JPH04200387A - 扁平上皮癌関連抗原蛋白質及び該蛋白質をコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野〕 本発明は、扁平上皮癌関連抗原（以下、ＳＣＣ抗原）蛋
白質をコードするＤＮＡ断片に関する。

詳しくは、子宮頚部の扁平上皮癌組織から抽出、精製さ
れたＳＣＣ抗原の蛋白質に対する遺伝子（相補的Ｄ　Ｎ
　Ａ　；ＣＤ　Ｎ　Ａ　）を含有するＤＮＡ断片に関す
る。

［従来の技術］ ＳＣＣ抗原は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法による分子量が約４５，０００の蛋白質であり、子
宮頚部癌、肺癌、食道癌などの扁平上皮癌組織あるいは
それらの転移巣より抽出、精製される扁平上皮癌関連抗
原である。ＳＣＣ抗原の測定は、扁平上皮癌の診断、予
後推定、病状管理を目的として免疫学的測定法によりな
されている。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、ＳＣＣ抗原を診断薬として使用する場合
には、多量のＳＣＣ抗原蛋白質を必要とするが、多量の
抗原蛋白質をヒトの癌細胞から精製することは必ずしも
好適な方法とは言えない。

また、核酸のハイブリダイゼーションによる５ｃｃａｉ
遺伝子の検出、さらには、組換えＤＮＡ技術によるＳＣ
Ｃ抗原の生産には、ＳＣＣ抗原蛋白質をコードする遺伝
子断片の収得が必須である。

［本発明の目的コ 本発明は、ＳＣＣ抗原蛋白質をコードする遺伝子を提供
するものである。

本発明により核酸ハイブリダイゼーションによるＳＣＣ
抗原蛋白質遺伝子の検出が可能になると共に、本発明を
利用して得られたＳＣＣ抗原は、扁平上皮癌の診断試薬
として、あるいは免疫原として利用することができる。

ＥａＭを解決するための手段］ 本発明者らは、ＳＣＣ抗原蛋白質をコードする遺伝子を
初めて分離・収得するに至り、本発明を完成した。本発
明のＳＣ，Ｃ抗原蛋白質をコードする遺伝子は、例えば
、次のような方法によって得ることができる。

まず、ＳＣＣ産生培養細胞である子宮頚部癌セルライン
Ｓ　Ｋ　Ｇ　−ＦＩＴ　ａ　［Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、
　４３．　ｐ、ｌ７４ｆｌ−１７６０、１９ａ３］をグ
アニジンチオシアネートにより変性、ホモジナイズ後、
Ｃｈｉｒｇｗｊｎらの方法［Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ　１８．　ｐ、５２９４−５２９９．１９７９］に従
って、塩化セシウム密度勾配遠心法によって全ＲＮＡを
沈殿として分離する。分離後、フェノール抽出、エタノ
ール沈殿により全ＲＮＡを精製する。

本発明においては、ｍＲＮＡ採取源としては、上記細胞
に限定されず広＜ＳＣＣ産生細胞あるいは組織として知
られているものも、場合により利用できる。このような
細胞あるいは組織の例としては、扁平上皮癌あるいはそ
れから誘導された培養細胞株などがあげられる。また、
−巨木発明のＤＮＡ配列が得られてからは、その原料細
胞は特に限定されない。

本発明においては、さらにまたこのようなりＮＡフラグ
メント及びｃＤＮＡライブラリーは、その遺伝子採取源
細胞から、市販のｍ　ＲＮ　Ａ　ＩＩ−ＩＩＩｔｎＩ製
キット、ＤＮＡ合成キット、ＤＮＡクローニングシステ
ムキットなどを適宜用いて行うことができる。このよう
な市販のものの例としては、例えばＲＮ　Ａ　　ｅｘｔ
ｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（アマジャム社製）、０１ｉ
ｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０　（日本ロシュ社製）、ｃＤＮＡ
　　合成システムプラス（アマジャム社製）、ｃＤＮＡ
クローニングシステムλｇｔｌＯ（アマジャム社製）、
Ｇ　ｅ　ｎ　ｅ　Ａ　ｍ　ｐ　Ｔ″Ｄ　Ｎ　Ａ　Ａｍｐ
ｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔキット（宝酒造
社製）などがあげられるが、これらのものに限定されな
い。

細胞内のｍＲＮＡの大部分は、その３′−末端にポリ（
Ａ）をもつので、オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムク
ロマトグラフィーによりｒＲＮＡなどのポリ（Ａ）をも
たないＲＮＡを除き、ポリ（Ａ）含有ＲＮＡ　（ポリ（
Ａ）′″ＲＮＡ）を分離しｍＲＮＡの原料とする。この
ｍＲＮＡ原料がら相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）をつくり
、このｃＤＮＡよりＰ　ＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　
Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を利用してＤＮＡフラ
グメントを得ると共に、クローニングによりｃＤＮＡラ
イブラリーを作製する。

