JP3015969B2 - 扁平上皮癌関連抗原蛋白質及び該蛋白質をコードするｄｎａ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は扁平上皮癌関連抗原（以下、SCC抗原）蛋白
質及び該蛋白質をコードするDNA（又はDNA断片）に関す
る。詳しくは、子宮頸部の扁平上皮癌組織から抽出、精
製されたSCC抗原蛋白質をコードする遺伝子（cDNA）を
含有するDNA（又はDNA断片）に関する。

［従来の技術］ SCC抗原は、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
による分子量が約45,000の蛋白質であり、子宮頚部癌、
肺癌、食道癌などの扁平上皮癌組織あるいはそれらの転
移巣より抽出、精製される扁平上皮癌関連抗原である。
SCC抗原の測定は、扁平上皮癌の診断、予後推定、病状
管理を目的として免疫学的測定法によりなされている。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、SCC抗原を診断薬として使用する場合
には、多量のSCC抗原蛋白質を必要とするが、多量の抗
原蛋白質をヒトの癌細胞から精製することは必ずしも好
適な方法とは言えない。

また、核酸のハイブリダイゼーションによるSCC抗原
遺伝子の検出、さらには、組換えDNA技術によるSCC抗原
の生産には、SCC抗原蛋白質をコードする遺伝子断片の
収得が必須である。

［本発明の目的］ 本発明はSCC抗原蛋白質及び該蛋白質をコードする遺
伝子を提供するものである。

本発明により核酸ハイブリダイゼーションによるSCC
抗原蛋白遺伝子の検出が可能になると共に本発明を利用
して得られたSCC抗原は扁平上皮癌の診断試薬として、
あるいは免疫原として利用することができる。

特に、本発明のSCC抗原蛋白はセリン・プロテアーゼ
・インヒビター活性をもつことが明らかにされ、該SCC
抗原蛋白はセリン・プロテアーゼ・インヒビター活性を
もつ物質として、治療薬として産業上の利用可能性をも
つことが明らかにされた。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、SCC抗原蛋白質をコードする遺伝子を
初めて分離・収得するに至り、本発明を完成した。本発
明のSCC抗原蛋白質をコードする遺伝子は、例えば、次
のような方法によって得ることができる。

まず、SCC産生培養細胞である子宮頚部癌セルラインS
KG−III a［Cancer Res.43,p.1748−1760,1983］をグア
ニジンチオシアネートにより変性、ホモジナイズ後、Ch
irgwinらの方法［Biochemistry 18,p.5294−5299,197
9］に従って、塩化セシウム密度勾配遠心法によって全R
NAを沈殿として分離する。分離後、フェノール抽出、エ
タノール沈殿により全RNAを精製する。

本発明においては、mRNA採取源としては、上記細胞に
限定されず広くSCC産生細胞あるいは組織として知られ
ているものも、場合により利用できる。このような細胞
あるいは組織の例としては、扁平上皮癌あるいはそれか
ら誘導された培養細胞株などがあげられる。また、一旦
本発明のDNA配列が得られてからは、その原料細胞は特
に限定されない。

本発明においては、さらにまたこのようなDNAフラグ
メント及びcDNAライブラリーは、その遺伝子採取源細胞
から、市販のmRNA単離精製キット、DNA合成キット、DNA
クローニングシステムキットなどを適宜用いて行うこと
ができる。このような市販のものの例としては、例えば
RNA extraction kit（アマシャム社製）、Oligotex−dT
30（日本ロシユ社製）、cDNA合成システムプラス（アマ
シャム社製）、cDNAクローニングシステムλgt10（アマ
シャム社製）、GeneAmp ^TMDNA Amplification Reagent
キット（宝酒造社製）などがあげられるが、これらもの
に限定されない。

細胞内のmRNAの大部分は、その３′−末端にポリ
（Ａ）をもつので、オリゴ（dT）−セルロースカラムク
ロマトグラフィーによりrRNAなどのポリ（Ａ）をもたな
いRNAを除き、ポリ（Ａ）含有RNA（ポリ（Ａ）⁺RNA）を
分離しmRNAの原料とする。このmRNA原料から相補的DNA
（cDNA）をつくり、このcDNAよりPCR（Polymerase Chai
n Reaction）を利用してDNAフラグメントを得ると共
に、クローニングによりcDNAライブラリーを作製する。

