４００によって少なくとも１つの生物学的物質または複数の磁性ナノ粒子３００上の遊離核酸物質をインサイチュで増幅する。増幅された少なくとも１つの生物学的物質２０２または遊離核酸物質を複数の粒子と接触させる。 この反応では、少なくとも１つの温度平衡物質が複数の磁性ナノ粒子３００を急速に冷却し、それによって急速な温度循環を達成する。 最後に、ステップ（ｇ）において、検出モジュールを使用して、増幅された生物学的物質または遊離核酸物質上の特定のマーカーよるの色の変化、発光、またはそれぞれの組み合わせを識別し、濃縮後の生物学的物質または遊離核酸物質を検出する。 蛍光または分光光度検出装置 (例えば、蛍光光度計や蛍光スキャナーなど) を使用して蛍光強度の違いを分析するか、特定の DNA フラグメントまたは抗体結合酵素反応を使用して、ポリメラーゼ標識によって増幅された生物学的物質上の特定のマーカーを識別します。
本実施形態に記載の核酸増幅システム１０の方法をより明確に理解するために、図３～図５を同時に参照してください。図４は、本発明の実施形態の濃縮前のサンプルの説明図である。図５は、本発明の実施形態の濃縮後のサンプルの説明図である。
本発明の一実施形態では、図３のステップ（ａ）は、サンプル２００を複数の磁性ナノ粒子３００と混合して、複数の磁性ナノ粒子３００が少なくとも１つの分析物２０１を捕捉するようにすることである。この実施形態における分析物２０１は、少なくとも１つの細胞、少なくとも１つの細菌、少なくとも１つの藻類、少なくとも１つの原生動物または原型真菌、少なくとも１つの真菌、少なくとも１つのウイルスまたはバクテリオファージ、少なくとも１つの原生生物、またはそれらの組み合わせを含む。 本発明の実施形態において、分析物２０１は、特定の抗体または特別に設計された抗体によって認識され得る抗原を有し、核酸などの遺伝関連物質を担持しなければならないので、この実施形態においてさらに検出され得る。図２に示すように、分析物２０１の抗原を認識することができる特異的抗体３０２またはアプタマー３０５を機能化ナノ粒子の表面にセットすることにより、分析物２０１はその後ナノ粒子を通過して識別され、溶解されること(cell lysis)を行われて核酸増幅される。
次に、図3-5を参照してください。図４は、本発明の実施形態の濃縮前のサンプルの説明図である。本発明の一実施形態では、検出をスピードアップするために、制御モジュールは、本実施形態のステップ(ｂ)において、反応空間１００中に制御モジュールを使用してサンプル２００を濃縮し、洗浄して不純物を除去し、図５の状態を呈する。図５の濃縮後のサンプル２００は、少なくとも１つの分析物２０１を含む。 本発明の一実施形態では、制御モジュールは、遠心装置、磁気要素６００、またはそれらの組み合わせである。この実施形態における濃縮方法は、遠心分離後に上清を抽出すること、磁性要素６００を使用して複数の磁性ナノ粒子３００を濃縮すること、またはそれらの組み合わせですが、これは本発明を限定するものではない。 この実施形態では、不純物は分析物以外の物質であり、分析物２０１は、第１のリガンド３０２と結合することによって複数の磁性ナノ粒子３００によって捕捉され、その後、複数の磁性ナノ粒子３００は、制御モジュールを介して濃縮される。磁性ナノ粒子３００が除去され、分析物２０１が不純物から分離される。
次に、図３と図６～７を同時に参照してください。図６は、本発明の実施形態によるポリメラーゼ４００の添加の説明図である。図７は、本発明の実施形態による破裂した分析物２０１の概略図である。図３のステップ(ｃ)は、図６～７に示した工程に対応するものであり、図６に示すように、ポリメラーゼ４００は、本実施形態のステップ(ｃ)において添加することができる。他の可能な実施において、ステップ(ｃ)のデトネーション温度がポリメラーゼ４００に影響を及ぼし、変性の危険性を引き起こす可能性がある場合、ポリメラーゼ４００はステップ(f)で添加されてもよく、本発明はこれに限定されない。
次に、図７に示すように、磁性ナノ粒子３００上の少なくとも１つの第１のリガンド３０２またはアプタマー３０５（図２参照）を介して、磁性ナノ粒子３００の抗原認識領域をスムーズかつ迅速に移動させ、サンプル２００内で分析物２０１とを一致して捕捉する。この実施形態では、分析物２０１は、例えば、微生物または特定の細胞である。 本発明の実施形態では、ステップ（ｃ）が実行されると、エネルギー供給モジュール５００は、複数の磁性ナノ粒子３００に外部エネルギーＢ（図７のエネルギー供給モジュール５００によって放出される灰色の波紋など）を提供する。磁性ナノ粒子３００の温度はデトネーション温度まで上昇します。
