JPH11176A

JPH11176A - 薬理学的に制御可能な自己促進的発現系

Info

Publication number: JPH11176A
Application number: JP9341728A
Authority: JP
Inventors: Rolf Prof Dr Mueller; ロルフ、ミューラー; Hans-Harald Prof Dr Sedlacek; ハンス‐ハラルト、ゼドラツェック
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1996-12-11
Filing date: 1997-12-11
Publication date: 1999-01-06
Also published as: US6482618B2; RU2197993C2; AU738344B2; CN1191898A; US20020151049A1; KR19980064289A; EP0848061A2; MX9710007A; HUP9702377A2; AR010341A1; AU4836297A; TR199701579A2; US6383785B1; HUP9702377A3; EP0848061A3; DE19651443A1; CA2224334A1; CZ397797A3; TR199701579A3; PL323657A1

Abstract

(57)【要約】【課題】自己促進的作用を有する核酸構築物の提供。【解決手段】本発明は、活性化合物をコードする少な
くとも１個の第一の構造遺伝子と、転写因子タンパク質
をコードする少なくとも１個の第二の構造遺伝子と、転
写因子タンパク質に結合する少なくとも１個の配列と少
なくとも１個のプロモーター配列とを含む少なくとも１
個の活性化配列とを含んでなる核酸構築物であって、そ
れぞれの活性化配列が構造遺伝子の発現および転写因子
タンパク質の発現を活性化することを特徴とする核酸構
築物である。本発明は疾患の治療用薬剤を製造するため
の核酸構築物の使用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】発明の分野本発明は、少なくとも１個の構造遺伝子と、少なくとも
１個の転写因子タンパク質遺伝子とに結合した少なくと
も１個の制御配列を含む自己促進性核酸構築物に関す
る。

【０００２】背景技術様々な試みが遺伝子治療で行われてきたが、これまでに
得られた前臨床及び臨床研究の結果は、二つの基本的な
問題点が解決されないままであることを示している。一
つは、細胞内閉鎖過程によるイン・ビトロ又はイン・ビ
ボでの標的細胞からのトランスジェニック発現が不十分
なことである。第二は、トランスジェニック発現の制御
が不十分なことである。

【０００３】従来技術のこれらの欠点を克服する試みと
して、Rivera et al. (Nature Med.2, 1028 (1996))、B
elshaw et al. (PNAS USA 93, 4604 (1996)) 、およびH
o et al. (Nature 382, 822 (1996))により、トランス
ジェニック発現を外部から制御する最初の技術が開発さ
れた。これらの方法は、活性化合物であるラパマイシン
を添加することに基づいており、この活性化合物は二個
のサブユニットと一緒に結合する。生成する連結生成物
は、転写因子として作用する。第一のサブユニットは、
ＤＮＡ結合タンパク質とＦＫ５０６結合タンパク質（Ｆ
ＫＢＰ）との間に形成される融合タンパク質を構成し、
このタンパク質もラパマイシンと結合する。第二のサブ
ユニットは、タンパク質ＦＲＡＰであってこれもラパマ
イシンと結合するものと、転写因子タンパク質ＮＦ−ｋ
Ｂの活性化配列との間に形成される融合タンパク質であ
る。

【０００４】これらの二個のサブユニットとラパマイシ
ンとの結合によって産生される機能的な転写因子タンパ
ク質は、次にトランスジーンの配列を活性化して、構造
遺伝子を活性化する。

【０００５】この外部法の利点は、構造遺伝子の発現
を、活性化合物であるラパマイシンの添加または除去に
よってそれぞれ開始または停止することができることで
ある。しかしながら、この方法によっては、構造遺伝子
の発現が不十分である問題点は解決されない。従って、
トランスジェニック発現を増加させる方法が必要とされ
ている。

【０００６】

【発明の概要】本発明は、核酸構築物、この構築物を含
む組成物、およびそれらを用いて高トランスジェニック
発現を達成する方法を提供することによって当該技術分
野において満たされない要求を実現する。本発明は、こ
れを核酸構築物自身に正のフィードバック系を取り込む
ことによって行う。生成する系は、本発明では「自己促
進的発現系」と呼ばれる。

【０００７】本発明の一態様では、活性化合物をコード
する少なくとも１個の第一の構造遺伝子と、転写因子タ
ンパク質をコードする少なくとも１個の第二の構造遺伝
子と、転写因子タンパク質と結合する少なくとも１個の
配列と少なくとも１個のプロモーター配列とを含む少な
くとも１個の活性化配列とを含んでなる核酸構築物であ
って、それぞれの活性化配列が構造遺伝子の発現および
転写因子タンパク質の発現を活性化することを特徴とす
る、核酸構築物が提供される。

【０００８】本発明のもう一つの態様では、活性化合物
をコードする少なくとも１個の第一の構造遺伝子と、転
写因子タンパク質をコードする少なくとも１個の第二の
構造遺伝子と、上記転写因子タンパク質に結合する少な
くとも１個の配列と、少なくとも１個のプロモーター、
転写因子タンパク質の活性化ドメインをコードしかつカ
ップリング物質タンパク質をコードする少なくとも１個
の融合タンパク質遺伝子、少なくとも１個のプロモータ
ー、ＤＮＡ結合タンパク質をコードしかつ第二のカップ
リング物質タンパク質をコードする少なくとも１個の融
合タンパク質遺伝子、およびＤＮＡ結合タンパク質の部
位を含む少なくとも１個の活性化配列を順次含んでなる
少なくとも１個の薬理学的制御モジュールとを含んでな
る少なくとも１個の活性化配列とを含んでなり、それぞ
れの活性化配列が構造遺伝子の発現および転写因子タン
パク質の発現を活性化する、ことを特徴とする核酸構築
物が提供される。

【０００９】本発明の更にもう一つの態様では、活性化
合物をコードする少なくとも１個の第一の構造遺伝子
と、転写因子タンパク質の活性化ドメインとカップリン
グ物質に結合する配列とを含んでなる少なくとも１個の
第一の融合タンパク質をコードする少なくとも１個の第
二の構造遺伝子と、カップリング物質に結合するタンパ
ク質とＤＮＡ結合タンパク質とを含んでなる少なくとも
１個の第二の融合タンパク質をコードする少なくとも１
個の第三の構造遺伝子と、カップリング物質によって上
記第一の融合タンパク質にカップリングした上記第二の
融合タンパク質に結合する少なくとも１個の配列と、少
なくとも１個のプロモーター配列とを含んでなる少なく
とも１個の活性化配列とを含んでなり、それぞれの活性
化配列が上記構造遺伝子の少なくとも１個の発現を活性
化することを特徴とする核酸構築物が提供される。

【００１０】その他の態様は、当業者であれば本明細書
および添付の請求の範囲を読むことにより明らかになる
であろう。

【００１１】

【発明の具体的説明】自己促進発的現系最も単純な態様では、新規な自己促進発現系は、下記の
成分 a) 転写因子タンパク質d)と結合するための少なくとも
１個の配列a)および／またはa') 、 b) 少なくとも１個のプロモーター配列b)および／また
はb') 、 c) 活性化合物をコードする少なくとも１個の構
造遺伝子c)、および d) 成分a)に結合する転写因子タンパク質d)をコードす
る少なくとも１個の遺伝子を含んでいる。

【００１２】本発明によれば、成分a)および／またはa
') 、およびb)および／またはb') は構造遺伝子c)の転
写を活性化し、かつ転写因子タンパク質d)の発現を活性
化するための配列を構成する。

【００１３】本発明による好ましい形態では、これらの
成分は図１に示されるように配置することができる。

【００１４】結合配列a)およびa') は同一でもまたは異
なっていてもよく、転写因子d)に結合する。

【００１５】プロモーター配列［成分b)およびb') ］
は、同一でもまたは異なっていてもよい。プロモーター
配列b)およびb') の活性化が低レベルであれば、構造遺
伝子［成分c)］および転写因子タンパク質［成分d)］の
遺伝子の発現は低レベルとなる。また、これによって作
成された転写因子タンパク質d)は、結合配列［成分a)お
よびa') ］に結合する。また、この結合により、プロモ
ーター配列b)およびb')が活性化され、構造遺伝子およ
び転写因子タンパク質d)の遺伝子の両方の発現が促進さ
れる。この促進発現自身が多量の転写因子タンパク質d)
を生じ、これはこの系にフィードバックされて、更に刺
激する。

【００１６】本発明によれば、図１に示される成分の配
置は、構造遺伝子の３′末端の核輸出シグナル（ＮＥ
Ｓ）と核輸出因子（ＮＥＦ）をコードする遺伝子を補足
する（すなわち、上流末端に「追加する」）ことができ
る。ＮＥＦの発現は、追加プロモーター（成分b'''）に
よって制御される。この追加プロモーター配列は、図２
に示される活性化配列［成分a)およびb)および／または
a') およびb') ］の任意の部分と同一でもまたは異なっ
ていてもよい。