作製されたcDNAライブラリーから目的とする、つまり
SCC抗原蛋白質をコードするDNA断片を含むクローンをス
クリーニングする。cDNAのスクリーニングは、部分的に
決定されているSCCのアミノ酸配列から適当な部分を二
箇所選び、それぞれに対する推定される全てのコドン配
列を化学合成してプライマーとし、得られたプライマー
及び前述のcDNAとを用いて、PCRを行い、DNAフラグメン
トを得る。得られたDNAフラグメントをT4ポリヌクレオ
チドキナーゼを用いてリン酸化後、M13ファージベクタ
ーに大腸菌JM109株を宿主として組換え、Sangerらの方
法［Pro.Natl.Acad.Sci.74,p.5463−5467,1977］に従っ
て塩基配列を決定し、部分的に予め決められたSCCのア
ミノ酸配列と一致するアミノ酸配列をコードするDNAフ
ラグメントを選び出す。このDNAフラグメントをプロー
ブとして前記cDNAライブラリーをさらにスクリーニング
し、クローンを得る。

これらを目的とするDNA配列の同定及びそのクローニ
ング、さらにはその配列の決定は、Maniatis等のMolecu
lar Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor
Laboratory,1982年に記載の各々の方法等及びそこに引
用された各種引用文献に記載された方法を参考にして行
うこともできる。

本発明においては、得られたクローンの塩基配列を決
定したところ翻訳開始部分が含まれていなかったため、
このクローンの５′側の塩基配列及びλgt10のEcoR I切
断部位の上流、下流各塩基配列に相当するユニークプラ
イマーを作製し、cDNAライブラリーから調製したDNAを
鋳型としてPCRを行い、DNAフラグメント クローンを得
た。

得られたクローンの塩基配列は、M13mp18及びmp19に
サブクローニングし、Sangerらの方法により決定され
る。

本発明においては、このようにして一旦得られたDNA
配列は、その配列をそのままあるいはそれを適当に修飾
して、各々の用途に使用することができる。このような
修飾方法としては、その塩基配列の切断、置換、欠失、
付加、連結などがあげられる。このような修飾方法の一
つとしては、好ましくは部位指定変異法、例えばLathe
r,R.F.およびLecoq,L.P.,Genetic Engineering,Academi
c Press,p.31−50（1983年）に述べられた方法を応用し
て行うこともできる。塩基配列の切断にあたっては、市
販されて入手可能な種々の制限酵素を用いて行うことが
できる。

本発明によって得られたDNA配列はその全部又は一部
を利用して、DNAプローブとして使用することも可能で
ある。DNAプローブとして用いる場合、適当な標識剤、
例えば放射性同位元素、酵素、蛍光剤、発色剤等で標識
することもでき、さらにそれら標識剤は適当なスペーサ
ーを介して付けられていてもよい。このようなDNAプロ
ーブとして用いられるDNA配列の代表的なものとして
は、実施例においてDNAライブラリー等のスクリーニン
グ等で使用された配列をあげることもできる。

本発明のDNA配列は、それを適当な発現ベクターに組
み込み、適当な宿主細胞に導入してそれを発現させるこ
とができる。このような発現ベクターとしては、大腸
菌、酵母、動物細胞用のそれぞれのベクターがあげられ
る。

本発明のDNAは、それを大腸菌で発現させると、モノ
クローナル抗体よりなるSCC測定用キット及びポリクロ
ーナル抗体を用いたウエスタンブロットで陽性反応及び
陽性バンドを示す蛋白質が得られる。本発明の扁平上皮
癌関連抗原蛋白質をコードする塩基配列を含んで成るDN
A断片を保持する大腸菌は、工業技術院微生物工業技術
研究所に、微工研菌寄第11871号（FERM Ｐ−11871）と
して寄託されている。こうして得られた蛋白質生成物
は、それを測定用抗原試薬、免疫原などに用いることが
可能である。

