CN111518956B - 一种检测禽呼肠孤病毒的纳米pcr方法、试剂盒及应用 - Google Patents

一种检测禽呼肠孤病毒的纳米pcr方法、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测禽呼肠孤病毒的纳米PCR方法和试剂盒，纳米PCR的反应体系中添加SiO2/Au/Fe3O4纳米粒子和SEQ ID No.1‑2所示引物，并对反应体系和反应条件进行了优化。本发明采用SiO2/Au/Fe3O4纳米复合材料可以集合几种材料的优势，配合使用本发明筛选的特异性引物，能够进一步提高PCR的灵敏性、特异性和PCR扩增效率。

Description

一种检测禽呼肠孤病毒的纳米PCR方法、试剂盒及应用
技术领域
本申请涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种检测禽呼肠孤病毒的纳米PCR方法、试剂盒及应用。
背景技术
禽呼肠孤病毒(avian reovirus，ARV)是呼肠孤病毒科，正呼肠孤病毒属的成员。各种禽类包括鸡、火鸡、鸭、鹅及其它野鸟都可因感染ARV而发病，临床病症表现为病毒性关节炎、呼吸道疾病、肠道疾病、矮小综合症和免疫抑制等多种疾病。现代养禽业因ARV感染而引发的这些临床病症严重影响鸡群健康和经济效益。因此，为有效防控ARV爆发流行，建立一种特异性强、敏感度高及快速的新型ARV检测方法是非常必要的。
目前检测ARV的主要方法有ELISA、RT-PCR、核酸探针、实时荧光定量PCR。虽然这些方法都具有较高的特异性和敏感性，但各有不足之处,如ELISA耗时较长，RT-PCR技术复杂且电泳时需要接触EB等有害物质，核酸探针技术操作较繁琐，实时荧光定量PCR所需仪器和试剂昂贵，这些不足或缺欠影响了它们的实际应用。纳米PCR技术是在PCR反应的buffer中添加一定量的纳米粒子颗粒，从而形成纳米流体，纳米流体具有很好的导热性，因此在添加了纳米粒子颗粒的PCR热循环中，PCR反应能更快的达到目标温度，从而缩短在非目标温度停留的时间，不仅减少了非特异性扩增，同时也提高了反应的特异性和灵敏性。因此，建立ARV纳米PCR检测方法，可以为ARV的分子流行病学调查和早期诊断提供试验方法。
发明内容
本发明提供了一种检测禽呼肠孤病毒的纳米PCR试剂盒，该试剂盒包括SiO2/Au/Fe3O4纳米粒子、上游引物和下游引物；上游引物的序列为5′-AAACTCCACTGCCATCTCC-3′，如序列表中SEQ ID No.1所示，下游引物的序列为5′-TCGCTGTACCATCACCTCC-3′，如序列表中SEQ ID No.2所示。
进一步的，该试剂盒所构建的PCR反应体系中所述SiO2/Au/Fe3O4纳米粒子的添加量为0.5-1.5μg/25μL。上游引物和下游引物的添加量为0.4-1.2μL/25μL。
进一步的，该试剂盒还包括MgCl2，10×PCR buffer，dNTP，Taq酶和阳性对照。
本发明还提供一种检测禽呼肠孤病毒的纳米PCR方法，该方法使用SEQ ID No.1所示的上游引物和SEQ ID No.2所示的下游引物扩增禽呼肠孤病毒的特异性片段，纳米PCR反应体系中添加有SiO2/Au/Fe3O4纳米粒子。
进一步的，该纳米PCR反应体系中，上游引物和下游引物添加量为0.4-1.2μL/25μL，SiO2/Au/Fe3O4纳米粒子的添加量为0.5-1.5μg/25μL，纳米PCR反应退火温度为55℃。
进一步的，该纳米PCR反应体系中，上游引物和下游引物添加量为0.8μL/25μL，SiO2/Au/Fe3O4纳米粒子的添加量为0.5μg/25μL。
该纳米PCR方法包括如下步骤：
1)提取样品DNA或RNA，并将RNA反转录为cDNA，获得扩增模板；
2)配制反应体系如下：25mmoL MgCl2 1μL，10×PCR buffer 2.5μL，10mmoL dNTP0.5μL，5units/μL Taq酶1μL，上游引物和下游引物各0.8μL,扩增模板1.0μL，SiO2/Au/Fe3O4 0.5μg，ddH2O补充至25μL；
3)PCR反应条件：95℃5min；95℃30S、55℃30S、72℃1min，30个循环；72℃10min。
扩增产物可经琼脂凝胶电泳检测。
本发明还提供一种检测禽呼肠孤病毒的纳米PCR方法和试剂盒在禽呼肠孤病毒的流行性调查中的应用。
本发明的有益效果包括：采用本发明的纳米PCR方法和试剂盒提高了禽呼肠孤病毒检测的灵敏度和特异性，缩短了检测时间，检测灵敏度比常规PCR方法高100倍。本发明将二氧化硅、金纳米粒子、磁性纳米粒子有序组合：利用磁性纳米粒子的磁性，以磁性纳米粒子为核，在其外包裹上其它材料可以减少集聚，二氧化硅和磁性纳米粒子仅为氧化物，导热性不如金纳米材料，因此以金纳米材料作为中间层，可以有效实现热传导。本发明采用SiO2/Au/Fe3O4纳米复合材料可以集合几种材料的优势，配合使用本发明筛选的特异性引物，能够进一步提高PCR的灵敏性、特异性和PCR扩增效率。
