CN102277433A

CN102277433A - 一种检测微量蛋白样品的方法

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Publication number: CN102277433A
Application number: CN2011102229543A
Authority: CN
Inventors: 盛司潼
Original assignee: 盛司潼
Current assignee: Shenzhen HYK Gene Technology Co., Ltd.
Priority date: 2011-08-04
Filing date: 2011-08-04
Publication date: 2011-12-14
Anticipated expiration: 2031-08-04
Also published as: CN102277433B

Abstract

本发明涉及生物样品的检测，提供了一种对微量蛋白样品进行高灵敏度检测的方法。所述方法包括以下步骤：A.将蛋白样品固定于带修饰基团的载体上，利用带寡核苷酸标签序列的抗体与蛋白样品孵育，形成抗体-蛋白结合物；B.对抗体-蛋白结合物所结合的寡核苷酸标签序列进行扩增，得到寡核苷酸标签序列库；C.利用测序方法采集寡核苷酸标签序列信号，并分析所述序列信号得到相应靶标蛋白的数量。本发明将蛋白样品固定于带有修饰基团的载体上，利用抗体上偶联的寡核苷酸标签序列进行级联扩增，并利用测序的方法检测寡核苷酸标签序列的信号，间接得到微量蛋白样品的放大信号，实现对微量蛋白样品进行高灵敏度检测以及定量的目的。

Description

一种检测微量蛋白样品的方法

技术领域

本发明涉及生物样品的检测，更具体地说，涉及一种检测微量蛋白样品的方法。

背景技术

蛋白质由基因组编码翻译生成，并在生物化学代谢途径、大分子组装中发挥重要作用。随着人类和许多典型生物体及具有亲缘关系物种的基因组测序完成，对于正常和非正常组织，如肿瘤和机能障碍的器官进行蛋白质(组)的分析就变得至关重要了。

为了对蛋白进行分析，已经发展起来许多技术，如质谱技术、蛋白质芯片、通过抗体介导表面等离子技术(surface plasma)等已经应用于细胞内物质的蛋白质分析。但是现存实验方法对于含量少的样品检测灵敏度低，这就限制了它们的应用范围。DNA和RNA与蛋白质不同，能够通过扩增放大用于芯片检测，而蛋白质本身不能实现转录后的扩增。因此，要对微量甚至是单个细胞的蛋白质(组)进行分析，就迫切需要发展一种新型的检测技术，能特异性检测出少到甚至单个细胞的微量蛋白样品。

现存技术中，使用抗体检测蛋白信号的方法能将信号进行级联放大，但是它的决定因素是结合动力学，而不在于检测的灵敏度。当加入过量的抗体时，抗体与其相应抗原的反应遵循一级反应动力学。假如所给定的抗体具有很高的亲和力，为了实现在限定的时间内使抗原、抗体达到最大限度的结合，需要增加靶抗原或检测抗体的浓度。当反应中靶蛋白含量很低时，就需要使用过量的抗体。但是对于载体表面来说，能够结合的抗体的浓度是固定的，很难增加，因此不能仅从载体表面固定的抗体方面考虑。同时，由于已经结合抗原的抗体带来的表面效应也会降低后续抗体的亲和力。上述原因，导致微量蛋白样品的检测灵敏度过低。

质谱技术对物种的鉴别非常准确，但是费用昂贵，耗费人力多。抗体检测是很早就建立起的一种检测特异蛋白或细胞内容物中蛋白质的技术，而且这种技术被广泛地用于蛋白质印迹(western blot)，但是western blot方法通常一次只能应用一种抗体来检测蛋白，这极大地限制了检测蛋白质的数量。

因此，迫切需要一种新的蛋白质检测方法，在实现高灵敏度检测微量蛋白样品的同时还能够对多种微量蛋白样品进行检测，特别是对于单细胞内的蛋白样品进行特定成份的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测微量蛋白样品的方法，旨在解决现有技术中对微量蛋白样品检测灵敏度过低以及不能同时对多种蛋白样品进行检测的问题。