本発明のDNA配列によってコードされるアミノ酸鎖中
には、４箇所の糖鎖結合可能部位、すなわちアスパラギ
ン結合型糖鎖の結合し得る配列（Asn−Ｘ−Ser/Thr）が
存在することから、そのDNA配列を種々の宿主で発現さ
せることにより、多くの分子種蛋白質を得られる可能性
がある。またそのDNA配列でコードされるアミノ酸配列
を、コンピューターのデータベース（日立製;DNASIS）
により相同性の検索をしたところ、セリン・プロテアー
ゼ・インヒビター・ファミリー（Serine Protease Inhi
bitors Family:Serpins Family）と全体にわたって相同
性があることが判明しており、治療薬としての利用可能
性を有していることが確認された。

以上、本発明で得られたDNA配列あるいはそれに関す
る情報を利用してなさえた用途も、上記したような思想
の範囲で全て本発明に含まれるものであることは明らか
であろう。

［実施例］ 以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明する
が、本発明は、その要旨を越えない限り以下の実施例に
よって限定されるものではない。

実施例1.SCC産生培養細胞SKG−III aのcDNA及びcDNAラ
イブラリーの作製 （１）全RNAの抽出 SCC産生培養細胞SKG−III aを材料とし、RNA extrac
tion Kit（アマシャム社製）を使用して、RNAを抽出し
た。SCC産生培養細胞SKG−III a1.7×10⁸個を、キット
の溶液１（グアニジンチオシアネート,EDTA含有トリス
塩酸緩衝液 pH7.4）及び２−メルカプトエタノールを
加えた溶液１を用いて、ホモジネートした。40秒間超音
波処理した後、0.3倍量の−20℃エタノールを加え10,00
0×g,0℃,5分間遠心した。遠心後、蛋白質の膜及び上清
を除去した。ペレット状のRNA沈殿を２−メルカプトエ
タノールを含有している溶液１の10mlに再懸濁させ、再
度40秒間超音波処理した。処理後、約30mlの溶液２（リ
チウムクロライド水溶液）を加え、４℃で一晩放置した
後、４℃で10,000×ｇで90分間遠心後、表面の蛋白質の
膜及び上清を除去し、ペレット状のRNA沈殿に35mlの溶
液３（リチウムクロライド・ウレア水溶液）を加え、30
秒間ボルテックス処理した後、40℃の温浴に約45分間浸
し、さらに懸濁液を再度４℃,10,000×ｇで60分間遠心
後、表面の蛋白質の膜及び上清を除去し、ペレット状の
RNA沈殿に5mlの溶液４（RNA緩衝液）を加え、約２時
間，−20℃に放置した。

30秒間ボルテックス処理した後、40℃の温浴に約45分
間浸し、沈殿物を再懸濁させた。0.1Mトリス塩酸緩衝液
（pH7.4）飽和フェノール5mlを加え、10秒間ボルテック
ス処理した。さらに20分間ゆるやかに混和した後、室温
で15分間,8,500×ｇで遠心した。上層の液を採取し、こ
れに再度0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH7.4）飽和フェノー
ル5mlを加え、10秒間ボルテックス処理し、さらに20分
間ゆるやかに混和した後、室温で15分間8,500×ｇで遠
心した。上層の液を採取し、これに5mlのクロロホルム
液を加え、５秒間ボルテックス処理した。室温で10分間
8,500×ｇで遠心し、上層の液を採取した。体積比0.1の
2M酢酸ナトリウム（pH5.0）と２倍量のエタノールを加
え、−20℃で一晩沈殿させた。

４℃で30分間8,500×ｇでRNA沈殿を遠心し、上清を捨
て、−20℃の70％（v/v）エタノール溶液1mlを加え、8,
500×ｇで４℃,15分間遠心した。上清を除去し、RNAペ
レットを風乾し、1mlの滅菌水に溶解した。