【００１７】核輸出シグナル（ＮＥＳ）は、これに連結
しているプレ−メッセンジャーＲＮＡの核膜を介する輸
送を妨害するヌクレオチド配列である。従って、ＮＥＳ
はそれ自身で、核保持シグナル（ＮＲＳ）を構成する。
しかしながら、ＮＲＳが、本明細書で「核輸出因子」ま
たは「ＮＥＦ」と呼ぶ輸出タンパク質に結合すると、Ｎ
ＲＳはＮＥＳの機能を獲得する。これは、核輸出因子
（ＮＥＦ）が細胞核からのおよび細胞質へのＮＥＳ含有
プレメッセンジャーまたはメッセンジャーＲＮＡの輸送
を実現するからである。従って、ＮＥＳ含有プレメッセ
ンジャーまたはメッセンジャーＲＮＡは、Fischer et a
l., Cell 82, 475 (1995) に記載されているようにＮＥ
Ｆに結合されていることによって細胞核から分泌され
る。

【００１８】本発明によれば、成分c)およびd)は、成分
a') およびb') と連結する代わりに内部リボソームエン
トリー部位（ＩＲＥＳ）によって互いに連結する（すな
わち、相互連結する）こともできる。このようなＩＲＥ
Ｓによって、ＩＲＥＳを介して互いに連結している２個
のＤＮＡ配列が発現する。

【００１９】ＩＲＥＳを介する連結は、例えば図３に示
されるようにして行うことができる。この配置により、
プロモーター配列b)を低レベルの活性化を施したとき
に、転写因子タンパク質［化合物d)］の遺伝子もＩＲＥ
Ｓ配列を介して発現されることが同程度に確保される。
この発現は、構造遺伝子［成分c)］が発現されるときに
起こる。また、転写因子タンパク質が結合配列a)に結合
して、これによってプロモーター配列b)の活性化が促進
され、構造遺伝子c)の発現が促進され、またＩＲＥＳ配
列によって、転写因子タンパク質d)遺伝子の発現も促進
される。

【００２０】図１〜３に示される個々の成分の本発明に
よる配置は、図４に示されるように機能する自己促進発
現系である。この自己促進発現系は、構造遺伝子［成分
c)、c') およびc'')］の幾つかの同一または異なる配列
を一緒に緊縮することによって伸張することができる。
これらの構造遺伝子は、同一または異なるＩＲＥＳ配列
によって、または結合配列a)、プロモーター配列b') お
よびプロモーター配列b'')を介して連結されている。代
表的な配置を、図５に示す。この自己促進発現系は、転
写因子タンパク質d)［成分d)、d') およびd'')］の幾つ
かの同一または異なる遺伝子を一緒に緊縮することによ
って伸張することもできる。一つの代表的な例を図６に
示すが、これはＩＲＥＳ配列による連結を示している。
ＩＲＥＳ配列は、場合によっては同一の配列であること
ができる。

【００２１】結合配列a)は、総ての活性化配列における
１つの型であるのが好ましい。総ての転写因子タンパク
質d)、d') およびd'')は、この結合配列に結合すべきで
ある。結合配列が同一の型でないとき（例えば、成分a
が成分a'と同一でないとき）には、転写因子タンパク質
［成分d)、d') およびd'')］は結合配列の総てに結合す
べきである。活性化配列は、転写因子タンパク質d)、d
') およびd'')の総ての生成物によって認識されるよう
に設計されまたは選択されるのが好ましい。

【００２２】図２に示したのと同様な方法で、図３の成
分に核輸出シグナル（ＮＥＳ）および核輸出因子をコー
ドする遺伝子を補足することができる。構造遺伝子［成
分c)］の３′末端にＮＥＳ遺伝子、およびＮＥＦ遺伝子
を有するこの配置を図７に示す。この最後の例では、Ｎ
ＥＦは追加プロモーター配列成分b''') によって別個に
活性化される。成分b'''配列は、成分a)およびb)と同一
であることもまたは非同一でもあることもできる。

【００２３】薬理学的に制御可能なプロモーターモジュ
ール新規な薬理学的に制御可能なプロモーターモジュール
（「薬理学的制御モジュール」）は、その最も単純な形
態では、下記の成分 e) 少なくとも１個のプロモーター配列、 f) 転写因子タンパク質の活性化ドメインとカップリン
グ物質［成分j)］結合タンパク質Ａとを含む融合タンパ
ク質f)をコードする少なくとも１個の遺伝子、 g) 少なくとも１個の追加のプロモーター配列［成分e)
と同一または非同一］または少なくとも１個のＩＲＥ
Ｓ、 h) ＤＮＡ結合ドメインとカップリング物質［成分j)］
結合タンパク質Ｂとを含む融合タンパク質h)をコードす
る少なくとも１個の遺伝子、 i) 融合タンパク質h)と結合する部位を有する少なくと
も１個の活性化配列、および j) 融合タンパク質f)におけるタンパク質Ａ［成分f)の
発現生成物］と結合するための部位A)と融合タンパク質
h)におけるタンパク質B)［成分h)の発現生成物］と結合
する部位B)とを両方とも含んでなる少なくとも１個のカ
ップリング物質j)を含んでなる。

【００２４】成分e 〜i)は、例えば図８に示される略図
に従って順次配置することができる。この配置により、
プロモーター配列e)およびg)が活性化されるときに融合
タンパク質f)およびh)［成分f)およびh)］が確実に発現
される。カップリング物質［成分j)］が存在するときに
は、２つの融合タンパク質は互いに連結し（「相互連結
し」）、活性化配列［成分i)］を活性化するための機能
的転写因子タンパク質を形成する。本発明のこの態様で
は、個々の成分からなるプロモーターモジュールは、成
分j)のようなカップリング物質の存在下で機能する。こ
のモジュールは、カップリング物質である成分j)を添加
すると、機能するようになる。図９にこの態様の一例を
示す。

【００２５】自己促進性の薬理学的に制御可能な発現系自己促進性発現系は、薬理学的に制御可能なプロモータ
ーモジュールと組み合わせることができる。この組み合
わせは、次に例えば薬理学的に制御可能なプロモーター
モジュール［成分e)〜j)］をプロモーター配列（成分b)
および／またはb') ）の代わりに自己促進発現系（図
１、２、３または７を参照されたい）に挿入することに
よって行われる。この組み合わせたヌクレオチド配列の
構築は、例えば図１０に示される。この例では、構造遺
伝子は、融合タンパク質f)およびh)［成分f)およびh)の
発現生成物］がカップリング物質である成分j)によって
連結されて転写因子タンパク質を形成するときにのみ転
写される。あるいは、または更に、薬理学的に制御可能
なプロモーターモジュールは、転写因子タンパク質［成
分d)］の遺伝子、転写因子タンパク質d)と結合するため
の配列［成分a)］、およびプロモーター配列b)［成分
b)］の代わりに自己促進発現系に挿入することができ
る。この場合には、結合成分h)部位は、少なくともその
５′末端によってプロモーター配列e)およびg)の一つに
結合すべきである。この組み合わせたヌクレオチド配列
の構築を、図１１に例示する。

【００２６】自己促進系は、他の方法で薬理学的に制御
可能なプロモーターモジュールと組み合わせることもで
きる。例えば、図８は、ＮＥＦのプロモーター配列（成
分b''') ）（図２または７を参照されたい）を薬理学的
に制御可能なプロモーターモジュールによって置換する
ことができることを示している。このヌクレオチド配列
を構築する一つの方法を、図１２に示す。

【００２７】本発明の核酸構築物は、ＤＮＡからなるの
が好ましい。「核酸構築物」という用語は、核酸を含ん
でなり、標的細胞に転写することができる人工的構造を
表している。核酸構築物は、ベクターに挿入されるのが
好ましい。これに関しては、プラスミドベクターまたは
ウイルスベクターが特に望ましい。

【００２８】プロモーター配列の選択によっては、新規
な核酸構築物を用いて構造遺伝子［成分c)］を非特異的
に発現することができる。あるいは、この発現は、細胞
特異性、ウイルス特異性、画定条件、または細胞サイク
ル条件によっても制御される。構造遺伝子は、薬剤の不
活性前駆体を開裂して活性薬剤を形成する薬理学的に活
性な化合物または酵素をコードするのが好ましい。この
構造遺伝子は、酵素−リガンド融合タンパク質を発現す
るように設計することもできる。この場合には、リガン
ドは細胞表面に結合することができる。これに関して最
も好ましいものは、増殖する内皮細胞または腫瘍細胞の
表面に結合するリガンドである。

