CN111500784B - 一组用于不同类型鸭肝炎病毒鉴别诊断的引物组 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一组用于不同类型鸭肝炎病毒鉴别诊断的引物组，所述引物组序列如SEQ ID NO.1‑4所示，利用所述引物组构建获得鉴别诊断试剂盒，可同时对鸭甲肝病毒和鸭乙肝病毒进行鉴别。方法简便灵敏。当前国内外尚未见一组用于不同类型鸭肝炎病毒鉴别诊断的引物组相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。
Description
技术领域
本发明提供一组用于不同类型鸭肝炎病毒鉴别诊断的引物组，属于动物传染病学领域。
背景技术
国际病毒分类委员会（The International Committee on Taxonomy ofViruses，ICTV）2014年（EC 46, Kingston and Montreal, Canada, July 2014, Emailratification 2015 (MSL #29)）综合国际上对于鸭甲肝病毒（duck hepatitis A virus1-3，鸭甲肝病毒1型DHAV-1，鸭甲肝病毒2型DHAV-2和鸭甲肝病毒3型DHAV-3）的最新研究进展，将鸭甲肝病毒重新命名为禽甲肝病毒（Avihepatovirus A），在病毒分类学上属于小RNA病毒科（Picornaviridae）禽肝病毒属（Avihepatovirus）。为便于文献的前后统一和相关研究人员的研究习惯，本发明中仍称呼为鸭甲肝病毒（DHAV）。基因组学分析发现，鸭甲肝病毒完整基因组长约7.7kb，单股正链RNA。基因组RNA由5’非编码区（untranslated region,UTR）、一个开放阅读框（ORF）、3’UTR 和 poly（A）尾巴组成，它作为遗传物质稳定传代的同时还可以直接作为mRNA指导合成一条完整的病毒多肽链（polyprotein）（即开放阅读框ORF）。5’-UTR长626nt，含有丰富的二级结构。DHAV 的 3′-UTR 长为 314~317nt，为已知小RNA 病毒科成员中3′-UTR 最长的病毒。鸭甲肝病毒的ORF可进一步切割形成L-VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C-3D。关于鸭甲肝病毒各地的流行病学数据存在较大差异，1945年，第一株鸭病毒性肝炎病毒（即鸭甲肝病毒1型DHAV-1）发现于美国纽约长岛鸭场。1980年，王平等在北京地区分离到了第一株DHAV-1。随后，浙江、福建等地都先后报道了DHAV-1的发生和流行。苏敬良等于1999年5月从北京、广西疑似鸭肝炎的病死鸭体内分离到2 株病毒（分别编号为B株和G株），经鸭胚血清中和试验表明两者为同一血清型，但与经典DHAV-1无血清学交叉免疫反应，人工感染雏鸭可复制出与临床病例相似的病变，于是认为有新的血清型出现，并把分离到的病毒命名为新型DHAV，基因组序列测定表明该毒株与Kim报道的韩国新型鸭病毒性肝炎（即鸭甲肝病毒3型DHAV-3）同源性最高。此外研究发现，我国台湾地区存在一种和DHAV-1、DHAV-3基因组差异较大（核苷酸同源性低于80.0%）但具有DHAV基因组结构特征的鸭甲肝病毒2型（DHAV-2）（Tseng CH, Tsai HJ. Molecularcharacterization of a new serotype of duck hepatitis virus. Virus Res, 2007,126(1-2): 19-31.）。目前GenBank数据库仅2株DHAV-2基因组序列（90D株，GenBank登录号EF067924；04G株，GenBank登录号EF067923）。上述数据证实，我们鸭群中广泛存在鸭甲肝病毒（DHAV）流行。
1980年，Mason等人在美国饲养的北京鸭血清中发现有内源性DNA多聚酶活性的DNA病毒，并在肝脏中发现大量的病毒基因，将其命名为鸭乙型肝炎病毒（duck hepatitisB virus, DHBV）。进一步研究证实，DHBV的形态结构，核酸组成和生物学特性与人乙型肝炎HBV相似，且DHBV在感染鸭后也可引起肝炎及肝硬化，对养鸭业造成较大危害。DHBV的基因组长3021~3027bp，是由长链（负链）和短链（正链）所组成的闭合环状不完全双链DNA，其所有基因都位于负链。DHBV基因组包含3个开放性阅读框（ORF）：S-ORF、C-ORF、P-ORF。S-ORF编码外膜蛋白，C-ORF编码核心蛋白，P-ORF编码聚合酶蛋白。最近研究表明，DHBV也有缺少起始密码子的X-like-ORF。