JPH10502529A - 血小板−内皮細胞接着性分子−１製剤及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒト血小板−内皮細胞接着性分子−１の新規で実質的に単離されたイソ型、この新規なイソ型及び明らかに同定された可溶性のイソ型などの他のイソ型をコードする転写産物をコードするＤＮＡ、このようなＤＮＡを用いてそのＤＮＡを発現させることによってイソ型を調製する方法、及びヒト血小板−内皮細胞接着性分子−１遺伝子の転写を制御するプロモーターセグメントが提供される。この新規なイソ型は、充分な長さの分子に対する遺伝子のエキソン１０〜１５によってコードされたＣ−末端近くの一個あるいはそれ以上のセグメントを欠如している点で完全なヒト血小板−内皮細胞接着性分子−１とは異なっており、その遺伝子から得られる転写産物を別のスプライシングを行うことでin vivoで生成する。

Description

【発明の詳細な説明】 血小板−内皮細胞接着性分子−１製剤及び方法技術分野 本発明は、「血小板−内皮細胞接着性分子−１」と言われ、また略して「ＰＥ ＣＡＭ−１」とよく言われる、あるタイプのヒトタンパク質分子に関する。ＰＥ ＣＡＭ−１は、血管壁にある内皮細胞の表面に存在するだけでなく、血液内の血 小板及び白血球の表面にも存在することが知られている。このタンパク質は、こ れらのタイプの細胞がもう一つの細胞に接着する際、またこのような接着が行わ れる工程に関与している。このタンパク質自体は、血管系が関与する種々の症状 、例えば多くの損傷や疾患、即ちアテローム性動脈硬化症や血管形成術によって 引き起こされる傷害に関連して起こる、炎症などの症状に関与している。 さらに特定すると本発明は、血小板−内皮細胞接着性分子−１（ＰＥＣＡＭ- １）の「イソ型」として知られているある新規な異性体に関する。これらのイソ 型は、ＰＥＣＡＭ−１に対する遺伝子の詳細な構造及び機構を決定する際に予期 せず発見されたものである。本発明はまた、本発明のイソ型をコードする新規な ＤＮＡ、本発明のイソ型を調製するために用いることのできる発現ベクター、及 びヒトの血小板−内皮細胞接着性分子−１をコードする遺伝子からその分子がin vivoで発現するのを制御する新規なプロモーターセグメントにも関する。発明の背景 完全な長さの成熟した血小板−内皮細胞接着性分子−１（ＰＥＣＡＭ−１）は 、７１１個のアミノ酸で約１３０キロダルトンの分子量を持つ、グリコシル化さ れたタンパク質である。このタンパク質は免疫グロブリンスーパーファミリーの 一つである。これらは血小板上の休止している内皮細胞の細胞間連結部や、循環 血液中の単核球、顆粒球、及びＴ細胞のうちのある種のもので発現される。Newm an et al．(I)(1990)Science 247，1219-1222、Muller et al．(I)(1989)J. Exp . Med．170, 399-414、Albelda, et al．(I)(1990)J. Cell. Biol．110，1227-1 237、Ashman and Aylett（1991）Tissue Antigens 38，208-212を参照のこと。 分子をクローニングする研究よりＰＥＣＡＭ−１には、６個の細胞外のＩｇ− 様ドメインと、短い膜貫通領域と、比較的長い１１８個のアミノ酸（ａａ）から なり、リン酸化、脂質による修飾、及び翻訳後の他の修飾を受ける可能性のある 多くの部位を含む細胞質のテール部分とを有していることがわかっている。Newm an et al．(I), 前出、及びNewman, United States Patent No. 5,264,554('554 特許)を参照のこと。 三つの完全な長さで成熟したＰＥＣＡＭ−１は先行技術においても見いだされ ている。'554 特許でNewmanは、これらのＰＥＣＡＭ−１のうちの一つであって 、'554特許の図１に示されているアミノ酸配列を持つ「１型」として本明細書に おいて設計されたものを明らかにした。もう一つの本明細書において「２型」と して設計されたものは、Stockinger et al．(1990)J．Immunol．145，3889-3897 に記載されているアミノ酸配列を持っている。「３型」として本明細書において 設計された３番目のものは、Zehnder et al．(1992)J．Biol．Chem．267，5243- 5249に記載されているアミノ酸配列を持っている。これらの参照文献では、それ ぞれの型のものをコードするｃＤＮＡ配列も明らかにしている。 アミノ酸配列及び遺伝子配列の部分が以下の配列番号：３〜配列番号：１１で 提供される４番目の型「４型」は、５３６番目（'554特許の図１に付与されてい る番号で）のアミノ酸としてセリンではなくアスパラギンを有しており、これは 、'554特許の図１に記載されたｃＤＮＡ配列において１８２９番目のヌクレオチ ド（以下の配列番号：３では１９６番目のヌクレオチドに対応する）が２’−デ オキシグアニレート（Ｇ）から２’−デオキシアデニレート（Ａ）に変わったこ とに起因している。Stockinger et al．(1990)，前出、によって報告されている 配列も、ｃＤＮＡの１８２９番目のヌクレオチドがＧではなくＡを持っているた めに５３６番目のアミノ酸がアスパラギンになっている。配列番号：３〜配列番 号：１１に示されたｃＤＮＡ配列に関しては、'554特許の図１に示されたｃＤＮ Ａ配列とはもう一つの違いがある。即ち配列番号：１１で３’末端の翻訳されな い配列に存在する１０８番目の塩基は、'554特許の図１に示されているように２ ’−デオキシアデニレートではなく２’−デオキシグアニレートである。この１ ０８番目の塩基は、'554特許の図１に示されたｃＤＮＡ配列における２４１６番 目の塩基に対応する。 また、ＰＥＣＡＭ−１に対するｃＤＮＡに存在する数個のヌクレオチド部分で サイレント置換（アミノ酸の変化を生じない置換）が見いだされている。'554特 許の図１に記載されたｃＤＮＡ配列に関して言うと、このようなサイレント置換 は、アミノ酸のコード領域にある１５９３番目と、上記に記載したように３’− 非翻訳領域にある２４１６番目（以下の配列番号：１１においては１０８番目の ヌクレオチドに対応する）に見られる。この点に関してはNewman et al．(I)， 前出、Stockinger et al.，前出、Zehnder et al.，前出、及び'554特許を参照 のこと。 それから明らかに、たくさんの非常に同一性の高いＰＥＣＡＭ−１遺伝子ＤＮ Ａの対立遺伝子が、ヒトの遺伝子プールに存在している。 ＰＥＣＡＭ−１の多型は、細胞質ドメイン、即ち５９４−７１１番目のアミノ 酸におけるアミノ酸置換について、これまでに全く見いだされていない。 完全な長さで成熟したＰＥＣＡＭ−１の分子量よりも小さい、約６，０００と ９，０００ダルトンの間の分子量を持つ可溶性のＰＥＣＡＭ−１がこれまでに同 定されている。Goldberger et al.，Blood 80，266a(1992)参照のこと。 ＰＥＣＡＭ−１は、例えば血管形成術あるいは同様の工程によって生じる可能 性のある、血管外傷の結果として起こる血小板の凝集、アテローム性動脈硬化症 のプラークの発生、及び血栓の形成において関与する血小板−血小板、血小板− 白血球、及び血小板−内皮細胞の相互作用における重要な媒体である。ＰＥＣＡ Ｍ−１はまた、内皮細胞を通過する移動のような工程で、また炎症などの関連の ある現象で起こる白血球−内皮細胞相互作用においても関与している。Muller e t al．(II)(1993)J. Exp. Med．178, 449-460及びVaporciyan et al．(1993)Sci ence 262，1580-1582には、好中球の補充および内皮細胞を通過する移動を妨害 する、ＰＥＣＡＭ−１特異性抗体の使用方法について記載されている。ＰＥＣＡ Ｍ−１がこれらの細胞の相互作用を仲介するメカニズムは複雑であり、そのとき ＰＥＣＡＭ−１はホモ親和性に（ＰＥＣＡＭ−１分子に結合するＰＥＣＡＭ−１ ）、即ちAlbelda et al．(II)(1991)J．Cell．Biol．114，1059-1068に記載され ているように、またヘテロ親和性に（ＰＥＣＡＭ−１分子以外の分子に結合する ＰＥＣＡＭ−１）、即ちMuller et al.(III)(1992)J. Exp. Med. 175, 1401-1 404及びDeLisser et al．(1993)J．Biol．Chem．268，16037-16046に記載されて いるように、接着機能を行うために相互作用することができる。 ＰＥＣＡＭ−１分子の細胞質ドメインは、成熟分子の５９４−７１１番目のア ミノ酸からなる１１８個のＣ−末端アミノ酸である。このドメインはＰＥＣＡＭ −１の接着剤としての性質を調節する、重要な役割を果たしている。組換えＰＥ ＣＡＭ−１構築物においてＣ−末端のタンパク質が除去されると、その分子がヘ テロ親和性リガンド−結合特異性からホモ親和性リガンド−結合特異性に変換す ることがわかっている。この点に関してはDeLisser et al．(II)(1994)J．Cell ．Biol．124，195-203参照のこと。細胞質ドメインはリン酸化や脂質による修飾 を行うための部位を持っており、細胞骨格と相互作用する。Newman et al．(II) (1992)J．Cell．Biol．119，239-246(1992)、Zehnder et al.，前出参照。細胞 質ドメインの修飾は、ＰＥＣＡＭ−１の細胞外ドメインにおける接着剤としての 特徴だけでなく、細胞より小さいものの分布や細胞内のシグナル分子との相互作 用、また細胞間でのシグナル変換に関与する能力に影響を与える。発明の概要 本発明は、ヒトの血小板−内皮細胞接着性分子−１（「ＰＥＣＡＭ−１」）が 発現する染色体１７の短腕から得られるヒトゲノムＤＮＡの機構及び構造の研究 に基づく。 この研究で、ＰＥＣＡＭ−１に対する遺伝子が１６個のエキソンを含んでいる ことが発見された。予期しなかったことに、異常に多くのエキソン、即ち１０− １６個のエキソンのうち７個のエキソンがＰＥＣＡＭ−１分子の「細胞質のテー ル部分」に対してコードされたところに含まれていること、またアミノ酸配列が 異なった細胞質のテール部分を持つＰＥＣＡＭ−１の他の型（「イソ型」）が、 ＰＥＣＡＭ−１遺伝子の転写産物をディファレンシャルスプライシングして生じ ることを発見した。このディファレンシャルスプライシングは、１０−１５個の エキソンのうちの一個またはそれ以上に対応する転写配列の部分を、そのタンパ ク質を生成するために翻訳されるｍＲＮＡから結果的に除外する。その結果、異 なるｍＲＮＡが、異なる細胞質のテール部分を持つＰＥＣＡＭ−１のイソ型をコ ードする。したがって本発明は、細胞質のテール部分が異なるＰＥＣＡＭ−１の 実質的に単離されたイソ型を提供する。 