JP2005253385A - 転写因子結合領域導入プロモータを含む発現ベクター及び転写因子重発現システムによる遺伝子発現方法 - Google Patents
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Abstract
真核生物やウイルス由来のプロモータの近接領域(flanking region)に転写因子結合領域を導入して転写能力を増強する。
【解決手段】
1又は数個の転写因子結合領域が付加された修飾プロモータと、前記プロモータと機能的に連結された所望の遺伝子とを含む発現ベクターを提供する。さらに当該転写因子結合領域に結合する転写因子をコードする核酸配列を導入することで、正の転写制御フィードバックループを形成させて転写量を増幅することができる。
【選択図】
なし
Description
また、本発明の他の目的は、所望の遺伝子を複数個含む発現系を構築し、宿主細胞における発現効率を上げることを目的とする。
(a)配列番号1〜6の何れか一つに記載の塩基配列からなるDNA
(b)(a)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ転写因子結合能を有するDNA。
(2)前記修飾プロモータが、以下の(a)又は(b)のDNAからなる(1)に記載の発現ベクター:
(a)配列番号7〜13の何れか一つに記載の塩基配列からなるDNA
(b)(a)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインターフェロンに対して至適化されたDNA。
(3)転写因子をコードする核酸配列をさらに含む(1)又は(2)に記載の発現ベクター。
(4)前記転写因子をコードする核酸配列が内部リボソーム結合サイト(IRES)と機能的に連結され、かつ前記修飾プロモータによって発現される所望の遺伝子の下流に、二重シストロンを形成するように構築される(3)に記載の発現ベクター。
(5)1種又は2種以上のプロモータと機能的に連結された1種又は2種以上の所望の遺伝子を複数個含む発現ベクターであって、前記複数の遺伝子がそれぞれプロモータを有するか、又は前記複数の遺伝子のうち少なくとも1つが内部リボソーム結合サイトを介して他の遺伝子と連結された多重シストロンを形成することを特徴とする発現ベクター。
(6)前記少なくとも1種のプロモータが、1又は数個の転写因子結合領域が付加された修飾プロモータであって、前記転写因子結合領域が、以下の(a)又は(b)のDNAからなることを特徴とする(5)に記載の発現ベクター:
(a)配列番号1〜6の何れか一つに記載の塩基配列からなるDNA
(b)(a)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ転写因子結合能を有するDNA。
(7)1又は数個の転写因子結合領域が付加された修飾プロモータと、前記プロモータと機能的に連結されるように所望の遺伝子を導入するためのマルチクローニングサイトとを含む異種遺伝子発現用組換えベクターであって、前記転写因子結合領域が、以下の(a)又は(b)のDNAからなることを特徴とする組換えベクター:
(a)配列番号1〜6の何れか一つに記載の塩基配列からなるDNA
(b)(a)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ転写因子結合能を有するDNA。
(8)前記修飾プロモータが、以下の(a)又は(b)のDNAからなる(7)に記載のベクター:
(a)配列番号7〜13の何れか一つに記載の塩基配列からなるDNA
(b)(a)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインターフェロンに対して至適化されたDNA。
(9)転写因子をコードする核酸配列をさらに含む(7)又は(8)に記載のベクター。
(10)前記転写因子をコードする核酸配列と機能的に連結された内部リボソーム結合サイト(IRES)をさらに含む(9)に記載のベクター。
(11)1又は数個の転写因子結合領域が付加された修飾プロモータと機能的に連結された所望の遺伝子と、転写因子をコードする核酸配列とを、宿主細胞内で同時に発現させる工程を含み、前記転写因子が前記修飾プロモータの転写活性を増強することを特徴とする遺伝子発現方法。
(12)(1)〜(4)及び(6)の何れか一つに記載の発現ベクターを用いる(11)に記載の方法。
(13)前記所望の遺伝子と前記修飾プロモータの間にイントロンAが介在することを特徴とする(11)又は(12)に記載の方法。
(14)前記転写因子が、NFκB転写因子のp65サブユニット、AP−1、インターフェロン制御因子(IRF)又はそれらの活性型変異体である(11)〜(13)の何れか一つに記載の方法。
