CN111500783B - 用于dhav-1、dhav-n和dhbv鉴别诊断的引物组 - Google Patents

用于dhav-1、dhav-n和dhbv鉴别诊断的引物组 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于DHAV‑1、DHAV‑N和DHBV鉴别诊断的引物组，属于水禽传染病学领域，所述引物组序列如SEQ ID NO.1‑5所示，利用所述引物组构建获得诊断试剂盒可同时对三种鸭肝炎病毒DHAV‑1、DHAV‑N和DHBV进行鉴别，方法快速简便。当前国内外尚未见相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

Description

用于DHAV-1、DHAV-N和DHBV鉴别诊断的引物组
技术领域
本发明提供用于DHAV-1、DHAV-N和DHBV鉴别诊断的引物组，属于水禽传染病学领域。
背景技术
1945年，第一株鸭病毒性肝炎病毒（即鸭甲肝病毒1型DHAV-1）发现于美国纽约长岛鸭场。1950年，Levine和Fabricant从鸡胚中首次分离到鸭病毒性肝炎病原，随后世界上很多国家相继报道了DHAV-1的流行。在我国，1963年上海畜牧研究所的黄均建首次报道了鸭病毒性肝炎发现于上海。苏敬良等于1999年5月从北京、广西疑似鸭肝炎的病死鸭体内分离到 2 株病毒（分别编号为B株和G株），经鸭胚血清中和试验表明两者为同一血清型，但与经典DHAV-1无血清学交叉免疫反应，人工感染雏鸭可复制出与临床病例相似的病变，于是认为有新的血清型出现，并把分离到的病毒命名为新型鸭肝炎病毒（DHAV-N）。
此外，当前国内外主要养鸭区除DHAV-1和DHAV-N外，还有一种鸭肝炎病毒类型——鸭乙型肝炎病毒（duck hepatitis B virus，DHBV）。该病最早于1980年由Mason等人在美国饲养的北京鸭血清中发现。进一步研究证实，DHBV的形态结构，核酸组成和生物学特性与人乙型肝炎HBV相似，且DHBV在感染鸭后也可引起肝炎及肝硬化，对养鸭业造成较大危害。日本学者Omata最早（1983年）研究了我国成年鸭DHBV感染率的地区差异性，上海市的感染率为22.5%，广西扶绥、隆县的为10%，崇明县为46%。这使人们开始认识到DHBV感染率的差异性。随后，瞿涤等发现麻鸭对DHBV很易感，如昆山麻鸭的阳性率为46.5%。邓学龙等又研究了广州地区3个鸭种的1日龄雏鸭携带情况，研究结果显示广州麻鸭阳性率为28%，樱桃谷鸭为20%，绿头鸭为80%。
需要说明的是，我国台湾地区存在一种和DHAV-1、DHAV-3基因组差异较大（核苷酸同源性低于80.0%）但具有DHAV基因组结构特征的鸭甲肝病毒2型（DHAV-2）（Tseng CH,Tsai HJ. Molecular characterization of a new serotype of duck hepatitisvirus. Virus Res, 2007, 126(1-2): 19-31.）。目前GenBank数据库仅2株DHAV-2基因组序列（90D株，GenBank登录号EF067924；04G株，GenBank登录号EF067923）。由于该病原暂时在我国大陆地区还未检测到，一般认为该病在我国大陆地区不流行，因此本发明仅针对当前我国大陆地区官方流行的3类鸭肝炎病毒[经典鸭甲肝病毒（DHAV-1）、新型鸭肝炎病毒（DHAV-N）和鸭乙型肝炎病毒（DHBV）]。
基于此，本发明通过分析DHAV-1、DHAV-N和DHBV基因组结构特征，综合利用多种生物信息学工具，巧妙设计引物获得用于DHAV-1、DHAV-N和DHBV鉴别诊断的引物组，组装成可用于DHAV-1、DHAV-N和DHBV鉴别诊断的试剂盒。该试剂盒简便快速，可同时对DHAV-1、DHAV-N和DHBV感染情况进行科学鉴别诊断；特异性强，对常见水禽传染病（禽流感病毒、禽1型副粘病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭新型呼肠孤病毒、禽坦布苏病毒等）均无交叉；优化程序简单（常规针对三个病原需设计6条引物而本发明仅需设计5条引物，便于条件优化）；易于观察，本发明的结果在设计上考虑到了目前实验应用最多（成本最低廉）的DNA分子量标准（DL2000），扩增条带分别位于DNA分子量标准（DL2000）各条特征性条带不同区域，观察结果非常直观。本发明的建立可填补国内外相关领域空白。
发明内容
本发明的目的在于提供用于DHAV-1、DHAV-N和DHBV鉴别诊断的引物组，可同时对DHAV-1、DHAV-N和DHBV感染情况进行科学鉴别诊断。