上述したように、本実施形態のエネルギー供給モジュール５００はレーザーエミッターであり、外部エネルギー源Ｂはレーザー光エネルギーである。しかしながら、実際には、エネルギー供給モジュール５００は、磁性ナノ粒子３００の本体３０１を自由に加熱するために、本体３０１の材料に従って選択されなければならない。 レーザー波長は、主に可視スペクトルから近赤外スペクトル（380nm～1.4μm）までの範囲であり、近赤外スペクトル領域（750nm～1.4μm）が好ましい。この実施形態のナノ粒子は、外部エネルギーを熱エネルギーに変換することができ、外部エネルギーは、光エネルギー、交流磁場、および本発明によって限定されない他のエネルギー源であり得る。本発明の実施形態では、エネルギー供給モジュール５００は、主にナノ粒子自体と近くの領域との間の微小環境（距離はマイクロメートル（μｍ）である）を加熱するので、インサイチュポリメラーゼ連鎖反応（in-situ PCR）により適している。
次に、図 3 と図 8 ～ 9 を同時に参照してください。図８は、本発明の実施形態による分析物２０１からの生物学的物質２０２の放出の説明図である。図９は、本発明の実施形態による生物学的物質２０２の捕捉の拡大の説明図である。 図８は、図３のステップ（ｄ）に対応する。この実施形態では、ステップ（ｃ）が実行されるので、複数の磁性ナノ粒子３００は、少なくとも１つの第１のリガンド３０２を介して分析物２０１を捕捉しているので、距離が複数の磁性ナノ粒子３００と分析物２０１との間の距離は非常に近い。複数の磁性ナノ粒子３００は、エネルギー供給モジュール５００によって提供される外部エネルギーＢを吸収し、それを本体３０１の光熱効果特性によって熱に変換する。複数の磁性ナノ粒子３００がブラスト温度まで上昇したという前提の下で、分析物２０１は、そのシェル構造（細胞膜、細胞壁など、しかしこれらに限定されない）を劣化および破裂させる。高熱の物理的作用により、分析物２０１の溶解すること(cell lysis)をとした目的に達する。 したがって、ステップ（ｄ）を完了した少なくとも１つの分析物２０１は、破裂し、少なくとも１つの生物学的物質２０２を放出する。
この実施形態では、前述の生物学的物質２０２は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である。図２に示すように、分析物２０１は、複数の磁性ナノ粒子３００が極めて接近した状態で爆発するため、分析物２０１から放出された生物学的物質２０２は高濃度で磁性ナノ粒子３００の周囲に解放される。このようにして、図３のステップ（ｅ）で説明したように、複数の磁性ナノ粒子３００が少なくとも１つの生物学的物質２０２と結合する（図９参照）。分析物が遊離核酸物質である場合、ステップ(b)が実行され、ステップ(e)に直接入る。このとき、少なくとも1つのエネルギー供給モジュールは、外部エネルギー源を結合温度まで複数の粒子に提供する。これにより、複数の磁性ナノ粒子３００が遊離核酸物質と結合する。また、複数の磁性ナノ粒子３００が少なくとも１つの生物学的物質２０２または遊離核酸物質と結合できるのは、磁性ナノ粒子３００が第２リガンド３０３を有するためである（図２参照）。
この実施形態では、生物学的物質２０２がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）であるため、第２のリガンド３０３もそれに応じて生物学的物質２０２に相補的なデオキシリボース核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)の短い鎖を選択する。 したがって、少なくとも１つの生体物質２０２と結合できるという目的は達成される。
次に、図３と図１０を同時に参照してください。図１０は、本発明の実施形態の検出反応の説明図であり、図３のステップ（ｅ）～（ｆ）に対応する。 図９に示すように、ステップ（ｅ）が複数の磁性ナノ粒子３００を少なくとも１つの生物学的物質２０２と結合させた後、図１０に示すように、複数の磁性ナノ粒子３００は磁性要素６００を通して濃縮される。
このように、ポリメラーゼ４００は、複数の磁性ナノ粒子３００上に捕捉された生物学的物質２０２がステップ（ｆ）を実行するのを支援し、エネルギー供給モジュール５００は、外部エネルギーＢを提供して空間１００内の複数の磁性ナノ粒子３００を反応させてサーモスタット増幅温度になるまで。このとき、複数の磁性ナノ粒子３００は、ポリメラーゼ４００を介して少なくとも１つの生物学的物質２０２を増幅すると同時に、酵素と結合した核酸マーカー３０６２の蛍光Ｆまたは色変化を生じる。本実施形態の温度平衡物質２０３は、例えば、大容量（例えば、１００マイクロリットル以上）のＰＣＲ増殖反応液であり、比熱が大きい性質の熱容量を有し、磁性ナノ粒子３００を急速に冷却し、核酸増幅反応を実行するための急速な温度サイクルを達成する。
