CN111549181B - 一种检测禽腺病毒4型的纳米pcr方法、试剂盒及应用 - Google Patents

一种检测禽腺病毒4型的纳米pcr方法、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测禽腺病毒4型的纳米PCR方法和试剂盒，纳米PCR的反应体系中添加Ag/Au/Fe3O4纳米粒子和SEQ ID No.1‑2所示引物，并对反应体系和反应条件进行了优化。本发明采用Ag/Au/Fe3O4纳米复合材料不仅提高了PCR的扩增效率，灵敏度提高10倍，还有效的抑制了非特异性扩增，弥补了引物特异性不足的缺陷。

Description

一种检测禽腺病毒4型的纳米PCR方法、试剂盒及应用
技术领域
本申请涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种一种检测禽腺病毒4型的纳米PCR方法、试剂盒及应用
背景技术
肝炎-心包积液综合征是由禽腺病毒4型(FAdV-4)新基因型引起的以禽心包积液、肝脏黄染、肿大和出血为特征的传染病。2013年以来该病在我国山东、河南、河北、江苏、陕西等地大面积流行，给家禽养殖业造成巨大的经济损失。目前已报道的FAdV-4检测方法包括病毒分离与鉴定、ELISA、病毒中和试验等。
目前市面上已出现的纳米PCR检测试剂盒或者已报道纳米PCR检测方法，通常使用的纳米材料是金纳米,专利申请CN10784157A和CN109609698A中采用的也是市面上的常规检测试剂盒。金纳米良好的导热性，将金纳米添加在PCR反应体系中，金纳米在PCR反应液中形成纳米流体，使反应体系更快的达到目标温度，以提高PCR扩增效率。并且有研究报道使用磁性纳米粒子(Fe3O4)能有效的提高PCR扩增效率，也有研究报道使用银纳米粒子粒子能有效的提高PCR扩增效率。但是现有的各种纳米粒子对PCR扩增效率、扩增灵敏性和特异性改进效果有待进一步提高。
发明内容
本发明提供了一种检测禽腺病毒4型的纳米PCR试剂盒，该试剂盒包括Ag/Au/Fe3O4纳米粒子、上游引物和下游引物；上游引物的序列为5′-AGGACCTCCAACAGTTCATTT-3′，如序列表中SEQ ID No.1所示，下游引物的序列为5′-CCTCGGTCTAGGATTCCCT-3′，如序列表中SEQ ID No.2所示。
进一步的，试剂盒所构建的PCR反应体系中Ag/Au/Fe3O4纳米粒子的添加量为0.4μg/25μL。上游引物和下游引物的添加量为2.2μL/25μL。试剂盒还包括MgCl2，10×PCRbuffer，dNTP，Taq酶、阳性对照。
本发明还提供一种检测禽腺病毒4型的纳米PCR方法，该方法使用SEQ ID No.1所示的上游引物和SEQ ID No.2所示的下游引物扩增禽腺病毒4型的特异性片段，反应体系中添加有Ag/Au/Fe3O4纳米粒子。
进一步的，该纳米PCR的反应体系中，Ag/Au/Fe3O4纳米粒子的添加量为0.4μg/25μL，和/或上游引物和下游引物添加量为2.2μL/25μL，和/或纳米PCR反应退火温度为48℃。
进一步的，检测禽腺病毒4型的纳米PCR方法包括如下步骤：
1)提取样品DNA，获得扩增模板；
2)配制反应体系如下：25mmoL MgCl2 1μL，10×PCR buffer 2.5μL，10mmoL dNTP0.5μL，5units/μL Taq酶1μL，上游引物和下游引物各2.2μL,扩增模板1.0μL，Ag/Au/Fe3O40.4μg，ddH2O补充至25μL；
3)PCR反应条件：95℃5min；95℃30S、48℃30S、72℃1min，30个循环；72℃10min。
扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。
本发明还提供一种检测禽腺病毒4型的纳米PCR试剂盒、方法在禽腺病毒4型的流行性调查中的应用。
本发明的有益效果包括：本发明将Fe3O4、金纳米粒子、银纳米粒子有序组合，制备出Ag/Au/Fe3O4纳米复合材料，该复合材料集合了几种材料的优势:以磁性纳米粒子为核是因为，它具有磁性，在其外包裹上Ag/Au可以减少集聚，磁性纳米粒子为氧化物，导热性不如金纳米材料及银纳米材料，因此以Ag/Au作外层材料，可以有效提高Fe3O4热传导。本发明通过对纳米粒子、PCR扩增引物及反应条件的筛选和优化，不仅提高了禽腺病毒4型检测用PCR的扩增效率，灵敏度提高10倍，还有效的抑制了非特异性扩增，弥补了引物特异性不足的缺陷，显著提高PCR特异性。
附图说明
