JP2798240B2 - インターフェロン誘起遺伝子及び酵素 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はインターフェロン誘起の
（２′−５′）オリゴＡ合成酵素遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃ
ＤＮＡ、および（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ活
性を保有する諸酵素に関する。 【０００２】 【従来の技術】インターフェロンの生物学的影響の多く
は、ＩＦＮにさらされた細胞で新しく誘起されるｍＲＮ
Ａと蛋白とに仲介されるように見える（抄録：Ｒｅｖｅ
ｌ，１９８４；Ｌｅｂｌｅｕ ａｎｄ Ｃｏｎｔｅｎ
ｔ，１９８２；Ｂａｇｌｉｏｎｉａｎｄ Ｎｉｌｓｏ
ｎ，１９８３）。これらＩＦＮ−誘起蛋白質のうち二群
が特に重要である：１）翻訳調整諸酵素（ｄｓＲＮＡ依
存蛋白キナーゼおよび（２′−５′）オリゴＡシンセタ
ーゼ，（２′−５′）オリゴＡで活性化されたヌクレア
ーゼの２′−フォスフォ ディ エステラーゼ）及び
２）細胞表面諸抗原（ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｂ２−ミク
ログロブリン，ＨＬＡ−ＤＲ）。他の細胞内蛋白質や放
出蛋白質も又重要な役目を演ずるであろう（Ｗｅｉｌ
ｅｔ ａｌ，１９８３；Ｃｈｅｂａｔｈ ｅｔ ａｌ，
１９８３；Ｗａｌｌａｃｈ ｅｔ ａｌ，１９８３）。
ＨＬＡ諸遺伝子を例外として（Ｍａｌｉｓｓｅｎ ｅｔ
ａｌ，１９８２；Ｓｃｈａｍｂｏｅｃｋ ｅｔ ａ
ｌ，１９８３），ＩＦＮ−誘起の諸蛋白質の構造と場合
によっては機能は不明であり、従ってそれに依って諸Ｉ
ＦＮが特定的にこれら諸遺伝子を活性化する機構も不明
である。これらの疑問に答えて、幾つかのＩＦＮ−誘起
遺伝子のｃＤＮＡが最近クローン化された（Ｃｈｅｂａ
ｔｈ ｅｔ ａｌ，１９８３；Ｍｅｒｌｉｎ ｅｔ ａ
ｌ，１９８３；Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９８
４；Ｓａｍａｎｔａ ｅｔ ａｌ，１９８４）。 【０００３】特に、人間の（２′−５′）オリゴＡシン
セターゼをコードしたｃＤＮＡと遺伝子が研究されて，
その酵素はｄｓＲＮＡ−誘起のものでＡＴＰをｐｐｐ
（Ａ２′ｐＡ）ｎオリゴマーに転換し（Ｋｅｒｒ ａｎ
ｄ Ｂｒｏｗｎ，１９７８），その代わりに潜在のＲＮ
ａｓｅ Ｆに結合して活性化する（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅ
ｔ ａｌ，１９７８）。この（２′−５′）オリゴＡシ
ンセターゼは、これら三型のヒトＩＦＮ総てで細胞内で
強く誘起され、そしてその増加は、ＩＦＮ活性の優れた
指標である（Ｗａｌｌａｃｈ ｅｔ ａｌ，１９８
２）。この酵素は造血細胞の分化中に誘起され、ＩＦＮ
−βのオートクリン分泌を指示する（Ｙａｒｄｅｎ ｅ
ｔ ａｌ，１９８４）。この酵素は後に胚の同調繊維芽
細胞のＳ期にも同様に誘起される（Ｗｅｌｌｓ ａｎｄ
Ｍａｌｌｕｃｃｉ，１９８５）。この酵素活性は細胞
生長が始まると低下し（Ｅｔｉｅｎｎｅ−Ｓｍｅｋｅｎ
ｓ ｅｔａｌ，１９８３；Ｃｒｅａｓｅｙ ｅｔ ａ
ｌ，１９８３）そして、ＩＦＮの反生長作用に関連して
いるように見える（Ｋｉｍｃｈｉ ｅｔ ａｌ，１９８
１）。（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ又は（２′
−５′）オリゴＡ−誘起のＲＮａｓｅ Ｆ欠乏は、これ
がＩＦＮのウイルス生長抑制の唯一の機構では多分無い
が（Ｌｅｂｌｅｕ ａｎｄ Ｃｏｎｔｅｎｔ，１９８
２），諸ＩＦＮの抗ウイルス効果の部分消滅と関連づけ
られて来た（Ｓａｌｚｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，１９８
３；Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ，１９８１）。 【０００４】この（２′−５′）オリゴＡヌクレオチド
は、多くの真核生物細胞で検出され、バクテリアでさえ
見出された（Ｌａｕｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ，１９８
４）。そして、この合成酵素は多分広範囲に分布したも
のであろう。この酵素はマウスから（Ｄｏｕｇｈｅｒｔ
ｙ ｅｔ ａｌ，１９８０）及びヒト細胞から（Ｙａｎ
ｄ ｅｔ ａｌ，１９８１；Ｒｅｖｅｌ ｅｔ ａｌ，
１９８１）純化され、大小二型の酵素が観察されている
が（Ｒｅｖｅｌ ｅｔ ａｌ，１９８２；ｓｔ，Ｌａｕ
ｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ，１９８３）、構造は未解明であ
る。 【０００５】ＩＦＮにさらされた細胞内に誘起された
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ（Ｈｏｂａｎｅｓ
ｓｉａｎ ｅｔ ａｌ，１９７７；Ｚｉｌｂｅｒｓｔｅ
ｉｎｅｔ ａｌ，１９７８）は種々の異常な特性を持
つ。それの主な活性は、ＡＴＰから５′三燐酸化短オリ
ゴＡ鎖を合成する事である（主として２連体から５連
体、最長１５連Ａの）が、他のＲＮＡ重合酵素と違っ
て、オリゴＡのアデニン化物の２′ＯＨに特定的にアデ
ニン化物又はもう１つのヌクレオチドを添加（Ｋｅｒｒ
ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，１９７８；Ｓａｍａｎｔａ ｅ
ｔ ａｌ，１９８０）するか、ＮＡＤのようなフリー
２′ＯＨのアデニン化物を持った他の（オリゴ）又はヌ
クレオチド（Ｂａｌｌ，１９８０）又は、ｔＲＮＡにさ
え（Ｆｅｒｂａｓｅｔ ａｌ，１９８１）添加する。活
性を保つためには、この酵素は、最短５０ｂｐ以上のＲ
ＮＡ複鎖部分と結合しなければならない（Ｍｉｎｋｓ
ｅｔ ａｌ，１９７９）、従って、幾つかの結合部分を
所有しなければならない：ヌクレオチド三燐酸用、２′
ＯＨアデノシン ポリヌクレオチド用および複鎖ＲＮＡ
用。この酵素は、２′，５′ＡＤＦ−セファロース（Ｊ
ｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ，１９８０）、ポリ（ｒ
Ｉ）（ｒＣ）−アガロース（Ｈｏｒａｎｅｓｓｉａｎｅ
ｔ ａｌ，１９７７）及びＣｉｂａｃｒｏｎブルーセフ
ァロース（Ｒｅｖｅｌ ｅｔ ａｌ，１９８１）に吸着
する。 【０００６】細胞の違いによって、この（２′−５′）
オリゴシンセターゼ活性はサイトゾル（Ｒｅｖｅｌ ｅ
ｔ ａｌ，１９８１）中で見られたり、リボソーム塩洗
出物（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ，１９８０）で
見られたり、核液中にあったり（Ｎｉｌｓｅｎ ｅｔ
ａｌ，１９８２ｂ）、核膜にさえ多量に見出されてい
る。細胞ＲＮＡはこの酵素の活性化に際し、ポリ（ｒ
Ｉ）（ｒＣ）に代行し得る事は注意すべきであり（Ｒｅ
ｖｅｌ ｅｔ ａｌ，１９８０）、このシンセターゼ
は、ＨｎＲＮＡの加工にさえ役割を持つかも知れない
（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔａｌ，１９８２ａ）。（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼの幾らかは細胞質膜に結合
し、出芽ウイルス粒に包含される（Ｗａｌｌａｃｈ ａ
ｎｄ Ｒｅｖｅｌ，１９８０）。このような複雑な相互
作用は、（２′−５′）オリゴＡシステムの局所的作用
を確保して（Ｎｉｌｓｅｎ ａｎｄ Ｂｅｇｌｉｏｎ
ｉ，１９８３）正常細胞、ウイルス感染細胞で指摘され
る複数の役割を説明可能にする。この合成酵素の含量
は、ＩＦＮ−処理細胞の全蛋白質の０．１％以下であ
り、その分子構造は直接に決定できなかった。 【０００７】（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ含量
測定値をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎｖｉｖｏで、細胞が
ＩＦＮにさらされ、それに反応しているか否かの決定に
使用できる。この測定は、未知の溶液におけるＩＦＮの
検定に、細胞を刻溶液にさらし、（２′−５′）オリゴ
Ａシンセターゼ含量を決定する事で使用することができ
る（Ｒｅｖｅｌ ｅｔ ａｌ．，米国特許４，３０２，
５３３）。この測定は人間を含む総ての生物でＩＦＮ生
産量が増したか否かを決めるのにも又使用できる。 【０００８】 【発明が解決しようとする課題】（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ測定の臨床的反応 健康個体の末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）では（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼ含量が比較的に恒常である
ことがわかっている（Ｓｃｈａｔｔｎｅｒ ｅｔ ａ
ｌ，１９８１ｂ）。（２′−５′）オリゴＡシンセター
ゼの増加は、急性ウイルス感染患者（Ｓｃｈａｔｔｎｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１ｂ；Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄ
ｅｔ ａｌ．，１９８５）、持続性ウイルス感染（Ｗ
ａｌｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８２）、自己免疫病
及びヤコブ−クロイツフェルト病のような感染病と見ら
れる幾つかの他の症候群（Ｒｅｖｅｌ ｅｔ ａｌ．，
１９８２）などに見られる、。（２′−５′）オリゴＡ
シンセターゼの基本含量は顆粒球では低いが、ウイルス
感染により大きく増量することがみられた（Ｓｃｈａｔ
ｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。ＡＩＤＳ患者の
ＰＢＭＣにおける（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ
酵素増加が最近報告された（Ｒｅａｄ ｅｔａｌ．，１
９８５）。動物の場合、（２′−５′）オリゴＡシンセ
ターゼ量の増加は速く、ＩＦＮの血中出現より恒常的で
ある（Ｓｃｈａｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ，１９８２
ａ）。（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ量は数週間
高水準を保つのに対してＩＦＮの最高値は短期的であ
る。 【０００９】（２′−５′）オリゴＡシンセターゼの造
血細胞分化中の増加は、ＩＦＮ−βのオートクリン分泌
の結果である（Ｙａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ，１９８
４）。急性白血病で多数の芽細胞と共に（２′−５′）
オリゴＡシンセターゼ水準の低下が見られる（Ｗａｌｌ
ａｃｈ ｅｔ ａｌ，１９８２；Ｓｃｈａｔｔｎｅｒ
ｅｔ ａｌ，１９８２ｂ）。（２′−５′）オリゴＡシ
ンセターゼ測定の重要な応用分野の他の１つは、ＩＦＮ
治療患者の監視である。臨床変化の他に、ＰＢＭＣの
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ水準を測定し、患
者のＩＦＮ投与への反応を決定することができ、この全
身投与の場合、ＩＦＮ−αの投与でもＩＦＮ−βの投与
でも酵素水準は５−１０倍の増大となる（Ｓｃｈａｔｔ
ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１ａ，Ｓｃｈｏｅｎｆｅ
ｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。他の、ＩＦＮ誘起の
諸活性又は諸分子の検定は、（２′−５′）オリゴＡシ
ンセターゼ酵素の検定と同様に使用可能であることは明
らかであるが、この方法が最も広く用いられている（Ｒ
ｅａｄ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｍｅｒｒｉｔｔ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８５）。これらの研究ではすべて、Ａ
ＴＰの（２′−５′）（Ａ）ｎオリゴマーへの転換を測
定する酵素的検定を用いている（Ｒｅｖｅｌ ｅｔ ａ
ｌ．，米国特許４，３０２，５３３）。 【００１０】（２′−５′）オリゴＡシンセターゼの検
定には、抗（２′−５′）オリゴＡシンセターゼペプチ
ド抗体を用いることができる。（２′−５′）オリゴＡ
シンセターゼのための抗体入手には、種々の（２′−
５′）オリゴＡ諸シンセターゼの全アミノ酸配列からペ
プチド配列を選び、内在（２′−５′）オリゴＡシンセ
ターゼ分子への抗体誘起のための抗原に用いることがで
きる。兎に抗体を作らせる為に抗原ペプチドを皮下注射
した。抗体反応が最大となる迄促進注射を繰返した。 【００１１】 【課題を解決するための手段】今回の発明は、（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼ活性のある１つの酵素をコ
ードするヒトＤＮＡに関するものである。ＤＮＡの型の
１つは図７Ａに示したヌクレオチド配列を持つ。他の型
のＤＮＡはＦｉｇｕｒｅ７Ａに示し、図７Ｂに示す９０
１−１５９０のヌクレオチド配列と重複する１−１３２
２のヌクレオチド配列を持つ。（２′−５′）オリゴＡ
シンセターゼ活性を持つ１つの酵素は、図７Ａに示すア
ミノ酸配列を持つ。（２′−５′）オリゴＡシンセター
ゼ活性をもつもう１つの酵素は、図７Ａに示す１−３６
４のアミノ酸配列を持ち、図７Ｂに示す２９０−４００
のアミノ酸配列と重複する。図７Ａと図７Ｂのヌクレオ
チド配列と相補的なヌクレオチド配列を持つ１．６ｋｂ
と１．８ｋｂのＲＮＡが単離されている。 【００１２】患者のインターフェロン投与に対する反応
を監視する方法は、（２′−５′）オリゴＡシンセター
ゼｍＲＮＡの細胞内又は体内濃度をそれに相補的なＤＮ
ＡとそのｍＲＮＡとをハイブリッド形成を行うことによ
って測定することから成っている。現発明の抗原性蛋白
質は図７Ａと図７Ｂに示したアミノ酸配列の中に含まれ
るアミノ酸配列を持つ。この抗原諸ペプチドに対して生
じた諸抗体は（２′−５′）オリゴＡシンセターゼを認
識し、免疫沈澱を行う。 【００１３】被検体でのインターフェロン活性を監視す
る方法は、被検体の細胞内又は体液の（２′−５′）オ
リゴＡシンセターゼ含量を、既定の時間隔で測定する
事、被検体の細胞内又は体液内でのシンセターゼ含有量
の相異を種々の時間隔で決定し、そこから被検体の細胞
内や体液内でのシンセターゼの量を決定し、それによっ
て被検体のインターフェロン活性をはかるものである。
このシンセターゼは、シンセターゼを今回の発明による
抗体と接触させて複合体を作り、作られた複合体の量を
決定することによって測定される。 【００１４】更に、今回の発明は（２′−５′）オリゴ
Ａシンセターゼの２つの抗体に関するもので、その抗体
は、（２′−５′）オリゴＡシンセターゼのアミノ酸配
列の一部を持つ抗原を調整することにより得られるもの
である。その抗−（２′−５′）オリゴシンセターゼペ
プチド抗体は、その酵素を検出する為に使用できるもの
である。 【００１５】図面の概説 図１は（２′−５′）オリゴＡシンセターゼＥ1 ｃＤＮ
Ａクローン１７４−３の構造と配列とを示す：図１Ａは
Ｅ1 ｃＤＮＡクローン１７４−３の制限酵素切断位置地
図を示す。挿入の諸塩基対は、ｐＢＲ３２２ＤＮＡと同
じ順序で番号付けしてある。ｐＢＲＥｃｏＲＩ位置は右
にある。挿入のどちらの鎖も（点線）、縦線で示した制
限切断位置から配列決定をした（Ｍａｘａｍ ＆ Ｇｉ
ｌｂｅｒｔ，１９８０）。コード鎖は、右から左に向っ
て５′から３′のものである。右Ｐｓｔ１位置につづい
て１７Ｇと７２Ｔがあり、２ヌクレオチドのＧＡが続
き、（Ｂ）に示した配列であり従って尾の一部でない３
Ｔと続く。３′の末端には４５Ａと１０Ｃの尾があり左
Ｐｃｔ１位置で終結する。 【００１６】図１Ｂは細長のコード枠を持ったヌクレオ
チド配列を示す。最初のＴはヌクレオチド９２であり、
挿入の尾（Ａの右端）の後に位置する。挿入部のＳａｕ
３Ａ 1 位置とＥｃｏＲ１位置は示した配列の夫々１２９
と４８０に当る。Ｆｉｇｕｒｅ２はＳＶ８０とＮａｍａ
ｌｖａ細胞内のＥ1 特定の諸ｍＲＮＡの大きさとその誘
導を示す。 【００１７】図２ＡはクローンＥ1 のニックトランスレ
ーションを行った〔32Ｐ〕−ｃＤＮＡのＳＶ８０細胞か
らの変成ポリＡ+ −ＲＮＡ電気泳動諸ブロットへの交配
を示す。その諸ＲＮＡはＩＦＮ−ベーター１の添加か
ら、示してある時間数の後に調整された。ＲＮＡの見か
けの大きさはオートラジオグラフィに示される。左レー
ン：ｒＲＮＡ諸マーカー。図２Ｂは図２Ａと同じくＩＦ
Ｎ−アルファで示したある時間数の処理をしたＮａｍａ
ｌｖａ細胞よりのＲＮＡである。左レーン：ｒＲＮＡ諸
マーカー。 【００１８】図３はＩＦＮ−処理したＳＶ８０細胞
（Ｉ）又は非処理細胞（Ｃ）からのＩＦＮ−誘起のｍＲ
ＮＡポリ（Ａ）+ ＲＮＡの為のｃＤＮＡを含んだ組換プ
ラズミドクローンＣ５６のＲＮＡ諸ブロットへの交配に
よる特性決定を示し、７ミクログラムがアガロースゲル
で電気泳動され、ニトロセルローズにブロットの後に、
Ｃ５６クローン、ヒトＨＬＡ ｃＤＮＡクローン又はラ
ットのチュブリンｃＤＮＡクローンのいずれかの、ニッ
クトランスレーションを行った〔32Ｐ〕−プラズミドＤ
ＮＡと交配した。接触時間は４８時間である。リボソー
ムＲＮＡマーカーの放射性１８s の位置が示してある。 【００１９】図４はＣ５６ ４５０ｂｐ挿入部の制限酵
素切断位置地図の一部とヌクレオチド配列を示す。Ｃ５
６プラズミドはＨｉｎｄ３で消化し、アルファー
〔32Ｐ〕−ｄＣＴＰを用いてＤＮＡポリメラーゼＩ−大
断片（クレノウ酵素、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で標識さ
れ、そのＨｉｎｄ３−Ｐｓｔ１断片が１％アガロースゲ
ル上で分離された。相補鎖の配列を決めるため、そのプ
ラズミドのＢｇ１２位置をガンマ〔32Ｐ〕−ＡＴＰを用
いてＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）で５′−標識をした後にそのＢｇｌ２−Ｐｓｔ１断
片を分離した。配列決定はＭａｘａｍ ａｎｄ Ｇｉｌ
ｂｅｒｔ法で行った。コード鎖Ａの配列（右から左へ）
は下のパネルに示してある。Ａ鎖配列の最初の２個のチ
ミヂン残基は多分上部の図にあるＡＴ尾に対応するので
あろう。 【００２０】図５はＩＦＮによるＣ５６ ｍＲＮＡ誘起
の時間経過を示す：図５Ａはポリ（Ａ）+ ＲＮＡでＩＦ
Ｎ−アルファ１０００Ｕ／ｍｌで示された時間数の処理
を受けたＮａｍａｌｖａ細胞からの７ミクログラムをア
ガロースゲルで電気泳動し、ブロットした後にニックト
ランスレーションを行った〔32Ｐ〕−Ｃ５６プラスミド
ＤＮＡと交配したものを示す。図５Ｂはポリ（Ａ）+ Ｒ
ＮＡで、２００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−ベータで示された時
間数処理したＳＶ８０細胞からの７ミクログラムのもの
を示す。星マークは単クローン抗体のカラム（２×１０
8 Ｕ／ｍｇ）で純化したＩＦＮ−ベーター１で処理した
細胞から得たＲＮＡを示す。 【００２１】図５Ｃはポリ（Ａ）+ ＲＮＡで、（５Ｂ）
と同様に処理したＳＶ８０からの１マイクログラムがＣ
５６ ＤＮＡの断片１（Ｆｉｇ．４を見よ）の３′末端
に標識したものと液中交配したものを示す。交配体はＳ
1 −ヌクレアーゼで処理し、変性ゲルで分析した。ｍＲ
ＮＡ−交雑検針（→）は自己再結合のもの（−−→）よ
り短かい。図６は（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ
の１．６及び１．８ｋｂ ｍＲＮＡのための諸ｃＤＮＡ
の制限酵素切断地図を示す。図６Ａは１．６ｋｂのｃＤ
ＮＡの地図である。Ｅ1 ｃＤＮＡ（Ｍｅｒｌｉｎｅｔ
ａｌ．，１９８３）の位置とラムダｇｔ１０ｃＤＮＡの
ものが示してある。ｐＡはポリアデニレーションの起る
位置である。エクソンの端は縦点線で示してある。各エ
クソンを持つゲノムＤＮＡ諸断片の大きさは括弧内に示
す。縦矢は１．８ｋｂ ＲＮＡに更に存在するスプライ
ス位置を示す。９−２１及び５−２１両ＣＤＮＡの配列
決定法を示した。３′ＥｃｏＲ１位置（Ｅ）からＰｓｔ
１位置（Ｐ）の配列はＥ１ ｃＤＮＡの中で決定した
（Ｍｅｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３）。 【００２２】図６Ｂは１．８ｋｂ ｃＤＮＡの地図であ
る。ラムダｇｔ１０クローン４８−１は１．８ｋｂ Ｒ
ＮＡのエクソン８を含むゲノム断片Ｐｓｔ１−Ｐｓｔ−
１を用いて分離した。（図９）諸エクソンは１．６ｋｂ
のＥ1 ｃＤＮＡの場合と同じく番付けした。切詰めたエ
クソン７は７ａとした。図７Ａと図７Ｂは２個の（２′
−５′）オリゴＡシンセターゼｃＤＮＡのヌクレオチド
配列を示す。１．８ｋｂ ｃＤＮＡクローン４８−１の
諸ヌクレオチドは１．６ｋｂ ｃＤＮＡクローン９−２
１に準じて番付けした。アミノ酸の番付けは括弧内に示
す。翻訳はＡＴＧＡＴＧ配列の第１又は第２のコドンか
ら始まる。諸エクソンの端は縦棒で示してある。（Ｇｌ
ｙｃｏｓ．）はＥ１８の中にあるグリコキシレーション
の可能性位置を示す。多分対立形質の相異による単塩基
変異はクローンとゲノムＤＮＡの相異として１．６ｋｂ
配列の３７６番（ＴとＣ）、５２５番（ＧとＡ）、８０
７（ＧとＣ）、８１１（ＡとＧ）；１．８ｋｂ配列の１
０８７（ＧとＡ）、１１１５（ＧとＣ）として発見され
た。 【００２３】図８はＥ１６とＥ１８の（２′−５′）オ
リゴＡシンセターゼのＣ−末端のハイドロパシープロッ
トを示す。ＫｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）
のコンピュータープログラムを用いた。疎水的部分は中
央の線の上にある。Ｅ１８の酸性部位はＦｉｇｕｒｅ７
のアミノ酸の３５３から３５８に相当する。図９はヒト
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ遺伝子の制限酵素
切断位置地図を示す。三つの重複するゲノムクローンか
ら作成した地図は１．６ｋｂ ＲＮＡの７つのエクソン
と１．８ｋｂ ＲＮＡ（黒棒）に更に１つある８番目の
エクソンを示す。挿入は、ゲノムＤＮＡのサザンブロッ
トとプローブ用の４８−１ｃＤＮＡのものを示す。Ｓｌ
ｏｔ １はＤａｕｄｉ ＤＮＡ；Ｓｌｏｔ ２は２倍体
繊維芽細胞ＦＳ１１のＤＮＡ。 【００２４】図１０はヒト（２′−５′）オリゴＡシン
セターゼ遺伝子のプロモーター部分を示す。Ｓｐｈ１−
Ｓｐｈ１間の０．８５ｋｂ断片で、Ｆｉｇｕｒｅ９の
４．２ｋｂ ＥｃｏＲ１ゲノムＤＮＡ断片に由来するも
のの制限酵素切断位置地図を示す。諸ｍＲＮＡの５′末
端はｃａｐとマークしてある。図１１はヒト（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼプロモーター部位を示す。
Ｆｉｇｕｒｅ１０で示したＳａｕ３ａ−Ｈｐａ１断片の
配列は、ヒトＩＦＮ−ベーター１遺伝子のプロモーター
部分との対比のためにならべた（Ｄｅｇｒａｖｅｅｔ
ａｌ．，１９８１）。番付けはｃａｐ位置と予想される
部分から始まる。ＩＦＮ−ベーター１プロモーター内で
約−７５に位置するプリンに富んだ転写制御配列（Ｚｉ
ｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３）で、−１０附近で繰返
されるものは、アンダーラインで示した。ＴＡＴＡボッ
クスは二重アンダーラインとした。図１２は合成ペプチ
ドに抗血清で免疫沈澱させたＩＦＮ処理のＷＩＳＨ細胞
からの35Ｓ−メチオニンで標識した蛋白質のＳＤＳ−ア
クリルアミドゲル電気泳動を示す。 【００２５】図１３はＥ１６ｃＤＮＡの大腸菌内発現を
示す。大腸菌の溶原菌Ａｇｔ１１−Ｅ１６で４２℃でＩ
ＰＴＧによって誘起されたものの抽出物はポリ（ｒＩ）
（ｒＣ）アガロース粒上で（２′−５′）オリゴＡシン
セターゼについて検定した。Ｃｏｎｔ＝ｌａｃＺ遺伝子
の配向と逆配向のＥ１６ｃＤＮＡを用いた大腸菌の挿出
物。Ｎａｍ＝ＩＦＮ−処理Ｎａｍａｌｖａ細胞の挿出
物。アルカリフォスターゼで作用させ、32Ｐ−ａ−ＡＴ
Ｐで標識した産物のｐＨ３．５による電気泳動が示して
ある。図１４はヒト末梢白血球中の（２′−５′）オリ
ゴＡシンセターゼＲＮＡの迅速なアッセイ法を図示して
いる。 【００２６】図１５は、Ｆｉｇｕｒｅ１４の方法に従っ
ての、ヒトＰＢＭＣの（２′−５′）オリゴＡシンテタ
ーゼ、ＥＲＮＡに対するクイックセルブロットを図示し
ている。示されている番号の細胞とインターフェロン
（１６Ｈ処理）を用いた。32Ｐ−ｃＤＮＡに関してオー
トラジオグラフィーを行った。図１６は、抗−Ｂ及び抗
−Ｃ ＩｇＧ−タンパク−Ａ−セファロースに吸着され
ている（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ活性が例に
示されているように測定されたことを図示している。下
のスキームは、Ｂｅｎｅｃｈら（１９８５ｂ）によって
配列が決定された２つの（２′−５′）オリゴＡシンテ
ターゼの型、Ｅ１６とＥ１８におけるペプチドＢとペプ
チドＣの位置を示している。黒く塗った領域は、Ｅ１６
がＥ１８分子と異なっている部分を示している。 【００２７】図１７は例２に記載のヒト細胞由来の抽出
物の電気泳動およびイムノブロッティングを示す。
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼの４型の位置は各
ブロットＭ＝14Ｃ−タン白分子量マーカーの右側の数に
より示す。ＩＦＮ処理は＋により示す。図１８はアンチ
−（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ ペプチドＢを
もつヒトＳＶ８０細胞由来の抽出物の電気泳動イムノブ
ロットを示す。左：粗細胞質抽出物（Ｓ１．５）、細胞
液（Ｓ１００）およびミクロソーム（Ｐ１００）。右：
ミクロソーム（ＤＯＣ−可溶性）のナトリウムデオキシ
コレート１０％抽出物、ミクロソームの高塩洗浄（ＲＷ
Ｆ）および塩抽出後のミクロソームペレット（ミクロソ
ーム−ＫＣｌ）。 【００２８】図１９はＳ１００の分画化およびＤＮＡＥ
−セルロースとカルボキシメチルセルロースによるミク
ロソームの高塩洗浄（ＲＷＦ）続くグリセロール勾配を
示す。アンチ−Ｂにより示した（２′−５′）オリゴＡ
シンセターゼプロフィルとタン白は勾配の下に示す。電
気泳動イムノブロットは左のブロットに対するフラクシ
ョンＣＭ（ＤＥＡＥ−セルロースに吸着されないＳ１０
０タン白由来のＣＭ−セルロース溶離液）を示す。左側
のブロットフラクションに、ＤＥ（ＲＷＦのＤＥＡＥ−
セルロース溶離液）とフラクションＧＧ（フラクション
ＤＥのグリセロール勾配からの８０−１００ｋｄのヘビ
イーピーク）。図２０はＳＶ８０細胞からの（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼの種々の型にＲＮＡ複鎖の
要求されるものを示す。諸断片はＦｉｇｕｒｅ１９に準
じて標識した。酵素活性はポリ（ｒＩ）（ｒｃ）の示さ
れた濃度について測定した。 【００２９】図２１は例３に述べられたように抗−Ｂ
ＩｇＧと125 Ｉ−蛋白質Ａを用いて行った（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼの放射線−免疫検定を示
す。オートラジオグラフィーが示してある。細胞は５０
０Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−β１で６時間処理か又は無処理で
あった。図２２はウイルス病患者の血液から得たリンパ
球（中段）の（２′−５′）オリゴＡシンセターゼレベ
ルの上昇を免疫蛍光顕微鏡で検知するに抗−Ｂを用いる
事を示す。右：正常血清によるコントロール：左：抗−
Ｂ色素入りの健康献血者の血液。（リンパ球は染色しな
い、マクロファージ又は顆粒白血球が不特定のバックグ
ラウンドを為す。） 【００３０】発明の詳説 現発明は、（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ活性を
持つ酵素のコードを持ったヒトＤＮＡで、図７Ａに示す
ヌクレオチド配列を持つものに関している。このＤＮＡ
は図７Ａに示した１−１３２２のヌクレオチド配列で
も、又図７Ｂに示したそれと重複する９０１−１５９０
のヌクレオチド配列であっても良い。現発明のＤＮＡ
は、図９に示した制限酵素切断位置を持つ。（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼ活性を持つ酵素は、図７Ａ
に示すアミノ酸配列を持つ。この酵素は約３６４のアミ
ノ酸より成り、約４１，５００ダルトンの分子量を示
す。他の酵素で（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ活
性を持つものは、図７Ａに示す１−３６４のアミノ酸配
列に加えて図７Ｂに示す２９０−４００のアミノ酸配列
を持つ。この酵素は約４００のアミノ酸より成り、その
分子量は約４６，０００ダルトンである。 【００３１】現発明は図７Ａに示したヌクレオチド配列
と相補のヌクレオチド配列を持った１．６ｋｂのＲＮＡ
を提供する。図７Ａに示す１−１３２２のヌクレオチド
配列に相補的であると同時にＦｉｇｕｒｅ７Ｂに示す９
０１−１５９０にも相補的であるヌクレオチド配列より
成る１．８ｋｂ ＲＮＡも提供する。現発明の転移ベク
ターは現発明のｌａｍｂｄａ−ｇｔ １１−Ｅ１６ Ｄ
ＮＡとｌａｃＺ遺伝子とより成り、そのＤＮＡはｌａｃ
Ｚ遺伝子と相的に接着していて、適当な寄主細胞中でＤ
ＮＡ発現を可能にする。微生物はこの転移ベクターで形
質転換を受ける。大腸菌はこの形質転換に適した微生物
である。 【００３２】患者のインターフェロンに対する反応を監
視する方法は、患者の細胞又は体液の（２′−５′）オ
リゴＡシンセターゼｍＲＮＡの濃度をこれと相補のＤＮ
Ａで交配させて測定する事より成る。そのｍＲＮＡは現
発明の１．６ｋｂ又は１．８ｋｂのＲＮＡであろう。イ
ンターフェロンに対する細胞や組織の反応の評価の方法
はインターフェロンで処理した細胞又は組織より得たＲ
ＮＡをそのＲＮＡと相補のｃＤＮＡと交配し、その交雑
量を決定することより成る。そのＲＮＡはインターフェ
ロンにさらした細胞又は組織から抽出し、膜フィルター
上で固定し、インターフェロン−誘起したｍＲＮＡに特