上述のように、ステップ（ｂ）でポリメラーゼ４００が添加された場合、この実施形態におけるポリメラーゼ４００は、少なくとも１つの生物学的物質２０２のタイプに対応し、DNA ポリメラーゼ(DNA Polymerase)、RNA ポリメラーゼ(RNA Polymerase)、または逆転写酵素(reverse transcriptase)を選択する必要があり、その後のステップ（ｆ）で行うことができる。本発明の他の実施形態では、ポリメラーゼ４００をステップ（ｅ）～（ｆ）の間に添加することも可能であり、本発明はポリメラーゼ４００を添加するタイミングを限定しない。
従来技術と比較して、本件の実施形態に記載の核酸増幅産物は、反応空間１００ではなく、ナノ粒子の表面の第２のリガンド３０３上にのみ存在し、ナノ粒子の表面上でインサイチューポリメラーゼ連鎖反応(in-situ PCR)を実行される。この場合の実施形態では、インサイチュー増殖増幅全体の運搬能力は、反応空間１００全体におけるポリメラーゼ連鎖反応の運搬能力よりもはるかに小さい。 したがって、ナノ粒子上の核酸担持能力が飽和に達する限り、すなわち、比較的短い時間または比較的少数の核酸増幅サイクルで、飽和を達成することができる。
次に、本実施形態のステップ（ｇ）では、蛍光強度の違いを蛍光光度計や蛍光スキャナーなどの検出装置で解析する。 あるいは、分光測光検出装置を使用して、核酸マーカー3062または増幅された生物学的物質２０２または遊離核酸に結合した抗体結合酵素反応によって生じる色の変化を識別する。本実施形態のステップ（ｇ）において、核酸マーカー３０６２は、例えば、抗体が認識可能なＤＮＡマーカーであり、抗体がＤＮＡ断片を認識した後のカップリングエンザイム反応により生じる色の変化を解析することができる。これにより、ポリメラーゼによって増幅された生物学的物質２０２が検出される。
蛍光Ｆまたは核酸マーカー３０６２による色変化の原因については、図２を参照してください。この実施形態では、遊離の核酸プライマー３０６は、蛍光基３０６１または核酸マーカー３０６２をさらに有する。換言すれば、サンプル２００中の少なくとも１つの分析物２０１が正しい少なくとも１つの生物学的物質２０２を放出することができる場合、またはサンプル２００が遊離の核酸物質を含む場合、第２のリガンド３０３は生物学的物質２０２または中性核酸物質の配列は相補的であり、鋳型としてポリメラーゼ４００の増幅作用により遊離核酸プライマー３０６と反応する。 このようにして、蛍光基３０６１または核酸マーカー３０６２が増幅産物に包埋される。逆に、サンプル２００中の少なくとも１つの分析物２０１が正しい少なくとも１つの生物学的物質２０２を放出できない場合、またはサンプル２００中に遊離の核酸物質がない場合、第２のリガンド３０６上の蛍光基３０６１または核酸マーカー３０６２では、ポリメラーゼ４００は増幅しないので、蛍光Ｆまたはその後の色度に変化はない。
前述のように、ナノ粒子上のアンプリコン（amplicon）によって生成される蛍光 Fの信号検出の例がいくつかあり、ここでは限定されません。 好ましい実施形態の１つとして、蛍光法を使用することができ、蛍光基３０６１で標識されたプライマーを使用することができる。この実施形態では、蛍光基３０６１はフルオレセインイソチオシアネート（Fluorescein isothiocyanate , FITC）から選択することができる。 したがって、蛍光基３０６１がＦＩＴＣ（Fluorescein isothiocyanate , FITC）である場合、本実施形態では、大腸菌ｍａｌＢ遺伝子を特異的に識別できる一対のプライマー（Ｆ３＆Ｂ３）を設計する。 F3 は、ストレプトアビジンとビオチンを介して、またはカルボキシルとアミン架橋の共有結合を介してナノ粒子に結合します。さらに、B3 プライマーは、フルオレセインイソチオシアネートとその 5 末端によるキャリブレーションにFITC-B3 プライマーを使用します。 しかしながら、実際には、蛍光基３０６１およびプライマーの選択は、異なる検出要件に従って任意に置き換えることができ、これは本発明によって限定されない。まとめると、本実施形態では、上述のインサイチュー核酸増幅を行う際に、磁性ナノ粒子３００の表面に蛍光基３０６１で標識されたアンプリコン（アンプリコン）が形成される。フリーフォーム(free form)ＦＩＴＣ－Ｂ３プライマーに関しては、磁性ナノ粒子３００を磁気的に把持し、洗浄することにより除去することができる。さらに、磁性ナノ粒子３００の表面上の蛍光Ｆシグナルは、後続の操作において磁力（または遠心手段の組み合わせ）によって濃縮されて集中されることができる。アンプリコン(amplicon)自体の長さにより、蛍光 F シグナルは磁性ナノ粒子３００の表面に適切なスペーサー(spacer)を形成し、磁性ナノ粒子３００と蛍光基３０３１が金属効果 (金属増強蛍光、MEF )及び蛍光 F 強度を高め、蛍光スキャナーまたは蛍光分光法で分析する。