1983年，日本学者Omata最早研究了我国成年鸭DHBV感染率的地区差异性，上海市的感染率为22.5%，广西扶绥、隆县的为10%，崇明县为46%。这使人们开始认识到DHBV感染率的差异性。随后，中国科学家瞿涤等发现麻鸭对DHBV很易感，如昆山麻鸭的阳性率为46.5%。邓学龙等又研究了广州地区3个鸭种的1日龄雏鸭携带情况，研究结果显示广州麻鸭的阳性率为28%，樱桃谷鸭的为20%，绿头鸭的为80%。上述数据证实，我们鸭群中广泛存在鸭乙肝病毒DHBV流行。这就给在我国鸭群中开展不同类型鸭肝炎病毒（DHAV和DHBV）鉴别诊断带来现实需求。当前国内外尚未见一组用于不同类型鸭肝炎病毒鉴别诊断的引物组相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一组用于不同类型鸭肝炎病毒鉴别诊断的引物组，可以准确快速的判别临床送检病料中鸭甲肝病毒DHAV和鸭乙肝病毒DHBV感染情况。
为实现上述目的，采用以下技术方案：
一组用于不同类型鸭肝炎病毒鉴别诊断的引物组，所述引物如下所示：
DHABV-F1：5’- TTCATGTYTTTGATGATTTTG-3’；
DHABV-F2：5’- ACTACACAGGGCATGCATGA-3’；
DHABV-R1：5’- CTTTCCAHACCAACCAGCCA-3’；
DHABV-R2：5’- TTCTTCTTCTAGGTTCGAGTCCAC-3’。
用于不同类型鸭肝炎病毒鉴别诊断试剂盒，其包含所述的引物组。所述试剂盒同时对鸭甲肝病毒DHAV和鸭乙肝病毒DHBV进行鉴别，判定方法为：
（1）当仅出现扩增条带为1125bp时，判为鸭甲肝病毒感染阳性；
（2）当仅出现扩增条带为466bp时，判为鸭乙肝病毒感染阳性；
（3）当出现扩增条带为466bp和1125bp时，判为鸭甲肝病毒和鸭乙肝病毒混合感染阳性。
本发明的优点在于：
本发明基于现实需求，利用序列分析和引物设计工具，对引物组进行优化，获得4条引物，本发明仅需4条引物，经条件优化后即可巧妙的对鸭甲肝病毒DHAV和鸭乙肝病毒DHBV进行扩增，且扩增条带大小不一，经常规琼脂糖凝胶电泳分析后可对鸭甲肝病毒（DHAV）和鸭乙肝病毒（DHBV）进行鉴别诊断。
附图说明
图1 DHAV扩增条件优化，M：M：DL2000 分子量标准；1：DHAV-1；2：DHAV-2；3：DHAV-3；4：DHBV；5：阴性对照。
图2 DHBV扩增条件优化，M：M：DL2000 分子量标准；1：DHAV-1；2：DHAV-2；3：DHAV-3；4：DHBV；5：阴性对照。
图3 不同类型鸭肝炎病毒鉴别诊断电泳结果，其中M：DL2000 分子量标准；1：DHAV；2：DHBV；3：DHAV和DHBV共感染；4：禽流感病毒；5：禽1型副粘病毒；6：番鸭呼肠孤病毒；7：鸭新型呼肠孤病毒；8：禽坦布苏病毒；9：鸭圆环病毒；10：阴性对照。
具体实施方式
下面实施例对本发明做进一步的描述。
实施例1
1、相关试验病原
试验用病原鸭甲肝病毒（DHAV-1和DHAV-3两种血清型）、鸭乙肝病毒（DHBV）、禽流感病毒、禽1型副粘病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭新型呼肠孤病毒、禽坦布苏病毒、鸭圆环病毒均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存。由于鸭2型甲肝病毒（DHAV-2）目前仅中国台湾省报道，本团队无法获得相关毒株，但是相关毒株序列已在GenBank中登陆，本发明利用全基因合成技术，在生工生物工程(上海)股份有限公司全基因合成鸭2型甲肝病毒（90D株，GenBank登录号EF067924）。
2、引物设计
参考鸭甲肝病毒和鸭乙肝病毒全基因序列信息，综合运用多种生物信息学分析分析方法，筛选出鸭甲肝病毒和鸭乙肝病毒特异性检测引物，相关序列信息如下：
DHABV-F1：5’- TTCATGTYTTTGATGATTTTG-3’；
DHABV-F2：5’- ACTACACAGGGCATGCATGA-3’；
DHABV-R1：5’- CTTTCCAHACCAACCAGCCA-3’；
DHABV-R2：5’- TTCTTCTTCTAGGTTCGAGTCCAC-3’。
上述引物均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
3、核酸提取和cDNA的制备
将待检测样品研磨处理后，反复冻融三次，3000rpm离心20min，小心吸取对应获得的鸭甲肝病毒（DHAV-1和DHAV-3）、鸭乙肝病毒（DHBV）、禽流感病毒、禽1型副粘病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭新型呼肠孤病毒、禽坦布苏病毒、鸭圆环病毒的上清液200μL，按照病毒核酸提取试剂盒（EasyPure® Viral DNA/ RNA Kit）说明书提取核酸。
