CN109609698A - 一种用于检测禽腺病毒iv型的纳米pcr试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于检测禽腺病毒IV型的纳米PCR试剂盒。所述试剂盒包括：2×Nano PCR Mix，上、下游引物，无核酸水，阳性对照。该试剂盒可用于检测禽腺病毒IV型。本发明还提供了一种PCR检测禽腺病毒IV型的方法，使用本试剂盒检测禽腺病毒IV型特异性好、敏感度高、重复性好，准确率高；有效提高了禽腺病毒IV型的检测效率及特异性扩增产量，缩短了检测时间。本试剂盒可在基层兽医检测广泛应用，对不同品种禽感染禽腺病毒IV型的快速检测提供新的方法。

Description

一种用于检测禽腺病毒IV型的纳米PCR试剂盒

技术领域

本发明属于预防兽医学检验领域，具体涉及一种用于检测禽腺病毒IV型的纳米PCR试剂盒。

背景技术

禽腺病毒属于腺病毒科禽腺病毒属成员，腺病毒科（Adenoviridae）可分为5个属，腺胸腺病毒属(Atadenovirus)、禽腺病毒属(Aviadenovirus)、鱼腺病毒属(Ichtadenovirus)、哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)和唾液酸酶病毒属（Siadenovirus）。根据目前的分类，禽腺病毒属共有12个种：5个禽（禽腺病毒A-E）、3个火鸡（火鸡腺病毒B-D）、1个隼（隼腺病毒A）、1个鹅（鹅腺病毒A）、1个鸭（鸭腺病毒B）和1个鸽（鸽腺病毒A）腺病毒种。根据血清中和试验，禽腺病毒A-E又可分为12个血清型。

禽腺病毒IV型（FAdV-4）属于禽腺病毒C种，感染鸡主要引起心包积液综合征，又名安卡拉病，因最早于巴基斯坦安卡拉一个肉鸡场暴发流行而得名。主要危害3-6周龄肉鸡，病程8-15 d，死亡率达20%-80%；而后备母鸡和蛋鸡只偶尔有发生，发病鸡主要表现为精神沉郁，羽毛逆立，排黄色稀粪，突然倒地后两腿划空，数分钟内死亡，剖检可见心包积有淡黄色透明的渗出液；肝脏肿胀、充血、质地变脆，色泽变暗，并出现坏死；肾苍白或暗黄色。

腺病毒大部分为长期潜伏病毒，引起无症状的感染，其中部分可以引起致病。Ⅰ群禽腺病毒存在于多种禽类的呼吸道和消化道，作为原发病原引起发病，往往与其他病毒混合感染致病。因此建立一种快速灵敏度高的检测禽腺病毒IV型方法具有重要的意义。

传统的聚合酶链式反应（PCR）方法在病原的鉴定及疫病的确诊中发挥了重要作用，PCR检测技术因其操作简单、灵敏性高、重复性好及等优点被广泛应用。但在实际应用中，亦存在诸多局限性，例如PCR反应始终存在不同程度的非特异性扩增，尤其是复杂体系的扩增会出现非特异性产物扩增及扩增效率不够高等问题。为解决以上间题，寻找可以提高PCR特异性的添加剂显得极为重要。

纳米PCR技术是当前的一种新型PCR技术，其原理是利用钠米金良好的热传导性能，将直径为1nm-100mm的固相纳米金属颗粒盐浮在液体中形成纳米流体，添加在PCR反应体系中，反应混合液更快的达到目标温度，从而减少整个体系达到温度平衡所用的时间，缩短在非目标温度的停留时间，同时还能降低非特异性扩增，提高特异性扩增产量。因此，建立一种能够快速、特异、高效的禽腺病毒IV型的纳米PCR检测技术就可以解决此问题。

发明内容

本发明针对上述现有技术的不足，提供了一种用于检测禽腺病毒IV型的纳米PCR试剂盒，该试剂盒特异性好、敏感度高、重复性好，准确率高。

本发明所采用的技术方案是：

一种用于检测禽腺病毒IV型的纳米PCR试剂盒，包括2× Nano PCR Mix、上游引物F和下游引物R，无核酸水，上、下游引物的序列如下表。

表1引物序列

引物是根据 Genbank公布的禽腺病毒IV型序列，在其ORF13基因保守序列区域设计的一对特异性引物，该保守序列区域与禽腺病毒IV型的核酸同源性高达99.3%，其他禽腺病毒血清型的核酸同源性很低，仅为14.6%-54.9%，可以特异性地扩增禽腺病毒IV型。（核酸同源性分析见附图1）。本发明还提供了所述的试剂盒在制各检测待检样品中是否含有禽腺病毒IV型的产品中的应用，检测样品可以是病死禽心肝肾等组织、病毒接种禽胚后收取的尿囊液和病毒接种细胞后收取的细胞液的核酸DNA。