本発明の別の実施形態は、ラテラルフローディップスティックを使用して、ナノ粒子上のアンプリコンによって生成された比色シグナルを検出するための方法を開示する。この方法は、従来のイムノゴールドが検査対象の抗体に結合する従来のラテラルフローイムノゴールド法とは少し異なります。 ただし、本実施例の検出工程では、抗体に結合した金コロイド粒子を添加せず、蛍光基３０３１を認識する抗体をラテラルフローの検出ラインに固定するだけである。 標的アンプリコン（アンプリコン）を含む液体が流れると、標的アンプリコン（アンプリコン）が検出ライン上に固定され、検出信号が得られます。 コントロールラインには、磁性ナノ粒子３００自身を認識する第１のリガンド３０２のみが固定化されている。
蛍光Ｆシグナルを検出する上記の実施形態に加えて、ビーズベースのＥＬＩＳＡおよびリトマス試験などの方法もあり、本発明は上記の実施形態に限定されない。ビーズベースの ELISA の目的は、蛍光法の感度を高めること、または蛍光 F シグナルを比色法に変換することである。この方法では、ホースラディッシュ ペルオキシダーゼ(HRP)と組み合わせることで、蛍光基 3031(FITC)の抗体を特異的に認識することができる。テトラメチルベンジジン基質（TMB基質）が西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)によって青色の生成物に変換された後、酸性化によって西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)の反応が停止し、450 ナノメートル(nm)の波長で磁性ナノ粒子３００の表面でインサイチューで増幅された核酸産物が検出される。
リトマス試験(Litmus test)は、上記の磁気ビーズベースの酵素結合免疫吸着アッセイ (Bead-based ELISA)と同じ目的を持っていますが、違いは特異的な抗体の認識ではなく、インサイチューポリメラーゼ鎖の反応(in-situ PCR)におけるリバースプライマーで、ウレアーゼで標識されたDNA断片に結合できるタグ (conjugated urease-DNA (UrD) binding tag)を設計して保存する。共役ウレアーゼ DNA (UrD) は、一本鎖ヌクレオチド結合ウレアーゼである。 ウレアーゼ（ウレアーゼ）は、尿素（尿素）を分解してアンモニア（NH3）を生成し、反応液中のpH値を上昇させます。この点に関して、磁性ナノ粒子３００上のアンプリコンの量は、酸塩基指示薬としてフェノールレッドまたはクレゾールレッドを使用することによって比色差に変換することができる。
本発明の実施形態をすると、単一の反応空間１００内での濃縮およびサンプル２００の処理およびスクリーニングなどの複数の制限を同時に克服することができ、また精密な磁性ナノ粒子３００の特定の設計、光熱特性および磁気特性によっても克服することができる。同時に、本発明の実施形態は、加熱源（ヒーター）と単一の担体（担体）の機能を達成することができ、分析物２０１がサンプル２００中に存在するかどうかを迅速かつ視覚的に識別することができる。 特に、サンプル２００中の温度平衡物質２０３は、ポリメラーゼ連鎖反応の温度サイクルを加速することができ、これまで時間のかかる検出プロセスを大幅に短縮することができる。
本発明の実際の動作をより明確に理解するために、図１１から図２３の実験データを参照してください。
図１～１０に示される本発明の一実施形態では、磁性ナノ粒子３００は、光熱温度変化実験用の磁性金ナノ粒子（磁性金ナノシェル、ＭＧＮ）から作製される。この実施形態では、水中の磁性ナノ粒子３００の濃度は２.９×１０10粒子／ｍｌであり、エネルギー供給モジュール５００は、異なるワット数エネルギー（２００ｍｗ～７００ｍｗ）で、外部エネルギー源Ｂとして８０８ｎｍの波長を有するレーザー光を使用して磁性ナノ粒子３００を加熱し、光熱反応変化を発生させる。
