CN1373364A - 一种使用免疫PCR技术的红斑狼疮抗Sm抗体的检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种使用免疫PCR技术的红斑狼疮抗Sm抗体的检测方法。结合了抗原抗体反应的特异性与PCR扩增技术的优点。步骤是将SmAg抗原包被、封闭、加血清、加探针、加PCR混合物,在PCR扩增仪上扩增。再在水凝胶中电泳,经EB柒色,在紫外线反射透射仪上观察结果,照像。使用本发明的积极效果是不仅具有免疫反应的特异性,而且有PCR的高灵敏性,大辅度的提高抗Sm抗体检出率。
Description
本发明属于抗体的检测方法。
系统性红斑狼疮(SLE)是常见的自身免疫病。具有累及多脏器，威胁生命，发病率高等特点，但早期治疗却有较高的治愈率或得到有效的控制。
目前诊断SLE的指标有抗dsDNA抗体和抗Sm抗体，抗dsDNA抗体，不仅与SLE的活动有关，而且其他疾病也可以检出，抗Sm抗体可能是一种回忆性抗体，在SLE非活动期也可以检出，是SLE的一种标志性抗体，但检出率低。
现有的抗体Sm抗体检测方法有Western-blot法，CIE法和ELISA法，前两种方法敏感性低，且操作复杂费时，临床应用受到限制，ELISA法特异性强，但敏感性不高。
PCR技术是一种基因检测技术，其原理是模拟DNA体内复制一种体外核酸扩增过程，这种检测技术具有快速、灵敏、特异的特点。1992年PCR技术开始在免疫分析中应用，免疫PCR将抗原抗体反应的特异性与PCR扩增结合在一起成为极为敏感的免疫测定技术。
本发明的目的是建立一种用免疫PCR技术检测红斑狼疮抗Sm抗体的方法，以克服现有的抗Sm抗体检测方法的不足之处。
本发明的技术方案是利用酶标软板，在每个孔中加入1∶1000～1∶2000(1000U/ml)稀释的SmAg100μl在37℃温度下1～2h，然后用洗涤液洗涤3次，每孔加50μl～200μl封闭液，在25～30℃温度下封闭30min～1h取出后再用洗涤液洗涤3次，每孔加入100μl血清，37℃温育40min，取出后再洗涤3次，之后加入1∶1500～1∶2500稀释的SaHIgG-DNA探针100～200μl，37℃温育45min，取出，再洗涤3～5次，最后加入PCR反应混合物，覆盖70μl石蜡油，在PCR扩增仪上进行扩增，扩增条件为，预变性94℃2min再行94℃40sec，55℃40sec，72℃60sec共35个循环，继续72℃延伸5min，扩增后，取PCR扩增产物20μl加入到2％琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色，在紫外反射透射仪上观察结果，照相，同时设PCR阳性对照，同上法进行PCR扩增。
使用本发明的积极效果是：敏感性实验结果表明，免疫PCR方法检测血清抗Sm抗体的敏感性是ELISA方法的107倍。用免疫PCR方法对抗Sm抗体的检出率明显高于ELISA方法(P＜0.05)。用免疫PCR方法检测血清标本抗Sm抗体结果表明，SLE患者血清Sm抗体阳性率为54.9％，而其它自身免疫病患者血清和正常对照血清未见此抗体。因此，免疫PCR方法检测血清抗Sm抗体的特异性强。相关性试验结果表明，免疫PCR方法检测血清抗Sm抗体与ELISA方法呈高度正相关(P＞0.001)。重复性试验结果得到批内和批间CV值分别为2.3～4.8％和3.7～6.95％，表明方法稳定、可靠、重复性好。
本发明的实施例：利用40孔酶标软板，在每个孔中加入1∶1500(1000U/ml)稀释的SmAg100μl在37℃温度下1.5h然后用洗涤液洗涤3次，每孔加100μl封闭液，在25℃温度下封闭45min，取出后再用洗涤液洗涤3次，每孔加入100μl待检血清37℃温育40min，取出后再洗涤3次，之后加入1∶2000稀释的SaHIGg DNA探针150μl，37℃温育45min，取出，再洗涤5次，最后加入PCR反应混合物，覆盖70μl石蜡油，在PCR扩增仪上进行扩增，扩增条件为预变性94℃2min再行94℃40sec，55℃40sec，72℃60sec共35个循环，继续72℃延伸5min，扩增后取PCR扩增产物20μl加入到2％琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色，在紫外反射透射仪上观察结果，照相，同时设PCR阳性对照，同上法进行PCR扩增。
本发明所使用的试剂与设备来源是，纯化SmAg(1000U/ml)、抗Sm抗体阳性和阴性血清、SaHIgG-DNA探针、Taq DNA、引物(p21/p23)、琼脂糖、溴化乙锭(EB)均为市场购买。
本发明试剂需经以下配制。
包被缓冲液(PH9.6 0.1mo/L碳酸盐缓冲液)：
Na2CO3 4.244g
NaHCO3 5.04g
蒸馏水加至 1000ml
PH7.4 0.02mol/L PBS：
NaCL 8g
KH2PO4 0.2g
Na2HPO4·12H2O2.9g
KCL 0.2g
蒸馏水加至 1000ml封闭液、探针稀释液、血清稀释液：小牛血清0.5g～1mlPH7.40.01～0,02mol/LpBs100ml洗涤液：Tween20 0.5mlPH7.4 0.02mol/L pBs 100ml5×电泳缓冲液：Tris 54gEDTA-Na2 0.38g硼酸 27.5g蒸馏水加至1000ml，用1mol/L NaOH调PH至8.0，2％琼脂糖凝胶：琼脂糖 0.6g1×电泳缓冲液30mlPCR反应混合物：10×Buffer 2.5μl2.5mmol/L dNTP 2.0μlP21 2.0μlP23 2.0μl1u/μlTaq DNA聚合酶1.0μl双蒸水 15.5μl
Claims (1)
- 一种使用免疫PCR技术的红斑狼疮抗Sm抗体的检测方法，其特征是：利用酶标软板，在每个孔中加入1∶1000～1∶2000(1000U/ml)稀释的SmAg100μl在37℃温度下1～2h；然后用洗涤液洗涤3次，每孔加50μl～200μl封闭液，在25～30℃温度下封闭30min～1h；取出后再用洗涤液洗涤3次，每孔加入100μl血清，37℃温育40min；取出后再洗涤3次，之后加入1∶1500～1∶2500稀释的SaHIgG-DNA探针100～200μl，37℃温育45min；取出，再洗涤3～5次，最后加入PCR反应混合物，覆盖70μl石蜡油，在PCR扩增仪上进行扩增，扩增条件为，预变性94℃2min再行94℃40sec，55℃40sec，72℃60sec共35个循环，继续72℃延伸5min；扩增后，取PCR扩增产物20μl加入到2％琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色，在紫外反射透射仪上观察结果，照相；同时设PCR阳性对照，同上法进行PCR扩增。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102277433A (zh) * | 2011-08-04 | 2011-12-14 | 盛司潼 | 一种检测微量蛋白样品的方法 |
| CN102360016A (zh) * | 2011-07-21 | 2012-02-22 | 南京工业大学 | 流式微球法对SLE的Sm-RNP抗体检测试剂盒的制备 |
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2001
- 2001-03-07 CN CN 01106288 patent/CN1373364A/zh active Pending
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