JP2002078494A

JP2002078494A - カンジダ属酵母の検出方法

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Publication number: JP2002078494A
Application number: JP2001213091A
Authority: JP
Inventors: Osamu Takeda; 理武田; Hiroyuki Mukai; 博之向井; Kiyozou Asada; 起代蔵浅田; Hideyo Yamaguchi; 山口英世; Ikunoshin Kato; 郁之進加藤
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1990-07-26
Filing date: 2001-07-13
Publication date: 2002-03-19
Anticipated expiration: 2019-03-02
Also published as: JP3501779B2

Abstract

(57)【要約】【課題】試料中の病原性カンジダ属酵母特有の分泌性
酸性プロテアーゼ遺伝子配列を明らかにし、その検出方
法及びそれに用いるキットを提供する。【解決手段】カンジダ属酵母の分泌性酸性プロテアー
ゼをコードする遺伝子にアニーリング可能なプライマ
ー。該プライマーを用いて増幅されたＤＮＡを検出する
ためのプローブ。該プライマー及びプローブを用いてカ
ンジダ属酵母を検出するカンジダ属酵母の検出方法。該
プライマー又はプローブを含有しているカンジダ属酵母
の検出キット。【効果】試料中のカンジダ属酵母の高感度検出方法及
び検出キットが提供された。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、カンジダ属酵母の
遺伝子及び検出方法に関し、更に詳細にはカンジダ属酵
母の分泌性酸性プロテアーゼ遺伝子及びその検出に関す
る。本発明はまた、このような検出のための検出キット
に関する。

【０００２】

【従来の技術】医療の高度化に基づき、近年ますます増
加傾向にある日和見感染症の最も重篤な疾患の１つであ
るカンジダ症は、その臨床的意義の重大さにもかかわら
ず、治療と密接に関連した有効な検査方法が確立されて
いない。現在市販されている検査薬としては、病原性カ
ンジダ属酵母の細胞壁成分の１つであるマンナン抗原を
用い、血清中の抗カンジダマンナン抗体を測定する検査
薬があるが、この検査薬は、正常人においても有意に高
値を示す場合がしばしば見られる（高木宏治、下野信
行、石丸敏行、岡田薫、澤江義郎；第１０回関東地方
医真菌懇話会講演抄録、第１３頁）。また、カンジダの
代謝産物あるいは菌体成分を生化学的にアッセイする方
法があるが、これらの方法も、病理学的にカンジダ症と
認められない患者に対しても有意に高値を示すことがあ
り、よりカンジダ症に特異的な検査方法の確立が望まれ
ている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】一方、近年種々の遺伝
子診断方法が開発されてきた。病原性カンジダ属酵母の
特徴はその遺伝子により規定されており、この病原性カ
ンジダ属酵母に特徴的な遺伝子配列を特定できれば、そ
の存在を確定することができる。一方カンジダ属酵母の
中で、分泌性酸性プロテアーゼを産生する菌種は病原性
酵母に限られており、この病原性酵母に特徴的な分泌性
酸性プロテアーゼ遺伝子配列を高感度かつ迅速に検出で
きれば、病原性カンジダ属酵母の存在を簡便に、確定す
ることができる。すなわち、本発明の目的は、試料中の
病原性カンジダ属酵母特有の分泌性酸性プロテアーゼ遺
伝子配列を明らかにし、その検出方法及びそれに用いる
キットを提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明はカンジダ属酵母の分泌性酸性プロテ
アーゼ遺伝子を検出するための特定プライマー又はプロ
ーブに関する。本発明の第２の発明は、上記第１の発明
のプライマー又はプローブを用いてカンジダ属酵母を検
出することを特徴とするカンジダ属酵母の検出方法に関
する。そして本発明の第３の発明は、上記第２の発明の
方法に用いる検出キットであって、少なくともカンジダ
属酵母の分泌性酸性プロテアーゼ遺伝子を検出するため
のプライマー又はプローブを含有していることを特徴と
するカンジダ属酵母の検出キットに関する。

【０００５】

【発明の実施の形態】以下、本発明を具体的に説明す
る。病原性カンジダアルビカンスの分泌性酸性プロテア
ーゼ遺伝子は例えば以下の手順でその全塩基配列を決定
することができる。（１）病原性カンジダ属酵母として、例えば病原性カン
ジダアルビカンスＮｏ．１１４株を培養し、培養菌体よ
りｍＲＮＡを調製する。（２）配列表の配列番号２で示されるｃＤＮＡ合成用Ｍ
１３Ｍ４−オリゴ（ｄＴ）プライマーを用い、ｍＲＮＡ
よりｃＤＮＡを合成する。（３）病原性カンジダアルビカンスＮｏ．１１４の分泌
性酸性プロテアーゼのＮ末端のアミノ酸配列は既に配列
表の配列番号３に示す様に決定されている。このアミノ
酸配列から、該プロテアーゼ遺伝子クローニングのため
のＰＣＲ〔Polymerase Chain Reaction ：サイキ（Saik
i)ら、サイエンス（Science)、第２３０巻、第１３５０
〜１３５４頁（１９８５）〕用ミックスプライマー及び
検出用ミックスプローブを合成、精製し、次にこのミッ
クスプライマーと、ランダムプライマーを用い、特開平
３−２３６７８１号公報記載の方法を用い、該プロテア
ーゼのＮ末端付近をコードする遺伝子を増幅、クローニ
ングし、塩基配列を決定する。（４）前工程で決定された塩基配列を基にネステッド
（nested)ＰＣＲプライマーと、検出用プローブを合
成、精製し、該プライマーとＭ１３Ｍ４プライマー（宝
酒造）を用いたＰＣＲにより、該プロテアーゼのＣ末端
部を含む遺伝子を増幅、クローニングし、塩基配列を決
定する。（５）前工程で決定された塩基配列を基にネステッドＰ
ＣＲ用プライマーを合成、精製する。前述ｃＤＮＡをＴ
４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化後、ＥｃｏＲＩ
アダプターを接続し、ＥｃｏＲＩで切断したファージベ
クターλｇｔ１０にライゲーションし、鋳型ＤＮＡを調
製する。次にネステッドＰＣＲ用プライマーとλｇｔ１
０リバースプライマーを用いたＰＣＲにより、該プロテ
アーゼのＮ末端部を含む遺伝子を増幅、クローニング
し、塩基配列を決定する。（６）配列表の配列番号４が該プロテアーゼのＮ末端付
近をコードする３２７ｂｐの塩基配列、配列表の配列番
号５がＣ末端部をコードする塩基配列を含む９３３ｂｐ
の塩基配列、配列表の配列番号６がＮ末端部をコードす
る塩基配列を含む５４７ｂｐの塩基配列であり、これら
より、配列表の配列番号１で示す分泌性酸性プロテアー
ゼ遺伝子の塩基配列が決定される。なお、配列表の配列
番号７がｃＤＮＡの全長、及び該プロテアーゼのアミノ
酸配列を示すものである。この遺伝子内には病原性カン
ジダ属酵母に特有な領域があり、この領域を検出するこ
とにより、該酵母の存在を確認することができる。