この研究ではまた、ＰＥＣＡＭ−１遺伝子におけるエキソン９がかりにｍＲＮ Ａに存在している場合に、細胞膜に係留するタンパク質のドメインを生成する部 分の転写配列を提供できることも見いだした。またエキソン９に対応する転写配 列は、ＰＥＣＡＭ−１のイソ型をコードするｍＲＮＡからディファレンシャルス プライシングをすることによって、それ単独で、あるいはエキソン１０−１５に 対応する一個またはそれ以上の転写配列とともに除外することができる。実際に 、Goldberger et al.，前出によって報告された可溶性のＰＥＣＡＭ−１が、エ キソン９によってコードされる転写配列を欠いたｍＲＮＡから得られることを、 本発明の一部分として発見した。 本発明の他のイソ型は、それらが細胞膜にＰＥＣＡＭ−１やそのイソ型を係留 するのに必要なセグメントのアミノ酸を欠いているために、可溶性となるのであ ろう。これらの他のイソ型は、遺伝子のエキソン１０−１５のうち一個またはそ れ以上に対応するＰＥＣＡＭ−１遺伝子の転写配列の一部分を欠いているだけで はなく、エキソン９に対応する即ち下記の配列番号：４に示されているエキソン の、少なくとも４４−１００塩基に対応する転写配列の部分も欠いているｍＲＮ Ａからコードされた型を含んでいる。この遺伝子のエキソン１０−１５のうちの 一個またはそれ以上のエキソンと、この遺伝子のエキソン９とに対応する転写配 列の一部分のイソ型をコードするｍＲＮＡを欠如したものに対応するイソ型は、 ディフアレンシャルスプライシングによって生成される。この遺伝子のエキソン １０−１５のうちの一個またはそれ以上と、配列番号：４に示されているような 、エキソン９の塩基４４−１００に対応する転写配列の一部分のイソ型をコード するｍＲＮＡが欠如したものに対応するイソ型は、本発明のすべてのイソ型が同 様に、そのイソ型をコードするｍＲＮＡに転写される配列を持つｃＤＮＡを発現 させることによって作製することができる。 さらに本発明にかかる研究では、ＤＮＡセグメント（「プロモーターセグメン ト」）が、ＰＥＣＡＭ−１に対する遺伝子の転写の開始及び調節を行う際の、プ ロモーターとして働くことが発見された。これらのプロモーターセグメントは、 実質的に脈管構造の細胞においてのみ、特定するとＰＥＣＡＭ−１が正常に発現 する血管内皮細胞、白血球、あるいは血小板前駆体（例えば巨核球）において、 転写の開始を操作しやすいようにＤＮＡに結び付き、そのＤＮＡの転写を可能に する。このようにプロモーターセグメントは、目的とするタンパク質（可能性と しては完全な長さのＰＥＣＡＭ−１自体を含む）を生成する遺伝子の発現、ある いは目的とするアンチセンスＲＮＡを製造するＤＮＡの転写を、これらのタイプ の細胞で制限するために用いられる。 本発明の他の観点は、詳細な説明及び請求の範囲において以下にさらに充分に 説明されており、それは本発明のイソ型、そのイソ型をコードする転写配列をコ ードするＤＮＡセグメント、及び本発明のプロモーターセグメントの発見に基づ く。配列表に示された配列の詳細な説明 配列番号：１は、ヒトの血小板−内皮細胞接着性分子−１に対する遺伝子につ いての本発明の基礎となる研究で決定された、４９２塩基対からなる初めの配列 （即ち、５’−最端の配列、言い換えると最も「上流」の配列）である。４９２ 塩基対は、この遺伝子の第１番目のエキソンの最も頻繁に用いられる最初の（即 ち、５’−最端の、言い換えると最も「上流」の）塩基対についての研究で決定 されたもののすぐ前にある。配列番号：１の配列を持つＤＮＡセグメントは、本 発明のプロモーターセグメントである。 配列番号：２は配列番号：１から２５９−４９２離れたところの塩基対の配列 である。配列番号：２の配列を持つセグメントの数個のサブセグメントは、プロ モーターに発生する配列特性のあるシス作用エレメントを備えている。したがっ て配列番号：２の塩基対１−７は、急性期の反応物に関連するプロモーターで生 じるセグメントの配列を持っており、配列番号：２の塩基対１４−２２は、サイ トカインによって調節される転写活性のあるプロモーターに生成する転化してＮ Ｆ−κＢ部位になる配列を持っており、配列番号：２の塩基対４６−５２及び塩 基対１８７−１９１は、ポリオーマウイルスのエンハンサーＡ−結合性タンパク 質によって認識されるｅｔｓ部位の７２５配列を持っており、塩基対２０７−２ １６は、巨核球系の細胞の遺伝子発現の調節に関与することが知られている、Ｇ ＡＴＡエレメント（５’−ＡＧＡＴＡ）の共通配列と結合する、ｅｔｓ部位の配 列を持っており、そして塩基対２００−２２３は、そのポリメラーゼに対する５ ’−ＴＡＴＡ認識配列を欠如する、配列番号：２の配列を持つセグメントと同様 の他のプロモーターに存在しているのと同じＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写イニシ エーター共通配列を持っている。配列番号：２の配列を持つセグメントは、配列 番号：１の配列を持つセグメントの転写制御活性を有する、サブセグメントであ る。 配列番号：３は、本発明の基礎となる研究において実験された遺伝子に存在す る、エキソン８のすぐ後ろの（即ち、そこから３’−側、言い換えるとそこから 「下流側」にある）イントロンの２０塩基からなる、最初の配列（即ち、５’− 最端の配列、言い換えると最も「上流」の配列）を共に持つエキソン８の配列で ある。 配列番号：４は、本発明の基礎となる研究において実験された遺伝子に存在す る、エキソン９のすぐ前にある（即ち、そこから５’−側、言い換えるとそこか ら「上流側」にある）イントロンの最後の（即ち、３’−最端の、言い換えると 最も「下流」の）２０塩基からなる配列と、エキソン９のすぐ後ろにあるイント ロンの、初めの２０塩基からなる配列とを共に持つ、エキソン９の配列である。 エキソン９は、血小板−内皮細胞接着性分子−１、あるいはそのイソ型のセグメ ント、即ち「膜貫通ドメイン」と言われるセグメントをコードする。配列番号： ４に示されているような塩基４４〜塩基１００のセグメントからなる、エキソン ９のセグメントが欠失したＤＮＡセグメントから得られるこのようなイソ型の発 現は、膜結合性のポリペプチドというよりはむしろ可溶性になる。配列番号：４ に示されているアミノ酸１−８及び２８−３６は、細胞あるいは血小板膜にポリ ペプチドが係留する際に関与すると考えられるが、アミノ酸９−２７はそうでは なく、可溶性になるそのポリペプチドにとってはポリペプチドがないことが必要 ではない。配列番号：４に示されているアミノ酸９−２７は、米国特許第5,264, 554号（'554特許）の図１に示されている、血小板−内皮細胞接着性分子−１に 対する配列であるアミノ酸５７５−５９３に対応する。 配列番号：５は、本発明の基礎となる研究で実験された遺伝子における、エキ ソン１０のすぐ前にあるイントロンの最後の２０塩基の配列と、エキソン１０の すぐ後ろのイントロンの最初の２０塩基の配列とを共に持つ、エキソン１０の配 列である。 配列番号：６は、本発明の基礎となる研究で実験された遺伝子における、エキ ソン１１のすぐ前にあるイントロンの最後の２０塩基の配列と、エキソン１１の すぐ後ろのイントロンの最初の２０塩基の配列とを共に持つ、エキソン１０の配 列である。 配列番号：７は、本発明の基礎となる研究で実験された遺伝子における、エキ ソン１２のすぐ前にあるイントロンの最後の２０塩基の配列と、エキソン１２の すぐ後ろのイントロンの最初の２０塩基の配列とを共に持つ、エキソン１２の配 列である。 配列番号：８は、本発明の基礎となる研究で実験された遺伝子におけるエキソ ン１３のすぐ前にあるイントロンの最後の２０塩基の配列と、エキソン１３のす ぐ後ろのイントロンの最初の２０塩基の配列とを共に持つ、エキソン１３の配列 である。 配列番号：９は、本発明の基礎となる研究で実験された遺伝子におけるエキソ ン１４のすぐ前にあるイントロンの最後の２０塩基の配列と、エキソン１４のす ぐ後ろのイントロンの最初の２０塩基の配列とを共に持つ、エキソン１４の配列 である。 配列番号：１０は、本発明の基礎となる研究で実験された遺伝子におけるエキ ソン１５のすぐ前にあるイントロンの最後の２０塩基の配列と、エキソン１５の すぐ後ろのイントロンの最初の２０塩基の配列とを共に持つ、エキソン１５の配 列である。 配列番号：１１は、ヒトの血小板−内皮細胞接着性分子−１に対する遺伝子に ついての本発明の基礎となる研究で決定された、９２１塩基からなる３’−最端 （即ち、最も「下流」）の配列である。配列番号：１１の最初の２０塩基の配列 は、その遺伝子のエキソン１６のすぐ前にあるイントロンの、最後の２０塩基の 配列である。配列番号：１１における最後の９０１塩基の配列は、エキソン１６ の初めの（５’−最端の）９０１塩基対の配列である。これらの９０１塩基対の ８７１は、エキソンが欠如しても変わらないｍＲＮＡのリーディングフレームに 対する、完全な長さのタンパク質及びそのイソ型をコードするｍＲＮＡに存在す る、停止コドンに対応するトリプレットから３’側にある。これらの８７１塩基 対の中には、５’−ＡＡＴＡＡＡプライマリー共通ポリアデニル化シグナル配列 はない。しかしながら二つのセカンダリー共通ポリアデニル化シグナル配列は配 列番号：１１内の塩基３８０−３８５及び塩基５３６−５４１に現れる。配列番 号：１１にある塩基２４９は、'554特許の図１に示された血小板−内皮細胞接着 性分子をコードするｃＤＮＡにある塩基２５５７に対応する。 配列番号：３〜配列番号：１１はまた、エキソンに対応するそれらの配列の部 分によってコードされるアミノ酸配列を示している。アミノ酸に対するコドンに 対応するトリプレットをイントロンが中断している場合には、コードされたアミ ノ酸はトリプレットの三つの塩基のうちの二つを含むエキソン配列とともに示さ れている。 配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、及び配列番号：１５は、 本発明を基礎とする研究で用いたプライマーの配列である。配列番号：１２は、 '554特許の図１に示された血小板−内皮細胞接着性分子をコードするｃＤＮＡに おける、塩基１００−１４１の配列に相補的である。配列番号：１３は、'554特 許の図１に示されたｃＤＮＡ配列の、塩基２４６５−２４８２の配列に相補的で ある。配列番号：１４は、'554特許の図１に示されたｃＤＮＡ配列の塩基２０８ ５−２１０２と同じ配列である。最後に配列番号：１５は、'554特許の図１に示 されたｃＤＮＡ配列の、塩基２３２４−２３４３の配列に相補的な配列を持って いる。 配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番 号：２０、及び配列番号：２１は、配列番号：４に示されたエキソン９の塩基４ ４−１００に対応するセグメントを持つ、本発明のイソ型をコードするｃＤＮＡ から、そのセグメントを欠如するｃＤＮＡを構築するために用いられるプライマ ーの配列であり、したがって本発明の可溶性のイソ型を造成するのに用いること ができる。