【００２９】本発明は、細胞、特に酵母または哺乳動物
細胞であって、新規な核酸構築物を宿主とするものにも
関する。特に好ましい態様では、核酸構築物は、カップ
リング物質［成分j)］の添加または投与によってトラン
スフェクションされる細胞系に導入される。カップリン
グ物質の添加により、構造遺伝子の発現が促進される。
これらの構築物を含む細胞を用いて、医薬組成物を製造
することができる。しかしながら、これらの細胞を治療
薬または医薬組成物として患者に投与して、疾患を治療
することもできる。あるいは、新規な核酸構築物をベク
ターに取り込み、局所的にまたは非経口的に間接的に患
者に投与することもできる。使用においては、この構築
物を特定の疾患に対して設計して、構築物が１種類以上
のタンパク質、またはこの疾患の１以上の症状を予防ま
たは改善する核酸を発現するようにする。これに関して
用いられる核酸構築物の量は、当業者には知られている
ように、投与経路、患者の状態、および疾患の性質によ
って決定される。

【００３０】患者に直接投与する場合には、カップリン
グ物質［成分j)］を更に投与して、構造遺伝子を発現さ
せることもできる。カップリング物質は、図９に示され
るように、トランスフェクションした細胞内で融合タン
パク質f)を融合タンパク質h)とカップリングすることに
よって完全な転写因子タンパク質を形成する。従って、
トランスフェクションした細胞は、カップリング物質が
体内にある場合に限って構造遺伝子を発現する。発現の
期間および強度は、カップリング物質を投与することに
よって制御することができる。

【００３１】従って、新規核酸構築物の好ましい用途
は、核酸構築物を標的細胞に導入し、カップリング物質
を投与することによって非特異的、ウイルス特異的また
は標的細胞特異的および／または細胞サイクル特異的な
方法で構築物を発現することを特徴とする薬剤の提供に
よる疾患の治療にある。

【００３２】本発明による核酸構築物を用いて、細胞で
の合成によって医薬組成物を製造することができる。な
お、細胞は本発明のＤＮＡ構築物で形質転換する。次
に、形質転換細胞を培養して細胞のクローンを得ること
によって、ＤＮＡ構築物の複数のコピーを作成する。遺
伝子増幅を用いて、それぞれの細胞におけるＤＮＡ構築
物の多数のコピーを増加させるのが好ましい。形質転換
細胞を培養してＤＮＡ構築物の複数のコピーを得た後
に、ＤＮＡ構築物を培養細胞から精製することができ
る。E. coli はＤＮＡ構築物の複数のコピーを得るため
の培養細胞として好ましい。精製ＤＮＡは、緩衝剤、
塩、または当該技術分野で知られている他の賦形剤のよ
うな（複数の）他の物質と混合することによって医薬組
成物の一成分として用いられる。

【００３３】新規な核酸構築物はこの形態では天然に存
在せず、すなわち活性化合物または酵素またはリガンド
／酵素融合タンパク質の構造遺伝子は、天然では新規な
核酸配列と結合して自己促進発現系を形成しないのであ
る。この系は、天然では薬理学的に制御可能なプロモー
ターモジュールとも結合しない。

【００３４】自己促進性の薬理学的に制御可能な発現系
に取り込まれる好ましい構造遺伝子は、薬理活性を有す
る化合物をコードする。これらの活性化合物は、サイト
カイン、成長因子、レセプターサイトカインまたは成長
因子、抗体または抗体断片、抗増殖またはサイズ増殖抑
制作用を有するタンパク質、脈管形成阻害薬、血栓症誘
発タンパク質、凝固阻害薬、血漿タンパク質、補体活性
化タンパク質、ウイルスおよび細菌コート物質、ホルモ
ン、循環に影響するペプチド、神経ペプチド、酵素、お
よびメディエイターからなる群から選択されるタンパク
質および糖タンパク質、およびこれらのタンパク質また
は糖タンパク質の少なくとも２個を含んでなる融合タン
パク質である。

【００３５】自己促進性の薬理学的に制御可能な発現系
の成分の詳細な説明 1) 自己促進発現系の活性化配列および転写因子タンパ
ク質本発明の意味においては、転写因子タンパク質d)［成分
d)の遺伝子生成物］は、関連結合配列a)［成分a)］であ
って、それに関する限り、３′−隣接プロモーター配列
b)（またはb'またはb'' ）を活性化するものに特異的に
結合する。従って、成分a)およびb)は、関連転写因子タ
ンパク質d)に結合する配列を含んでなる活性化配列を構
成している。一方、転写因子タンパク質d)は、活性化配
列［成分a)］の相当する結合配列に特異的な結合ドメイ
ン並びにトランス活性化ドメインを含んでいなければな
らない。追加の核局在化シグナル（ＮＬＳ）は、活性化
配列a)との相互作用を促進する。

【００３６】この必要条件に合う核酸構築物の例は、下
記の通りである。態様A) 1. Ｇａｌ４タンパク質（Chasman and Kornberg, Mol.
Cell Biol. 10, 2916 (1990) ）と結合する少なくとも
１個の配列［例えば、ヌクレオチド配列：5'-CGGACAACT
GTT-GACCG-3' （配列番号１）］、および３′末端に基
本ＳＶ４０プロモーター（核酸４８〜５１９１：Tooze
（監修）, ＤＮＡ腫瘍ウイルス(DNA Tumor Viruses)
（Cold Spring Harbor New York, (1980),ニューヨー
ク; Cold Spring Harbor Laboratory ）ｃ−ｆｏｓプロモーター(Das et al., Nature 374, 657
(1995))、およびその３′末端にＨＳＶ１ＶＰ１６酸
トランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）（アミノ酸４０６〜
４８８；Treizenberg et al., Genes Developm. 2, 718
(1988); Trizenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5,
190 (1995) ）、Ｕ２ｓｎＲＮＡプロモーター、お
よび（その３′末端に）ＨＳＶ１ＶＰ１６ＴＡＤまた
はＯｃｔ−２の活性化ドメインの少なくとも１個の配列
（アミノ酸４３８〜４７９; Tanaka et al., Mol. Cell
Biol. 14, 6046 (1994); Das et al., Nature 374, 65
7 (1995)）、またはＨＳＶＴＫプロモーター(Papavas
siliou et al., J. Biol. Chem. 265, 9402(1990); Par
k et al., Molec. Endocrinol. 7, 319 (1993))、また
はもう一つの非特異的、細胞特異的、ウイルス特異的ま
たは細胞サイクル特異的、または代謝的に活性化可能な
プロモーターを含んでなる成分b)を有する成分a)を含ん
でなる活性化配列、および 2. Ｇａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインのための
ｃＤＮＡ（アミノ酸１〜１４７；Chasman and Kornber
g, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990) ）であって、そ
の３′末端にＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）（Ｓ
Ｖ４０ラージＴ；アミノ酸１２６〜１３２；例えば、Ｐ
ＫＫＫＲＫＶ；Dingwall et al., TIBS 16,478 (199
1)）が結合し、その３′末端にＨＳＶ−１ＶＰ１６酸
トランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）（アミノ酸４０６〜
４８８; Trienzenberg et al., Genes Developm. 2, 71
8 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm.
5, 190 (1995) ）が結合しているものを含む関連転写因
子タンパク質d)［成分d)］の遺伝子を含んでなるもの。

【００３７】態様B) 1. ＬｅｘＡタンパク質［ＬｅｘＡオペレーター; Bren
t et al., Nature 612,312 (1984)］と結合する少なく
とも１個の配列［例えば、ヌクレオチド配列：5'-TACTG
TATGTACA-TACAGTA-3' （配列番号２）、およびその３′
末端に基本ＳＶ４０プロモーター（核酸４８〜５１９
１：Tooze （監修）, ＤＮＡ腫瘍ウイルス(DNA Tumor V
iruses) （Cold Spring Harbor New York, (1980),ニュ
ーヨーク; Cold Spring Harbor Laboratory ）、または
もう一つのプロモーター（態様Ａを参照されたい）を含
んでなる成分b)を含む成分a)を含んでなる活性化配列、
および 2. ＬｅｘＡタンパク質のＤＮＡ結合ドメインのための
ｃＤＮＡ（アミノ酸１〜８１；Kim et al., Science 25
5, 203 (1992) ）または全ＬｅｘＡタンパク質（アミノ
酸１〜２０２; Brent et al., Cell, 43, 729 (1985)）
であって、その３′末端にＳＶ４０核局在化シグナル
（ＮＬＳ）（ＳＶ４０ラージＴ；アミノ酸１２６〜１３
２；例えば、ＰＫＫＫＲＫＶ；Dingwall et al., TIBS
16, 478 (1991)）が結合し、その３′末端にＨＳＶ−１
ＶＰ１６酸トランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）（アミ
ノ酸４０６〜４８８; Trienzenberg et al., Genes Dev
elopm.2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen.
Developm. 5, 190 (1995) ）が結合しているものを含
む関連転写因子タンパク質d)［成分d)］の遺伝子を含ん
でなるもの。