为了实现发明目的，所述检测微量蛋白样品的方法包括以下步骤：

A.将蛋白样品固定于带修饰基团的载体上，利用带寡核苷酸标签序列的抗体与蛋白样品孵育，形成抗体-蛋白结合物；

B.对抗体-蛋白结合物所结合的寡核苷酸标签序列进行扩增，得到寡核苷酸标签序列库；

C.利用测序方法采集寡核苷酸标签序列信号，并分析所述序列信号得到相应靶标蛋白的数量。

所述检测微量蛋白样品的方法，将蛋白样品固定于载体形成固定相，利用带有寡核苷酸标签序列的抗体作为流动相与蛋白样品孵育生成抗体-蛋白结合物，能够使得蛋白样品充分结合相应的抗体；再对抗体上携带的寡核苷酸标签序列进行扩增，使得相应的待测靶标蛋白得到级联放大；而利用灵敏度和特异性高的测序方法采集寡核苷酸标签序列信号，分析所述序列信号从而推算出所测靶标蛋白的数量，通过上述方式可以提高微量蛋白样品的检测灵敏度。同时，通过寡核苷酸标签序列与抗体-蛋白结合物的一一对应关系，能够实现多种蛋白的同时检测。

进一步的，步骤A包括：

A1.对所述载体进行化学修饰，使其表面携带修饰基团，并将蛋白样品连接到所述修饰基团上；

A2.将与待测靶标蛋白匹配的抗体和寡核苷酸标签序列偶联，得到带寡核苷酸标签序列的抗体；

A3.将带寡核苷酸标签序列的抗体与载体上的蛋白样品孵育，形成抗体-蛋白结合物；

其中，所述步骤A1、A2无先后顺序。

优选的，本发明中所述载体，包括常见的具有规则表面形状的固相载体，如玻片、硅片和塑料，也包括具有不规则表面形状的固相载体，如带有弧度的载体。上述载体的形状和材料，并不用以限定本发明的保护范围，其他形状和材料的载体也可以用于本发明。

优选的，步骤A1中所述载体表面的修饰基团能与蛋白所携带的基团相互结合，结合后的连接形式为P1-P-P2，其中P1代表载体表面的修饰基团，P为P1与P2形成的化学键或中间偶联剂，P2代表了蛋白所携带的末端基团。

优选的，所述载体固定的蛋白样品是指：含一种蛋白的单一样品，或含多种蛋白的混合样品，所述蛋白样品是天然状态或变性状态的样品。

优选的，所述抗体匹配于所要检测的靶标蛋白。

优选的，若所述的蛋白样品是含多种蛋白的混合样品，则所述的寡核苷酸标签序列对应于不同的抗体，且所有寡核苷酸标签序列的扩增条件一致，相互之间不会产生交叉配对，其序列的长度则由扩增和后续测序的需求来决定。

进一步的，抗体与寡核苷酸标签序列的偶联一一对应，其偶联后的连接形式为R1-R-R2，其中R1代表抗体上所携带的末端基团，R为R1和R2形成的化学键或中间偶联剂，R2代表寡核苷酸标签序列上携带的末端基团。

更进一步的，抗体与寡核苷酸标签序列偶联形成的连接形式R1-R-R2中，R1为抗体携带的羧基或氨基；R2为寡核苷酸标签序列上携带的修饰基团如氨基、羧基或生物素等；R为酰胺键或中间偶联剂如均苯三甲酸(TMA)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基乙胺(DIEA)等。

优选的，偶联寡核苷酸标签序列的抗体与蛋白结合时，蛋白作为固定相，而抗体作为流动相，能够使得微量靶标蛋白样品也能充分结合上抗体，提高检测方法的灵敏度，而且不同的抗体能与相应的靶标蛋白同时进行结合。