定の、標識付ＣＤＮで交配する。この方法は組織切片を
標識付ＣＤＮＡで原位置交雑し、顕微鏡観察オートグラ
フィ又は蛍光で標価する事より成る。分析する細胞又は
組織はヒト又は他の動物起原であろう。 【００３３】細胞又は組織のインターフェロンに対する
反応を評価する方法を実施する為のキットには、図７Ａ
又は図７Ｂに示した配列に相補のｃＤＮＡ、デオキシリ
ボヌクレアーゼＩと〔32Ｐ〕−ガンマーｄＣＴＰで割れ
目移動をする際の交雑テストを実施するに必要な試薬
類、ニトロセルローズ膜上で交雑する為の試薬類および
細胞からＲＮＡを抽出するための試薬類を含んでいる。
図７Ａと図７Ｂに示したアミノ酸配列に含まれるアミノ
酸配列を持った抗原性諸ペプチドも又提供されている。 【００３４】現発明による抗原性ペプチドの１つはＣ−
末端アミノ酸の１７個を図７Ａに示した配列で所持し、
そのアミノ酸配列がＡＲＧ−ＰＲＯ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−
ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＬＥＵ−ＰＲＯ−ＰＨＥ−ＩＬＥ−Ｐ
ＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＬＥＵ−ＨＩＳ−ＧＬＵ−ＡＬ
Ａである。もう一つの抗原性ペプチドのアミノ酸配列
は、ＧＬＵ−ＬＹＳ−ＴＹＲ−ＬＥＵ−ＡＲＧ−ＡＲＧ
−ＧＬＮ−ＬＥＵ−ＴＨＲ−ＬＹＳ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−
ＰＲＯ−ＶＡＬ−ＩＬＥ−ＬＥＵ−ＡＳＰ−ＰＲＯ−Ａ
ＬＡ−ＡＳＰである。現発明の抗原性両ペプチドに対し
て生ずる諸抗体は（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ
を識別し、免疫沈澱する。 【００３５】被験体でのインターフェロン活性を監視す
る方法は、（２′−５′）オリゴＡシンセターゼの細胞
又は体液中での濃度を既定の時間間隔で測定し、被験体
の細胞又は体液中の該シンセターゼ量の相異を、異なる
時間間隔の間で決定し、それから被験体でのシンセター
ゼの量を決定し、それにより被験体でのインターフェロ
ン活性を決める事より成る。シンセターゼの量はそのシ
ンセターゼを現発明の抗体と接触させ、そこで複合体を
形成し、この形成された複合体量決定する事から測定さ
れる。 【００３６】インターフェロン活性を監視する方法は、
更に（２′−５′）オリゴＡシンセターゼをインターフ
ェロンにさらした細胞又は体液から抽出し、この抽出シ
ンセターゼを識別し得るマーカーで標識付をしてラベル
付シンセターゼを作り、このラベル付シンセターゼを現
発明の抗体と適当な条件下で接触させて、標識付のシン
セターゼ−抗体複合体を作らせ、複合体中の標識を検出
し、それによってシンセターゼを検出する。その標識は
３５s −メチンニンであるだろう。インターフェロン活
性を監視する方法を実施する為のキットは、現発明の抗
体を１つ、シンセターゼ抽出用諸材料、シンセターゼ標
識付けの諸材料及び標識を検出し、シンセターゼ量を決
定する為の諸材料より成る。 【００３７】現発明は又、インターフェロンにさらした
後ヒト細胞に現れる諸メッセンジャーＲＮＡと特定的に
交雑するクローン化したＤＮＡを提出する。そのクロー
ン化ｃＤＮＡは、３．６、１．８と１．６キロベースの
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ両ｍＲＮＡに特定
的であろう。現発明のクローン化ＤＮＡは５６，０００
Ｍｒ蛋白質のｍＲＮＡに特定的であり、そのｍＲＮＡは
２キロベースで図１に示す配列を持つ。ヒトＳＶ８０細
胞から得た（２′−５′）オリゴＡシンセターゼｍＲＮ
Ａのための部分ｃＤＮＡクローン（Ｅ1 ）は、それがア
フリカツメガエル卵細胞中での翻訳で（Ｍｅｒｌｉｎ
ｅｔ ａｌ，１９８３）（２′−５′）オリゴＡシンセ
ターゼ活性を起すｍＲＮＡを交配で選別する能力を通じ
て始めて獲得された。Ｅ 1 ｃＤＮＡの挿入（６７５ｂ
ｐ）はＲＮＡの１．６、１．８および３．６ｋｂの三種
類で、ＳＶ８０細胞のＩＦＮに符号するものと交雑し、
１２時間の蓄積で細胞質ポリソーム分画に見出される
（Ｂｅｎｅｃｈ ｅｔ ａｌ，１９８５）。 【００３８】他の二種の早期転写体（２．７および４ｋ
ｂ）は、より少い分量で現れる。ヒト細胞の種々の型の
分析から、これら諸ＲＮＡは各細胞の特定の方法で別個
に発現される事がわかった。Ｂリンパ芽細胞では（Ｎａ
ｍａｌｖａ，Ｄａｕｄｉ）１．８ｋｂのＲＮＡが集積す
るが、一方、羊膜のＷＩＳＨ細胞、組織球のリンパ腫Ｕ
９３７細胞、およびＨｅＬａ細胞では１．６ｋｂのＲＮ
Ａが幾らかの３．６ｋｂ ＲＮＡと共に主としてＩＦＮ
で誘起されるが１．８ｋｂ ＲＮＡは殆ど作られない。
２倍体繊維芽細胞ＦＳ１１内、ＳＶ８０繊維プラストイ
ド細胞内およびＴ細胞ＣＥＮＴ系では安定ＲＮＡの三型
全部が発現される（Ｂｅｎｅｃｈ ｅｔａｌ，１９８
５）。（２′−５′）オリゴＡシンセターゼの発現され
る型は用いたＩＦＮの種（α，βまたはγ）の相異には
依らず、むしろ細胞内で発生的に規制されるように見え
る。 【００３９】（２′−５′）オリゴＡシンセターゼの異
った転写物は、１遺伝子に由来するようである（Ｂｅｎ
ｅｃｈ ｅｔ ａｌ，１９８５）。制限酵素切断位置地
図に依れば、１）Ｅ1 ｃＤＮＡは１．６ｋｂ ＲＮＡの
３′末端に相当する、２）１．８ｋｂ ＲＮＡは１．６
ｋｂ ＲＮＡと異った３′末端を持ち、下流エクソン１
つを余分に持つ、３）３．６ｋｂ ＲＮＡは１．８ｋｂ
ＲＮＡと共通の３′末端を持つが、不完全にスプライ
スされている。特定のゲノムＤＮＡ断片を用いた交雑−
翻訳試験は、これも１．８と１．６ｋｂの両ＲＮＡは、
積極的に（２′−５′）オリゴＡシンセターゼをコード
する事を示した（Ｂｅｎｅｃｈ ｅｔａｌ，１９８
５）。 【００４０】１．６と１．８ｋｂ両ＲＮＡのためのｃＤ
ＮＡ諸クローンは単離され配列決定が行われ、これはヒ
ト細胞に二型あるＩＦＮ−誘起の（２′−５′）オリゴ
Ａシンセターゼのアミノ酸配列の由来解明を可能にし
た。二種の蛋白質はｃ−末端を異にし、１．６ｋｂ Ｒ
ＮＡ産物（Ｅ１６）では疎水性であり、１．８ｋｂ Ｒ
ＮＡの産物（Ｅ１８）では酸性である。（２′−５′）
オリゴＡシンセターゼ遺伝子の完全地図では、１．６ｋ
ｂ ＲＮＡは７つのエクソンにコードされ、１．８ｋｂ
ＲＮＡは８つのエクソンにコードされる。ＩＦＮ−誘
起のヒト（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ遺伝子の
転写開始位置と仮定される位置の配列はヒトＩＦＮ−β
1 遺伝子のプロモーター部位と強い相同性を示す。 【００４１】例 １ （２′−５′）オリゴＡシンセターゼｍＲＮＡのｃＤＮ
Ａクローンによる測定 Ａ） Ｅ−ｃＤＮＡ諸クローンの単離 全ＲＮＡは１０9 のＳＶ８０細胞（ＳＶ４０−形質転換
ヒト繊維芽細胞）をｍｌ当り２００単位ＩＦＮ−ベータ
で１２時間処理して調整した。そのＲＮＡは３ＭのＬｉ
Ｃｌ−６Ｍ尿素で抽出し、オリゴｄＴ−セルロースの上
を通して純化した。得たポリＡ+ −ＲＮＡの０．４ｍｇ
は１．５％アガロース／６Ｍ尿素２５ｍＭクエン酸ナト
リウムｐＨ３．５で、ゲル電気泳動装置のプレパレーシ
ョン中で分画された。その１７−１８ｓＲＮＡ分画が次
のようにｃＤＮＡの調整に用いられた：２ミリグラムの
ＲＮＡを１分間、９０℃で２ミクログラムのオリゴ（ｄ
Ｔ）12-18 と、６０ミクロリットルの水中で熱した、次
に０℃で冷却、その後塩の最終濃度が５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、７５
ｍＭ ＫＣｌとなるように補足し、５分間４２℃で保温
後に１ｍＭヂチオトレイトール、各１ｍＭのｄＡＴＰ、
ｄＴＧＰ、０．５ｍＭのｄＣＴＰ、２０ミクロ−Ｃｉの
３２p −ｄＣＴＰ（３００（Ｃｉ／ｍｍｏｌ））、４ｍ
Ｍのピロ燐酸ナトリウムと２０単位の逆転写酵素を最終
容量０．１ｍｌにして加える。 【００４２】この混合物を４２℃で４５分間保温し、１
０ｍＭ ＥＤＴＡで反応を止め、０．２％ナトリウム−
ドヂシル硫酸、そしてｃＤＮＡはフェノール−クロロフ
ォルムで抽出し、０．３ＮのＮａＯＨで２０時間５２℃
の処理をし、中性化した。そのｃＤＮＡをＳｅｐｈａｄ
ｅｘ Ｇ−７５で濾過し、エタノール沈澱をし、そして
ｄＡＴＰと末端トランスファラーゼとで尾付けをした。
第二のｃＤＮＡ鎖の合成はオリゴ（ｄＴ）でプライム付
けをし、第一鎖と同様に２時間４２℃で進行させたが、
放射性ヌクレオチドとピロ燐酸は用いなかった。末尾の
整形を確保する為にｄｓ ｃＤＮＡは大腸菌ポリメラー
ゼＩ大断片と共に先ず２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐ
Ｈ８、７５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ1 、１ｍＭ
チチオトレイトールで５分間３７℃（角切り反応）で処
理し、次にＡＴＰ存在下に充填条件に置いた。 【００４３】そのｄｓ ｃＤＮＡは５−２０％の蔗糖傾
斜で沈澱分画し、最も重い分画にｄＣＴＰで尾付けをし
て、等モル量のＰｓｔ１−切断ｐＢＲ３２２プラズミド
ＤＮＡのｄＣＴＰで尾付けしたものでアニールした。約
７ｎｇのＤＮＡを１００ミクロリットルの凍結し、Ｃａ
Ｃｌ2 −処理した大腸菌ＭＭ２９４と混合した。０℃で
３０分と３７℃で５分の処理後、そのバクテリアは２ｍ
ｌのＬＢ−ブロス中で３７℃で２時間の生育をさせ、Ｌ
Ｂ−寒天プレートに１０ミクログラム／ｍｌのテトラサ
イクリンで接種した。約１．４×１０5 のテトラサイク
リン−耐性でアンピシリン−感受性のコロニーが、ミリ
グラム当りの組換プラズミドＤＮＡから得られた。 【００４４】（２′−５′）オリゴＡシンセターゼｍＲ
ＮＡのｃＤＮＡクローンを識別するため、総計３，００
０のプラズミドクローンをＩＦＮ−処理ＳＶ８０細胞の
ＲＮＡと交雑しスクリーンし、そのＤＮＡで選抜したＲ
ＮＡをＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ卵細胞に注射して
テストし、Ｓｈｕｌｍａｎ ａｎｄ Ｒｅｖｅｌ（１９
８０）の方法で（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ活
性測定した。１２の個別のクローン（各３ミクログラム
のＤＮＡ；ＥｃｏＲ１で分断）からのプラズミドＤＮＡ
の合併物は直径０．４ｃｍのニトロセルローズ濾紙を通
し、３７℃２時間の予備交雑を５０％フォルムアミド、
２ｍＭ Ｐｉｐｅｓ緩衝液ｐＨ６．４、０．７５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（緩衝液Ａ）中で行った。ｐ
ＢＲ３２２ ＤＮＡによる濾紙３本、組換ＤＮＡによる
濾紙３０本を３００ミクログラムのポリＡ+ −ＲＮＡと
共に（仮定の（２′−５′）オリゴＡシンセターゼｍＲ
ＮＡ量、０．０９ミクログラム又は０．０３％の１０倍
過剰のｃＤＮＡの添加になる計算で）、１ｍｌの緩衝液
Ａ中で３７℃で２０時間保温した。 【００４５】これらの濾紙は３７℃の緩衝液Ａで２回、
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌのｐＨ７．５と０．１５Ｍ
ＮａＣｌと１ｍＭ ＥＤＴＡと０．５％ナトリウムド
デシル硫酸の混合物で４回（１度は３７℃で、残り３度
は５２℃で）、そして１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌのｐ
Ｈ７．５と１ｍＭ ＥＤＴＡの混合物（緩衝液Ｃ）で５
２℃において４回の諸洗滌を行った。各濾紙は、次に個
別にして緩衝液Ｃで５２℃の洗滌をし、次に９６℃で
０．３ｍｌの緩衝液Ｃに１ｍｌ当り４０ミクログラムの
兎肝ｔＲＮＡを加えたもの、中で２分間加熱してＲＮＡ
を取り出した。そのエタノール沈澱物を急冷の後、その
ＲＮＡは２ミクロリットルの水に溶解した。０．７ミク
ロリットルのＲＮＡを１０個のアフリカツメガエル卵細
胞に注射し、１９℃１８時間の保温後、その卵細胞を孵
卵液中でホモゲナイズし（Ｓｈｕｌｍａｎ ａｎｄ Ｒ
ｅｖｅｌ，１９８０）、そのホモゲネート０．１５ｍｌ
をポリ（ｒＩ）（ｒＣ）−アガロース粒と混合した。 【００４６】その粒は３０℃で１６時間、２．５ｍＭの
（32Ｐ）−アルファーＡＴＰ（０．３Ｃｉ／ｍｍｏｌ）
と１０ｍＭジチオトレイトールとの混合物中で保温し、
この１０ミクロリットルの液相部を０．３５単位のバク
テリア アルカリ フォスファターゼと共に３０ｍＭの
Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ中で３７℃６０分の保温をした。そ
の消化物はＷａｔｍａｎ ３ＭＭ濾紙上で濾紙電気泳動
に３，０００Ｖで４時間かけ、（２′−５′）ＡｐＡと
（２′−５′）ＡｐＡｐＡに相当する汚点を切り取り、
シンチレーション測定をした。ＤＮＡ−選抜ＲＮＡか
ら、１ミクロリットルを取り網赤血球分解物でＷｅｉｓ
ｓｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ，（１９７９）に述べられ
たようにｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳に用い、資料の全ｍＲＮ
Ａ活性の測定を行った。 【００４７】ＤＮＡ選抜ＲＮＡ資料中の（２′−５′）
オリゴＡシンセターゼ活性の全ｍＲＮＡ活性に対する比
は各濾紙毎に計算した。１２の各個別プラズミドからの
２５０合併資料のプール１７４を持つ濾紙は、他の合併
資料のものやｐＢＲ３２２ＤＮＡのものに比し１０倍高
い値が常に現れた。プール１７４の各個のクローンのプ
ラズミドを各個別の濾紙で試し、１７４−３が常に、
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼｍＲＮＡの全ｍＲ
ＮＡに対しての濃度について全ＲＮＡ又はｐＢＲ３２２
のＤＮＡ選抜ＲＮＡに比し３５−１００倍の高さを示し
た（Ｔａｂｌｅｌ）。クローン１７４−３は、（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼｃＤＮＡと同定され、Ｅ−
ｃＤＮＡと命名した。このｃＤＮＡの構造と配列とを図
１に示す。このＥ−ｃＤＮＡクローンはその酵素のカル
ホキシ末端のアミノ酸を１００個塩基配列中に保有し、
ポリＡの尾の前に翻訳されない１９２塩基長の部位を持
つ。Ｔａｂｌｅ １ （２′−５′）オリゴＡシンセターゼｃＤＮＡのクロー
ンの交雑−翻訳による同定 誘起ＲＮＡの卵細胞注射（２）により測定したＥｍＲＮ
Ａの活性 【００４８】 【表１】【００４９】Ｂ）Ｅ−ｃＤＮＡの交雑による、インター
フェロン−誘起（２′−５′）オリゴＡシンセターゼｍ
ＲＮＡの測定 クローン１７４−３（Ｅ−ｃＤＮＡ）のプラズミドＤＮ
Ａは細胞の全ＲＮＡによる電気泳動諸汚点から相補的Ｒ
ＮＡを検出するのに使用できる。ポリＡ+ −ＲＮＡは２
０００／ｍｌのインターフェロンビータで種々の回数処
理したＳＶ８０細胞から調整して、その７ミクログラム
のＲＮＡは５０％フォルムアミドと６％のフォルムアル
デヒド中で変性し、１．３％のアガロースと６％のフォ
ルムアルデヒド中で電気泳動にかけ、Ｔｈｏｍａｓ（１
９８０）とＦｅｌｌｏｕｓ ｅｔａｌ，（１９８２）の
手順でニトロセルローズにブロットした。Ｍｅｒｌｉｎ
ｅｔ ａｌ，（１９８０）に依り、（32Ｐ）−ガンマー
ｄＣＴＰを用いて割れ目移動で構識付けしたそのＥ−ｃ
ＤＮＡプズミドは、先のニトロセルローズの汚点と交雑
した。 【００５０】ＳＶ８０細胞中で、インターフェロン処理
で同時に誘起された三種のＲＮＡ、３．６キロベースの
大きいＲＮＡ１つと１．８５、１．６５キロベースの小
さいＲＮＡは、Ｅ−ｃＤＮＡと交雑する（図２）。非処
理のＳＶ８０細胞ではＥ−限定のＲＮＡは見出せない。
４時間目に現れるこの三種のＲＮＡは１２時間で最大値
となり、その後徐々に減少する。この諸ＲＮＡはインタ
ーフェロン処理後２４時間でも明瞭に検出される。わず
か４時間後に出現する別のＲＮＡ諸種は、更に安定度の
高い諸種の前駆体である可能性が強い。同じ三種のＲＮ
Ａは、インターフェロン処理を受けたヒト２倍体繊維芽
細胞にも見られる。しかし、リンパ芽球Ｎａｍａｌｖａ
細胞のような造血細胞系の細胞では、一つの主要種だけ
がＥ−ｃＤＮＡと雑種化し（図２）それは１．８５キロ
ベースのＲＮＡ種に相当する。同様のＲＮＡパターンが
多種のリンパ芽球細胞である赤血球ＨＬ−６０および原
モノサイトＵ９３７に見られる。 【００５１】繊維芽細胞やリンパ細胞に見られる異型の
Ｅ−限定ＲＮＡパターンは、これらの細胞内の（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼの異型に相当する。リンパ
細胞は分子量３０，０００ダルトンの酵素を持つが、繊
維芽細胞では分子量８０，０００ダルトンと３０，００
０ダルトンの２型をＲｅｖｅｌ ｅｔ ａｌ，（１９８
２）の発表のように含有している。小さい１．８５キロ
ベースｍＲＮＡは３０，０００Ｍｒの酵素をコードする
に十分の長さがあるが、大型の方には足りない。一方、
３．６キロベースのＥ−ｍＲＮＡは８０，０００Ｍｒの
型の酵素をコードする。三型のＥ−限定ＲＮＡ種は全部
ヒトのゲノムＤＮＡの単クローンと交雑し、３．６キロ
ベースのＲＮＡは１．８５キロベースのＲＮＡと比べて
インターフェロンエクソンを一つ余分に持っている。 【００５２】白血球インターフェロン−アルファは繊維
芽細胞のインターフェロン−ベータと同じようにＥ．限
定ＲＮＡを誘起する。ＲＮＡは複数種がある事はＥ−ｃ
ＤＮＡとの交雑から明らかとなった。インターフェロン
にも異同がある。それらは総て（２′−５′）オリゴＡ
シンセターゼを誘起するが、違った型のＲＮＡや酵素も
誘起するだろう事を示唆する。異ったインターフェロン
種は、Ｅ−ｍＲＮＡ誘起の効率に差のある事もあり得
る。 【００５３】上記のＥ−ｃＤＮＡとの交雑検定で処理さ
れるＲＮＡは、種々の培養細胞から又はインターフェロ
ン治療を受けている患者から又はウイルス病の病人から
或いは（２′−５′）オリゴＡシンセターゼの昂進する
病気（Ｓｃｈａｔｔｎｅｒｅｔ ａｌ．，１９８１）か
ら調整できる。ＲＮＡは他の白血球のような末梢血液か
らの血球からも調整できる。電気泳動ブロットは点−交
雑法で代行でき、それではＲＮＡの資料を、ニトロセル
ローズの上に一定の広さで円形、矩形等で直接設置す
る。そして放射性ｃＤＮＡはニトロセルローズ布上で直
接に交雑される。各円形又は矩形は次に直接計測又はオ
ートラヂオグラフフイルムの選別後にオートラヂオグラ
フする事で測定される。 【００５４】代替法としては、インターフェロンにさら
した組織を生検して組織切片に原位置交雑で行う。脳の
ウイルス病又は腫瘍のためインターフェロンの投与を受
けた患者に対し投薬が莢壁内注射であったか体内注射で
あった時に脳インターフェロン処理を受けているかを測
るのに脳生検として優先的に応用される。この方法はイ
ンターフェロン投与が局所的に皮膚病斑の軟膏として行
われた時に皮膚生検に対して行われる。他の様々な応用
ができる事は明白である。組織片は固定し、原位置で放
射性ＤＮＡと交雑し、次に感度の良い感光剤でオートラ
ヂオグラフにかける。このｃＤＮＡは蛍光ヌクレオチド
で又は蛍光分子と結合するよう改造したヌクレオチドで
標識し、組織切片と交雑すれば蛍光顕微鏡で監視でき
る。 【００５５】Ｅ−ｃＤＮＡの交雑が増加すれば、通常の
コントロール細胞ＲＮＡ又は組織資料と比較して、その
細胞や組織がインターフェロンにさらされた事を意味す
る。この方法は速断性（４−２４時間）と高感応性（ｍ
ｌ当り１〜２００単位のインターフェロン）のために外
来のインターフェロン投与又は患者の血液や組織での内
生インターフェロンの形成の後に非常に有用である。 【００５６】例−２ インターフェロンで誘導した５６，０００Ｍｒタンパク Ａ）クローニングしたＣ56−ｃＤＮＡの単離 クローニングしたｃＤＮＡを例１に記述した組み換えプ
ラスミッドのライブラリーから単離した。 １．使用された方法の原理は、判別ハイブリッド形成で
あった。ニトロセルローズロ紙上に、生育させた３，０
００のバクテリアのクローンの２つの重複セットを、イ
ンターフェロン−β（２００Ｕ／ｍｌ）で処理したＳＶ
８０細胞の１７Ｓから１８ＳのポリＡ+ −ＲＮＡからの
（32Ｐ）−ｃＤＮＡか、もしくは、無処理のＳＶ８０の
細胞の全ポリＡ+ −ＲＮＡからの（32Ｐ）−ｃＤＮＡと
ハイブリッド形成を行なった。放射活性のｃＤＮＡは、
例１におけるように、ｍＲＮＡから逆転写した。バクテ
リアのクローンのうち、約４０％が“インターフェロ
ン”処理”ｃＤＮＡプローブと、強くハイブリッドを形
成し、８％が、明確な判別シグナルを与え、“熱処理”
ｃＤＮＡとくらべて、優先的または、特別に“インター
フェロン処理”ｃＤＮＡとハイブリッド形成を行なっ
た。 【００５７】後者のグループのクローンを、次に、ニッ
クトランスレーションによって放射活性ラベルをした各
クローンからのプラスミッドＤＮＡを、インターフェロ
ンで処理したＳＶ８０細胞から、及び、無処理の細胞か
ら、ＲＮＡの電気泳動ブロットとハイブリッドを形成す
ることによってスクリーニングを行なった。この基準に
よって、最初の３，０００のバクテリアのクローンのう
ち、１−２％が、インターフェロンによって誘導された
ｍＲＮＡに相当するプラスミッドｃＤＮＡクローンを含
んでいることが見出された。これらのプラスミッドｃＤ
ＮＡクローンのうち、Ｃ56と読んだ１つが、特別に強い
判別ハイブリッド形成を示した。このＣ 56ＤＮＡは、イ
ンターフェロンで処理した細胞に存在するが、コントロ
ール細胞ＲＮＡには存在しない１８Ｓ ＲＮＡとハイブ
リッドを形成する（図３）。対照的に、インターフェロ
ン処理によって、ＳＶ８０細胞に、５倍に増加している
ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ ｍＲＮＡは、Ｃ56ｍＲＮＡよりも
誘導がはるかに少いようであり、Ｆｉｇ．３の実験条件
下では、“無処理”ＲＮＡとも明確なシグナルを与え
る。 【００５８】ニトロセルローズロ紙に固定化したＣ56ｃ
ＤＮＡとハイブリッドを形成することによって選ばれた
ｍＲＮＡは、続いてフイルムから溶出され、（例１にお
けるように）網状赤血球溶解産物のセルフリー系で翻訳
し、35Ｓ−メチオニンでラベルした翻訳産物を、Ｌｅａ
ｍｌｅ（１９７０）から応用したＷｅｉｓｓｅｎｂａｃ
ｋら（１９７９）が記述した方法に従ってＮａ−ｄｏｄ
ｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ中でポリアクリルアミドゲル
電気泳動によって分析した。Ｃ56のｃＤＮＡで選ばれた
ＲＮＡは、５６，０００Ｍｒタンパクに翻訳された。Ｃ
56ｃＤＮＡの塩基配列のうち、５６，０００Ｍｒの、カ
ルボキシル末端の６５のアミノ酸が、その道の技術を持
った人により、導き出された（図４）。 【００５９】インターフェロン−β（２００Ｕ／ｍｌ）
で、時間を種々変えて処理したＳＶ８０から抽出したＲ
ＮＡに対するＣ56ｃＤＮＡのハイブリッド形成からＣ56
ｍＲＮＡが、インターフェロンを加えてから１時間後に
現れ始めるということがわかる（図５）。Ｃ56ＲＮＡは
４時間後にその極大に達するが、しかし、減少はするも
のも、２４時間後もまだ検出できる。Ｃ56ｍＲＮＡの誘
導は、倍数体、線維芽細胞、及びリンパ芽球様細胞にお
いても示される。誘導は、インターフェロン１０から２
００単位／ｍｌの間で濃度に比例していた。Ｃ56ｍＲＮ
Ａは、後者は能率が悪かったが、インターフェロン−
α、インターフェロン−γによっても誘導された。この
ｍＲＮＡが、未処理の細胞に存在していないことと、イ
ンターフェロンを添加した後、急速に増加することによ
り、Ｃ56ｃＤＮＡは、細胞のインターフェロンに対する
反応を評価するための素晴らしいプローブとなっている
例１中のＥ−ｃＤＮＡに対して、記述された技術は、同
様にＣ56ｃＤＮＡにも適用できる。 【００６０】インターフェロンによって誘導されたｍＲ
ＮＡに相当する多数のｃＤＮＡが手に入るということ
は、新しい展望を提供している。特に、Ｅ−ｍＲＮＡや
Ｃ56ｍＲＮＡを誘導するためよりも、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，
Ｃ ｍＲＮＡを誘導するために、インターフェロンは、
１／１００の濃度しか必要としない。（Ｗａｌｌａｃｈ
ら、（１９８２））；他方、α−ｄのようなインターフ
ェロン−αの亜種は、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ ｍＲＮＡを
誘導するのに必要な濃度より１００倍低い濃度でＥ−ｍ
ＲＮＡを誘導できる。異った、クローン化されるｃＤＮ
Ａを同じＲＮＡサンプルとハイブリッド結合させること
により、どういう種類のインターフェロンが含まれるか
を示すことができる。かくして、唯１つのｃＤＮＡプロ
ーブを用いるよりも、異ったｃＤＮＡの比較からもっと
多くの知識が誘導できる。 【００６１】例 ３ インターフェロン誘導ｍＲＮＡｓの測定のためのキット このキットは、デオキシ−リボヌクレアーゼＩと
（32Ｐ）−γ−ｄＣＴＰとのニック翻訳のための試薬ニ
トロセルローズメンブラン上のハイブリッド形成のため
の試薬、及び細胞からのＲＮＡ抽出用の試薬と同じく
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼのｍＲＮＡに対し
て、特異的な、そして、ここに記述した、５６，０００
ＭｒタンパクのｍＲＮＡに特異的なクローン化したｃＤ
ＮＡを提供するだろう。 【００６２】例 ４ １．６ＫＢ（２′−５′）オリゴＡシンセターゼｍＲＮ
Ａに対するｃＤＮＡの配列 ヒトの細胞中のインターフェロンによる１．６ｋｂ
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの末端であること
がわかった（Ｂｅｎｅｃｈら、１９８５）部分的なＥ1
ｃＤＮＡクローン（Ｍｅｒｌｉｎら、１９８３）が、Ｓ
Ｖ８０細胞ＲＮＡから、ラムダ−ｑｔ１０ｃＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングするのに用いられた（Ｗｏｌ
ｆとＲｏｔｔｅｒ、１９８５）。制限酵素を用いたマッ
ピングにより、クローンラムダ−ｑｔ１０ ９−２はｐ
ＢＲ（９−２１ｃＤＮＡ）中にサブクローニングを行っ
た１．３２ｋｂ ＥｃｏＲ１インサート（図６Ａ）の
３′の端に、Ｅ１ｃＤＮＡを含むことが見出された。配
列決定は、図６Ａに概説したように行なわれ、似前にＥ
１ｃＤＮＡについて報告されたｃ−末端と３′の翻訳さ
れていない配列を含むことが確認された（Ｍｅｒｌｉｎ
ら、１９８３）。９−２１ｃＤＮＡ配列（図７）は、Ａ
ＴＧＡＴＧ配列において出発する３６４アミノ酸のオー
プンリーディングフレームを予告する。 【００６３】タンパクのコ−ディング配列の３塩基周期
性に基いたコンピュータ−プログラム（Ｔｒｉｆｏｎｏ
ｖ，１９８４）により唯一の矛盾しないリーディングフ
レームは、このＡＴＧＡＴＧから出発するものであるこ
とがわかった。翻訳が、この場合の２番目のＡＴＧにお
いてはじまることは可能である。何故なら、それは、−
３におけるＡが前にあり、コンセンサス翻訳イニシエー
ション配列と相同性がある唯一のものであるからである
（Ｋｏｚａｋ，１９８４）。 【００６４】このようにして、１．６ｋｂ（２′−
５′）オリゴＡシンテターゼＲＮＡによってコードされ
た酵素は、４１，７００の分子量を持ち、Ｅ１ｃＤＮＡ
とハイブリッド結合をしたｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳産物
（Ｍｅｒｌｉｎら１９８３）のＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によってみられる、みかけ上の３８，
０００−Ｍｒのタンパクとよく一致する。オープンリー
ディングフレームによって予告されたｃ−末端ヘプタデ
カぺプチドが化学的に合成され、ラビットを免疫するの
に用いられた。得られた抗血清（図１２のｃ）は、未処
理の細胞には存在していないインターフェロンによって
処理した細胞の３５−Ｓメチオニンラベルの抽出物から
のＳＤＳ電気泳動中の３８，０００−Ｍｒに移動するタ
ンパクを特異的に沈澱させる。２つの実験により、この
タンパクは、（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性
をもつことが確かめられた。それは、ポリ（γＩ）（γ
Ｃ）アガロース・カラムを通すことによって抽出物から
除かれ、免疫沈澱後残っている上澄液は酵素活性の大部
分がなくなった。 【００６５】例 ５ １．８ＫＢ（２′−５′）オリゴシンテターゼｍＲＮＡ
に対するｃＤＮＡの配列 １．８ｋｂ ＲＮＡの追加のエクソン（Ｂｅｎｅｃｈ
ら、１９８５；図９をみよ。）に相当する遺伝子ＤＮＡ
断片ＳＶ８０ＲＮＡの同じラムダ−ｑｔ１０ｃＤＮＡラ
イブラリーからＥ１８ｃＤＮＡクローン−８−１を単離
するプローブとして用いられた。Ｅ１８ｃＤＮＡクロー
ンの制限マップ（図６Ｂ）はその５′末端がＥ１６ｃＤ
ＮＡの一部であるが、３′末端は違っているということ
を確かめた。配列決定の結果（図７）結合部は、Ｅ１６
９−２１ｃＤＮＡクローンの１０７１のヌクレオチド
の位置にあり、Ｅ１６の最後の２４７ヌクレオチドが異
なるポリアデニル化の位置によって終っている５１５の
ヌクレオチドの長い配列によって置き換っている。 【００６６】この差は、ノーザンブロット上にみられる
２つのｍＲＮＡの間の大きさの差０．２ｋｂを説明す
る。Ｅ１８ｃＤＮＡの５′の部分は、Ｅ１６ｃＤＮＡの
配列から、塩基の変化がないことを示しているが、未完
成である。下に述べられる遺伝子のマッピングによる
と、１．６と１．８ｋｂ ｍＲＮＡｓの両者とも同じ
５′末端を有している。Ｅ１６配列から分れた１８ｃＤ
ＮＡの３′領域は、５４のコドンの後終るオープンリー
ディングフレームを含んでいる。３５０のヌクレオチド
の長さの翻訳されない領域を残しているリーディングフ
レームは、タンパク−コーディング配列の３塩基の周期
性に基いたコンピュータ−プログラム（Ｔｒｉｆｏｎｏ
ｖ，１９８４）によって確かめられた。 【００６７】交互のより長いオープンリーディングフレ
ームは、Ｅ１６ｃＤＮＡに共通な５′部分のように、同
じコンピューティッドフレーズの中にはないだろう。
１．６と１．８ｋｂ ｍＲＮＡタンパク産物のｃ−末端
上のハイドロパシープロット（ＫｙｔｅとＤｏｏｌｉｔ
ｔｌｅ，１９８２）により（２′−５′）オリゴシンテ
ターゼ（図８）の２つの形の間に著しい違いが示され
る。Ｅ１６タンパクのｃ末端は、非常に疎水性である
が、Ｅ１８タンパクのｃ末端は親水性であり、２つの酸