为实现上述目的，采用以下技术方案：
用于DHAV-1、DHAV-N和DHBV鉴别诊断的引物组，所述引物组如下所示：
DHABV-F1：5’- ATTCCCACATTGGATCAGTCTGG -3’；
DHABV-F2：5’- CAGCATCTCAGGGGGGTGGCTT -3’；
DHABV-F3：5’- TTAGCCAATGTGTATGATCTACCA -3’；
DHABV-R1：5’- TCCKGATTTGCCAACAAC-3’；
DHABV-R2：5’- ACTTTTCTTCTTCTAGGTTCGAGT -3’。
用于鉴别DHAV-1、DHAV-N和DHBV的诊断试剂盒，其包含所述的引物组，所述试剂盒同时对三种鸭肝炎病毒（DHAV-1、DHAV-N和DHBV）进行鉴别，判定方法为：
（1）当仅出现扩增条带为237bp时，判为鸭甲肝病毒1型DHAV-1感染阳性；
（2）当仅出现扩增条带为392bp时，判为鸭甲肝病毒新型DHAV-N感染阳性；
（3）当仅出现扩增条带为632bp时，判为鸭乙型肝炎病毒DHBV感染阳性；
（4）当出现扩增条带为237bp和392bp时，判为鸭甲肝病毒1型DHAV-1和鸭甲肝病毒新型DHAV-N混合感染阳性；
（5）当出现扩增条带为392bp和632bp时，判为鸭甲肝病毒新型DHAV-N和鸭乙型肝炎病毒DHBV混合感染阳性；
（6）当出现扩增条带为237bp和632bp时，判为鸭甲肝病毒1型DHAV-1和鸭乙型肝炎病毒DHBV混合感染阳性；
（7）当出现扩增条带为237bp、392bp和632bp时，判为鸭甲肝病毒1型DHAV-1、鸭甲肝病毒新型DHAV-N和鸭乙型肝炎病毒DHBV混合感染阳性。
本发明的优点在于：
本发明通过分析DHAV-1、DHAV-N和DHBV基因组结构特征，综合利用多种生物信息学工具，巧妙设计引物获得用于DHAV-1、DHAV-N和DHBV鉴别诊断的引物组，组装成可用于DHAV-1、DHAV-N和DHBV鉴别诊断的试剂盒。该试剂盒简便快速，可同时对DHAV-1、DHAV-N和DHBV感染情况进行科学鉴别诊断；特异性强，对常见水禽传染病（禽流感病毒、禽1型副粘病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭新型呼肠孤病毒、禽坦布苏病毒等）均无交叉；优化程序简单（常规针对三个病原需设计6条引物而本发明仅需设计5条引物，便于条件优化）；易于观察，本发明的结果在设计上考虑到了目前实验应用最多（成本最低廉）的DNA分子量标准（DL2000），扩增条带分别位于DNA分子量标准（DL2000）各条特征性条带不同区域，观察结果非常直观。本发明的建立可填补国内外相关领域空白。
附图说明
图1 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果，其中M：DL2000 分子量标准；1：DHAV-1（泳道1）；2：DHAV-N（泳道2）；3 DHBV（泳道3）：；4：DHAV-1和DHAV-N共感染阳性（泳道4）；5：DHAV-N和DHBV共感染阳性（泳道5）；6：DHAV-1和DHBV共感染阳性（泳道6）；7：DHAV-1、DHAV-N和DHBV共感染阳性（泳道7）；8：禽流感病毒；9：禽1型副粘病毒；10：番鸭呼肠孤病毒；11：鸭新型呼肠孤病毒；12：禽坦布苏病毒；13：阴性对照。
具体实施方式
下面实施例对本发明做进一步的描述。
实施例1
1、相关试验病原
试验用病原DHAV-1、DHAV-N、DHBV、禽流感病毒、禽1型副粘病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭新型呼肠孤病毒、禽坦布苏病毒均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。
2、引物设计
参考DHAV-1、DHAV-N和DHBV基因序列及其主要编码区特点，利用序列分析和引物设计工具巧妙选择区域并进行引物设计，设计特异性的引物序列信息如下：
DHABV-F1：5’- ATTCCCACATTGGATCAGTCTGG -3’；
DHABV-F2：5’- CAGCATCTCAGGGGGGTGGCTT -3’；
DHABV-F3：5’- TTAGCCAATGTGTATGATCTACCA -3’；
DHABV-R1：5’- TCCKGATTTGCCAACAAC-3’。
DHABV-R2：5’- ACTTTTCTTCTTCTAGGTTCGAGT -3’。
上述引物均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