図１１を参照すると、図１１は、レーザー光の異なる強度（２００ｍｗ～７００ｍｗ）を使用して、エネルギー供給モジュール５００によって生成される光および熱変化によって引き起こされる周囲温度から安定状態までの温度変化を示すグラフである。磁性ナノ粒子３００に印加されるエネルギー。 図１２は、磁性ナノ粒子３００として磁性金ナノ粒子(Magnetic Gold Nanoshells, MGNs)を用いた場合の、磁性ナノ粒子３００に照射するレーザー強度と粒子周囲温度との関係を示すグラフである。この例では、磁性金ナノ粒子 (Magnetic Gold Nanoshells、MGNs) の温度は、波長 808 nm のレーザー光で5分間加熱した後、定常状態まで上昇し、次に K 型熱電対(k-type thermocouple)加熱プロセス全体を検出する。図１２から、磁性金ナノ粒子(Magnetic Gold Nanoshells, MGNs)から選択された磁性ナノ粒子３００の定常状態温度は、外部エネルギー源のレーザー強度に直線的に関連することが分かる。 さらに、図１２の薄い灰色の帯および濃い灰色の帯は、磁性ナノ粒子３００が光熱開裂および定温ループ増幅反応（ＬＡＭＰ）を行うのに最適な温度範囲をそれぞれ示す。図１３は、磁性ナノ粒子３００をレーザーで加熱し、水中で光熱反応を行い、恒温循環増幅反応を行ったときの温度変化を示すグラフである。図１３に示すように、波長８０８ｎｍのレーザー光を３００ｍｗ～７００ｍｗのパワーで磁性ナノ粒子３００に照射し、光熱反応分解を５分間行う。 次に、磁性ナノ粒子３００の温度は、粒子上にＤＮＡを捕捉するように、１０ｍｗ～５０ｍｗの印加電力でゆっくりと下げられる。最後に、磁性ナノ粒子３００に対する恒温循環増幅反応は、２００ｍｗ～２５０ｍｗの適用電力のレーザーで実施され、維持時間は３０分である。
本発明の別の実施形態では、ポリピロールで覆われた酸化鉄粒子(PPy-enveloped Fe3O4 particles)を磁性ナノ粒子３００として使用して、光熱温度変化実験を行う。この例では、水中のポリピロール キャップ酸化鉄粒子(PPy-capped Fe3O4 particles)の濃度は1000ppmであり、波長 808 nm のレーザー光も異なるワット数エネルギー (200mw～1000mw) での加熱に使用される。ポリピロールで覆われた酸化鉄粒子 (PPy-enveloped Fe3O4 particles) が光熱反応の変化を起こす。
図 14 を参照してください。図 14 は、磁性ナノ粒子３００に適用されるさまざまな強度 (200mw～1000mw) のレーザー光の使用と、ポリピロールで覆われた酸化鉄粒子 (PPy-enveloped Fe3O4 particles) の使用を示し、周囲温度が定常状態への温度変化グラフである。図 15 は、ポリピロール外層のない酸化鉄粒子 (Fe3O4 particles) に異なる強度 (200mw-～1000mw) のレーザー光を照射したときの、光熱変化による周囲温度から安定状態までの温度変化を示す図である。図１６は、磁性ナノ粒子３００としてポリピロール被覆酸化鉄粒子(PPy-enveloped Fe3O4 particles)を用いた場合の、磁性ナノ粒子３００に照射するレーザー強度と粒子周囲温度との関係を示すグラフである。この実施形態では、波長８０８ｎｍのレーザー光で５分間加熱した後、磁性ナノ粒子３００として使用されるポリピロール被覆酸化鉄粒子(PPy-enveloped Fe3O4 particles)の温度が安定状態に上昇し、その後、Ｋ型熱電対(k-type thermocouple)は、加熱プロセス全体を検出する。図１６を参照すると、磁性ナノ粒子３００がポリピロール被覆酸化鉄粒子(PPy-enveloped Fe3O4 particles)からなる場合、定常状態温度は、外部エネルギーのレーザー強度と線形関係を有することが分かる。さらに、図１６の薄い灰色の帯および濃い灰色の帯のそれぞれは、磁性ナノ粒子３００が光熱開裂および恒温循環増幅反応(ＬＡＭＰ)のために、ポリピロール覆われた酸化鉄粒子(PPy-enveloped Fe3O4 particles)でできていることを示している。図１７は、磁性ナノ粒子３００としてポリピロール被覆酸化鉄粒子(PPy-enveloped Fe3O4 particles)をレーザー加熱し、水中で光熱反応させて恒温循環増幅を行った場合の温度変化を示すグラフである。図１７に示すように、磁性ナノ粒子３００であるポリピロール覆われた酸化鉄粒子(PPy-enveloped Fe3O4 particles)に波長８０８ｎｍのレーザー光を５００ｍｗ～１０００ｍｗのパワーで照射すると、5分間ぐらい光熱反応分解が起こる。次に、磁性ナノ粒子３００であるポリピロール被覆酸化鉄粒子(PPy-enveloped Fe3O4 particles)に２０ｍｗ～８０ｍｗの電力を加え、徐々に温度を下げてＤＮＡを磁性ナノ粒子３００に捕捉する。 最後に、磁性ナノ粒子３００であるポリピロール被覆酸化鉄粒子(PPy-enveloped Fe3O4 particles)に出力３００ｍｗ～４５０ｍｗのレーザーを照射し、３０分間ぐらい恒温循環増幅反応を行う。