应用所述试剂盒检测禽腺病毒IV型的方法，包括如下步骤：

１、待检样品的处理

待检样品为病死禽的心脏、肝脏等组织时，其处理方法为：将组织脏器等剪碎后，按1:3=质量体积比加入PBS缓冲液（0.01MPBS）混匀后进行研磨，置于-20℃反复冻融三次。10000rpm 离心10min，取上清备用。

待检样品为病毒接种禽胚后收取的尿囊液和病毒接种细胞后时，其处理方法为：将样品置于-20℃反复冻融三次。10000rpm 离心10min，取上清备用。

、病毒DNA的提取

按常规方法或病毒DNA的提取试剂盒说明方法提取样品的核酸DNA，置于-20℃保存备用。

、纳米PCR扩增

按下列表2中依次加入各成份于PCR反应管中即可，若有多个样品，可按下列比例将各成份加入1管中后进行分装。同时设阴阳性对照，阴性对照的核酸模板以无核酸水替代。

表2 PCR反应体系组份表

将反应混合液混匀后置于常规PCR仪中，按如下程序进行PCR扩增：

4、结果观察

取5μL PCR产物，经1%常规琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下或凝胶成像系统中观察。

、结果判定

空白对照组无条带，实验成立；反之，则不成立，需重做。

实验成立时，若出现一条759bp的清晰条带，则说明存在禽腺病毒IV型感染；若无条带出现，则说明不存在禽腺病毒IV型感染。

本发明的优点在于：

1、本发明提供了一对检测禽腺病毒IV型的特异性引物，利用其组装成的钠米PCR试剂盒，能快、特异的检测禽腺病毒IV型。

2、提取禽腺病毒IV型核酸DNA模板稀释至10^-7后作为纳米PCR反应的模板DNA，仍能检测到清晰的特异性条带，说明本申请的引物组具有较高的灵敏度。

3、使用本申请的引物组对禽腺病毒I型、H9亚型禽流感病毒、禽坦布苏病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、禽偏肺病毒、禽白血病病毒、传染性法氏囊病毒、禽脑脊髓炎病毒、产蛋下降综合征病毒和禽呼肠孤病毒等进行PCR扩增，均未扩增出特异性条带，说明本申请引物组具有较好的特异性。

4、本发明可使PCR反应更快地达到目标温度，减少了整个体系达到温度平衡所用的时间，进而缩短在非目标温度的停留时间（PCR全过程45min内即可完成），并有效提高了禽腺病毒IV型的特异性扩增产量，降低了非特异性扩增，具有良好的应用前景。

附图说明

图1 禽腺病毒IV型ORF13基因保守序列与其他禽腺病毒血清型的核酸同源性分析。

图2为禽腺病毒IV型纳米PCR扩增电泳结果： M： DNA Marker DL2000；1：阳性对照；2：阴性对照。

图3为禽腺病毒IV型纳米PCR敏感性检测结果：M： DNA Marker DL2000；1-8：10⁰-10^-7稀释病毒核酸扩增产物；9：阴性对照，A为钠米PCR，B为普通PCR。

图4为禽腺病毒IV型纳米PCR特异性检测结果：M： DNA Marker DL2000，1：禽腺病毒IV型，2：阴性对照，3：禽腺病毒I型，4：H9亚型禽流感病毒，5：禽坦布苏病毒，6：新城疫病毒，7：传染性支气管炎病毒，8：传染性喉气管炎病毒，9：禽偏肺病毒，10：禽白血病病毒，11、传染性法氏囊病毒，12：禽脑脊髓炎病毒，13：产蛋下降综合征病毒，14：禽呼肠孤病毒。

图5本发明试剂盒重复性实验结果图。图中各泳道分别为： M、DNA Marker DL2000bp；1-3：3次平行纳米PCR扩增，4：阴性对照。

图6本发明试剂盒对7个临床样品实验结果图。图中各泳道分别为： M、DNA MarkerDL2000 bp；1：阳性对照，2-8：样品1-7号，9：阴性对照。

图7 本发明试剂盒临床应用检测的3个阳性样品与Genbank中禽腺病毒核酸序列同源性比较。

图8本发明试剂盒临床应用检测的3个阳性样品与Genbank中禽腺病毒遗传进化分析图。

具体实施方式

下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。下述实施例中所使用的实验方法，如无特别说明，均为常规方法，所用材料及试剂等，如无特别说明，均可从商业途径购买获得。