进一步的，所述步骤A3结束之后，还应包括对结合靶标蛋白后的抗体使用改变缓冲液种类或盐溶液浓度的方式进行洗脱分离的步骤。

优选的，所述步骤B中的扩增采用液相扩增或固-液相扩增方式。如液相扩增方式中普通的聚合酶链式反应(PCR)扩增或固-液相扩增方式中的微乳液PCR(emulsion PCR，E-PCR)扩增、桥式PCR扩增、双引物E-PCR(dualprimer emulsion PCR，DPePCR)扩增(或称为桥式E-PCR扩增)。在实际的操作中，可以优选前面所列的多种固-液相扩增方式，能够保证寡核苷酸标签序列的扩增是均一且高保真的。在具体操作中，进一步优选采用E-PCR进行单分子扩增，保证检测结果的可靠性。所述的E-PCR扩增采用典型方案，包括：

B1.将与寡核苷酸标签序列对应的扩增引物结合到微珠表面；

B2.利用结合有扩增引物的微珠以及抗体-蛋白结合物制备乳浊液体系；

B3.利用制备好的乳浊液体系进行E-PCR扩增，得到寡核苷酸标签序列库；

B4.对扩增产物进行破乳释放和洗涤纯化回收。

优选的，所述步骤B1中的微珠包括磁珠、塑料珠或玻璃珠中的至少一种。

进一步的，步骤C中所述的测序方法，是指通过碱基互补原则测定寡核苷酸标签序列中的碱基，确认寡核苷酸标签序列及其对应的靶标蛋白。

所述检测微量蛋白样品的方法中，每一种抗体对应一种标签序列，这些标签序列代表的是不同的抗体，也就是代表了不同的靶标蛋白。由于之前的扩增采用均一高保真的扩增方式，而且是进行单分子检测，因此高通量测序得到的序列片段的个数即为原始样品中所对应的靶标蛋白的个数。通过简单的记数每一种标签序列片段的个数，就可以得到对应的靶标蛋白的个数，二者呈线性关系。

由上可知，本发明在对微量蛋白样品进行高灵敏度检测的过程中，对应靶标蛋白的多种抗体采用寡核苷酸标签序列进行偶联，通过抗体与蛋白结合形成抗体-蛋白结合物进行级联扩增，将检测信号进行级联放大，然后再采用测序的方法检测寡核苷酸标签序列的信号，提高了对微量蛋白样品的检测灵敏度。将蛋白样品固定于载体，可以进行多种蛋白的同时检测。

附图说明

图1是本发明检测微量蛋白样品的方法流程图；

图2是图1所示实施例中将蛋白样品固定于带修饰基团的载体上，利用带寡核苷酸标签序列的抗体与蛋白样品孵育，形成抗体-蛋白结合物的方法流程图；

图3是图1所示实施例中用于固定蛋白样品的载体结构示意图；

图4是图1所示实施例中用于固定蛋白样品的载体结构示意图；

图5是图1所示实施例中对抗体-蛋白结合物所结合的寡核苷酸标签序列进行液相扩增，得到寡核苷酸标签序列库的方法流程图；

图6是图1所示实施例中对抗体-蛋白结合物所结合的寡核苷酸标签序列进行固-液相扩增，得到寡核苷酸标签序列库的方法流程图；

图7是本发明一个实施例中检测微量蛋白样品的方法示意图；

图8是本发明一个实施例中检测微量蛋白样品的方法示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

图1示出了本发明检测微量蛋白样品的方法流程，包括：

在步骤S101中，将蛋白样品固定于带修饰基团的载体上，利用带寡核苷酸标签序列的抗体与蛋白样品孵育，形成抗体-蛋白结合物。关于步骤S101的具体过程，将在图2中详细阐述。

在步骤S102中，对抗体-蛋白结合物所结合的寡核苷酸标签序列进行扩增，得到寡核苷酸标签序列库。关于步骤S102的具体过程，将在图5中详细阐述。

在步骤S103中，利用测序方法采集寡核苷酸标签序列信号，并分析所述序列信号得到相应靶标蛋白的数量。在之前的步骤中，设计的是每一种抗体对应一种寡核苷酸标签序列，不同标签序列代表不同的抗体，也就代表了不同的靶标蛋白。由于之前的扩增是单分子扩增，因此测序得到的寡核苷酸序列片段的数量即为原始样品中所对应的靶标蛋白的数量。通过计算每一种寡核苷酸标签序列片段的数量，就可以得到对应的靶标蛋白的数量。