図１８を参照して、前述の実施形態をさらに説明する。図１８は、磁性ナノ粒子３００としてポリピロール被覆酸化鉄粒子(PPy-enveloped Fe3O4 particles)を用いて光熱反応により大腸菌を溶菌した場合の細菌生存率と周囲温度との関係を示すグラフである。図 18 に示すように、検体の光熱分解の最適出力は700mw ～ 800mwであり、その操作条件は、磁性ナノ粒子 300 として 1000ppm の濃度でポリピロール被覆酸化鉄粒子(PPy-enveloped Fe3O4 particles)を提供することであり、最適なバースト温度範囲の最適な効果は、正確には最高温度ではありません。
図１９を参照して、上述の実施形態を以下にさらに説明する。図１９は、前の実施例において細菌の光熱溶解を使用し、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ‐ＰＣＲ）によってジェノソームＤＮＡおよびプラスチドＤＮＡの放出を定量化する効果を示すグラフである。実験データは、磁性ナノ粒子３００として(PPy-enveloped Fe3O4 particles)を使用する場合、近赤外レーザー光による光熱反応分解の効果が、従来の熱分解方法よりも優れていることを確認した。
さらに、図２０を参照して、前述の実施形態を説明する。図２０は、コピー数(copy number)および蛍光強度(fluorescence intensity, FI)によってフォトニックインサイチューＬＡＭＰ(photonic in-situ LAMP)の感度性能(sensitivity)の評価を示す図である。図 20 から、反応 30 分後に蛍光強度が閾値（テンプレートなしのコントロール群の蛍光強度に三つの標準偏差を加えた値）に達すると、遺伝子本体の DNA のコピー数が102 と 103 の間の大腸菌の最低濃度である。さらに、図２１を参照して、従来の恒温循環増幅反応を使用して同じ実験を行う状況を説明する。図 21 は、コピー数(copy number)および蛍光強度(fluorescence intensity, FI)によって、さまざまな時点での従来の恒温循環増幅反応(LAMP)の感度性能(sensitivity)の評価を示す図である。図 20 と図 21 を比較すると、フォトニックインサイチューＬＡＭＰ(photonic in-situ LAMP)の感度が従来の定温循環増幅 (LAMP) の感度よりも優れていることがわかる。
図２２は、粒子と結合する酵素イムノアッセイ(bead-based ELISA)を使用したフォトニックインサイチューＬＡＭＰ(photonic in-situ LAMP)の性能の評価を示す図である。この実施形態では、同様に、７００～８００ｍｗ（ミリワット）のレーザー光エネルギーが適用されるとき、分析物タンパク質のより良好な信号性能が存在する。
図２３は、本発明の一実施形態による磁性ナノ粒子を前記磁性金ナノシェル(Magnetic Gold Nanoshells, MGNs)が、増幅サイクル(cycle)と検出された蛍光強度(normalized fluorescence intensity)との間の関係をさらに評価するために、2段階フォトニックインサイチューＬＡＭＰ(photonic in-situ LAMP)を行うことの説明図である。この実施形態では、前述の磁性金ナノシェル(ＭＧＮ)を磁性ナノ粒子３００として選択して光熱反応実験を行い、２段階の光熱インサイチュポリメラーゼ連鎖反応(photonic in-situ LAMP)を用いて増幅サイクル数と検出された蛍光強度(normalized fluorescence intensity)との関係をさらに評価する。 この実施形態では、２段階のポリメラーゼ連鎖反応が採用され、段階ごとに異なる強度のレーザー光エネルギーが入力され、 第１の実施形態では、４５７ｍｗが１０秒間使用され、次に２４０ｍｗが６０秒間使用される。 さらに、他の例では、400 mw を 10 秒間使用した後、145 mw を 60 秒間使用しました。図２３から、一実施形態では、増幅サイクル数が２０サイクルから３０サイクルに達すると、結合強度が飽和に達するため、３０サイクルに達したときに検出される蛍光強度がそれに応じて増加することが分かる。別の実施形態では、改善後、サイクル数が３０に達すると蛍光強度が増加する。 換言すれば、この他の実施形態は、より低いエネルギーを適用することによって、増幅された核酸の結合強度を効果的に増加させることができる。 増幅サイクル数と検出された蛍光強度との間の正の相関は、核酸の結合強度および増幅された核酸の飽和度によって制限されることが分かる。