これにより、全RNA366μｇを得た。

（２）ポリ（Ａ）⁺RNAの精製 次に、得られた全RNAからポリ（Ａ）⁺RNAをOligotex
−dT30（日本ロシユ社製）を使用して２回精製した。す
なわち、296μｇの全RNAをエタノール沈殿した後、1mM
EDTA,0.1％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）含有10mM
トリス塩酸緩衝液（pH7.5）800μｌに溶かし、65℃,5分
間加熱処理後、氷中で急冷した。5M塩化ナトリウム100
μｌを加え、200μｌ（4mg）のOligotex−dT30と混合し
た。混合液を37℃で５分間インキュベートした後、室温
で15,000rpm,10分間遠心し、上清を除去した。得られた
ペレットに1mM EDTA,0.1％SDS含有10mMトリス塩酸緩衝
液（pH7.5）1mlと、5M塩化ナトリウム液100μｌを加
え、ピペッティングでほぐし、均一な懸濁液とした。37
℃で５分間インキュベート後、室温で15,000rpm,10分間
遠心し、上清を除去した。得られたペレットに1mM EDT
A,0.1％SDS含有10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）800μｌ
を加え、65℃で５分間加熱処理を行い、15,000rpmで10
分間遠心し、上清を得た。この上清を65℃で５分間加熱
後、氷中で急冷した。5M塩化ナトリウムを100μｌ加
え、200μｌ（4mg）のOligotex−dT30と混合した。混合
液を37℃で５分間インキュベートした後、室温で15,000
rpm,10分間遠心し、上清を除去した。得られたペレット
に1mM EDTA,0.1％SDS含有10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.
5）1mlと、5M塩化ナトリウム液100μｌを加え、ピペッ
ティングでほぐし、均一な懸濁液とした。37℃で５分間
インキュベート後、室温で15,000rpm,10分間遠心し、上
清を除去した。得られたペレットに1mM EDTA,0.1％SDS
含有10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）800μｌを加え、65
℃で５分間加熱処理を行い、15,000rpmで10分間遠心
し、上清を得た。等容量のフェノール・クロロホルム
（1:1、v/v）混合液で抽出後、エタノール沈殿した。得
られたペレットを100μｌの3M酢酸ナトリウム（pH5.6）
に溶解し、200μｌのエタノールを加え、−80℃に30分
間放置した。４℃で15,000rpm,10分間遠心分離を行い、
ポリ（Ａ）⁺RNAのペレットを得た。ペレットを70％エタ
ノールで洗浄後、ペレットを乾燥させ、10μｌの滅菌水
に溶解した。

これにより、3.6μｇのポリ（Ａ）⁺RNAを得た。

（３）cDNAの合成 ポリ（Ａ）⁺RNAからオリオ（dT）プライマーを用い
て、cDNA合成システム・プラス（アマシャム社製）を使
用し、cDNAを合成した。

氷浴中、５×ファーストストランド合成反応用緩衝液
４μl,ピロリン酸ナトリウム溶液１μl,ヒト胎盤リポヌ
クレアーゼインヒビター１μl,デオキシヌクレオシド三
リン酸混液２μl,オリゴ（dT）プライマー１μl,mRNA1
μｇ及び滅菌水を加え、全量が19μｌとなるようにし、
静かに混和、エッペンドルフ遠心器で数秒間遠心した。
逆転写酵素（20単位／μｌ）１μｌを添加し、静かに混
和後、42℃で40分間インキュベートした。反応チューブ
を氷浴中に戻し、セカンドストランド合成反応用緩衝液
37.5μl,大腸菌リボヌクレアーゼH0.8単位，大腸菌DNA
ポリメラーゼI23単位及び滅菌水を加え99.5μｌとし、
静かに混和後、12℃で60分間、次いで22℃で60分間反応
させた。さらに70℃で10分間インキュベートした後、エ
ッペンドルフ遠心器で数秒間遠心した。氷浴中に戻し、
T4DNAポリメラーゼ2.0単位を添加し、静かに混和後、37
℃で10分間反応させた。

４μｌの0.25M EDTA（pH8.0）を加えて反応を停止さ
せ、104μｌのフェノール／クロロホルム（1:1,v/v）を
加え、ボルテックスミキサーを用いて激しく混和、エマ
ルジョンとした。エッペンドルフ遠心器で１分間遠心
し、２層に分離した。中間層を取らないように注意しな
がら水層（上層）を取り、もう一度104μｌのフェノー
ル／クロロホルム液を加え、ボルテックスミキサーを用
いて激しく混和、エマルジョンとした後、エッペンドル
フ遠心器で１分間遠心し、２層に分離した。水層（上
層）を取り、104μｌのクロロホルムを加え、よく混和
した。エッペンドルフ遠心器で数秒間遠心し、水層（上
層）を採取した。104μｌの4M酢酸アンモニウム溶液を
加え、さらに−20℃に冷やしたエタノール416μｌを加
え、ドライアイス上に15分間放置した。