附图说明
图1为加入不同体积的SiO2/Au/Fe3O4时ARV纳米PCR扩增凝胶电泳图，其中样品1-10分别为加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5μL SiO2/Au/Fe3O4,N为阴性对照，M为DNA相对分子质量标准；
图2为不同退火温度下ARV纳米PCR扩增凝胶电泳图，其中样品1-8的退火温度分别为48℃、49℃、51℃、53℃、55℃、57℃、59℃、60℃，N为阴性对照，M为DNA相对分子质量标准；
图3为不同引物浓度下ARV纳米PCR扩增凝胶电泳图，其中样品1-10的引物添加体积分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0，N为阴性对照，M为DNA相对分子质量标准；
图4为不同ARVcDNA模板浓度下纳米PCR和常规PCR扩增凝胶电泳图，其中图4A为常规PCR凝胶电泳图，4B为纳米PCR凝胶电泳图，样品1-10依次为将ARVcDNA模板稀释1-1×109倍，N为阴性对照，M为DNA相对分子质量标准；
图5为ARV常规PCR和纳米PCR特异性试验凝胶电泳图，其中，图5A为常规PCR凝胶电泳图，5B为纳米PCR凝胶电泳图，样品1-11依次为H5N1、H3N6和H9N2亚型禽流感病毒、传染性法氏囊病毒、喉气管炎病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、鸡传染性贫血病毒、减蛋综合征病毒、禽腺病毒、大肠杆菌，N为阴性对照，P为ARV阳性对照，M为DNA相对分子质量标准。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步说明和描述，但所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明和实施例中，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他发明和实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中,Triozol试剂购自Invitrogen公司，AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、Premix Taq(Ex TaqVersion 2.0Plus dye)、100bp DNA Ladder购自宝生物工程(大连)有限公司。FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、硫酸、氨水、柠檬酸钠、四氯金酸购自国药集团化学试剂有限公司。TaKaRa Ex Taq的来源购自宝生物工程(大连)有限公司。
实施例1、SiO2/Au/Fe3O4的制备
1g FeCl3·6H2O和0.4g FeSO4·7H2O加入到10mL的去离子水中,置于300mL三颈烧瓶中室温下搅拌30min，N2保护条件下加热至80℃，迅速加入100mL1.0mol/L的氨水，继续反应40min,生成黑色悬浊液，用磁铁分离，收集沉淀，并用二次去离子水反复洗涤五次，再用无水乙醇洗涤两次，直到上清液变澄清，将收集到的固体分散到100mL去离子水中，得到Fe3O4纳米粒子。
0.229g柠檬酸钠溶解在100mL去离子水中，磁性搅拌下加热到80℃，再加入50mL上述制备得到的Fe3O4纳米粒子，然后加入20mL 10mmol/L四氯金酸，80℃下反应15min，最后移走热源，在室温下继续搅拌15min。当酒红色悬浊液冷却至室温后，再次用磁铁分离。最后将收集到的固体分散到50mL去离子水中，得到的Au/Fe3O4悬浊液置于4℃下保持备用。
将50mL上述制备得到的Au/Fe3O4分散在200mL乙醇中，超声10min,搅拌条件下，将1mL NH3·H2O滴加到上述混合物中搅拌30min，加入0.027g正硅酸四乙酯，持续搅拌6h，用磁铁分离，收集沉淀，并用二次去离子水反复洗涤五次，70℃真空干燥，称重，最后将收集到的固体分散到去离子水中得到的1mg/mL SiO2/Au/Fe3O4悬浊液置于4℃下保持备用。
实施例2、纳米PCR方法的建立
1.PCR模板的准备
禽呼肠孤病毒S1133购自中国兽药检测所，收集禽呼肠孤病毒S1133Vero细胞按106～107加入1.0mL Trizol,裂解后加入0.2mL氯仿，离心后吸取上清，加入0.5mL异丙醇，离心沉淀后弃上清，加入75％乙醇洗涤沉淀。沉淀RNA干燥后溶于ddH2O。反转录反应体系为30.0μL体系，即上述总RNA 1μg,5×Buffer 6.0μL,随机引物1.0μL，10mmol/L dNTP 2.0μL,RNA抑制剂0.5μL，AMV反转录酶1.0μL，加ddH2O至30.0μL，离心混合。在PCR仪上进行反转录，反转录程序为：30℃10min,50℃60min,70℃15min。产物置于-20℃保存备用，分光光度计测定cDNA的纯度和浓度。