【００３８】態様C) 1. ｌａｃＩリプレッサータンパク質(Fuerst et a
l., PNAS USA 86, 2549 (1989); Simons et al., PNAS
USA 81, 1624 (1984) ）と結合する少なくとも１個の配
列（例えば、ヌクレオチド配列：5'-GAATTGTGAGCGCTCAC
AATTC-3'（配列番号３））およびその３′末端に基本Ｓ
Ｖ４０プロモーター（核酸４８〜５１９１：Tooze （監
修）, ＤＮＡ腫瘍ウイルス(DNA Tumor Viruses) （Cold
Spring Harbor New York, (1980),ニューヨーク; Cold
Spring Harbor Laboratory ）、またはもう一つのプロ
モーター（態様Ａを参照されたい）を含んでなる成分b)
を含む成分a)を含んでなる活性化配列、および 2. ｌａｃリプレッサー（ｌａｃＩ）タンパク質(Bro
wn et al., Cell 49, 603 (1987); Fuerst et al., PNA
S USA 86, 2549 (1989))のためのｃＤＮＡであって、そ
の３′末端にＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）（Ｓ
Ｖ４０ラージＴ；アミノ酸１２６〜１３２；例えば、Ｐ
ＫＫＫＲＫＶ；Dingwall et al., TIBS 16, 478 (199
1)）が結合し、その３′末端にＨＳＶ−１ＶＰ１６酸
トランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）（アミノ酸４０６〜
４８８; Trienzenberg et al., GenesDevelopm. 2, 718
(1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm.
5, 190(1995) ）が結合しているものを含む関連転写因
子タンパク質d)［成分d)］の遺伝子を含んでなるもの。

【００３９】態様D) 1. テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）タン
パク質と結合する少なくとも１個の配列（例えば、ヌク
レオチド配列：5'-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAA
AAGTGAAAG-3'（配列番号４））およびその３′末端に基
本ＳＶ４０プロモーター（核酸４８〜５１９１：Tooze
（監修）, ＤＮＡ腫瘍ウイルス(DNA Tumor Viruses)
（Cold Spring Harbor New York, (1980),ニューヨー
ク; Cold Spring Harbor Laboratory ）、またはもう一
つのプロモーター（態様Ａを参照されたい）を含んでな
る成分b)を含む成分a)を含んでなる活性化配列、および 2. テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）タン
パク質(Gossen et al.,PANS USA 89, 5547 (1992); Din
germann et al., EMBO J. 11, 1487 (1992)) 、のｃＤ
ＮＡ、およびその３′末端におけるＳＶ４０核局在化シ
グナル（ＮＬＳ）（ＳＶ４０ラージＴ；アミノ酸１２６
〜１３２；例えば、ＰＫＫＫＲＫＶ；Dingwall et al.,
TIBS 16, 478 (1991)）、およびその３′末端にＨＳＶ
−１ＶＰ１６酸トランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）
（アミノ酸４０６〜４８８; Trienzenberg et al., Gen
es Developm. 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opi
n. Gen. Developm. 5, 190 (1995) ）が結合しているも
のを含む関連転写因子タンパク質d)［成分d)］の遺伝子
を含んでなるもの。

【００４０】態様E) 1. ＺＦＨＤ−１タンパク質(Pomeranz et al., Scienc
e 267,93 (1995))と結合する少なくとも１個の配列（例
えば、ヌクレオチド配列：5'-TAATGATGGGCG-3'（配列番
号５）］、およびその３′末端に基本ＳＶ４０プロモー
ター（核酸４８〜５１９１：Tooze （監修）, ＤＮＡ腫
瘍ウイルス(DNA Tumor Viruses) （Cold Spring Harbor
New York, (1980),ニューヨーク; Cold Spring Harbor
Laboratory ）、またはもう一つのプロモーター（態様
Ａを参照されたい）を含んでなる成分b)を含む成分a)を
含んでなる活性化配列、および 2. ＺＦＨＤ−１タンパク質(Pomeranz et al., Scienc
e 267,93 (1995))のｃＤＮＡ、およびその３′末端にお
けるＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）（ＳＶ４０ラ
ージＴ；アミノ酸１２６〜１３２；例えば、ＰＫＫＫＲ
ＫＶ；Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991)）、およ
びその３′末端にＨＳＶ−１ＶＰ１６酸トランス活性
化ドメイン（ＴＡＤ）（アミノ酸４０６〜４８８; Trie
nzenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1988); Tr
iezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5, 190 (199
5) ）が結合しているものを含む関連転写因子タンパク
質d)［成分d)］の遺伝子を含んでなるもの。

【００４１】2) 薬理学的に制御可能なプロモーターモ
ジュール本発明によれば、下記の遺伝子は薬理学的に制御可能な
プロモーターモジュールの特異的成分である（図８およ
び９も参照されたい）。

【００４２】融合タンパク質f)［成分f)］について転写因子タンパク質の活性化ドメインの遺伝子、および
カップリング物質j)に結合するタンパク質Ａについての
少なくとも１個の遺伝子であって、好適には核局在化シ
グナル（ＮＬＳ）を補足したもの、融合タンパク質h)［成分h)］についてカップリング物質j)に結合するタンパク質Ｂについての
少なくとも１個の遺伝子、および活性化配列［成分i)］
のＤＮＡに結合するタンパク質の遺伝子、カップリング物質についてタンパク質Ａに結合しかつタンパク質Ｂに結合するため
の少なくとも１個の部位を有する成分j)、および成分i)について融合タンパク質h)［成分h)］に結合するための部位およ
びプロモーター要素を含んでなる活性化配列。

【００４３】カップリング物質［成分j)］の選択によっ
て、成分f)およびh)におけるそれぞれ成分j)結合タンパ
ク質ＡおよびＢの性質が必然的に決定される。これに関
して、成分f)およびh)における成分j)結合タンパク質Ａ
およびＢは、同一でも非同一であることもできる。特
に、カップリング物質［成分j)］が幾つかの同一結合部
位を有するときには、同一成分j)結合タンパク質Ａおよ
びＢを用いることができる。しかしながら、本発明の意
味においては、非同一成分j)結合タンパク質ＡおよびＢ
が成分f)およびh)では好ましい。

【００４４】これは、カップリング物質［成分j)］は、
融合タンパク質h)［成分h)］と結合する部位とは異なる
部位で融合タンパク質f)［成分f)］と結合するので、融
合タンパク質f)およびh)はカップリング物質への結合に
ついて互いに競合しないことを意味している。

【００４５】薬理学的に制御可能なプロモーターの成分
f)およびh)に遺伝子を用いることができる特定のタンパ
ク質に結合することが既に知られているカップリング物
質を用いることができる。

【００４６】しかしながら、本発明は、特にモノクロー
ナル抗体、およびそれから誘導される組換え抗体、また
はそれらの断片であって、カップリング物質j)に結合す
るものにも関する。これらのモノクローナル抗体、特に
それらの組換えＦｖ断片の、融合タンパク質f)およびh)
［成分f)およびh)］への挿入は、本発明の特別な態様を
構成する。なお、カップリング物質［成分j)］での異な
る結合部位（それぞれＡおよびＢ結合部位のエピトー
プ）を認識する組換えＦｖ断片を、融合タンパク質［成
分f)およびh)］に用いるのが好ましい。

【００４７】本発明の意味において、ネズミおよびヒト
モノクローナル抗体の両方を用いることができる。ネズ
ミモノクローナル抗体は、ヒト化した形態で用いるのが
好ましい。ヒト化(humanization)は、Winter et al. (N
ature 349, 293 (1991))およびHoogenbooms et al. (Re
v. Tr. Trnasfus Hemobiol. 36, 19 (1993))によって報
告された方法で行われる。抗体断片は、当該技術分野の
状態に準じて、例えばWinter et al. Nature 349, 293
(1991); Hoogenbooms et al. Rev. Tr. Trnasfus Hemob
iol. 36, 19 (1993); Girol, Mol. Immunol. 28, 1379
(1991)、およびHuston et al., Int. Rev. Immunol. 1
0, 195 (1993)によって報告された方法で作製される。