图1为加入不同体积的Ag/Au/Fe3O4时FAdV-4纳米PCR扩增凝胶电泳图，其中样品1-8分别为加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4μL Ag/Au/Fe3O4,N为阴性对照，M为DNA相对分子质量标准；
图2为不同退火温度下FAdV-4纳米PCR扩增凝胶电泳图，其中M为DNA相对分子质量标准，样品1-8的退火温度分别为45℃、46℃、48℃、51℃、54℃、57℃、59℃、60℃，N为阴性对照；
图3为不同引物浓度下FAdV-4纳米PCR扩增凝胶电泳图，其中样品1-17的引物添加体积分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4，N为阴性对照，M为DNA相对分子质量标准；
图4为不同FAdV-4DNA模板浓度下纳米PCR和常规PCR扩增凝胶电泳图，其中样品1-10依次为常规PCR将FAdV-4DNA模板稀释1-1×107倍，9-16依次为纳米PCR将FAdV-4DNA模板稀释1-1×107倍，N为阴性对照，M为DNA相对分子质量标准；
图5为FAdV-4常规PCR和纳米PCR特异性试验凝胶电泳图，其中，图5A为常规PCR凝胶电泳图，5B为纳米PCR凝胶电泳图，样品1-19依次为FAdV-1,FAdV-2,FAdV-3,FAdV-5,FAdV-6,FAdV-7,FAdV-8a,FAdV-8b,FAdV-9,FAdV-10,FAdV-11、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性贫血病毒、新城疫病毒、减蛋综合征病毒、禽呼肠孤病毒、H9亚型禽流感病毒、阴性对照、FAdV-4，M为DNA相对分子质量标准。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步说明和描述，但所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明和实施例中，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他发明和实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中,FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、硫酸、氨水、柠檬酸钠、四氯金酸购自国药集团化学试剂有限公司，Premix Taq(Ex Taq Version 2.0Plus dye)、100bp DNA Ladder购自TaKaRa。
实施例1、Ag/Au/Fe3O4的制备
Fe3O4的制备过程：4.64g FeCl3·6H2O和1.71g FeSO4·7H2O加入到250mL的去离子水中，然后加入2mL 0.2mol/L的硫酸用于阻止溶液中的Fe2+被氧化。再加入25％的氨水直到pH达到9.0～9.5，在室温下搅拌30min，氨基化之后，加热到80℃下继续搅拌30min，生成黑色悬浊液后超声10min。用磁铁分离，收集沉淀，并用热水反复洗涤沉淀，直到上清液变澄清。Fe3O4纳米粒子重悬于100mL的去离子水中并保存在容量瓶中，用于制备Ag/Au/Fe3O4纳米粒子。
0.229g柠檬酸钠溶解在100mL去离子水中，磁性搅拌下加热到95℃，再加入50mL上述制备得到的Fe3O4，然后加入10mL 10mmol/L四氯金酸及10mL 10mmol/L AgNO3，95℃下反应15min，最后移走热源，在室温下继续搅拌15min。当酒红色悬浊液冷却至室温后，再次用磁铁分离。70℃真空干燥，称重，最后将收集到的固体分散到去离子水中得到的1mg/mLAg/Au/Fe3O4悬浊液置于4℃下保持备用。
实施例2、纳米PCR方法的建立
1.PCR模板的准备
取FAdV-4GX0625(由广西壮族自治区兽医研究所分离并保存)鸡胚培养物上清液200μL按照EasyPure Genomic DNA Kit(购自北京全式金生物技术有限公司)的操作说明书提取样品中的DNA，于—70℃保存备用。
2.PCR引物设计