静かに混ぜながら室温に戻し、エッペンドルフ遠心器
で10分間遠心した。cDNAペレットを舞い上げないように
注意して上清を除き、50μｌの2M酢酸アンモニウム、次
いで100μｌエタノール（−20℃）を加え、室温で静か
に混和後、遠心して上清をアスピレーションで除去する
ことにより洗浄した。ペレットを乱さないように200μ
ｌのエタノール（−20℃）を加え、室温で静かに混和
後、遠心して上清をアスピレーションで除去することに
より洗浄した。200μｌのエタノール（−20℃）を静か
に加え、エッペンドルフ遠心器で２分間遠心した。注意
深く上清を取り除き、cDNAペレットを乾燥後、1mM EDT
A含有10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）10μｌに溶解させ
た。

これにより、１μｇのポリ（Ａ）⁺RNAから1.2μｇのc
DNAがつくられた。

（４）cDNAライブラリーの合成 cDNAライブラリーは、cDNAクローニングシステムλgt
10（アマシャム社製）を用いて合成した。

すなわち、720ngのcDNAにL/K緩衝液２μl,EcoR Iアダ
プター2.5μｌ及び滅菌水を加え全量を18μｌとし、静
かに混和し、微量遠心器で数秒間遠心した。２μｌのT4
DNAリガーゼ（５単位）を加え、静かに混和し、15℃で2
0時間反応させた。２μｌの0.25M EDTAを加え、反応を
停止させ、微量遠心器で数秒間遠心した。EcoR Iアダプ
ターが結合したcDNAをキット中に添付されているカラム
にかけ、サイズフラクショネーションし、選択プールと
すると共に、未反応のアダプターを除去した。得られた
選択プール900μｌとL/K緩衝液100μｌ及びT4ポリヌク
レオチドキナーゼ10μｌ（80単位）を加え、37℃で30分
間インキュベートした。リン酸化反応後、等量のフェノ
ール／クロロホルム（1:1,V/V）による抽出及びクロロ
ホルム／イソアミルアルコール（24:1）による抽出を各
２回行った。各抽出は軽くボルテックスし、微量遠心器
で１分間遠心、下層の有機溶媒を除き、上層の水層を残
した。水層に、2.2容のブタノールを加え、激しく振盪
し、二層に分離させて、上層のブタノールを除いた。さ
らにもう一回ブタノール抽出を行い、cDNA溶液を濃縮し
た。上層のブタノール層を除き、水層に1/10容の3M酢酸
ナトリウムと２倍量のエタノールを加え、よく混和後、
−20℃に一晩放置した。微量遠心器で30分間遠心後、上
清を除いた。0.5mlの氷冷した70％エタノールを加え、
軽くボルテックスした後、微量遠心器で５分間遠心し、
上清を除いた。cDNAペレットを乾燥させた後、約20ng/
μｌの濃度になるように1mM EDTA含有10mMトリス塩酸
緩衝液（pH7.5）に溶解した。

リン酸化されたcDNA25ng,λgt10アーム２μｌ（１μ
ｇ）,L/K緩衝液１μｌ及び滅菌水を全量が９μｌとなる
ように氷浴上で加え、静かに混和し、微量遠心器で数秒
間遠心した。T4DNAリガーゼ１μｌ（2.5単位）を静かに
混和後、15℃水浴で20時間インキュベートした。微量遠
心器で数秒間遠心してチューブの底に反応液を集め、ラ
イゲーション反応液の全量10μｌをin vitroパッケージ
ングし、50万個のcDNAライブラリーを作製した。

実施例2.SCC cDNAのスクリーニング 部分的に決定されているSCCのアミノ酸配列から２箇
所選び（表１ 下線部）、それぞれにおいて全ての可能
なコドン配列に対する自己相補的な17塩基から成るミッ
クスプライマー（プライマー1,2及びプライマー3,4）を
DNA合成装置（ABI社;381A）を使用して作製した。ここ
でプライマー2,3はアンチセンス鎖、プライマー1,4はセ
ンス鎖の配列に一致するミックスプライマーである（表
２）。ただしプライマー1,2においては、縮重（degener
acy）を少なくするためにAsnのコドン（AAC/U）をAACと
規定した。プライマー１（100pmol）とプライマー３（1
00pmol）又はプライマー２（100pmol）とプライマー４
（100pmol）及びDNAポリメラーゼ2.5単位（AmpliTaq;宝
酒造社製）を用い、cDNA（100ng）を鋳型として、50mM
塩化カリウム、10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、1.5mM
塩化マグネシウム、0.01％（W/V）ゼラチン、200μM dA
TP,dGTP,dCTP,dTTPの終濃度でPCR 30サイクル（変性94
℃,1分、アニーリング37℃,1.5分、伸長反応72℃,3分）
を行った。さらにPCRで産生されたDNAの10分の１量を同
じプライマーを用いてPCR 25サイクル（変性94℃,1
分、アニーリング55℃、1.5分、伸長反応72℃,3分）を
行い、そのPCR産生全量を５％ポリアクリルアミドゲル
で電気泳動を行った結果、プライマー１と３の組合せで
190bp（base pair）から580bpの９本のDNAフラグメント
を得た。