(15)前記転写因子の発現を制御するプロモータの当該転写因子への反応性が、前記修飾プロモータよりも低いことを特徴とする(11)〜(14)の何れか一つに記載の方法。
(16)(1)〜(6)の何れか一つに記載の発現ベクターと薬理的に許容される担体とを含むことを特徴とする医薬組成物。
(17)抗原特異的免疫応答の誘導、又は遺伝子治療を目的として投与されるDNAである(16)に記載の医薬組成物。
(18)(1)〜(6)の何れか一つに記載の発現ベクターにより形質転換されたことを特徴とする細胞。
一つの実施形態において、本発明の発現ベクターは、1又は複数の転写因子結合領域が付加された修飾プロモータと、前記プロモータと機能的に連結された所望の遺伝子とを含む。本明細書において「転写因子」とは、転写反応を制御するタンパク質性因子であって、DNA上のプロモータ領域に対して塩基配列特異的に結合し、或いはDNAに結合した転写因子が互いに特異的に相互作用することを通じて転写の調節を行う因子である。好ましくは、RNAポリメラーゼによるRNA合成の際に遺伝子の上流プロモータ部位やエンハンサ部位の特定の塩基配列に結合して、転写を促進又は抑制する因子であり、例えば、Sp1、Ap−1(原がん遺伝子産物JunとFosの複合体)、NFκB、MyoD、ホメオドメイン、熱ショックに関係するHSF、ステロイドホルモン受容体等が挙げられる。本発明において、前記転写因子が結合する特異的な塩基配列を「転写因子結合領域(モチーフ)」と称し、それぞれの転写因子によって特異的な塩基配列を有するDNAのある領域のことを意味する。具体的には、例えば、インターフェロンβプロモータ(IFNβpromoter;配列番号1)、4×GAS(Interferon gamma active site)モチーフ(配列番号2)、5×IFRE(Interferon regulatory element)モチーフ(配列番号3)、5×ISRE(Interferon stimulated response element)モチーフ(配列番号4)、5×NFκBモチーフ(配列番号5)、及び7×AP−1モチーフ(配列番号6)等が挙げられる。
本発明の遺伝子発現方法は、上記発現ベクターを宿主細胞に導入することによって行う。発現させたい所望の遺伝子と転写因子をコードする核酸配列は同一のDNA上に構築されていても、或いは別々のDNAとして構築し同一の宿主細胞内にコトランスフェクション(共形質転換)してもよい。コトランスフェクションする場合は、それぞれのベクターDNAの量比を変えることにより所望の遺伝子発現量を最適化することができる。このベクターDNAの量比は、用いる宿主細胞の種類によって最適となるように適宜調整される。
本発明の発現ベクターは、宿主細胞を形質転換することができ、得られた形質転換細胞を培養することによって本発明の発現ベクター及びそれによって発現される所望の遺伝子産物を製造することができる。ここで、宿主としては、本発明の発現ベクターを複製及び維持できるものであれば特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌(Escherichia coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)等の細菌や、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母、さらにCOS細胞、CHO細胞等の動物細胞、或いはSf9、Sf21等の昆虫細胞を用いることができる。
本発明の発現ベクターは、所望の遺伝子を宿主細胞内で発現させることができるから、これら遺伝子産物、例えば、サイトカイン、成長因子、レセプターサイトカイン又は成長因子、抗体又はその断片、ホルモン、神経ペプチド、酵素及び糖タンパク質等の生理活性に基づく医薬組成物として用いることができる。本発明の医薬組成物は、経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる。
本発明の発現ベクターは、pGAベクター(Ross, TM et al. Nature Immunology vol.1 p127-131, 2000参照)由来のヒトサイトメガロウイルスIEプロモータ/エンハンサの5’近接領域(flanking region)に部位特異的変異導入法により固有の制限酵素部位を複数設置し、その制限酵素部位を使用して転写因子結合領域を導入して構築した。図1は、そのようなCMVプロモータ領域の一つの塩基配列を示したものであって、図1(a)には転写因子結合領域を導入するために用いる制限酵素切断部位が示される。図1(a)に示したサイト1〜4の何れかにそれぞれの制限酵素を用いて本発明に係る転写因子結合領域を導入した。例えば、サイト3にインターフェロンβプロモータを導入したものを「プロモータB」と称する。同様に、サイト2と3にインターフェロンβプロモータを導入したものを「プロモータBB」又は「プロモータ2×B」と、サイト1、2及び3にインターフェロンβプロモータを導入したものを「プロモータBBB」又は「プロモータ3×B」と称する。この「プロモータBBB」の構造を図2に示した。