本発明の精神と範囲を逸脱しない範囲で、本発明に種々の改良および変形ができることは、当業者には明らかであろう。本発明を開示された特定の形態（単数または複数）に限定するように意図しておらず、逆に、その意図は、添付された特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲に該当する全ての修正物、代替構築物、および均等物を包括することである。従って、本発明は、添付された請求項およびそれらの均等物の範囲内にあるという条件で、この発明の修正物および変形に及ぶ、ということが意図される。
１０ 核酸増幅システム、
１００ 反応空間、
２００ サンプル、
２０１ 分析物、
２０２ 生物学的物質、
２０３ 温度平衡物質、
３００ 磁性ナノ粒子、
３０１ 本体、
３０２ 第１のリガンド、
３０３ 第２のリガンド、
３０４ 安定化構造、
３０５ アプタマー、
３０６ 遊離の核酸プライマー、
３０６１ 蛍光基、
３０６２ 核酸マーク、
４００ ポリメラーゼ、
５００ エネルギー供給モジュール、
６００ 磁性要素、
B 外部エネルギー源、
F 蛍光
１００ 反応空間、
２００ サンプル、
２０１ 分析物、
２０２ 生物学的物質、
２０３ 温度平衡物質、
３００ 磁性ナノ粒子、
３０１ 本体、
３０２ 第１のリガンド、
３０３ 第２のリガンド、
３０４ 安定化構造、
３０５ アプタマー、
３０６ 遊離の核酸プライマー、
３０６１ 蛍光基、
３０６２ 核酸マーク、
４００ ポリメラーゼ、
５００ エネルギー供給モジュール、
６００ 磁性要素、
B 外部エネルギー源、
F 蛍光
Claims (24)
- 核酸増幅システムであって、
反応空間と、
前記反応空間に配置された、少なくとも１つの分析物を含むサンプルと、
前記サンプルと混合された多数の粒子であって、それぞれの前記粒子が本体と、前記本体上に提供されて前記少なくとも１つの分析物と一致する少なくとも１つの第１のリガンドと、前記本体上に提供されて特定のマークを含む少なくとも１つの第２のリガンドと、を含む多数の粒子と、
前記サンプルと混合された少なくとも1つの酵素と、
外部エネルギー源を前記多数の粒子に提供する少なくとも１つのエネルギー供給モジュールと、
前記反応空間に配置された少なくとも１つの温度平衡化物質と、
前記反応空間内の前記多数の粒子を制御する制御モジュールと、を備える核酸増幅システム。 - 前記多数の粒子がナノ粒子であることを特徴とする、請求項1に記載の核酸増幅システム。
- 前記温度平衡化物質は冷却物質であることを特徴とする、請求項1に記載の核酸増幅システム。
- 前記少なくとも１つの分析物は、少なくとも１つの細胞、少なくとも１つの細胞小器官、少なくとも１つの細菌、少なくとも１つのウイルス、少なくとも１つの原生生物、少なくとも１つの遊離核酸物質、またはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項1に記載の核酸増幅システム。
- 前記少なくとも１つの遊離核酸物質は、体液、腫瘍、またはそれらの組み合わせに由来する遊離核酸物質であることを特徴とする、請求項4に記載の核酸増幅システム。
- 前記少なくとも１つの第１のリガンドまたは前記少なくとも１つの第２のリガンドは、抗体、アプタマー、オリゴヌクレオチド（oligonucleotide）またはそれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項1に記載の核酸増幅システム。
- 前記少なくとも１つの第１のリガンドおよび前記少なくとも１つの第2のリガンドのそれぞれは、安定な構造を介して前記本体に結合され、前記安定な構造は熱的に安定な結合、接触抑制コーティング、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項1に記載の核酸増幅システム。
- 前記特定のマークは、蛍光基または核酸マーカーであることを特徴とする、請求項1に記載の核酸増幅システム。
- 前記少なくとも1つの酵素はポリメラーゼであることを特徴とする、請求項1に記載の核酸増幅システム。
- 前記ポリメラーゼは、デオキシリボ核酸ポリメラーゼ（DNA Polymerase）、リボ核酸ポリメラーゼ（RNA Polymerase）、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項9に記載の核酸増幅システム。
- 前記少なくとも1つの酵素は、逆転写酵素（reverse transcriptase, RT）、リボヌクレアーゼ（ribonuclease, RNase）、ヘリカーゼ（helicases）、DNAリガーゼ、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項1に記載の核酸増幅システム。