3、核酸提取和cDNA的制备
将待检测样品研磨处理后，反复冻融三次，3000rpm离心20min，小心吸取对应获得的DHAV-1、DHAV-N、DHBV、禽流感病毒、禽1型副粘病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭新型呼肠孤病毒、禽坦布苏病毒的上清液200μL，按照病毒核酸提取试剂盒（EasyPure® Viral DNA/ RNAKit）说明书提取核酸RNA。小心吸取提取的核酸RNA（DHAV-1、DHAV- N、禽流感病毒、禽1型副粘病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭新型呼肠孤病毒和禽坦布苏病毒） 10μL，利用反转录试剂盒（EasyScript® First-Strand cDNA Synthesis SuperMix）将RNA反转录成cDNA。DHBV核酸类型为DNA，无需进行反转录（即使不小心对核酸进行反转录反应，也不会影响后续试验结果）。
4、PCR反应
PCR扩增采用PCR扩增试剂盒（2×EasyTaq® PCR SuperMix (+dye )）推荐的50μL进行，其中2×EasyTaq PCR SuperMix 25μL，引物组（DHABV-F1、DHABV-F2、DHABV-F3、DHABV-R1和DHABV-R2；浓度在5pmol至20pmol进行优化）各1 μL，模板（DNA或cDNA）1 μL，去离子水19 μL，至总体积50μL。反应条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s、△T 30 s、72 ℃45s，35个循环；循环结束后72 ℃延伸10 min。其中退火温度（△T）在50℃﹣60℃之间进行条件优化。
优化后的PCR反应体系为：2×EasyTaq PCR SuperMix 25μL、DHABV-F1（10pmol）1μL、DHABV-F2（10pmol）1μL、DHABV-F3（5pmol）1μL、DHABV-R1（20pmol）1μL、DHABV-R2（20pmol）1μL、模板1 μL，去离子水19 μL。
优化后的用于DHAV-1、DHAV-N和DHBV鉴别诊断的PCR条件是：反应条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s、53.8℃ 30 s、72 ℃ 40s，35个循环；循环结束后72 ℃延伸10min。
5、结果判定
其可用于DHAV-1、DHAV-N和DHBV鉴别诊断，判定方法为：
（1）当仅出现扩增条带为237bp时，判为鸭甲肝病毒1型（DHAV-1）感染阳性（图1，泳道1）；
（2）当仅出现扩增条带为392bp时，判为鸭甲肝病毒新型（DHAV-N）感染阳性（图1，泳道2）；
（3）当仅出现扩增条带为632bp时，判为鸭乙型肝炎病毒（DHBV）感染阳性（图1，泳道3）；
（4）当出现扩增条带为237bp和392bp时，判为鸭甲肝病毒1型（DHAV-1）和鸭甲肝病毒新型（DHAV-N）混合感染阳性（图1，泳道4）；
（5）当出现扩增条带为392bp和632bp时，判为鸭甲肝病毒新型（DHAV-N）和鸭乙型肝炎病毒（DHBV）混合感染阳性（图1，泳道5）；
（6）当出现扩增条带为237bp和632bp时，判为鸭甲肝病毒1型（DHAV-1）和鸭乙型肝炎病毒（DHBV）混合感染阳性（图1，泳道6）；
（7）当出现扩增条带为237bp、392bp和632bp时，判为鸭甲肝病毒1型（DHAV-1）、鸭甲肝病毒新型（DHAV-N）和鸭乙型肝炎病毒（DHBV）混合感染阳性（图1，泳道7）。
6、特异性试验
以优化后条件，对水禽其他常见病原（禽流感病毒、禽1型副粘病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭新型呼肠孤病毒、禽坦布苏病毒）和阴性对照进行扩增，结果未见特异性目的条带（见图1泳道8至13），表明本发明建立的检测方法特异性好。
7、临床应用
对154份临床送检鸭源病料进行鸭肝炎病毒感染的检测，用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取核酸，按照优化后的体系和条件分别进行反转录和PCR扩增检测。结果发现，DHAV-1单一阳性12份，阳性率为7.79%；DHAV-N单一阳性17份，阳性率为11.04%；DHBV单一阳性20份，阳性率为12.99%；DHAV-1和DHAV-N混合感染15份，阳性率为9.74%；DHAV-1和DHBV混合感染9份，阳性率为5.84%；DHAV-1和DHBV混合感染16份，阳性率为10.39%；DHAV-1、DHAV-N和DHBV三者混合感染8份，阳性率为5.19%。上述结果表明，我们鸭群中广泛存在多种鸭肝炎病毒感染，且多种鸭肝炎病毒混合感染现象突出，建议我国应加强相关疫病的多联鸭肝炎病毒疫苗研究和开发工作。