これらのDNAフラグメントを含む各ゲルを回収し、2.5
mlの注射器を通してゲルを潰し、1mM EDTA含有10mMトリ
ス塩酸緩衝液（pH7.5）1mlを加え、37℃で一晩インキュ
ベートした後、シリコナイズ綿を通して濾過したものを
エタノール沈殿した。沈殿物を10μｌの滅菌水に溶解
後、このうちの７μｌを２μｌの５×リガーゼ緩衝液
［330mMトリス塩酸緩衝液（pH7.6）,33mM塩化マグネシ
ウム,50mM DTT,0.5mM ATP］及び１μｌ（１単位）のT
4ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）と共に37℃
で１時間インキュベートしてリン酸化した。これをHinc
IIで切断したM13mp18（1.4μｇ）とDNA Ligation Kit
（宝酒造社製）を使用して連結し、Sangerらの方法で塩
基配列を決定した結果、194bpからなるDNAフラグメント
でコードされるアミノ酸配列が、部分的に決められたSC
Cのアミノ酸配列と一致した。この194bpのDNAフラグメ
ントをMultiprime DNA labelling systems（アマシャム
社製）を使用して、Feinberg and Vogelsteinの方法に
より³²P標識（比活性;8.8×10⁸cpm/μｇ）し、プローブ
として用いて２×10⁵個のcDNAライブラリーを以下の方
法でスクリーニングした。

プレート上のプラークをナイロンフィルター（Hybond
N;アマシャム社製）に移した後、３×SSC（0.15M塩化ナ
トリウム,0.015Mクエン酸ナトリウム）、0.1％SDSで65
℃,3時間プレウォッシュし、50％オルマミド、５×Denh
ardt液（0.02％Ficoll,0.02％ウシ血清アルブミン,0.02
％ポリビニルピロリドン）、0.1％SDS、５×SSEP［0.18
M塩化ナトリウム,0.01Mリン酸ナトリウム（pH8.0）,1mM
EDTA］及び熱変性サケ精子DNA溶液100μg/ml中で37
℃,7時間プレハイブリダイゼーションした。ハイブリダ
イゼーションは、³²P標識したプローブの存在下、プレ
ハイブリダイゼーションと同じ条件で15時間行った。続
いてフィルターを２×SSC,0.1％SDS中で室温にて１時
間,0.1×SSC,0.1％SDS中で50℃にて30分間ウォッシュ
し、−80℃で一晩オートラジオグラフィーを行った。こ
の結果１個の陽性クローン（λSCC1,1.6kb）を得た。