配列番号：１６は、'554特許の図１に示されたｃＤＮＡ配列の塩基１ ６０２−１６２１の配列である。配列番号：１７の５’−最端にある１６塩基か らなる配列は、'554特許の図１に示されたｃＤＮＡ配列の塩基１９２９−１９４ ４の配列に相補的な配列であり、そして配列番号：１７の３’−最端にある１８ 塩基からなる配列は、そのｃＤＮＡの塩基２００２−２０１９の配列に相補的な 配列である。配列番号：１８は配列番号：１７に相補的である。配列番号：１９ は、'554特許の図１に示されたｃＤＮＡ配列における塩基２４６５−２４８２の 配列に相補的な配列であり、配列番号：２０は、その塩基１７５４−１７７３の 配列と同じであり、そして配列番号：２１は、その塩基２３２４−２３４３の配 列に相補的な配列である。発明の詳細な説明 観点の一つによると本発明は、ヒトの血小板−内皮細胞接着性分子−１の実質 的に単離されたイソ型であり、それは完全な長さで成熟したものであって、ここ ではそのイソ型は、ヒトの血小板−内皮細胞接着性分子−１を調製するために翻 訳されるｍＲＮＡと同じｍＲＮＡを翻訳することによって得られる、アミノ酸の 配列を持っている。ただしそのｍＲＮＡからは、ヒトの血小板−内皮細胞接着性 分子−１に対する遺伝子の、エキソン１０−１５に対応するｍＲＮＡセグメント のうちの、一つまたはそれ以上のｍＲＮＡセグメントを欠損するイソ型を調製す るために翻訳されるｍＲＮＡ、及び任意で該遺伝子の全体にあるエキソン９に対 応するｍＲＮＡセグメントを欠くか、あるいは配列番号：４に示された塩基対４ ４−１００からなりかつ３で均等に割り切れる数の塩基対を持つ、該エキソン９ の連続するセグメントも欠損するイソ型を調製するために翻訳されるｍＲＮＡが 除かれる。 もう一つの観点によると本発明は、ヒトの血小板−内皮細胞接着性分子−１の イソ型の転写産物をコードするＤＮＡセグメントであり、それは完全な長さであ って、ここではこのイソ型は、ヒトの血小板−内皮細胞接着性分子−１を調製す るために翻訳されるｍＲＮＡと同じｍＲＮＡを翻訳することで得られるアミノ酸 の配列を持つが、ただしそのｍＲＮＡからは、ヒトの血小板−内皮細胞接着性分 子−１に対する遺伝子のエキソン９−１５に対応するｍＲＮＡセグメントのうち の一個あるいはそれ以上のｍＲＮＡセグメントを欠損するイソ型を調製するため に翻訳されるｍＲＮＡ、及び該イソ型を調製するために翻訳される該ｍＲＮＡが 該遺伝子のエキソン９に対応する完全なセグメントを欠損していないならば、配 列番号：４に示されている塩基対４４−１００からなりかつ３で均等に割り切れ る数の塩基対を持つ該エキソン９の連続するサブセグメントに対応するｍＲＮＡ セグメントを任意で欠損するイソ型を調製するために翻訳される該ｍＲＮＡが除 かれているイソ型であることを特徴とする。 本発明のＤＮＡは、イソ型を発現させるために操作しやすく、本発明のＤＮＡ セグメントが転写配列としてコードされている発現ベクター中に、あるいは細胞 中、培養物（マウスあるいはラットの腹膜腔内のような動物内にin vivoで保有 されている培養物を含む）中、さらにin vivoでのヒトの体内に含まれる可能性 がある。好ましい発現ベクターは、培養されている咄乳動物の細胞中、あるいは in vivoでヒトの体内の血管にある細胞中で本発明のイソ型を発現させるであろ う。本発明のプロモーターセグメント（下記参照）は、ヒトの血管内の細胞に特 異的に発現させるために用いることができる。したがって本発明のＤＮＡセグメ ントは、培養物中の細胞においてあるいは発現ベクターについてまさに示されて いるような他の状態において、セグメントが転写産物をコードしているイソ型を 、ＤＮＡセグメントを発現させる工程を含む方法で生成させるために用いること ができる。なお本発明は、本発明にかかるＤＮＡセグメントを使用するこのよう な方法を包含する。 本発明はまた、このような発現ベクター、そのようなベクターを用いて形質転 換された細胞、そのような細胞の培養物、及び本発明の発現ベクターから培養物 中の細胞においてあるいは他の状態において発現させることによって本発明のイ ソ型を形成する方法も包含する。 さらに本発明には、（ｉ）配列番号：１あるいはそのサブ配列、即ち例えば転 写配列に操作可能に連結するＤＮＡセグメントに関連する（即ち、その転写を開 始したり制御したりできること）転写-制御-活性のある配列番号：２のようなサ ブ配列と実質的に同じ配列を持つプロモーターセグメントであって、（ii）ヒト の血小板−内皮細胞接着性分子−１に対する遺伝子にそのプロモーターセグメン トの５’が直接的に位置づけられるならばヒト染色体１７の長腕上にないような プロモーターセグメントも含まれる。 本発明はさらに、血管内の細胞において、特に血管内皮細胞、白血球、及びＰ ＥＣＡＭ−１が自然に発現する血小板の前駆体（例えば巨核球）において、アン チセンスＲＮＡを調製するためのＤＮＡセグメントの転写を制御するように、あ るいはタンパク質（可能性としては完全な長さのＰＥＣＡＭが含まれるが、これ に限られるわけではない）を調製するための遺伝子の発現を制御するように本発 明のプロモーターセグメントを使用する方法を含む。 本発明のイソ型に関する「実質的に単離された」とは、「イソ型が天然で生じ るような環境から隔離されている」ことを意味している。したがって他の可能性 のあるところ、即ち培養物中の細胞内のイソ型、自然発生しないかあるいは異な る濃度で自然発生するような生きたヒトの細胞内のイソ型、クロマトグラフィー あるいは電気泳動ゲルに載せられているか、リポソームに含まれているか、ある いは溶液中に含まれているイソ型が、「実質的に単離された」状態であろう。注 射またはその他の手段によるヒトへの投与において、薬剤学的に許容される溶液 のような、水溶液中のイソ型は、「実質的に単離された」ものと言えよう。この ような薬剤学的に許容される溶液中で本発明のイソ型は、約１０ｎＭから約５０ μＭ未満の濃度で存在することができ、そのイソ型はその溶液中に溶解している 。少なくとも約５０ｎＭの濃度、あるいはより普通には少なくとも約１μＭの濃 度が用いられる。 膜貫通ドメイン（'554特許の図１に示されたアミノ酸５７３−５９３のセグメ ントであり、それは配列番号：４におけるアミノ酸９−２７に対応する）を含む 本発明のイソ型は、溶液に懸濁させるためにうまくリポソームに封入されて、通 常は静脈内あるいは動脈内に拡散させることによって、即ちそのような溶液を注 入することによってヒトへの投与が行われる。 「成熟した」イソ型あるいは他のタンパク質とは、そのタンパク質がシグナル ペプチドを持たないことを意味している。 「完全な長さ」の血小板−内皮細胞接着性分子−１とは、その分子が天然に発 生するアミノ酸の完全な配列を持っている分子であることを意味している。本発 明の後で現在までに判明しているこれらの分子の４種のヒト型の場合では、この 「完全な長さ」の配列は「成熟した」分子では７１１個のアミノ酸を有しており 、シグナルペプチドを持っている「完全な長さ」の分子では７３８個のアミノ酸 を有している。 ＲＮＡに対してコードする「ｃＤＮＡセグメント」とは、転写することによっ てイントロンを持たないＲＮＡを調製することのできるＤＮＡセグメントを意味 している。別途限定しない限り「ｃＤＮＡ」あるいは「ｃＤＮＡセグメント」は 二本鎖である。タンパク質あるいはポリペプチドに対するｃＤＮＡセグメントは 、イントロンを持たないＤＮＡセグメントであること、またこれとは逆に、翻訳 することでタンパク質あるいはポリペプチドを調製することのできるＲＮＡ（即 ち、そのタンパク質あるいはポリペプチドを「コード」している）に転写できる ＤＮＡセグメントであることを意味している。 タンパク質あるいはポリペプチドに対する「遺伝子」とは、（１）そのタンパ ク質あるいはポリペプチドに対するゲノムＤＮＡのセグメントであって、このセ グメントはイントロンを持っているＲＮＡに転写され、そこでそのＲＮＡがイン トロンに対応するセグメントを除去する工程を経た後でタンパク質あるいはポリ ペプチドに翻訳されるようなセグメントであるか、（２）全体的にサイレントで あるような一個あるいはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠損、あるいは付加に よってのみこのパラグラフの（１）項で特定したセグメントとは異なる、ｃＤＮ Ａセグメントではないセグメントを意味している。このような置換、欠損、及び 付加を伴っているセグメントがＲＮＡに転写されて、そのＲＮＡがイントロンに 対応するセグメントを除去する工程を経た後で同じタンパク質あるいはポリペプ チドに翻訳される能力があれば、そのような置換、欠損、及び付加は、全体的に 「サイレント」である。 「ゲノムＤＮＡ」とは、染色体の一部を構成するＤＮＡを意味し、それは「遺 伝子」（転写されるセグメント）だけでなく、プロモーターセグメント、即ちＤ ＮＡの一部であろう遺伝子の転写を制御するセグメントのような転写されないセ グメントも含んでいる。 この説明で言及する全てのアミノ酸からは、非光学異性体のグリシン及びＬ− アミノ酸は除外される。アミノ酸は次の表Ｉに示したように、標準的な三文字か らなる略称を用いて表すことができる。 ペプチドあるいはポリペプチドの配列が記載されていて、アミノ末端のアミノ 酸からカルボキシ末端のアミノ酸へと番号が付されている。 通常一個の文字のコード「Ａ」、「Ｃ」、「Ｇ」及び「Ｔ」は、ここではそれ ぞれヌクレオチドアデニレート、ヌクレオチドシチジレート、ヌクレオチドグア ニレート、及びヌクレオチドチミジレートに対して用いられている。当業者は、 ＤＮＡではそのヌクレオチドが２’−デオキシリボヌクレオチド−５’−リン酸 （あるいは、５’−末端が三リン酸になっている）であり、これに対してＲＮＡ ではそのヌクレオチドがリボヌクレオチド−５’−リン酸（あるいは、５’−末 端が三リン酸になっている）であってかつウリジレート（Ｕ）がＴの代わりに存 在していることを認識するであろう。「Ｎ」は、４個のヌクレオチドのうちの一 つを意味している。「ｄＮＴＰ」は、４個の２’−デオキシリボヌクレオシド− ５’−三リン酸を意味している。 オリゴヌクレオチドあるいはポリヌクレオチド配列は、５’−末端から３’− 末端へと記載されている。 あるプロモーターセグメントの配列が一個あるいはそれ以上の位置である特定 の配列のセグメントの配列と異なっているが、ヒト臍帯静脈の内皮細胞（"HUVEC ,"Newman et al．(III)(1986)J. Cell. Biol．103, 81-86）あるいはＥＣＶ３０ ４細胞（ATCCCRL-1998）のような哺乳動物の血管細胞において、プロモーター活 性について標準のアッセイを行った場合、その特定の配列のセグメントによる転 写の開始速度の少なくとも１０％、あるいはより好ましくは少なくとも５０％の 速度でそのプロモーターセグメントが転写を開始するのであれば、そのプロモー ターセグメントは特定の配列の一つと「実質的に同じ」である。