其中，所述测序方法是利用碱基互补原则对寡核苷酸标签序列进行碱基序列测定，例如合成测序法或连接测序法。在一个实施例中，利用与寡核苷酸标签序列互补的测序引物，通过DNA聚合酶以及带可去除标记的四种核苷酸混合物进行单碱基延伸合成反应，收集加入核苷酸的标记信号，即可得到相应碱基的序列信号，从而达到通过合成测序法采集所述寡核苷酸标签序列信号的目的。在另一个实施例中，则采用连接测序法，利用含数个bp的带荧光标记的核酸探针以及连接酶作用，采集连接到寡核苷酸标签序列上的探针荧光信号，再切除荧光探针，反复测定得到寡核苷酸标签序列信号。

图2给出了图1步骤S101将蛋白样品固定于带修饰基团的载体上，利用带寡核苷酸标签序列的抗体与蛋白样品孵育，形成抗体-蛋白结合物的方法流程。其中包括：

在步骤S1011中，预先对要用于固定蛋白样品的载体进行化学基团修饰，使载体表面携带修饰基团，并将蛋白样品连接到所述修饰基团上。所述载体表面的修饰基团能与蛋白所携带的基团相互结合，结合后的连接形式为P1-P-P2，其中P1代表载体表面的修饰基团，P为P1与P2形成的化学键或中间偶联剂，P2代表了蛋白所携带的末端基团。需要说明的是：本发明中的蛋白样品存在多种，载体也存在多种，而蛋白样品与修饰基团之间的连接方式也存在多种，以下将分别详述。

关于蛋白样品：本发明所述的蛋白样品可以是任意来源的蛋白，包括直接得到的或人工合成的蛋白，或是从生物组织中提取得到的蛋白，如破碎细胞得到的蛋白或病毒中提取的蛋白。在本发明的一个实施例中，从非洲绿猴肾细胞(Vero)中提取细胞蛋白用于检测。在本发明的另一个实施例中，从痘病毒(Poxviuses)中提取病毒蛋白用于检测病毒特征蛋白。此外，为凸显本发明的意义所在，固定的蛋白样品是指：含一种蛋白的单一样品，或含多种蛋白的混合样品，所述蛋白样品是天然状态或变性状态的样品。当固定于载体的蛋白样品为多种蛋白的混合样品时，本发明可以实现对多于一种靶标蛋白的样品进行同时检测。

关于载体：本发明中所述载体，包括常见的具有规则表面形状的固相载体，如平面的玻片、硅片和塑料，也包括具有不规则表面形状的固相载体，如带有弧度的载体。在本发明的一个实施例中，采用如图3所示的规则形状的矩形玻片。而在本发明的另一个实施例中，采用了如图4所示的不规则弧形的载体。上述载体的形状和材料，并不用以限定本发明的保护范围，其他形状和材料的载体也可以用于本发明。

关于蛋白样品与修饰基团之间的连接方式：在一个实施例中，对载体表面进行氨基(P1)修饰，可以与蛋白所携带的羧基(P2)形成酰胺键(P)。在本发明的另一个实施例中，对载体进行氨基(P1)修饰，采用中间偶联剂戊二醛(P)，将载体表面的氨基(P1)与蛋白所携带的羧基(P2)连接。

在步骤S1012中，将与待测靶标蛋白匹配的抗体和寡核苷酸标签序列偶联，得到带寡核苷酸标签序列的抗体。若检测的蛋白样品为多种蛋白的混合样品，则不同的寡核苷酸标签序列对应不同的抗体，相互之间不会产生错配，且所有的寡核苷酸标签序列的扩增条件一致，其长度由扩增和后续测序的需求决定。抗体与寡核苷酸标签序列的偶联一一对应，其偶联后的连接形式为R1-R-R2，其中R1代表抗体上所携带的末端基团，R为R1和R2形成的化学键或中间偶联剂，R2代表寡核苷酸标签序列上携带的末端基团。关于该连接形式，分别阐述如下：