【００４８】組換え抗体断片は、存在しているハイブリ
ドーマから直接作成され、またはファージ−ディスプレ
イ法(Smith, Science 228, 1315 (1985)) を用いてネズ
ミまたはヒト抗体断片（Winter et al., Annu. Rev. Im
munol. 12, 433 (1994))のライブラリーから分離され
る。次に、これらの抗体断片を用いて、直接遺伝学的水
準で他のタンパク質またはペプチドと［転写因子タンパ
ク質（成分f ）の活性化ドメインとまたはＤＮＡ結合タ
ンパク質（成分h)と］融合する。

【００４９】ハイブリドーマから組換え抗体断片を作成
するため、抗体の抗原結合ドメイン（ＶＨおよびＨＬ）
をコードする遺伝子情報を、ｍＲＮＡを単離し、このＲ
ＮＡををｃＤＮＡに逆転写した後、可変断片(Orlandi e
t al., PNAS-USA 86, 3833 1989)のそれぞれ５′および
３′末端に相補的なオリゴヌクレオチドを用いるポリメ
ラーゼ連鎖反応(Saiki et al., Science 230, 1350 (19
85))によって増幅する。次いで、ＶＨおよびＶＬ断片を
Ｆｖ断片（Skerra & Plueckthun, Science 240, 1038
(1988),一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）(Bird et al., Sci
ence 242, 423 (1988); Huston et al., PNAS-USA 85,
5879 (1988)) 、またはＦａｂ断片(Better et al., Sci
ence 240, 1041 (1988)) の形態で細菌発現ベクターに
クローニングする。

【００５０】新規な抗体断片を、ファージ−デイスプレ
イ法を用いてネズミまたはヒト供給源の抗体ライブラリ
ー（免疫ライブラリーまたはナイーブライブラリー）か
ら直接分離することもできる。抗体断片のファージディ
スプレイでは、抗原結合ドメインを、ファージゲノム(M
cCafferty et al., Nature 348, 552 (1990)) またはフ
ァージミドベクター(Breitling et al., Gene 104, 147
(1991))に、ｓｃＦｖ断片(McCafferty et al., Nature
348, 552 (1990)) または糸状バクテリオファージのｇ
３Ｐコートタンパク質との融合タンパク質としてのＦａ
ｂ断片(Hoogenboom et al., Nucl. Acid Res., 19, 413
3 (1991); Barbas et al., PNAS USA 88, 7978 (1991))
の形態でクローニングされる。抗原結合ファージは、抗
原をロードしたプラスチック容器上で（パンニング(pan
ning) ）(Marks et al., J. Mol.Biol. 222, 581 (199
1)) 、抗原と接合した常磁性ビーズ上で(Hawkins et a
l.,J. Mol. Biol. 226, 889 (1992)) 、または細胞表面
に結合することによって(Marks et al., Bio/Technol.
11, 1145 (1993))選択される。

【００５１】免疫ライブラリーは、免疫した動物(Sastr
y et al., PNAS-USA 86, 5728 (1989); Ward et al., N
ature 341, 544 (1989); Clackson et al., Nature 35
2, 624 (1991)) の、または患者(Mullinax et al., PNA
S-USA 87, 8095 (1990); Barbas et al., PNAS-USA 88,
7978 (1991))のＢリンパ球からの可変抗体断片のＰＣ
Ｒ増幅によって作成される。このため、ネズミ(Orlandi
et al., PNAS-USA 86,3833 (1989); Sastry et al., P
NAS-USA 86, 5728 (1989)) またはヒト免疫グロブリン
遺伝子(Larrick et al., BBRC 160, 1250 (1989)) に特
異的な、またはヒト免疫グロブリン遺伝子ファミリー(M
arks et al., Eur. J. Immunol. 21, 985(1991)) に特
異的なオリゴヌクレオチドの組み合わせが用いられる。

【００５２】天然ライブラリーは、非免疫ドナーをメン
チルグロブリン遺伝子の供給源として用いることによっ
て作成することができる(Marks et al., J. Mol. Biol.
222, 581 (1991)) 。あるいは、免疫グロブリン微生物
ライン遺伝子を用いて、宿体プライマーを用いるＰＣＲ
によって増幅される可変断片の相補性決定領域３を有す
る半合成抗体レパトリーを作成することができる(Hooge
nboom & Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1992); Bar
bas et al., PNAS-USA 89, 4457 (1992); Nissim et a
l., EMBO J. 13, 692 (1994); Griffiths et al., EMBO
J. 13, 3245 (1994)) 。免疫ライブラリーと比較し
て、いわゆる単一ポットラインは、多数の抗原に対する
抗体断片を単一ライブラリーから分離することができる
という利点を有する(Nissim et al., EMBO J. 13, 692
(1994)) 。

【００５３】抗体断片のアフィニティは、ランダム(Haw
kins et al., J. Mol. Biol. 226,889 (1992); Gram et
al., PNAS-USA 89, 3576 (1992))、コドンを基礎とし
た(Glaser et al., J. Immunol. 149, 3903 (1992)) 、
または部位指向性突然変異誘発(Balint & Larrick, Gen
e 137, 109 (1993) によって、個々のドメインの鎖をナ
イーブレパトリーからの断片の鎖と混合することによっ
て(Marks et al., Bio/Technol. 10, 779 (1992)) 、ま
たは細菌ミューテーター株を用い(Low et al.,J. Mol.
Biol. 260, 359 (1996)) 、緊縮条件下で再選択するこ
とによって改良された特性を有する抗体断片を単離する
(Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226,889 (1992)) 先
在する抗体断片から作成した新規なライブラリーを有す
るファミリー−ディスプレイ法を用いて更に増加するこ
とができる。更に、ネズミ抗体断片を、可変ドメインの
１個をヒトレパリトーで段階的に置換した後、最初の抗
原を用いて選択することによってヒト化することもでき
る（誘導選択(guided selection)(Jespers et al., Bio
/Technol. 12, 889 (1994)) 。あるいは、ネズミ抗体を
ヒト抗体の超可変領域を最初のネズミ抗体の相当する領
域で特異的に置換することによってヒト化する(Jones e
t al., Nature 321, 522 (1987))。

【００５４】従って、本発明の意味では、カップリング
物質は、基本的に細胞中に浸透することができる総ての
物質を包含する。本発明の意味では、遺伝子治療とは独
立して医薬品として既に用いられているカップリング物
質が優先する。

【００５５】例えば、これらのカップリング物質として
は、特定のカップリング物質に結合しかつその遺伝子が
成分f)およびh)に挿入されてそれぞれ融合タンパク質f)
およびh)を発現する関連タンパク質と一緒のカップリン
グ物質が挙げられる。

【００５６】カップリング物質：下記の結合タンパク
質（およびそれらの遺伝子）と一緒のラパマイシンまた
はラパマイシン類似体、例えばＬ６８５８１８(Becker
et al., J. Biol. Chem. 268,11335 (1993))；ＦＫ５０
６結合タンパク質（ＦＫＢＰ；Bierer et al., Proc Na
tl. Acad.Sci. USA 87, 9231 (1990)) ラパマイシン／ＦＫＢＰ複合体に結合するＦＫＢＰ／ラ
パマイシン関連タンパク質、またはラパマイシン／ＦＫ
ＢＰ複合体に結合するその部分配列（ＦＲＡＰ; Brown
et al., Nature 369,756 (1994); Chiu et al., Proc.
Natl. Acad.Sci. USA 91, 12574 (1994); Sabatini et
al., Cell 78, 35 (1994); Sabers et al., J. Biol. C
hem. 270, 815 (1995))。

【００５７】ＦＫＢＰおよびＦＲＡＰの遺伝子を用いる
代わりに、ラパマイシンに結合しおよび／またはＦＫＢ
ＰまたはＦＲＡＰのラパマイシンへの結合を阻害する組
換えＦｖ断片に対する遺伝子を用いることができる。

【００５８】カップリング物質：下記の結合タンパク
質（およびそれらの遺伝子）と一緒のＦＫ５０６の二量
体（ＦＫ１０１２）(Spencer et al., Science 262, 10
19 (1993); Pruschy et al., Chem. Biol. 1, 163 (199
4)) ：ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ、上記を参
照されたい）；カルシネウリン(Lin et al., Cell 66,
807 (1991)、またはＦＫ５０６複合体に結合するその部
分配列(Clipstone et al., J. Biol. Chem. 269, 26431
(1994)); およびＦＫ５０６のカルシネウリンへの結合
を阻害し(Ho et al., Nature 382, 822 (1996)) カルシ
ネウリン遺伝子の代わりに挿入することができる組換え
Ｆｖ断片に対する遺伝子。