この点に関して は例えば、Sections 9.6 and 9.7 of Current Protocols in Molecular Biology , edited by Ausubel et al., Current Protocols, a joint venture betweenGr eene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc．(1994)参照 。 転写が行われるセグメントに関与して「転写に対して操作可能に」プロモータ ーセグメントが位置づけられることは当業者にとっては当然のことである。それ は、プロモーターセグメントが転写を開始する際に有効性を発揮する細胞内で、 転写されるべきセグメントがそのプロモーターセグメントから開始される転写工 程で実際に転写されるように、プロモーターセグメント及びそのプロモーターセ グメントの制御の下で転写されるセグメントの両方を含むより大きなＤＮＡセグ メント内において、そのプロモーターセグメントが配向されていること及び位置 づけられていることを意味している。 転写制御活性を維持している本発明のプロモーターセグメントのサブセグメン トをこの技術分野で周知の方法によって検出することは、当業者にとっては日常 的に行っている操作である。サブセグメントは、数多くの標準的な手法のうちの どれかの方法、例えばChapter 8 of Current Protocols in Molecular Biolory, 前出に示された方法によって調製できる。サブセグメントの転写制御活性のテ ストは、上記のSections 9.6 and 9.7 of Current Protocols in Molecular Bio logy，前出に記載されたように、プロモーター活性についての標準的なアッセイ によって行われる。 本発明のプロモーターセグメント及びサブセグメントは、対象のタンパク質が 血管の細胞で発現できるように、遺伝子、あるいは好ましくはｃＤＮＡに転写さ れるように操作可能に連結されているのであろう。これらのタンパク質にはＰＥ ＣＡＭ−１あるいはそのイソ型だけでなく、アデノシンデアミナーゼのようなタ ンパク質が含まれるためにその酵素の欠乏に起因する免疫不全を治療することが でき、また第ＩＸ因子が含まれるために、その凝固因子の欠乏に起因する血友病 の症状を治療することができる。得られた構築物はその後、内皮細胞、白血球、 あるいは血小板前駆体細胞のような血管内の細胞に、レトロウイルスが仲介する 形質転換に制限されない方法を含む標準的な形質転換法によって形質転換するこ とができる。治療を行うべき人に形質転換した細胞は、その後目的とするタンパ ク質を製造するであろう。 本発明のプロモーターセグメント及びサブセグメントは、そのプロモーターセ グメントあるいはサブセグメントから転写が行われる方向に関連して指向されて いるＤＮＡに、転写する際に操作可能なように連結しており、それによって血管 の細胞内にアンチセンスＲＮＡを転写して生成させることができる。当業者には 認識されているように、このようなアンチセンスＲＮＡは、相補的な配列のＤＮ ＡあるいはＲＮＡセグメントに作られる細胞にハイブリダイゼーションすること によって、そのＤＮＡあるいはＲＮＡセグメントの機能を遮断し、それによって そのような機能に依存する遺伝子の発現を減じるかあるいは阻害する。例えばア ンチセンスＲＮＡは、タンパク質に翻訳されるｍＲＮＡのすべてあるいは一部に ハイブリダイゼーションし、そしてそのｍＲＮＡの翻訳を遮断することによって そのタンパク質に対する遺伝子の発現を阻害することができる。本発明のプロモ ーターセグメント、あるいはそのサブセグメントは、ＰＥＣＡＭ−１のすべてあ るいは一部分に対するｃＤＮＡを転写するために用いることができ、この際その ｃＤＮＡは、プロモーターセグメントあるいはサブセグメントから転写が行われ る方向に関連して位置づけられており、ＰＥＣＡＭ−１を得るために翻訳される ｍＲＮＡのすべてあるいは一部分にそれぞれ相補的な配列を持つＲＮＡを生成す ることができる。このように形質転換された細胞によって産生されるＰＥＣＡＭ −１の量は、減少または消失するであろう。このことより、表面にＰＥＣＡＭ− １を自然状態で備えている血小板及び細胞の中での癒着に起因して、白血球の内 皮細胞を通過する移動または動脈の閉塞が起こることによって生じる、炎症のよ うな症状を治療する場合に治療効果があり、その際にはＰＥＣＡＭ−１分子と他 のＰＥＣＡＭ−１分子あるいは他の細胞表面のタンパク質との相互作用がかかわ っているのであろう。 本発明のイソ型を形成するために、'554特許に記載された説明が参照文献にさ れる。エキソン９以外の一個あるいはそれ以上のエキソンに対応する完全なセグ メントを欠損するｍＲＮＡによってコードされているイソ型は、血管内の細胞の 数は天然では低いレベルでしか生成せず、そのため回収可能な型の細胞からＰＥ ＣＡＭ−１を得るために'554特許に記載された方法を簡単に修飾した方法によっ てそのような細胞から単離することができる。細胞からイソ型を単離するための これらの方法では、イソ型を調製する発現ベクターで形質転換した培養物内の細 胞から非常に多く産生されるＰＥＣＡＭ−１のイソ型を抗原として用いて得られ る抗体を使用すればよい。 エキソン９に対応するアミノ酸セグメントを欠損するか、あるいは配列番号： ４に示されているようにエキソン９に対応するセグメントであるアミノ酸９−２ ７に対応するアミノ酸セグメントを欠損する本発明のイソ型は可溶性である。エ キソン９に対応するセグメントを欠損するイソ型は、天然では血清中に含まれて おり、それらは標準的な手法、即ちイソ型を産生するように発現ベクターで形質 転換した培養物中の細胞から大量に産生できる対応するＰＥＣＡＭ−１の複数の イソ型をそれぞれ抗原として利用して得られる抗体を、ここで再び別法で用いる ことによって血清から単離することができる。 本発明のイソ型、及びエキソン９に対応する完全なアミノ酸セグメントを欠如 するイソ型は、発現ベクターの一部として本発明のＤＮＡセグメントを用いるこ とによって、また、発現ベクターを用いて形質転換した細胞を培養することによ って本発明のイソ型をコードするＤＮＡを発現させてイソ型を産生させることに よってうまく生成できる。これに関連して、細菌、酵母、あるいは哺乳動物の細 胞のイソ型を調製するための発現ベクターを調製する際には、参照文献として'5 54特許だけでなく、前述のようなベクターが関与する標準的な研究が記載された 例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, 前出などを挙げることができ る。培養状態の哺乳動物の細胞の、特定するとヒトの細胞のイソ型を調製する場 合、天然に存在する型であるグリコシル化体と同じようにイソ型のグリコシル化 体が調製されることが好ましい。哺乳動物の細胞で発現させるために、ジヒドロ 葉酸／還元酵素−メトトレキセートシステムを用いて目的の遺伝子の数をコピー して増幅する工程が関与するシステムを用いて増殖させた細胞が好まれる。Curr ent Protocols in Moleculae Biology, 前出のChapter 16, and especially Sec tion 16.14を参照のこと。 本発明のイソ型は、'554特許でＰＥＣＡＭ−１について記載されているのと同 様に用いることができる。 したがって本発明のイソ型は、例えばさまざまな診断用や治療用の抗体を製造 するために、好ましくはモノクローナル抗体を製造するために用いることができ る。 本発明のイソ型は、内科医の指導のもとにヒトに対して投与されるべきである 。 本発明の可溶性のイソ型、あるいは本発明のＤＮＡを用いて提供されたものは 、薬剤学的に許容される担体に入れて、レシピエントの体重１ｋｇあたり約０． ０５ｍｇ／ｋｇと約５ｍｇ／ｋｇの間の単一用量を、静脈内あるいは動脈内に一 回の注射を行うことによって、あるいは約１分から約１０時間の間の時間をかけ て静脈内あるいは動脈内に拡散させることによってヒトに投与すればよく、それ によって関節炎やハチの刺し傷、クモの噛み傷、敗血症、アナフィラキシーショ ック、及び他の状態などの様々な状況で起こる、白血球の内皮細胞を通過する移 動に原因のある炎症を緩和することができ、また粥状硬化や血管形成術などの血 管の外傷が関与して起こる動脈の閉塞を阻害することができる。 実際の用量管理は、他の個体の因子、イソ型が投与される目的、及びその個人 の薬に関する条件に依存して、個体毎に変わるであろう。 本発明のイソ型の溶解しないものは、リポソームと組み合わせて用いることが でき、得られたリポソームは可溶性のイソ型の効果と同じ効果を奏するように投 与することができる。 本発明は、次の実施例でさらに詳細に説明されている。実施例は、本発明を例 示し明確にする目的で示されているのであって、本発明に制限を加えるものでは ない。 実施例１ この実施例は、ＰＥＣＡＭ−１に対するゲノムＤＮＡの構造及び機構、及びＰ ＥＣＡＭ−１の種々のイソ型をコードするｍＲＮＡをコードしたｃＤＮＡの配列 の決定に関する研究について説明するものである。 二つのヒトゲノムライブラリーは、ラムダファージベクターにクローニングさ れた末梢血液の白血球ＤＮＡを部分的に消化したＳａｕ３ＡＩから構築されてお り、それをスクリーニングすることで大部分のＰＥＣＡＭ−１遺伝子を得ること ができた。λＥＭＢＬ３における第１番目のライブラリーは、Clontech Laborat ories(Palo Alto, California, USA)より入手した。λＧＥＭ−１１における第 ２番目のライブラリーは、Novagen(Madison, Wisconsin, USA)より入手した。 ライブラリーのスクリーニングは、[α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ（DuPont, New Engla nd Nuclear, Boston, Massachusetts, USA）を用いて無作為にプライマー付けす ることによって³²Ｐ−ラベルされたＰＥＣＡＭ−１ ｃＤＮＡプローブの完全な 長さのものあるいは部分だけのものと、オリゴラベリングキット（Pharmacia，P iscataway, New Jersey, USA）（Feinberg and Vogelstein（1983）Anal. Bioch em. 132, 6-13）とを用いて、プラーク−リフトハイブリダイゼーション（Sambr ook et al.（1989）Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Ha rbor Laboratory Press, Co1d Spring Harbor, New York）することで行った。 陽性のクローンをプラーク−精製し、ファージＤＮＡを、続いて標準的な操作（ Sa mbrook et al.，前出）を行うことでゲノムの挿入物の特徴に対して単離した。 