この陽性クローンよりファージDNAを回収し、制限酵
素地図を作製した。制限酵素（Taq I,EcoR I,Hind III,
Pst I,Sph I）を使用して、陽性クローンDNAを切断し、
M13mp18,19ベクターにサブクローニングし、塩基配列を
決定したところ翻訳開始部分が含まれていなかったた
め、このクローンの５′側の塩基配列（５′末端から37
9塩基から399塩基までのセンス鎖）及びλgt10ベクター
のEcoR I切断部分の上流（切断点より上流52塩基から33
塩基まで）、下流（切断点より下流35塩基から12塩基ま
で）各塩基配列に一致するユニークプライマー（プライ
マー5,7,8）を作製し（表２、３）、プライマー７又は
８（100pmol）、プライマー５（100pmol）、DNAポリメ
ラーゼ2.5単位（AmpliTaq;宝酒造社製）を用い、cDNAラ
イブラリーから調製したDNA（100ng）を鋳型として、50
mM塩化カリウム、10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、1.5
mM塩化マグネシウム、0.01％（W/V）ゼラチン、200μMd
ATP,dGTP,dCTP,dTTPの終濃度でPCRを30サイクル（変性9
4℃,1分、アニーリング50℃,2分、伸長反応72℃,3分）
行い、３％NuSieve GTGアガロース（FMC Bio Product社
製）でPCR産物を電気泳動したところプライマー５とプ
ライマー７より約510bpからなるフラグメントを得た。P
CRの特異性を高めるために、プライマー５がハイブリダ
イゼーションする位置の上流（λSCC1の５′末端より28
7塩基から307塩基までのセンス鎖）に一致するユニーク
プライマー（プライマー6,表２）を作製し、プライマー
６とプライマー７を用いNuSieveアガロースよりGENECLE
AN II kit（BIO 101社製）で回収した510bpのDNAフラグ
メント（10ng）を鋳型として、上記と同じ条件でPCRを
行い、約420bpのフラグメントを得た。

切断サイトをプライマーに付加してあったXba I及びS
ac Iで消化後、M13mp18及びM13mp19のXba I,Sac Iサイ
トに接続し増幅されたcDNAの塩基配列（pcSCC2）を決定
したところ、λSCC1とpcSCC2は307bpにおいて重複して
いた。SCC cDNAの62番目から1711番目まで（表４にお
ける塩基配列の番号62から1711まで）の部分を大腸菌発
現用ベクターPKK233−２に組み込んだ発現プラスミドPK
K SCC1を保持した大腸菌株は、工業技術院微生物工業技
術研究所に、微工研菌寄第11871号（FERM Ｐ−11871）
として寄託されている。

第１図にSCC cDNAクローンの制限酵素地図及び塩基
配列決定の方向と長さを示した。この結果、表４に示す
SCC cDNAの塩基配列（1693bp,ポリ（Ａ）テイル配列を
省く）及びそれから推定されるアミノ酸配列（390アミ
ノ酸）が決定された。このアミノ酸配列は、部分的に決
定されているフラグメントのアミノ酸配列と一致した。
しかしフラグメント13のみ一致しなかった（フラグメン
ト13と連続５アミノ酸分、配列が一致するところが113
−117アミノ酸に存在する）。

また、250番目のアミノ酸はアミノ酸解析で決定され
ていたものと異なっていた（Gln→Glu）。

決定された塩基配列内に４箇所アスパラギン結合型糖
鎖の結合し得る配列（Asn−Ｘ−Ser/Thr）が認められ
た。また、アミノ酸配列をコンピューターのデータベー
スによりその相同性を検索したところ、セリン・プロテ
アーゼ・インヒビター・ファミリー（Serine Protease
Inhibitors Family;Serpins）と全体にわたって相同性
があることが判明し、SCC抗原蛋白質がセリン・プロテ
アーゼ・インヒビター活性を有する物質として治療薬と
して使用できる可能性をも有していることが確認され
た。

実施例3.サザーンブロッテイング解析による人ゲノムDN
AにおけるSCC遺伝子の同定 本発明で得られたDNA配列の一部を用いてサザーンブ
ロッテイング法によりSCC遺伝子の解析を行った。すな
わち、高分子人ゲノムDNAを末梢血白血球より得、10μ
ｇのDNAを制限酵素で切断後フェノール処理、エタノー
ル沈殿しTE緩衝液（1mM EDTA含有10mMトリス塩酸緩衝
液pH7.5）に溶かした後0.8％アガロースゲルで電気泳動
した。ナイロンフィルター（HybondN⁺;アマシャム社
製）に0.4M水酸化ナトリウムでアルカリブロッテイング
した後、フィルターは50％ホルマミド,5×Denhart（0.1
％Ficoll,0.1％ウシ血清アルブミン,0.1％ポリビニルピ
ロリドン）,5×SSPE（0.9M塩化ナトリウム,0.05Mリン酸
ナトリウム,5mM EDTA pH8.0）,0.5％SDS,20μg/mlサ
ケ精子DNA中で37℃で４時間プレハイブリダイゼーショ
ンした。λSCC1をpUC118のEcoR Iサイトにサブクローニ
ングし、Sph Iフラグメント（1436bp）をFeinberg and
Vogelsteinの方法にてラベルして加え（比活性;6.6×10
⁸cpm/μｇ）、37℃で24時間ハイブリダイゼーションし
た。２×SSPE,0.1％SDS（37℃）で20分間２回洗い、−8
0℃で一晩オートラジオグラフィーしたところ、１又は
２本の濃いバンドを認めた。そこで、0.1×SSPE,0.1％S
DS（37℃）で30分間２回洗浄し、オートラジオグラフィ
ーにかけたが、１又は２本のそのバンドのパターンは変
化しない（第２図）ことから、SCC遺伝子は１コピーの
みであり、他に類縁の遺伝子はないと考えられる。