測定が容易で、高感度でバックグラウンドが低い。測定のダイナミックレンジが広い等の好ましい特徴を備えている。後述するインビトロの実験ではほとんどがこのレポーター遺伝子を使用した。欠点として、遺伝子産物(ルシフェラーゼタンパク)は細胞内にとどまるので、インビボで実験する場合、遺伝子導入した臓器を抽出し、抽出液を調製して測定しなければならない。従って、同一個体で経時的に測定することは難しい。
感度やバックグラウンド、ダイナミックレンジ等の点でFFLに劣るが、FFLと同一の測定系で、FFLとの交叉反応なく測定可能という利点がある。従って、異なる転写制御下にある(違ったプロモータの下流に置かれた)2種のインサートの遺伝子発現量を同時に測定する際にRNLを使用した。或いは、陰性コントロールのインサートとして使用した場合もある。
感度、ダイナミックレンジ共にFFLに劣るが、遺伝子産物(SEAPタンパク)は細胞外に分泌されるので、導入細胞を破壊することなく経時的に遺伝子発現量を測定できる利点がある。従って、インビボの実験では動物を生かしたまま採血し、血漿中のSEAPを測定することで同一個体で経時的変化を追うことが可能となる。
本実施例では陰性コントロールのインサートとして用いた。
上記のようにして作製した各種修飾プロモータの下流にレポータ遺伝子を挿入した発現プラスミドを用いて、更に、多重プロモータプラスミドを構築した。プラスミドの多重接合は以下の要領で行った。接合したい二つのプラスミドのうち、ひとつを供与体プラスミド、もう一方を受容体プラスミドとする。部位特異的変異導入法により供与体プラスミドのプロモータの5’側近傍とポリアデニレーションシグナルの3’側近傍にユニークな制限酵素部位を設置した。図8では一例としてNotIとPvuIを示してあるが、供与体、受容体いずれにおいてもユニークな制限酵素であれば何を選んでもよい。これに対応して受容体プラスミドのポリアデニレーションシグナルの3’側近傍にNotIとPvuI部位を新たに設置した。供与体、受容体双方のプラスミドをNotIとPvuIで消化して、供与体から切り出した発現カセットを受容体のNotIとPvuI部位の間に導入した。こうして二重プロモータプラスミドを作製した(図8参照)。
IRESを利用した二重シストロン発現系は以下の要領で作成する。例えば、BD-Clontech社より市販されているpIRESベクター(図10a)等からCMVプロモータ(1-750)を実施例1で作製した種々の修飾プロモータで置換する。所望の遺伝子をマルチプルクローニングサイトMCS Aに導入し、さらにプロモータに増設した転写因子結合部位に対応する転写因子をコードするDNAをMCS Bに導入することにより簡便に作製することができる。本実施例において実際に行った方法を具体的に説明すると、図10cに示すプラスミドSS376のMCS (イントロンAとIRESの間)に所望の遺伝子を挿入し、また、図10bに示すプラスミドSS359のMCSに修飾プロモータに設置した転写因子結合部位に対応する転写因子をコードするDNAを挿入した。SS359をEcoRIで消化して転写因子をコードするDNAを切り出して、EcoRIで開裂させたSS376に導入した。
実施例3の要領で作成された二重シストロン発現ベクターを実施例2の要領で接合すれば、多重シストロン発現ベクターが構築できる。図11には、二つの二重シストロン発現ベクターを接合して出来た四重シストロン発現ベクターを示すが、実施例2に示した要領で発現カセットを更に増設すれば、六重シストロン、八重シストロン等々の発現ベクターも作製できる。
実施例1〜4に記載した方法によって作製した種々の発現ベクターを培養細胞にトランスフェクトして、細胞内に発現した遺伝子量を測定した。場合によっては、対応する転写因子の発現プラスミドやインターフェロンを培地に加えた。遺伝子発現量は、プロモーターの転写活性に正比例するため、高レベルの遺伝子発現がみられたプロモータは強いプロモータであると言える。
実施例1〜4に記載した方法によって作製した種々の発現ベクターを動物に投与して遺伝子導入を行った。対象臓器と方法は以下の通りである。
1)筋肉(大腿四頭筋):エレクトロポレーション法
筋肉を露出して、直視下にプラスミド溶液を注射し、その部位に通電して細胞膜に電気刺激による微少穿孔を起こしてプラスミドの細胞内到達を促進する。
2)肝臓:大容量高速静注法
ポリマーと混合した大量のプラスミド溶液を尾静脈から高速で注入し、下大静脈に鬱滞させて、肝静脈から逆行性に肝臓に到達させて遺伝子導入する。実施例5の場合と同様に、遺伝子発現量を測定することで、プロモータの転写活性を評価する。