ＰＥＣＡＭ−１のゲノムＤＮＡの一部を含む約４５ｋｂのゲノムのクローンは 、ＰＥＣＡＭ−１特異性プライマーを用いてＰＣＲに基づくスクリーニングを行 うことによって、Ｐ１ファージミッドライブラリー（P1 phagemid library）（c lone #530, Genome Systems, St. Louis, Missouri, USA）から誘導した。 全ての挿入物は、制限酵素地図によって特徴が明らかになった。エキソンを含 む制限断片は、³²−Ｐラベルを施したＰＥＣＡＭ ｃＤＮＡプローブを用いて制 限酵素のエンドヌクレアーゼで消化したものをサザンブロットハイブリダイゼー ションを行うことで同定した。ゲノムのクローンＤＮＡを制限酵素のエンドヌク レアーゼで消化したものを１％のアガロースゲル電気泳動で分離し、減圧によっ てナイロン製の膜（Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indian a, Usa or Micron Separations, Inc., Westborough, Massachusetts, USA）に 移しとった。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションは、５× デンハート溶液（Sambrook et al., 前出）、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ：０．１ ５Ｍの塩化ナトリウム、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７）、５ｍＭ のエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐ Ｈ７、１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５０μｇ／ｍｇのニシンの精 子ＤＮＡ中で６８℃で行った。ラベルを施したプローブを２−３×１０⁶ｃｐｍ ／ｍｌで添加し、１８時間ハイブリダイゼーションさせた。その膜を、２×ＳＳ Ｃ、０．１％のＳＤＳで二度、０．５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで一度、０． １×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで二度、それぞれ３０分間かけて６８℃で洗浄し た。 ある例では、エキソンが非常に小さいために二本鎖のＤＮＡプローブのハイブ リダイゼーションによって検出することができなかった。そのため適切な場合に はオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを行った。ＰＥＣＡＭ−１ｃＤＮ Ａ（'554特許を参照のこと）の配列から誘導した合成のオリゴヌクレオチドは、 ［γ−³²Ｐ］ｄＡＴＰ（DuPont，New England Nuclear）とＴ４ポリヌクレオチ ドキナーゼ（Promega, Madison, Wisconsin, USA、あるいはNew England Bioabs , Boston, Massachusetts, USA）を用いて³²Ｐ−ラベルを施した。膜を、５×デ ンハート溶液、６×ＳＳＣ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、 ｐＨ７、１％のＳＤＳ中でプレハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼー ションは、１０×デンハート溶液、５×ＳＳＣ、５ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭの リン酸ナトリウム、ｐＨ７、７％のＳＤＳ、１００μｇ／ｍｇのニシンの精子Ｄ ＮＡ中で５０℃で、少なくとも１８時間かけて行った。その膜を、１０×デンハ ート溶液、３×ＳＳＣ、７０ｍＭの燐酸ナトリウム、５％のＳＤＳでそれぞれ２ ０分づつ３回、５０℃で洗浄し、続いて１×ＳＳＣ、１％のＳＤＳで一回あるい は二回、６０℃で洗浄した。 全てのハイブリダイゼーションの工程は、Model 310 Hybridization oven(Rob bins Scientific, Sunnyvale, California, USA)を用いて行った。 それぞれのゲノムの挿入物は、さらに遺伝子地図を作成し配列分析を行うべく 、プラスミドベクター、即ちｐｔｚ１８ｒ（Stratagene,La Jolla, California, USA）あるいはｐＧＥＭ−７（Primega）にフラグメントとしてサブクローニン グした。 大部分の遺伝子配列、つまり全てのエキソン、エキソン／イントロンの連結部 、及びイントロン配列の大部分は、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Sequenase(商品名 )brand, United States Biochemical, Cleveland, Ohio, USA）及び［γ-³⁵Ｓ］ ｄＡＴＰ（DuPont, New England Nuclear）を用いて生成した。数個のイントロ ン配列は、Ｔａｑポリメラーゼ、プリズムダイデオキシターミネーターキット、 及びＡＢＩ ３７３Ａ自動シーケンス装置（Applied Biosystems, Foster City, California, USA）を用いてサイクルシーケンスを行うことによって得た。すべ ての配列は、Sanger et al．(1977), Proc. Natl. Acad. Sci.（USA）74, 5463- 5467(the Sanger method)に記載されたジデオキシヌクレオチドターミネーショ ン法によって決定した。 イントロンの距離は、制限酵素地図、ＰＣＲ増幅法、及び直接的シーケンス法 を組み合わせることで決定した。 ゲノムのサザンブロットハイブリダイゼーションを行うためにヒトゲノムのＤ ＮＡは、正常で健康なボランティアから採取した５０ｍｌのヒト血液より分離し た末梢血液の白血球から単離した（Poncz et al.（1982）Hemoglobin 6, 27-36 参 照）。１０μｇのヒトゲノムのＤＮＡを、種々の制限酵素を用いて３７℃で１８ 時間消化した。その消化物を３０ボルトで１８時間、トリスーホウ酸−ＥＤＴＡ 緩衝液中で電気泳動することによって０．８％のアガロースゲルで分離し、ナイ ロン製の膜に移し取ってから、³²Ｐ−ラベルの施されたＰＥＣＡＭ−１ ｃＤＮ Ａプローブを用いて６５℃で少なくとも１８時間、５×デンハート溶液、６×Ｓ ＳＣ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７、１％のＳＤＳ 、１００μｇ／ｍｌのニシンの精子ＤＮＡ中でハイブリダイゼーションした。そ の膜を２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを用いて６５℃で二回、続いて１×ＳＳＣ 、０．１％のＳＤＳを用いて二回、それぞれ３０分間かけて洗浄した。その洗浄 した膜を、増幅スクリーンの存在下で、Kodak XOMatARあるいはXRPフィルム（Fo todyne, Milwaukee, Wisconsin, USA）に、１週間から２週間露光させた。 ポリメラーゼ連鎖反応は次のように行った。１μｇの全ヒトゲノムＤＮＡ、２ ０ｎｇのラムダファージＤＮＡ、あるいは２ｎｇのプラスミドＤＮＡを、１００ μｌのＰＣＲ増幅法における出発物質として日常的に用いた。ＰＣＲ反応は、１ ０ｍＭのTris−ＨＣｌ、ｐＨ８、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、５０ｍＭのＫＣｌ、 ０．０１％のゲラチン、及び０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ（２’−デオキシリボヌク レオシド トリホスフェート）の混合液中で行った。プライマーは、最終濃度が ０．５μＭになるように添加した。ＰＣＲ増幅法は、次のプロトコールを用いて サーモサイクラー（MJ Reserch, Inc. Watertown, Massachusetts, USA）で行っ た。そのプロトコールは、（１）３分間、１００℃でＤＮＡの変性を行い、（２ ）２分間、５５−５７℃で最初のプライマーのアニーリングを行い、（３）７２ ℃に加熱した後で１ユニットのＴａｑポリメラーゼ（Perkin-Elmer Corp. Oakbr ook, Illinois, USA）を添加してから、（４）１−５分間、７℃で伸長し、（５ ）１．０分間、９６℃で変性を行い、（６）１．０分間、５５−５７℃でプライ マーアニーリング処理し、（７）工程（４）−（６）を３０回繰り返し、（８） 最後に７分間、伸長し、そして（９）４℃に冷却する工程からなる。 プライマリー伸長法およびｃＤＮＡ末端の５’−急速増幅（ＲＡＣＥ）分析法 は次のように行った。ヒト臍帯静脈の内皮細胞を臍帯から採取し、第１世代の培 養物をNewman et al. (III)(1986)J. Cell. Biol. 103, 81-86に記載されてい るように確立した。全ＲＮＡとポリＡｍＲＮＡは、以前に公開された方法（Lyma n et al.（1990）Blood 75, 2343-2348参照）によって単離した。酵母のｔＲＮ Ａは、Life Technologies, Inc．（Gaithersburg, Maryland, USA）から入手し た。プライマー伸長反応は、配列番号：１２のオリゴヌクレオチドを用いて誘導 した。そのプライマーは、［γ−³²Ｐ］ＡＴＰを用いてキナーゼ反応をすること によってラベルし、１５μｇの全ＲＮＡ、４μｇのポリＡ ＲＮＡ、あるいは１ ５μｇの酵母のｔＲＮＡのいずれかを用いてハイブリダイゼーションした。ハイ ブリダイゼーション反応は、１２５ｍＭのTris、７５ｍＭのＫＣｌ及び７．５ｍ ＭのＭｇＣｌ₂を含むｐＨ８．３の緩衝液中において、５６℃で処理した。伸長 反応は、５０ｍＭのTris、７５ｍＭのＫＣｌを含むｐＨ８．３の緩衝液、０．５ ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．０５ｍｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤ、０．１Ｕ／ｍｌ のRNasin（商品名）ブランドリボヌクレアーゼ阻害剤（Promega）、及び０．２ Ｕ／ｍｌのＭＭＬＶ逆転写酵素の混合液中で、４０℃にて行った。伸長させた後 で保護されていないＲＮＡはRNaseH（１０Ｕ／ｍｌ）で消化し、続いてそのまま のＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのエタノール沈澱を行った。その産物は、５％変 性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、オートラジオグラフィーによって可視 化した。