【０００６】その検出方法は、サザンハイブリダイゼー
ション法等の遺伝子検出方法で良いが、ＰＣＲ法が現在
最も高感度な遺伝子検出方法である。ＰＣＲ法で選定領
域を増幅させるために一対のオリゴヌクレオチドプライ
マーＤＮＡが必要である。検出感度を上昇させるために
は、更にもう一対のプライマーＤＮＡが必要である。こ
れらのプライマーは上記決定領域にアニーリングできる
ものであれば良い。その一例として、配列表の配列番号
８で示すプライマー１、配列表の配列番号９で示すプラ
イマー２、配列表の配列番号１０で示すプライマー３、
配列表の配列番号１１で示すプライマー４、配列表の配
列番号１２で示すプライマー５等があり、ＤＮＡ合成機
により合成でき、ＨＰＬＣにて精製できる。

【０００７】検出する病原性カンジダ属酵母は、血清等
病原性カンジダ感染試料より調製することができる。Ｐ
ＣＲ法についてはタック−ポリメラーゼ(Taq-polymeras
e)を含む遺伝子増幅キット及び自動遺伝子増幅装置が宝
酒造社から市販されており、これと本発明のプライマー
対を用い、病原性カンジダ属酵母ＤＮＡの増幅反応を行
えばよい。ＰＣＲ法によれば、酵素として、例えば耐熱
性タック−ポリメラーゼを用い、ＤＮＡの変性（９４
℃）の工程、プライマーＤＮＡのアニーリング（５５
℃）の工程、ＤＮＡ相補鎖の酵素的合成（７２℃）の工
程より成る温度サイクルを任意の回数繰返すことで、目
的遺伝子のみを指数的に増幅することができる。例えば
温度サイクルを２５回繰返せば、目的ＤＮＡは約１０万
倍に増幅され、微量試料より高感度にＤＮＡを検出する
には、このＰＣＲ法が最も有効である。増幅後の分泌性
酸性プロテアーゼ遺伝子ＤＮＡの検出は、例えばアガロ
ースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、
スポット法、及びサザンブロット法を用いて行うことが
できる。スポット法、サザンブロット法の際は増幅領域
内でプローブＤＮＡを選択すればよい。その一例として
配列表の配列番号１３のプローブ１がある。

【０００８】プローブＤＮＡは前記プライマーＤＮＡと
同様の方法で合成、精製することができる。プローブＤ
ＮＡは、標識化することにより、高感度な検出が可能と
なる。標識化の方法は放射性同位元素標識法に限らず、
酵素標識、蛍光標識、ビオチン、アビジン系標識、ケミ
プローブ標識法等公知の方法なら何でもよい。実際選定
されたプライマーを用い、病原性カンジダ属酵母の分泌
性酸性プロテアーゼ遺伝子のＰＣＲ反応を行うことがで
き、電気泳動法、サザンハイブリダイゼーション法等に
より高感度に検出することができる。

【０００９】このように病原性カンジダ属酵母の分泌性
酸性プロテアーゼに特有の遺伝子領域が明らかになり、
この領域を検出することによりカンジダ属酵母を高感度
に検出することができる。ＰＣＲ法の場合、高感度な検
出を行うことができ、病原性カンジダ属酵母の早期検出
が可能となり、その治療に利用可能となる。また、本発
明に従って、病原性カンジダ属酵母の分泌性酸性プロテ
アーゼＤＮＡ領域を増幅させるためのプライマー対、及
び増幅されたＤＮＡ領域を検出するためのプローブをそ
ろえてキットしておくことにより、病原性カンジダ属酵
母の検出を簡便に行うことができる。なお、キットに用
いる試薬は溶液状でも良いし、凍結乾燥物でもよい。以
上ＰＣＲ法を用いた病原性カンジダ属酵母の高感度検出
法について詳細に説明してきたが、本発明はＰＣＲ法に
限定されるものではなく、特定の核酸及びその相補鎖を
高感度に検出する方法はすべて本発明に含まれるもので
あり、例えばＱβ−レプリケースアンプリフィケーシ
ョンシステム〔バイオ／テクノロジー(Bio／technolog
y)、第６巻、第１１９７頁(１９８８年) 〕による方法
が挙げられる。

【００１０】また、本発明により病原性カンジダ属酵母
の分泌性酸性プロテアーゼの全アミノ酸配列が決定され
た。本発明の遺伝子を用いれば、該プロテアーゼを遺伝
子工学的に製造することができる。遺伝子工学的に発現
されたポリペプチド、アミノ酸配列から合成したポリペ
プチド等はタンパク質工学、免疫工学、診断用試薬等の
分野において有用である。

【００１１】

【実施例】以下本発明を実施例をもって更に具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるも
のではない。