若R为R1和R2形成的化学键：在一个实施例中，R1选用抗体上所携带的氨基，而寡核苷酸标签序列经过羧基化修饰，从而R2为寡核苷酸标签序列上的羧基，R则为二者形成的酰胺键。在另一个实施例中，抗体经过链霉亲和素修饰，R1为抗体上所带的链霉亲和基团，而寡核苷酸标签序列经过生物素修饰，R2为生物素基团，R为链霉亲和生物素融合体。

若R为中间偶联剂：中间偶联剂可以包括均苯三甲酸(TMA)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)溶液、二异丙基乙胺(DIEA)的至少一种。在一个实施例中，R选用NHS，通过NHS将抗体与寡核苷酸标签序列偶联在一起。

在步骤S1013中，将带寡核苷酸标签序列的抗体与载体上的蛋白样品孵育，形成抗体-蛋白结合物。其中，固定在载体上的蛋白样品作为固定相，而偶联标签寡核苷酸标签序列的抗体作为流动相，靶标蛋白与抗体能够进行充分的结合，提高检测的灵敏度。两者孵育的条件，在一个实施中为37℃下孵育2h，在另一个实施例中，28℃下孵育结合2h，即可得到所要的抗体-蛋白结合物。

上述步骤中S1011和S1012之间并无先后顺序，在另一个实施例中，二者的先后顺序置换，同样能实现形成抗体-蛋白结合物的目的。

上述步骤结束之后，还包括对未结合蛋白的抗体进行分离洗涤，然后再对结合有靶标蛋白的抗体进行洗脱收集的步骤。利用缓冲液对孵育之后的反应液进行洗涤，将剩余的流动相抗体分离。然后换用洗脱液，对结合有靶标蛋白的抗体进行洗脱，收集以待后续使用。

在一个实施例中，我们分别对靶标蛋白protein A和protein B进行检测，因此我们选择antibody-A和antibody-B作为靶标蛋白的抗体，对应的，设计了两种寡核苷酸标签序列I和II。按照上述方法，将蛋白样品固定于载体，然后先将antibody-A与寡核苷酸标签序列I、antibody-B与寡核苷酸标签序列II偶联起来，再与固定在载体上的蛋白样品进行孵育结合，形成抗体-蛋白结合物，通过分离洗涤以及洗脱，提纯抗体-蛋白结合物。

图5示出了图1所示实施例中步骤S102对抗体-蛋白结合物所结合的寡核苷酸标签序列进行液相扩增，得到寡核苷酸标签序列库的方法流程。包括：

在步骤S1021’中，利用抗体-蛋白结合物上结合的寡核苷酸标签序列作为模板，配制液相PCR扩增体系。本发明的一个实施例中，以抗体-蛋白结合物中的寡核苷酸标签序列为模板，建立如下液相PCR扩增体系：10×PCR buffer，15μL；50mM MgSO4，3μL；10mM dNTP，3μL；10μM浓度的上、下游两端引物，各1μL；抗体-蛋白结合物洗脱液，1μL；5U/μL浓度的Taq酶，5μL，加ddH₂O至150μL，形成液相PCR扩增体系。

在步骤S1022’中，利用配制好的液相PCR扩增体系，进行PCR扩增，得到扩增产物。本发明中的一个实施例中，进行如下PCR扩增：

94℃，5min；

94℃，30s；60℃，50s；72℃，2min；循环25次；

72℃，2min；然后4℃保存。

在步骤S1023’中，对扩增产物进行凝胶纯化回收，得到寡核苷酸标签序列库。液相PCR扩增反应结束后，点样于琼脂糖凝胶，跑胶回收寡核苷酸标签序列长度所在的目的条带，通过吸附柱以及高速离心方式对扩增产物进行回收，回收产物以TE缓冲液重悬保存。