2.PCR引物设计
参考Genbank上发表的ARV基因序列(登录号：L39002.1)，针对ARV S1基因设计并合成1对引物，引物序列分别为上游引物(ARV-572F):5′-AAACTCCACTGCCATCTCC-3′(990—1008)，序列表中编号为SEQ ID NO.1；下游引物(ARV-572R):5′-TCGCTGTACCATCACCTCC-3′(1543—1561)，序列表中编号为SEQ ID NO.2；目的片段大小为572bp。由华大基因生物科技(深圳)有限公司合成，超纯水稀释至10μmol/L，冷冻保存备用。
3.纳米PCR反应体系及条件优化
反应体系：TaKaRa Ex Taq 12.5μL(本发明中使用的TaKaRa Ex Taq可用25mmoLMgCl2 1μL,10×PCR buffer 2.5μL,10mmoL dNTP 0.5μL,5units/μL Taq酶1μL代替，差量ddH2O补齐，下同)，上游引物/下游引物(10μmol·L-1)1.0μL,DNA模板1.0μL，SiO2/Au/Fe3O4 1.0μL，ddH2O补充至25μL；反应条件预设定：95℃5min；95℃30S、55℃30S、72℃1min，30个循环；72℃10min。并采用二次去离子水代替DNA模版作为阴性对照。扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。
为了确定SiO2/Au/Fe3O4最佳浓度，分别将0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5μL SiO2/Au/Fe3O4加入到纳米PCR反应体系中进行扩增。扩增结果如图1所示，其中0.5～1.5μL有明显扩增条带，2.0～3.0μL对PCR扩增抑制逐步加强，3.8～4.5μL完全抑制PCR扩增。
用梯度PCR仪分别设置退火温度为48℃、49℃、51℃、53℃、55℃、57℃、59℃、60℃，反应体系和其它条件均相同，探索最佳退火温度。琼脂糖凝胶电泳结果见图2。由图2可知，48-60℃下，纳米PCR均可扩增得到目的条带，最佳退火温度为55℃。
引物的使用体积从0.2到2.0μL进行优化，间隔0.2μL，按照优化后的SiO2/Au/Fe3O4加入量(0.5μL)及退火温度(55℃)进行扩增反应，扩增产物经1.0％琼脂凝胶电泳检测。结果如图3所示，当引物量为0.4～1.2μL时扩增效果最佳。
经反应退火温度、SiO2/Au/Fe3O4浓度及引物浓度的摸索，最终确定ARV纳米PCR反应体系：TaKaRa Ex Taq 12.5μL，上游引物/下游引物(10μmol·L-1)0.8μL,DNA 1.0μL，SiO2/Au/Fe3O4 0.5μL，ddH2O补充至25μL。反应条件预设定：95℃5min；95℃30S、55℃30S、72℃1min，30个循环；72℃10min。
作为对比实验的常规PCR反应体系为：TaKaRa Ex Taq 12.5μL，上游引物/下游引物(10μmol·L-1)0.8μL,DNA 1.0μL，ddH2O补充至25μL；反应条件预设定：95℃5min；95℃30S、55℃30S、72℃1min，30个循环；72℃10min。
4.敏感性实验
病毒cDNA的浓度经测定为57ng·μL-1，将抽提的cDNA进行10倍梯度稀释，得到浓度梯度(57～5.7×10-8ng·μL-1)模版标准品。取每个稀释度的cDNA模版分别应用步骤3中优化后的纳米PCR和常规PCR方法检测，扩增产物经1.0％琼脂凝胶电泳检测，比较两者的敏感性，实验重复三次。
琼脂糖凝胶电泳结果见图4，由图4B可知，纳米PCR能检测到1×108倍稀释提取DNA(5.7×10-7ng·μL-1)，而图4A中常规PCR能检测到1×106倍稀释提取DNA((5.7×10-5ng·μL-1)，敏感性实验结果表明纳米PCR灵敏度比常规PCR方法高100倍。
5特异性实验
应用纳米PCR和常规PCR分别对H5N1、H3N6和H9N2亚型禽流感病毒、传染性法氏囊病毒、喉气管炎病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、鸡传染性贫血病毒、减蛋综合征病毒、禽腺病毒、大肠杆菌及ARV进行检测，以此验证纳米PCR的特异性，实验重复3次。
结果如图5所示，纳米PCR扩增中，只有ARV能扩增出572bp的目的片段(图5B)，而常规PCR扩增中，新城疫病毒也能扩增出572bp的目的片段(图5A),实验结果表明纳米PCR比常规PCR特异性高，SiO2/Au/Fe3O4能有效抑制PCR非特异性扩增，提高特异性。