性領域をもっている（ＡＳＰ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔｈｕ
−Ａｓｐ−Ａｓｐ−とＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ）（図
７）さらに、Ｅ１８産物のｃ末端に可能なグリコシル化
の場所が存在している。（図７） ９−２４ ｃＤＮＡをｌａｃ Ｚ遺伝子とフェーズをあ
わせて融合するように、λｇｔｌｌにサブクローンニン
グを行なった。このフェーズを含んでいるＥ．Ｃｏｌｉ
のリソーゲンは、ポリ（γＩ）（γＣ）アガロースに結
合した後、明らかに（２′−５′）オリゴＡシンテター
ゼ活性を示した。一方、９−２１ｃＤＮＡが反対の方向
に融合した場合には、何も活性が生じなかった（図１
３）。 【００６８】このＥ．ｃｏｌｉにおける発現は、ｃＤＮ
Ａは確かにｄｓＲＮＡで活性化された（２′−５′）オ
リゴＡシンテターゼをコードする構造遺伝子に相当して
おり、インターフェロンで誘導されたＲＮＡによりコー
ドされた約４０ｋｄのタンパクは、酵素そのものであ
り、制御因子ではないということを証明している。この
タンパクは、酵素活性を示すために、翻訳後の修飾は必
要としないようである。９−２１ｃＤＮＡを含むトラン
スフォームした明細は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉラムダ−ｇｔｌｌ−Ｅ１６と呼ばれ、取得番号１４
９６の下にＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅ
ｓ，パストール研究所、２５ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅ
ｕｒ Ｒｅｕｘ，７５７２４−Ｐａｒｉｓ−Ｃｅｄｅｘ
１５、フランスに預けられている。この寄託は、パテ
ントの手続きの目的のために、微生物の寄託の国際的認
識に関するブタペスト条約に従って行なわれたものであ
る。 【００６９】例 ６ ヒト（２′−５′）オリゴシンテターゼ遺伝子の組織化 ３つの重なり合った遺伝子のクローンが、１つが、ヒト
血球細胞ＤＮＡ（Ｍｏｒｙら、１９８１）の部分的Ｅｃ
ｏＲＩ消化物のライブラリーから（Ｍａｎｉａｔｉｓ
ら、１９７８）Ｅ１ｃＤＮＡをプローブとして用いて単
離した。（Ｂｅｎｅｃｈら、１９８７）。遺伝子クロー
ンは、ヒトＤＮＡの約２９ｋｂを表しており、ライブラ
リーをスクリーニングしても、１個のＥ遺伝子以上に対
する証拠は存在しなかった。遺伝子的ＤＮＡのサザーン
ブロットは、単一遺伝子の存在と一致していた（図
９）。ノーザンブロット解析によって、遺伝子ＤＮＡ断
片をプローブとするノーザンブロット解析により、Ｓ１
ヌクレアーゼマッピングと配列決定により、Ｅ１６ｃＤ
ＮＡ９−２１は、遺伝子上の５エキソンに相当すること
が示された。（図９） 【００７０】ＡＴＧＡＴＧ配列は、エクソン３に見出さ
れたが、停止コドンと１．６ｋｂＲＮＡのポリアデニレ
ーションの位置を持った翻訳されない領域は、エクソン
７中に見出された。別の５′エクソン１と２の構造が下
に記してある。イントロ−エキソン境界の配列が決定さ
れ（Ｔａｂｌｅ ２）スプライスアクセプター、ドナー
サイトに対するＣＡＧとＧＴ規則にしたがう（Ｂｒｅａ
ｔｈｎａｃｈ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１）。
最近Ｋｅｌｌｅｒ（１９８４）によって総説されたよう
に、ＣＴＧＡＣ／Ｔは、共通してスプライスアクセプタ
ーから遠くないところに見出される。（アクセプターサ
イト：Ｔａｂｌｅ ２）Ｋｅｌｅｒ（１９８４）によ
り、ラリアートモデルで役割を演じていることが指摘さ
れているＣＴＧＡＣ配列とイントロン−ドナーの相補性
に加えて、ＣＴＧＡＣ／Ｔ領域が、イントロン／エクソ
ンの３′境界の配列と相補性があるということは注目す
べきことである。 【００７１】１．６ｋｂのｍＲＮＡによって生産される
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼのコーディング領
域を含む５エリクソンの配列は、酵素が異なるアミノ酸
組成（Ｔａｂｌｅ ３）をもった領域から成立っている
ことを示している。最初のエクソンのドメイン（６０ア
ミノ酸）は、アスパラギン酸に富んでおり、２番目では
（アミノ酸６１から１５６）アルギニンが優先してお
り、２番目の次のエクソンは（アミノ酸１５７から２１
８と２１９から２９５）リジンに富み、産物（２９６か
ら３６４）のｃ末端はプロリンとアラニンに富んでい
る。エクソンの番号のつけ方については、図７と図９を
見よ。ＣＧＡＴ／Ｃまたは、ＣＴＴＡＣ，ＣＴＧＴＣ
（Ｋｅｌｌｅｒ，１９８４）とスプライスアクセプター
ＣＡＧの間の自己・補性領域に下線が引いてある。ヒト（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ遺伝子のエク
ソン−イントロン境界 【００７２】 【表２】【００７３】１．６及び１．８ｋｂ ＲＮＡｓ（図７を
見よ）の保持されたウンデカヌクレオチドをもったポリ
アデニレーションサイトには、下に点線が記されてい
る。カッコ内の数は、イントロンまたはエクソン（図９
を見よ）をになっているＥｃｏＲＩ遺伝子断片の大きさ
である。各エクソンの出発点と終点は、図７の９−２１
ＥｃＤＮＡにおけるように数字がついている。Ｅ１６とＥ１８の（２′−５′）オリゴシンテターゼの
エクソンドメイン 【００７４】 【表３】【００７５】Ｅ１８ｃＤＮＡ４８−１は不完全であるけ
れども、我々は、エクソン１−６（図９）がノーザンブ
ロット上の１．６ｋｂと同様に１．８ｋｂのｍＲＮＡと
ハイブリッド結合することを見出した。２つのＲＮＡの
構造はエクソン７迄は同一であることはかなり確からし
い。Ｅ１８ｃＤＮＡを特徴づけるエクソン７の中央から
エクソン８への追加的スプライシングは、遺伝子ＤＮＡ
クローン中のこれらのイントロン−エクソンの境界の配
列を決定することにより確かめられた（Ｔａｂｌｅ
２）。 【００７６】Ｅ１８ｃＤＮＡ中に存在する切りつめたエ
クソン７ａは１．６ｋｂ ＲＮＡのポリアデニレーショ
ンの位置を含む１．６ｋｂのイントロンに続いている。
エクソン８はその遺伝子のユニークなＢａｍ Ｈ１の位
置から、９８ｂｐ下流で始まる（Ｔａｂｌｅ ２，図
９）ＡＡＴＡＡＡシグナルの二連の繰返しによって特徴
づけられる１．８ｋｂ ＲＮＡのポリアデニレーション
サイトによって終る。エクソン７と８は相同性がないけ
れども、その中で３番目のシチジンが、ポリアデニル化
されている保持されたウンデカヌクレオチドＡＣＣＡＴ
ＴＴＡＴＴＣが両方のエクソン（Ｔａｂｌｅ ２）の端
に存在している。以前に指摘されたように、（Ｂｅｎｅ
ｃｈら、１９８５）ヘアピンループ構造が、両方の場合
にその保持されたウンデカヌクレオチドと、ＡＡＴＴＡ
ＡＡ領域の間に形成されることができる。このような構
造が、転写物の開裂と、ポリアデニル化が、エクソン７
の端でおこるか、エクソン８の端でおこるかを決定す
る、細胞特有のメカニズムに関与しているかもしれな
い。 【００７７】上記の遺伝子マッピングに基いて、１．８
ｋｂ ｍＲＮＡによってコードされる酵素は、最初の３
４６のアミノ酸中のＥ１６産物と同一であるべきであ
り、その次にアスパラギン酸、グルタミン酸、ヌクレオ
チンに富んでいる。５４のアミノ酸の長い領域が続く。
４００のアミノ酸の長さの、Ｅ１８酵素は４６，０００
の分子量を持っているであろう。 【００７８】例 ７ 同一遺伝子を二者選一的スプライシングによって生産さ
れるヒト（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの２つの
形 ＳＶ８０ＲＮＡｓのノーザンブロット分析の結果、イン
ターフェロンに接触した後、１２時間迄に、Ｅ１ｃＤＮ
Ａとハイブリッドを作る３種の（１．６，１．８及び
３．６ｋｂ）が蓄積することが明らかになった（Ｍｅｒ
ｌｉｎら、１９８３）。更にその外に不安定な転写物も
みられた。これらのＲＮＡｓの間の関係を遺伝的ＤＮＡ
クローン上の転写マッピングによって研究した。２つの
ヒト遺伝的ライブラリーにおいて、Ｅ１ｃＤＮＡは、ヒ
トＤＮＡ（図９）の２９ｋｂを表す重なり合っている遺
伝的ＤＮＡのクローンの一系列のみを同定し、明らかに
ユニークな（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ遺伝子
（Ｂｅｎｅｃｈら、１９５５ａ）を含むことが見出され
た。 【００７９】Ｓ１ヌクレアーゼ分析と部分的遺伝子の配
列決定により、９−２１（Ｅ１）のｃＤＮＡが５つのエ
クソンに相当することが見出された。（図９Ａと図７の
配列に３−７の番号がついている）このｃＤＮＡの３′
未満とポリアデニレーションの位置は、エクソン７の端
にあることが同定された（図９）。しかし、ＳＶ８０Ｒ
ＮＡのノーザンブロットに対する、さらに下流のジェノ
ミックＤＮＡ断片のハイブリッド形成により、１．６ｋ
ｂのＲＮＡだけが、エクソン７のポリアデニレーション
の位置に終っており、１．８と３．６ｋｂのＲＮＡｓは
１．６ｋｂ下流に位置しており、やはり、ポリアデニレ
ーションの位置に終っている（エクソン８、図９）、更
に、別のエクソンとハイブリッド形成を行なうことが明
らかとなった。 【００８０】このようにして、９−２１（Ｅ１）ｃＤＮ
Ａは、１．６ｋｂ ＲＮＡを呈しており、Ｅ１６ｃＤＮ
Ａと名前をつけ直した。さらに、エクソンの３′の半分
は、１．８ｋｂのＲＮＡとはハイブリッド結合せず、転
写がエクソン７からエクソン８への中間からスプライシ
ングイベントによって形成されるということを示してい
る。５′の上流のエキソンはすべて、１．６及び１．８
ｋｂ ＲＮＡｓとハイブリッド結合し、２ＲＮＡｓは、
その３′末端においてのみ異なることを示している。こ
のことは、ＳＶ８０λｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリーか
ら１．８ｋｂＲＮＡに対する判別スプライシングを証明
しており、エクソン８（図４）のポリアデニレーション
の位置で終っている、（図４）ｃＤＮＡクローンの単離
によって確かめられた（クローン４８−１または、Ｅ１
８ｃＤＮＡ、図７Ｂ）。同様なｃＤＮＡクローンが、Ｓ
ａｕｎｄｅｒｓとＷｉｌｌｉａｍｓ（１９８４）による
Ｄａｕｄｉ ｃＤＮＡライブラリーにおいて見出され
た。Ｅ１８の配列は、５１５のヌクレオチドによって置
きかえられているＥ１６の最後の２４７のヌクレオチド
をロックしており、１．６ｋｂと１．８ｋｂ ＲＮＡｓ
の間の大きさの差を説明している。 【００８１】１．８ｋｂのＲＮＡは、したがって、Ｅ１
６タンパクとそのＣ末端が異なっている４６，０００−
Ｍｒのタンパクをコードしている。Ｅ１６タンパクと同
様に、Ｅ１８産物は、ｄｓＲＮＡ結合を有しており、
（２′−５′）Ｅ１８固有のＤＮＡ断片へのハイブリッ
ド形成によって選ばれたｍＲＮＡの翻訳によって示され
た（Ｂｅｎｅｃｈら、１９８５）。このことは、２種の
タンパクに共通な最初の３４６アミノ酸が触媒の場所を
含んでいることを示唆している。エクソン組成を試験す
ることにより、この共通の部分は、３つの塩基性領域が
続いているＮ末端酸性ドメインから構成されているよう
に思われる。Ｅ１６タンパクの最後の１８残基は、非常
に疎水性の領域を形成しており、それはＥ１８において
は、潜在的グリコシル化の位置を含んでいるもっと長い
水溶性で酸性の領域でおきかえられている。２つの酸素
の間のこの差は、それらが二量化したり、または他のタ
ンパク類や細胞構造と相互作用を行なう能力を決定する
かもしれない。例えば、Ｅ１６は膜と結合するが、Ｅ１
８はリボソームや核の中の塩基性タンパクと相互作用を
行なうかもしれない。 【００８２】（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの２
つの形は、インターフェロン処理のヒト細胞（Ｒｅｖｅ
ｌら、１９８２）の抽出物中ゲルロ過を行なうことによ
って見出された（Ｒｅｖｅｌら、１９８２）、即ち、Ｅ
１６またはＥ１８タンパクの単量形に相当するかもしれ
ない３０−４０ｋｄの酵素と、今後同定しなければなら
ない６０−８０ｋｄのタンパクである。転写物のマッピ
ングが、このＲＮＡは、１．８ｋｂのＲＮＡから除去さ
れるイントロン領域を（例えば、エクソン７と８の間）
含んでおり、そしてオープンリーディングフレームがな
いことを示したので、３．６ｋｂのＲＮＡは、大きい酵
素をコードしているとは思われない。我我は、接合子に
おける翻訳において、大きなｍＲＮＡを観察できなかっ
た。精製ヒト（ＨｅＬａ）合成酵素中に８０ｋｄタンパ
クが報告された（Ｙａｎｄら、１９８１）が、その酵素
活性は証明されなかった。 【００８３】ＮａｍａｌｖａとＣＭＬ細胞から精製した
（Ｒｅｖｅｌら、１９８１ｂ）酵素において、我々はＳ
ＤＳ中に、４０ｋｄのバンドを検出できた。したがっ
て、６０−８０ｋｄ酵素が、４０ｋｄタンパクのダイマ
ーである可能性が残っている。ヒトのシンテターゼは、
３０ｋｄ酵素（主に核の）をコードしている１．５ｋｂ
ＲＮＡに加えて、８０ｋｄ酵素（主に細胞質の）をコー
ドする大きな３．８ｋｂのＲＮＡが、変性条件でみられ
るマウスの細胞中のそれとは異なっているかもしれない
（Ｓｔ．Ｌａｕｒｅｎｔら、１９８３）。ヒトＥｃＤＮ
Ａは、３．８Ｍｂと０．６−１．７ｋｂのＲＮＡを検出
し、大きなＲＮＡは、Ｅ１８に特異的なＤＮＡとハイブ
リッド形成をする（Ｍａｌｌｕｃｃｉら、１９８５）。
ヒトの細胞では、大きなＲＮＡが更に加工されて、１．
８ｋｂ ＲＮＡとなり、それがマウスの細胞にみられな
いという可能性がある。Ｓｈｕｌｍａｎら、１９８４）
は、ヒト細胞の（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの
大きさは、ヒト細胞中でも、ヒト−げつし類のハイブリ
ッド細胞染色体へのシンテターゼ遺伝子をマップするマ
ウスの細胞中よりも、もっと小さいタンパクとして挙動
するという事実を用いた。Ｅ１６とＥ１８に特異的な抗
血清は、これからのタンパクと２種の天然のままの酵素
の２つの形の間の関係を解明するのに役立つであろう。 【００８４】例 ８ ２つ（２′−５′）のオリゴＡシンテターゼの細胞特異
的な発現 多数のヒトの細胞系からのＲＮＡが、ノーザンブロット
中で、ＥｃＤＮＡプローブについて試験された（Ｍｅｒ
ｌｉｎら、１９８３；Ｂｅｎｅｃｈら、１９８５）。Ｔ
ａｂｌｅ ４は、ヒト細胞が、インターフェロンで誘導
された重要ＥｍＲＮＡ種にしたがって、３つの細胞にわ
けることができることを示している。Ｂｕｒｋｉｔｔリ
ンパ腫からのリンパ芽球様Ｂ細胞系は、主として１．８
ｋｂ ＲＮＡを有している。そうではなくて、いくつか
の細胞系は、１．６と３．６ｋｂＲＮＡをもっている
が、１．８ｋｂのＲＮＡは殆どもっていない。もし３．
６ｋｂ ＲＮＡが部分的にスプライスを受けた１．８ｋ
ｂ ＲＮＡのプリカーサーだとすると、これらの細胞
は、３．６ｋｂ ＲＮＡの加工に阻害をしているのかも
しれない。 【００８５】Ｔ−リンパ球系（急性白血病からのＣＥＭ
Ｔとヘアリー細胞白血病からのＧａｓｈ）は、繊維芽細
胞と同様に、すべての３ＥＲＮＡシリーズを含んでい
る。だから、Ｅ１８ポリアデニレーションの位置は、す
べての人の細胞の中で利用され、３．６か１．８ｋｂ
ＲＮＡを生産しているように思われる。Ｅ１６ｐＡの位
置は、Ｂリンパ芽球様細胞では用いられていないようで
ある。Ｅ１６とＥ１８ｐＡの位置の両方において、存在
している保存されているウンデカヌクレオチドは（図９
Ｂ）ＡＡＴＡＡＡシグナルとヘアピンループを作ること
ができ、場所の選択に役割を演じるかもしれない（Ｂｅ
ｎｅｃｈら、１９８５）。Ｅ１８は、ＡＡＴＡＡＡシグ
ナル（図９Ｂ）の２連性繰返しを有しており、より強い
ｐＡの位置であるかもしれない。Ｅ１８のｐＡの位置で
終る転写は、インターフェロン添加の後、１．６ｋｂ
ＲＮＡ（Ｂｅｎｅｃｈら、１９８５）よりも早く蓄積す
る。 優先的に存在する（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ
ＲＮＡ種 【００８６】 【表４】 【００８７】優先して作られるシンテターゼの型は、ヒ
トの細胞が異なれば変化する。我々は、シンテターゼの
細胞質または核の高圧と細胞中に存在するＲＮＡの型と
の間になんら相関関係を見出さなかった。しかし、ゲル
ロカを行なったとき、Ｎａｍａｌａｖａ細胞は、主とし
て、３０ ０ｋｄ酵素であったが、一方ＨｅＬａと
ＳＶ８０細胞は、６０−８０ｋｄ型ももっていた（Ｒｅ
ｖｅｌら、１９８２） 【００８８】例 ９ （２′−５′）グリコＡシンテターゼの 領域 Ｅ１６ｃＤＮＡ９−２１クローンのエクソン３の部分を
含んでいる４．２ｋｂＥｃｏ Ｒ１フラグメント（Ｆｉ
ｇ．９）から、０．８５ｋｂ（Ｆｉｇ．１０）のＳｐｈ
１−Ｓｐｈ１が、１．６，１．８，２．７および３．６
ｋｂＲＮＡｓとノーザンブロックで、ハイブリッドを形
成した。しかし、上流域はハイブリッド形成をしなかっ
た。いくつかの実験により、その断片の転写の出発点の
位置がわかるようになった。Ｓ１ヌクレアーゼによる分
析によって、まず、エクソン３が、９−２１ｃＤＮＡの
終りの、上流約５０ヌクレオチドから出発していること
がわかった。９−２１ｃＤＮＡの終りからのオリゴヌク
レオチドを用いてのプライマーの拡張実験により、ｍＲ
ＮＡの５′末端は、このｃＤＮＡの５′の端からの、約
２３０ヌクレオチドであるということを示した。リボプ
ローブとのＲＮＡのハイブリッド形成は （Ｇ
ｒｅｅｎら、１９８３）およびＲＮａｓｅによる分解に
よってエクソン３の前に、７０及び、１１０ヌクレオチ
ドの２つのエクソンの存在が示された。 【００８９】ユニークなＨｐａｌの位置（図９）におい
て、ラベルしたプローブを用いてＳ１ヌクレアーゼを解
折することによって、ｍＲＮＡの５′末端は、最終的に
Ｈｐａｌの位置から１７ヌクレオチド上流に位置してい
ることがわかった。この領域の配列は、図６に示されて
いる。Ｈｐａｌ ｓｉｔｅの前の１７残基の転写開始位
置の決定は、−３０の位置に、ＴＡＴＡＡボックスが存
在することによって支持されている。上流配列の著しい
特徴は、プリン含量が高いことであり、（６９．６
％）、主としてアデニン（５８．９％）である。他の既
知のプロモーターの上流配列との、相同性のマトリック
スを比較したところ、ヒトインターフェーロンプロモー
ター、とりわけ、インターフェロンβ１遺伝子プロモー
ター（Ｄｅｇｒａｖｅら、１９８１）の配列と著しい相
同性が明らかになった。Ｚｉｎｎら（１９８３）によっ
て記述された本質的な転写シグナルを含むＩＦＮ−β１
プロモーターの−７５から−８５のプリンに富んだ領域
は、ＴＡＴＡＡボックス（−４０から−５０）の丁度上
流にある（２′−５′）オリゴシンテターゼの の
プロモーターの領域との９％の相同性を示した（図１
１）このプリンに富んだシグナルは、ＴＡＴＡＡボック
スとそのキャップの位置の間の小片の中のＩＦＮβ１プ
ロモーターの中に繰返されている。 【００９０】やはり、制御的な機能をもっているかもし
れない（Ｎｉｒら、１９８４）この領域において、ＩＦ
Ｎ−β１遺伝子と（２′−５′）オリゴシンテターゼ遺
伝子は高い。対照的に、インターフェロンで活性化され
る（Ｆｅｌｌｏｕｓら、１９８２；Ｒｏｓａら、１９８
３ｂ；Ｆｒｉｅｄｍａｎら、１９８４）ＨＬＡ遺伝子や
（Ｍａｌｉｓｓｅｎら１９８２；Ｓｃｈａｍｂｏｅｃｋ
ら、１９８３）ＩＩ遺伝子（ＫａｒｉｎとＲｉｃｈａｒ
ｄｓ、１９８２）は、この（２′−５′）オリゴＡシン
テターゼ遺伝子のプロモーターにおいて、なんら明らか
な配列関係を生じなかった。ＩＮＦ−β１の遺伝子本体
とは、やはり、有意な相同性はみられなかった。（２′
−５′）オリゴシンテターゼｍＲＮＡ（エクソン１，
２，及びエクソン３の１部）の翻訳されないリーダー
は、その位置がＦｉｇ．６に示されたような、Ｓ１分折
によって、仮に決定された２つの短いイントロンを含ん
でいる。全体のヒト（２′−５′）オリゴＡシンテター
ゼ遺伝子は、約１３ｋｂ（図９）であり、エクソンの総
計はｍＲＮＡｓの観察された大きさと一致している。 【００９１】例１０ （２′−５′）オリゴＡシンテターゼのラムダー−ＧＴ
１０ｃＤＮＡクローン ヒトＳＶ８０細胞のポリＡ＋ＲＮＡから調整したλｇｔ
１０ｃＤＮＡライブラリー（ＷｏｌｆとＲｏｔｔｅｒ、
１９８５）を、前に記述された（Ｍｅｒｌｉｎら、１９
８５）Ｅ１ｃＤＮＡプラスミッドＰｓｔｌ−Ｐｓｔ１イ
ンサートをプローブとしてスクリーニングした。１．６
ｋｂＥＲＮＡの３′の端に相当するインサート（Ｂｅｎ
ｅｃｈら、１９８５）を、アガロースゲル電気泳動によ
って精製し、ニック−トランスレーションを行なった。
（Ｒｉｇｂｙら、１９７７）。プラークを、９ｃｍのプ
レート（１０5 ファージ）から繰返し拾いあげ、小量の
λＤＮＡ調製物を、ルーチン法によって（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら、１９８２）制限マッピングによって解析した。 【００９２】Ｅ１ｃＤＮＡ断片をふくむ１５のλｇｔ１
０ ｃＤＮＡクローンが単離され、最も長いインサート
をもったファージ９−２と５−２を、ＥｃｏＲ１でき
り、インサートをｐＢＲ３２２にサブクローニングを行
ない、Ｆｉｇ．１ＡのＥ１６ｃＤＮＡクローン９−２１
と５−２１を得た。同じライブラリーが、１．８ｋｂＲ
ＮＡと特異的にハイブリッドを作る１断片であるファー
ジλｃｈＥ１（Ｂｅｎｅｃｈら、１９８５）からのヒト
遺伝子的Ｐｓｔ１−Ｐｓｔ１０．９ｋｂ断片についてス
クリーニングされた。その際、我々は、部分的にスプラ
イスを行なったＲＮＡを表している他のｃＤＮＡクロー
ンとともに、図１Ｂのλｇｔ１０ｃＤＮＡクローン４８
−１を単離した。配列決定は、ＭａｘａｍとＧｉｌｂｅ
ｒｔ（１９８０）に従って行なわれた。制限酵素は、Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓと、Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒからであった。ＰｕｓｔｅｌｌとＫａｆａｔ
ｏｓ（１９８２ａ，ｂ）の相同性マトリックスと、ハイ
ドロプロットコンピュータープログラムは、ＩＢＭＰＣ
で行なった。タンパクのコーディングフレームの位置を
決める３塩基の周期性は、Ｔｒｉｆｏｎｏｖ（１９８
４）に従って計算した。 【００９３】（２′−５′）オリゴシンテターゼ遺伝子
を含む遺伝子ＤＮＡのクローン ３つの重なりのある遺伝子のクローンが、以前に記述し
たように単離された（Ｂｅｎｅｃｈら、１９８５）。す
なわち、部分的にＥｃｏＲ１で切ったＤＮＡライブラリ
ーからの、λｃｈ Ｅ１（Ｍｏｒｙら、１９８１）と部
分的な、Ａｌｕ１／Ｈａｅ３ ＤＮＡライブラリー（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓら、１９７８）からのλｃｈＥ２とＥ３
である。これらのファージのＥｃｏＲ１遺伝子断片が、
ｐＢＲ３２２サブクローニングされた。エクソンマッピ
ングは、１）サブクローニングを行なった遺伝子断片の
制限酵素による分解物のサザンブロットを、種々のｃＤ
ＮＡプローブに、ハイブリッド形成を行なわせることに
より、２）遺伝子ＤＮＡの制限酵素断片を、記述されて
あるように（Ｂｅｎｅｃｈら、１９８５）ＩＦＮで処理
したが、処理していない細胞から、ポリＡ＋ＲＮＡのノ
ーザンブロットとハイブリット結合させることにより、
そして、３）ｃＤＮＡと比較して、イントロン−エクソ
ンの境界の配列を決めることによって行なった。 【００９４】ｍＲＮＡの５′末端を含む遺伝子４．２ｋ
ｂ ＥｃｏＲ１断片の内部のＳｐｈ１−Ｓｐｈ１ ０．
７８ｋｂ小片を配決定を行なう前にｐＢＲ３２２のＳｐ
ｈ１の位置にサブクローニングを行なった。ｍＲＮＡ
（Ｄｒ．Ｄ．Ｓｅｇｅｖ，Ｉｎｔｅｒｙｅｄａのおくり
もの）に相補的な１８−２０塩基の合成オリゴヌクレオ
チドを用いて、以前と同様にプライマー拡張を行なった
（Ｒｏｓｅら、１９８３ａ）。ＳＰ６ベクター中のサブ
クローニングの後、リボプロープの合成は、Ｐｒｏｍｅ
ｇａ Ｂｉｏｔｅｃの教えに従って行なった。Ｄａｕｄ
ｉリンパ芽球様細胞と、ＦＳ１１包皮繊維芽細胞からの
ＤＮＡは、Ｗｉｇｌｅｒら（１９７９）に従って調整
し、サザンブロットアナリシスは、製造者（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）によって推奨されている
ハイブリッド形成操作Ｂを用いてＧｅｎｅ−Ｓｃｒｅｅ
ｎ Ｐｌｕｓナイロンファイバー上で行なった。 【００９５】例１２ （２′−５′）オリゴＡシンテターゼのＲＮＡのインタ
ーフェロン作用の臨床モニター用の迅速セル・ブロット
・アッセイ （２′−５′）オリゴＡシンテターゼの測定の有用性
は、患者のインターフェロン−βに対する反応をモニタ
ーするため、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において
（Ｓｃｈａｔｔｎｅｒら、１９８１ａ）と、筋肉注射
（Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄら、１９８４）によって示され
た。正常な個人個人におけるＰＢＭＣの酵素レベルは、
どちらかというと一定であるからこのアッセイによっ
て、ＰＢＭＣや、顆粒球の酵素の増加（Ｓｃｈａｔｔｅ
ｒら、１９８１ｂ，１９８４；Ｓｃｈｏｎｆｅｌｄら、
１９８５）によって、証拠づけられるウイルスの感染の
診断が可能となった。酵素の減少は、様々な芽細胞に関
する急性白血病をもちつづける（Ｗａｌｌａｃｈら、１
９８２；Ｓｃｈａｔｔｎｅｒら、１９８２）。この技術
はまた、Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９８１）によって開拓
され、現在では、広く用いられている。 【００９６】シンテターゼＥは、すべての３種の型のイ
ンターフェロン、α，β，γによって処理された細胞で
強く誘導され、その増加は、インターフェロン活性のよ
いマーカーである（Ｗａｌｌａｃｈら、１９８２）。し
たがって、Ｅレベルの測定を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
または、ｉｎ ｖｉｖｏの細胞がインターフェロンに触
れ、それに反応するかどうかを決定することが可能であ
る。この測定は、該溶液に細胞をさらし、Ｅレベルの増
加を決定することによって、この測定をインターフェロ
ンのアッセイに用いることができる（Ｆｅｖｅｌら、
Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，３０２，５３３）こ
の測定は、また、インターフェロンが人をはじめとし
て、全生体中に増加して生産されるかどうかを確立する
ためにも用いられる。 【００９７】インターフェロン−βの自動的分泌作用の
結果として、造血性細胞の分化を通じて、（２′−
５′）オリゴＡシンテターゼは増加する（Ｙａｒｄｅｎ
ら、１９８４）。もう１つのＥ測定の重要な応用は、イ
ンターフェロン治療を行なっている患者のモニターを行
なうことにある。臨床的変化の外に、全身性のインター
フェロンβ処理と同様に、インターフェロンα処理によ
って５−１０倍増加するＰＢＭＣＥレベルを測定するこ
とによって、患者が、インターフェロンに反応している
ことを確立することが可能である（Ｓｃｈａｔｔｎｅｒ
ら、１９８１ａ；Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄら、１９８
４）。他のＩＦＮによって誘導された活性または分子
が、Ｅ酵素のアッセイと同様に用いられるかもしれな
い。しかし、この方法は、もっとも広く用いられてい
る。（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｂｏｒｄｅｎ）。 【００９８】さて、ヒトＰＢＭＣ中のＥＲＮＡのアッセ
イが同じ目的に使われる。９−２１ＥｃＤＮＡをプロー
ブとして用い、素早いセルブロットが（Ｃｈｅｌｅｙと
Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９８４）ＰＭＢＣについて開発さ
れた（図１４）。ＥｃＤＮＡから誘導したオリゴヌクレ
オチドも、プローブとして使うことができる。１０Ｕ／
ｍｌのインターフェロンの効果は、この方法で容易に検
出できる（図１５）１０7 単位／１日のインターフェロ
ンα−Ｃによって処理された患者において陽性の結果が
得られた。 【００９９】例１３ （２′−５′）オリゴＡシンテターゼに対する抗体の獲
得 天然の（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性分子に
対する抗体の誘導のための抗原として役立てるため、Ｅ
１６及びＥ１８の全アミノ酸配列が選ばれた。 ペプチドＢ： ＧＬＵ ＬＹＳ ＴＹＲ ＬＥＵ ＡＲＧ ＡＲＧ ＧＬＭ ＬＥＵ ＴＨＲ ＬＹＳ ＰＲＯ ＡＲＧ ＰＲＯ ＶＡＬ ＩＬＥ ＬＥＵ ＡＳＰ ＰＲＯ ＡＬＡ ＡＳＰ は、Ｅ１８とＥ１６配列に共通なアミノ酸２８４から３
０３迄を含んでいる。 ペプチドＣ： ＡＲＧ ＰＲＯ ＰＲＯ ＡＬＡ ＳＥＲ ＳＥＲ ＬＥＵ ＰＲＯ ＰＨＥ ＩＬＥ ＰＲＯ ＡＬＡ ＰＲＯ ＬＥＵ ＨＩＳ ＧＬＵ ＡＬＡ Ｅ１６（３４８から３６４迄の残基）のＣ末端を含んで
いる。両ペプチドともＢａｒａｎｙとＭｅｒｒｉｆｉｅ
ｌｄ（１９８０）の固相ペプチド合成法によって合成さ
れた。 【０１００】セファデックスＧ２５カラム上で２Ｍの酢
酸中で精製し、ペプチドはＫｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅ
ｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ．）
と結合した。ペプチドＣのアミノ末端アルギニンのアミ
ノ基を、Ｐ−アミノフェニール酢酸でエステル化するこ
とによって、そのアミノ末端を通じて、キャリアータン
パクと共軛ペプチド結合することができる（Ｓｐｉｒｅ
ｒら、１９７７）。ペプチドＢは、エチレンジアミンカ
ルボジイミド（ＨｏａｒｅとＫｏｓｈｌａｎｄ，１９６
７）によって、キャリヤータンパクとカップルさせた。
ラビットに完全なＦｒｅｕｎｄのアジュバンド中に乳化
させた１ｍｇのキャリヤーにカップしたペプチド（０．
２ｍｇの純粋なペプチドに相当する）を皮下注射した。
ラビットは２週間おきに２回強化注射により、不完全ア
ジュバンド中の０．５ｍｇのキャリヤーにカップルした
ペプチドを与え、最大の抗体反応が出るまで続けた。ラ
ビットの血清中の抗体の力価は、キャリヤーフリーのペ
プチドを用いて、エンザイムにリンクした、イミュノソ
ルベントアッセイ（Ｇｒｅｅｎら、１９８２）において
測定された。 【０１０１】例１４ 酵素を探知するための抗−（２′−５′）オリゴＡシン
テターゼ活性ペプチドの抗体の使用 インターフェロン処理のヒト細胞培養物の抽出物 繊維芽様細胞系ＳＶ８０と羊皮細胞系Ｗｉｓｈをプラス