- 前記少なくとも１つのエネルギー供給モジュールは、レーザーエミッター、発光ダイオード、または磁場発生器であることを特徴とする、請求項1に記載の核酸増幅システム。
- 前記外部エネルギー源は、光エネルギーまたは交流磁場であることを特徴とする、請求項1に記載の核酸増幅システム。
- 前記制御モジュールは、磁気要素、遠心装置、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項1に記載の核酸増幅システム。
- 前記制御モジュールが前記磁気素子を含む場合、前記多数の粒子は複数の磁性粒子を含むことを特徴とする、請求項14に記載の核酸増幅システム。
- 前記核酸増幅システムは検出モジュールをさらに含み、前記検出モジュールは、制御モジュールによって濃縮されて凝集された前記多数の粒子の前記少なくとも１つの第２のリガンドのそれぞれに含まれる、前記特定のマーカーを検出することを特徴とする、請求項1に記載の核酸増幅システム。
- 請求項１に記載の核酸増幅システムの方法であって、（ａ）サンプルが多数の粒子と混合することによって、少なくとも１つの分析物を捕捉するステップと、（ｂ）反応空間に制御モジュールを使用して不純物を除去し、前記サンプルを濃縮し、前記サンプルは前記少なくとも1つの分析物を含み、前記少なくとも1つの分析物が遊離核酸物質である場合、直接ステップ（e）にに進み、そうでない場合はステップ（c）を実行するステップと、（c）少なくとも１つのエネルギー供給モジュールは、前記多数の粒子が爆発温度まで上昇するように、外部エネルギー源を前記多数の粒子に提供するステップと、（ｄ）前記少なくとも１つの分析物が破裂して少なくとも１つの生物学的物質を放出するステップと、（e）前記少なくとも１つのエネルギー供給モジュールは、結合温度まで前記外部エネルギー源を前記多数の粒子に提供し、前記多数の粒子を前記少なくとも１つの生物学的物質または前記遊離核酸物質と結合させ、前記制御モジュールを介して前記多数の粒子をグループ化するステップと、（ｆ）前記少なくとも１つのエネルギー供給モジュールは前記多数の粒子に前記外部エネルギー源を提供して特定の増幅温度になるまで、前記酵素を介して前記多数の粒子上の前記少なくとも１つの生物学的物質または前記遊離核酸物質をインサイチュで増幅し、増幅された前記少なくとも１つの生物学的物質または前記遊離核酸物質が前記多数の粒子と接触するステップと、を備える核酸増幅システムの方法。
- 前記ステップ（ｆ）に続くステップ（ｇ）は、増幅された前記少なくとも１つの生物学的物質または前記遊離核酸物質上の前記特定のマークによって生成される色の変化、発光、またはそれらの組み合わせを、検出モジュールを介して識別し、濃縮後に多数の粒子上で増幅された前記少なくとも１つの生物学的物質または前記遊離核酸物質を検出することを特徴とする、請求項17に記載の核酸増幅システムの方法。
- 前記酵素は、前記少なくとも１つの生物学的物質または前記遊離核酸物質のタイプに対応し、少なくとも１つのポリメラーゼが選択され、前記少なくとも１つのポリメラーゼは、デオキシリボ核酸ポリメラーゼ（DNA Polymerase）、リボ核酸ポリメラーゼ（RNA Polymerase）であることを特徴とする、請求項17に記載の核酸増幅システムの方法。
- 前記制御モジュールは、磁気要素、遠心装置、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項17に記載の核酸増幅システムの方法。
- 前記ステップ（ａ）における前記多数の粒子は、前記少なくとも１つの第１のリガンドを前記少なくとも１つの分析物と一致させ、前記少なくとも１つの分析物を捕捉することを特徴とする、請求項17に記載の核酸増幅システムの方法。
- 前記ステップ（ｅ）の前記多数の粒子は、前記少なくとも１つの第２のリガンドによって前記少なくとも１つの生物学的物質または前記遊離核酸物質に連結されることを特徴とする、請求項17に記載の核酸増幅システムの方法。
- 前記ステップ（ｆ）において前記酵素を介して前記少なくとも１つの生物学的物質を増幅する方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）または核酸恒温増幅反応を含むことを特徴とする、請求項17に記載の核酸増幅システムの方法。
- 前記ステップ（ｆ）において少なくとも１つの温度平衡物質が前記多数の粒子を急速に冷却し、それによって急速な温度サイクルを達成することを特徴とする、請求項17に記載の核酸増幅システムの方法。
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