作製されたｃＤＮＡライブラリーから目的とする、つま
りＳＣＣ抗原蛋白質をコードするＤＮＡ断片を含むクロ
ーンをスクリーニングする。ｃＤＮＡのスクリーニング
は、部分的に決定されているＳＣＣのアミノ酸配列から
適肖な部分を二箇所選び、それぞれに対する推定される
全てのコドン配列を化学合成してプライマーとし、得ら
れたプライマー及び前述のｃＤＮＡとを用いて、ＰＣＲ
を行い、ＤＮＡフラグメントを得る。得られたＤＮＡフ
ラグメントをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリ
ン酸化後、Ｍ１３ファージベクターに犬ｗ３ＮＪＭｌｏ
ｑ株を宿主として紐換え、Ｓａｎｇｅｒらの方法［Ｐｒ
ｏ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　７４．　ｐ
、５４６３−５４６７、１９７７］に従って塩基配列を
決定し、部分的に予め決められたＳＣＣのアミノ酸配列
と一致するアミノ酸配列をコードするＤＮＡフラグメン
トを選び出す。このＤＮＡフラグメントをグローブとし
て前記ｃＤＮＡライブラリーをさらにスクリーニングし
、クローンを得る。

これらを目的とするＤＮＡ配列の同定及びそのクローニ
ング、さらにはその配列の決定は、Ｍａｎｊａｔｉｓ等
のＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　　Ａ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ
ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８
２年（二ε己載の各々の方法等及びそこに引用された各
種引用文献に記載された方法を参考にして行うこともで
きる。

本発明においては、得られたクローンの塩基配列を決定
したところ翻訳開始部分が含まれていなかったため、こ
のクローンの５°例の塩基配列及び＾ｇｔｌＯのＥｃｏ
ＲＩ切断部位の上流、下流多塩基配列に相当するユニー
クプライマーを作製し、ｃＤＮＡライブラリーから調製
したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＤＮＡフラグメ
ント　クローンを得た。

得られたクローンの塩基配列は、Ｍ１３ｍｐ１８及び１
ｐ１９にサブクローニングし、Ｓａｎｇｅｒらの方法に
より決定される。

本発明においては、このようにして−旦得られたＤ　Ｎ
　Ａ配列は、その配列をそのままあるいはそれを適当に
修飾して、各々の用途に使用することができる。このよ
うな修飾方法としては、その塩基配列の切断、置換、欠
失、付加、連結などがあげられる。このような修飾方法
の一つとしては、好ましくは部位指定変異法、例えばＬ
ａｔｈｅｒ、Ｒ，ＦおよびＬｅｃｏｑ、Ｌ、Ｐ、、　　
Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　Ａｃａｄ
ｅａ＋ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ｐ、３１−５０　（１９８
３年）に述べられた方法を応用して行うこともできる。

塩基配列の切断にあたっては、市販されて入手可能な種
々の制限酵素を用いて行うことができる。

本発明によって得られたＤＮＡ配列はその全部又は一部
を利用して、ＤＮＡグローブとして使用することも可能
である。ＤＮＡプローブとして用いる場合、適当な標識
剤、例えば放射性同位元素、酵素、蛍光剤、発色剤等で
標識することもでき、さらにそれら標識剤は適当なスペ
ーサーを介して付けられていてもよい。このようなりＮ
Ａプローブとして用いられるＤＮＡ配列の代表的なもの
としては、実施例においてＤＮＡライブラリー等のスク
リーニング等で使用された配列をあげることもできる。

本発明のＤＮＡ配列は、それを適当な発現ベクターに組
み込み、適当な宿主細胞に導入してそれを発現させるこ
とができる。このような発現ベクターとしては、大腸菌
、酵母、動物細胞用のそれぞれのベクターがあげられる
。

本発明のＤＮＡは、それを大腸菌で発現させると、モノ
クローナル抗体よりなるＳＣＣ測定用キット及びポリク
ローナル抗体を用いたウェスタンプロットで陽性反応及
び陽性バンドを示す蛋白質が得られる。本発明の扁平上
皮癌関連抗原蛋白質をコードする塩基配列を含んで成る
ＤＮＡ断片を保持する大腸菌は、工業技術院微生物工業
技術研究所に、微工研菌寄第１１８７１号（ＦＥＲＭＰ
−１１８７１）として寄託されている。こうして得られ
た蛋白質生成物は、それを測定用抗原試薬、免疫原など
に用いることが可能である。

本発明のＤＮＡ配列によってコードされるアミノ＃ｌｉ
鎖中には、４箇所の糖鎖結合可能部位、すなわちアスパ
ラギン結合型糖鎖の結合し得る配列（Ａｓｎ−Ｘ−５ｅ
ｒ／　Ｔｈｒ　）が存在することから、そのＤＮＡ配列
を種々の宿主で発現させることにより、多くの分子種蛋
白質を得られる可能性がある。またそのＤＮＡ配列でコ
ードされるアミノ酸配列を、コンピューターのデータベ
ース（日立型ｉ　ＤＮＡ５ＩＳ）により相同性の検索を
したところ、セリン・グロテアーゼ・インヒビター・フ
ァミリー（５ｅｒｉｎｅ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｉｎｈｉ
ｂｉｔｏｒｓ　Ｆａｍｉｌｙ　：　ＳｅｒｐｉｎｓＦａ
ｍｉｌｙ）と全体にわたって相同性があることが判明し
ており、治療薬としての利用可能性を有していることが
確認された。

以上、本発明で得られたＤＮＡ配列あるいはそれに関す
る情報を利用してなさえた用途も、上記したような思想
の範囲で全て本発明に含まれるものであることは明らか
であろう。

［実施例］ 以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが
、本発明は、その要旨を越えない限り以下の実施例によ
って限定されるものではない。