【００１２】実施例１カンジダアルビカンスＮｏ．１１４の分泌性酸性プロテ
アーゼｃＤＮＡのＰＣＲ法によるクローニングと塩基配
列決定（１）カンジダアルビカンスＮｏ．１１４のｍＲＮＡの
調製カンジダアルビカンスの培養、スフェロプラストの調
製、全ＲＮＡの調製、ポリ（Ａ）−ｍＲＮＡの分画を阿
部らの方法〔昭和６２年１１月１０日、（株）ソフトサ
イエンス社発行、口野嘉幸ほか２名編「遺伝子・タンパ
ク質実験操作ブロッティング法」（初版）〕により行
い、最終的に培養液４００ｍｌより約１５０μｇのｍＲ
ＮＡを得た。（２）ｃＤＮＡの合成上記ポリ（Ａ）−ｍＲＮＡ約１１μｇよりアマーシャ
ム社製ｃＤＮＡ合成キット（コード番号ＲＰＮ．１２
５６）及びＭ１３Ｍ４−オリゴ（ｄＴ）プライマーを用
い、ｃＤＮＡを合成し、二本鎖ｃＤＮＡ約２μｇを得
た。（３）ＰＣＲ法による分泌性酸性プロテアーゼｃＤＮＡ
の部分クローニング上記ｃＤＮＡ約０．１μｇを０．５ｍｌ用チューブに取
り、ジーンアンプ^TMキット（宝酒造社）中の５μｌの１
０倍濃縮増幅用緩衝液〔１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、
ｐＨ８．３、５００ｍＭＫＣｌ、１５ｍＭＭｇＣ
ｌ₂、０．０１％(ｗ／ｖ)ゼラチン〕、８μｌの１．２
５ｍＭｄＮＴＰ混合液(ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ＴＴＰ）、０．５μｇの配列表の配列番号１４で示
すミックスプライマー１、０．２μｇのランダムプライ
マー（デカマー）、０．５μｌの５ユニット／μｌアン
プリタック^TM（宝酒造社）を加え、滅菌水を加えて５０
μｌのミネラルオイル（シグマ社）を重層した後、自動
遺伝子増幅装置サーマル・サイクラー（宝酒造社）によ
り増幅を行った。反応条件は、（１）９４℃で３０秒間
（熱変性）→５５℃で２分間（アニーリング）→７２℃
で１分間（合成反応）のサイクルを３５サイクル行っ
た。次に上記反応液１μｌを０．５ｍｌ用チューブに取
り、ジーンアンプ^TMキット中の５μｌの１０倍濃縮増幅
用緩衝液、８μｌの１．２５ｍＭｄＮＴＰ混合液、
０．５μｇの配列表の配列番号１５で示すミックスプラ
イマー２、０．２μｇのランダムプライマー（デカマ
ー）、０．５μｌの５ユニット／μｌアンプリタック^TM
を加え、滅菌水を加えて５０μｌのミネラルオイルを重
層した後、自動遺伝子増幅装置サーマル・サイクラーに
より増幅を行った。反応後、反応液を１０μｌ取り、ア
ガロースゲル（宝酒造社製）にて電気泳動を行い、ナイ
ロンメンブランハイボンド(Hybond)−Ｎ（アマーシャ
ム社）を用いてサザンハイブリダイゼーションを行っ
た。プローブは配列表の配列番号１６で示すミックスプ
ローブ１を〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰで末端標識したものを用
いた。このサザンハイブリダイゼーションの結果、分泌
性酸性プロテアーゼｃＤＮＡの一部、約３００ｂｐの断
片が増幅されていることが確認できた。この断片をゲル
から切り出して精製し、ＤＮＡブランティングキット
（宝酒造社）を用いて末端を平滑化し、ｐＵＣ１８ベク
ターのＨｉｎｃＩＩサイトにサブクローニングし、上記
ミックスプローブ１をプローブとして、コロニーハイブ
リダイゼーションを行って得たポジティブ・クローンを
ジデオキシ法によりシークエンシングし、カンジダアル
ビカンスＮｏ．１１４の分泌性酸性プロテアーゼｃＤＮ
Ａの一部、配列表の配列番号４で示した３２７ｂｐの塩
基配列を決定した。（４）ネステッドＰＣＲ法による分泌性酸性プロテアー
ゼＣ末端領域ｃＤＮＡのクローニング１−（３）で決定した塩基配列よりＰＣＲ用プライマー
のプライマー１、及びプライマー２を合成精製し、実施
例１−（２）記載のｃＤＮＡを鋳型に用いてＰＣＲを行
った。これらはすべて実施例１−（３）記載の反応液組
成、反応手順に従った。ただし１回目のＰＣＲにはプラ
イマー１とＭ１３プライマーＭ４（宝酒造社製）を用
い、２回目のＰＣＲにはプライマー２とＭ１３プライマ
ーＭ４を用いた。この結果、分泌性酸性プロテアーゼｃ
ＤＮＡのＣ末端領域、約９００ｂｐ断片が増幅されてい
ることが確認できた。この断片を実施例１−（３）の方
法に従いサブクローニング、シークエンシングを行いカ
ンジダアルビカンスＮｏ．１１４の分泌性酸性プロテア
ーゼｃＤＮＡのＣ末端領域を含み、配列表の配列番号５
で示した９３３ｂｐの塩基配列を決定した。（５）ネステッドＰＣＲ法による分泌性酸性プロテアー
ゼＮ末端領域ｃＤＮＡのクローニング１−（４）で決定した塩基配列よりＰＣＲ用プライマー
のプライマー３、及びプライマー４を合成、精製しＰＣ
Ｒのプライマーとして用いた。鋳型としては、実施例１
−（２）記載のｃＤＮＡとファージベクターλｇｔ１０
を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化したものを、ｃＤＮＡクロ
ーニングシステムλｇｔ１０（アマーシャム社製）を用
いてライゲーションしたものを使用した。ＰＣＲの反応
液組成、反応手順はすべて実施例１−（３）に従った。
ただし１回目のＰＣＲにはプライマー３とλｇｔ１０プ
ライマー・リバース（宝酒造社製）を用い、２回目のＰ
ＣＲにはプライマー４とλｇｔ１０プライマー・リバー
スを用いた。この結果、分泌性酸性プロテアーゼｃＤＮ
ＡのＮ末端領域、約５５０ｂｐの断片が増幅されている
ことが確認できた。この断片を実施例１−（３）の方法
に従いサブクローニング、シークエンシングを行い、カ
ンジダアルビカンスＮｏ．１１４の分泌性酸性プロテア
ーゼｃＤＮＡのＮ末端領域を含み、配列表の配列番号６
で示した５４７ｂｐの塩基配列を決定し、配列表の配列
番号１及び配列番号７で示した、分泌性酸性プロテアー
ゼの遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を決定した。