【００５９】カップリング物質：下記の結合タンパク
質（およびそれらの遺伝子）と一緒のシクロスポリンＡ
の二量体(Belshaw et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA
93,4604 (1996)) ：シクロフィリン(Belshaw et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci USA 93, 4604 (1996));シクロ
スポリン、またはシクロスポリンＡ／シクロスポリン複
合体に結合するその部分配列（上記を参照されたい）；
およびシクロスポリンＡのシクロスポリン結合を阻害
し、シクロスポリンに対する遺伝子の代わりに挿入する
ことができる組換えＦｖ断片に対する遺伝子。

【００６０】カップリング物質：下記の結合タンパク
質（およびそれらの遺伝子）と一緒のシクロスポリンＡ
のモノマー：シクロスポリン；シクロスボリン／シクロ
スポリンＡ複合体におけるシクロスポリンＡに結合する
組換えＦｖ断片に対する遺伝子(Cacalano et al., Mole
c. Immunol. 29, 107 (1992));シクロフィリンの代替物
として、シクロスポリンＡの様々なエピトープに結合す
る様々な組換えＦｖ断片に対する遺伝子を用いることが
できる(Vix et al.,Proteins 15, 339 (1993); Cacalan
o et al., Mol. Immunol. 29, 107 (1992);Rauffer et
al., Molec. Immunol. 31, 913 (1994))。

【００６１】カップリング物質：下記の結合タンパク
質（およびそれらの遺伝子）と一緒のメトトレキセー
ト：メトトレキセートに対する抗体または抗体断片（組
換えＦｖ断片）(Pimm etal., Brit. J. Cancer 61, 508
(1990); Kato et al., J. Immunol. Methods 67, 321
(1984);プテリジン基(Cot et al., 6, 87 (1987))に対
する抗体または抗体断片（組換えＦｖ断片）；ベンゼン
基(Cot et al., 6, 87 (1987))に対する抗体または抗体
断片（組換えＦｖ断片）；およびジヒドロホレートレダ
クターゼ(Masters et al., Gene 21, 59 (1983); Swift
et al., Mol. Genetics 181, 441 (1981); Goldsmith
et al., Mol. Cell Biol. 6, 878 (1986))。

【００６２】カップリング物質：下記の結合タンパク
質（およびそれらの遺伝子）と一緒のゲンタマイシン：
ゲンタマイシンに対する抗体または抗体断片（組換えＦ
ｖ断片）(Sierra-Madero et al., J. Clin. Microbiol.
26, 1904 (1988)) 。

【００６３】カップリング物質：下記の結合タンパク
質（およびそれらの遺伝子）と一緒のセフタジジム：セ
フタジジムに対する抗体または抗体断片（組換えＦｖ断
片）(Shimizu etal., Int. Arch. Allergy Immunol. 9
8, 392 (1992))。

【００６４】カップリング物質：下記の結合タンパク
質（およびそれらの遺伝子）と一緒のセファレキシン：
セフェムのＣ７位におけるアシル側鎖に対する抗体また
は抗体断片（組換えＦｖ断片）(Nagakura et al., Int.
Arch. Allergy Applied Immunol. 93, 126(1990)) 。

【００６５】カップリング物質：下記の結合タンパク
質（およびそれらの遺伝子）と一緒の葉酸：葉酸結合タ
ンパク質(Ratnam et al., Biochem. 28, 8249 (1989);
Elwood,J. Biol. Chem. 264, 14893 (1989); Sadasivan
et al., Biochem. Biophys. Acta 1131, 91 (1992);葉
酸に対する抗体または抗体断片（組換えＦｖ断片）(Ray
burn et al., Clin. Chem. 30, 1007 (1984)) 。カップ
リング物質：下記の結合タンパク質（およびそれらの
遺伝子）と一緒のレチン酸：細胞性レチン酸結合タンパ
ク質のレチン酸結合ドメイン(Stoner et al, Cancer Re
s. 49, 1497 (1989); Eller et al., Clin. Res. 39, 5
60A (1991)); およびレチン酸に対する抗体または抗体
断片（組換えＦｖ断片）(Twal et al., Developm. Bio
l. 168, 225 (1995); Zhou et al., J. Immunol. Metho
ds 138, 211(1991))。

【００６６】カップリング物質：下記の結合タンパク
質（およびそれらの遺伝子）と一緒のペニシリン：アモ
キシシリンに対する抗体または抗体断片（組換えＦｖ断
片）(Mayorga et al., Toxicol. 97, 225 (1995); Mayo
rga et al., Int. Arch. Allergy Applied Immunol. 9
9, 443 (1992));ベンジルペニシリロイル基に対する抗
体または抗体断片（組換えＦｖ断片）(de Haan et al.,
Int. Arch. Allergy Applied Immunol. 76, 42 (198
5); Fukushima et al., Clin. Exp. Immun. 68, 427 (1
987));ペニシリンに対する抗体または抗体断片（組換え
Ｆｖ断片）(Sierra-Maderoet al., J. Clin. Microbio
l. 26, 1904 (1988));およびペニシリン結合タンパク質
(Popham et al., J. Bacteriol. 177, 326 (1995); J.
Bacteriol. 176, 7197 (1994))。

【００６７】カップリング物質：下記の結合タンパク
質（およびそれらの遺伝子）と一緒の４−ヒドロキシタ
モキシフェンまたはタモキシフェン：エストロゲンレセ
プタータンパク質のエストロゲン結合ドメイン(Spreafi
coet al., Eur. J. Pharmacol. 227, 353 (1992); Gree
n et al., Nature 320, 134 (1986);およびエストロゲ
ンレセプター／エストロゲンまたは４−ヒドロキシタモ
キシフェン複合体に対する抗体または抗体断片（組換え
Ｆｖ断片）(Giambiagi et al., J. Steroid Biochem. 3
0, 213 (1988); Biochim. Biophys. Acta 883, 559 (19
86); Katzenellenbogen et al., Biochem. 26, 2364 (1
987); Tate et al., Breast Cancer Res. Treatm. 3, 2
67 (1983))。

【００６８】カップリング物質：下記の結合タンパク
質（およびそれらの遺伝子）と一緒のテトラサイクリ
ン：テトラサイクリンリプレッサータンパク質(Gossen
et al., PNAS USA 89, 5547 (1992));およびテトラサイ
クリンに対する抗体および抗体断片。

【００６９】カップリング物質：下記の結合タンパク
質（およびそれらの遺伝子）と一緒のテトラサイクリン
およびイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド：テト
ラサイクリンリプレッサータンパク質(Gossen et al.,
PNAS USA 89, 5547 (1992));およびｌａｃリプレッサー
（ｌａｃＩ）タンパク質(Brow et al., Cell 49, 60
3)(1987)) 。

【００７０】本発明によれば、カップリング物質［成分
j)］結合タンパク質ＡおよびＢに対する遺伝子は、融合
タンパク質f)［成分f)、タンパク質Ａ］において、転写
因子タンパク質の活性化ドメインに対する遺伝子に、融
合タンパク質h)［成分h)、タンパク質Ｂ］において、Ｄ
ＮＡ結合タンパク質に対する遺伝子であって、このＤＮ
Ａ結合タンパク質が特異的に結合するように選択される
ものに、活性化配列［成分i)］に、連結される（図８お
よび９を参照されたい）。これに関して、「天然に存在
するタンパク質」は、天然に見られるタンパク質であ
る。従って、「天然に存在するタンパク質」由来の結合
ドメインはヒトが設計した結合ドメインとは異なってい
る。天然に存在するタンパク質は、天然に見出だされて
おり、天然から分離される。「結合ドメイン」に対する
核酸配列情報を別個に用いて、他の配列情報と組み合わ
せて、天然に存在するタンパク質から結合ドメインを形
成することができる。

【００７１】本発明の意味において、例えば、成分f)に
おける活性化ドメインに対するヌクレオチド配列として
下記のものを用いることができる：ヘルペスウイルスＶ
Ｐ１６トランス活性化ドメイン(Greaves et al., J. Vi
rol. 64, 2716 (1990); 65, 6705 (1991));ＮＦ−ｘＢ
転写因子タンパク質のｐ６５サブユニット(Schmitz et
al., EMBO J. 10, 3805 (1991));およびＯｃｔ−２のＣ
末端プロリン濃度の高いＯｃｔ−２ドメインに直接また
は間接的に（例えば、Ｇａｌ４結合タンパク質を介し
て）連結したＯｃｔ−２のＮ末端のグルタミン濃度の高
いドメイン(Tanaka et al., Mol. Cell Biol. 14, 6046
(1994))。