チックでプレートでコンフルエンモノレイヤー培養を行
なった。Ｄａｕｄｉ細胞系は、サスペンジョンで、１．
５×１０6 細胞／ｍｌまで生育させた。培養液をｒＩＦ
Ｎ−β１，５００μ／ｍｌで１６−２４時間処理した。
ヒトｒＩＦＮ−β１は、遺伝子工学にかけたＣＨＯ細胞
によって生産され、モノクローナル抗体クロマトグラフ
ィーによって均一になるまで精製した（Ｃｈｅｒｎａｊ
ｏｖｓｋｙら、１９８４）。 【０１０２】細胞は、４℃で、燐酸緩衝液を含んだ食塩
水で２度洗い、緩衝液、即ち２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝
液、ｐＨ７、５．５ｍＭ酢酸マグネシウム、３０ｍＭβ
−メルカプトエタノール１００μＭフェニルメチルスル
フォニルフラロイド（ＰＭＳＦ）１０％グリセロール及
び０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＤ４０）中で
冷時融解した。核と、こわれていない細胞を１５００γ
で１０分間遠心分離して除いた。上澄（Ｓ１．５）をＥ
ｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ中で、ミトコン
ドリアとライソゾームのない上澄（Ｓ１５）を得るた
め、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ中で、１
５，０００γで１０分遠心分離した。タンパクの濃度
は、ミクロアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ１９７６）によ
って測定した。Ｂｅｃｋｍａｎｎ冷凍遠心器中で、Ｓ１
５を、１００，０００γで２時間遠心分離して細胞液
（Ｓ１０００）とミクロソーム（Ｐ１００）区分を調整
した。 【０１０３】例１５ （２′−５′）オリゴＡシンテターゼのアッセイ １−２μｇのタンパクを含むＳ１５の割当て量を２０μ
ｌの、２５ｍＭ Ｈｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．５、２０ｍ
Ｍｇ Ａｃｅｔａｔｅ，１ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅ
ｉｔｏｌ，１．５ｍＭ ＡＴＰ，４μＣｉの32Ｐ−α−
ＡＴＰ，５０μｇ／ｍｌ ｐｏｌｙ（ｒＩ）（ｒＣ）
（ＰＬ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌから）を含む反応液中
で３０℃２時間インキュベートした。５分間沸とうさせ
た後、Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ遠心分離した後、バクテリア
のアルカリ性ファスファターゼを２５０Ｕ／ｍｌを加
え、反応物を３７℃で２時間インキュベートした。２か
ら７μｌをＷｈａｔｍａｎｎ３ｍｍ濾紙にスポットし、
ピリジン酢酸中ｐＨ３．５で３，０００Ｖで電気泳動を
行なって分折した。オートラジオグラフィーで分折した
後、（Ａ２′ｐ）ｎＡオリゴマースポットを切出し、カ
ウントした。 【０１０４】例１６ 電気泳動−トランスファーインミュノブロット 粗細胞区分の一部分（３０μプロテイン）を、Ｌａｅｍ
ｍｌｉのナトリウム−ドデシル−サルフェート−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動ローディング緩衝液で調節し
（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）で１０分間沸騰してか
ら、７．５または、１０％ゲル上で電気泳動にかけた。
Ａｍｅｒｓｈａｍの14Ｃ−メチル化したタンパクを分子
量標準物質として用いた（１０4 ｃｐｍ）。ニトロセル
ローズペーパーへの電気泳動トランスファーは、（Ｓｃ
ｈｌｅｉｃｈｅｒ及びＳｃｈｕｌｌＥＡ８５）２５ｍＭ
トリスベース、１９２ｍＭグリシン及び２０％メタノー
ル中で行なわれた。ブロットを０．０９Ｍ ＮａＣｌ，
０．０１Ｍトリス−塩酸、ｐＨ７．５、１０％（ｖ／
ｖ）の１％ファットミルク溶液、１０％（ｖ／ｖ）の熱
で不活性化した仔牛胎児血清、そして、０．０５％トウ
イーン−２０、中で３７℃で２時間か、４℃で一夜、続
いて、３７℃で３０分予備的インキュベーションを行な
った。次に、ブロットは、ラビット１ｇＧ０．１ｍｇ／
ｍｌの形で、アンチ−（２′−５′）オリゴＡシンテタ
ーゼペプチドＢ抗体と２時間３７℃でインキュベートし
た。ブロットは、４％仔牛血清中で１０分間５回洗い、
１０6 ｃｐｍ／ｍｌのの 125Ｉ−タンパクＡ（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ，３０ｍｃｉ／ｍｇ）を含む完全な上記前イン
キュベーション混合物中で、３７℃で１時間インキュベ
ートし、ブロットを洗い、オートラヂオグラフィーにか
けた。 【０１０５】例１７ （２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性とラベルタン
パクの免疫沈澱 ５−１０μｌのアンチ−オリゴＡシンテターゼペプチド
Ｂラビット血清の最初の適量を、３％牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）とともに、ＰＢＳ中で平衡させた３ｍｇのタ
ンパクＡ−セファロース（ｐｈａｒｍａｃｉａ）に吸着
させ、３０分室温で、次にＰＢＳ−１％ＢＳＡで洗っ
た。（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ酵素活性の免
疫沈澱には、２μｇのＳ１５タンパクの適量を緩衝液Ａ
最終量２０μｌとして、上のペレットにした１ｇＧ−タ
ンパクＡセファローズに、２時間４℃で吸着させた。緩
衝液は、バッファーＡで５倍にうすめ、上澄液を別のチ
ューブに移した。ペレットを０．５ｍｌのバッファーＡ
で３回洗い、次に、２５μｌの酵素反応液中でけん濁さ
せた（上を見よ）。活性は、結合していない上澄の一部
についても測定を行なった。 【０１０６】（２′−５′）オリゴＡシンテターゼをラ
ベルするために、Ｗｉｓｈ細胞をコンフルエントモノレ
イヤー迄、３ｃｍのプラスチック皿で生育させ、１２時
間、５００Ｕ／ｍｌのｒＩＦＮ−β1 で処理した。培地
は、５００μＣｉの、35Ｓ−メチオニン（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ４００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）を含むメチオニンフリー
ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）で置き換え、細胞は、２時間イ
ンキュベートし、ＰＢＳで洗いバッフーＡでホモジナイ
ズした。Ｓ１５を免疫沈澱に用いた。約１０7ｃｐｍの
Ｓ１５タンパクをペレット状にしたタンパクＡ−セファ
ロースに加え４℃で２時間混合した。ビーズを１％ＢＳ
Ａ、１％ＮＰ４０、ＰＢＳ中の２Ｍ ＫＣｌで洗い、そ
して、ＰＢＳだけで２回洗った。サンプルをナトリウム
−ドデシル−サルフェート−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動によって解折した。 【０１０７】例１８ （２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性を検知するた
めの抗ペプチド抗体の使用 アンチ−（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性ペプ
チド抗体による（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活
性の免疫沈澱 抗血清Ｂは、Ｅ１６とＥ１８配列に共通なペプチドに対
して作り、一方、抗血清Ｃは、Ｅ１６においてのみ見出
されたペプチドに対して作った。我々は、これらの抗体
が、（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性を、特異
的に沈澱させるかどうかを確かめるために用いた。免疫
１ｇＧ−タンパクＡセファロース上に吸着した合成活性
と、上澄に残っている同活性は、免疫していないＩｇＧ
から得られた同じ分画と比較した。 【０１０８】１．６ｋｂ ＮＡ（Ｗｉｓｈ細胞）また
は、１．８ｋｂ ＲＮＡ（Ｄａｕｄｉｃｅｌｌ）を、優
先的に表している２つの細胞系からの抽出物を比較し
た。正常血清のバックグラウンドを差し引くことによ
り、抗−Ｂ、抗−Ｃに特異的に結合するものを評価でき
るようになる（図１６）。抗Ｃは、Ｗｉｓｈ細胞からの
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性を保持してい
たが、Ｄａｕｄｉ細胞からの活性は保持していなかっ
た。これは、これらの細胞にＥ１６ｍＲＮＡそして、４
０ｋｄタンパクが存在しないことと一致している（例１
９をみよ）。抗Ｂは、ＤａｕｄｉとＷｉｓｈの細胞抽出
物から（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性を吸着
した。クローニングを行なったｃＤＮＡｓから、引き出
したペプチドに対してつくられたアンチボディーは、従
って、特異的に異った（２′−５′）オリゴＡシンテタ
ーゼの形を認識する。 【０１０９】例１９ ヒト細胞からの（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活
性の異なる形のインミュノブロット分析 ペプチドＢに対する抗体を、ナトリウム−ドデシル−サ
ルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離
し、電気泳動的に、ニトロセルローズ紙にブロットされ
たヒト細胞の抽出物中の（２′−５′）オリゴＡシンテ
ターゼに特異的に結合する能力について調べた。インミ
ュノブロット中の抗体によって認識される存在の他に、
我々は、インターフェロン処理によって誘導される抽出
物中に存在する天然の（２′−５′）オリゴＡシンテタ
ーゼタンパクを期待している。そこで我々は、インミュ
ノタンパクによって明らかとなる誘導タンパクのみを調
べた（図１７）。 【０１１０】（２′−５′）オリゴＡシンテターゼｍＲ
ＮＡｓ（例１８をみよ）の表現のパターンの差のため
に、Ｄａｕｄｉ，Ｗｉｓｈ及びＳＶ８０の細胞系を比較
した（例１８をみよ）。抗体Ｂは、期待されたように、
Ｅ１８産物に大きさが類似している４５−４６ｋｄのタ
ンパクを、Ｄａｕｄｉ細胞中に検出し、Ｄａｕｄｉ細胞
中に発現されていないｍＲＮＡのＥ１６に相当すると考
えられる４０ｋｄを検出できない。対照的に、４０ｋｄ
Ｅ１６タンパクが、Ｗｉｓｈ細胞には存在し、これらの
細胞に、１．８ｋｂＲＮＡが存在していないことと一致
して、４６ｋｄＥ１８が存在しない。両方のタンパクと
もＳＶ８０細胞中に検出された。これらの結果は、ヒト
の細胞が、４０と４６ｋｄタンパクを生産し、そしてそ
れは、細胞がそれぞれ、１．６と１．８ｋｂＲＮＡｓを
表現する場合のみに起るということを、この結果は示し
ている。 【０１１１】抗−Ｂのインミュノブロットは、また、ヒ
トの細胞には（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの２
つの形のみならず、多分４つの形があることを明らかに
している。この事実は、インターフェロンによって誘導
される１００ｋｄと６７ｋｄの２つの他のタンパクを、
抗−Ｂが、４０と４６ｋｄのタンパクの外にはっきりと
検出したという事実から導き出せる。１００ｋｄはＤａ
ｕｄｉ細胞には検出されず、抗Ｂによって検出される大
きなタンパクも、やはり、細胞特異的なパターンで表現
されるということを示した。抗−Ｂが、天然の（２′−
５′）オリゴＡシンテターゼの形の配列から誘導された
ペプチドに対し作られ、インターフェロンによって、２
つのより大きいタンパクが誘導されるということから、
それらが（２′−５′）オリゴＡシンテターゼシステム
に属する可能性が非常に高い。これらが（２′−５′）
オリゴＡシンテターゼの形であることを確かめるため
に、我々は、ＳＶ８０の異なる細胞区分から、（２′−
５′）オリゴＡシンテターゼを精製した、そして平行し
て抗体Ｂによって検出されたタンパクを追跡した。 【０１１２】２つの異なる（２′−５′）オリゴＡシン
テターゼ活性型の分離 抗体Ｂによって探知された異なる２つのタンパクの分離
が、Ｆｉｇ．１８とＦｉｇ．１９に示してある４０ｋｄ
タンパクの大部分は、ＳＶ８０細胞からのＮＰ４０細胞
質抽出物の１００，０００ｇの上澄（Ｓ１００）中に残
っている。それは、低塩濃度では、ＤＥＡＥ−セルロー
ズには吸着されず、高濃度で吸着、溶出される。対照的
に、１００ｋｄタンパクは、Ｓ１００からのものに殆ど
存在せず、ミクロゾームペレット（Ｐ１００）に存在し
ており、それから、Ｎａ ｄｅｏｘｙ ｃｈｏｌａｔｅ
（ＤＯＣ）または０．５ＭＫＣｌによって溶解すること
ができる。このタンパクは、ＤＥＡＥ−セルローズに低
塩濃度に吸着し、高塩濃度で溶出される。６７ｋｄと４
５−４６ｋｄは、１部Ｓ１００に残っているが、比較的
ミクロゾームペレット中のｍｇタンパクあたりに比較的
濃縮されている。それらは、ミクロゾームからＤＯＣま
たは、ＫＣｌによって容易に抽出されにくいようであ
る。 【０１１３】グリセロールグリーディエント沈降によ
り、ＣＭ−セルローズ精製後Ｓ１００から精製した活性
は、４０ｋｄタンパクＥ１６の沈降と平行していること
がわかった。Ｐ１００から精製し、ＤＥＡＥ−セルロー
ズから溶出し、１００及び４６ｋｄタンパク類を含む分
画は、グリセロールグレーディエントで２つのピークに
わかれ、８０，０００及び４５，０００Ｍｒタンパクと
して沈澱した。重いピーク中の、（２′−５′）オリゴ
Ａシンテターゼは、１００ｋｄタンパクの存在と平行し
ている。 【０１１４】種々の（２′−５′）オリゴＡシンテター
ゼ活性型の異なる酵素的性質 グリセロールグレーディエントからの４０ｋｄタンパク
は、その活性に対する至適ｐＨが６．８であり、ｐＨ
７．８では２５％しか活性がない。さらに、ｐｏｌｙ
（ｒｌ）（ｒｃ）の濃度が１μｇ／ｍｌより低いと、４
０ｋｄ（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの活性は全
く認められず、最大活性には、５０−１００μｇ／ｍｌ
を必要とする（図２０）。同じ高いｄｓＲＮＡ要求性
が、Ｅ．ｃｏｌｉにおける組み換えＤＮＡ技術によって
作られた。Ｅ１６ｃＤＮＡ産物について見出された。 【０１１５】グリセロールグレーディエントの後１００
ｋｄタンパクは（２′−５′）オリゴＡシンテターゼに
ついての至適ｐＨは、７．６であり、酸性では活性がよ
り低い。それは、極度に低いｐｏｌｙ（ｒｌ）（ｒＣ）
の濃度あるいは、存在しない状態で、既に最大の活性を
有し、そして高濃度のｄｓＲＮＡで阻害さえ起る。これ
は、異なる（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの形が
それらの細胞質中の局在位置及び酵素的性質が違ってい
るため、異なる条件で使用されることを強く示唆してい
る。 【０１１６】多くの観察の結果、インターフェロンで誘
導された（２′−５′）オリゴＡシンテターゼは、（１
９８４年Ｒｅｖｅｌによって総説されている）その抗ウ
イルス効果に加えて２つの、みたところ反対の細胞生長
のフェーズ（セルサイクリングと成長の阻害）に関与し
ていることが示唆される。これは、複数の（２′−
５′）オリゴＡシンテターゼの型の問題と関係している
かもしれない。同調細胞培養において、我々は、（２′
−５′）オリゴＡシンテターゼが、セルサイクルタンパ
クとして作用することを観察した（Ｍａｌｌｕｃｃｉ
ら、１９８５）。このようにして、マウス胚芽の繊維芽
細胞の同調培養により、（２′−５′）オリゴＡシンテ
ターゼ活性と、（２′−５′）ＡシンテターゼｍＲＮＡ
が、Ｓ−期の終りに上昇し、細胞がＧ２期に進むと、そ
のＲＮＡと酵素活性が急速に消えることが示された。 【０１１７】抗マウスインターフェロン抗体は、オリゴ
シンテターゼ誘導を減少した。この系において、我々
は、Ｓ−フェーズにおいて蓄積する（２′−５′）オリ
ゴＡシンテターゼは、外生インターフェロンで処理した
とき、同じ細胞に蓄積する１．７ｋｂＲＮＡ種とは異っ
た大きな４−５ｋｂの転写物であることも観察した。こ
のことは、Ｓ−フェーズの（２′−５′）オリゴＡシン
テターゼは、外から加えたインターフェロンによって成
長を止められた細胞中のシンテターゼとは異なる形であ
ることを示唆している。その大きなｍＲＮＡのため、そ
れは、低いｄｓＲＮＡを要求する形である１００ｋｄに
近いものと思われる。抗−Ｂ抗体は、マウス細胞中に、
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの複数の型を検出
している。これらの観察は、（２′−５′）オリゴＡシ
ンテターゼの４つの型を別々にアッセイすることが出来
ることの利点を、わかり易く説明している。このシンテ
ターゼは、個々に、種々の生理的条件及び病気によって
変化しうる。 【０１１８】例２０ 抗−（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性ペプチド
抗体を（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性のイン
ミュノアッセイに使用すること 抗−Ｂ抗体は、（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの
すべての型を認識するので、それは、培養または直接患
者から得られたヒト細胞からの分別前の抽出物中におい
ての（２′−５′）オリゴＡシンテターゼのインミュノ
アッセイのために用いることができる。固相のラジオイ
ンミュノアッセイの例が、図２１に示される。インター
フェロンで処理してあるか、処理していないか、いずれ
のＷｉｓｈとＤａｕｄｉ ＣｅｌｌをＮＰ４０を含む、
ＢｕｆｆｅｒＡで融解し、上記の如く、ｍｉｃｒｏｆｕ
ｇｅ遠心で、Ｓ１５を調整した。１〜１０μｇのタンパ
クを含む１部をとり、直接にニトロセルローズペーパー
（もしくは、他のタンパク結合性紙）に適用し、そのシ
ートを、正規のインミュノブロット（図１９）に対する
場合のように抗−Ｂで処理した。 【０１１９】Ｆｉｇ．１１のオートラジオグラフィーが
示すように、 125Ｉ−タンパクＡは、インターフェロン
処理細胞から由来するサンプルのみと結合する。このア
ッセイは、ラベルタンパクＡを、パーオキシダーゼかβ
ガラクトシダーゼを共軛させた抗−ラビットＩｇＧと置
き換えることによって、エンザイム−リンクト−インミ
ュノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）の形でも使うことができる
のは明らかである。 【０１２０】（２′−５′）オリゴＡシンテターゼのイ
ンミュノアッセイは迅速であり、細胞抽出物調製に２０
分、抗−Ｅとタンパク−Ａ吸着及び洗浄に２時間であ
る。このアッセイは感度が高く、非常に少量の細胞抽出
物でも、その（２′−５′）オリゴＡシンテターゼレベ
ルを測るのに十分である。それは特異性があり、インタ
ーフェロン処理をしていない細胞においては、全くシグ
ナルが表れない。 【０１２１】例２１ 細胞中の（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの免疫蛍
光顕微鏡法 酵素的アッセイによって、ウイルスに感染した患者の末
梢血単核細胞において、（２′−５′）オリゴＡシンテ
ターゼが上昇することが確立された（前の研究をみ
よ）。抗−（２′−５′）オリゴＡシンテターゼペプチ
ド抗体は、細胞一般、特に白血球中の（２′−５′）オ
リゴＡシンテターゼの上昇を探知するために、抗−
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼを免疫蛍光顕微鏡
法の形で用いることができる。 【０１２２】健康な供血者及び急性ウイルス疾患をもっ
た患者から血液（２ｍｌ）を採血した。単核血液細胞を
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（ファルマシア）遠心に
よって分離し、カバーグラスの上に、直接かまたはサイ
トスピンミクロフュージ（ミクロヘマトクリット）を用
いてひろげた。細胞をＰＢＳで洗い、３％フォルムアル
デヒト常温で３０分間固定し、ＰＢＳですすぎ、Ｈａｎ
ｋの塩中で０．５％Ｔｒｉｒｏｎ−Ｘ１００で５分間処
理し、再びＰＢＳとＰＢＳ−２％ゼラチンですすいだ。
次に、ＰＢＳゼラチンで１：５に稀釈した抗Ｂ血清４０
μｌの小滴をパラフィルム上に加え、カバーグラスを重
ね、インキュベートした。室温で６０分後、カバーグラ
スＰＢＳ−ゼラチン及び１：２０に稀釈したＦＩＩＣ共
軛抗−ラビットＩｇＧ（Ｂｉｏｙｅｄａ）中ですすぎ、
パラフィルム操作にかけた。室温で２０分たってから、
カバーグラスをＰＢＳ−ゼラチンで２回洗い、次に水で
洗い、Ｍｉｖｉｏｌ ４−８８（ヘキスト）−グリセロ
ール（２．５ｇＭｏｖｉｏｌ，６ｇグリセロール及び１
２ｍｌの０．２Ｍトリス塩酸ｐＨ８．５を加えた水６ｍ
ｌ、５０℃でインキュベートし、５，０００ｇで１５分
沈澱物をのぞいたもの）とともに、顕微鏡スライド状に
マウントする。同時に、抗−Ｂの代りに、正常のラビッ
トの血清を用いてカバーグラスを処理した。スライドを
ツアイス蛍光顕微鏡で観察し、３０秒の露出で、ポロラ
イドフィルムに写した。 【０１２３】Ｆｉｇ．２２は、リンパ球が、ウイルスの
感染患者からの血液サンプル中においては、抗−（２′
−５′）オリゴ−シンテターゼで染まり、健康な供血サ
ンプルでは染まらず、マクロファージと顆粒球だけに弱
い蛍光がみられるにすぎないことを示している。正常の
血清は、リンパ球を染めないが、マクロファージまたは
顆粒球においても、低いバックグラウンドを与える。従
って、本抗−（２′−５′）オリゴＡシンテターゼペプ
チド抗体は、細胞が、インターフェロンと反応して、
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼを蓄積したかどう
かを評価するために、培養、血液組織片中の細胞の顕微
鏡的観察に用いることができる。 【０１２４】【０１２５】【０１２６】【０１２７】【０１２８】【０１２９】【０１３０】【０１３１】【０１３２】【０１３３】【０１３４】【０１３５】【０１３６】
（２′−５′）オリゴＡ合成酵素遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃ
ＤＮＡ、および（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ活
性を保有する諸酵素に関する。 【０００２】 【従来の技術】インターフェロンの生物学的影響の多く
は、ＩＦＮにさらされた細胞で新しく誘起されるｍＲＮ
Ａと蛋白とに仲介されるように見える（抄録：Ｒｅｖｅ
ｌ，１９８４；Ｌｅｂｌｅｕ ａｎｄ Ｃｏｎｔｅｎ
ｔ，１９８２；Ｂａｇｌｉｏｎｉａｎｄ Ｎｉｌｓｏ
ｎ，１９８３）。これらＩＦＮ−誘起蛋白質のうち二群
が特に重要である：１）翻訳調整諸酵素（ｄｓＲＮＡ依
存蛋白キナーゼおよび（２′−５′）オリゴＡシンセタ
ーゼ，（２′−５′）オリゴＡで活性化されたヌクレア
ーゼの２′−フォスフォ ディ エステラーゼ）及び
２）細胞表面諸抗原（ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｂ２−ミク
ログロブリン，ＨＬＡ−ＤＲ）。他の細胞内蛋白質や放
出蛋白質も又重要な役目を演ずるであろう（Ｗｅｉｌ
ｅｔ ａｌ，１９８３；Ｃｈｅｂａｔｈ ｅｔ ａｌ，
１９８３；Ｗａｌｌａｃｈ ｅｔ ａｌ，１９８３）。
ＨＬＡ諸遺伝子を例外として（Ｍａｌｉｓｓｅｎ ｅｔ
ａｌ，１９８２；Ｓｃｈａｍｂｏｅｃｋ ｅｔ ａ
ｌ，１９８３），ＩＦＮ−誘起の諸蛋白質の構造と場合
によっては機能は不明であり、従ってそれに依って諸Ｉ
ＦＮが特定的にこれら諸遺伝子を活性化する機構も不明
である。これらの疑問に答えて、幾つかのＩＦＮ−誘起
遺伝子のｃＤＮＡが最近クローン化された（Ｃｈｅｂａ
ｔｈ ｅｔ ａｌ，１９８３；Ｍｅｒｌｉｎ ｅｔ ａ
ｌ，１９８３；Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ，１９８
４；Ｓａｍａｎｔａ ｅｔ ａｌ，１９８４）。 【０００３】特に、人間の（２′−５′）オリゴＡシン
セターゼをコードしたｃＤＮＡと遺伝子が研究されて，
その酵素はｄｓＲＮＡ−誘起のものでＡＴＰをｐｐｐ
（Ａ２′ｐＡ）ｎオリゴマーに転換し（Ｋｅｒｒ ａｎ
ｄ Ｂｒｏｗｎ，１９７８），その代わりに潜在のＲＮ
ａｓｅ Ｆに結合して活性化する（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅ
ｔ ａｌ，１９７８）。この（２′−５′）オリゴＡシ
ンセターゼは、これら三型のヒトＩＦＮ総てで細胞内で
強く誘起され、そしてその増加は、ＩＦＮ活性の優れた
指標である（Ｗａｌｌａｃｈ ｅｔ ａｌ，１９８
２）。この酵素は造血細胞の分化中に誘起され、ＩＦＮ
−βのオートクリン分泌を指示する（Ｙａｒｄｅｎ ｅ
ｔ ａｌ，１９８４）。この酵素は後に胚の同調繊維芽
細胞のＳ期にも同様に誘起される（Ｗｅｌｌｓ ａｎｄ
Ｍａｌｌｕｃｃｉ，１９８５）。この酵素活性は細胞
生長が始まると低下し（Ｅｔｉｅｎｎｅ−Ｓｍｅｋｅｎ
ｓ ｅｔａｌ，１９８３；Ｃｒｅａｓｅｙ ｅｔ ａ
ｌ，１９８３）そして、ＩＦＮの反生長作用に関連して
いるように見える（Ｋｉｍｃｈｉ ｅｔ ａｌ，１９８
１）。（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ又は（２′
−５′）オリゴＡ−誘起のＲＮａｓｅ Ｆ欠乏は、これ
がＩＦＮのウイルス生長抑制の唯一の機構では多分無い
が（Ｌｅｂｌｅｕ ａｎｄ Ｃｏｎｔｅｎｔ，１９８
２），諸ＩＦＮの抗ウイルス効果の部分消滅と関連づけ
られて来た（Ｓａｌｚｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，１９８
３；Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ，１９８１）。 【０００４】この（２′−５′）オリゴＡヌクレオチド
は、多くの真核生物細胞で検出され、バクテリアでさえ
見出された（Ｌａｕｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ，１９８
４）。そして、この合成酵素は多分広範囲に分布したも
のであろう。この酵素はマウスから（Ｄｏｕｇｈｅｒｔ
ｙ ｅｔ ａｌ，１９８０）及びヒト細胞から（Ｙａｎ
ｄ ｅｔ ａｌ，１９８１；Ｒｅｖｅｌ ｅｔ ａｌ，
１９８１）純化され、大小二型の酵素が観察されている
が（Ｒｅｖｅｌ ｅｔ ａｌ，１９８２；ｓｔ，Ｌａｕ
ｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ，１９８３）、構造は未解明であ
る。 【０００５】ＩＦＮにさらされた細胞内に誘起された
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ（Ｈｏｂａｎｅｓ
ｓｉａｎ ｅｔ ａｌ，１９７７；Ｚｉｌｂｅｒｓｔｅ
ｉｎｅｔ ａｌ，１９７８）は種々の異常な特性を持
つ。それの主な活性は、ＡＴＰから５′三燐酸化短オリ
ゴＡ鎖を合成する事である（主として２連体から５連
体、最長１５連Ａの）が、他のＲＮＡ重合酵素と違っ
て、オリゴＡのアデニン化物の２′ＯＨに特定的にアデ
ニン化物又はもう１つのヌクレオチドを添加（Ｋｅｒｒ
ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，１９７８；Ｓａｍａｎｔａ ｅ
ｔ ａｌ，１９８０）するか、ＮＡＤのようなフリー
２′ＯＨのアデニン化物を持った他の（オリゴ）又はヌ
クレオチド（Ｂａｌｌ，１９８０）又は、ｔＲＮＡにさ
え（Ｆｅｒｂａｓｅｔ ａｌ，１９８１）添加する。活
性を保つためには、この酵素は、最短５０ｂｐ以上のＲ
ＮＡ複鎖部分と結合しなければならない（Ｍｉｎｋｓ
ｅｔ ａｌ，１９７９）、従って、幾つかの結合部分を
所有しなければならない：ヌクレオチド三燐酸用、２′
ＯＨアデノシン ポリヌクレオチド用および複鎖ＲＮＡ
用。この酵素は、２′，５′ＡＤＦ−セファロース（Ｊ
ｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ，１９８０）、ポリ（ｒ
Ｉ）（ｒＣ）−アガロース（Ｈｏｒａｎｅｓｓｉａｎｅ
ｔ ａｌ，１９７７）及びＣｉｂａｃｒｏｎブルーセフ
ァロース（Ｒｅｖｅｌ ｅｔ ａｌ，１９８１）に吸着
する。 【０００６】細胞の違いによって、この（２′−５′）
オリゴシンセターゼ活性はサイトゾル（Ｒｅｖｅｌ ｅ
ｔ ａｌ，１９８１）中で見られたり、リボソーム塩洗
出物（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ，１９８０）で
見られたり、核液中にあったり（Ｎｉｌｓｅｎ ｅｔ
ａｌ，１９８２ｂ）、核膜にさえ多量に見出されてい
る。細胞ＲＮＡはこの酵素の活性化に際し、ポリ（ｒ
Ｉ）（ｒＣ）に代行し得る事は注意すべきであり（Ｒｅ
ｖｅｌ ｅｔ ａｌ，１９８０）、このシンセターゼ
は、ＨｎＲＮＡの加工にさえ役割を持つかも知れない
（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔａｌ，１９８２ａ）。（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼの幾らかは細胞質膜に結合
し、出芽ウイルス粒に包含される（Ｗａｌｌａｃｈ ａ
ｎｄ Ｒｅｖｅｌ，１９８０）。このような複雑な相互
作用は、（２′−５′）オリゴＡシステムの局所的作用
を確保して（Ｎｉｌｓｅｎ ａｎｄ Ｂｅｇｌｉｏｎ
ｉ，１９８３）正常細胞、ウイルス感染細胞で指摘され
る複数の役割を説明可能にする。この合成酵素の含量
は、ＩＦＮ−処理細胞の全蛋白質の０．１％以下であ
り、その分子構造は直接に決定できなかった。 【０００７】（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ含量
測定値をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎｖｉｖｏで、細胞が
ＩＦＮにさらされ、それに反応しているか否かの決定に
使用できる。この測定は、未知の溶液におけるＩＦＮの
検定に、細胞を刻溶液にさらし、（２′−５′）オリゴ
Ａシンセターゼ含量を決定する事で使用することができ
る（Ｒｅｖｅｌ ｅｔ ａｌ．，米国特許４，３０２，
５３３）。この測定は人間を含む総ての生物でＩＦＮ生