実施例１．３ＣＣ産生培養細胞５ＫＧ−ＩｌｌａのＣＤ
ＮＡ及びｃＤＮＡライブラリーの作製（１）全ＲＮＡの
抽出 ＳＣＣ産生培養細胞ＳＫＧ−ｍａを材料とし、ＲＮ　Ａ
　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　　（アマジャム社製
）を使用して、ＲＮＡを抽出した。Ｓｃｃ産生培養細胞
Ｓ　Ｋ　Ｇ　−１０ａ　１．７ｘ　１０’個を、キット
の溶液１（グアニジンチオシアネート、ＥＤＴＡ含有ト
リス塩酸１１１１ｉ液　ｐＨ７，４）及び２−メルカプ
トエタノールを加えた溶液１を用いて、ホモジネートし
た。

４０秒間超音波処理した後、０．３倍量の一２０″Ｃエ
タノールを加工１０，０００ｘ　ｇ　、　Ｏ’Ｃ、５分
間遠心シた。

遠心後、蛋白質の膜及び上清を除去した。ベレット状の
ＲＮＡ沈殿を２−メルカプトエタノールを含有している
溶液１のｌＯ■ｌに再懸濁させ、再度４０秒間超音波処
理した。処理後、約３０−１の溶液２（リチウムクロラ
イド水溶液）を加え、４°Ｃで一晩放置した後、４℃で
１０，０００ｘ　ｇで９０分間遠心後、表面の蛋白質の
膜及び上清を除去し、ベレット状のＲＮＡ沈殿に３５１
１の溶液３（リチウムクロライド・ウレア水溶液）を加
え、３０秒間ポルテックス処理した後、４０“Ｃの温浴
に約４５分間浸し、さらに懸濁液を再度４　”Ｃ、１０
，０ＯＯＸ　ｇ　”ｔ”　６０分間遠心後、表面の蛋白
質の膜及び上清を除去し、ベレット状のＲＮ　Ａ沈殿に
５ａ＋１の溶液４（ＲＮ、１Ｉｉｉ）を加え、約２時間
、−２０°Ｃに放置した。

３０秒間ポルテックス処理した後、４０°Ｃの温浴に約
４５分間浸し、沈殿物を再懸濁させた。０．１Ｍ　　）
リス塩ａＭｉＳ液（ｐ　Ｈ７，４）飽和フェノール　５
　ｍｌを加え、１０秒間ポルテックス処理した。さらに
２０分間ゆるやかに混和した後、室温で１５分間、８，
５ＯＯＸｇで遠心した。上層の液を採取し、これに再度
０．１Ｍ　　トリス塩酸ｌ！衝液（ｐＨ７，４）飽和フ
ェノール　５ｇ＋１を加え、１０秒間ポルテックス処理
し、さらに２０分間ゆるやかに混和した後、室温で１５
分間Ｂ、５００Ｘ　ｇで遠心した。上層の液を採取し、
これに５、ｍｌのクロロホルム液を加え、５秒間ポルテ
ックス処理した。室温で１０分間８，５００ｘ　ｇで遠
心し、上層の液を採取した。体積比　０．１の２Ｍ酢酸
ナトリウム（ｐＨ５，０）と２倍量のエタノールを加え
、−２０’Ｃで一晩沈殿させた。

４　’Ｃで３０分間８，５００ｘ　ｇでＲＮＡ沈殿を遠
心し、上滑を捨て、−２０℃の７０％（Ｖ／Ｖ）エタノ
ール溶液１ｍｌを加え、８，５００ｘ　ｇ　Ｔ　４°ｃ
、１５分間遠心した。上清を除去し、ＲＮＡベレットを
風乾し、１−１の［菌水に溶解した。

これにより、全ＲＮＡ３６６μｇを得た。

（２）ポリ（Ａ）”ＲＮＡの精製 次に、得られた全ＲＮＡがらボッ（Ａ）”ＲＮＡを０１
ｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０　（日本ロシュ社製）を使用し
て２回精製した。すなわち、２９６μｇの全ＲＮＡをエ
タノール沈殿した葎、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．１％Ｓ
ＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリウム）含有１０ｍ　Ｍトリ
ス塩Ｍ緩衝液（ｐＨ７，５）　８００μｌに溶かし、６
５°Ｃ１５分間加熱処理後、水中で急冷した。５Ｍ塩化
ナトリウム１００μｌヲ加え、２００．ｕ　ｌ　（４ｍ
’ｇ）　（７）　０１ｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０と混合し
た。混合液を３７℃で５分間インキュベートしたイ麦、
室温で１５，０ｆ）Ｏｒｐ鐙、１０分間遠心し、上滑を
除去した。得られたベレットに１　ｍＭ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ
　Ａ　、　０．１％　ＳＤＳ含有含有１０卜ウム液１０
０μｌを加え、ピペッティングでほぐし、均一な懸濁液
とした．３７℃で５分間インキュベート後、室温で１５
　、　ＯＯＯｒｐｍ　、　１０分間達遠心ー１ＪｊＲヲ
Ｍ：去した。得られたベレットに　１ｍＭ　　ＥＤＴＡ
。

０１％ＳＤＳ含有　１０ｍＭトリス塩ａ！　緩＊液（ｐ
Ｈ７、５）　　８００μｍを加え、６５°Ｃで５分間加
熱処理を行い、１５，０００ｒｐｍで）０分間遠心し、
上清を得た。この上清を６５°Ｃで５分間加熱後、水中
で急冷した。