【００１３】実施例２カンジダアルビカンスＮｏ．１１４の分泌性酸性プロテ
アーゼ遺伝子ＤＮＡのＰＣＲによる検出（１）プライマーＤＮＡ及びプローブＤＮＡの合成及び
精製配列表の配列番号８〜１３に示したプライマーＤＮＡ及
びプローブＤＮＡをアプライドバイオシステムズ社のＤ
ＮＡ合成機を用いて合成し、脱保護の後、イオン交換Ｈ
ＰＬＣ（ＴＳＫゲル、ＤＥＡＥ−２ＳＷカラム）で精製
し、セプーパク（ＳＥＰ−ＰＡＣ)Ｃ₁₈（ウォーターズ
社）で脱塩し、各ＤＮＡを約５０μｇ得た。（２）カンジダアルビカンスＮｏ．１１４のゲノムＤＮ
Ａの調製カンジダアルビカンスの培養（６０ｍｌ）、スフェロプ
ラストの調製、ゲノムＤＮＡの調製は阿部らの方法〔既
述の遺伝子・タンパク質実験操作ブロッティング法、
ソフトサイエンス社〕により行い、最終的に培養液６０
ｍｌより約３４０μｇのゲノムＤＮＡを得た。（３）カンジダアルビカンスＮｏ．１１４の分泌性酸性
プロテアーゼ遺伝子ＤＮＡに特異的な領域のＰＣＲ法に
よる増幅実施例２−（２）で調製したカンジダアルビカンスＮ
ｏ．１１４のＤＮＡ６８０ｎｇ、公知の方法により調
製したマウスのＤＮＡ２４０ｎｇ、大腸菌ＨＢ１０１
のＤＮＡ３００ｎｇ、サッカロミセスセレビシェのＤ
ＮＡ５００ｎｇ、ヒトのＤＮＡ１μｇ、コイのＤＮ
Ａ３００ｎｇをそれぞれ０．５ｍｌ用チューブに取
り、１０μｌの１０×増幅用緩衝液、１６μｌの１．２
５ｍＭｄＮＴＰ混合液（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ＴＴＰ）１μｌの０．１μｇ／μｌプライマー１、
１μｌの０．１μｇ／μｌプライマー５、０．５μｌの
５ユニット／μｌタックポリメラーゼを加え、更に滅菌
水を加えて１００μｌの溶液にした。この反応液は上層
に１００μｌのミネラルオイルを加えた後、自動遺伝子
増幅装置サーマル−サイクラーにより増幅反応を行っ
た。反応条件は、９４℃、３０秒間の変性→５５℃、２
分間のプライマーのアニーリング→７２℃、１分間の合
成反応のサイクルを３０サイクル行った。反応後、上層
のミネラルオイルを除去した後、反応液を１０μｌ取
り、１％アガロース（宝酒造社製）ゲル電気泳動を行
い、エチジウムブロマイドでＤＮＡを染色し、増幅され
たＤＮＡを確認した。その結果、カンジダアルビカンス
Ｎｏ．１１４ＤＮＡを鋳型にした場合のみ３１２ｂｐの
バンドを確認した。他のＤＮＡからは増幅は認められな
かった。（４）サザンハイブリダイゼーションによるカンジダア
ルビカンスＤＮＡの検出実施例２−（３）で記載のＰＣＲ反応液を泳動した１％
アガロースゲルをアルカリ変性後、ナイロンメンブラン
（アマーシャムハイボンド−Ｎ）に一晩サザンブロット
した。紫外線トランスイルミネーター（２５４ｎｍ）に
１０分間照射させ、ＤＮＡをメンブランに固定させた。
このメンブランは、プレハイブリダイゼーション緩衝液
（５×デンハーツ液、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、１
００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）５ｍｌ中で３７℃、２
時間プレハイブリダイゼーションを行った。次に³²Ｐに
て５′末端をラベルしたプローブ１を加え、３７℃、一
晩ハイブリダイゼーションを行った。プローブの³²Ｐ−
ラベルはメガラベルキット(MEGALABEL Kit) （宝酒
造）を用いて次のように行った。１０ｐmoleのプロー
ブ、１μｌの１０×リン酸化緩衝液、５０μＣｉの〔γ
−³²Ｐ〕ＡＴＰ（アマーシャム社）、１０ユニットのＴ
４−ポリヌクレオチドキナーゼを含む反応液に滅菌水を
加えて１０μｌにし、３７℃、３０分間反応させた。反
応後、９４℃、５分間処理し、この反応液の全量（約１
０⁸ｃｐｍ)をハイブリダイゼーションに用いた。ハイブ
リダイゼーション後、メンブランを２×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳを含む洗浄液１で室温５分間で１回洗浄し、続
いて２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む洗浄液２で３７
℃、３０分間で１回洗浄した。更に、０．５×ＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳを含む洗浄液３で３７℃、３０分間で１
回洗浄した。メンブランは乾燥させた後、Ｘ線フィルム
（富士フィルム）を入れたカセット内で−７０℃、１時
間感光させ、オートラジオグラフをとった。この結果、
カンジダアルビカンスのＰＣＲ増幅ＤＮＡはプローブ１
とハイブリダイゼーションし、バンドが現われたが、そ
の他のサンプルではバンドが認められなかった。このこ
とは、プライマー１、及びプライマー５でカンジダアル
ビカンスのＤＮＡが特異的に増幅され、プローブ１との
ハイブリダイゼーションで、カンジダアルビカンスのＤ
ＮＡが特異的に検出できることを示すものである。