産量が増したか否かを決めるのにも又使用できる。 【０００８】 【発明が解決しようとする課題】（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ測定の臨床的反応 健康個体の末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）では（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼ含量が比較的に恒常である
ことがわかっている（Ｓｃｈａｔｔｎｅｒ ｅｔ ａ
ｌ，１９８１ｂ）。（２′−５′）オリゴＡシンセター
ゼの増加は、急性ウイルス感染患者（Ｓｃｈａｔｔｎｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１ｂ；Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄ
ｅｔ ａｌ．，１９８５）、持続性ウイルス感染（Ｗ
ａｌｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８２）、自己免疫病
及びヤコブ−クロイツフェルト病のような感染病と見ら
れる幾つかの他の症候群（Ｒｅｖｅｌ ｅｔ ａｌ．，
１９８２）などに見られる、。（２′−５′）オリゴＡ
シンセターゼの基本含量は顆粒球では低いが、ウイルス
感染により大きく増量することがみられた（Ｓｃｈａｔ
ｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。ＡＩＤＳ患者の
ＰＢＭＣにおける（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ
酵素増加が最近報告された（Ｒｅａｄ ｅｔａｌ．，１
９８５）。動物の場合、（２′−５′）オリゴＡシンセ
ターゼ量の増加は速く、ＩＦＮの血中出現より恒常的で
ある（Ｓｃｈａｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ，１９８２
ａ）。（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ量は数週間
高水準を保つのに対してＩＦＮの最高値は短期的であ
る。 【０００９】（２′−５′）オリゴＡシンセターゼの造
血細胞分化中の増加は、ＩＦＮ−βのオートクリン分泌
の結果である（Ｙａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ，１９８
４）。急性白血病で多数の芽細胞と共に（２′−５′）
オリゴＡシンセターゼ水準の低下が見られる（Ｗａｌｌ
ａｃｈ ｅｔ ａｌ，１９８２；Ｓｃｈａｔｔｎｅｒ
ｅｔ ａｌ，１９８２ｂ）。（２′−５′）オリゴＡシ
ンセターゼ測定の重要な応用分野の他の１つは、ＩＦＮ
治療患者の監視である。臨床変化の他に、ＰＢＭＣの
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ水準を測定し、患
者のＩＦＮ投与への反応を決定することができ、この全
身投与の場合、ＩＦＮ−αの投与でもＩＦＮ−βの投与
でも酵素水準は５−１０倍の増大となる（Ｓｃｈａｔｔ
ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１ａ，Ｓｃｈｏｅｎｆｅ
ｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。他の、ＩＦＮ誘起の
諸活性又は諸分子の検定は、（２′−５′）オリゴＡシ
ンセターゼ酵素の検定と同様に使用可能であることは明
らかであるが、この方法が最も広く用いられている（Ｒ
ｅａｄ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｍｅｒｒｉｔｔ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８５）。これらの研究ではすべて、Ａ
ＴＰの（２′−５′）（Ａ）ｎオリゴマーへの転換を測
定する酵素的検定を用いている（Ｒｅｖｅｌ ｅｔ ａ
ｌ．，米国特許４，３０２，５３３）。 【００１０】（２′−５′）オリゴＡシンセターゼの検
定には、抗（２′−５′）オリゴＡシンセターゼペプチ
ド抗体を用いることができる。（２′−５′）オリゴＡ
シンセターゼのための抗体入手には、種々の（２′−
５′）オリゴＡ諸シンセターゼの全アミノ酸配列からペ
プチド配列を選び、内在（２′−５′）オリゴＡシンセ
ターゼ分子への抗体誘起のための抗原に用いることがで
きる。兎に抗体を作らせる為に抗原ペプチドを皮下注射
した。抗体反応が最大となる迄促進注射を繰返した。 【００１１】 【課題を解決するための手段】今回の発明は、（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼ活性のある１つの酵素をコ
ードするヒトＤＮＡに関するものである。ＤＮＡの型の
１つは図７Ａに示したヌクレオチド配列を持つ。他の型
のＤＮＡはＦｉｇｕｒｅ７Ａに示し、図７Ｂに示す９０
１−１５９０のヌクレオチド配列と重複する１−１３２
２のヌクレオチド配列を持つ。（２′−５′）オリゴＡ
シンセターゼ活性を持つ１つの酵素は、図７Ａに示すア
ミノ酸配列を持つ。（２′−５′）オリゴＡシンセター
ゼ活性をもつもう１つの酵素は、図７Ａに示す１−３６
４のアミノ酸配列を持ち、図７Ｂに示す２９０−４００
のアミノ酸配列と重複する。図７Ａと図７Ｂのヌクレオ
チド配列と相補的なヌクレオチド配列を持つ１．６ｋｂ
と１．８ｋｂのＲＮＡが単離されている。 【００１２】患者のインターフェロン投与に対する反応
を監視する方法は、（２′−５′）オリゴＡシンセター
ゼｍＲＮＡの細胞内又は体内濃度をそれに相補的なＤＮ
ＡとそのｍＲＮＡとをハイブリッド形成を行うことによ
って測定することから成っている。現発明の抗原性蛋白
質は図７Ａと図７Ｂに示したアミノ酸配列の中に含まれ
るアミノ酸配列を持つ。この抗原諸ペプチドに対して生
じた諸抗体は（２′−５′）オリゴＡシンセターゼを認
識し、免疫沈澱を行う。 【００１３】被検体でのインターフェロン活性を監視す
る方法は、被検体の細胞内又は体液の（２′−５′）オ
リゴＡシンセターゼ含量を、既定の時間隔で測定する
事、被検体の細胞内又は体液内でのシンセターゼ含有量
の相異を種々の時間隔で決定し、そこから被検体の細胞
内や体液内でのシンセターゼの量を決定し、それによっ
て被検体のインターフェロン活性をはかるものである。
このシンセターゼは、シンセターゼを今回の発明による
抗体と接触させて複合体を作り、作られた複合体の量を
決定することによって測定される。 【００１４】更に、今回の発明は（２′−５′）オリゴ
Ａシンセターゼの２つの抗体に関するもので、その抗体
は、（２′−５′）オリゴＡシンセターゼのアミノ酸配
列の一部を持つ抗原を調整することにより得られるもの
である。その抗−（２′−５′）オリゴシンセターゼペ
プチド抗体は、その酵素を検出する為に使用できるもの
である。 【００１５】図面の概説 図１は（２′−５′）オリゴＡシンセターゼＥ1 ｃＤＮ
Ａクローン１７４−３の構造と配列とを示す：図１Ａは
Ｅ1 ｃＤＮＡクローン１７４−３の制限酵素切断位置地
図を示す。挿入の諸塩基対は、ｐＢＲ３２２ＤＮＡと同
じ順序で番号付けしてある。ｐＢＲＥｃｏＲＩ位置は右
にある。挿入のどちらの鎖も（点線）、縦線で示した制
限切断位置から配列決定をした（Ｍａｘａｍ ＆ Ｇｉ
ｌｂｅｒｔ，１９８０）。コード鎖は、右から左に向っ
て５′から３′のものである。右Ｐｓｔ１位置につづい
て１７Ｇと７２Ｔがあり、２ヌクレオチドのＧＡが続
き、（Ｂ）に示した配列であり従って尾の一部でない３
Ｔと続く。３′の末端には４５Ａと１０Ｃの尾があり左
Ｐｃｔ１位置で終結する。 【００１６】図１Ｂは細長のコード枠を持ったヌクレオ
チド配列を示す。最初のＴはヌクレオチド９２であり、
挿入の尾（Ａの右端）の後に位置する。挿入部のＳａｕ
３Ａ 1 位置とＥｃｏＲ１位置は示した配列の夫々１２９
と４８０に当る。Ｆｉｇｕｒｅ２はＳＶ８０とＮａｍａ
ｌｖａ細胞内のＥ1 特定の諸ｍＲＮＡの大きさとその誘
導を示す。 【００１７】図２ＡはクローンＥ1 のニックトランスレ
ーションを行った〔32Ｐ〕−ｃＤＮＡのＳＶ８０細胞か
らの変成ポリＡ+ −ＲＮＡ電気泳動諸ブロットへの交配
を示す。その諸ＲＮＡはＩＦＮ−ベーター１の添加か
ら、示してある時間数の後に調整された。ＲＮＡの見か
けの大きさはオートラジオグラフィに示される。左レー
ン：ｒＲＮＡ諸マーカー。図２Ｂは図２Ａと同じくＩＦ
Ｎ−アルファで示したある時間数の処理をしたＮａｍａ
ｌｖａ細胞よりのＲＮＡである。左レーン：ｒＲＮＡ諸
マーカー。 【００１８】図３はＩＦＮ−処理したＳＶ８０細胞
（Ｉ）又は非処理細胞（Ｃ）からのＩＦＮ−誘起のｍＲ
ＮＡポリ（Ａ）+ ＲＮＡの為のｃＤＮＡを含んだ組換プ
ラズミドクローンＣ５６のＲＮＡ諸ブロットへの交配に
よる特性決定を示し、７ミクログラムがアガロースゲル
で電気泳動され、ニトロセルローズにブロットの後に、
Ｃ５６クローン、ヒトＨＬＡ ｃＤＮＡクローン又はラ
ットのチュブリンｃＤＮＡクローンのいずれかの、ニッ
クトランスレーションを行った〔32Ｐ〕−プラズミドＤ
ＮＡと交配した。接触時間は４８時間である。リボソー
ムＲＮＡマーカーの放射性１８s の位置が示してある。 【００１９】図４はＣ５６ ４５０ｂｐ挿入部の制限酵
素切断位置地図の一部とヌクレオチド配列を示す。Ｃ５
６プラズミドはＨｉｎｄ３で消化し、アルファー
〔32Ｐ〕−ｄＣＴＰを用いてＤＮＡポリメラーゼＩ−大
断片（クレノウ酵素、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で標識さ
れ、そのＨｉｎｄ３−Ｐｓｔ１断片が１％アガロースゲ
ル上で分離された。相補鎖の配列を決めるため、そのプ
ラズミドのＢｇ１２位置をガンマ〔32Ｐ〕−ＡＴＰを用
いてＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）で５′−標識をした後にそのＢｇｌ２−Ｐｓｔ１断
片を分離した。配列決定はＭａｘａｍ ａｎｄ Ｇｉｌ
ｂｅｒｔ法で行った。コード鎖Ａの配列（右から左へ）
は下のパネルに示してある。Ａ鎖配列の最初の２個のチ
ミヂン残基は多分上部の図にあるＡＴ尾に対応するので
あろう。 【００２０】図５はＩＦＮによるＣ５６ ｍＲＮＡ誘起
の時間経過を示す：図５Ａはポリ（Ａ）+ ＲＮＡでＩＦ
Ｎ−アルファ１０００Ｕ／ｍｌで示された時間数の処理
を受けたＮａｍａｌｖａ細胞からの７ミクログラムをア
ガロースゲルで電気泳動し、ブロットした後にニックト
ランスレーションを行った〔32Ｐ〕−Ｃ５６プラスミド
ＤＮＡと交配したものを示す。図５Ｂはポリ（Ａ）+ Ｒ
ＮＡで、２００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−ベータで示された時
間数処理したＳＶ８０細胞からの７ミクログラムのもの
を示す。星マークは単クローン抗体のカラム（２×１０
8 Ｕ／ｍｇ）で純化したＩＦＮ−ベーター１で処理した
細胞から得たＲＮＡを示す。 【００２１】図５Ｃはポリ（Ａ）+ ＲＮＡで、（５Ｂ）
と同様に処理したＳＶ８０からの１マイクログラムがＣ
５６ ＤＮＡの断片１（Ｆｉｇ．４を見よ）の３′末端
に標識したものと液中交配したものを示す。交配体はＳ
1 −ヌクレアーゼで処理し、変性ゲルで分析した。ｍＲ
ＮＡ−交雑検針（→）は自己再結合のもの（−−→）よ
り短かい。図６は（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ
の１．６及び１．８ｋｂ ｍＲＮＡのための諸ｃＤＮＡ
の制限酵素切断地図を示す。図６Ａは１．６ｋｂのｃＤ
ＮＡの地図である。Ｅ1 ｃＤＮＡ（Ｍｅｒｌｉｎｅｔ
ａｌ．，１９８３）の位置とラムダｇｔ１０ｃＤＮＡの
ものが示してある。ｐＡはポリアデニレーションの起る
位置である。エクソンの端は縦点線で示してある。各エ
クソンを持つゲノムＤＮＡ諸断片の大きさは括弧内に示
す。縦矢は１．８ｋｂ ＲＮＡに更に存在するスプライ
ス位置を示す。９−２１及び５−２１両ＣＤＮＡの配列
決定法を示した。３′ＥｃｏＲ１位置（Ｅ）からＰｓｔ
１位置（Ｐ）の配列はＥ１ ｃＤＮＡの中で決定した
（Ｍｅｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３）。 【００２２】図６Ｂは１．８ｋｂ ｃＤＮＡの地図であ
る。ラムダｇｔ１０クローン４８−１は１．８ｋｂ Ｒ
ＮＡのエクソン８を含むゲノム断片Ｐｓｔ１−Ｐｓｔ−
１を用いて分離した。（図９）諸エクソンは１．６ｋｂ
のＥ1 ｃＤＮＡの場合と同じく番付けした。切詰めたエ
クソン７は７ａとした。図７Ａと図７Ｂは２個の（２′
−５′）オリゴＡシンセターゼｃＤＮＡのヌクレオチド
配列を示す。１．８ｋｂ ｃＤＮＡクローン４８−１の
諸ヌクレオチドは１．６ｋｂ ｃＤＮＡクローン９−２
１に準じて番付けした。アミノ酸の番付けは括弧内に示
す。翻訳はＡＴＧＡＴＧ配列の第１又は第２のコドンか
ら始まる。諸エクソンの端は縦棒で示してある。（Ｇｌ
ｙｃｏｓ．）はＥ１８の中にあるグリコキシレーション
の可能性位置を示す。多分対立形質の相異による単塩基
変異はクローンとゲノムＤＮＡの相異として１．６ｋｂ
配列の３７６番（ＴとＣ）、５２５番（ＧとＡ）、８０
７（ＧとＣ）、８１１（ＡとＧ）；１．８ｋｂ配列の１
０８７（ＧとＡ）、１１１５（ＧとＣ）として発見され
た。 【００２３】図８はＥ１６とＥ１８の（２′−５′）オ
リゴＡシンセターゼのＣ−末端のハイドロパシープロッ
トを示す。ＫｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）
のコンピュータープログラムを用いた。疎水的部分は中
央の線の上にある。Ｅ１８の酸性部位はＦｉｇｕｒｅ７
のアミノ酸の３５３から３５８に相当する。図９はヒト
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ遺伝子の制限酵素
切断位置地図を示す。三つの重複するゲノムクローンか
ら作成した地図は１．６ｋｂ ＲＮＡの７つのエクソン
と１．８ｋｂ ＲＮＡ（黒棒）に更に１つある８番目の
エクソンを示す。挿入は、ゲノムＤＮＡのサザンブロッ
トとプローブ用の４８−１ｃＤＮＡのものを示す。Ｓｌ
ｏｔ １はＤａｕｄｉ ＤＮＡ；Ｓｌｏｔ ２は２倍体
繊維芽細胞ＦＳ１１のＤＮＡ。 【００２４】図１０はヒト（２′−５′）オリゴＡシン
セターゼ遺伝子のプロモーター部分を示す。Ｓｐｈ１−
Ｓｐｈ１間の０．８５ｋｂ断片で、Ｆｉｇｕｒｅ９の
４．２ｋｂ ＥｃｏＲ１ゲノムＤＮＡ断片に由来するも
のの制限酵素切断位置地図を示す。諸ｍＲＮＡの５′末
端はｃａｐとマークしてある。図１１はヒト（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼプロモーター部位を示す。
Ｆｉｇｕｒｅ１０で示したＳａｕ３ａ−Ｈｐａ１断片の
配列は、ヒトＩＦＮ−ベーター１遺伝子のプロモーター
部分との対比のためにならべた（Ｄｅｇｒａｖｅｅｔ
ａｌ．，１９８１）。番付けはｃａｐ位置と予想される
部分から始まる。ＩＦＮ−ベーター１プロモーター内で
約−７５に位置するプリンに富んだ転写制御配列（Ｚｉ
ｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３）で、−１０附近で繰返
されるものは、アンダーラインで示した。ＴＡＴＡボッ
クスは二重アンダーラインとした。図１２は合成ペプチ
ドに抗血清で免疫沈澱させたＩＦＮ処理のＷＩＳＨ細胞
からの35Ｓ−メチオニンで標識した蛋白質のＳＤＳ−ア
クリルアミドゲル電気泳動を示す。 【００２５】図１３はＥ１６ｃＤＮＡの大腸菌内発現を
示す。大腸菌の溶原菌Ａｇｔ１１−Ｅ１６で４２℃でＩ
ＰＴＧによって誘起されたものの抽出物はポリ（ｒＩ）
（ｒＣ）アガロース粒上で（２′−５′）オリゴＡシン
セターゼについて検定した。Ｃｏｎｔ＝ｌａｃＺ遺伝子
の配向と逆配向のＥ１６ｃＤＮＡを用いた大腸菌の挿出
物。Ｎａｍ＝ＩＦＮ−処理Ｎａｍａｌｖａ細胞の挿出
物。アルカリフォスターゼで作用させ、32Ｐ−ａ−ＡＴ
Ｐで標識した産物のｐＨ３．５による電気泳動が示して
ある。図１４はヒト末梢白血球中の（２′−５′）オリ
ゴＡシンセターゼＲＮＡの迅速なアッセイ法を図示して
いる。 【００２６】図１５は、Ｆｉｇｕｒｅ１４の方法に従っ
ての、ヒトＰＢＭＣの（２′−５′）オリゴＡシンテタ
ーゼ、ＥＲＮＡに対するクイックセルブロットを図示し
ている。示されている番号の細胞とインターフェロン
（１６Ｈ処理）を用いた。32Ｐ−ｃＤＮＡに関してオー
トラジオグラフィーを行った。図１６は、抗−Ｂ及び抗
−Ｃ ＩｇＧ−タンパク−Ａ−セファロースに吸着され
ている（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ活性が例に
示されているように測定されたことを図示している。下
のスキームは、Ｂｅｎｅｃｈら（１９８５ｂ）によって
配列が決定された２つの（２′−５′）オリゴＡシンテ
ターゼの型、Ｅ１６とＥ１８におけるペプチドＢとペプ
チドＣの位置を示している。黒く塗った領域は、Ｅ１６
がＥ１８分子と異なっている部分を示している。 【００２７】図１７は例２に記載のヒト細胞由来の抽出
物の電気泳動およびイムノブロッティングを示す。
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼの４型の位置は各
ブロットＭ＝14Ｃ−タン白分子量マーカーの右側の数に
より示す。ＩＦＮ処理は＋により示す。図１８はアンチ
−（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ ペプチドＢを
もつヒトＳＶ８０細胞由来の抽出物の電気泳動イムノブ
ロットを示す。左：粗細胞質抽出物（Ｓ１．５）、細胞
液（Ｓ１００）およびミクロソーム（Ｐ１００）。右：
ミクロソーム（ＤＯＣ−可溶性）のナトリウムデオキシ
コレート１０％抽出物、ミクロソームの高塩洗浄（ＲＷ
Ｆ）および塩抽出後のミクロソームペレット（ミクロソ
ーム−ＫＣｌ）。 【００２８】図１９はＳ１００の分画化およびＤＮＡＥ
−セルロースとカルボキシメチルセルロースによるミク
ロソームの高塩洗浄（ＲＷＦ）続くグリセロール勾配を
示す。アンチ−Ｂにより示した（２′−５′）オリゴＡ
シンセターゼプロフィルとタン白は勾配の下に示す。電
気泳動イムノブロットは左のブロットに対するフラクシ
ョンＣＭ（ＤＥＡＥ−セルロースに吸着されないＳ１０
０タン白由来のＣＭ−セルロース溶離液）を示す。左側
のブロットフラクションに、ＤＥ（ＲＷＦのＤＥＡＥ−
セルロース溶離液）とフラクションＧＧ（フラクション
ＤＥのグリセロール勾配からの８０−１００ｋｄのヘビ
イーピーク）。図２０はＳＶ８０細胞からの（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼの種々の型にＲＮＡ複鎖の
要求されるものを示す。諸断片はＦｉｇｕｒｅ１９に準
じて標識した。酵素活性はポリ（ｒＩ）（ｒｃ）の示さ
れた濃度について測定した。 【００２９】図２１は例３に述べられたように抗−Ｂ
ＩｇＧと125 Ｉ−蛋白質Ａを用いて行った（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼの放射線−免疫検定を示
す。オートラジオグラフィーが示してある。細胞は５０
０Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−β１で６時間処理か又は無処理で
あった。図２２はウイルス病患者の血液から得たリンパ
球（中段）の（２′−５′）オリゴＡシンセターゼレベ
ルの上昇を免疫蛍光顕微鏡で検知するに抗−Ｂを用いる
事を示す。右：正常血清によるコントロール：左：抗−
Ｂ色素入りの健康献血者の血液。（リンパ球は染色しな
い、マクロファージ又は顆粒白血球が不特定のバックグ
ラウンドを為す。） 【００３０】発明の詳説 現発明は、（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ活性を
持つ酵素のコードを持ったヒトＤＮＡで、図７Ａに示す
ヌクレオチド配列を持つものに関している。このＤＮＡ
は図７Ａに示した１−１３２２のヌクレオチド配列で
も、又図７Ｂに示したそれと重複する９０１−１５９０
のヌクレオチド配列であっても良い。現発明のＤＮＡ
は、図９に示した制限酵素切断位置を持つ。（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼ活性を持つ酵素は、図７Ａ
に示すアミノ酸配列を持つ。この酵素は約３６４のアミ
ノ酸より成り、約４１，５００ダルトンの分子量を示
す。他の酵素で（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ活
性を持つものは、図７Ａに示す１−３６４のアミノ酸配
列に加えて図７Ｂに示す２９０−４００のアミノ酸配列
を持つ。この酵素は約４００のアミノ酸より成り、その
分子量は約４６，０００ダルトンである。 【００３１】現発明は図７Ａに示したヌクレオチド配列
と相補のヌクレオチド配列を持った１．６ｋｂのＲＮＡ
を提供する。図７Ａに示す１−１３２２のヌクレオチド
配列に相補的であると同時にＦｉｇｕｒｅ７Ｂに示す９
０１−１５９０にも相補的であるヌクレオチド配列より
成る１．８ｋｂ ＲＮＡも提供する。現発明の転移ベク
ターは現発明のｌａｍｂｄａ−ｇｔ １１−Ｅ１６ Ｄ
ＮＡとｌａｃＺ遺伝子とより成り、そのＤＮＡはｌａｃ
Ｚ遺伝子と相的に接着していて、適当な寄主細胞中でＤ
ＮＡ発現を可能にする。微生物はこの転移ベクターで形
質転換を受ける。大腸菌はこの形質転換に適した微生物
である。 【００３２】患者のインターフェロンに対する反応を監
視する方法は、患者の細胞又は体液の（２′−５′）オ
リゴＡシンセターゼｍＲＮＡの濃度をこれと相補のＤＮ
Ａで交配させて測定する事より成る。そのｍＲＮＡは現
発明の１．６ｋｂ又は１．８ｋｂのＲＮＡであろう。イ
ンターフェロンに対する細胞や組織の反応の評価の方法
はインターフェロンで処理した細胞又は組織より得たＲ
ＮＡをそのＲＮＡと相補のｃＤＮＡと交配し、その交雑
量を決定することより成る。そのＲＮＡはインターフェ
ロンにさらした細胞又は組織から抽出し、膜フィルター
上で固定し、インターフェロン−誘起したｍＲＮＡに特
定の、標識付ＣＤＮで交配する。この方法は組織切片を
標識付ＣＤＮＡで原位置交雑し、顕微鏡観察オートグラ
フィ又は蛍光で標価する事より成る。分析する細胞又は
組織はヒト又は他の動物起原であろう。 【００３３】細胞又は組織のインターフェロンに対する
反応を評価する方法を実施する為のキットには、図７Ａ
又は図７Ｂに示した配列に相補のｃＤＮＡ、デオキシリ
ボヌクレアーゼＩと〔32Ｐ〕−ガンマーｄＣＴＰで割れ
目移動をする際の交雑テストを実施するに必要な試薬
類、ニトロセルローズ膜上で交雑する為の試薬類および
細胞からＲＮＡを抽出するための試薬類を含んでいる。
図７Ａと図７Ｂに示したアミノ酸配列に含まれるアミノ
酸配列を持った抗原性諸ペプチドも又提供されている。 【００３４】現発明による抗原性ペプチドの１つはＣ−
末端アミノ酸の１７個を図７Ａに示した配列で所持し、
そのアミノ酸配列がＡＲＧ−ＰＲＯ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−
ＳＥＲ−ＳＥＲ−ＬＥＵ−ＰＲＯ−ＰＨＥ−ＩＬＥ−Ｐ
ＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＬＥＵ−ＨＩＳ−ＧＬＵ−ＡＬ
Ａである。もう一つの抗原性ペプチドのアミノ酸配列
は、ＧＬＵ−ＬＹＳ−ＴＹＲ−ＬＥＵ−ＡＲＧ−ＡＲＧ
−ＧＬＮ−ＬＥＵ−ＴＨＲ−ＬＹＳ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−
ＰＲＯ−ＶＡＬ−ＩＬＥ−ＬＥＵ−ＡＳＰ−ＰＲＯ−Ａ
ＬＡ−ＡＳＰである。現発明の抗原性両ペプチドに対し
て生ずる諸抗体は（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ
を識別し、免疫沈澱する。 【００３５】被験体でのインターフェロン活性を監視す
る方法は、（２′−５′）オリゴＡシンセターゼの細胞
又は体液中での濃度を既定の時間間隔で測定し、被験体
の細胞又は体液中の該シンセターゼ量の相異を、異なる
時間間隔の間で決定し、それから被験体でのシンセター
ゼの量を決定し、それにより被験体でのインターフェロ
ン活性を決める事より成る。シンセターゼの量はそのシ
ンセターゼを現発明の抗体と接触させ、そこで複合体を
形成し、この形成された複合体量決定する事から測定さ
れる。 【００３６】インターフェロン活性を監視する方法は、
更に（２′−５′）オリゴＡシンセターゼをインターフ
ェロンにさらした細胞又は体液から抽出し、この抽出シ
ンセターゼを識別し得るマーカーで標識付をしてラベル
付シンセターゼを作り、このラベル付シンセターゼを現
発明の抗体と適当な条件下で接触させて、標識付のシン
セターゼ−抗体複合体を作らせ、複合体中の標識を検出
し、それによってシンセターゼを検出する。その標識は
３５s −メチンニンであるだろう。インターフェロン活
性を監視する方法を実施する為のキットは、現発明の抗
体を１つ、シンセターゼ抽出用諸材料、シンセターゼ標
識付けの諸材料及び標識を検出し、シンセターゼ量を決
定する為の諸材料より成る。 【００３７】現発明は又、インターフェロンにさらした
後ヒト細胞に現れる諸メッセンジャーＲＮＡと特定的に
交雑するクローン化したＤＮＡを提出する。そのクロー
ン化ｃＤＮＡは、３．６、１．８と１．６キロベースの
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ両ｍＲＮＡに特定
的であろう。現発明のクローン化ＤＮＡは５６，０００
Ｍｒ蛋白質のｍＲＮＡに特定的であり、そのｍＲＮＡは
２キロベースで図１に示す配列を持つ。ヒトＳＶ８０細
胞から得た（２′−５′）オリゴＡシンセターゼｍＲＮ
Ａのための部分ｃＤＮＡクローン（Ｅ1 ）は、それがア
フリカツメガエル卵細胞中での翻訳で（Ｍｅｒｌｉｎ
ｅｔ ａｌ，１９８３）（２′−５′）オリゴＡシンセ
ターゼ活性を起すｍＲＮＡを交配で選別する能力を通じ
て始めて獲得された。Ｅ 1 ｃＤＮＡの挿入（６７５ｂ
ｐ）はＲＮＡの１．６、１．８および３．６ｋｂの三種
類で、ＳＶ８０細胞のＩＦＮに符号するものと交雑し、
１２時間の蓄積で細胞質ポリソーム分画に見出される
（Ｂｅｎｅｃｈ ｅｔ ａｌ，１９８５）。 【００３８】他の二種の早期転写体（２．７および４ｋ
ｂ）は、より少い分量で現れる。ヒト細胞の種々の型の
分析から、これら諸ＲＮＡは各細胞の特定の方法で別個
に発現される事がわかった。Ｂリンパ芽細胞では（Ｎａ
ｍａｌｖａ，Ｄａｕｄｉ）１．８ｋｂのＲＮＡが集積す
るが、一方、羊膜のＷＩＳＨ細胞、組織球のリンパ腫Ｕ
９３７細胞、およびＨｅＬａ細胞では１．６ｋｂのＲＮ
Ａが幾らかの３．６ｋｂ ＲＮＡと共に主としてＩＦＮ
で誘起されるが１．８ｋｂ ＲＮＡは殆ど作られない。
２倍体繊維芽細胞ＦＳ１１内、ＳＶ８０繊維プラストイ
ド細胞内およびＴ細胞ＣＥＮＴ系では安定ＲＮＡの三型
全部が発現される（Ｂｅｎｅｃｈ ｅｔａｌ，１９８
５）。（２′−５′）オリゴＡシンセターゼの発現され
る型は用いたＩＦＮの種（α，βまたはγ）の相異には
依らず、むしろ細胞内で発生的に規制されるように見え
る。 【００３９】（２′−５′）オリゴＡシンセターゼの異
った転写物は、１遺伝子に由来するようである（Ｂｅｎ
ｅｃｈ ｅｔ ａｌ，１９８５）。制限酵素切断位置地
図に依れば、１）Ｅ1 ｃＤＮＡは１．６ｋｂ ＲＮＡの
３′末端に相当する、２）１．８ｋｂ ＲＮＡは１．６
ｋｂ ＲＮＡと異った３′末端を持ち、下流エクソン１
つを余分に持つ、３）３．６ｋｂ ＲＮＡは１．８ｋｂ
ＲＮＡと共通の３′末端を持つが、不完全にスプライ
スされている。特定のゲノムＤＮＡ断片を用いた交雑−
翻訳試験は、これも１．８と１．６ｋｂの両ＲＮＡは、
積極的に（２′−５′）オリゴＡシンセターゼをコード
する事を示した（Ｂｅｎｅｃｈ ｅｔａｌ，１９８
５）。 【００４０】１．６と１．８ｋｂ両ＲＮＡのためのｃＤ
ＮＡ諸クローンは単離され配列決定が行われ、これはヒ
ト細胞に二型あるＩＦＮ−誘起の（２′−５′）オリゴ
Ａシンセターゼのアミノ酸配列の由来解明を可能にし
た。二種の蛋白質はｃ−末端を異にし、１．６ｋｂ Ｒ
ＮＡ産物（Ｅ１６）では疎水性であり、１．８ｋｂ Ｒ
ＮＡの産物（Ｅ１８）では酸性である。（２′−５′）
オリゴＡシンセターゼ遺伝子の完全地図では、１．６ｋ
ｂ ＲＮＡは７つのエクソンにコードされ、１．８ｋｂ
ＲＮＡは８つのエクソンにコードされる。ＩＦＮ−誘
起のヒト（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ遺伝子の
転写開始位置と仮定される位置の配列はヒトＩＦＮ−β
1 遺伝子のプロモーター部位と強い相同性を示す。 【００４１】例 １ （２′−５′）オリゴＡシンセターゼｍＲＮＡのｃＤＮ
Ａクローンによる測定 Ａ） Ｅ−ｃＤＮＡ諸クローンの単離 全ＲＮＡは１０9 のＳＶ８０細胞（ＳＶ４０−形質転換
ヒト繊維芽細胞）をｍｌ当り２００単位ＩＦＮ−ベータ
で１２時間処理して調整した。そのＲＮＡは３ＭのＬｉ
Ｃｌ−６Ｍ尿素で抽出し、オリゴｄＴ−セルロースの上
を通して純化した。得たポリＡ+ −ＲＮＡの０．４ｍｇ
は１．５％アガロース／６Ｍ尿素２５ｍＭクエン酸ナト
リウムｐＨ３．５で、ゲル電気泳動装置のプレパレーシ
ョン中で分画された。その１７−１８ｓＲＮＡ分画が次
のようにｃＤＮＡの調整に用いられた：２ミリグラムの
ＲＮＡを１分間、９０℃で２ミクログラムのオリゴ（ｄ
Ｔ）12-18 と、６０ミクロリットルの水中で熱した、次
に０℃で冷却、その後塩の最終濃度が５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、７５
ｍＭ ＫＣｌとなるように補足し、５分間４２℃で保温
後に１ｍＭヂチオトレイトール、各１ｍＭのｄＡＴＰ、
ｄＴＧＰ、０．５ｍＭのｄＣＴＰ、２０ミクロ−Ｃｉの
３２p −ｄＣＴＰ（３００（Ｃｉ／ｍｍｏｌ））、４ｍ
Ｍのピロ燐酸ナトリウムと２０単位の逆転写酵素を最終
容量０．１ｍｌにして加える。 【００４２】この混合物を４２℃で４５分間保温し、１
０ｍＭ ＥＤＴＡで反応を止め、０．２％ナトリウム−
ドヂシル硫酸、そしてｃＤＮＡはフェノール−クロロフ
ォルムで抽出し、０．３ＮのＮａＯＨで２０時間５２℃
の処理をし、中性化した。そのｃＤＮＡをＳｅｐｈａｄ
ｅｘ Ｇ−７５で濾過し、エタノール沈澱をし、そして
ｄＡＴＰと末端トランスファラーゼとで尾付けをした。
第二のｃＤＮＡ鎖の合成はオリゴ（ｄＴ）でプライム付
けをし、第一鎖と同様に２時間４２℃で進行させたが、
放射性ヌクレオチドとピロ燐酸は用いなかった。末尾の
整形を確保する為にｄｓ ｃＤＮＡは大腸菌ポリメラー
ゼＩ大断片と共に先ず２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐ
Ｈ８、７５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ1 、１ｍＭ
チチオトレイトールで５分間３７℃（角切り反応）で処
理し、次にＡＴＰ存在下に充填条件に置いた。 【００４３】そのｄｓ ｃＤＮＡは５−２０％の蔗糖傾
斜で沈澱分画し、最も重い分画にｄＣＴＰで尾付けをし
て、等モル量のＰｓｔ１−切断ｐＢＲ３２２プラズミド
ＤＮＡのｄＣＴＰで尾付けしたものでアニールした。約
７ｎｇのＤＮＡを１００ミクロリットルの凍結し、Ｃａ
Ｃｌ2 −処理した大腸菌ＭＭ２９４と混合した。０℃で
３０分と３７℃で５分の処理後、そのバクテリアは２ｍ
ｌのＬＢ−ブロス中で３７℃で２時間の生育をさせ、Ｌ
Ｂ−寒天プレートに１０ミクログラム／ｍｌのテトラサ
イクリンで接種した。約１．４×１０5 のテトラサイク
リン−耐性でアンピシリン−感受性のコロニーが、ミリ
グラム当りの組換プラズミドＤＮＡから得られた。 【００４４】（２′−５′）オリゴＡシンセターゼｍＲ
ＮＡのｃＤＮＡクローンを識別するため、総計３，００
０のプラズミドクローンをＩＦＮ−処理ＳＶ８０細胞の
ＲＮＡと交雑しスクリーンし、そのＤＮＡで選抜したＲ
ＮＡをＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ卵細胞に注射して
テストし、Ｓｈｕｌｍａｎ ａｎｄ Ｒｅｖｅｌ（１９
８０）の方法で（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ活
性測定した。１２の個別のクローン（各３ミクログラム
のＤＮＡ；ＥｃｏＲ１で分断）からのプラズミドＤＮＡ
の合併物は直径０．４ｃｍのニトロセルローズ濾紙を通
し、３７℃２時間の予備交雑を５０％フォルムアミド、
２ｍＭ Ｐｉｐｅｓ緩衝液ｐＨ６．４、０．７５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（緩衝液Ａ）中で行った。ｐ
ＢＲ３２２ ＤＮＡによる濾紙３本、組換ＤＮＡによる
濾紙３０本を３００ミクログラムのポリＡ+ −ＲＮＡと
共に（仮定の（２′−５′）オリゴＡシンセターゼｍＲ
ＮＡ量、０．０９ミクログラム又は０．０３％の１０倍
過剰のｃＤＮＡの添加になる計算で）、１ｍｌの緩衝液
Ａ中で３７℃で２０時間保温した。 【００４５】これらの濾紙は３７℃の緩衝液Ａで２回、
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌのｐＨ７．５と０．１５Ｍ
ＮａＣｌと１ｍＭ ＥＤＴＡと０．５％ナトリウムド
デシル硫酸の混合物で４回（１度は３７℃で、残り３度
は５２℃で）、そして１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌのｐ
Ｈ７．５と１ｍＭ ＥＤＴＡの混合物（緩衝液Ｃ）で５
２℃において４回の諸洗滌を行った。各濾紙は、次に個
別にして緩衝液Ｃで５２℃の洗滌をし、次に９６℃で
０．３ｍｌの緩衝液Ｃに１ｍｌ当り４０ミクログラムの
兎肝ｔＲＮＡを加えたもの、中で２分間加熱してＲＮＡ
を取り出した。そのエタノール沈澱物を急冷の後、その
ＲＮＡは２ミクロリットルの水に溶解した。０．７ミク
ロリットルのＲＮＡを１０個のアフリカツメガエル卵細
胞に注射し、１９℃１８時間の保温後、その卵細胞を孵
卵液中でホモゲナイズし（Ｓｈｕｌｍａｎ ａｎｄ Ｒ
ｅｖｅｌ，１９８０）、そのホモゲネート０．１５ｍｌ
をポリ（ｒＩ）（ｒＣ）−アガロース粒と混合した。 【００４６】その粒は３０℃で１６時間、２．５ｍＭの
（32Ｐ）−アルファーＡＴＰ（０．３Ｃｉ／ｍｍｏｌ）
と１０ｍＭジチオトレイトールとの混合物中で保温し、
この１０ミクロリットルの液相部を０．３５単位のバク
テリア アルカリ フォスファターゼと共に３０ｍＭの
Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ中で３７℃６０分の保温をした。そ
の消化物はＷａｔｍａｎ ３ＭＭ濾紙上で濾紙電気泳動
に３，０００Ｖで４時間かけ、（２′−５′）ＡｐＡと
（２′−５′）ＡｐＡｐＡに相当する汚点を切り取り、
シンチレーション測定をした。ＤＮＡ−選抜ＲＮＡか
ら、１ミクロリットルを取り網赤血球分解物でＷｅｉｓ
ｓｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ，（１９７９）に述べられ
たようにｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳に用い、資料の全ｍＲＮ
Ａ活性の測定を行った。 【００４７】ＤＮＡ選抜ＲＮＡ資料中の（２′−５′）
オリゴＡシンセターゼ活性の全ｍＲＮＡ活性に対する比
は各濾紙毎に計算した。１２の各個別プラズミドからの
２５０合併資料のプール１７４を持つ濾紙は、他の合併
資料のものやｐＢＲ３２２ＤＮＡのものに比し１０倍高
い値が常に現れた。プール１７４の各個のクローンのプ
ラズミドを各個別の濾紙で試し、１７４−３が常に、
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼｍＲＮＡの全ｍＲ
ＮＡに対しての濃度について全ＲＮＡ又はｐＢＲ３２２
のＤＮＡ選抜ＲＮＡに比し３５−１００倍の高さを示し
た（Ｔａｂｌｅｌ）。クローン１７４−３は、（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼｃＤＮＡと同定され、Ｅ−
ｃＤＮＡと命名した。このｃＤＮＡの構造と配列とを図
１に示す。このＥ−ｃＤＮＡクローンはその酵素のカル
ホキシ末端のアミノ酸を１００個塩基配列中に保有し、
ポリＡの尾の前に翻訳されない１９２塩基長の部位を持
つ。Ｔａｂｌｅ １ （２′−５′）オリゴＡシンセターゼｃＤＮＡのクロー
ンの交雑−翻訳による同定 誘起ＲＮＡの卵細胞注射（２）により測定したＥｍＲＮ
Ａの活性 【００４８】 【表１】【００４９】Ｂ）Ｅ−ｃＤＮＡの交雑による、インター
フェロン−誘起（２′−５′）オリゴＡシンセターゼｍ
ＲＮＡの測定 クローン１７４−３（Ｅ−ｃＤＮＡ）のプラズミドＤＮ
Ａは細胞の全ＲＮＡによる電気泳動諸汚点から相補的Ｒ
ＮＡを検出するのに使用できる。ポリＡ+ −ＲＮＡは２
０００／ｍｌのインターフェロンビータで種々の回数処
理したＳＶ８０細胞から調整して、その７ミクログラム
のＲＮＡは５０％フォルムアミドと６％のフォルムアル
デヒド中で変性し、１．３％のアガロースと６％のフォ
ルムアルデヒド中で電気泳動にかけ、Ｔｈｏｍａｓ（１
９８０）とＦｅｌｌｏｕｓ ｅｔａｌ，（１９８２）の
手順でニトロセルローズにブロットした。Ｍｅｒｌｉｎ
ｅｔ ａｌ，（１９８０）に依り、（32Ｐ）−ガンマー
ｄＣＴＰを用いて割れ目移動で構識付けしたそのＥ−ｃ
ＤＮＡプズミドは、先のニトロセルローズの汚点と交雑
した。 【００５０】ＳＶ８０細胞中で、インターフェロン処理
で同時に誘起された三種のＲＮＡ、３．６キロベースの
大きいＲＮＡ１つと１．８５、１．６５キロベースの小
さいＲＮＡは、Ｅ−ｃＤＮＡと交雑する（図２）。非処
理のＳＶ８０細胞ではＥ−限定のＲＮＡは見出せない。
４時間目に現れるこの三種のＲＮＡは１２時間で最大値
となり、その後徐々に減少する。この諸ＲＮＡはインタ
ーフェロン処理後２４時間でも明瞭に検出される。わず
か４時間後に出現する別のＲＮＡ諸種は、更に安定度の
高い諸種の前駆体である可能性が強い。同じ三種のＲＮ
Ａは、インターフェロン処理を受けたヒト２倍体繊維芽
細胞にも見られる。しかし、リンパ芽球Ｎａｍａｌｖａ
細胞のような造血細胞系の細胞では、一つの主要種だけ
がＥ−ｃＤＮＡと雑種化し（図２）それは１．８５キロ
ベースのＲＮＡ種に相当する。同様のＲＮＡパターンが
多種のリンパ芽球細胞である赤血球ＨＬ−６０および原
モノサイトＵ９３７に見られる。 【００５１】繊維芽細胞やリンパ細胞に見られる異型の
Ｅ−限定ＲＮＡパターンは、これらの細胞内の（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼの異型に相当する。リンパ
細胞は分子量３０，０００ダルトンの酵素を持つが、繊
維芽細胞では分子量８０，０００ダルトンと３０，００
０ダルトンの２型をＲｅｖｅｌ ｅｔ ａｌ，（１９８
２）の発表のように含有している。小さい１．８５キロ
ベースｍＲＮＡは３０，０００Ｍｒの酵素をコードする
に十分の長さがあるが、大型の方には足りない。一方、
３．６キロベースのＥ−ｍＲＮＡは８０，０００Ｍｒの
型の酵素をコードする。三型のＥ−限定ＲＮＡ種は全部
ヒトのゲノムＤＮＡの単クローンと交雑し、３．６キロ
ベースのＲＮＡは１．８５キロベースのＲＮＡと比べて
インターフェロンエクソンを一つ余分に持っている。 【００５２】白血球インターフェロン−アルファは繊維
芽細胞のインターフェロン−ベータと同じようにＥ．限
定ＲＮＡを誘起する。ＲＮＡは複数種がある事はＥ−ｃ
ＤＮＡとの交雑から明らかとなった。インターフェロン
にも異同がある。それらは総て（２′−５′）オリゴＡ
シンセターゼを誘起するが、違った型のＲＮＡや酵素も
誘起するだろう事を示唆する。異ったインターフェロン
種は、Ｅ−ｍＲＮＡ誘起の効率に差のある事もあり得
る。 【００５３】上記のＥ−ｃＤＮＡとの交雑検定で処理さ
れるＲＮＡは、種々の培養細胞から又はインターフェロ
ン治療を受けている患者から又はウイルス病の病人から
或いは（２′−５′）オリゴＡシンセターゼの昂進する
病気（Ｓｃｈａｔｔｎｅｒｅｔ ａｌ．，１９８１）か
ら調整できる。ＲＮＡは他の白血球のような末梢血液か
らの血球からも調整できる。電気泳動ブロットは点−交
雑法で代行でき、それではＲＮＡの資料を、ニトロセル
ローズの上に一定の広さで円形、矩形等で直接設置す
る。そして放射性ｃＤＮＡはニトロセルローズ布上で直
接に交雑される。各円形又は矩形は次に直接計測又はオ
ートラヂオグラフフイルムの選別後にオートラヂオグラ
フする事で測定される。 【００５４】代替法としては、インターフェロンにさら
した組織を生検して組織切片に原位置交雑で行う。脳の
ウイルス病又は腫瘍のためインターフェロンの投与を受
けた患者に対し投薬が莢壁内注射であったか体内注射で
あった時に脳インターフェロン処理を受けているかを測
るのに脳生検として優先的に応用される。この方法はイ
ンターフェロン投与が局所的に皮膚病斑の軟膏として行
われた時に皮膚生検に対して行われる。他の様々な応用
ができる事は明白である。組織片は固定し、原位置で放
射性ＤＮＡと交雑し、次に感度の良い感光剤でオートラ
ヂオグラフにかける。このｃＤＮＡは蛍光ヌクレオチド
で又は蛍光分子と結合するよう改造したヌクレオチドで
標識し、組織切片と交雑すれば蛍光顕微鏡で監視でき
る。 【００５５】Ｅ−ｃＤＮＡの交雑が増加すれば、通常の
コントロール細胞ＲＮＡ又は組織資料と比較して、その
細胞や組織がインターフェロンにさらされた事を意味す
る。この方法は速断性（４−２４時間）と高感応性（ｍ
ｌ当り１〜２００単位のインターフェロン）のために外
来のインターフェロン投与又は患者の血液や組織での内
生インターフェロンの形成の後に非常に有用である。 【００５６】例−２ インターフェロンで誘導した５６，０００Ｍｒタンパク Ａ）クローニングしたＣ56−ｃＤＮＡの単離 クローニングしたｃＤＮＡを例１に記述した組み換えプ
ラスミッドのライブラリーから単離した。 １．使用された方法の原理は、判別ハイブリッド形成で
あった。ニトロセルローズロ紙上に、生育させた３，０
００のバクテリアのクローンの２つの重複セットを、イ
ンターフェロン−β（２００Ｕ／ｍｌ）で処理したＳＶ
８０細胞の１７Ｓから１８ＳのポリＡ+ −ＲＮＡからの
（32Ｐ）−ｃＤＮＡか、もしくは、無処理のＳＶ８０の
細胞の全ポリＡ+ −ＲＮＡからの（32Ｐ）−ｃＤＮＡと
ハイブリッド形成を行なった。放射活性のｃＤＮＡは、
例１におけるように、ｍＲＮＡから逆転写した。バクテ
リアのクローンのうち、約４０％が“インターフェロ
ン”処理”ｃＤＮＡプローブと、強くハイブリッドを形
成し、８％が、明確な判別シグナルを与え、“熱処理”
ｃＤＮＡとくらべて、優先的または、特別に“インター
フェロン処理”ｃＤＮＡとハイブリッド形成を行なっ
た。 【００５７】後者のグループのクローンを、次に、ニッ
クトランスレーションによって放射活性ラベルをした各
クローンからのプラスミッドＤＮＡを、インターフェロ
ンで処理したＳＶ８０細胞から、及び、無処理の細胞か
ら、ＲＮＡの電気泳動ブロットとハイブリッドを形成す
ることによってスクリーニングを行なった。この基準に
よって、最初の３，０００のバクテリアのクローンのう
ち、１−２％が、インターフェロンによって誘導された
ｍＲＮＡに相当するプラスミッドｃＤＮＡクローンを含
んでいることが見出された。これらのプラスミッドｃＤ
ＮＡクローンのうち、Ｃ56と読んだ１つが、特別に強い
判別ハイブリッド形成を示した。このＣ 56ＤＮＡは、イ
ンターフェロンで処理した細胞に存在するが、コントロ
ール細胞ＲＮＡには存在しない１８Ｓ ＲＮＡとハイブ
リッドを形成する（図３）。対照的に、インターフェロ
ン処理によって、ＳＶ８０細胞に、５倍に増加している
ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ ｍＲＮＡは、Ｃ56ｍＲＮＡよりも
誘導がはるかに少いようであり、Ｆｉｇ．３の実験条件
下では、“無処理”ＲＮＡとも明確なシグナルを与え
る。 【００５８】ニトロセルローズロ紙に固定化したＣ56ｃ
ＤＮＡとハイブリッドを形成することによって選ばれた
ｍＲＮＡは、続いてフイルムから溶出され、（例１にお
けるように）網状赤血球溶解産物のセルフリー系で翻訳
し、35Ｓ−メチオニンでラベルした翻訳産物を、Ｌｅａ
ｍｌｅ（１９７０）から応用したＷｅｉｓｓｅｎｂａｃ
ｋら（１９７９）が記述した方法に従ってＮａ−ｄｏｄ
ｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ中でポリアクリルアミドゲル
電気泳動によって分析した。Ｃ56のｃＤＮＡで選ばれた
ＲＮＡは、５６，０００Ｍｒタンパクに翻訳された。Ｃ
56ｃＤＮＡの塩基配列のうち、５６，０００Ｍｒの、カ
ルボキシル末端の６５のアミノ酸が、その道の技術を持
った人により、導き出された（図４）。 【００５９】インターフェロン−β（２００Ｕ／ｍｌ）
で、時間を種々変えて処理したＳＶ８０から抽出したＲ
ＮＡに対するＣ56ｃＤＮＡのハイブリッド形成からＣ56
ｍＲＮＡが、インターフェロンを加えてから１時間後に
現れ始めるということがわかる（図５）。Ｃ56ＲＮＡは
４時間後にその極大に達するが、しかし、減少はするも
のも、２４時間後もまだ検出できる。Ｃ56ｍＲＮＡの誘
導は、倍数体、線維芽細胞、及びリンパ芽球様細胞にお
いても示される。誘導は、インターフェロン１０から２
００単位／ｍｌの間で濃度に比例していた。Ｃ56ｍＲＮ
Ａは、後者は能率が悪かったが、インターフェロン−
α、インターフェロン−γによっても誘導された。この
ｍＲＮＡが、未処理の細胞に存在していないことと、イ
ンターフェロンを添加した後、急速に増加することによ
り、Ｃ56ｃＤＮＡは、細胞のインターフェロンに対する
反応を評価するための素晴らしいプローブとなっている
例１中のＥ−ｃＤＮＡに対して、記述された技術は、同
様にＣ56ｃＤＮＡにも適用できる。 【００６０】インターフェロンによって誘導されたｍＲ
ＮＡに相当する多数のｃＤＮＡが手に入るということ
は、新しい展望を提供している。特に、Ｅ−ｍＲＮＡや
Ｃ56ｍＲＮＡを誘導するためよりも、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，
Ｃ ｍＲＮＡを誘導するために、インターフェロンは、
１／１００の濃度しか必要としない。（Ｗａｌｌａｃｈ
ら、（１９８２））；他方、α−ｄのようなインターフ
ェロン−αの亜種は、ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ ｍＲＮＡを
誘導するのに必要な濃度より１００倍低い濃度でＥ−ｍ
ＲＮＡを誘導できる。異った、クローン化されるｃＤＮ
Ａを同じＲＮＡサンプルとハイブリッド結合させること
により、どういう種類のインターフェロンが含まれるか
を示すことができる。かくして、唯１つのｃＤＮＡプロ
ーブを用いるよりも、異ったｃＤＮＡの比較からもっと
多くの知識が誘導できる。 【００６１】例 ３ インターフェロン誘導ｍＲＮＡｓの測定のためのキット このキットは、デオキシ−リボヌクレアーゼＩと
（32Ｐ）−γ−ｄＣＴＰとのニック翻訳のための試薬ニ
トロセルローズメンブラン上のハイブリッド形成のため
の試薬、及び細胞からのＲＮＡ抽出用の試薬と同じく
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼのｍＲＮＡに対し
て、特異的な、そして、ここに記述した、５６，０００
ＭｒタンパクのｍＲＮＡに特異的なクローン化したｃＤ
ＮＡを提供するだろう。 【００６２】例 ４ １．６ＫＢ（２′−５′）オリゴＡシンセターゼｍＲＮ
Ａに対するｃＤＮＡの配列 ヒトの細胞中のインターフェロンによる１．６ｋｂ
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの末端であること
がわかった（Ｂｅｎｅｃｈら、１９８５）部分的なＥ1
ｃＤＮＡクローン（Ｍｅｒｌｉｎら、１９８３）が、Ｓ
Ｖ８０細胞ＲＮＡから、ラムダ−ｑｔ１０ｃＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングするのに用いられた（Ｗｏｌ
ｆとＲｏｔｔｅｒ、１９８５）。制限酵素を用いたマッ
ピングにより、クローンラムダ−ｑｔ１０ ９−２はｐ
ＢＲ（９−２１ｃＤＮＡ）中にサブクローニングを行っ
た１．３２ｋｂ ＥｃｏＲ１インサート（図６Ａ）の
３′の端に、Ｅ１ｃＤＮＡを含むことが見出された。配
列決定は、図６Ａに概説したように行なわれ、似前にＥ
１ｃＤＮＡについて報告されたｃ−末端と３′の翻訳さ
れていない配列を含むことが確認された（Ｍｅｒｌｉｎ
ら、１９８３）。９−２１ｃＤＮＡ配列（図７）は、Ａ
ＴＧＡＴＧ配列において出発する３６４アミノ酸のオー
プンリーディングフレームを予告する。 【００６３】タンパクのコ−ディング配列の３塩基周期
性に基いたコンピュータ−プログラム（Ｔｒｉｆｏｎｏ
ｖ，１９８４）により唯一の矛盾しないリーディングフ
レームは、このＡＴＧＡＴＧから出発するものであるこ
とがわかった。翻訳が、この場合の２番目のＡＴＧにお
いてはじまることは可能である。何故なら、それは、−
３におけるＡが前にあり、コンセンサス翻訳イニシエー
ション配列と相同性がある唯一のものであるからである
（Ｋｏｚａｋ，１９８４）。 【００６４】このようにして、１．６ｋｂ（２′−
５′）オリゴＡシンテターゼＲＮＡによってコードされ
た酵素は、４１，７００の分子量を持ち、Ｅ１ｃＤＮＡ
とハイブリッド結合をしたｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳産物
（Ｍｅｒｌｉｎら１９８３）のＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によってみられる、みかけ上の３８，
０００−Ｍｒのタンパクとよく一致する。オープンリー
ディングフレームによって予告されたｃ−末端ヘプタデ
カぺプチドが化学的に合成され、ラビットを免疫するの
に用いられた。得られた抗血清（図１２のｃ）は、未処
理の細胞には存在していないインターフェロンによって
処理した細胞の３５−Ｓメチオニンラベルの抽出物から
のＳＤＳ電気泳動中の３８，０００−Ｍｒに移動するタ
ンパクを特異的に沈澱させる。２つの実験により、この
タンパクは、（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性
をもつことが確かめられた。それは、ポリ（γＩ）（γ
Ｃ）アガロース・カラムを通すことによって抽出物から
除かれ、免疫沈澱後残っている上澄液は酵素活性の大部
分がなくなった。 【００６５】例 ５ １．８ＫＢ（２′−５′）オリゴシンテターゼｍＲＮＡ
に対するｃＤＮＡの配列 １．８ｋｂ ＲＮＡの追加のエクソン（Ｂｅｎｅｃｈ
ら、１９８５；図９をみよ。）に相当する遺伝子ＤＮＡ
断片ＳＶ８０ＲＮＡの同じラムダ−ｑｔ１０ｃＤＮＡラ
イブラリーからＥ１８ｃＤＮＡクローン−８−１を単離
するプローブとして用いられた。Ｅ１８ｃＤＮＡクロー
ンの制限マップ（図６Ｂ）はその５′末端がＥ１６ｃＤ
ＮＡの一部であるが、３′末端は違っているということ
を確かめた。配列決定の結果（図７）結合部は、Ｅ１６
９−２１ｃＤＮＡクローンの１０７１のヌクレオチド
の位置にあり、Ｅ１６の最後の２４７ヌクレオチドが異
なるポリアデニル化の位置によって終っている５１５の
ヌクレオチドの長い配列によって置き換っている。 【００６６】この差は、ノーザンブロット上にみられる
２つのｍＲＮＡの間の大きさの差０．２ｋｂを説明す
る。Ｅ１８ｃＤＮＡの５′の部分は、Ｅ１６ｃＤＮＡの
配列から、塩基の変化がないことを示しているが、未完
成である。下に述べられる遺伝子のマッピングによる
と、１．６と１．８ｋｂ ｍＲＮＡｓの両者とも同じ
５′末端を有している。Ｅ１６配列から分れた１８ｃＤ
ＮＡの３′領域は、５４のコドンの後終るオープンリー
ディングフレームを含んでいる。３５０のヌクレオチド
の長さの翻訳されない領域を残しているリーディングフ
レームは、タンパク−コーディング配列の３塩基の周期
性に基いたコンピュータ−プログラム（Ｔｒｉｆｏｎｏ
ｖ，１９８４）によって確かめられた。 【００６７】交互のより長いオープンリーディングフレ
ームは、Ｅ１６ｃＤＮＡに共通な５′部分のように、同
じコンピューティッドフレーズの中にはないだろう。
１．６と１．８ｋｂ ｍＲＮＡタンパク産物のｃ−末端
上のハイドロパシープロット（ＫｙｔｅとＤｏｏｌｉｔ
ｔｌｅ，１９８２）により（２′−５′）オリゴシンテ
ターゼ（図８）の２つの形の間に著しい違いが示され
る。Ｅ１６タンパクのｃ末端は、非常に疎水性である
が、Ｅ１８タンパクのｃ末端は親水性であり、２つの酸
性領域をもっている（ＡＳＰ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔｈｕ
−Ａｓｐ−Ａｓｐ−とＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ）（図
７）さらに、Ｅ１８産物のｃ末端に可能なグリコシル化
の場所が存在している。（図７） ９−２４ ｃＤＮＡをｌａｃ Ｚ遺伝子とフェーズをあ
わせて融合するように、λｇｔｌｌにサブクローンニン
グを行なった。このフェーズを含んでいるＥ．Ｃｏｌｉ
のリソーゲンは、ポリ（γＩ）（γＣ）アガロースに結
合した後、明らかに（２′−５′）オリゴＡシンテター
ゼ活性を示した。一方、９−２１ｃＤＮＡが反対の方向
に融合した場合には、何も活性が生じなかった（図１
３）。 【００６８】このＥ．ｃｏｌｉにおける発現は、ｃＤＮ
Ａは確かにｄｓＲＮＡで活性化された（２′−５′）オ
リゴＡシンテターゼをコードする構造遺伝子に相当して
おり、インターフェロンで誘導されたＲＮＡによりコー
ドされた約４０ｋｄのタンパクは、酵素そのものであ
り、制御因子ではないということを証明している。この
タンパクは、酵素活性を示すために、翻訳後の修飾は必
要としないようである。９−２１ｃＤＮＡを含むトラン
スフォームした明細は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉラムダ−ｇｔｌｌ−Ｅ１６と呼ばれ、取得番号１４
９６の下にＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅ
ｓ，パストール研究所、２５ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅ
ｕｒ Ｒｅｕｘ，７５７２４−Ｐａｒｉｓ−Ｃｅｄｅｘ
１５、フランスに預けられている。この寄託は、パテ
ントの手続きの目的のために、微生物の寄託の国際的認
識に関するブタペスト条約に従って行なわれたものであ
る。 【００６９】例 ６ ヒト（２′−５′）オリゴシンテターゼ遺伝子の組織化 ３つの重なり合った遺伝子のクローンが、１つが、ヒト
血球細胞ＤＮＡ（Ｍｏｒｙら、１９８１）の部分的Ｅｃ
ｏＲＩ消化物のライブラリーから（Ｍａｎｉａｔｉｓ
ら、１９７８）Ｅ１ｃＤＮＡをプローブとして用いて単
離した。（Ｂｅｎｅｃｈら、１９８７）。遺伝子クロー
ンは、ヒトＤＮＡの約２９ｋｂを表しており、ライブラ
リーをスクリーニングしても、１個のＥ遺伝子以上に対
する証拠は存在しなかった。遺伝子的ＤＮＡのサザーン
ブロットは、単一遺伝子の存在と一致していた（図
９）。ノーザンブロット解析によって、遺伝子ＤＮＡ断
片をプローブとするノーザンブロット解析により、Ｓ１
ヌクレアーゼマッピングと配列決定により、Ｅ１６ｃＤ
ＮＡ９−２１は、遺伝子上の５エキソンに相当すること
が示された。（図９） 【００７０】ＡＴＧＡＴＧ配列は、エクソン３に見出さ
れたが、停止コドンと１．６ｋｂＲＮＡのポリアデニレ
ーションの位置を持った翻訳されない領域は、エクソン
７中に見出された。別の５′エクソン１と２の構造が下
に記してある。イントロ−エキソン境界の配列が決定さ
れ（Ｔａｂｌｅ ２）スプライスアクセプター、ドナー
サイトに対するＣＡＧとＧＴ規則にしたがう（Ｂｒｅａ
ｔｈｎａｃｈ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１）。
最近Ｋｅｌｌｅｒ（１９８４）によって総説されたよう
に、ＣＴＧＡＣ／Ｔは、共通してスプライスアクセプタ
ーから遠くないところに見出される。（アクセプターサ
イト：Ｔａｂｌｅ ２）Ｋｅｌｅｒ（１９８４）によ
り、ラリアートモデルで役割を演じていることが指摘さ
れているＣＴＧＡＣ配列とイントロン−ドナーの相補性
に加えて、ＣＴＧＡＣ／Ｔ領域が、イントロン／エクソ
ンの３′境界の配列と相補性があるということは注目す
べきことである。 【００７１】１．６ｋｂのｍＲＮＡによって生産される
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼのコーディング領
域を含む５エリクソンの配列は、酵素が異なるアミノ酸
組成（Ｔａｂｌｅ ３）をもった領域から成立っている
ことを示している。最初のエクソンのドメイン（６０ア
ミノ酸）は、アスパラギン酸に富んでおり、２番目では
（アミノ酸６１から１５６）アルギニンが優先してお
り、２番目の次のエクソンは（アミノ酸１５７から２１
８と２１９から２９５）リジンに富み、産物（２９６か
ら３６４）のｃ末端はプロリンとアラニンに富んでい
る。エクソンの番号のつけ方については、図７と図９を
見よ。ＣＧＡＴ／Ｃまたは、ＣＴＴＡＣ，ＣＴＧＴＣ
（Ｋｅｌｌｅｒ，１９８４）とスプライスアクセプター
ＣＡＧの間の自己・補性領域に下線が引いてある。ヒト（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ遺伝子のエク
ソン−イントロン境界 【００７２】 【表２】【００７３】１．６及び１．８ｋｂ ＲＮＡｓ（図７を
見よ）の保持されたウンデカヌクレオチドをもったポリ
アデニレーションサイトには、下に点線が記されてい
る。カッコ内の数は、イントロンまたはエクソン（図９
を見よ）をになっているＥｃｏＲＩ遺伝子断片の大きさ
である。各エクソンの出発点と終点は、図７の９−２１
ＥｃＤＮＡにおけるように数字がついている。Ｅ１６とＥ１８の（２′−５′）オリゴシンテターゼの
エクソンドメイン 【００７４】 【表３】【００７５】Ｅ１８ｃＤＮＡ４８−１は不完全であるけ
れども、我々は、エクソン１−６（図９）がノーザンブ
ロット上の１．６ｋｂと同様に１．８ｋｂのｍＲＮＡと
ハイブリッド結合することを見出した。２つのＲＮＡの
構造はエクソン７迄は同一であることはかなり確からし
い。Ｅ１８ｃＤＮＡを特徴づけるエクソン７の中央から
エクソン８への追加的スプライシングは、遺伝子ＤＮＡ
クローン中のこれらのイントロン−エクソンの境界の配
列を決定することにより確かめられた（Ｔａｂｌｅ
２）。 【００７６】Ｅ１８ｃＤＮＡ中に存在する切りつめたエ
クソン７ａは１．６ｋｂ ＲＮＡのポリアデニレーショ
ンの位置を含む１．６ｋｂのイントロンに続いている。
エクソン８はその遺伝子のユニークなＢａｍ Ｈ１の位
置から、９８ｂｐ下流で始まる（Ｔａｂｌｅ ２，図
９）ＡＡＴＡＡＡシグナルの二連の繰返しによって特徴
づけられる１．８ｋｂ ＲＮＡのポリアデニレーション
サイトによって終る。エクソン７と８は相同性がないけ
れども、その中で３番目のシチジンが、ポリアデニル化
されている保持されたウンデカヌクレオチドＡＣＣＡＴ
ＴＴＡＴＴＣが両方のエクソン（Ｔａｂｌｅ ２）の端
に存在している。以前に指摘されたように、（Ｂｅｎｅ
ｃｈら、１９８５）ヘアピンループ構造が、両方の場合
にその保持されたウンデカヌクレオチドと、ＡＡＴＴＡ
ＡＡ領域の間に形成されることができる。このような構
造が、転写物の開裂と、ポリアデニル化が、エクソン７
の端でおこるか、エクソン８の端でおこるかを決定す
る、細胞特有のメカニズムに関与しているかもしれな
い。 【００７７】上記の遺伝子マッピングに基いて、１．８
ｋｂ ｍＲＮＡによってコードされる酵素は、最初の３
４６のアミノ酸中のＥ１６産物と同一であるべきであ
り、その次にアスパラギン酸、グルタミン酸、ヌクレオ
チンに富んでいる。５４のアミノ酸の長い領域が続く。
４００のアミノ酸の長さの、Ｅ１８酵素は４６，０００
の分子量を持っているであろう。 【００７８】例 ７ 同一遺伝子を二者選一的スプライシングによって生産さ
れるヒト（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの２つの
形 ＳＶ８０ＲＮＡｓのノーザンブロット分析の結果、イン
ターフェロンに接触した後、１２時間迄に、Ｅ１ｃＤＮ
Ａとハイブリッドを作る３種の（１．６，１．８及び
３．６ｋｂ）が蓄積することが明らかになった（Ｍｅｒ
ｌｉｎら、１９８３）。更にその外に不安定な転写物も
みられた。これらのＲＮＡｓの間の関係を遺伝的ＤＮＡ
クローン上の転写マッピングによって研究した。２つの
ヒト遺伝的ライブラリーにおいて、Ｅ１ｃＤＮＡは、ヒ
トＤＮＡ（図９）の２９ｋｂを表す重なり合っている遺
伝的ＤＮＡのクローンの一系列のみを同定し、明らかに
ユニークな（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ遺伝子
（Ｂｅｎｅｃｈら、１９５５ａ）を含むことが見出され
た。 【００７９】Ｓ１ヌクレアーゼ分析と部分的遺伝子の配
列決定により、９−２１（Ｅ１）のｃＤＮＡが５つのエ
クソンに相当することが見出された。（図９Ａと図７の
配列に３−７の番号がついている）このｃＤＮＡの３′
未満とポリアデニレーションの位置は、エクソン７の端
にあることが同定された（図９）。しかし、ＳＶ８０Ｒ