FAdV-4属于禽腺病毒Ⅰ群，呈12面体对称结构，病毒粒子大小在70～90nm。FAdV-4病毒粒子有252个衣壳粒，包含240个六邻体(Hexon)和12个五邻体(顶点衣壳粒)。研究表明，Hexon基因是特异性抗原决定簇，可以引发很强的中和反应，当六邻体发生变异将导致中和免疫的缺失，可作为诊断病毒的型和群的首先蛋白。FAdV-4的Hexon抗原表位主要集中在前段、中段，推测其具有型和群特异性表位。为此，本研究利用Hexon基因设计引物。参考Genbank上发表的FAdV-4基因序列(登录号：HQ709228.1)，针对FAdV六邻体Hexon基因设计并合成了1对引物，序列分别为上游引物(FAdv-4-253F):5′-AGGACCTCCAACAGTTCATTT-3′(92—112)，序列表中编号为SEQ ID NO.1；下游引物(FAdv-4-253R):5′-CCTCGGTCTAGGATTCCCT-3′(326—344)，序列表中编号为SEQ ID NO.2；目的片段大小为253bp。由华大基因生物科技(深圳)有限公司合成，超纯水稀释至10μmol/L，冷冻保存备用。
3.纳米PCR反应体系及条件优化
反应体系：TaKaRa Ex Taq(购自宝生物工程(大连)有限公司)(本发明中使用的TaKaRa Ex Taq可用25mmoL MgCl2 1μL,10×PCR buffer 2.5μL,10mmoL dNTP 0.5μL,5units/μL Taq酶1μL代替，差量ddH2O补齐，下同)12.5μL，上游引物/下游引物(10μmol·L-1)1.0μL,DNA模板1.0μL，Ag/Au/Fe3O41.0μL，ddH2O补充至25μL；反应条件预设定：95℃5min；95℃30S、55℃30S、72℃1min，30个循环；72℃10min。并采用二次去离子水代替DNA模版作为阴性对照。扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。
为了确定Ag/Au/Fe3O4最佳浓度，应用0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4μL Ag/Au/Fe3O4加入纳米PCR反应体系中进行扩增。扩增结果如图1所示，其中0.2～0.6μL有明显扩增条带，0.8～1.2μL对PCR扩增抑制逐步加强，1.4μL完全抑制PCR扩增。
用梯度PCR仪分别设置退火温度为45℃、46℃、48℃、51℃、54℃、57℃、59℃、60℃，反应体系和其它条件均相同，探索最佳退火温度。琼脂糖凝胶电泳结果见图2。由图2可知，45-60℃下，纳米PCR均可扩增得到目的条带，最佳退火温度为48℃
引物的使用体积从0.2到3.2μL进行优化，间隔0.2μL，按照优化后的Ag/Au/Fe3O4加入量(0.4μL)及退火温度(48℃)进行，扩增产物经1.0％琼脂凝胶电泳检测。结果如图3所示，当引物量为2.2μL时扩增效果最佳。
经反应退火温度、Ag/Au/Fe3O4浓度及引物浓度的摸索，最终确定FAdV-4纳米PCR反应体系：TaKaRa Ex Taq 12.5μL，上游引物/下游引物(10μmol·L-1)2.2μL,DNA 1.0μL，Ag/Au/Fe3O40.4μL，ddH2O补充至25μL；反应条件预设定：95℃5min；95℃30S、48℃30S、72℃1min，30个循环；72℃10min。
作为对比实验的常规PCR反应体系为：TaKaRa Ex Taq 12.5μL，上游引物/下游引物(10μmol·L-1)2.2μL,DNA 1.0μL，ddH2O补充至25μL；反应条件预设定：95℃5min；95℃30S、48℃30S、72℃1min，30个循环；72℃10min。
4.敏感性实验
测定抽提的病毒液DNA的浓度经测定为81ng·μL-1，将抽提的DNA进行10倍梯度稀释，得到浓度梯度(81～8.1×10-6ng·μL-1)模板标准品。取每个稀释度的DNA模板分别应用步骤3中优化后的纳米PCR和常规PCR方法进行扩增，扩增产物经1.0％琼脂凝胶电泳检测，比较两者的敏感性，实验重复三次。
琼脂糖凝胶电泳结果见图4，由图4可知，纳米PCR能检测到1×105倍稀释提取DNA(8.1×10-4ng·μL-1)，而常规PCR能检测到1×104倍稀释提取DNA(8.1×10-3ng·μL-1)，敏感性实验结果表明纳米PCR灵敏度比常规PCR方法高10倍。
5.特异性实验
应用纳米PCR和常规PCR分别对FAdV-4,FAdV-1,FAdV-2,FAdV-3,FAdV-5,FAdV-6,FAdV-7,FAdV-8a,FAdV-8b,FAdV-9,FAdV-10,FAdV-11、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性贫血病毒、新城疫病毒、减蛋综合征病毒、禽呼肠孤病毒及H9亚型禽流感病毒进行检测，以此验证纳米PCR的特异性，实验重复3次。