５Ｍ塩化ナトリウＡ　％　１００μｌ加え、２ｏａμｍ
　（　４　ａｇ）の０１ｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０と混合
した。混合液を３７℃で５分間インキュベートした後、
室温で　１５　、　００Ｏｒｐｍ　。

１０分間遠心し、上清を除去した。得られたベレット＋
．＝１ｍＭ　　ＥＤＴＡ，０．１％ＳＤＳ含有１０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（　ｐ　Ｈ７．５）　１　＋ｎｌと、
５Ｍ塩化ナトリウム液１００μｍを加え、ピペッティン
グて゛はぐし、均一な懸濁液とした。３７℃で５分間イ
ンキュベート後、室温で１５，０００ｒｐｍ，　１０分
間遠心し、上清を除去した。得られたベレットに１ｍＭ
ＥＤＴＡ，０．１％ＳＤＳ含有１０ｍＭトリス塩Ｍ緩衝
液（１）　Ｈ　７．５）　８００μｌ　Ｇ加え、６５°
（４’５分間加熱処理を行い、１５．００Ｏｒｐｍで１
ｏ分間遠心し、上清を得た。

等容量のフェノール・クロロポルム（　１　：　１．　
ｖ／ｖ）混合液で抽出後、エタノール沈殿した。得られ
たペレットを１００μｍの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５
，６）に溶解し、２００μｍのエタノールを加え、−８
０°Ｃ（：３０分間放置した。４℃で　１５．００Ｏｒ
ｐｍ、　１０分間遠心分離を行い、ポリ（Ａ）”ＲＮ、
へのペレットを得た。ペレットを７０％エタノールで洗
浄後、ペレットを乾燥させ、１０μｍの滅菌水に溶解し
た。

これにより、３．６μｇのポリ（Ａ）”ＲＮＡを得た。

（３）ｃＤＮＡの合成 ポリ（Ａ）”　ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）プライマーを
用いて、ｃＤＮＡ合成システム・プラス（アマジャム社
製）を使用し、ｃＤＮＡを合成した。

水浴中、５ｘフア一ストストランド合成反応用緩衝液４
μｌ、ピロリン酸ナトリウム溶液　１μｌ。

ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター　１μｍ。

デオキシヌクレオシド三リン酸混液　２μｌ、オリゴ（
ｄＴ）ブライマー１　、ｕｌ、　ｍＲＮＡ　１　）ｔｇ
及び滅菌水を加え、全量が　１９μｌとなるようにし、
静かに混和、エッベンドルフ遠心器で数秒間遠心した。

逆転写酵素（２０単位／μｌ）　ｌμｌを添加し、静か
に混和後、４２°Ｃで４０分間インキュベートした。

反応チューブを水浴中に戻し、セカンドストランド合成
反応用緩衝液３７．５μｌ、大腸菌リボヌクレアーゼＨ
Ｏ３８単位、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１２３単位及び
滅菌水を加え　９９．５μｍとし、静かに混和後、１２
℃で６０分間、次いで２２℃で６０分間反応させた。さ
らに７０°Ｃで１０分間インキュベートした懐、エッペ
ンドルフ遠心器で数秒間遠心した。水浴中に戻し、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼ　２．０単位を添加し、静かに混和
後、３７℃で１０分間反応させた。

４μｌの０．２５Ｍ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（Ｐ　Ｈ８，
０）を加えて反応を停止させ、１０４μｌのフェノール
／クロロホルム（１：１．ｖ／ｖ）を加え、ポルテック
スミキサーを用いて激しく混和、エマルジョンとした。

エッベンドルフ遠心器で１分間遠心し、２層に分離した
。中間層を取らないように注意しながら水層（上層）を
取り、もう−度１０４μｍのフェノール／クロロホルム
液を加え、ポルテックスミキサーを用いて激しく混和、
エマルジョンとした後、エッペンドルフ遠心器で１分間
遠心し、２層に分離した。水層（上層）を取り一１０４
ｕｌのクロロホルムを加え、よく混和した。エツベンド
ルフ遠心器で数秒間遠心し、水層（上層）を採取した。

１０４μｍの４Ｍ酢酸アンモニウム溶液を加え、さらに
−２０℃に冷やしたエタノール４１６μｍを加え、ドラ
イアイス上に１５分間放置した。

静かに混ぜながら室温に戻し、エツペンドルフ遠心器で
１０分間遠心した。ｃＤＮＡベレットを舞い上げないよ
うに注意して上清を除き、５０μｍの２Ｍ酢酸アンモニ
ウム、次いで１００μｌエタノール（−２０°Ｃ）を加
え、室温で静かに混和後、遠心して上清をアスビレーシ
ョンで除去することにより洗浄した。ペレットを乱さな
いように２００μｌのエタノール（−２０°Ｃ）を加え
、室温で静かに混和後、遠心して上清をアスビレーショ
ンで除去することにより洗浄した。２００μｍのエタノ
ール（−２０°Ｃ）を静かに加え、エツペンドルフ遠心
器で２分間遠心した。注意深く上清を取り除き、ｃＤＮ
Ａベレットを乾燥後、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ含有　１０ｍ
Ｍトリス塩Ｍ緩衝液（ｐＨ７，５）　１０μｌに溶解さ
せた。