图6示出了对抗体-蛋白结合物所结合的寡核苷酸标签序列进行固-液相扩增，得到寡核苷酸标签序列库的方法流程。包括：

在步骤S1021中，将与寡核苷酸标签序列对应的扩增引物结合到微珠上。其中，所述微珠包括磁珠、塑料珠或玻璃珠中的一种。二者结合的方法可以利用现有方法，如通过氨基与羧基或醛基结合，丙烯酰胺与聚丙烯酰胺结合等。在本发明的一个实施例中，采用磁珠表面带有的链霉亲和素与被生物素化的引物进行孵育结合。在本发明的另一个实施例中，采用醛基修饰磁珠表面，与扩增引物的氨基反应而使扩增引物结合到磁珠上。

在步骤S1022中，利用结合了扩增引物的微珠以及抗体-蛋白结合物制备乳浊液扩增体系。将抗体上所结合的寡核苷酸标签序列作为模板，加入结合了扩增引物的微珠以及扩增体系所需要的其他试剂，制备成水相体系。然后将水相与油相混合，放置于乳浊液制备仪上，根据扩增产物的需要，以适宜的频率和时间进行震荡混匀，制备成乳浊液扩增体系。在本发明的一个实施例中，乳浊液扩增体系采用13HZ，13s的条件进行制备。

在步骤S1023中，利用上述制备好的乳浊液扩增体系进行E-PCR扩增，得到寡核苷酸标签序列库。在本发明的一个实施例中，进行如下所示扩增：

94℃ 4min；

94℃ 3s，64℃ 55s，72℃ 45s，3cycles；

94℃ 30s，61℃ 55s，72℃ 45s，3cycles；

94℃ 30s，58℃ 55s，72℃ 45s，3cycles；

94℃ 30s，57℃ 55s，72℃ 45s，100cycles；

72℃ 6min；10℃保温。

应当说明的是，上述扩增条件仅为部分实施例，并不用以限定本发明的保护范围。

在步骤S1024中，对扩增产物进行破乳释放和洗涤，提纯寡核苷酸标签序列库。在本发明的一个实施例中，在扩增产物中加入异丙醇，混合均匀，4000rpm离心3min，去上清；然后加入适量的Extraction buffer，振荡混匀，4000rpm离心3min，去上清；加入TE洗涤，去上清，再用TE重悬扩增产物。

图7是本发明实施例中检测细胞中微量蛋白样品的方法示意图。该图直观的展示了检测细胞中微量蛋白样品的过程：

步骤1、对载体进行羧基化修饰，利用化学裂解法破碎细胞获取细胞全蛋白，将细胞全蛋白通过羧基与氨基作用形成的酰胺键固定于载体上。

步骤2、将与待测靶标细胞蛋白匹配的抗体通过氨基羧基之间的键和作用和寡核苷酸标签序列一一对应偶联，然后将偶联了寡核苷酸标签序列的抗体与固定于载体上的细胞全蛋白孵育形成抗体-蛋白结合物，将未结合的抗体洗涤分离，然后将载体上的抗体-蛋白结合物进行洗脱收集，以备后续操作使用。

步骤3、利用链霉亲和生物素的作用将与寡核苷酸标签序列对应的扩增引物结合到磁珠上，再利用磁珠以及抗体上所偶联的寡核苷酸标签序列制备乳浊液扩增体系，对抗体-蛋白结合物进行E-PCR扩增获取寡核苷酸标签序列库，破乳收集扩增产物。

步骤4、将扩增产物点样固定到测序所用的玻片上，利用测序方法采集寡核苷酸标签序列信号，统计并分析寡核苷酸标签序列信号，通过线性对应关系得到各相应靶标蛋白的数量。

图8是本发明实施例中检测病毒中微量蛋白样品的方法示意图。该图直观的展示了检测病毒中微量蛋白样品的过程：

步骤1、对载体进行羧基化修饰，利用反复冻融法裂解病毒获取病毒蛋白，将病毒蛋白通过羧基与氨基作用形成的酰胺键固定于载体上。

步骤2、将与待测靶标病毒特征蛋白匹配的抗体通过氨基羧基之间的键和作用与寡核苷酸标签序列一一对应偶联，然后将偶联了寡核苷酸标签序列的抗体与固定于载体上的病毒蛋白孵育形成抗体-蛋白结合物，将未结合的抗体洗涤分离，然后将载体上的抗体-蛋白结合物进行洗脱收集，以备后续操作使用。