【００１４】実施例３カンジダアルビカンス各菌株の分泌性酸性プロテアーゼ
遺伝子ＤＮＡのＰＣＲによる検出（１）ゲノムＤＮＡの調製カンジダアルビカンスＴＩＭＭ０１６７、ＴＩＭＭ２１
４１、ＴＩＭＭ２２９０、ＴＩＭＭ２２９７、ＴＩＭＭ
２３２５、ＴＩＭＭ２３２９（帝京大学医真菌研究セン
ター）、Ｎｏ．１１４の各コロニーをつまようじでかき
取り、１．５ｍｌ用チューブ内の１００μｌのリシス緩
衝液（１００ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．５、０．５
％ＳＤＳ、３０ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁した。１００℃
で１５分間熱処理した後５０μｌの５Ｍ酢酸カリウムを
加え、かくはん後、０℃で１時間インキュベートした。
室温で５分間遠心した後、上清７０μｌを新しい１．５
ｍｌ用チューブに移し、それに７０μｌのイソプロピル
アルコールを加えかくはんした。次に４℃で５分間遠心
し、上清を除いた後９５％エタノール５００μｌでリン
スした。風乾後１００μｌの滅菌蒸留水に溶解した。（２）プライマー１及びプライマー５を用いたＰＣＲに
よる分泌性酸性プロテアーゼ遺伝子の検出上記ＤＮＡ溶液５μｌを０．５ｍｌ用チューブに取り、
ジーンアンプ^TMキット中の５μｌの１０倍濃縮増幅用緩
衝液、８μｌの１．２５ｍＭｄＮＴＰ混合液、０．０
５μｇのプライマー１、０．０５μｇのプライマー５、
０．２５μｌの５ユニット／μｌアンプリタック^TMを加
え、滅菌水を加えて５０μｌのミネラルオイルを重層し
た後サーマル・サイクラーにより増幅を行った。反応条
件は、９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、７２℃で３
０秒間のサイクルを２５サイクル行った。反応後、反応
液を１０μｌ取り、エチジウムブロマイドを含むアガロ
ースゲルにて電気泳動を行い増幅の確認をした。この結
果７種類の菌株すべてに３１２ｂｐの増幅が認められ
た。

【００１５】実施例４ネステッドＰＣＲを用いたカンジダアルビカンスの検出
感度の検定（１）鋳型ＤＮＡの濃度限界の検定実施例２−（２）で調製したカンジダアルビカンスＮ
ｏ．１１４のゲノムＤＮＡを１ｎｇ／μｌのλ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ digest （宝酒造社製）で順次１０倍希釈し
ていき１０ｎｇ／μｌ〜１ｆｇ／μｌのモデルテンプレ
ートＤＮＡを調製した。このテンプレートＤＮＡ溶液１
μｌを用いて実施例３−（２）に示した方法でＰＣＲ、
それに続く電気泳動を行った。ただしプライマーとし
て、プライマー１及びプライマー３を用いた。この結
果、鋳型ＤＮＡ量が１ｐｇまで３６６ｂｐのバンドが確
認された。次に１回目ＰＣＲ反応液１μｌを０．５ｍｌ
用チューブに取り、実施例３−（２）に示した方法に従
い２回目のＰＣＲを行った。ただしプライマーとしてプ
ライマー２、プライマー４を用いた。電気泳動を行った
結果、鋳型ＤＮＡ量が１０ｆｇまで１２５ｂｐのバンド
が確認された。酵母のハプロイド当りの質量は約２０ｆ
ｇであるので、理論的には、少なくともカンジダアルビ
カンス１個が存在していれば検出可能ということにな
る。（２）カンジダアルビカンスの検出限界カンジダアルビカンスＮｏ．１１４を実施例２−（２）
記載の方法で培養後、血球計算盤により菌数を算出した
（１×１０⁷個／ｍｌ）。次に各１．５ｍｌチューブ
に、それぞれ菌数が１×１０⁵個、１×１０⁴個、１×１
０³個、１００個、１０個、１個相当の上記培養液を取
り、実施例３−（１）記載の方法によりＤＮＡを調製し
た。このテンブレート溶液１０μｌを用い実施例４−
（１）で示した方法に従いネステッドＰＣＲを行った。
この結果、１個相当の菌数より調製したＤＮＡ量でも１
２５ｂｐのバンドが確認された。これは実施例４−
（１）の結果とよく符号するものであった。

【００１６】実施例５病原性カンジダ属酵母の増幅・検出キットの作製試料中の病原性カンジダ属酵母ＤＮＡを増幅・検出する
ためのキットを作製した。ＤＮＡ増幅用プライマーとし
て、プライマー１、プライマー３が各２０μＭ溶液とな
るようにＴＥ緩衝液２０μｌに溶解し、カンジダプライ
マーＡ−１液（Ａ−１剤）とした。同じくＤＮＡ増幅用
プライマーとしてプライマー２、プライマー４が各２０
μＭ溶液となるようにＴＥ緩衝液２０μｌに溶解し、カ
ンジダプライマーＡ−２液（Ａ−２剤）とした。ＤＮＡ
検出用プローブとして、プローブ１の１μｇをＴＥ緩衝
液２０μｌに溶解し、カンジダプローブＢ−１液（Ｂ−
１剤）とした。Ａ−１剤、Ａ−２剤、Ｂ−１剤を１組と
して、病原性カンジダ属酵母の増幅・検出キットとした
（表１）。

【００１７】

【表１】

【００１８】

【発明の効果】以上、詳細に説明したように、本発明に
より病原性カンジダ属酵母の分泌性酸性プロテアーゼ遺
伝子領域が明らかになり、この領域を検出することによ
る、試料中のカンジダ属酵母の高感度検出方法及び検出
キットが提供された。