ＮＡのノーザンブロットに対する、さらに下流のジェノ
ミックＤＮＡ断片のハイブリッド形成により、１．６ｋ
ｂのＲＮＡだけが、エクソン７のポリアデニレーション
の位置に終っており、１．８と３．６ｋｂのＲＮＡｓは
１．６ｋｂ下流に位置しており、やはり、ポリアデニレ
ーションの位置に終っている（エクソン８、図９）、更
に、別のエクソンとハイブリッド形成を行なうことが明
らかとなった。 【００８０】このようにして、９−２１（Ｅ１）ｃＤＮ
Ａは、１．６ｋｂ ＲＮＡを呈しており、Ｅ１６ｃＤＮ
Ａと名前をつけ直した。さらに、エクソンの３′の半分
は、１．８ｋｂのＲＮＡとはハイブリッド結合せず、転
写がエクソン７からエクソン８への中間からスプライシ
ングイベントによって形成されるということを示してい
る。５′の上流のエキソンはすべて、１．６及び１．８
ｋｂ ＲＮＡｓとハイブリッド結合し、２ＲＮＡｓは、
その３′末端においてのみ異なることを示している。こ
のことは、ＳＶ８０λｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリーか
ら１．８ｋｂＲＮＡに対する判別スプライシングを証明
しており、エクソン８（図４）のポリアデニレーション
の位置で終っている、（図４）ｃＤＮＡクローンの単離
によって確かめられた（クローン４８−１または、Ｅ１
８ｃＤＮＡ、図７Ｂ）。同様なｃＤＮＡクローンが、Ｓ
ａｕｎｄｅｒｓとＷｉｌｌｉａｍｓ（１９８４）による
Ｄａｕｄｉ ｃＤＮＡライブラリーにおいて見出され
た。Ｅ１８の配列は、５１５のヌクレオチドによって置
きかえられているＥ１６の最後の２４７のヌクレオチド
をロックしており、１．６ｋｂと１．８ｋｂ ＲＮＡｓ
の間の大きさの差を説明している。 【００８１】１．８ｋｂのＲＮＡは、したがって、Ｅ１
６タンパクとそのＣ末端が異なっている４６，０００−
Ｍｒのタンパクをコードしている。Ｅ１６タンパクと同
様に、Ｅ１８産物は、ｄｓＲＮＡ結合を有しており、
（２′−５′）Ｅ１８固有のＤＮＡ断片へのハイブリッ
ド形成によって選ばれたｍＲＮＡの翻訳によって示され
た（Ｂｅｎｅｃｈら、１９８５）。このことは、２種の
タンパクに共通な最初の３４６アミノ酸が触媒の場所を
含んでいることを示唆している。エクソン組成を試験す
ることにより、この共通の部分は、３つの塩基性領域が
続いているＮ末端酸性ドメインから構成されているよう
に思われる。Ｅ１６タンパクの最後の１８残基は、非常
に疎水性の領域を形成しており、それはＥ１８において
は、潜在的グリコシル化の位置を含んでいるもっと長い
水溶性で酸性の領域でおきかえられている。２つの酸素
の間のこの差は、それらが二量化したり、または他のタ
ンパク類や細胞構造と相互作用を行なう能力を決定する
かもしれない。例えば、Ｅ１６は膜と結合するが、Ｅ１
８はリボソームや核の中の塩基性タンパクと相互作用を
行なうかもしれない。 【００８２】（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの２
つの形は、インターフェロン処理のヒト細胞（Ｒｅｖｅ
ｌら、１９８２）の抽出物中ゲルロ過を行なうことによ
って見出された（Ｒｅｖｅｌら、１９８２）、即ち、Ｅ
１６またはＥ１８タンパクの単量形に相当するかもしれ
ない３０−４０ｋｄの酵素と、今後同定しなければなら
ない６０−８０ｋｄのタンパクである。転写物のマッピ
ングが、このＲＮＡは、１．８ｋｂのＲＮＡから除去さ
れるイントロン領域を（例えば、エクソン７と８の間）
含んでおり、そしてオープンリーディングフレームがな
いことを示したので、３．６ｋｂのＲＮＡは、大きい酵
素をコードしているとは思われない。我我は、接合子に
おける翻訳において、大きなｍＲＮＡを観察できなかっ
た。精製ヒト（ＨｅＬａ）合成酵素中に８０ｋｄタンパ
クが報告された（Ｙａｎｄら、１９８１）が、その酵素
活性は証明されなかった。 【００８３】ＮａｍａｌｖａとＣＭＬ細胞から精製した
（Ｒｅｖｅｌら、１９８１ｂ）酵素において、我々はＳ
ＤＳ中に、４０ｋｄのバンドを検出できた。したがっ
て、６０−８０ｋｄ酵素が、４０ｋｄタンパクのダイマ
ーである可能性が残っている。ヒトのシンテターゼは、
３０ｋｄ酵素（主に核の）をコードしている１．５ｋｂ
ＲＮＡに加えて、８０ｋｄ酵素（主に細胞質の）をコー
ドする大きな３．８ｋｂのＲＮＡが、変性条件でみられ
るマウスの細胞中のそれとは異なっているかもしれない
（Ｓｔ．Ｌａｕｒｅｎｔら、１９８３）。ヒトＥｃＤＮ
Ａは、３．８Ｍｂと０．６−１．７ｋｂのＲＮＡを検出
し、大きなＲＮＡは、Ｅ１８に特異的なＤＮＡとハイブ
リッド形成をする（Ｍａｌｌｕｃｃｉら、１９８５）。
ヒトの細胞では、大きなＲＮＡが更に加工されて、１．
８ｋｂ ＲＮＡとなり、それがマウスの細胞にみられな
いという可能性がある。Ｓｈｕｌｍａｎら、１９８４）
は、ヒト細胞の（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの
大きさは、ヒト細胞中でも、ヒト−げつし類のハイブリ
ッド細胞染色体へのシンテターゼ遺伝子をマップするマ
ウスの細胞中よりも、もっと小さいタンパクとして挙動
するという事実を用いた。Ｅ１６とＥ１８に特異的な抗
血清は、これからのタンパクと２種の天然のままの酵素
の２つの形の間の関係を解明するのに役立つであろう。 【００８４】例 ８ ２つ（２′−５′）のオリゴＡシンテターゼの細胞特異
的な発現 多数のヒトの細胞系からのＲＮＡが、ノーザンブロット
中で、ＥｃＤＮＡプローブについて試験された（Ｍｅｒ
ｌｉｎら、１９８３；Ｂｅｎｅｃｈら、１９８５）。Ｔ
ａｂｌｅ ４は、ヒト細胞が、インターフェロンで誘導
された重要ＥｍＲＮＡ種にしたがって、３つの細胞にわ
けることができることを示している。Ｂｕｒｋｉｔｔリ
ンパ腫からのリンパ芽球様Ｂ細胞系は、主として１．８
ｋｂ ＲＮＡを有している。そうではなくて、いくつか
の細胞系は、１．６と３．６ｋｂＲＮＡをもっている
が、１．８ｋｂのＲＮＡは殆どもっていない。もし３．
６ｋｂ ＲＮＡが部分的にスプライスを受けた１．８ｋ
ｂ ＲＮＡのプリカーサーだとすると、これらの細胞
は、３．６ｋｂ ＲＮＡの加工に阻害をしているのかも
しれない。 【００８５】Ｔ−リンパ球系（急性白血病からのＣＥＭ
Ｔとヘアリー細胞白血病からのＧａｓｈ）は、繊維芽細
胞と同様に、すべての３ＥＲＮＡシリーズを含んでい
る。だから、Ｅ１８ポリアデニレーションの位置は、す
べての人の細胞の中で利用され、３．６か１．８ｋｂ
ＲＮＡを生産しているように思われる。Ｅ１６ｐＡの位
置は、Ｂリンパ芽球様細胞では用いられていないようで
ある。Ｅ１６とＥ１８ｐＡの位置の両方において、存在
している保存されているウンデカヌクレオチドは（図９
Ｂ）ＡＡＴＡＡＡシグナルとヘアピンループを作ること
ができ、場所の選択に役割を演じるかもしれない（Ｂｅ
ｎｅｃｈら、１９８５）。Ｅ１８は、ＡＡＴＡＡＡシグ
ナル（図９Ｂ）の２連性繰返しを有しており、より強い
ｐＡの位置であるかもしれない。Ｅ１８のｐＡの位置で
終る転写は、インターフェロン添加の後、１．６ｋｂ
ＲＮＡ（Ｂｅｎｅｃｈら、１９８５）よりも早く蓄積す
る。 優先的に存在する（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ
ＲＮＡ種 【００８６】 【表４】 【００８７】優先して作られるシンテターゼの型は、ヒ
トの細胞が異なれば変化する。我々は、シンテターゼの
細胞質または核の高圧と細胞中に存在するＲＮＡの型と
の間になんら相関関係を見出さなかった。しかし、ゲル
ロカを行なったとき、Ｎａｍａｌａｖａ細胞は、主とし
て、３０ ０ｋｄ酵素であったが、一方ＨｅＬａと
ＳＶ８０細胞は、６０−８０ｋｄ型ももっていた（Ｒｅ
ｖｅｌら、１９８２） 【００８８】例 ９ （２′−５′）グリコＡシンテターゼの 領域 Ｅ１６ｃＤＮＡ９−２１クローンのエクソン３の部分を
含んでいる４．２ｋｂＥｃｏ Ｒ１フラグメント（Ｆｉ
ｇ．９）から、０．８５ｋｂ（Ｆｉｇ．１０）のＳｐｈ
１−Ｓｐｈ１が、１．６，１．８，２．７および３．６
ｋｂＲＮＡｓとノーザンブロックで、ハイブリッドを形
成した。しかし、上流域はハイブリッド形成をしなかっ
た。いくつかの実験により、その断片の転写の出発点の
位置がわかるようになった。Ｓ１ヌクレアーゼによる分
析によって、まず、エクソン３が、９−２１ｃＤＮＡの
終りの、上流約５０ヌクレオチドから出発していること
がわかった。９−２１ｃＤＮＡの終りからのオリゴヌク
レオチドを用いてのプライマーの拡張実験により、ｍＲ
ＮＡの５′末端は、このｃＤＮＡの５′の端からの、約
２３０ヌクレオチドであるということを示した。リボプ
ローブとのＲＮＡのハイブリッド形成は （Ｇ
ｒｅｅｎら、１９８３）およびＲＮａｓｅによる分解に
よってエクソン３の前に、７０及び、１１０ヌクレオチ
ドの２つのエクソンの存在が示された。 【００８９】ユニークなＨｐａｌの位置（図９）におい
て、ラベルしたプローブを用いてＳ１ヌクレアーゼを解
折することによって、ｍＲＮＡの５′末端は、最終的に
Ｈｐａｌの位置から１７ヌクレオチド上流に位置してい
ることがわかった。この領域の配列は、図６に示されて
いる。Ｈｐａｌ ｓｉｔｅの前の１７残基の転写開始位
置の決定は、−３０の位置に、ＴＡＴＡＡボックスが存
在することによって支持されている。上流配列の著しい
特徴は、プリン含量が高いことであり、（６９．６
％）、主としてアデニン（５８．９％）である。他の既
知のプロモーターの上流配列との、相同性のマトリック
スを比較したところ、ヒトインターフェーロンプロモー
ター、とりわけ、インターフェロンβ１遺伝子プロモー
ター（Ｄｅｇｒａｖｅら、１９８１）の配列と著しい相
同性が明らかになった。Ｚｉｎｎら（１９８３）によっ
て記述された本質的な転写シグナルを含むＩＦＮ−β１
プロモーターの−７５から−８５のプリンに富んだ領域
は、ＴＡＴＡＡボックス（−４０から−５０）の丁度上
流にある（２′−５′）オリゴシンテターゼの の
プロモーターの領域との９％の相同性を示した（図１
１）このプリンに富んだシグナルは、ＴＡＴＡＡボック
スとそのキャップの位置の間の小片の中のＩＦＮβ１プ
ロモーターの中に繰返されている。 【００９０】やはり、制御的な機能をもっているかもし
れない（Ｎｉｒら、１９８４）この領域において、ＩＦ
Ｎ−β１遺伝子と（２′−５′）オリゴシンテターゼ遺
伝子は高い。対照的に、インターフェロンで活性化され
る（Ｆｅｌｌｏｕｓら、１９８２；Ｒｏｓａら、１９８
３ｂ；Ｆｒｉｅｄｍａｎら、１９８４）ＨＬＡ遺伝子や
（Ｍａｌｉｓｓｅｎら１９８２；Ｓｃｈａｍｂｏｅｃｋ
ら、１９８３）ＩＩ遺伝子（ＫａｒｉｎとＲｉｃｈａｒ
ｄｓ、１９８２）は、この（２′−５′）オリゴＡシン
テターゼ遺伝子のプロモーターにおいて、なんら明らか
な配列関係を生じなかった。ＩＮＦ−β１の遺伝子本体
とは、やはり、有意な相同性はみられなかった。（２′
−５′）オリゴシンテターゼｍＲＮＡ（エクソン１，
２，及びエクソン３の１部）の翻訳されないリーダー
は、その位置がＦｉｇ．６に示されたような、Ｓ１分折
によって、仮に決定された２つの短いイントロンを含ん
でいる。全体のヒト（２′−５′）オリゴＡシンテター
ゼ遺伝子は、約１３ｋｂ（図９）であり、エクソンの総
計はｍＲＮＡｓの観察された大きさと一致している。 【００９１】例１０ （２′−５′）オリゴＡシンテターゼのラムダー−ＧＴ
１０ｃＤＮＡクローン ヒトＳＶ８０細胞のポリＡ＋ＲＮＡから調整したλｇｔ
１０ｃＤＮＡライブラリー（ＷｏｌｆとＲｏｔｔｅｒ、
１９８５）を、前に記述された（Ｍｅｒｌｉｎら、１９
８５）Ｅ１ｃＤＮＡプラスミッドＰｓｔｌ−Ｐｓｔ１イ
ンサートをプローブとしてスクリーニングした。１．６
ｋｂＥＲＮＡの３′の端に相当するインサート（Ｂｅｎ
ｅｃｈら、１９８５）を、アガロースゲル電気泳動によ
って精製し、ニック−トランスレーションを行なった。
（Ｒｉｇｂｙら、１９７７）。プラークを、９ｃｍのプ
レート（１０5 ファージ）から繰返し拾いあげ、小量の
λＤＮＡ調製物を、ルーチン法によって（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら、１９８２）制限マッピングによって解析した。 【００９２】Ｅ１ｃＤＮＡ断片をふくむ１５のλｇｔ１
０ ｃＤＮＡクローンが単離され、最も長いインサート
をもったファージ９−２と５−２を、ＥｃｏＲ１でき
り、インサートをｐＢＲ３２２にサブクローニングを行
ない、Ｆｉｇ．１ＡのＥ１６ｃＤＮＡクローン９−２１
と５−２１を得た。同じライブラリーが、１．８ｋｂＲ
ＮＡと特異的にハイブリッドを作る１断片であるファー
ジλｃｈＥ１（Ｂｅｎｅｃｈら、１９８５）からのヒト
遺伝子的Ｐｓｔ１−Ｐｓｔ１０．９ｋｂ断片についてス
クリーニングされた。その際、我々は、部分的にスプラ
イスを行なったＲＮＡを表している他のｃＤＮＡクロー
ンとともに、図１Ｂのλｇｔ１０ｃＤＮＡクローン４８
−１を単離した。配列決定は、ＭａｘａｍとＧｉｌｂｅ
ｒｔ（１９８０）に従って行なわれた。制限酵素は、Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓと、Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒからであった。ＰｕｓｔｅｌｌとＫａｆａｔ
ｏｓ（１９８２ａ，ｂ）の相同性マトリックスと、ハイ
ドロプロットコンピュータープログラムは、ＩＢＭＰＣ
で行なった。タンパクのコーディングフレームの位置を
決める３塩基の周期性は、Ｔｒｉｆｏｎｏｖ（１９８
４）に従って計算した。 【００９３】（２′−５′）オリゴシンテターゼ遺伝子
を含む遺伝子ＤＮＡのクローン ３つの重なりのある遺伝子のクローンが、以前に記述し
たように単離された（Ｂｅｎｅｃｈら、１９８５）。す
なわち、部分的にＥｃｏＲ１で切ったＤＮＡライブラリ
ーからの、λｃｈ Ｅ１（Ｍｏｒｙら、１９８１）と部
分的な、Ａｌｕ１／Ｈａｅ３ ＤＮＡライブラリー（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓら、１９７８）からのλｃｈＥ２とＥ３
である。これらのファージのＥｃｏＲ１遺伝子断片が、
ｐＢＲ３２２サブクローニングされた。エクソンマッピ
ングは、１）サブクローニングを行なった遺伝子断片の
制限酵素による分解物のサザンブロットを、種々のｃＤ
ＮＡプローブに、ハイブリッド形成を行なわせることに
より、２）遺伝子ＤＮＡの制限酵素断片を、記述されて
あるように（Ｂｅｎｅｃｈら、１９８５）ＩＦＮで処理
したが、処理していない細胞から、ポリＡ＋ＲＮＡのノ
ーザンブロットとハイブリット結合させることにより、
そして、３）ｃＤＮＡと比較して、イントロン−エクソ
ンの境界の配列を決めることによって行なった。 【００９４】ｍＲＮＡの５′末端を含む遺伝子４．２ｋ
ｂ ＥｃｏＲ１断片の内部のＳｐｈ１−Ｓｐｈ１ ０．
７８ｋｂ小片を配決定を行なう前にｐＢＲ３２２のＳｐ
ｈ１の位置にサブクローニングを行なった。ｍＲＮＡ
（Ｄｒ．Ｄ．Ｓｅｇｅｖ，Ｉｎｔｅｒｙｅｄａのおくり
もの）に相補的な１８−２０塩基の合成オリゴヌクレオ
チドを用いて、以前と同様にプライマー拡張を行なった
（Ｒｏｓｅら、１９８３ａ）。ＳＰ６ベクター中のサブ
クローニングの後、リボプロープの合成は、Ｐｒｏｍｅ
ｇａ Ｂｉｏｔｅｃの教えに従って行なった。Ｄａｕｄ
ｉリンパ芽球様細胞と、ＦＳ１１包皮繊維芽細胞からの
ＤＮＡは、Ｗｉｇｌｅｒら（１９７９）に従って調整
し、サザンブロットアナリシスは、製造者（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）によって推奨されている
ハイブリッド形成操作Ｂを用いてＧｅｎｅ−Ｓｃｒｅｅ
ｎ Ｐｌｕｓナイロンファイバー上で行なった。 【００９５】例１２ （２′−５′）オリゴＡシンテターゼのＲＮＡのインタ
ーフェロン作用の臨床モニター用の迅速セル・ブロット
・アッセイ （２′−５′）オリゴＡシンテターゼの測定の有用性
は、患者のインターフェロン−βに対する反応をモニタ
ーするため、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において
（Ｓｃｈａｔｔｎｅｒら、１９８１ａ）と、筋肉注射
（Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄら、１９８４）によって示され
た。正常な個人個人におけるＰＢＭＣの酵素レベルは、
どちらかというと一定であるからこのアッセイによっ
て、ＰＢＭＣや、顆粒球の酵素の増加（Ｓｃｈａｔｔｅ
ｒら、１９８１ｂ，１９８４；Ｓｃｈｏｎｆｅｌｄら、
１９８５）によって、証拠づけられるウイルスの感染の
診断が可能となった。酵素の減少は、様々な芽細胞に関
する急性白血病をもちつづける（Ｗａｌｌａｃｈら、１
９８２；Ｓｃｈａｔｔｎｅｒら、１９８２）。この技術
はまた、Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９８１）によって開拓
され、現在では、広く用いられている。 【００９６】シンテターゼＥは、すべての３種の型のイ
ンターフェロン、α，β，γによって処理された細胞で
強く誘導され、その増加は、インターフェロン活性のよ
いマーカーである（Ｗａｌｌａｃｈら、１９８２）。し
たがって、Ｅレベルの測定を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
または、ｉｎ ｖｉｖｏの細胞がインターフェロンに触
れ、それに反応するかどうかを決定することが可能であ
る。この測定は、該溶液に細胞をさらし、Ｅレベルの増
加を決定することによって、この測定をインターフェロ
ンのアッセイに用いることができる（Ｆｅｖｅｌら、
Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，３０２，５３３）こ
の測定は、また、インターフェロンが人をはじめとし
て、全生体中に増加して生産されるかどうかを確立する
ためにも用いられる。 【００９７】インターフェロン−βの自動的分泌作用の
結果として、造血性細胞の分化を通じて、（２′−
５′）オリゴＡシンテターゼは増加する（Ｙａｒｄｅｎ
ら、１９８４）。もう１つのＥ測定の重要な応用は、イ
ンターフェロン治療を行なっている患者のモニターを行
なうことにある。臨床的変化の外に、全身性のインター
フェロンβ処理と同様に、インターフェロンα処理によ
って５−１０倍増加するＰＢＭＣＥレベルを測定するこ
とによって、患者が、インターフェロンに反応している
ことを確立することが可能である（Ｓｃｈａｔｔｎｅｒ
ら、１９８１ａ；Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄら、１９８
４）。他のＩＦＮによって誘導された活性または分子
が、Ｅ酵素のアッセイと同様に用いられるかもしれな
い。しかし、この方法は、もっとも広く用いられてい
る。（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｂｏｒｄｅｎ）。 【００９８】さて、ヒトＰＢＭＣ中のＥＲＮＡのアッセ
イが同じ目的に使われる。９−２１ＥｃＤＮＡをプロー
ブとして用い、素早いセルブロットが（Ｃｈｅｌｅｙと
Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９８４）ＰＭＢＣについて開発さ
れた（図１４）。ＥｃＤＮＡから誘導したオリゴヌクレ
オチドも、プローブとして使うことができる。１０Ｕ／
ｍｌのインターフェロンの効果は、この方法で容易に検
出できる（図１５）１０7 単位／１日のインターフェロ
ンα−Ｃによって処理された患者において陽性の結果が
得られた。 【００９９】例１３ （２′−５′）オリゴＡシンテターゼに対する抗体の獲
得 天然の（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性分子に
対する抗体の誘導のための抗原として役立てるため、Ｅ
１６及びＥ１８の全アミノ酸配列が選ばれた。 ペプチドＢ： ＧＬＵ ＬＹＳ ＴＹＲ ＬＥＵ ＡＲＧ ＡＲＧ ＧＬＭ ＬＥＵ ＴＨＲ ＬＹＳ ＰＲＯ ＡＲＧ ＰＲＯ ＶＡＬ ＩＬＥ ＬＥＵ ＡＳＰ ＰＲＯ ＡＬＡ ＡＳＰ は、Ｅ１８とＥ１６配列に共通なアミノ酸２８４から３
０３迄を含んでいる。 ペプチドＣ： ＡＲＧ ＰＲＯ ＰＲＯ ＡＬＡ ＳＥＲ ＳＥＲ ＬＥＵ ＰＲＯ ＰＨＥ ＩＬＥ ＰＲＯ ＡＬＡ ＰＲＯ ＬＥＵ ＨＩＳ ＧＬＵ ＡＬＡ Ｅ１６（３４８から３６４迄の残基）のＣ末端を含んで
いる。両ペプチドともＢａｒａｎｙとＭｅｒｒｉｆｉｅ
ｌｄ（１９８０）の固相ペプチド合成法によって合成さ
れた。 【０１００】セファデックスＧ２５カラム上で２Ｍの酢
酸中で精製し、ペプチドはＫｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅ
ｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ．）
と結合した。ペプチドＣのアミノ末端アルギニンのアミ
ノ基を、Ｐ−アミノフェニール酢酸でエステル化するこ
とによって、そのアミノ末端を通じて、キャリアータン
パクと共軛ペプチド結合することができる（Ｓｐｉｒｅ
ｒら、１９７７）。ペプチドＢは、エチレンジアミンカ
ルボジイミド（ＨｏａｒｅとＫｏｓｈｌａｎｄ，１９６
７）によって、キャリヤータンパクとカップルさせた。
ラビットに完全なＦｒｅｕｎｄのアジュバンド中に乳化
させた１ｍｇのキャリヤーにカップしたペプチド（０．
２ｍｇの純粋なペプチドに相当する）を皮下注射した。
ラビットは２週間おきに２回強化注射により、不完全ア
ジュバンド中の０．５ｍｇのキャリヤーにカップルした
ペプチドを与え、最大の抗体反応が出るまで続けた。ラ
ビットの血清中の抗体の力価は、キャリヤーフリーのペ
プチドを用いて、エンザイムにリンクした、イミュノソ
ルベントアッセイ（Ｇｒｅｅｎら、１９８２）において
測定された。 【０１０１】例１４ 酵素を探知するための抗−（２′−５′）オリゴＡシン
テターゼ活性ペプチドの抗体の使用 インターフェロン処理のヒト細胞培養物の抽出物 繊維芽様細胞系ＳＶ８０と羊皮細胞系Ｗｉｓｈをプラス
チックでプレートでコンフルエンモノレイヤー培養を行
なった。Ｄａｕｄｉ細胞系は、サスペンジョンで、１．
５×１０6 細胞／ｍｌまで生育させた。培養液をｒＩＦ
Ｎ−β１，５００μ／ｍｌで１６−２４時間処理した。
ヒトｒＩＦＮ−β１は、遺伝子工学にかけたＣＨＯ細胞
によって生産され、モノクローナル抗体クロマトグラフ
ィーによって均一になるまで精製した（Ｃｈｅｒｎａｊ
ｏｖｓｋｙら、１９８４）。 【０１０２】細胞は、４℃で、燐酸緩衝液を含んだ食塩
水で２度洗い、緩衝液、即ち２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝
液、ｐＨ７、５．５ｍＭ酢酸マグネシウム、３０ｍＭβ
−メルカプトエタノール１００μＭフェニルメチルスル
フォニルフラロイド（ＰＭＳＦ）１０％グリセロール及
び０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＤ４０）中で
冷時融解した。核と、こわれていない細胞を１５００γ
で１０分間遠心分離して除いた。上澄（Ｓ１．５）をＥ
ｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ中で、ミトコン
ドリアとライソゾームのない上澄（Ｓ１５）を得るた
め、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ中で、１
５，０００γで１０分遠心分離した。タンパクの濃度
は、ミクロアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ１９７６）によ
って測定した。Ｂｅｃｋｍａｎｎ冷凍遠心器中で、Ｓ１
５を、１００，０００γで２時間遠心分離して細胞液
（Ｓ１０００）とミクロソーム（Ｐ１００）区分を調整
した。 【０１０３】例１５ （２′−５′）オリゴＡシンテターゼのアッセイ １−２μｇのタンパクを含むＳ１５の割当て量を２０μ
ｌの、２５ｍＭ Ｈｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．５、２０ｍ
Ｍｇ Ａｃｅｔａｔｅ，１ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅ
ｉｔｏｌ，１．５ｍＭ ＡＴＰ，４μＣｉの32Ｐ−α−
ＡＴＰ，５０μｇ／ｍｌ ｐｏｌｙ（ｒＩ）（ｒＣ）
（ＰＬ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌから）を含む反応液中
で３０℃２時間インキュベートした。５分間沸とうさせ
た後、Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ遠心分離した後、バクテリア
のアルカリ性ファスファターゼを２５０Ｕ／ｍｌを加
え、反応物を３７℃で２時間インキュベートした。２か
ら７μｌをＷｈａｔｍａｎｎ３ｍｍ濾紙にスポットし、
ピリジン酢酸中ｐＨ３．５で３，０００Ｖで電気泳動を
行なって分折した。オートラジオグラフィーで分折した
後、（Ａ２′ｐ）ｎＡオリゴマースポットを切出し、カ
ウントした。 【０１０４】例１６ 電気泳動−トランスファーインミュノブロット 粗細胞区分の一部分（３０μプロテイン）を、Ｌａｅｍ
ｍｌｉのナトリウム−ドデシル−サルフェート−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動ローディング緩衝液で調節し
（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）で１０分間沸騰してか
ら、７．５または、１０％ゲル上で電気泳動にかけた。
Ａｍｅｒｓｈａｍの14Ｃ−メチル化したタンパクを分子
量標準物質として用いた（１０4 ｃｐｍ）。ニトロセル
ローズペーパーへの電気泳動トランスファーは、（Ｓｃ
ｈｌｅｉｃｈｅｒ及びＳｃｈｕｌｌＥＡ８５）２５ｍＭ
トリスベース、１９２ｍＭグリシン及び２０％メタノー
ル中で行なわれた。ブロットを０．０９Ｍ ＮａＣｌ，
０．０１Ｍトリス−塩酸、ｐＨ７．５、１０％（ｖ／
ｖ）の１％ファットミルク溶液、１０％（ｖ／ｖ）の熱
で不活性化した仔牛胎児血清、そして、０．０５％トウ
イーン−２０、中で３７℃で２時間か、４℃で一夜、続
いて、３７℃で３０分予備的インキュベーションを行な
った。次に、ブロットは、ラビット１ｇＧ０．１ｍｇ／
ｍｌの形で、アンチ−（２′−５′）オリゴＡシンテタ
ーゼペプチドＢ抗体と２時間３７℃でインキュベートし
た。ブロットは、４％仔牛血清中で１０分間５回洗い、
１０6 ｃｐｍ／ｍｌのの 125Ｉ−タンパクＡ（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ，３０ｍｃｉ／ｍｇ）を含む完全な上記前イン
キュベーション混合物中で、３７℃で１時間インキュベ
ートし、ブロットを洗い、オートラヂオグラフィーにか
けた。 【０１０５】例１７ （２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性とラベルタン
パクの免疫沈澱 ５−１０μｌのアンチ−オリゴＡシンテターゼペプチド
Ｂラビット血清の最初の適量を、３％牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）とともに、ＰＢＳ中で平衡させた３ｍｇのタ
ンパクＡ−セファロース（ｐｈａｒｍａｃｉａ）に吸着
させ、３０分室温で、次にＰＢＳ−１％ＢＳＡで洗っ
た。（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ酵素活性の免
疫沈澱には、２μｇのＳ１５タンパクの適量を緩衝液Ａ
最終量２０μｌとして、上のペレットにした１ｇＧ−タ
ンパクＡセファローズに、２時間４℃で吸着させた。緩
衝液は、バッファーＡで５倍にうすめ、上澄液を別のチ
ューブに移した。ペレットを０．５ｍｌのバッファーＡ
で３回洗い、次に、２５μｌの酵素反応液中でけん濁さ
せた（上を見よ）。活性は、結合していない上澄の一部
についても測定を行なった。 【０１０６】（２′−５′）オリゴＡシンテターゼをラ
ベルするために、Ｗｉｓｈ細胞をコンフルエントモノレ
イヤー迄、３ｃｍのプラスチック皿で生育させ、１２時
間、５００Ｕ／ｍｌのｒＩＦＮ−β1 で処理した。培地
は、５００μＣｉの、35Ｓ−メチオニン（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ４００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）を含むメチオニンフリー
ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）で置き換え、細胞は、２時間イ
ンキュベートし、ＰＢＳで洗いバッフーＡでホモジナイ
ズした。Ｓ１５を免疫沈澱に用いた。約１０7ｃｐｍの
Ｓ１５タンパクをペレット状にしたタンパクＡ−セファ
ロースに加え４℃で２時間混合した。ビーズを１％ＢＳ
Ａ、１％ＮＰ４０、ＰＢＳ中の２Ｍ ＫＣｌで洗い、そ
して、ＰＢＳだけで２回洗った。サンプルをナトリウム
−ドデシル−サルフェート−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動によって解折した。 【０１０７】例１８ （２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性を検知するた
めの抗ペプチド抗体の使用 アンチ−（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性ペプ
チド抗体による（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活
性の免疫沈澱 抗血清Ｂは、Ｅ１６とＥ１８配列に共通なペプチドに対
して作り、一方、抗血清Ｃは、Ｅ１６においてのみ見出
されたペプチドに対して作った。我々は、これらの抗体
が、（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性を、特異
的に沈澱させるかどうかを確かめるために用いた。免疫
１ｇＧ−タンパクＡセファロース上に吸着した合成活性
と、上澄に残っている同活性は、免疫していないＩｇＧ
から得られた同じ分画と比較した。 【０１０８】１．６ｋｂ ＮＡ（Ｗｉｓｈ細胞）また
は、１．８ｋｂ ＲＮＡ（Ｄａｕｄｉｃｅｌｌ）を、優
先的に表している２つの細胞系からの抽出物を比較し
た。正常血清のバックグラウンドを差し引くことによ
り、抗−Ｂ、抗−Ｃに特異的に結合するものを評価でき
るようになる（図１６）。抗Ｃは、Ｗｉｓｈ細胞からの
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性を保持してい
たが、Ｄａｕｄｉ細胞からの活性は保持していなかっ