これにより、１μｇのポリ（Ａ）　ＲＮＡから１．２μ
ｇのｃＤＮＡがつくられた。

（４）ｃＤＮＡライブラリーの合成 ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーは、ｃＤＮＡクローニング
システムλｇ’ｔ＋［］（アマジャム社ｔりを用いて合
成した。

すなわち、７２０ｎｇのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　＋＝　Ｌ　／
　Ｋ　［Ｅ衝液２μｌ、…ＲＩアダプター２．５μｌ及
び滅菌水を加え全量を１８μｍとし、静かに混和し、微
量遠心器で数秒間遠心した。２μｍのＴ４ＤＮＡリガー
ゼ（５単位）を加え、静かに混和し、１５°Ｃで２０時
間反応させた。２μｌの０．２５Ｍ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ
を加え、反応を停止させ、微量遠心器で数秒間遠心した
。

Ｅ　ｃｏＲＩアダプターが結合したｃＤＮＡをキット中
に添付されているカラムにかけ、サイズフラクショネー
ションし、選択プールとすると共に、未反応のアダプタ
ーを除去した。得られた選択プール９００μｍとＬ／に
緩衝液１００μｌ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ　
１０μ１（８０単位）を加え、３７°Ｃで３０分間イン
キュベートした。リン酸化反応後、等量のフェノール／
クロロホルム（１：　１．　Ｖ／Ｖ）による抽出及びク
ロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）による
抽出を各２回行った。各抽出は軽くポルテックスし、微
量遠心器で１分間遠心、下層の有機溶媒を除き、上層の
水層を残した。

水層に２．２容のブタノールを加え、激しく振盪し、二
層に分離させて、上層のブタノールを除いた。

さらにもう−回プタノール抽出を行い、ｃＤＮＡ溶液を
濃縮した。上層のブタノール層を除き、水層に１／１０
容の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍量のエタノールを加え、
よく混和後、−２０°Ｃに一晩放１した。微量遠心器で
３０分間遠心後、上清を除いた。

０．５　ｍｌの氷冷した７０％エタノールを加え、軽く
ポルテックスした後、微量遠心器で５分間遠心し、上清
を除いた。ｃＤＮＡペレットを乾燥させた後、約２０ｎ
ｇ／　ｕ　ｌの濃度になるように１ｍＭ　　ＥＤＴＡ含
有１含有１卜 した。

リンＭ化されたｃ　Ｄ　ＮＡ　　２５ｍｇ，　λｇｔｌ
ｏアーム２μｍ（１μｇ）、Ｌ／Ｋｌｌ衝液１μｌ及び
滅菌水を全量が９μｍとなるように水浴上で加え、静か
に混和し、微量遠心器で数秒間遠心した。Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ１μｍ　（　２．５単位）を静かに混和後、１５
℃水浴で２０時間インキュベートした。微量遠心器で数
秒間遠心してチューブの底に反応液を集め、ライゲーシ
ョン反応液の全量１０μｍをｉｎ　ＶｉｔｒＯパッケー
ジングし、５０万個のｃＤＮＡライブラリーを作製した
。

実施例２．ＳＣＣ　　ｃＤＮＡのスクリーニング部分的
に決定されているＳＣＣのアミノ酸配列から２箇所選び
（表１　下線部）、それぞれにおいて全ての可能なコド
ン配列に対する自己相補的な１７塩基から成るミックス
ブライマー（ブライマー１．２及びブライマー３，４）
をＤＮＡ合成装置（　ＡＢＩ社．３８１Ａ）を使用して
作製した。ここでブライマー２，３はアンチセンス鎖、
ブライマー１。

４はセンス鎖の配列に一致するミックスブライマーであ
る（表２）。ただしブライマー１．２においては、縮重
（　ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）を少なくするためにＡｓｎ
のコドン（ＡＡＣ／Ｕ）をＡＡＣと規定した。ブライマ
ー１　（　１００　ｐｍｏｌ）とブライマー３（　１０
０　ｐｍｏｌ）又はブライマー２　（　１００　ｐｍｏ
ｌ）とブライマー４（１００Ｐ−０１）及びＤＮＡポリ
メラーゼ２、５単位（　ＡｍｐｌｉＴａｑ　；宝酒造社
製）を用い、ｃＤＮ　Ａ　（１００ｎｇ）を鋳型として
、５０ｍ　Ｍ塩化カリウム、１０ｍＭ）リス塩Ｍ緩衝液
（　ｐＨ８．３）　、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０
．０１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン、２００μＭ　ｄＡＴＰ，
ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰの終濃度でＰＣＲ　　３
０サイクル（変性９４°Ｃ，１分、アニーリング３７°
Ｃ，１．５分、伸長反応７２°Ｃ，３分）を行った．さ
らにＰＣＲで産生されたＤＮＡの１０分の１量を同じブ
ライマーを用いてＰＣＲ２５サイクル（変性９４℃，１
分、アニーリング５５℃、１。

５分、伸長反応７２℃，３分）を行い、そのＰＣＲ産物
全量を５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行った
結果、ブライマー１と３の組合せで１９０ｂｐ　（　ｂ
ａｓｅ　ｐａｉｒ）から５８０ｂｐの９本のＤ　Ｎ　Ａ
フラグメントを得た。