上記のプライマーとＰＥＣＡＭ−１遺伝子（下記参照）の５’−末端を 含むゲノムのクローンとを用いたシーケンシング反応は、Sangerの方法を利用し て誘導した。５’−ＲＡＣＥ反応は、製造指示書（Clontech, Inc.）にしたがっ て処理した。 ＰＥＣＡＭ−１のｍＲＮＡをスプライシングした異型の同定は次のように行っ た。全ＲＮＡは、Chomczynski and Sacchi（1987）Anal. Biochem. 162, 156-15 9(1987)に記載された方法によってヒト臍帯静脈の内皮細胞から単離した。ｃＤ ＮＡは単離したＲＮＡより、配列番号：１３のアンチセンスプライマーを用い、 ＭＭＬＶ逆転写酵素（Boehringer Mnnheim Biochemicals）で３７℃にて逆転写 することによって生成した。ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅法は、配列番号：１４配列を 持つエキソン１１の前方のプライマーと、配列番号：１５配列を持つエキソン１ ５／１６連結部にわたっているアンチセンスプライマーとを利用した。ＰＣＲの 生成物は２％のアガロースゲル電気泳動によって分離した。時にはＰＣＲ生成物 は 、ゲルから直接的に活性化されてｐＧＥＭ−５プラスミドベクター（Promega） にサブクローニングされ、そして上記に説明したようにシーケンシングした。 ヒト／ハムスター体細胞のハイブリッドクローンについて染色体の局在分析を 行うことによって、ＰＥＣＡＭ−１（全ての型）に対するゲノムＤＮＡがヒトの 染色体１７の長腕上の一つのコピー部分に存在することがわかった。 ヒトのＰＥＣＡＭ−１に対するゲノムＤＮＡの機構を決定するために、二つの 異なるラムダファージライブラリーと一つのＰ１ファージミッドライブラリーと を、ＰＣＲ増幅法（Ｐ１ファージミッドライブラリーに対して）とＰＥＣＡＭ− １異性のプローブでハイブリダイゼーションする方法（ファージライブラリーに 対して）とを組み合わせて、同上文献に示されているようにスクリーニングした 。平均約１５ｋｂ（キロ塩基対）の大きさの挿入物を備えた６個のゲノムのクロ ーンの全部が得られた。 これらの６個のクローンについての第１番目の制限酵素地図は、約６５ｋｂの 大きさのゲノムＤＮＡであることを表していた。このヌクレオチド配列は、以前 に報告されている（'554特許の図１参照）ＰＥＣＡＭ−１のｃＤＮＡ配列の５’ −末端で７位（人為的産物の５’−ＧＡＡＴＴＣ ＥｃｏＲ１部位の部分ではな い最初の塩基）のＣに５’が結合した５６１ｂｐ（塩基対）を含むＰＥＣＡＭ− １ゲノムのＤＮＡの３０，１２７塩基対について決定した。 この５６１ｂｐセグメント内のＰＥＣＡＭ−１のｍＲＮＡ転写物（エキソン１ の開始部）をコードするゲノムＤＮＡの５’末端を位置決めするために、プライ マー伸長分析法を行った。配列番号：１２を持つアンチセンスオリゴヌクレオチ ドは即ちＰＥＣＡＭ−１ｍＲＮＡの５’領域にあるセグメントの配列に相補的な 配列であって、それはヒト臍帯静脈の内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、Ａ５４９肺癌細 胞、及び酵母のＲＮＡの逆転写を開始するために用いられる。（肺癌細胞及び酵 母細胞はＰＥＣＡＭ−１を発現しない。） 配列番号：１のヌクレオチド４９２ に直接ヌクレオチドの３’位で結合しているＡに対応するＨＵＶＥＣｍＲＮＡに 特有の特定のバンドが得られた。このヌクレオチドは、'554特許の図１に示され ている翻訳開始部位から２０４ｂｐ上流側にある。 ＰＥＣＡＭ−１のｍＲＮＡの５’末端から誘導される５’ＲＡＣＥＰＣＲ産物 も生成したが、数個のこれらの産物の配列分析では３個の別の転写開始部位を示 し、それらはすべて配列番号：１のヌクレオチド４９２の３’に直接的に結合す るＡの８個以内のヌクレオチドであった。この領域に結合する転写開始部位の配 置は、２０７ｂｐの５’非翻訳領域を含むｃＤＮＡクローンについて報告してい るZehnder et l., 前出の発見と一致している。したがって、ＰＥＣＡＭ−１遺 伝子（ＰＥＣＡＭ−１のゲノムＤＮＡの転写される部分）が、血管細胞接着性分 子のＥ−セレクション（Collins et al.（1991）J. Biol. Chem. 266, 2466-247 3参照）及びＬ−セレクション（Ord et al.（1990）J. Biol. Chem. 265, 7760- 7767参照）に対する遺伝子で起こる状況と同じように、間隔が近接する数個のヌ クレオチドの一つを開始する（そのためそこにＰＥＣＡＭ−１ゲノムＤＮＡの転 写開始部位がある）ことが明らかである。 ＰＥＣＡＭ−遺伝子の主要な機構の特徴は次に記載したとおりであることがわ かった。この遺伝子は、長さが８６塩基対〜１２，０００塩基対以上の範囲のイ ントロンで分離された１６個のエキソンを含んでいる。エキソン１はＰＥＣＡＭ −１ ｃＤＮＡの５’非翻訳（ＵＴ）領域に対応しており、それはシグナルペプ チドの全てではないが大部分をコードするｍＲＮＡについてもコードしている。 エキソン２はエキソン１に非常に近接する位置にあり、長さが２７ｂｐだけしか なく、シグナルペプチドの残りと成熟したタンパク質のＮ−末端の前の最初の３ つのアミノ酸をコードするＲＮＡをコードしている。 その後でエキソン／イントロン機構及びＰＥＣＡＭ−１タンパク質の細胞外ド メインの構造との間に直接的な相互関係が存在する。Ｉｇのスーパーファミリー の他のＩｇに同じように、６個のＩｇ相同性のドメイン（'554特許の図２参照） のそれぞれは、３−８と番号が付されているそれ自身のエキソン、即ちその相同 性ドメインをコードするｍＲＮＡに対してコードしているエキソンに対応する。 すぐ側面にあるセグメントを持つ膜貫通セグメント（'554特許の図１に示され ているアミノ酸５７５−５９３）も、隣接するエキソン、即ちエキソン９に対応 している。 予期しなかったことに発明者らは、ＰＥＣＡＭ−１の細胞質の部分ているが７ 個の異なるセグメント／領域に分割されており、そのそれぞれがＰＥＣＡＭ遺伝 子のエキソンに対応していることを見いだした。したがって、ＰＥＣＡＭ−遺伝 子の７個のエキソン、即ちエキソン１０−１６のそれぞれは、細胞質のテール部 分のセグメントをコードするｍＲＮＡに対してコードされている。エキソン１６ は、ＰＥＣＡＭ−１ｍＲＮＡの転写物の３’ＵＴ（非翻訳領域）に対してコード されている。 ３’が翻訳停止のコドンをコードしている遺伝子のトリプレットに結合してい るＰＥＣＡＭ−１のゲノムＤＮＡの付加的な８７１ｂｐに対するヌクレオチド配 列についても決定した。この８７１ｂｐセグメントでは、共通の一次の５’−Ａ ＡＴＡＡＡポリアデニル化配列は存在していなかった。しかしながら二つの二次 の共通配列である５’−ＧＡＴＡＡＡ及び５’−ＡＡＴＡＣＡは、停止コドンを コードしているトリプレットの後ろに存在していた。 ＰＥＣＡＭ−１遺伝子の転写物の別のスプライシング（ここでは時に、「ディ ファレンシャル」スプライシングと言われる）が発見された。それぞれのイント ロンは、共通のスプライス−ドナー配列「ＧＴ」で始まり、共通のスプライス− アクセプター配列「ＡＧ」で終わる。興味深いことに全てのエキソンは、エキソ ン１０とエキソン１５の例外があるものの、こうして「フェーズ１（phase 1） 」エキソン（Sharp（1981）Cell 23, 643-646参照）の分類を持つコドンをコー ドするトリプレットの第１塩基を持つものになる。特定して述べると、膜貫通ド メイン及び細胞質ドメイン（エキソン９−１５）に対応する７個のエキソンのう ちの５個のエキソンは、エキソン８と同じくフェーズ１クラスにあり、それは膜 貫通ドメインがないことにより可溶性であるかあるいは細胞質のテール部分の配 列が異なっているＰＥＣＡＭ−１イソ型を生成するイン−フレームの別のスプラ イシングが起こる可能性をもたらす。 細胞内でこのようなイソ型が生成するかどうかを調べるために、ＨＵＶＥＣの ｍＲＮＡを、配列番号：１４の配列を持つプライマー及び配列番号：１５の配列 を持つプライマーを用いてエキソン１１−１６によってコードされている領域に ついてＲＴ−ＰＣＲ増幅法にかけた。二つのＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳 動によって単離した。即ち、エキソン１２−１５のすべて、エキソン１１の一部 、及びエキソン１６の一部を含む完全な長さのセグメントに対応する２６０ｂｐ の大きな方の産物と、完全な長さのＰＥＣＡＭ−１ ｃＤＮＡプローブでハイブ リダイゼーションされる２００ｂｐの小さい方の産物である。小さい方のｍＲＮ Ａ−誘導ＰＣＲ産物をサブクローニングして配列決定すると、それがエキソン１ ４を欠いていること以外は完全な長さの産物と同じであることがわかった。した がってこの小さい方の産物に対応するｍＲＮＡは、ＰＥＣＡＭ−１△１４イソ型 をコードしている。 「ＰＥＣＡＭ−１△ｘ イソ型」とは、翻訳することによって完全な長さのＰ ＥＣＡＭ−１を調製することのできるｍＲＮＡであって、ただし翻訳することに よってＰＥＣＡＭ−１に対する遺伝子のエキソンｘに対応するｍＲＮＡセグメン トを欠いているイソ型を調製することのできるｍＲＮＡ以外のｍＲＮＡと同じｍ ＲＮＡを翻訳することで得られるアミノ酸の配列を持つイソ型である。同様に「 ＰＥＣＡＭ−１△ｘ，ｙ，……ｚ イソ型」とは、翻訳することによって完全な 長さのＰＥＣＡＭ−１を調製することのできるｍＲＮＡであって、ただし翻訳す ることによってＰＥＣＡＭ−１に対する遺伝子のエキソンｘ，ｙ，……及びｚに 対応するｍＲＮＡセグメントを欠いているイソ型を調製することのできるｍＲＮ Ａ以外のｍＲＮＡと同じｍＲＮＡを翻訳することで得られるアミノ酸の配列を持 つイソ型である。 ＰＥＣＡＭ−１遺伝子のエキソンの機構を調べることによって、Goldberger e t al.，前出によって同定されたＰＥＣＡＭ−１の可溶性型がゲノムＤＮＡのエ キソン９によってコードされているセグメントを欠いたｍＲＮＡによってコード されるＰＥＣＡＭ−１イソ型（即ち、ＰＥＣＡＭ−１△９イソ型）であることを 検出した。このｍＲＮＡにおいてエキソン９に対応する欠損しているセグメント は、'554特許の図１に示されているようなＰＥＣＡＭ−１のアミノ酸５７５−５ ９３からなる膜貫通ドメインをコードするサブセグメントを含んでいる。 ｃＤＮＡは'554特許の図１で報告されている配列に対するｃＤＮＡとは、その 図１に示されている塩基２１８６−２２４８に対応する６３塩基対セグメントを 欠いている点でのみ実質的に異なっていることがわかった。このセグメントは正 確には、ｃＤＮＡが'554特許の図１に示されているＰＥＣＡＭ−１遺伝子のエキ ソン１３に対応している。こうしてＰＥＣＡＭ−１△１３イソ型が明らかになっ た。 