た。これは、これらの細胞にＥ１６ｍＲＮＡそして、４
０ｋｄタンパクが存在しないことと一致している（例１
９をみよ）。抗Ｂは、ＤａｕｄｉとＷｉｓｈの細胞抽出
物から（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性を吸着
した。クローニングを行なったｃＤＮＡｓから、引き出
したペプチドに対してつくられたアンチボディーは、従
って、特異的に異った（２′−５′）オリゴＡシンテタ
ーゼの形を認識する。 【０１０９】例１９ ヒト細胞からの（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活
性の異なる形のインミュノブロット分析 ペプチドＢに対する抗体を、ナトリウム−ドデシル−サ
ルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離
し、電気泳動的に、ニトロセルローズ紙にブロットされ
たヒト細胞の抽出物中の（２′−５′）オリゴＡシンテ
ターゼに特異的に結合する能力について調べた。インミ
ュノブロット中の抗体によって認識される存在の他に、
我々は、インターフェロン処理によって誘導される抽出
物中に存在する天然の（２′−５′）オリゴＡシンテタ
ーゼタンパクを期待している。そこで我々は、インミュ
ノタンパクによって明らかとなる誘導タンパクのみを調
べた（図１７）。 【０１１０】（２′−５′）オリゴＡシンテターゼｍＲ
ＮＡｓ（例１８をみよ）の表現のパターンの差のため
に、Ｄａｕｄｉ，Ｗｉｓｈ及びＳＶ８０の細胞系を比較
した（例１８をみよ）。抗体Ｂは、期待されたように、
Ｅ１８産物に大きさが類似している４５−４６ｋｄのタ
ンパクを、Ｄａｕｄｉ細胞中に検出し、Ｄａｕｄｉ細胞
中に発現されていないｍＲＮＡのＥ１６に相当すると考
えられる４０ｋｄを検出できない。対照的に、４０ｋｄ
Ｅ１６タンパクが、Ｗｉｓｈ細胞には存在し、これらの
細胞に、１．８ｋｂＲＮＡが存在していないことと一致
して、４６ｋｄＥ１８が存在しない。両方のタンパクと
もＳＶ８０細胞中に検出された。これらの結果は、ヒト
の細胞が、４０と４６ｋｄタンパクを生産し、そしてそ
れは、細胞がそれぞれ、１．６と１．８ｋｂＲＮＡｓを
表現する場合のみに起るということを、この結果は示し
ている。 【０１１１】抗−Ｂのインミュノブロットは、また、ヒ
トの細胞には（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの２
つの形のみならず、多分４つの形があることを明らかに
している。この事実は、インターフェロンによって誘導
される１００ｋｄと６７ｋｄの２つの他のタンパクを、
抗−Ｂが、４０と４６ｋｄのタンパクの外にはっきりと
検出したという事実から導き出せる。１００ｋｄはＤａ
ｕｄｉ細胞には検出されず、抗Ｂによって検出される大
きなタンパクも、やはり、細胞特異的なパターンで表現
されるということを示した。抗−Ｂが、天然の（２′−
５′）オリゴＡシンテターゼの形の配列から誘導された
ペプチドに対し作られ、インターフェロンによって、２
つのより大きいタンパクが誘導されるということから、
それらが（２′−５′）オリゴＡシンテターゼシステム
に属する可能性が非常に高い。これらが（２′−５′）
オリゴＡシンテターゼの形であることを確かめるため
に、我々は、ＳＶ８０の異なる細胞区分から、（２′−
５′）オリゴＡシンテターゼを精製した、そして平行し
て抗体Ｂによって検出されたタンパクを追跡した。 【０１１２】２つの異なる（２′−５′）オリゴＡシン
テターゼ活性型の分離 抗体Ｂによって探知された異なる２つのタンパクの分離
が、Ｆｉｇ．１８とＦｉｇ．１９に示してある４０ｋｄ
タンパクの大部分は、ＳＶ８０細胞からのＮＰ４０細胞
質抽出物の１００，０００ｇの上澄（Ｓ１００）中に残
っている。それは、低塩濃度では、ＤＥＡＥ−セルロー
ズには吸着されず、高濃度で吸着、溶出される。対照的
に、１００ｋｄタンパクは、Ｓ１００からのものに殆ど
存在せず、ミクロゾームペレット（Ｐ１００）に存在し
ており、それから、Ｎａ ｄｅｏｘｙ ｃｈｏｌａｔｅ
（ＤＯＣ）または０．５ＭＫＣｌによって溶解すること
ができる。このタンパクは、ＤＥＡＥ−セルローズに低
塩濃度に吸着し、高塩濃度で溶出される。６７ｋｄと４
５−４６ｋｄは、１部Ｓ１００に残っているが、比較的
ミクロゾームペレット中のｍｇタンパクあたりに比較的
濃縮されている。それらは、ミクロゾームからＤＯＣま
たは、ＫＣｌによって容易に抽出されにくいようであ
る。 【０１１３】グリセロールグリーディエント沈降によ
り、ＣＭ−セルローズ精製後Ｓ１００から精製した活性
は、４０ｋｄタンパクＥ１６の沈降と平行していること
がわかった。Ｐ１００から精製し、ＤＥＡＥ−セルロー
ズから溶出し、１００及び４６ｋｄタンパク類を含む分
画は、グリセロールグレーディエントで２つのピークに
わかれ、８０，０００及び４５，０００Ｍｒタンパクと
して沈澱した。重いピーク中の、（２′−５′）オリゴ
Ａシンテターゼは、１００ｋｄタンパクの存在と平行し
ている。 【０１１４】種々の（２′−５′）オリゴＡシンテター
ゼ活性型の異なる酵素的性質 グリセロールグレーディエントからの４０ｋｄタンパク
は、その活性に対する至適ｐＨが６．８であり、ｐＨ
７．８では２５％しか活性がない。さらに、ｐｏｌｙ
（ｒｌ）（ｒｃ）の濃度が１μｇ／ｍｌより低いと、４
０ｋｄ（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの活性は全
く認められず、最大活性には、５０−１００μｇ／ｍｌ
を必要とする（図２０）。同じ高いｄｓＲＮＡ要求性
が、Ｅ．ｃｏｌｉにおける組み換えＤＮＡ技術によって
作られた。Ｅ１６ｃＤＮＡ産物について見出された。 【０１１５】グリセロールグレーディエントの後１００
ｋｄタンパクは（２′−５′）オリゴＡシンテターゼに
ついての至適ｐＨは、７．６であり、酸性では活性がよ
り低い。それは、極度に低いｐｏｌｙ（ｒｌ）（ｒＣ）
の濃度あるいは、存在しない状態で、既に最大の活性を
有し、そして高濃度のｄｓＲＮＡで阻害さえ起る。これ
は、異なる（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの形が
それらの細胞質中の局在位置及び酵素的性質が違ってい
るため、異なる条件で使用されることを強く示唆してい
る。 【０１１６】多くの観察の結果、インターフェロンで誘
導された（２′−５′）オリゴＡシンテターゼは、（１
９８４年Ｒｅｖｅｌによって総説されている）その抗ウ
イルス効果に加えて２つの、みたところ反対の細胞生長
のフェーズ（セルサイクリングと成長の阻害）に関与し
ていることが示唆される。これは、複数の（２′−
５′）オリゴＡシンテターゼの型の問題と関係している
かもしれない。同調細胞培養において、我々は、（２′
−５′）オリゴＡシンテターゼが、セルサイクルタンパ
クとして作用することを観察した（Ｍａｌｌｕｃｃｉ
ら、１９８５）。このようにして、マウス胚芽の繊維芽
細胞の同調培養により、（２′−５′）オリゴＡシンテ
ターゼ活性と、（２′−５′）ＡシンテターゼｍＲＮＡ
が、Ｓ−期の終りに上昇し、細胞がＧ２期に進むと、そ
のＲＮＡと酵素活性が急速に消えることが示された。 【０１１７】抗マウスインターフェロン抗体は、オリゴ
シンテターゼ誘導を減少した。この系において、我々
は、Ｓ−フェーズにおいて蓄積する（２′−５′）オリ
ゴＡシンテターゼは、外生インターフェロンで処理した
とき、同じ細胞に蓄積する１．７ｋｂＲＮＡ種とは異っ
た大きな４−５ｋｂの転写物であることも観察した。こ
のことは、Ｓ−フェーズの（２′−５′）オリゴＡシン
テターゼは、外から加えたインターフェロンによって成
長を止められた細胞中のシンテターゼとは異なる形であ
ることを示唆している。その大きなｍＲＮＡのため、そ
れは、低いｄｓＲＮＡを要求する形である１００ｋｄに
近いものと思われる。抗−Ｂ抗体は、マウス細胞中に、
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの複数の型を検出
している。これらの観察は、（２′−５′）オリゴＡシ
ンテターゼの４つの型を別々にアッセイすることが出来
ることの利点を、わかり易く説明している。このシンテ
ターゼは、個々に、種々の生理的条件及び病気によって
変化しうる。 【０１１８】例２０ 抗−（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性ペプチド
抗体を（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性のイン
ミュノアッセイに使用すること 抗−Ｂ抗体は、（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの
すべての型を認識するので、それは、培養または直接患
者から得られたヒト細胞からの分別前の抽出物中におい
ての（２′−５′）オリゴＡシンテターゼのインミュノ
アッセイのために用いることができる。固相のラジオイ
ンミュノアッセイの例が、図２１に示される。インター
フェロンで処理してあるか、処理していないか、いずれ
のＷｉｓｈとＤａｕｄｉ ＣｅｌｌをＮＰ４０を含む、
ＢｕｆｆｅｒＡで融解し、上記の如く、ｍｉｃｒｏｆｕ
ｇｅ遠心で、Ｓ１５を調整した。１〜１０μｇのタンパ
クを含む１部をとり、直接にニトロセルローズペーパー
（もしくは、他のタンパク結合性紙）に適用し、そのシ
ートを、正規のインミュノブロット（図１９）に対する
場合のように抗−Ｂで処理した。 【０１１９】Ｆｉｇ．１１のオートラジオグラフィーが
示すように、 125Ｉ−タンパクＡは、インターフェロン
処理細胞から由来するサンプルのみと結合する。このア
ッセイは、ラベルタンパクＡを、パーオキシダーゼかβ
ガラクトシダーゼを共軛させた抗−ラビットＩｇＧと置
き換えることによって、エンザイム−リンクト−インミ
ュノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）の形でも使うことができる
のは明らかである。 【０１２０】（２′−５′）オリゴＡシンテターゼのイ
ンミュノアッセイは迅速であり、細胞抽出物調製に２０
分、抗−Ｅとタンパク−Ａ吸着及び洗浄に２時間であ
る。このアッセイは感度が高く、非常に少量の細胞抽出
物でも、その（２′−５′）オリゴＡシンテターゼレベ
ルを測るのに十分である。それは特異性があり、インタ
ーフェロン処理をしていない細胞においては、全くシグ
ナルが表れない。 【０１２１】例２１ 細胞中の（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの免疫蛍
光顕微鏡法 酵素的アッセイによって、ウイルスに感染した患者の末
梢血単核細胞において、（２′−５′）オリゴＡシンテ
ターゼが上昇することが確立された（前の研究をみ
よ）。抗−（２′−５′）オリゴＡシンテターゼペプチ
ド抗体は、細胞一般、特に白血球中の（２′−５′）オ
リゴＡシンテターゼの上昇を探知するために、抗−
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼを免疫蛍光顕微鏡
法の形で用いることができる。 【０１２２】健康な供血者及び急性ウイルス疾患をもっ
た患者から血液（２ｍｌ）を採血した。単核血液細胞を
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（ファルマシア）遠心に
よって分離し、カバーグラスの上に、直接かまたはサイ
トスピンミクロフュージ（ミクロヘマトクリット）を用
いてひろげた。細胞をＰＢＳで洗い、３％フォルムアル
デヒト常温で３０分間固定し、ＰＢＳですすぎ、Ｈａｎ
ｋの塩中で０．５％Ｔｒｉｒｏｎ−Ｘ１００で５分間処
理し、再びＰＢＳとＰＢＳ−２％ゼラチンですすいだ。
次に、ＰＢＳゼラチンで１：５に稀釈した抗Ｂ血清４０
μｌの小滴をパラフィルム上に加え、カバーグラスを重
ね、インキュベートした。室温で６０分後、カバーグラ
スＰＢＳ−ゼラチン及び１：２０に稀釈したＦＩＩＣ共
軛抗−ラビットＩｇＧ（Ｂｉｏｙｅｄａ）中ですすぎ、
パラフィルム操作にかけた。室温で２０分たってから、
カバーグラスをＰＢＳ−ゼラチンで２回洗い、次に水で
洗い、Ｍｉｖｉｏｌ ４−８８（ヘキスト）−グリセロ
ール（２．５ｇＭｏｖｉｏｌ，６ｇグリセロール及び１
２ｍｌの０．２Ｍトリス塩酸ｐＨ８．５を加えた水６ｍ
ｌ、５０℃でインキュベートし、５，０００ｇで１５分
沈澱物をのぞいたもの）とともに、顕微鏡スライド状に
マウントする。同時に、抗−Ｂの代りに、正常のラビッ
トの血清を用いてカバーグラスを処理した。スライドを
ツアイス蛍光顕微鏡で観察し、３０秒の露出で、ポロラ
イドフィルムに写した。 【０１２３】Ｆｉｇ．２２は、リンパ球が、ウイルスの
感染患者からの血液サンプル中においては、抗−（２′
−５′）オリゴ−シンテターゼで染まり、健康な供血サ
ンプルでは染まらず、マクロファージと顆粒球だけに弱
い蛍光がみられるにすぎないことを示している。正常の
血清は、リンパ球を染めないが、マクロファージまたは
顆粒球においても、低いバックグラウンドを与える。従
って、本抗−（２′−５′）オリゴＡシンテターゼペプ
チド抗体は、細胞が、インターフェロンと反応して、
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼを蓄積したかどう
かを評価するために、培養、血液組織片中の細胞の顕微
鏡的観察に用いることができる。 【０１２４】【０１２５】【０１２６】【０１２７】【０１２８】【０１２９】【０１３０】【０１３１】【０１３２】【０１３３】【０１３４】【０１３５】【０１３６】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、（２′−５′）オリゴＡ合成酵素Ｅ1
ｃＤＮＡクローン１７４−３の構造と配列を示す。 【図２】図２は、ＳＶ８０及びＮａｍａｌｖａ細胞中の
Ｅ1 特異性ｍＲＮＡの大きさ及び誘導を示す。 【図３】図３は、ＩＦＮ−誘導ｍＲＮＡのための保有ｃ
ＤＮＡの、組換えプラスミドクローンＣ56のＲＮＡのブ
ロットとハイブリッドを形成することによる、特性決定
を示す。 【図４】図４は、部分的制限地図及び挿入Ｃ56４５０ｂ
ｐのヌクレオチド配列を示す。 【図５】図５は、ＩＦＮによるＣ56ｍＲＮＡの誘導の時
間経過を示す。 【図６】図６Ａは１．６ｋｂのｃＤＮＡ地図である。図
６Ｂは１．８ｋｂのｃＤＮＡ地図である。 【図７】図７Ａは１．６ｋｂに対するｃＤＮＡの塩基配
列を示す。図７Ｂは１．８ｋｂに対するｃＤＮＡの塩基
配列を示す。 【図８】図８は、２個の（２′−５′）オリゴＡ合成酵
素のＣ−末端のハイドロパシープロットを示している。 【図９】図９は、ヒト（２′−５′）オリゴ合成酵素遺
伝子の制限地図を示している。 【図１０】図１０は、ヒト（２′−５′）オリゴ合成酵
素遺伝子のプロモーター領域を示している。 【図１１】図１１は、ヒト（２′−５′）オリゴＡシン
セターゼプロモーター領域の塩基配列を示している。 【図１２】図１２は、（２′−５′）オリゴＡ合成酵素
の免疫沈降反応を示している。 【図１３】図１３は、Ｅ．ＣｏｌｉにおけるＥ１６ｃＤ
ＮＡの発現を示している。 【図１４】図１４はヒト末梢白血球中の（２′−５′）
オリゴＡシンセターゼＲＮＡの迅速なアッセイ法を示し
ている。 【図１５】図１５は、ヒトＰＢＭＣの（２′−５′）オ
リゴシンセターゼＥＲＮＡに対するに対するクイックセ
ルブロットを示している。 【図１６】図１６は、抗ペプチド抗原による（２′−
５′）Ａ合成酵素活性の特異免疫沈降反応を示してい
る。 【図１７】図１７は、ヒト細胞とサブフラクションにお
ける（２′−５′）Ａ合成酵素の異型を示している。 【図１８】図１８は、ＳＶ８０細胞中の（２′−５′）
Ａ合成酵素の諸型を示している。 【図１９】図１９は、２′−５′Ａ合成酵素の４型の分
析と細胞内の位置を示している。 【図２０】図２０は、ＳＶ８０由来の（２′−５′）オ
リゴＡシンセターゼの諸型の二重螺線ＲＮＡ要求性を示
している。 【図２１】図２１は（２′−５′）オリゴＡシンセター
ゼのラジオインミユノアッセイを示している。 【図２２】図２２は末梢血液単核細胞と抗ＯＡＳＥ血清
の免疫抗体蛍光染色によるウイルス性疾患の診断を示し
ている。
ｃＤＮＡクローン１７４−３の構造と配列を示す。 【図２】図２は、ＳＶ８０及びＮａｍａｌｖａ細胞中の
Ｅ1 特異性ｍＲＮＡの大きさ及び誘導を示す。 【図３】図３は、ＩＦＮ−誘導ｍＲＮＡのための保有ｃ
ＤＮＡの、組換えプラスミドクローンＣ56のＲＮＡのブ
ロットとハイブリッドを形成することによる、特性決定
を示す。 【図４】図４は、部分的制限地図及び挿入Ｃ56４５０ｂ
ｐのヌクレオチド配列を示す。 【図５】図５は、ＩＦＮによるＣ56ｍＲＮＡの誘導の時
間経過を示す。 【図６】図６Ａは１．６ｋｂのｃＤＮＡ地図である。図
６Ｂは１．８ｋｂのｃＤＮＡ地図である。 【図７】図７Ａは１．６ｋｂに対するｃＤＮＡの塩基配
列を示す。図７Ｂは１．８ｋｂに対するｃＤＮＡの塩基
配列を示す。 【図８】図８は、２個の（２′−５′）オリゴＡ合成酵
素のＣ−末端のハイドロパシープロットを示している。 【図９】図９は、ヒト（２′−５′）オリゴ合成酵素遺
伝子の制限地図を示している。 【図１０】図１０は、ヒト（２′−５′）オリゴ合成酵
素遺伝子のプロモーター領域を示している。 【図１１】図１１は、ヒト（２′−５′）オリゴＡシン
セターゼプロモーター領域の塩基配列を示している。 【図１２】図１２は、（２′−５′）オリゴＡ合成酵素
の免疫沈降反応を示している。 【図１３】図１３は、Ｅ．ＣｏｌｉにおけるＥ１６ｃＤ
ＮＡの発現を示している。 【図１４】図１４はヒト末梢白血球中の（２′−５′）
オリゴＡシンセターゼＲＮＡの迅速なアッセイ法を示し
ている。 【図１５】図１５は、ヒトＰＢＭＣの（２′−５′）オ
リゴシンセターゼＥＲＮＡに対するに対するクイックセ
ルブロットを示している。 【図１６】図１６は、抗ペプチド抗原による（２′−
５′）Ａ合成酵素活性の特異免疫沈降反応を示してい
る。 【図１７】図１７は、ヒト細胞とサブフラクションにお
ける（２′−５′）Ａ合成酵素の異型を示している。 【図１８】図１８は、ＳＶ８０細胞中の（２′−５′）
Ａ合成酵素の諸型を示している。 【図１９】図１９は、２′−５′Ａ合成酵素の４型の分
析と細胞内の位置を示している。 【図２０】図２０は、ＳＶ８０由来の（２′−５′）オ
リゴＡシンセターゼの諸型の二重螺線ＲＮＡ要求性を示
している。 【図２１】図２１は（２′−５′）オリゴＡシンセター
ゼのラジオインミユノアッセイを示している。 【図２２】図２２は末梢血液単核細胞と抗ＯＡＳＥ血清
の免疫抗体蛍光染色によるウイルス性疾患の診断を示し
ている。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｐ
33/573 33/573 Ａ
// Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ
Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｑ 1/25
Ｃ１２Ｑ 1/25 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
(Ｃ１２Ｎ 9/16
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(56)参考文献 ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ
ＥＡＲＣＨ，13（４）（1985），Ｐ.
1267−1281
ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣ
Ｉ．ＵＳＡ，80（16）（1983），Ｐ.
4904−4908
(58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名)
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．（２′−５′）オリゴＡ合成酵素の４つの型，４０
ＫＤ，４６ＫＤ，６７ＫＤ及び１００ＫＤのすべてに結
合する抗体。 ２．ペプチドＢで動物を免疫することにより得られた抗
体である、請求項第１項に記載の抗体。 ３．標識とコンジュゲートしていて標識抗体を形成して
いる請求項第１項に記載の抗体。 ４．その標識が蛍光体標識である、請求項第３項に記載
の抗体。 ５．その標識が放射活性標識である、請求項第３項に記
載の抗体。 ６．その標識が酵素である、請求項第３項に記載の抗
体。 ７．（２′−５′）オリゴＡ合成酵素の４つの型，４０
ＫＤ，４６ＫＤ，６７ＫＤ及び１００ＫＤのすべてに結
合する抗体であって放射活性標識とコンジュゲートして
いる標識抗体とともに細胞を培養し、該標識により、当
該型の（２′−５′）オリゴＡ合成酵素活性をもつ細胞
を検知することを特徴とする細胞の中の（２′−５′）
オリゴＡ合成酵素の４０ＫＤ，４６ＫＤ，６７ＫＤ及び
１００ＫＤの型の検査法。 ８．その分析が蛍光免疫検査法である、請求項第７項に
記載の検査法。 ９．その分析は放射線免疫検定法である、請求項第７項
に記載の検査法。 １０．その分析は酵素免疫検査法でなされる、請求項第
７項に記載の検査法。 １１．その細胞が単核血液細胞である、請求項第７項に
記載の検査法。 １２．（２′−５′）オリゴＡ合成酵素の４つの型、４
０ＫＤ，４６ＫＤ，６７ＫＤ及び１００ＫＤのすべてに
結合する抗体であって、標識とコンジュゲートしていて
標識抗体を形成している抗体を含む、細胞中の（２′−
５′）オリゴＡ合成酵素の４つの型すべての検出用キッ
ト。 １３．予め定められた間隔で、被験者の細胞あるいは体
液中の（２′−５′）オリゴＡ合成酵素量を測定し、相
異する時間間隔以内での被験者の細胞あるいは体液中の
該合成酵素量における相異を決定し、 その合成酵素量が、それと共に複合体を生成するよう
に、（２′−５′）オリゴＡ合成酵素の４つの型、４０
ＫＤ，４６ＫＤ，６７ＫＤ及び１００ＫＤのすべてに結
合する抗体と合成酵素を接触させることにより、またそ
のように生成された複合体の量を決定することによっ
て、被験者の細胞あるいは体液中の合成酵素量を、また
それによって被験者のインターフェロン活性を測定する
ことを特徴とする、被験者中のインターフェロン活性を
モニターする方法。 １４．さらに、インターフェロンの攻撃にさらされた細
胞あるいは体液から（２′−５′）オリゴＡ合成酵素を
抽出し，標識合成酵素を生成するために抽出酵素を確認
し得る標識で標識し，標識−合成酵素−抗体複合体を生
成するように適切な条件下で標識合成酵素を抗体と接触
させ、複合体中の標識を検出すること及びそれによって
合成酵素を検出することを特徴とする、請求項第１３項
に記載の方法。 １５．その標識が３５Ｓ−メチオニンである、請求項第
１４項に記載の方法。 １６．（２′−５′）オリゴＡ合成酵素の４つの型、４
０ＫＤ，４６ＫＤ，６７ＫＤ及び１００ＫＤのすべてに
結合する抗体，合成酵素を抽出するための材料，合成酵
素を標識するための材料，及び合成酵素量を測定する際
の標識を検出するための材料からなる、被験者中のイン
ターフェロン活性をモニターするためのキット。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL76233 | 1985-08-26 | ||
| IL7623385A IL76233A (en) | 1985-08-28 | 1985-08-28 | DNA molecules coding for an enyzme having (2'-5') oligo a synthetase activity, expression vectors comprising them, microorganisms transfected by thevectors, and amino acid sequences corresponding to the DNA molecules |
| IL78445 | 1986-04-08 | ||
| IL7844586A IL78445A (en) | 1986-04-08 | 1986-04-08 | Antibodies to subtypes of (2'-5') oligo-a-synthetase, an assay for said subtypes, and a method and kit for monitoring interferon activity |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61202614A Division JP2653653B2 (ja) | 1985-08-28 | 1986-08-28 | インターフエロン誘起遺伝子及び酵素 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9225181A Division JPH1084962A (ja) | 1985-08-28 | 1997-08-21 | インターフェロン誘起遺伝子及び酵素 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07278199A JPH07278199A (ja) | 1995-10-24 |
| JP2798240B2 true JP2798240B2 (ja) | 1998-09-17 |
Family
ID=26321471
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|---|---|---|---|
| JP61202614A Expired - Lifetime JP2653653B2 (ja) | 1985-08-28 | 1986-08-28 | インターフエロン誘起遺伝子及び酵素 |
| JP7045586A Expired - Lifetime JP2798240B2 (ja) | 1985-08-28 | 1995-03-06 | インターフェロン誘起遺伝子及び酵素 |
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| JP9225181A Pending JPH1084962A (ja) | 1985-08-28 | 1997-08-21 | インターフェロン誘起遺伝子及び酵素 |
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|---|---|---|---|
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| JP9225181A Pending JPH1084962A (ja) | 1985-08-28 | 1997-08-21 | インターフェロン誘起遺伝子及び酵素 |
Country Status (5)
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|---|---|
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| EP (1) | EP0217102B1 (ja) |
| JP (4) | JP2653653B2 (ja) |
| AU (1) | AU597268B2 (ja) |
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| AU686005B2 (en) * | 1994-09-14 | 1998-01-29 | Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education | 2',5' phosphorothioate/phosphodiester oligoadenylates and antiviral uses thereof |
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| WO2008021431A2 (en) | 2006-08-14 | 2008-02-21 | Xdx, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring the status of transplant rejection and immune disorders |
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- 1986-08-21 DE DE8686111585T patent/DE3683335D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-21 EP EP86111585A patent/EP0217102B1/en not_active Expired
- 1986-08-21 DE DE198686111585T patent/DE217102T1/de active Pending
- 1986-08-27 AU AU61896/86A patent/AU597268B2/en not_active Expired
- 1986-08-28 JP JP61202614A patent/JP2653653B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-04-08 US US07/036,104 patent/US5071963A/en not_active Expired - Lifetime
-
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- 1995-03-06 JP JP7045586A patent/JP2798240B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
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- 1996-07-24 JP JP8225793A patent/JPH09121852A/ja active Pending
-
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，１３（４）（１９８５），Ｐ．１２６７−１２８１ |
| ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ，８０（１６）（１９８３），Ｐ．４９０４−４９０８ |
Also Published As
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| DE3683335D1 (de) | 1992-02-20 |
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