【００１９】

【配列表】

【００２０】配列番号：1 配列の長さ：1023 配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源：Candida albicans 配列の特徴： 1-1023 E CDS（分泌性酸性プロテアーゼ）配列： CAAGCTGTCC CAGTGACTTT ACACAATGAA CAAGTCACTT ATGCTGCTGA TATTACCGTT 60 GGATCCAATA ATCAAAAACT TAATGTTATT GTTGATACTG GATCATCAGA TTTATGGGTT 120 CCTGATGTTA ATGTTGATTG TCAAGTCACT TATAGTGATC AAACTGCAGA TTTCTGTAAA 180 CAAAAGGGGA CATATGATCC AAGTGGTTCA TCAGCTTCAC AAGATTTGAA TACTCCATTC 240 AAAATTGGTT ATGGTGATGG ATCTTCATCT CAAGGTACTT TATATAAGGA TACCGTTGGA 300 TTTGGTGGTG TTTCGATTAA AAATCAAGTT TTAGCTGATG TTGATTCTAC TTCAATTGAT 360 CAAGGTATTT TAGGGGTTGG TTATAAAACC AATGAAGCCG GTGGTAGTTA TGATAATGTC 420 CCTGTCACTT TAAAAAAACA AGGAGTCATT GCTAAGAATG CTTATTCACT TATCTTAATT 480 CTCCAGATGC TGCCACGGGA CAAATCATTT TCGGTGGGGT TGATAATGCT AAATATAGTG 540 GGTTCATTAA TTGCATTACC AGTTACTTCT GATCGTGAAT TAAGAATTAG TTTGGGTTCA 600 GTTGAAGTTT CTGGTAAAAC CATCAATACT GATAATGTCG ATGTTCTTTT GGATTCAGGT 660 ACCACCATTA CTTATTTGCA ACAAGATCTT GCTGATCAAA TCATTAAAGC TTTCAATGGT 720 AAATTAACTC AAGATTCCAA TGGTAATTCA TTCTATGAAG TTGATTGTAA TTTGTCAGGG 780 GATGTTGTAT TCAATTTTAG TAAAAATGCT AAAATTTCCG TTCCAGCTTC CGAATTTGCT 840 GCTTCTTTAC AAGGTGATGA TGGTCAACCA TATGATAAAT GTCAATTACT TTTCGATGTT 900 AATGATGCTA ACATTCTTGG TGATAACTTT TTGAGATCAC TTATATTGTT TATGATTTGG 960 ATGATAATGA AATTTCTTTG GCTCAAGTCA AATATACTTC TCTTCCAGTA TTTCTCCTTG 1020 ACC 1023

【００２１】配列番号：2 配列の長さ：37 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセテイカル配列：NO アンチセンス：YES 配列の特徴： 1-37 E primer 配列： GTTTTCCCAG TCACGACTTT TTTTTTTTTT TTTTTTT 37

【００２２】配列番号：3 配列の長さ：30 配列の型：アミノ酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：Ｎ末端フラグメント（分泌性酸性プロテアーゼ）起源：Candida albicans 配列： Gln Ala Val Pro Val Thr Leu His Asn Glu Gln Val Thr Tyr Ala 1 5 10 15 Ala Asp Ile Thr Val Gly Ser Asn Xaa Gln Xaa Leu Xaa Asp Ile 20 25 30

【００２３】配列番号：4 配列の長さ：327 配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源：Candida albicans 配列： GAGCAGGTGA CTTATGCTGC TGATATTACC GTTGGATCCA ATAATCAAAA ACTTAATGTT 60 ATTGTTGATA CTGGATCATC AGATTTATGG GTTCCTGATG TTAATGTTGA TTGTCAAGTC 120 ACTTATAGTG ATCAAACTGC AGATTTCTGT AAACAAAAGG GGACATATGA TCCAAGTGGT 180 TCATCAGCTT CACAAGATTT GAATACTCCA TTCAAAATTG GTTATGGTGA TGGATCTTCA 240 TCTCAAGGTA CTTTATATAA GGATACCGTT GGATTTGGTG GTGTTTCGAT TAAAAATCAA 300 GTTTTAGCTG ATGTTGATTC TACTTCA 327

【００２４】配列番号：5 配列の長さ：933 配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源：Candida albicans 配列： GGATCTTCAT CTCAAGGTAC TTTATATAAG GATACCGTTG GATTTGGTGG TGTTTCGATT 60 AAAAATCAAG TTTTAGCTGA TGTTGATTCT ACTTCAATTG ATCAAGGTAT TTTAGGGGTT 120 GGTTATAAAA CCAATGAAGC CGGTGGTAGT TATGATAATG TCCCTGTCAC TTTAAAAAAA 180 CAAGGAGTCA TTGCTAAGAA TGCTTATTCA CTTATCTTAA TTCTCCAGAT GCTGCCACGG 240 GACAAATCAT TTTCGGTGGG GTTGATAATG CTAAATATAG TGGGTTCATT AATTGCATTA 300 CCAGTTACTT CTGATCGTGA ATTAAGAATT AGTTTGGGTT CAGTTGAAGT TTCTGGTAAA 360 ACCATCAATA CTGATAATGT CGATGTTCTT TTGGATTCAG GTACCACCAT TACTTATTTG 420 CAACAAGATC TTGCTGATCA AATCATTAAA GCTTTCAATG GTAAATTAAC TCAAGATTCC 480 AATGGTAATT CATTCTATGA AGTTGATTGT AATTTGTCAG GGGATGTTGT ATTCAATTTT 540 AGTAAAAATG CTAAAATTTC CGTTCCAGCT TCCGAATTTG CTGCTTCTTT ACAAGGTGAT 600 GATGGTCAAC CATATGATAA ATGTCAATTA CTTTTCGATG TTAATGATGC TAACATTCTT 660 GGTGATAACT TTTTGAGATC ACTTATATTG TTTATGATTT GGATGATAAT GAAATTTCTT 720 TGGCTCAAGT CAAATATACT TCTCTTCCAG TATTTCTCCT TGACCTAAGA TGAAGGGGTG 780 AGATAAAGTT GAAATATTAA AATATTAGTT CTTGATTAGT TTTTACTTAC TTGAAAGGAG 840 TGGCTTTTTT TTTATAGTTT GATAACTTTT TTTGCTTTCT TTCAAGTTTT TTTTATATTT 900 TGTTTTGTTT TGTAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA 933