エキソン１２、１３、及び１４はすべてフェーズ１のエキソンであるため、Ｐ ＥＣＡＭ−１をコードするｍＲＮＡをスプライシングして除去すると、エキソン １３によってコードされたセグメントは細胞質のテール部分の残りをコードする ｍＲＮＡのリーディングフレームを変えることなく２１アミノ酸の正味の欠失が 起こることになる。エキソン１３に対応するアミノ酸セグメントは、ＰＥＣＡＭ −１の細胞質ドメインに存在する１２個のセリン残基のうちの４個を含んでおり 、それが存在する場合には翻訳後のリン酸化及びPＥＣＡＭ−１の細胞骨格の会 合のための部位として働くらしい。したがってＰＥＣＡＭ−１△１３イソ型は、 リン酸化をしたり細胞骨格が会合したりするためにはＰＥＣＡＭ−１自体、ある いはその他のイソ型に比べて異なる能力を持っていなくてはならない。 他の研究者らは最近、発育した心臓内皮細胞から得たマウスのＰＥＣＡＭ−１ イソ型である、マウスＰＥＣＡＭ−１△１２，１５を単離してその特徴を明らか にした。このイソ型はマウスのＰＥＣＡＭ−１に対する遺伝子のエキソン１２及 び１５に対応するセグメントを欠如する完全な長さの分子をコードするＲＮＡと は異なるＲＮＡによってコードされているため、完全な長さで成熟した分子の配 列とは異なるアミノ酸配列を持っている。 このように、細胞質のている部分に対応する領域にあるＰＥＣＡＭ−１遺伝子 の高度に分割されたエキソン／イントロン機構は、たくさんのＰＥＣＡＭ−１イ ソ型を発生させるために形成されていることが明らかであろう。 驚くべきことに、ＰＥＣＡＭ−１のゲノムＤＮＡのたくさんのエキソンからな るモザイク構造は、細胞質領域に広がっている。一個のエキソンに膜貫通ドメイ ンと細胞質ドメインのコード領域とを合同させている相同性タンパク質のＩＣＡ Ｍ−１及びＶＣＡＭ−１に対する遺伝子とは違って、ＰＥＣＡＭ−１の細胞質の ている部分は、７個の分離した小さなエキソン、即ちそのそれぞれが別個の機能 を持つドメインを表すことが明らかであるようなエキソンによってコードされて いるＲＮＡでコードされていることがわかった。 実施例２ この実施例では、ＰＥＣＡＭ−１あるいはそのイソ型に対するｃＤＮＡから、 特に前もって決めたセグメントを除去する方法を提供する。この実施例において その方法は、配列番号：４に示されたエキソン９の塩基４４−１００に対応する ｃＤＮＡセグメントを除去するために用いられる。このｃＤＮＡセグメントは、 「膜貫通ドメイン」をコードするＰＥＣＡＭ−１−コードｍＲＮＡのセグメント についてコードしている。このセグメントを欠如するｃＤＮＡから発現させたＰ ＥＣＡＭ−１のイソ型は可溶性である。 当業者は、完全な長さのＰＥＣＡＭ−１あるいはそのイソ型をコードするｍＲ ＮＡをコードするｃＤＮＡセグメントから、エキソン９−１５の一個あるいはそ れ以上に対応するセグメントを除去する目的でここに記載されている方法を容易 に適用することができる。この方法を適用する際に必要とされる情報は、ＰＥＣ ＡＭ−１のゲノムＤＮＡに存在するエキソンの配列（したがって、ＰＥＣＡＭ− １のｃＤＮＡにおけるエキソンの境界）についてここで提供された情報、また完 全な長さのＰＥＣＡＭ−１に対するｃＤＮＡの配列について（例えば、'554特許 、Stockinger et al.，前出、及びZehnder et al., 前出参照）、制限酵素の認 識部位及び開裂部位の配列について、及び多くの好適なクローニングベクターの 配列についての情報などの当業者が容易に入手できる知識である。 ここに説明した手法は、Kahn（1990 Technique−A Journal of Methods in Ce ll and Molecular Biology 2, 27-30に記載された手法を基礎としている。 '554特許の図１に図示されている配列のＰＥＣＡＭ−１ ｃＤＮＡは、ベクタ ー内の二つのＥｃｏＲ１部位の間に保持させた。実際には、その図に示されてい るｃＤＮＡの５’−末端にある５’−ＧＡＡＴＴはＥｃｏＲ１部位の一部でｃＤ ＮＡライブラリーを調製する方法の人為的な構造であり、ｃＤＮＡはそこから得 られるものであってそのライブラリーからそのｃＤＮＡを単離した。 '554特許の図１に示されている配列を持つＰＥＣＡＭ−１のｃＤＮＡを、より 好適なｃＤＮＡ、即ち図１に示された配列のｃＤＮＡにある二つの内部ＥｃｏＲ １部位を持たない都合のよいｃＤＮＡに、部位指向性の突然変異誘発を行うこと によって変換した。この図に示された６８４−６８９位にあるＥｃｏＲ１部位の 配列は、％’−ＧＡＡＣＴＣに変わった。この図に示された７１５−７２０位に ある部位の配列は、５’−ＧＡＧＴＴＣに変わった。二つの塩基置換はサイレン トである。得られたｃＤＮＡについてはここでは、「図１のＥｃｏＲ１のない」 ＰＥＣＡＭ−１ｃＤＮＡとも言われる。 図１のＥｃｏＲ１のないＰＥＣＡＭ−１ ｃＤＮＡを、ｐＧＥＭ−７プラスミ ドベクター（Promega）のＥｃｏＲ１部位にクローニングした。ここではそれは 、製造、修飾、発現ベクターあるいは他の目的の別のベクターに移す際のＥｃｏ Ｒ１による切除を行うために都合よく保持されている。ｐＧＥＭ−７以外のこの 技術で有用な他の多くのベクターが、これらの目的に対するものと同様に適合す るであろう。 ｐＧＥＭ−７ベクター内の図１のＥｃｏＲ１のないＰＥＣＡＭ−１ ｃＤＮＡ の３４３塩基対セグメント、即ち'554特許の図１に示された配列の塩基１６０２ −１９４４を、配列番号：１６の配列を持つプライマーと、配列番号：１７の配 列を持つプライマーを用いてＰＣＲ法を行うことで増幅した。増幅した生成物は ３６１塩基対セグメントであって、本明細書においては「セグメントＡ」と言わ れており、それは'554特許の図１に示されたような塩基２００２−２０１９の配 列を持ち、一方の端部が３４３塩基対のセグメントでもう一方の端部が1８塩基 対のセグメントからなっている。セグメントＡは、反応混合物から単離された。 '554特許の図１に示されているような塩基１９４５−２００１の配列を持つＣ ＤＮＡセグメントは、配列番号：４に示されている塩基４４−１００の配列を持 つエキソン９のセグメントに対応していることに注目されたい。 ｐＧＥＭ−７ベクター内の図１のＥｃｏＲ１のないＰＥＣＡＭ−１ ｃＤＮＡ の４８１塩基対セグメント、即ち'554特許の図１に示された配列の塩基２００２ −２４８２を、配列番号：１８の配列を持つプライマーと、配列番号：１９の配 列を持つプライマーを用いてＰＣＲ法を行うことで増幅した。増幅した生成物は ４９７塩基対のセグメントであって、本明細書においては「セグメントＢ」と言 われており、それは'554特許の図１に示されたような塩基１９２９−１９４４の 配列を持ち、一方の端部が４８１塩基対のセグメントでもう一方の端部が１６塩 基対のセグメントからなっている。セグメントＢは、反応混合物から単離された 。 セグメントＡの一方の端部にある３４塩基対の配列が、セグメントＢの一方の 端部にある３４塩基対のセグメントの配列と同じであることに注目されたい。そ れゆえにセグメントＡのそれぞれの鎖がセグメントＢの鎖の一方を鋳型としてプ ライマー伸長反応を開始することができ、またセグメントＢのそれぞれの鎖がセ グメントＡの一方を鋳型としてプライマー伸長反応を開始することができる。 次にＰＣＲ反応を、セグメントＡ、セグメントＢ、配列番号：２０の配列を持 つプライマー、及び配列番号：２１の配列を持つプライマーを組み合わせて行っ た。この反応の主要生成物は５３３塩基対のセグメントであり、それは一方の端 部に'554特許の図１に示された塩基１７５４−１９４４の配列を持つサブセグメ ントを結合し、他方の端部に図１に示された塩基２００２−２３４３の配列を持 つサブセグメントを結合した「セグメントＣ」とここでは言われている。 セグメントＣは、'554特許の図１に示されている塩基１８２５−１８３０に対 応するサブセグメントとしてＮｈｅＩ部位（５’−ＧＣＴＡＧＣ）５’−末端で ＧとＣの間を開裂する）と、'554特許の図１に示されている塩基２２４７−２２ ５２に対応するサブセグメントとしてＢｇｌＩＩ部位（５’−ＡＧＡＴＣＴ、５ ’−末端でＡとＧの間を開裂する）とを持っている。 セグメントＣを、ＮｈｅＩとＢｇｌＩＩを用いて切り取って、約３６９ｂｐの フラグメントを単離した。 ｐＧＥＭ−７ベクター内の完全な長さの図１のＥｃｏＲ１のないＰＥＣＡＭ− １ ｃＤＮＡもＮｈｅｌとＢｇｌＩＩを用いて切り取って、より大きなフラグメ ントを単離した。ｐＧＥＭ−７ベクター自体はＮｈｅＩ及びＢｇｌＩＩに対する 部位がないことに注意してほしい。 セグメントＣの３６９塩基対フラグメントを次に、図１のＥｃｏＲ１のないＰ ＥＣＡＭ−１ ｃＤＮＡを持つｐＧＥＭ−ベクターをＮｈｅＩ／ＢｇｌＩＩ−開 裂して得られた大きなフラグメントにリガーゼ反応させた。得られたベクターは 、'554特許の図１に示されている完全なアミノ酸配列、ただし「膜貫通ドメイン 」のアミノ酸であるその図に示されたアミノ酸５７５−５９３、あるいはこれと は別の場合で配列番号：４に示されているアミノ酸９−２７を除外した完全なア ミノ酸配列を持つ可溶性のＰＥＣＡＭ−１イソ型に対するｃＤＮＡを持っていた 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/47 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/02 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＥ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 グミーナ リチャード ジェイ. アメリカ合衆国 ウィスコンシン州 ミル ウォーキー 61スト ストリート 2535 エヌ. (72)発明者 キルシュバーム ナンシー アメリカ合衆国 ウィスコンシン州 ミル ウォーキー リッチモンド アベニュー 6132 ダブリュ.