次に部分的に決定されているSCCのアミノ酸配列を示
す（表１）。下線はプライマー1,2（フラグメント1
9）、プライマー3,4（フラグメント21−１）に相当する
配列であり、Ｘは未確認のアミノ酸を、（）は推定され
るアミノ酸を示している。

表２は、PCR用オリゴデオキシヌクレオチドプライマ
ーを示したものである。プライマー1,4は表１の下線部
分のアミノ酸配列から推定されるセンス鎖側、プライマ
ー2,3はアンチセンス鎖側の配列と一致するミックスプ
ライマーである。プライマー5,6はλSCCC1の５′側の塩
基配列に、プライマー7,8はλgt10ベクターのEcoR I切
断部分の上流，下流各塩基配列にそれぞれ一致するユニ
ークプライマーであり、プライマー5,6にはXba Iサイト
を、プライマー7,8にはSac Iサイトをそれぞれ５′側に
加えた。

表３に、λgt10ベクターのEcoR I切断部分及びプライ
マー7,8がハイブリッドする部分を示した。

表４は、SCC cDNAの塩基配列と推定されるアミノ酸
配列を示したものである。pcSCC2は上段の番号１から37
0まで、λSCC1は64から1711までである。アミノ酸配列
を塩基配列の下に示した。矢印は５′側より順にプライ
マー6,5,3,1の位置である。四角で囲った部分は部分的
に決定されているSCCのアミノ酸配列に一致する部分
（Ｎ末端側より順にフラグメント21−２＝26,10,21−1,
19）である。点線はアスパラギン結合型糖鎖の結合され
得る配列（Asn−ｘ−Ser/Thr）に一致する場所を示す。
また二重下線はポリ（Ａ）シグナルを表す。

［発明の効果］ 大腸菌、哺乳動物細胞等の公知の宿主を用いて、本発
明の扁平上皮癌関連抗原（SCC抗原）蛋白質をコードす
る遺伝子を発現させ、SCC抗原を大量に得ることができ
る。同抗原及び同抗原から得られる抗体は、免疫学的方
法によるSCC抗原の測定に使用される。

また、本発明のSCC抗原蛋白質をコードする遺伝子
は、核酸ハイブリダイゼーションによるSCC抗原蛋白質
遺伝子の検出のためのプローブとして有用である。

特に、本発明のSCC抗原蛋白質はセリン・プロテアー
ゼ・インヒビター活性をもつ治療薬としての信頼性の高
い利用可能性をもつ。

【図面の簡単な説明】

第１図は、λSCC1とpcSCC2の制限酵素地図を示したもの
である。左側が５′端、右側が３′端で、boxは翻訳領
域を表し、水平ラインは非翻訳領域を表す。垂直ライン
はDNAの切断に利用した制限酵素部位を表す。矢印はシ
ークエンスの領域と方向を示す。略字はT:Taq I,E:EcoR
I,H:Hind III,P:Pst I,S:Sph I 第２図は、サザーンブロッテイング法により人ゲノムDN
AにおけるSCC遺伝子の同定を行ったオートラジオグラフ
ィーのバンドを示したものである。

フロントページの続き (72)発明者 武田 克道 千葉県松戸市稔台344 ダイナボット株 式会社総合研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎｅＳｅｑ

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】扁平上皮癌組織由来であり且つ下記のアミ
   ノ酸配列であらわされる扁平上皮癌関連抗原蛋白質。 （式中、X1はClu又はGlnである）
2. 【請求項２】下記のDNA配列であらわされる請求項１記
   載のアミノ酸配列をコードするDNA。 （式中、ＹはＧ又はＣであり、「・」はその上に示され
   た塩基に相補的な塩基を表わす）