小心吸取提取的核酸RNA（鸭甲肝病毒、禽流感病毒、禽1型副粘病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭新型呼肠孤病毒和禽坦布苏病毒） 10μL，利用反转录试剂盒（EasyScript®First-Strand cDNA Synthesis SuperMix）将RNA反转录成cDNA。全基因合成的DHAV-2、鸭圆环病毒和鸭乙型肝炎病毒核酸为DNA，无需进行cDNA的制备。
4、PCR反应
4.1 鸭甲肝病毒的PCR条件优化
PCR扩增采用PCR扩增试剂盒（2×EasyTaq® PCR SuperMix (+dye )）推荐的50μL进行，其中2×EasyTaq PCR SuperMix 25μL，10 μmol/L上/下游引物（DHABV-F1、DHABV-F2、DHABV-R1和DHABV-R2）各1 μL，模板（cDNA或DNA或阴性对照）1 μL，补充去离子水至总体积50μL。反应条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s、△T 30 s、72 ℃ 70s，35个循环；循环结束后72 ℃延伸10 min。其中退火温度（△T）在50℃﹣60℃之间进行条件优化，优化后的鸭甲肝病毒通用型检测试剂盒PCR条件是：反应条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s、（53.0-56.5）℃ 30 s、72 ℃ 70s，35个循环；循环结束后72 ℃延伸10 min。
4.2 鸭乙肝病毒的PCR条件优化
PCR扩增采用PCR扩增试剂盒（2×EasyTaq® PCR SuperMix (+dye )）推荐的50μL进行，其中2×EasyTaq PCR SuperMix 25μL，10 μmol/L上/下游引物（DHABV-F1、DHABV-F2、DHABV-R1和DHABV-R2）各1 μL，模板（cDNA或DNA或阴性对照）1 μL，补充去离子水至总体积50μL。反应条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s、△T 30 s、72 ℃ 70s，35个循环；循环结束后72 ℃延伸10 min。其中退火温度（△T）在50℃﹣60℃之间进行条件优化，优化后的鸭甲肝病毒通用型检测试剂盒PCR条件是：反应条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s、（54.0-58.0）℃ 30 s、72 ℃ 30s，35个循环；循环结束后72 ℃延伸10 min。
4.3 鸭甲肝病毒和鸭乙肝病毒的PCR条件优化
PCR扩增采用PCR扩增试剂盒（2×EasyTaq® PCR SuperMix (+dye )）推荐的50μL进行，其中2×EasyTaq PCR SuperMix 25μL，10 μmol/L上/下游引物（DHABV-F1、DHABV-F2、DHABV-R1和DHABV-R2）各1 μL（引物浓度进行5pmol-20 pmol优化，最终选择浓度为10pmol），模板（cDNA或DNA或阴性对照）1 μL，补充去离子水至总体积50μL。反应条件为95℃预变性5 min；95 ℃ 30 s、△T 30 s、72 ℃ 70s，35个循环；循环结束后72 ℃延伸10min。其中退火温度（△T）在50℃﹣60℃之间进行条件优化，优化后的鸭甲肝病毒和鸭乙肝病毒PCR条件是：反应条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s、54.5℃ 30 s、72 ℃ 70s，35个循环；循环结束后72 ℃延伸10 min。将PCR扩增产物进行常规琼脂糖凝胶电泳后进行结果判定，判定方法为：
（1）当仅出现扩增条带约为1125bp时，判为鸭甲肝病毒（DHAV）感染阳性（见图3，泳道1）；
（2）当仅出现扩增条带约为466bp时，判为鸭乙肝病毒（DHBV）感染阳性（见图3，泳道2）；
（3）当出现扩增条带约为466bp和1125bp时，判为鸭甲肝病毒（DHAV）和鸭乙肝病毒（DHBV）混合感染阳性（见图3，泳道3）。
5、特异性试验
以优化后条件，以鸭甲肝病毒（DHAV-1）和鸭乙肝病毒（DHBV）为阳性对照，对水禽其他常见病原（禽流感病毒、禽1型副粘病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭新型呼肠孤病毒、禽坦布苏病毒、鸭圆环病毒）和阴性对照进行扩增，结果仅鸭甲肝病毒（DHAV-1）和鸭乙肝病毒（DHBV）为阳性对照见特异性条带，水禽其他常见病原（见图3，泳道4-9）和阴性对照（见图3，泳道10）均未见特异性目的条带，表明本发明建立的不同类型鸭肝炎病毒鉴别诊断方法特异性好。