これらのＤＮＡフラグメントを含む各ゲルを回収し、２
．５１１１１の注射器を通してゲルを潰し、１ｍＭＥＤ
ＴＡ含有１０ｍＭトリス塩Ｍ　ＩＩ衝１（ｉ）Ｈ７．５
）１ｍｌを加え、３７℃で一晩インキユベートした後、
シリコナイズ綿を通して濾過したものをエタノール沈殿
した。沈殿物を１０μｌの滅菌水に溶解後、このうちの
７μｍを２μｌの５×リガーゼＩ！衝液（３３０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（　ｐ　Ｈ　７．６）　、　３３ｍ　Ｍ
塩化マグネシウム、　５０ｍＭ　　ＤＴＴ，　０．５ｍ
Ｍ　ＡＴＰＩ及び　１μｍ（１単位）のＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（宝酒造社製）と共に３７°Ｃで１時間
インキュベートしてリン酸化した。これをＨｉｎｃｌｌ
で切断したＭ　１３ｍｐ１８（１．４μｇ）とＤ　Ｎ　
Ａ　　ＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ（宝酒造社製）を使用し
て連結し、Ｓａｎｇｅｒらの方法で塩基配列を決定した
結果、１９４ｂｐかうなるＤＮＡフラグメントでコード
されるアミノ酸配列が、部分的に決められたＳＣＣのア
ミノ酸配列と一致した。この１９４ｂｐのＤＮＡフラグ
メントをＭｕｌｔｉｐｒｉｍｅ　Ｄ　Ｎ　Ａ　　ｌａｂ
ｅｌｌｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍｓ　（アマシャム社製）を
使用して、Ｆｅｉｎｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｖｏｇｅｌｓｔ
ｅｉｎの方法により？２Ｐ標識（比活性；　８．８ｘ　
１１０８ｃｐ／μｇ）　Ｌ、プローブとして用いて２Ｘ
　１０５個のｃＤＮＡライブラリーを以下の方法でスク
リーニングした。

プレート上のプラークをナイロンフィルター（Ｈｙｂｏ
ｎｄＮ　；アマジャム社製）に移した後、３×５ＣＣ（
０，１５Ｍ塩化ナトリウム、　０．０１５Ｍクエン酸ナ
トリウム）　、０．１％ＳＤＳで６５℃、３時間ブレウ
ォッシュし、５０％ホルマミド、５　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒ
ｄｔ液（０，０２％Ｆｉｃｏｌｌ、　０．０２％ウシ血
清アルブミン。

０．０２％ポリビニルピロリドン）　、０．１％ＳＤＳ
、５ＸＳＳＥＰ［０，１８Ｍ　塩化ナトリウム、　０．
０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８，０）、１ｍＭ　　
ＥＤＴＡＩ及び熱変性サケ精子ＤＮＡ溶液１００μｇ／
ａ＋１中で３７°Ｃ，７時間プレハイブリダイゼーショ
ンした。

ハイブリダイゼーションは、”ｐｍ識したプローブの存
在下、プレハイブリダイゼーションと同じ条件で１５時
間行った。続いてフィルターを２ＸＳＳＣ，０，１％Ｓ
　Ｄ　Ｓ中で室温にて１時間、０．１ＸＳＳＣ，０，１
％ＳＤＳ中で５０°Ｃにて３０分間　ウォッシュし、−
８０℃で一晩オートラジオグラフィーを行った。この結
果１個の陽性クローン（λＳ　ＣＣｌ。

１．６　ｋｂ）を得た。

この陽性クローンよりファージＤＮＡを回収し、制限酵
素地図を作製した。制限酵素（論Ｉ　、　Ｅｃ。

ＲＩ、　ＨｉｎｄＩＩＩ　、　ＰｓｔＩ　、（１）■）
を使用して、陽性クローンＤＮＡを切断し、Ｍ１３園ρ
１８．１９ベクターにサブクローニングし、塩基配列を
決定したところ翻訳開始部分が含まれていなかったため
、このクローンの５°側の塩基配列（５′末端から　３
７９塩基から　３９９塩基までのセンス鎖）及びλｇｔ
ｌｏベクターのＥｃｏＲＩ切断部分の上流（切断点より
上流５２塩基から３３塩基まで）、下流（切断点より下
流３５塩基から１２塩基まで）各塩基配列に一致するユ
ニークブライマー（プライマー５．７．８）を作製しく
表２．３）、プライマー７又は８　（１００ｐｍｏｌ）
、プライマー５　（１００ｐｍｏｌ）　、ＤＮＡポリメ
ラーゼ２．５単位（ＡｍｐｌｉＴａｑ　；宝酒造社製）
を用い、ｃＤＮＡライブラリーから調製したＤ　Ｎ　Ａ
　（１０１００ｎを鋳型として、５０ｍ　Ｍ塩化カリウ
ム、］ＯｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，３）　、１．
５ｍ　Ｍ塩化マグネシウム、０．０１％（Ｗ／Ｖ）ゼラ
チン、２００ｕ　Ｍｄ　Ａ　Ｔ　Ｐ。

ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの終濃度でＰＣＲを３０
サイクル（変性９４°Ｃ，１分、アニーリング５０℃、
２分、伸長反応７２℃１３分）行い、３％ＮｕＳｉｅｖ
ｅＧＴＧアガロース（ＦＭＣＢｉｏ　Ｐｒｏｄｕｃｔ社
製）でＰＣＲ産物を電気泳動したところプライマー５と
プライマー７より約５１０ｂｐからなるフラグメントを
得た。ＰＣＨの特異性を高めるために、プライマー５が
ハイブリダイゼーションする位置の上流（λ５ＣＣＩの
５′末端より　２８７塩基から　３０７塩基までのセン
ス鎖）に一致するユニークプライマー（プライマー６、
表２）を作製し、プライマー６とプライマー７を用いＮ
ｕＳｉｅｖｅアガロースよりＧＥＮＥＣＬＥＡＮ　ＩＩ
　　ｋｉｔ　（ＢＩＯ１０１社製）で回収した５１０ｂ
ｐのＤＮＡフラグメント（１０％ｇ）を鋳型として、上
記と同じ条件でＰＣＲを行い、約４２０ｂＰのフラグメ
ントを得た。

切断サイトをプライマーに付加してあった穐■及び畢■
で消化後、Ｍ　１３＋＊ｐ１８及びＭ　１３ｓｐ１９の
Ｘｂａｌ　、　５ａｃＴサイトに接続し増幅されたＣ・
ＤＮＡの塩基配列（ｐｃＳＣＣ２）を決定したところ、
λ５ＣＣＩとｐｃｓｃｃ２は３０７ｂｐにおいて重複し
ていた。ＳＣＣｃＤＮＡの６２番目から１７１１番目ま
で（表４における塩基配列の番号６２から１７１■まで
）の部分を大腸菌発現用ベクターＰＫＫ２３３−２に組
み込んだ発現プラスミドＰＫＫ　５ＣＣＩを保持した大
腸菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研
菌寄第１１８７１号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−冊８７１）とし
て寄託されている。

第１図にＳＣＣｃＤＮＡクローンの制限酵素地図及び塩
基配列決定の方向と長さを示した。この結果、表４に示
すＳＣＣｃＤＮＡの塩基配列（１６９３ｂｐ、ポリ（Ａ
）テイル配列を省く）及びそれから推定されるアミノ酸
配列（３９０アミノ酸）が決定された。このアミノ酸配
列は、部分的に決定されているフラグメントのアミノ酸
配列と一致した。しかしフラグメント１３のみ一致しな
かった（フラグメント１３と連続５アミノ酸分、配列が
−致するところが１１３−１１７アミノ酸に存在する）
、。

また、２５０番目のアミノ酸はアミノ酸解析で決定され
ていたものと異なっていた（　Ｇｉｎ→Ｇｌｕ）。

決定された塩基配列内に４箇所アスパラギン結合型ｍｓ
ｔの結合し得る配列（Ａｓｎ−Ｘ−３ｅｒ／　Ｔｈｒ）
が認められた。また、アミノ酸配列をコンピューターの
データベースによりその相同性を検索したところ、セリ
ン・プロテアーゼ・インヒビター・ファミリー（５ｅｒ
ｉｎｅ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　Ｆ
ａｍｉｌｙ；５ｅｒｐｉｎｓ　）と全体にわたって相同
性があることが判明し、ＳＣＣ抗原蛋白質がセリン・プ
ロテアーゼ・インヒビター活性を有する物質として治療
薬として使用できる可能性をも有していることが確認さ
れた。

実施例３．サザーンブロツテイング解析による大ゲノム
ＤＮＡにおけるＳＣＣ遺伝子の同定本発明で得られたＤ
ＮＡ配列の一部を用いてサザーンブロッテイング法によ
りＳＣＣ遺伝子の解析を行った。すなわち、高分子大ゲ
ノムＤＮＡを末梢血白血球より得、１０μｇのＤＮＡを
制限酵素で切断後フェノール処理、エタノール沈殿しＴ
ＥＩ！衝液（１ｍＭ　　ＥＤＴＡ含有　１０ｍ　Ｍ　ト
リス塩酸緩衝液　ｐＨ７，５）に溶かした後　０．８％
アガロースゲルで電気泳動した。ナイロンフィルター（
ＨｙｂｏｎｄＮ　；アマジャム社製）に　０．４Ｍ水酸
化ナトリウムでアルカリプロッティングした壕、フィル
ターは５０％ホルマミド、　５　ｘ　Ｄｅｎｈａｒｔ　
（０，１％Ｆｉｃｏｌｌ。

０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロ
リドン）　、　５　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅ　（０，９Ｍ塩
化ナトリウム。

０．０５Ｍリンリントリウム、５ｍＭ　　ＥＤＴＡ　　
ｐＨ８，０）　、　０．５％Ｓ　Ｄ　Ｓ　、　２０μｇ
／ａ＋１サケ精子ＤＮＡ中で３７℃で４時間プレハイブ
リダイゼーションした。λ５ＣＣＩをｐ　Ｕ　Ｃ１１８
の顕ＲＩサイトにサブクローニングし、（１）エ　フラ
グメント（１４３６ｂｐ）をＦｅｉｎｂｅｒｇ　ａｎｄ
　Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎの方法にてラベルして加え（比
活性；　６．６Ｘ　１０’ｃｐｍ／μｇ）　、３７°Ｃ
で２４時間ハイブリダイゼーションした。２　Ｘ　Ｓ　
Ｓ　Ｐ　Ｅ。