【００２５】配列番号：6 配列の長さ：547 配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源：Candida albicans 配列： TTTTTAAAGA ATATTTTCAT GGCCTTGCTA TTGCTTTATT AGTCGATGCT ACTCCAACAA 60 CAACCAAAAG ATCAGCTGGT TTCGTTGCTT TAGATTTCAG TGTTGTGAAA ACTCCTAAAG 120 CATCCCCAGT TACTAATGGC CAAGAAGGTA AAACTTCCAA AAGACAAGCT GTCCCAGTGA 180 CTTTACACAA TGAACAAGTC ACTTATGCTG CTGATATTAC CGTTGGATCC AATAATCAAA 240 AACTTAATGT TATTGTTGAT ACTGGATCAT CAGATTTATG GGTTCCTGAT GTTAATGTTG 300 ATTGTCAAGT CACTTATAGT GATCAAACTG CAGATTTCTG TAAACAAAAG GGGACATATG 360 ATCCAAGTGG TTCATCAGCT TCACAAGATT TGAATACTCC ATTCAAAATT GGTTATGGTG 420 ATGGATCTTC ATCTCAAGGT ACTTTATATA AGGATACCGT TGGATTTGGT GGTGTTTCGA 480 TTAAAAATCA AGTTTTAGCT GATGTTGATT CTACTTCAAT TGATCAAGGT ATTTTAGGGG 540 TTGGTTA 547

【００２６】配列番号：7 配列の長さ：1355 配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源：Candida albicans 配列の特徴： 165-1187 E CDS（分泌性酸性プロテアーゼ） 1336-1355 E poly A site 配列： TTTTTAAAGA ATATTTTCAT GGCCTTGCTA TTGCTTTATT AGTCGATGCT ACTCCAACAA 60 CAACCAAAAG ATCAGCTGGT TTCGTTGCTT TAGATTTCAG TGTTGTGAAA ACTCCTAAAG 120 CATCCCCAGT TACTAATGGC CAAGAAGGTA AAACTTCCAA AAGA CAA GCT GTC CCA 176 Gln Ala Val Pro 1 GTG ACT TTA CAC AAT GAA CAA GTC ACT TAT GCT GCT GAT ATT ACC 221 Val Thr Leu His Asn Glu Gln Val Thr Tyr Ala Ala Asp Ile Thr 5 10 15 GTT GGA TCC AAT AAT CAA AAA CTT AAT GTT ATT GTT GAT ACT GGA 266 Val Gly Ser Asn Asn Gln Lys Leu Asn Val Ile Val Asp Thr Gly 20 25 30 TCA TCA GAT TTA TGG GTT CCT GAT GTT AAT GTT GAT TGT CAA GTC 311 Ser Ser Asp Leu Trp Val Pro Asp Val Asn Val Asp Cys Gln Val 35 40 45 ACT TAT AGT GAT CAA ACT GCA GAT TTC TGT AAA CAA AAG GGG ACA 356 Thr Tyr Ser Asp Gln Thr Ala Asp Phe Cys Lys Gln Lys Gly Thr 50 55 60 TAT GAT CCA AGT GGT TCA TCA GCT TCA CAA GAT TTG AAT ACT CCA 401 Tyr Asp Pro Ser Gly Ser Ser Ala Ser Gln Asp Leu Asn Thr Pro 65 70 75 TTC AAA ATT GGT TAT GGT GAT GGA TCT TCA TCT CAA GGT ACT TTA 446 Phe Lys Ile Gly Tyr Gly Asp Gly Ser Ser Ser Gln Gly Thr Leu 80 85 90 TAT AAG GAT ACC GTT GGA TTT GGT GGT GTT TCG ATT AAA AAT CAA 491 Tyr Lys Asp Thr Val Gly Phe Gly Gly Val Ser Ile Lys Asn Gln 95 100 105 GTT TTA GCT GAT GTT GAT TCT ACT TCA ATT GAT CAA GGT ATT TTA 536 Val Leu Ala Asp Val Asp Ser Thr Ser Ile Asp Gln Gly Ile Leu 110 115 120 GGG GTT GGT TAT AAA ACC AAT GAA GCC GGT GGT AGT TAT GAT AAT 581 Gly Val Gly Tyr Lys Thr Asn Glu Ala Gly Gly Ser Tyr Asp Asn 125 130 135 GTC CCT GTC ACT TTA AAA AAA CAA GGA GTC ATT GCT AAG AAT GCT 626 Val Pro Val Thr Leu Lys Lys Gln Gly Val Ile Ala Lys Asn Ala 140 145 150 TAT TCA CTT ATC TTA ATT CTC CAG ATG CTG CCA CGG GAC AAA TCA 671 Tyr Ser Leu Ile Leu Ile Leu Gln Met Leu Pro Arg Asp Lys Ser 155 160 165 TTT TCG GTG GGG TTG ATA ATG CTA AAT ATA GTG GGT TCA TTA ATT 716 Phe Ser Val Gly Leu Ile Met Leu Asn Ile Val Gly Ser Leu Ile 170 175 180 GCA TTA CCA GTT ACT TCT GAT CGT GAA TTA AGA ATT AGT TTG GGT 761 Ala Leu Pro Val Thr Ser Asp Arg Glu Leu Arg Ile Ser Leu Gly 185 190 195 TCA GTT GAA GTT TCT GGT AAA ACC ATC AAT ACT GAT AAT GTC GAT 806 Ser Val Glu Val Ser Gly Lys Thr Ile Asn Thr Asp Asn Val Asp 200 205 210 GTT CTT TTG GAT TCA GGT ACC ACC ATT ACT TAT TTG CAA CAA GAT 851 Val Leu Leu Asp Ser Gly Thr Thr Ile Thr Tyr Leu Gln Gln Asp 215 220 225 CTT GCT GAT CAA ATC ATT AAA GCT TTC AAT GGT AAA TTA ACT CAA 896 Leu Ala Asp Gln Ile Ile Lys Ala Phe Asn Gly Lys Leu Thr Gln 230 235 240 GAT TCC AAT GGT AAT TCA TTC TAT GAA GTT GAT TGT AAT TTG TCA 941 Asp Ser Asn Gly Asn Ser Phe Tyr Glu Val Asp Cys Asn Leu Ser 245 250 255 GGG GAT GTT GTA TTC AAT TTT AGT AAA AAT GCT AAA ATT TCC GTT 986 Gly Asp Val Val Phe Asn Phe Ser Lys Asn Ala Lys Ile Ser Val 260 265 270 CCA GCT TCC GAA TTT GCT GCT TCT TTA CAA GGT GAT GAT GGT CAA 1031 Pro Ala Ser Glu Phe Ala Ala Ser Leu Gln Gly Asp Asp Gly Gln 275 280 285 CCA TAT GAT AAA TGT CAA TTA CTT TTC GAT GTT AAT GAT GCT AAC 1076 Pro Tyr Asp Lys Cys Gln Leu Leu Phe Asp Val Asn Asp Ala Asn 290 295 300 ATT CTT GGT GAT AAC TTT TTG AGA TCA CTT ATA TTG TTT ATG ATT 1121 Ile Leu Gly Asp Asn Phe Leu Arg Ser Leu Ile Leu Phe Met Ile 305 310 315 TGG ATG ATA ATG AAA TTT CTT TGG CTC AAG TCA AAT ATA CTT CTC 1166 Trp Met Ile Met Lys Phe Leu Trp Leu Lys Ser Asn Ile Leu Leu 320 325 330 TTC CAG TAT TTC TCC TTG ACC TAAGATGAAG GGGTGAGATA AAGTTGAAAT 1217 Phe Gln Tyr Phe Ser Leu Thr 335 340 ATTAAAATAT TAGTTCTTGA TTAGTTTTTA CTTACTTGAA AGGAGTGGCT TTTTTTTTAT 1277 AGTTTGATAA CTTTTTTTGC TTTCTTTCAA GTTTTTTTTA TATTTTGTTT TGTTTTGTAA 1337 AAAAAAAAAA AAAAAAAA 1355