【００７２】例えば、下記のものを、融合タンパク質h)
［成分h)］におけるＤＮＡ結合タンパク質のヌクレオチ
ド配列として、および関連の活性化配列［成分i)］とし
て用いることができる：態様F) 1. Ｇａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインのための
ｃＤＮＡ（アミノ酸１〜１４７；Chasman and Kornber
g, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990) ）、およびその
３′末端におけるＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）
（ＳＶ４０ラージＴ；アミノ酸１２６〜１３２；例え
ば、ＰＫＫＫＲＫＶ；Dingwall et al., TIBS16, 478
(1991)）が結合し、その３′末端におけるＨＳＶ−１
ＶＰ１６酸トランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）（アミノ
酸４０６〜４８８; Trienzenberg et al., Genes Devel
opm. 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen.
Developm. 5, 190 (1995) ）を含んでなる融合タンパク
質h)におけるＤＮＡ結合タンパク質に対するヌクレオチ
ド配列、および 2. Ｇａｌ４タンパク質（Chasman and Kornberg, Mol.
Cell Biol. 10, 2916 (1990) ）と結合する少なくとも
１個の配列［例えば、ヌクレオチド配列：5'-CGGACAACT
GTTCACCG-3' （配列番号１）］、および３′末端に基本
ＳＶ４０プロモーター（核酸４８〜５１９１：Tooze
（監修）, ＤＮＡ腫瘍ウイルス(DNA Tumor Viruses)
（Cold Spring Harbor New York, (1980),ニューヨー
ク; Cold Spring Harbor Laboratory ）、またはｃ−ｆ
ｏｓプロモーター(Das et al., Nature 374, 657 (199
5))、およびその３′末端にＨＳＶ１ＶＰ１６酸トラ
ンス活性化ドメイン（ＴＡＤ）（アミノ酸４０６〜４８
８；Treizenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (19
88); Trizenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5, 190
(1995) ）、またはＵ２ｓｎＲＮＡプロモーター、
および（その３′末端に）ＨＳＶ１ＶＰ１６ＴＡＤま
たはＯｃｔ−２の活性化ドメインの少なくとも１個の配
列（アミノ酸４３８〜４７９; Tanaka et al., Mol. Ce
ll Biol. 14, 6046 (1994); Das et al., Nature 374,
657 (1995)）、またはＨＳＶプロモーター(Papavassi
liou et al., J. Biol. Chem. 265, 9402 (1990); Park
et al., Molec. Endocrinol. 7, 319 (1993))、または
もう一つの非特異的、細胞特異的、ウイルス特異的およ
び／または細胞サイクル特異的に任意の他のプロモータ
ーを含んでなる関連活性化配列［成分i)］を含んでな
る。

【００７３】態様G) 1. ＬｅｘＡタンパク質のＤＮＡ結合ドメインのための
ｃＤＮＡ（アミノ酸１〜８１；Kim et al., Science 25
5, 203 (1992) ）または全ＬｅｘＡタンパク質（アミノ
酸１〜２０２; Brent et al., Cell, 43, 729 (198
5)）、およびその３′末端におけるＳＶ４０核局在化シ
グナル（ＮＬＳ）（ＳＶ４０ラージＴ；アミノ酸１２６
〜１３２；例えば、ＰＫＫＫＲＫＶ；Dingwall et al.,
TIBS 16, 478(1991)）、その３′末端におけるＨＳＶ
−１ＶＰ１６酸トランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）
（アミノ酸４０６〜４８８; Trienzenberg et al., Gen
es Developm. 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opi
n. Gen. Developm. 5, 190 (1995)）を含んでなる融合
タンパク質h)におけるＤＮＡ結合タンパク質に対するヌ
クレオチド配列、および 2. 関連活性化配列［成分i)］：ＬｅｘＡタンパク質
［ＬｅｘＡオペレーター; Brent et al., Nature 612,3
12 (1984)］と結合する少なくとも１個の配列［例え
ば、ヌクレオチド配列：5'-TACTGTATGTACATACAGTA-3'
（配列番号２）であって、その３′末端に基本ＳＶ４０
プロモーター（核酸４８〜５１９１：Tooze （監修）,
ＤＮＡ腫瘍ウイルス(DNA Tumor Viruses) （Cold Sprin
g Harbor New York, (1980),ニューヨーク; Cold Sprin
g Harbor Laboratory ）、またはもう一つのプロモータ
ー（態様Ｆを参照されたい）が結合しているものを含ん
でなる。

【００７４】態様H) 1. ｌａｃリプレッサー（ｌａｃＩ）タンパク質(Bro
wn et al., Cell 49, 603 (1987); Fuerst et al., PNA
S USA 86, 2549 (1989))に対するｃＤＮＡ、およびその
３′末端におけるＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）
（ＳＶ４０ラージＴ；アミノ酸１２６〜１３２；例え
ば、ＰＫＫＫＲＫＶ；Dingwall et al., TIBS 16, 478
(1991)）、およびその３′末端におけるＨＳＶ−１Ｖ
Ｐ１６酸トランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）（アミノ酸
４０６〜４８８; Trienzenberg et al., Genes Develop
m. 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. De
velopm. 5, 190 (1995) ）を含む融合タンパク質h)にお
けるＤＮＡ結合タンパク質に対するヌクレオチド配列、
および 2. ｌａｃＩリプレッサータンパク質(Fuerst et a
l., PNAS USA 86, 2549 (1989); Simons et al., PNAS
USA 81, 1624 (1984) ）と結合する少なくとも１個のｌ
ａｃオペレーター配列（例えば、ヌクレオチド配列：5'
-GAATTGTGAGCGCTCACAATTC-3'（配列番号３））、および
その３′末端における基本ＳＶ４０プロモーター（核酸
４８〜５１９１：Tooze （監修）, ＤＮＡ腫瘍ウイルス
(DNA Tumor Viruses) （Cold Spring Harbor New York,
(1980),ニューヨーク; Cold SpringHarbor Laboratory
）、またはもう一つのプロモーター（態様Ｆを参照さ
れたい）を含む関連活性化配列［成分i)］を含んでな
る。

【００７５】態様I) 1. テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）タン
パク質(Gossen et al.,PANS USA 89, 5547 (1992); Din
germann et al., EMBO J. 11, 1487 (1992)) に対する
ｃＤＮＡ、およびその３′末端におけるＳＶ４０核局在
化シグナル（ＮＬＳ）（ＳＶ４０ラージＴ；アミノ酸１
２６〜１３２；例えば、ＰＫＫＫＲＫＶ；Dingwall et
al., TIBS 16, 478 (1991)）、およびその３′末端にＨ
ＳＶ−１ＶＰ１６酸トランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）
（アミノ酸４０６〜４８８; Trienzenberg et al., Gen
es Developm. 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opi
n.Gen. Developm. 5, 190 (1995) ）を含んでなる融合
タンパク質h)におけるＤＮＡ結合タンパク質に対するヌ
クレオチド配列、および 2. テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）タン
パク質と結合する少なくとも１個のテトラサイクリンオ
ペレーター（ｔｅｔＯ）配列（例えば、ヌクレオチド
配列：5'-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAA
G-3'（配列番号４））、およびその３′末端における基
本ＳＶ４０プロモーター（核酸４８〜５１９１：Tooze
（監修）, ＤＮＡ腫瘍ウイルス(DNA Tumor Viruses)
（Cold Spring Harbor New York, (1980),ニューヨー
ク; Cold Spring Harbor Laboratory ）、またはもう一
つのプロモーター（態様Ｆを参照されたい）を含む関連
活性化配列［成分i)］を含んでなる。

【００７６】態様J) 1. ＺＦＨＤ−１タンパク質(Pomeranz et al., Scienc
e 267,93 (1995))に対するｃＤＮＡ、およびその３′末
端におけるＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）（ＳＶ
４０ラージＴ；アミノ酸１２６〜１３２；例えば、ＰＫ
ＫＫＲＫＶ；Dingwall et al., TIBS 16, 478 (199
1)）、およびその３′末端におけるＨＳＶ−１ＶＰ１６
酸トランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）（アミノ酸４０６
〜４８８; Trienzenberg et al., Genes Developm. 2,
718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Develop
m. 5, 190 (1995) ）を含んでなるＤＮＡ結合タンパク
質に対するヌクレオチド配列、および 2. ＺＦＨＤ−１タンパク質(Pomeranz et al., Scienc
e 267,93 (1995))と結合する少なくとも１個の配列（例
えば、ヌクレオチド配列：5'-TAATGATGGGCG-3'（配列番
号５）］、およびその３′末端における基本ＳＶ４０プ
ロモーター（核酸４８〜５１９１：Tooze （監修）, Ｄ
ＮＡ腫瘍ウイルス(DNA Tumor Viruses) （Cold Spring
Harbor New York, (1980),ニューヨーク; Cold Spring
Harbor Laboratory ）、またはもう一つのプロモーター
（態様Ｆを参照されたい）を含んでなる関連活性化配列
を含んでなるもの。