6、临床应用
对72份临床送检鸭源病料进行鸭甲肝病毒感染的检测，用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取相应核酸，按照优化后的体系和条件分别进行反转录和PCR扩增检测。结果发现，检测到DHAV单一阳性样品17份，阳性率为23.61%；检测到DHBV单一阳性样品14份，阳性率为13.89%；检测到DHAV和DHBV共感染阳性样品11份，阳性率为15.28%。上述结果表明，该批临床送检样品中DHAV、DHBV单一感染和混合感染较为严重。对阳性结果分别进行胶回收后克隆测序，测序结果经BLAST分析，DHAV阳性结果的序列均为DHAV核苷酸序列；DHBV阳性结果的序列均为DHBV核苷酸序列；DHAV和DHBV混合感染阳性结果的序列均有对应的DHAV和DHBV核苷酸序列。
此外，关于本发明的试剂盒还需说明的是，对于DHAV检测阳性的检测样品，可将PCR扩增产物利用胶回收试剂盒回收特异性的目的条带后，将其克隆到T载体上，转化感受态细胞后随机挑取8个质粒进行鉴定，将阳性重组质粒送由生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。对获得的测序结果进行BLAST分析（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），根据BLAST分析结果即可判定感染不同血清型（DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3）。结果可见，DHAV单一阳性样品17份中，DHAV-1阳性6份、DHAV-2阳性0份、DHAV-3阳性9份、DHAV-1和DHAV-3混合阳性2份。检测到DHAV和DHBV共感染阳性样品11份样品中，DHAV-1和DHBV共感染阳性7份、DHAV-2和DHBV共感染阳性0份、DHAV-3和DHBV共感染阳性2份、DHAV-1、DHAV-3和DHBV混合感染混合阳性2份。上述结果表明，临床样品中不同类型鸭肝炎病毒感染或混合感染严重，提示我们需加强不同类型鸭肝炎病毒通用疫苗研发工作，为科学防控不同类型鸭肝炎病毒、提升养殖效益奠定理论基础。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一组用于不同类型鸭肝炎病毒鉴别诊断的引物组
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttcatgtytt tgatgatttt g 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
actacacagg gcatgcatga 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctttccahac caaccagcca 20
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttcttcttct aggttcgagt ccac 24
Claims (3)
1.一组用于不同类型鸭肝炎病毒鉴别诊断的引物组，其特征在于：所述引物如下所示：
DHABV-F1：5’- TTCATGTYTTTGATGATTTTG-3’；
DHABV-F2：5’- ACTACACAGGGCATGCATGA-3’；
DHABV-R1：5’- CTTTCCAHACCAACCAGCCA-3’；
DHABV-R2：5’-TTCTTCTTCTAGGTTCGAGTCCAC-3’。
2.用于不同类型鸭肝炎病毒鉴别诊断试剂盒，其特征在于：其包含权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的用于不同类型鸭肝炎病毒鉴别诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒同时对鸭甲肝病毒（DHAV）和鸭乙肝病毒（DHBV）进行鉴别，判定方法为：
（1）当仅出现扩增条带为1125bp时，判为鸭甲肝病毒感染阳性；
（2）当仅出现扩增条带为466bp时，判为鸭乙肝病毒感染阳性；
（3）当出现扩增条带为466bp和1125bp时，判为鸭甲肝病毒和鸭乙肝病毒混合感染阳性。
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