Claims (18)
- 1又は数個の転写因子結合領域が付加された修飾プロモータと、前記プロモータと機能的に連結された所望の遺伝子とを含む発現ベクターであって、前記転写因子結合領域が、以下の(a)又は(b)のDNAからなることを特徴とする発現ベクター:
(a)配列番号1〜6の何れか一つに記載の塩基配列からなるDNA
(b)(a)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ転写因子結合能を有するDNA。 - 前記修飾プロモータが、以下の(a)又は(b)のDNAからなる請求項1に記載の発現ベクター:
(a)配列番号7〜13の何れか一つに記載の塩基配列からなるDNA
(b)(a)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインターフェロンに対して至適化されたDNA。 - 転写因子をコードする核酸配列をさらに含む請求項1又は2に記載の発現ベクター。
- 前記転写因子をコードする核酸配列が内部リボソーム結合サイト(IRES)と機能的に連結され、かつ前記修飾プロモータによって発現される所望の遺伝子の下流に二重シストロンを形成するように構築される請求項3に記載の発現ベクター。
- 1種又は2種以上のプロモータと機能的に連結された1種又は2種以上の所望の遺伝子を複数個含む発現ベクターであって、前記複数の遺伝子がそれぞれプロモータを有するか、又は前記複数の遺伝子のうち少なくとも1つが内部リボソーム結合サイトを介して他の遺伝子と連結された多重シストロンを形成することを特徴とする発現ベクター。
- 前記少なくとも1種のプロモータが、1又は数個の転写因子結合領域が付加された修飾プロモータであって、前記転写因子結合領域が、以下の(a)又は(b)のDNAからなることを特徴とする請求項5に記載の発現ベクター:
(a)配列番号1〜6の何れか一つに記載の塩基配列からなるDNA
(b)(a)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ転写因子結合能を有するDNA。 - 1又は数個の転写因子結合領域が付加された修飾プロモータと、前記プロモータと機能的に連結されるように所望の遺伝子を導入するためのマルチクローニングサイトとを含む異種遺伝子発現用組換えベクターであって、前記転写因子結合領域が、以下の(a)又は(b)のDNAからなることを特徴とする組換えベクター:
(a)配列番号1〜6の何れか一つに記載の塩基配列からなるDNA
(b)(a)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ転写因子結合能を有するDNA。 - 前記修飾プロモータが、以下の(a)又は(b)のDNAからなる請求項7に記載のベクター:
(a)配列番号7〜13の何れか一つに記載の塩基配列からなるDNA
(b)(a)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインターフェロンに対して至適化されたDNA。 - 転写因子をコードする核酸配列をさらに含む請求項7又は8に記載のベクター。
- 前記転写因子をコードする核酸配列と機能的に連結された内部リボソーム結合サイト(IRES)をさらに含む請求項9に記載のベクター。
- 1又は数個の転写因子結合領域が付加された修飾プロモータと機能的に連結された所望の遺伝子と、転写因子をコードする核酸配列とを、宿主細胞内で同時に発現させる工程を含み、前記転写因子が前記修飾プロモータの転写活性を増強することを特徴とする遺伝子発現方法。
- 請求項1〜4及び6の何れか一項に記載の発現ベクターを用いる請求項11に記載の方法。
- 前記所望の遺伝子と前記修飾プロモータの間にイントロンAが介在することを特徴とする請求項11又は12に記載の方法。
- 前記転写因子が、NFκB転写因子のp65サブユニット、AP−1、インターフェロン制御因子(IRF)又はそれらの活性型変異体である請求項11〜13の何れか一項に記載の方法。
- 前記転写因子の発現を制御するプロモータの当該転写因子への反応性が、前記修飾プロモータよりも低いことを特徴とする請求項11〜14の何れか一項に記載の方法。
- 請求項1〜6の何れか一項に記載の発現ベクターと薬理的に許容される担体とを含むことを特徴とする医薬組成物。
- 抗原特異的免疫応答の誘導、又は遺伝子治療を目的として投与されるDNAである請求項15に記載の医薬組成物。
- 請求項1〜6の何れか一項に記載の発現ベクターにより形質転換されたことを特徴とする細胞。
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