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ｉ）配列番号：１と実質的に同じ配列あるいは配列番号：１のヌクレオチ ド４９２を含みその転写制御活性のあるサブ配列を有し、（ii）セグメントがヒ トの血小板−内皮細胞接着性分子−１に対する遺伝子の５’に直接接して位置す るならばヒト染色体１７の長腕上にない、プロモーターセグメント。 ２．配列番号：１及び配列番号：２からなる群より選択される配列を持つ、請求 の範囲１に記載のプロモーターセグメント。 ３．アンチセンスＲＮＡあるいはタンパク質の製造のための第１ＤＮＡセグメン トであって、該第１ＤＮＡセグメントが第２ＤＮＡセグメント及び第３ＤＮＡセ グメントを含み、該第２ＤＮＡセグメントが、配列番号：１または配列番号：１ のヌクレオチド４９２を含むその転写抑制活性サブ配列と実質的に同じ配列を有 するプロモーターセグメントであって、該第３ＤＮＡセグメントの転写のために 操作可能に該第３ＤＮＡセグメントに関連して位置しており、該第３ＤＮＡセグ メントが、（ｉ）該第１ＤＮＡセグメントがアンチセンスＲＮＡの生成のための ものであるならば、そのアンチセンスＲＮＡの配列を有する一本鎖であって、そ の第３ＤＮＡセグメントの転写によりアンチセンスＲＮＡを生成するように該第 ２ＤＮＡセグメントに関連して配向されており、あるいは（ii）該第１ＤＮＡセ グメントがタンパク質の生成のためのものであるならば、該タンパク質に対する 遺伝子あるいはｃＤＮＡであって該第３ＤＮＡセグメントからの発現による該タ ンパク質の生成のために該第２ＤＮＡセグメントに関連して配向されており、該 第３ＤＮＡセグメントがヒトの血小板−内皮細胞接着性分子−１に対する遺伝子 であるならば、該第１ＤＮＡセグメントはヒト染色体１７の長腕に存在せず、該 第２ＤＮＡセグメントの３’−末端が該遺伝子の第１エキソンの５’−末端に直 接的に連結するように構成されている、第１ＤＮＡセグメント。 ４．第２ＤＮＡセグメントが配列番号：１及び配列番号：２からなる群より選択 される配列を有する、請求の範囲３に記載の第１ＤＮＡセグメント。 ５．タンパク質を生成するための、請求の範囲３に記載の第１ＤＮＡセグメント 。 ６．第３ＤＮＡセグメントがタンパク質に対するｃＤＮＡである、請求の範囲５ に記載の第１ＤＮＡセグメント。 ７．タンパク質を生成するための、請求の範囲４に記載の第１ＤＮＡセグメント 。 ８．第３ＤＮＡセグメントがタンパク質に対するｃＤＮＡである、請求の範囲７ に記載の第１ＤＮＡセグメント。 ９．アンチセンスＲＮＡを生成するための、請求の範囲３に記載の第１ＤＮＡセ グメント。 １０．アンチセンスＲＮＡを生成するための、請求の範囲４に記載の第１ＤＮＡ セグメント。 １１．実質的に単離されたヒトの血小板−内皮細胞接着性分子−１のイソ型であ って、該イソ型が完全な長さで成熟しており、イソ型を調製するために翻訳され るｍＲＮＡがヒトの血小板−内皮細胞接着性分子−１に対する遺伝子のエキソン １０−１５に対応するｍＲＮＡセグメントのうちの一個あるいはそれ以上のｍＲ ＮＡセグメントを欠損しており、任意で該遺伝子の全体においてエキソン９に対 応するｍＲＮＡセグメントあるいは配列番号：４に示されている塩基対４４〜１ ００を含み、かつ３で均等に割り切れる数の塩基対を持つ該エキソン９の連続す るセグメントを欠損していることを除けば、ヒトの血小板−内皮細胞接着性分子 −１を調製するために翻訳されるｍＲＮＡと同じｍＲＮＡを翻訳することで得ら れるアミノ酸の配列を有する、ヒトの血小板−内皮細胞接着性分子−１のイソ型 。 １２．ＰＥＣＡＭ−１△１３、ＰＥＣＡＭ−１△９，１３、イソ型を調製するた めに翻訳されるｍＲＮＡがヒトの血小板−内皮細胞接着性分子−１に対する遺伝 子のエキソン１３に対応するｍＲＮＡセグメント及び配列番号：４に示されてい る塩基対４４〜１００を含む該遺伝子のエキソン９のセグメントに対応するｍＲ ＮＡセグメントを欠損していることを除けば、ヒトの血小板−内皮細胞接着性分 子−１を調製するために翻訳されるｍＲＮＡと同じｍＲＮＡを翻訳することで得 られるアミノ酸の配列を有するイソ型、ＰＥＣＡＭ−１△１４であるイソ型、Ｐ ＥＣＡＭ−１△９，１４であるイソ型、及びイソ型を調製するために翻訳される ｍＲＮＡがヒトの血小板−内皮細胞接着性分子−１に対する遺伝子のエキソン１ ４に対応するｍＲＮＡセグメント及び配列番号：４に示されている塩基対４４〜 １００を含む該遺伝子のエキソン９のセグメントに対応するｍＲＮＡセグメント を欠損していることを除けば、ヒトの血小板−内皮細胞接着性分子−１を調製す るために翻訳されるｍＲＮＡと同じｍＲＮＡを翻訳することで得られるアミノ酸 の配列を有するイソ型とからなる群より選択される、請求の範囲１１に記載のイ ソ型。 １３．血小板−内皮細胞接着性分子−１の１型、２型、３型、及び４型からなる 群より選択される、請求の範囲１１に記載のイソ型。 １４．血小板−内皮細胞接着性分子−１の１型、２型、３型、及び４型からなる 群より選択される、請求の範囲１２に記載のイソ型。 １５．ヒトの血小板−内皮細胞接着性分子−１のイソ型の転写産物をコードする 完全な長のＤＮＡセグメントであって、イソ型を調製するために翻訳されるｍＲ ＮＡがヒトの血小板−内皮細胞接着性分子−１に対する遺伝子のエキソン９〜１ ５に対応するｍＲＮＡセグメントのうちの一個あるいはそれ以上のｍＲＮＡセグ メントを欠損しており、かつ該イソ型を調製するために翻訳される該ｍＲＮＡが 該遺伝子のエキソン９に対応する完全なセグメントを欠損していないならば、イ ソ型を調製するために翻訳される配列番号：４に示されている塩基対４４−１０ ０を含みかつ３で均等に割り切れる数の塩基対を持つ該エキソン９の連続するサ ブセグメントに対応するｍＲＮＡセグメントを任意で欠損していることを除けば 、ヒトの血小板−内皮細胞接着性分子−１を調製するために翻訳されるｍＲＮＡ と同じｍＲＮＡを翻訳することで得られるアミノ酸の配列を有する、ＤＮＡセグ メント。 １６．ＰＥＣＡＭ−１△１３、ＰＥＣＡＭ−１△９，１３、イソ型を調製するた めに翻訳されるｍＲＮＡがヒトの血小板−内皮細胞接着性分子−１に対する遺伝 子のエキソン１３に対応するｍＲＮＡセグメント及び配列番号：４に示されてい る塩基対４４〜１００を含む該遺伝子のエキソン９のセグメントに対応するｍＲ ＮＡセグメントを欠損していることを除けば、ヒトの血小板−内皮細胞接着性分 子−１を調製するために翻訳されるｍＲＮＡと同じｍＲＮＡを翻訳することで得 られるアミノ酸の配列を有するヒトの血小板−内皮細胞接着性分子−１のイソ型 、ＰＥＣＡＭ−１△１４、ＰＥＣＡＭ−１△９，１４、及びイソ型を調製するた めに翻訳されるｍＲＮＡがヒトの血小板−内皮細胞接着性分子−１に対する遺伝 子のエキソン１４に対応するｍＲＮＡセグメント及び配列番号：４に示されてい る塩基対４４〜１００を含む該遺伝子のエキソン９のセグメントに対応するｍＲ ＮＡセグメントを欠損していることを除けば、ヒトの血小板−内皮細胞接着性分 子−１を調製するために翻訳されるｍＲＮＡと同じｍＲＮＡを翻訳することで得 られるアミノ酸の配列を有するヒトの血小板−内皮細胞接着性分子−１のイソ型 とからなる群より選択されることを特徴とするイソ型の転写産物をコードする、 請求の範囲１５に記載のＤＮＡセグメント。 １７．ＰＥＣＡＭ−１△９のイソ型である転写産物をコードする、請求の範囲１ ５に記載のＤＮＡセグメント。 １８．血小板−内皮細胞接着性分子−１の１型、２型、３型、及び４型からなる 群より選択される血小板−内皮細胞接着性分子−１のイソ型の転写産物をコード する、請求の範囲１５に記載のＤＮＡセグメント。 １９．血小板−内皮細胞接着性分子−１の１型、２型、３型、及び４型からなる 群より選択される血小板−内皮細胞接着性分子−１のイソ型の転写産物をコード する、請求の範囲１６に記載のＤＮＡセグメント。 ２０．該血小板−内皮細胞接着性分子−１の１型、２型、３型、及び４型からな る群より選択される血小板−内皮細胞接着性分子−１のイソ型の転写産物をコー ドする、請求の範囲１７に記載のＤＮＡセグメント。 ２１．ｃＤＮＡセグメントである、請求の範囲第１５項記載のＤＮＡセグメント 。 ２２．ｃＤＮＡセグメントである、請求の範囲第１７項記載のＤＮＡセグメント 。 ２３．ｃＤＮＡセグメントである、請求の範囲第１８項記載のＤＮＡセグメント 。 ２４．ｃＤＮＡセグメントである、請求の範囲第２０項記載のＤＮＡセグメント 。 ２５．ヒトの血小板−内皮細胞接着性分子−１のイソ型の転写産物をコードする 完全な長さのＤＮＡセグメントを使用する方法であって、イソ型を調製するため に翻訳されるｍＲＮＡがヒトの血小板−内皮細胞接着性分子−１に対する遺伝子 のエキソン９〜１５に対応するｍＲＮＡセグメントのうちの一個あるいはそれ以 上のｍＲＮＡセグメントを欠損しており、かつ該イソ型を調製するために翻訳さ れる該ｍＲＮＡが該遺伝子のエキソン９に対応する完全なセグメントを欠損して いないならば、配列番号：４に示されている塩基対４４〜１００を含みかつ３で 均等に割り切れる数の塩基対を持つ該エキソン９の連続するサブセグメントに対 応するｍＲＮＡセグメントを任意で欠損していることを除けば、該イソ型はヒト の血小板−内皮細胞接着性分子−１を調製するために翻訳されるｍＲＮＡと同じ ｍＲＮＡを翻訳することで得られるアミノ酸の配列を有する、該ＤＮＡセグメン トを発現する工程を含むＤＮＡセグメントの使用方法。 ２６．ＤＮＡセグメントが哺乳動物の培養細胞で発現する、請求の範囲２５に記 載の使用方法。 ２７．調製されたイソ型が、１型、２型、３型及び４型のＰＥＣＡＭ−１△１３ 、１型、２型、３型及び４型のＰＥＣＡＭ−１△９，１３、１型、２型、３型及 び４型のＰＥＣＡＭ−１△１４、１型、２型、３型及び４型のＰＥＣＡＭ−１△ ９，１４、並びに１型、２型、３型及び４型のイソ型であって、イソ型を調製す るために翻訳されるｍＲＮＡが、該型のヒトの血小板−内皮細胞接着性分子−１ に対する遺伝子のエキソン１３及びエキソン１４のうちの一つに対応するｍＲＮ Ａセグメント及び配列番号：４に示されている塩基対４４〜１００を含む該遺伝 子のエキソン９のセグメントに対応するｍＲＮＡセグメントを欠損していること を除けば、該型のヒトの血小板−内皮細胞接着性分子−１を調製するために翻訳 されるｍＲＮＡと同じｍＲＮＡを翻訳することで得られるアミノ酸の配列を有す るイソ型とからなる群より選択される、請求の範囲２５に記載の方法。 ２８．調製されたイソ型が１型、２型、３型、及び４型のＰＥＣＡＭ−１△９か らなる群より選択される、請求の範囲２５に記載の方法。 ２９．調製されたイソ型が、１型、２型、３型及び４型のＰＥＣＡＭ−１△１３ 、１型、２型、３型及び４型のＰＥＣＡＭ−１△９，１３、１型、２型、３型及 び４型のＰＥＣＡＭ−１△１４、１型、２型、３型及び４型のＰＥＣＡＭ−１△ ９，１４、並びに１型、２型、３型及び４型のイソ型であって、イソ型を調製す るために翻訳されるｍＲＮＡが該型のヒトの血小板−内皮細胞接着性分子−１に 対する遺伝子のエキソン１３及びエキソン１４のうちの一つに対応するｍＲＮＡ セグメント及び配列番号：４に示されている塩基対４４〜１００を含む該遺伝子 のエキソン９のセグメントに対応するｍＲＮＡセグメントを欠損していることを 除けば、該型のヒトの血小板−内皮細胞接着性分子−１を調製するために翻訳さ れるｍＲＮＡと同じｍＲＮＡを翻訳することで得られるアミノ酸の配列を有する イソ型とからなる群より選択される、請求の範囲２６に記載の方法。 ３０．調製されたイソ型が、１型、２型、３型、及び４型のＰＥＣＡＭ−１△９ からなる群より選択される、請求の範囲２６に記載の方法。 ３１．使用されるＤＮＡセグメントがｃＤＮＡセグメントである、請求の範囲２ ５に記載の方法。 ３２．使用されるＤＮＡセグメントがｃＤＮＡセグメントである、請求の範囲２ ６に記載の方法。 ３３．使用されるＤＮＡセグメントがｃＤＮＡセグメントである、請求の範囲２ ８に記載の方法。 ３４．使用されるＤＮＡセグメントがｃＤＮＡセグメントである、請求の範囲３ ０に記載の方法。