实施例1一种禽腺病毒IV型纳米PCR检测试剂盒最佳实施例

1、病毒核酸的提取

取禽腺病毒IV型 (FJ1674株)的病毒液200μL，按常规方法提取核酸DNA，-20℃保存备用。

、纳米PCR反应

PCR扩增的最佳反应体系为20μL体系：2× Nano PCR Mix 10 μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL、模板DNA 2 μL、无核酸水补足至20 μL。最佳反应条件为：95℃，5min预变性；95℃ 15s，58℃ 15 s，72℃ 15s，共30个循环，循环结束后，最后72℃延伸7 min，保存于10℃。同时设阴性对照。

、PCR结果观察

PCR反应完成后，产物经1%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像系统拍照，结果可见一条759bp的清晰条带，阴性对照无条带（见附图2）。

实施例2禽腺病毒IV型纳米PCR检测试剂盒的最感性测定

用超微量分光光度计测得禽腺病毒IV型DNA浓度为267.4ng/μL，将DNA进行10倍梯度稀释，取10⁰-10⁷倍稀释的DNA样本进行钠米PCR敏感性测定。同时采用普通PCR方法对这些10倍梯度稀释的病毒核进行检测，比较两种方法的敏感性。

禽腺病毒IV型纳米PCR和普通PCR检测操作过程均参照实施例1进行，其中，普通PCR检测将步骤2中的2× Nano PCR Mix 10 μL替换为2×PCR Mix 10 μL，其余操作步骤不变。

PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图3所示，结果显示，纳米PCR最低能检测到10⁵倍稀释（即2.674pg）的禽腺病毒病毒DNA样本，普通PCR最低能检测到10⁴倍稀释（即26.74pg）的禽腺病毒IV型DNA样本。钠米PCR检测敏感性是普通PCR检测敏感性的10倍（见附图3A、3B）。

实施例3 禽腺病毒IV型纳米PCR检测试剂盒的特异性检测

按照实施例1的方法，分别对禽腺病毒IV型、禽腺病毒I型、亚型禽流感病毒、禽坦布苏病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、禽偏肺病毒、禽白血病病毒、传染性法氏囊病毒、禽脑脊髓炎病毒、产蛋下降综合征病毒和禽呼肠孤病毒进行纳米PCR，同时以无核酸水替代模板DNA进行阴性对照钠米PCR反应，检测纳米PCR方法的特异性，以上PCR产物均通过1%琼脂糖凝胶电泳进行分析（RNA病毒按常规方法提取核酸后RT反应作核酸模板用）。

结果如图4所示，禽腺病毒IV型核酸扩增获得与预期大小相符的759bp的清晰条带，而其他病毒核酸均未扩增出清晰条带。

实施例4 试剂盒重复性测定

按照实施例1中PCR反应条件用试剂盒对禽腺病毒IV型病毒核酸DNA进行3次平行纳米PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像系统拍照，3次均扩增出与预期结果一致的清晰条带，说明引物组的重复性好（图5）。

实施例5试剂盒临床应用

使用试剂盒按实施例1方法对临床送检的7例病死鸡组织样品处理后进行纳米PCR检测后发现，禽腺病毒IV型感染阳性有3 例，阳性率为42.8%（3/7）（图6）。经测序3例样品与禽腺病毒IV型核酸同源性均高于99%（图7），遗传进化分析表明样品与禽腺病毒IV型处于同一分支（图8）。因此说明本发明试剂盒准确性高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种用于检测禽腺病毒IV型的纳米PCR试剂盒

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggggatgcat gggaggggct t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

catggtcgct cgccgctttc c 21

Claims (7)

1.一种用于检测禽腺病毒IV型的引物，其特征在于：所述的引物如下：

上游引物F ：5＇-GGGGATGCATGGGAGGGGCTT-3＇；

下游引物R：5＇-CATGGTCGCTCGCCGCTTTCC-3＇。

2. 一种用于检测禽腺病毒IV型的纳米PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括2×Nano PCR Mix、无核酸水，权利要求1所述的上游引物F和下游引物R。

3.根据权利要求2所述的用于检测禽腺病毒IV型的纳米PCR试剂盒，其特征在于：所述2× Nano PCR Mix由DNA聚合酶、dNTPs和2×Nano PCR缓冲液组成。

4.根据权利要求2所述的用于检测禽腺病毒IV型的纳米PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阳性对照，阳性对照为禽腺病毒IV型FJ1674病毒株的核酸DNA。

5.根据权利要求2所述的用于检测禽腺病毒IV型的纳米PCR试剂盒，其特征在于：所述上下游引物还用于检测禽腺病毒IV型的PCR扩增。

6.根据权利要求2所述的用于检测禽腺病毒IV型的纳米PCR试剂盒，其特征在于：检测样品是病死禽心肝肾等组织、病毒接种禽胚后收取的尿囊液和病毒接种细胞后收取的细胞液的核酸DNA。

7.如权利要求2-6任一项所述试剂盒在制备检测禽腺病毒IV型产品中的应用。