步骤3、利用链霉亲和生物素的作用将与寡核苷酸标签序列对应的扩增引物结合到磁珠上，再利用所述磁珠以及抗体上所偶联的寡核苷酸标签序列制备乳浊液扩增体系，对抗体-蛋白结合物进行E-PCR扩增获取寡核苷酸标签序列库，破乳收集扩增产物。

步骤4、将扩增产物点样固定于到测序所用的玻片上，利用测序方法采集寡核苷酸标签序列信号，并分析所述寡核苷酸标签序列信号，通过线性对应关系得到各相应病毒特征蛋白的数量。

应当说明的是，本发明对微量蛋白样品进行检测的方法典型的应用于蛋白样品检测，但不限于蛋白样品检测，任何其他类似的应用均应包含在本发明的保护范围之内。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种检测微量蛋白样品的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的检测微量蛋白样品的方法，其特征在于，所述步骤A包括以下步骤：

其中，所述步骤A1、A2无先后顺序。

3.根据权利要求1或2所述的检测微量蛋白样品的方法，其特征在于，所述步骤A中载体表面的修饰基团能与蛋白所携带的基团相互结合，结合后的连接形式为P1-P-P2，其中P1代表载体表面的修饰基团，P为P1与P2形成的化学键或中间偶联剂，P2代表蛋白所携带的末端基团。

4.根据权利要求3述的检测微量蛋白样品的方法，其特征在于，所述蛋白样品是指：含一种蛋白的单一样品，或含多种蛋白的混合样品。

5.根据权利要求4所述的检测微量蛋白样品的方法，其特征在于，若所述蛋白样品是含多种蛋白的混合样品，则所述步骤B中寡核苷酸标签序列的扩增条件一致。

6.根据权利要求2所述的检测微量蛋白样品的方法，其特征在于，抗体与寡核苷酸标签序列的偶联一一对应，其偶联后的连接形式为R1-R-R2，其中R1代表抗体上所携带的末端基团，R为R1和R2形成的化学键或中间偶联剂，R2代表寡核苷酸标签序列上携带的末端基团。

7.根据权利要求2所述的检测微量蛋白样品的方法，其特征在于，所述步骤A3后还包括：

对未结合蛋白的抗体进行分离洗涤，并对结合有靶标蛋白的抗体进行洗脱。

8.根据权利要求7所述的检测微量蛋白样品的方法，其特征在于，对结合靶标蛋白后的抗体采用改变缓冲液种类或盐溶液浓度的方式进行洗脱分离。

9.根据权利要求1所述的检测微量蛋白样品的方法，其特征在于，所述步骤B中扩增的方式，采用液相扩增或固-液相扩增的方式。

10.根据权利要求9所述的检测微量蛋白样品的方法，其特征在于，若所述步骤B采用固-液相扩增方式，则扩增步骤包括：

B1.将与寡核苷酸标签序列对应的扩增引物结合到微珠表面；

B3.利用制备的乳浊液体系进行E-PCR扩增，得到扩增产物；

B4.对扩增产物进行破乳释放和纯化回收，得到寡核苷酸标签序列库。

11.根据权利要求10所述的检测微量蛋白样品的方法，其特征在于，所述步骤B1中的微珠包括磁珠、塑料珠或玻璃珠中的至少一种。

12.根据权利要求1所述的检测微量蛋白样品的方法，其特征在于，步骤C中所述测序方法，是指通过碱基互补原则测定寡核苷酸标签序列中的碱基，确认寡核苷酸标签序列及其对应的靶标蛋白。