０．１％５ＤＳ（３７℃）で２０分間　２回洗い、−８
０℃で一部オートラジオグラフィーしたところ、１又は
２本の濃いバンドを認めた。そこで、０．１Ｘ　５ＳＰ
Ｅ、０．１％５ＤＳ（３７°Ｃ）で３０分間２回洗浄し
、オートラジオグラフィーにかけたが、１又は２本のそ
のバンドのパターンは変化しない（第２図）ことから、
ＳＣＣ遺伝子は１コピーのみであり、他に類縁の遺伝子
はないと考えられる。

次に部分的に決定されているＳＣＣのアミノ酸配列を示
す（表１）、下線はブライマー１，２（フラグメント１
９）、ブライマー３．４（フラグメント２１−１　）に
相当する配列であり、Ｘは未確認のアミノ酸を、（）は
推定されるアミノ酸を示している。

以下余白 へ　　い　　　１）　　　　　　き　　　へ　　　ヘ　
　　ヘ表２は、ＰＣＲ用オリゴデオキシヌクレオチドプ
ライマーを示したものである。プライマー１゜４は表１
の下線部分のアミノ酸配列から推定されるセンス＃ｌ側
、プライマー２，３はアンチセンス鎖側の配列と一致す
るミックスブライマーである。

プライマー５，６はλ５ＣＣＩの５゛倒の塩基配列に、
プライマー７．８はえｇｔｌＯベクターの鏡ＲＩ切断部
分の上流、下流各塩基配列にそれぞれ一致するユニーク
プライマーであり、プライマー５゜６にはＸｂａ　Ｉサ
イトを、プライマー７．８には津■サイトをそれぞれ５
′側に加えた。

表２゜ プライマ−１ニ プライマー　２ニ プライマー　３； プライマー　４； 八 プライマー　５＝ ５’−ＴＴ吟甲％ＡＣＡＧＡＴＴＣＣＡＣＡＣＴＧＧＴ
ＣＴＧＧ−３”プライマー　６二 ５’−ＴＴ任Ｈ平ＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＴＣＡＴＡＴＧ
ＣＡＴＣ−３’プライマー　７； ５’−ＧＧ＋汁￥ＧＣＴＧＧＧＴＡＧＴＣＣＣＣＡＣＣ
ＴＴＴ−３“プライマー　８＝ 表３に、λｇｔｌＤベクターのＥｃｏＲＩ切断部分及び
プライマー７．８がハイブリッドする部分を示した。

斡　　　　−。

Ｑ　　　Ｌ′□ 表４は、ＳＣＣｃＤＮＡの塩基配列と推定されるアミノ
酸配列を示したものである。ｐｃＳＣＣ２は上段の番号
１から３７０まで、λＳＣＣ１は６４から１７１１まで
である。アミノ酸配列を塩基配列の下に示した。矢印は
５′側より順にプライマー６゜５．３．１の位置である
。四角で囲った部分は部分的に決定されているＳＣＣの
アミノ酸配列に一致する部分（Ｎ末端側より順にフラグ
メント２ｌ−２＝２６．１０．２１−１．１９）である
。点線はアスパラギン結合型糖鎖の結合され得る配列（
Ａｓｎ−Ｘ−５ｅｒ／Ｔｈｒｌに一致する場所を示す。

また二重下線はポリ（Ａ）シグナルを表す。

以下余白 ［発明の効果］ 大腸菌、補乳動物細胞等の公知の宿主を用いて、本発明
の扁平上皮癌関連抗原（ＳＣＣ抗原）蛋白質をコードす
る遺伝子を発現させ、ＳＣＣ抗原を大量に得ることがで
きる。同抗原及び同抗原から得られる抗体は、免疫学的
方法によるＳＣＣ抗原の測定に使用される。

また、本発明のＳＣＣ抗原蛋白質をコードする遺伝子は
、核酸ハイブリダイゼーションによるＳＣＣ抗原蛋白質
遺伝子の検出のためのプローブとして有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、λ５ＣＣＩとｐｃｓｃｃ２の制限酵素地図を
示したものである。左側が５′端、右側が３°端で、ｂ
ｏｘは翻訳領域を表し、水平ラインは非翻訳領域を表す
。垂直ラインはＤＮＡの切断に利用した制限酵素部位を
表す。矢印はシーフェンスの領域と方向を示す。略字は
Ｔ　：　論Ｉ　、　Ｅ　：　Ｅｃ。 Ｒ工、Ｈ：Ｈｉ何ｍ、Ｐ：田Ｉ、Ｓ：鑞Ｉ第２図は、サ
ザーンブロツテイング法により大ゲノムＤＮＡにおける
ＳＣＣ遺伝子の同定を行ったオートラジオグラフィーの
バンドを示したものである。 第２図 （ｋｂ） ２．３−

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）扁平上皮癌関連抗原蛋白質をコードする塩基配列
   を含んで成るＤＮＡ断片
2. （２）扁平上皮癌関連抗原蛋白質が、下記のアミノ酸配
   列の全部又は一部で示されることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項記載のＤＮＡ断片【遺伝子配列があります
   】 【遺伝子配列があります】 （式中、Ｘ１はＧｌｕ又はＧｌｎである）
3. （３）核酸配列が、下記の塩基配列の全部又は一部で示
   されることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のＤ
   ＮＡ断片 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 （式中、ＹはＧ又はＣであり、「・」はその上に示され
   た塩基に相補的な塩基を表わす）