序列表
<110> 广西壮族自治区兽医研究所
<120> 一种检测禽呼肠孤病毒的纳米PCR方法、试剂盒及应用
<141> 2020-05-20
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaactccact gccatctcc 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcgctgtacc atcacctcc 19

Claims (8)

1.一种检测禽呼肠孤病毒的纳米PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括SiO2/Au/Fe3O4纳米粒子、上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为SEQ ID No.1所示，所述下游引物的序列为SEQ ID No.2所示；所述SiO2/Au/Fe3O4纳米粒子包括如下制备步骤：
1)1g FeCl3·6H2O和0.4g FeSO4·7H2O加入到10mL的去离子水中，置于300mL三颈烧瓶中室温下搅拌30min，N2保护条件下加热至80℃，迅速加入100mL1.0mol/L的氨水，继续反应40min，生成黑色悬浊液，用磁铁分离，收集沉淀，并用二次去离子水反复洗涤五次，再用无水乙醇洗涤两次，直到上清液变澄清，将收集的固体分散到100mL去离子水中，得到Fe3O4纳米粒子；
2)0.229g柠檬酸钠溶解在100mL去离子水中，磁性搅拌下加热到80℃，再加入50mL步骤1）得到的Fe3O4纳米粒子，然后加入20mL 10mmol/L四氯金酸，80℃下反应15min，最后移走热源，在室温下继续搅拌15min；当酒红色悬浊液冷却至室温后，再次用磁铁分离；最后将收集到的固体分散到50mL去离子水中，得到的Au/Fe3O4悬浊液置于4℃下保持备用；
3)取50mL步骤2）得到的Au/Fe3O4悬浊液分散在200mL乙醇中，超声10min，搅拌条件下，将1mL NH3·H2O滴加到上述混合物中搅拌30min，加入0.027g正硅酸四乙酯，持续搅拌6h，用磁铁分离，收集沉淀，并用二次去离子水反复洗涤五次，70℃真空干燥，称重，最后将收集到的固体分散到去离子水中得到的1mg/mL SiO2/Au/Fe3O4悬浊液置于4℃下保持备用。
2.根据权利要求1所述的检测禽呼肠孤病毒的纳米PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括MgCl2，10×PCR buffer，dNTP，Taq酶。
3.根据权利要求2所述的检测禽呼肠孤病毒的纳米PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照。
4.一种检测禽呼肠孤病毒的纳米PCR方法，其特征在于，所述方法使用权利要求1中所述的SiO2/Au/Fe3O4纳米粒子、上游引物和下游引物扩增禽呼肠孤病毒的特异性片段，所述方法不包括疾病的诊断和治疗方法。
5.根据权利要求4所述的检测禽呼肠孤病毒的纳米PCR方法，其特征在于，所述纳米PCR的反应体系中，所述上游引物和下游引物添加量为0.4-1.2μL/25μL，和/或所述SiO2/Au/Fe3O4纳米粒子的添加量为0.5-1.5μg/25μL，和/或所述纳米PCR反应退火温度为55℃。
6.根据权利要求5所述的检测禽呼肠孤病毒的纳米PCR方法，其特征在于，所述纳米PCR反应体系中，所述上游引物和下游引物添加量为0.8μL/25μL，和/或所述SiO2/Au/Fe3O4纳米粒子的添加量为0.5μg/25μL。
7.根据权利要求6所述的检测禽呼肠孤病毒的纳米PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)提取样品DNA或RNA，并将RNA反转录为cDNA，获得扩增模板；
2)配制反应体系如下：25mmoL MgCl2 1μL，10×PCR buffer 2.5μL，10mmoL dNTP 0.5μL，5units/μL Taq酶1μL，上游引物和下游引物各0.8μL,扩增模板1.0μL，SiO2/Au/Fe3O40.5μg，ddH2O补充至25μL；
3)PCR反应条件：95℃5min；95℃30S、55℃30S、72℃1min，30个循环；72℃10min。
8.权利要求1-3任一项所述的检测禽呼肠孤病毒的纳米PCR试剂盒、权利要求4-7任一项所述的检测禽呼肠孤病毒的纳米PCR方法在禽呼肠孤病毒的流行性调查中的应用，所述应用不包括疾病的诊断和治疗方法。
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