【００２７】配列番号：8 配列の長さ：19 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセテイカル配列：NO アンチセンス：NO 配列の特徴： 1-19 E primer 配列： GCTGCTGATA TTACCGTTG 19

【００２８】配列番号：9 配列の長さ：19 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセテイカル配列：NO アンチセンス：NO 配列の特徴： 1-19 E primer 配列： GGATCTTCAT CTCAAGGTA 19

【００２９】配列番号：10 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセテイカル配列：NO アンチセンス：YES 配列の特徴： 1-20 E primer 配列： ACTACCACCG GCTTCATTGG 20

【００３０】配列番号：11 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセテイカル配列：NO アンチセンス：YES 配列の特徴： 1-20 E primer 配列： TAACCAACCC CTAAAATACC 20

【００３１】配列番号：12 配列の長さ：18 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセテイカル配列：NO アンチセンス：YES 配列の特徴： 1-18 E primer 配列： TGAAGTAGAA TCAACATC 18

【００３２】配列番号：13 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセテイカル配列：NO アンチセンス：NO 配列の特徴： 1-20 E probe 配列： TTGGATTTGG TGGTGTTTCG 20

【００３３】配列番号：14 配列の長さ：17 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセテイカル配列：NO アンチセンス：NO 配列の特徴： 1-17 E primer 配列： CARGCNGTNC CNGTNAC 17

【００３４】配列番号：15 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセテイカル配列：NO アンチセンス：NO 配列の特徴： 1-20 E primer 配列： CAYAAYGARC ARGTNACNTA 20

【００３５】配列番号：16 配列の長さ：20 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセテイカル配列：NO アンチセンス：NO 配列の特徴： 1-20 E probe 配列： GCNGCNGAYA THACNGTNGG 20

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:725）Ｃ１２Ｒ 1:725） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:725）Ｃ１２Ｒ 1:725）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者浅田起代蔵滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号寳酒造株式会社中央研究所内 (72)発明者山口英世神奈川県川崎市多摩区２丁目15番15号 (72)発明者加藤郁之進滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号寳酒造株式会社中央研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA13 CA09 HA14 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ07 QQ44 QR32 QR56 QR62 QS12 QS25 QS34 QX01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記（ａ）〜（ｆ）に記載の遺伝子から
選択されるカンジダ属酵母の分泌性酸性プロテアーゼを
コードする遺伝子にアニーリング可能なプライマー。（ａ）配列表の配列番号７で示されるアミノ酸配列をコ
ードする遺伝子、（ｂ）配列表の配列番号７で示される
アミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸残基
が欠失、付加、挿入若しくは置換の少なくとも１つがな
されているアミノ酸配列をコードする遺伝子、（ｃ）配
列表の配列番号１で示される塩基配列を有する遺伝子、
（ｄ）配列表の配列番号１で示される塩基配列におい
て、１個又は複数個の塩基が欠失、付加、挿入若しくは
置換の少なくとも１つがなされている遺伝子、（ｅ）上
記（ｃ）又は（ｄ）に記載の遺伝子に厳密な条件下でハ
イブリダイズする遺伝子、（ｆ）上記（ｃ）〜（ｅ）に
記載の遺伝子を含んでなる遺伝子、
【請求項２】配列表の配列番号８〜１２記載の少なく
ともいずれか１つで示される塩基配列を有することを特
徴とするプライマー。
【請求項３】請求項１又は２記載のプライマーを用い
て増幅されたＤＮＡを検出するためのプローブ。
【請求項４】配列表の配列番号１３記載の塩基配列を
有することを特徴とする請求項３記載のプローブ。
【請求項５】請求項１又は２記載のプライマー、及び
請求項３又は４記載のプローブを用いてカンジダ属酵母
を検出することを特徴とするカンジダ属酵母の検出方
法。
【請求項６】請求項５記載の方法に用いる検出キット
であって、少なくともカンジダ属酵母の分泌性酸性プロ
テアーゼ遺伝子を検出するためのプライマー又はプロー
ブを含有していることを特徴とするカンジダ属酵母の検
出キット。