对DHAV-1单一阳性12份样品、DHAV-N单一阳性17份样品和DHBV单一阳性20份利用鸭胚进行病毒分离鉴定（一般需要7天左右可出结果），和本发明的试剂盒（包括核酸提取，一般3小时可出结果）进行分析比较。结果可见，12份DHAV-1单一阳性样品分离到病毒10株（病毒分离率为83.33%），经本发明的试剂盒检测均为DHAV-1单一阳性感染，和病毒分离鉴定的符合率为100%；17份DHAV-N单一阳性样品分离到病毒14株（病毒分离率为82.35%），经本发明的试剂盒检测均为DHAV-N单一阳性感染，和病毒分离鉴定的符合率为100%；20份DHBV单一阳性样品分离到病毒17株（病毒分离率为85%），经本发明的试剂盒检测均为DHBV单一阳性感染，和病毒分离鉴定的符合率为100%（说明，混合样品未进行病毒分离鉴定，绝大部分分离出来的病原也是混合感染，临床上一般不进行病毒分离鉴定，所以本发明不做相关内容比较分析）。上述结果表明，本发明的试剂盒和经典的病毒学病毒分离鉴定方法相比，时效性更优且敏感性更高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 用于DHAV-1、DHAV-N和DHBV鉴别诊断的引物组
<130> 5
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
attcccacat tggatcagtc tgg 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cagcatctca ggggggtggc tt 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttagccaatg tgtatgatct acca 24
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcckgatttg ccaacaac 18
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
acttttcttc ttctaggttc gagt 24

Claims (3)

1.用于DHAV-1、DHAV-N和DHBV鉴别诊断的引物组，其特征在于：所述引物组如下所示：
DHABV-F1：5’- ATTCCCACATTGGATCAGTCTGG -3’；
DHABV-F2：5’- CAGCATCTCAGGGGGGTGGCTT -3’；
DHABV-F3：5’- TTAGCCAATGTGTATGATCTACCA -3’；
DHABV-R1：5’- TCCKGATTTGCCAACAAC-3’；
DHABV-R2：5’- ACTTTTCTTCTTCTAGGTTCGAGT -3’。
2.用于鉴别DHAV-1、DHAV-N和DHBV的诊断试剂盒，其特征在于：其包含权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的用于鉴别DHAV-1、DHAV-N和DHBV的诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒同时对三种鸭肝炎病毒DHAV-1、DHAV-N和DHBV进行鉴别，判定方法为：
（1）当仅出现扩增条带为237bp时，判为鸭甲肝病毒1型DHAV-1感染阳性；
（2）当仅出现扩增条带为392bp时，判为鸭甲肝病毒新型DHAV-N感染阳性；
（3）当仅出现扩增条带为632bp时，判为鸭乙型肝炎病毒DHBV感染阳性；
（4）当出现扩增条带为237bp和392bp时，判为鸭甲肝病毒1型DHAV-1和鸭甲肝病毒新型DHAV-N混合感染阳性；
（5）当出现扩增条带为392bp和632bp时，判为鸭甲肝病毒新型DHAV-N和鸭乙型肝炎病毒DHBV混合感染阳性；
（6）当出现扩增条带为237bp和632bp时，判为鸭甲肝病毒1型DHAV-1和鸭乙型肝炎病毒DHBV混合感染阳性；
（7）当出现扩增条带为237bp、392bp和632bp时，判为鸭甲肝病毒1型DHAV-1、鸭甲肝病毒新型DHAV-N和鸭乙型肝炎病毒DHBV混合感染阳性。
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