CN101063128A - 基于纳米磁珠快速提取植物病毒核酸的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
将纳米磁珠加入含有植物病毒的水溶液中，纳米磁珠与病毒形成磁珠－病毒复合物，外加磁场将复合物从水溶液中分离，将复合物重新分散到水溶液中并加热，病毒裂解其核酸释放到溶液中，从而实现植物病毒核酸的快速提取。这种方法步骤少，操作方便；时间短，能够有效地防止核酸特别是RNA的降解，利于下一步的PCR扩增；不需要有毒或有害试剂，利于身体健康和环境保护，纳米磁珠比表面积大，能够高效富集植物病毒。
Description
[技术领域]
本发明涉及植物病毒核酸分离及鉴定领域。具体而言，纳米磁珠与植物病毒形成磁珠-病毒复合物，加热复合物使病毒核酸释放到溶液中，实现病毒核酸的快速提取，涉及植物病毒核酸分离方法、试剂盒及应用。
[背景技术]
植物病毒的分子生物学的鉴定是研究分子植物病理及预防控制植物病毒传播的基础，植物病毒核酸的提取是分子生物鉴定的前提。目前植物病毒核酸的提取通常采用Trizol试剂方法。然而，这种方法存在一些问题：1、操作步骤复杂，对实验人员要求较高；2、耗费时间长，核酸特别是RNA容易降解；3、试剂含有毒有害化学成分，损害人体污染环境；4、试剂昂贵，增加实验成本。
近年来，磁珠分离动物病毒核酸的方法有报道。这种方法，磁珠吸附的是核酸，病毒首先需要裂解释放出核酸。缺点如下：1、针对核酸的操作步骤多，包括核酸从病毒释放，在磁珠表面吸附和从磁珠表面洗脱等，核酸容易受到损害或降解；2、在病毒裂解及核酸吸附过程中往往用到异硫氰酸胍等有毒有害试剂；3、磁珠直径是微米级，吸附能力有限。
[发明内容]
本发明目的是利用纳米磁珠实现植物病毒核酸的快速提取。
本发明的技术方案是以纳米磁珠为载体来吸附植物病毒。含有植物病毒的水溶液中加入纳米磁珠，纳米磁珠与病毒形成磁珠-病毒复合物，外加磁场将复合物从水溶液液中分离，将复合物重新分散到水溶液中并加热，病毒裂解其核酸释放到溶液中，从而实现植物病毒核酸的快速提取。
本发明的优点，1、磁珠吸附的是病毒，针对核酸的直接操作步骤少利于保护核酸；2、操作方便时间短，30分钟可完成操作过程能够有效地防止核酸特别是RNA的降解，利于下一步的PCR扩增；3、不需要有毒或有害试剂，利于身体健康和环境保护；4、与微米磁珠相比，纳米磁珠比表面积增加几个数量级能够高效富集植物病毒。
[附图说明]
图1不同纳米磁珠快速提取植物病毒核酸RT-PCR电泳图。
图中：
1 Marker
2 30纳米磁珠
3 300纳米磁珠
4 2000纳米磁珠
5 30纳米固定有抗体磁珠
6 300纳米固定有抗体磁珠
7 2000纳米固定有抗体磁珠
8 阳性对照
[具体实施方式]
1.30纳米、300纳米、2000纳米的磁珠按照文献(Nano Lett. Vol2，pp183，Chem.Phy.Lett.Vol 401，pp19)所描述的方法制备。
2.南芥菜花叶病毒抗体由美国Agdia公司购买。
3.磁珠氨基修饰后通过戊二醛将抗体固定到磁珠上。
4.南芥菜花叶病毒特异引物ArMV-FP/RP由北京赛百盛基因技术有限公司提供。
5.含有植物病毒溶液的制备。称取一定量的带南芥菜花叶病毒植物叶片，加入1ml PBS缓冲液，在研钵中研磨，收集研磨后的汁液于5000rmp的条件下离心5min，取上清备用。
6.纳米磁珠对病毒的吸附。40μl的病毒汁液上清用60μl的PBS液稀释，加入纳米磁性颗粒混匀，放置30min，其间颠倒混匀样品数次。用磁铁吸附纳米磁珠，移除上清，加入200μl PBS清洗纳米磁珠。
7.将纳米磁珠分散到水溶液中，95℃加热10min。用磁铁吸附纳米磁珠后，吸取5μl上清做RT-PCR检测。Trizol法提取的RNA经过RT-PCR后做为阳性对照。
本发明的优点：1、磁珠吸附的是病毒，针对核酸的直接操作步骤少利于保护核酸；2、操作方便时间短，30分钟可完成操作过程能够有效地防止核酸特别是RNA的降解，利于下一步的PCR扩增；3、不需要有毒或有害试剂，利于身体健康和环境保护；4、纳米磁珠能够高效富集植物病毒。
Claims (8)
1.基于纳米磁珠快速提取植物病毒核酸的方法，其特征在于包括下列步骤，
1)将纳米磁珠加入含有植物病毒的水溶液中，纳米磁珠与病毒形成磁珠-病毒复合物，2)外加磁场将复合物从水溶液中分离，3)加热复合物，病毒裂解其核酸释放到水溶液中。
2.根据权利要求1所述的基于磁珠快速提取植物病毒核酸的方法，其特征在于纳米磁珠表面固定有病毒抗体，特异吸附植物病毒形成复合体。
3.根据权利要求1所述的基于磁珠快速提取植物病毒核酸的方法，其特征在于纳米磁珠非特异吸附植物病毒形成磁珠-病毒复合体。
4 根据权利要求1和3任何一项所述的基于磁珠快速提取植物病毒核酸的方法，其特征在于纳米磁珠的直径为5-3000纳米。
5 根据权利要求1和3任何一项所述的基于磁珠快速提取植物病毒核酸的方法，其特征在于纳米磁珠的直径为10-800纳米。
6 根据权利要求1所述的基于磁珠快速提取植物病毒核酸方法的应用，其特征在于提取的核酸可应用于植物病毒分子生物学鉴定。
7 根据权利要求6所述的基于磁珠快速提取植物病毒核酸的方法的应用，其特征在于植物病毒为农业部1992年公布的“中华人民共和国进镜植物检疫危险性病、虫、杂草名录”中的植物病毒。
8 根据权利要求7所述的基于磁珠快速提取植物病毒核酸的方法的应用，其特征在于植物病毒为番茄环斑病毒、番茄黑环病毒、烟草环斑病毒、南芥菜花叶病毒、烟草脆裂病毒。
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| CN103820431A (zh) * | 2014-02-25 | 2014-05-28 | 苏州天隆生物科技有限公司 | 基于纳米磁珠的核酸提取纯化方法及试剂盒 |
| WO2022109863A1 (zh) * | 2020-11-25 | 2022-06-02 | 长庚大学 | 核酸扩增系统及其方法 |
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