结果如图5所示，纳米PCR扩增中，只有FAdV-4能扩增出253bp的目的片段(图5B)，常规PCR扩增中，FAdV-4、FAdV-5、FAdV-6、FAdV-7及FAdV-8b均能扩增出253bp的目的片段(图5A),实验结果表明纳米PCR比常规PCR特异性高，Ag/Au/Fe3O4能有效抑制PCR非特异性扩增，提高特异性。
序列表
<110> 广西壮族自治区兽医研究所
<120> 一种检测禽腺病毒4型的纳米PCR方法、试剂盒及应用
<141> 2020-05-20
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggacctcca acagttcatt t 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cctcggtcta ggattccct 19

Claims (8)

1.一种检测禽腺病毒4型的纳米PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括Ag/Au/Fe3O4纳米粒子、上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为SEQ ID No.1所示，所述下游引物的序列为SEQ ID No.2所示；其中，所述Ag/Au/Fe3O4纳米粒子的制备如下：
1)4.64gFeCl3·6H2O和1.71gFeSO4·7H2O加入到250mL的去离子水中，加入2mL0.2mol/L的硫酸，再加入25％的氨水直到pH达到9.0～9.5，在室温下搅拌30min后，加热到80℃下继续搅拌30min，生成黑色悬浊液后超声10min，用磁铁分离，收集沉淀，先后用热水洗涤沉淀直到上清液变澄清，将收集的Fe3O4纳米粒子重悬于100mL的去离子水中并保存在容量瓶中；
2)0.229g柠檬酸钠溶解在100mL去离子水中，磁性搅拌下加热到95℃；再加入50mL步骤1)得到的Fe3O4纳米粒子，然后加入10mL10mmol/L四氯金酸及10mL10mmol/LAgNO3，95℃下反应15min，移走热源，在室温下继续搅拌15min，当酒红色悬浊液冷却至室温后，再次用磁铁分离；于70℃真空干燥，称重后将收集到的固体分散到去离子水中得到的1mg/mL Ag/Au/Fe3O4悬浊液，置于4℃下保持备用。
2.根据权利要求1所述的检测禽腺病毒4型的纳米PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括MgCl2，10×PCRbuffer，dNTP，Taq酶。
3.根据权利要求1所述的检测禽腺病毒4型的纳米PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照。
4.一种检测禽腺病毒4型的纳米PCR方法，其特征在于，所述方法使用权利要求1所述的上游引物和下游引物扩增禽腺病毒4型的特异性片段，所述纳米PCR的反应体系中添加有MgCl2、10×PCRbuffer、dNTP、Taq酶和权利要求1所述的Ag/Au/Fe3O4纳米粒子；所述方法不包括疾病的诊断和治疗方法。
5.根据权利要求4所述的检测禽腺病毒4型的纳米PCR方法，其特征在于，所述纳米PCR反应体系中，所述Ag/Au/Fe3O4纳米粒子的添加量为0.4μg/25μL。
6.根据权利要求5所述的检测禽腺病毒4型的纳米PCR方法，其特征在于，所述纳米PCR的反应体系中，所述上游引物和下游引物添加量为2.2μL/25μL，和/或所述纳米PCR反应退火温度为48℃。
7.根据权利要求6所述的检测禽腺病毒4型的纳米PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)提取样品DNA，获得扩增模板；
2)配制反应体系如下：25mmoLMgCl21μL，10×PCRbuffer2.5μL，10mmoLdNTP0.5μL，5units/μLTaq酶1μL，上游引物和下游引物各2.2μL，扩增模板1.0μL，Ag/Au/Fe3O40.4μg，ddH2O补充至25μL；
3)PCR反应条件：95℃5min；95℃30S、48℃30S、72℃1min，30个循环；72℃10min。
8.权利要求1-3任一项所述的检测禽腺病毒4型的纳米PCR试剂盒、权利要求4-7任一项所述的检测禽腺病毒4型的纳米PCR方法在禽腺病毒4型的流行性调查中的应用，所述应用不包括疾病的诊断和治疗方法。
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