【００７７】3) プロモーター配列本発明の意味では、転写因子タンパク質に結合した後
に、３′末端の隣接位置にある構造遺伝子の転写を活性
化するヌクレオチド配列をプロモーター配列として用い
る［成分b)、e)、g)およびi)］。プロモーター配列の選
択は、治療を行う疾患および形質導入される標的細胞に
よって変わる。従って、プロモーター配列は、非制限的
に、特定の代謝条件下では標的細胞特異的に、細胞サイ
クル特異的に、またはウイルス特異的に活性化すること
ができる。更に、同一または異なるプロモーター配列
を、成分b)、e)および／またはg)、および成分i)に用い
ることができる。既に態様A)に引用されているプロモー
ター配列の他のプロモーター配列の例は、下記のもので
ある。

【００７８】非制限的に活性化できるプロモーターおよ
び活性化配列ＲＮＡポリメラーゼIII プロモーターＲＮＡポリメラーゼIIプロモーターＣＭＶプロモーターおよびＣＭＶエンハンサーＳＶ４０プロモーターウイルスプロモーター配列および活性化配列、例えばＨＢＶＨＣＶＨＳＶＨＰＶＥＢＶＨＴＬＶＨＩＶＨＩＶプロモーターを用いるときには、ＴＡＲ配列（位
置≦−４５３〜≧＋８０，Rosen et al., Cell 41, 813
(1985))を含む全ＬＴＲ配列がウイルス特異的プロモー
ターとして用いられる。

【００７９】代謝的に活性化することができるプロモー
ター配列またはエンハンサー配列、例えば低酸素症によ
って誘導可能なエンハンサーまたはプロモーター。

【００８０】細胞サイクル特異的に活性化することがで
きるプロモーター、例えばｃｄｃ２５Ｃ遺伝子プロモー
ター、サイクリンＡ遺伝子プロモーター、ｃｄｃ２遺伝
子プロモーター、Ｂ−ｍｙｂ遺伝子プロモーター、ＤＨ
ＦＲ遺伝子プロモーターまたはＥ２Ｆ−１プロモータ
ー、または細胞増殖中に現れるまたは活性化される転写
因子タンパク質に対する結合配列。これらの結合配列と
しては、例えばｃ−ｍｙｃタンパク質に対する結合配列
が挙げられる。これらの結合配列としては、ｍｙｃＥ
ボックスと呼ばれるヌクレオチド配列のモノマーまたは
マルチマー、例えば［5'-GGAAGCAGAC-CACGTGGTCTGCTTCC
-3'（配列番号６）, Blackwood and Eisenmann, Scienc
e 251, 1211 (1911)］も挙げられる。

【００８１】テトラサイクリンによって活性化できるプ
ロモーター、例えば相当するリプレッサーと組み合わせ
たテトラサイクリンオペレーター。

【００８２】キメラプロモーターキメラプロモーターは、細胞特異的に、代謝的にまたは
ウイルス特異的に活性化することができる上流の活性化
因子配列と、ＣＤＦおよびＣＨＦまたはＥ２ＦおよびＣ
ＨＦファミリーの転写因子タンパク質に結合することが
でき、これによって細胞サイクルのＧ０およびＧ１相に
おける上流の活性化因子配列の活性化を阻害することが
できる顆粒のプロモーターモジュールとの組み合わせを
構成する。

【００８３】例えば、プロモーターのＴＡＴＡボックス
が突然変異を行い、この突然変異がＴＡＴＡ結合タンパ
ク質の遺伝子における相当する突然変異によって相殺さ
れ、このＴＡＴＡ結合タンパク質が別のプロモーターに
よって制御される形態でのハイブリッドプロモーター。

【００８４】細胞特異的に活性化することができるプロ
モーター。

【００８５】これらのプロモーターとしては、選択され
る細胞中のタンパク質を好ましくコードする遺伝子から
のプロモーターまたは活性化因子配列が挙げられる。

【００８６】例えば、本発明の意味では、下記の細胞に
おける下記タンパク質に対するプロモーターを用いるの
が好ましい。

【００８７】内皮細胞で活性化されるプロモーター配列
または活性化因子配列脳特異的な内皮グルコース−１−トランスポーターエンドグリンＶＥＧＦレセプター１（ｆｌｔ−１）ＶＥＧＦレセプター２（ｆｌｋ−１，ＫＤＲ）ｔｉｌ−１またはｔｉｌ−２Ｂ６１レセプター（Ｅｃｋレセプター）Ｂ６１エンドセリン、具体的にはエンドセリンＢエンドセリン−１エンドセリンレセプター、特にエンドセリンＢレセプタ
ーＩＬ−１α，ＩＬ−１β ＩＬ−１レセプター脈管細胞付着分子（ＶＣＡＭ−１）合成活性化因子配列天然の内皮特異的プロモーターの代替物としては、内皮
細胞で優先的または選択的に活性を有する転写因子タン
パク質に対するオリゴマー化した結合部位を含んでなる
合成活性化因子配列を用いることもできる。これらの転
写因子タンパク質の一例は転写因子タンパク質ＧＡＴＡ
−２であり、エントセリン−１遺伝子における結合部位
が例えば５′−ＴＴＡＴＣＴ−３′であるものである。

【００８８】活性化した内皮細胞に隣接する細胞で活性
化されるプロモーターまたは活性化因子配列ＶＥＧＦＶＥＧＦ遺伝子に対する遺伝子制御配列は５′隣接領
域、または３′隣接領域、またはｃ−Ｓｒｃ遺伝子、ま
たはｖ−Ｓｃｒ遺伝子。

【００８９】ステロイドホルマリンレセプターおよびそ
のプロモーター要素(Truss and Beato, Endocr. Rev. 1
4, 459 (1993))、特にマウス哺乳類腫瘍ウイルスプロモ
ーター筋肉細胞、特に平滑筋細胞で活性化されるプロモーター
または活性化因子配列トロポミオシン α−アクチン α−ミオシンＰＤＧＦに対するレセプターＦＧＦに対するレセプターＭＲＦ−４ホスホフルクトキナーゼＡホスホグリセレート・ムターゼトロポニンＣミオゲニンエンドセリンＡに対するレセプターデスミンＶＥＧＦＶＥＧＦ遺伝子に対する遺伝子制御配列は、「活性化し
た内皮細胞に隣接する細胞で活性化されるプロモータ
ー」の節で既に列記されている（上記を参照された
い）。

【００９０】「人工的」プロモーターヘリックス−ループ−ヘリックス（ＨＬＨ）ファミリー
の因子（ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ−５、ミオゲンおよびＭＲＦ
４）は、筋肉特異的転写活性化因子であることが報告さ
れている。筋肉特異的な転写活性化因子としては、ジン
クフィンガータンパク質ＧＡＴＡ−４およびＭＥＦ転写
因子グループも挙げられる。

【００９１】ＨＬＨタンパク質およびＧＡＴＡ−４も、
筋肉特異的遺伝子のプロモーターとだけでなく、異種
的、すなわち人工的プロモーターとでも同様に筋肉特異
的転写を示す。これらの人工的プロモーターの例は、下
記の通りである筋肉特異的ＨＬＨタンパク質に結合するためのＤＮＡ部
位の複数のコピー、例えばＥボックス（ＭｙｏＤ）
（例えば、4×AGCAGGTGTTGGGAGGC（配列番号７）） α−ミオシン重鎖遺伝子のＧＡＴＡ−４に結合するため
のＤＮＡ部位の複数のコピー（例えば、5'-GGCCGATGGGC
AGATA-GAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG3'（配列番号８））グリア細胞で活性化されるプロモーターおよび活性化因
子配列これらとしては、特に例えば、それぞれ下記のタンパク
質をコードする遺伝子からの遺伝子制御配列または要素
が挙げられる。

【００９２】シュバン細胞特異的タンパク質ペリアキシ
ングルタミンシンターゼグリア細胞特異的タンパク質（グリア細胞の繊維状の酸性タンパク質＝ＧＦＡＰ）グリア細胞タンパク質Ｓ１００ｂＩＬ−６（ＣＮＴＦ）５−ＨＴレセプターＴＮＦα ＩＬ−１０インシュリン様成長因子レセプターＩおよびII ＶＥＧＦＶＥＧＦ遺伝子に対する遺伝子制御配列は、既に上記に
列記されている。

【００９３】増血細胞で活性化されるプロモーターおよ
び活性化因子配列これらの遺伝子制御配列としては、サイトカインまたは
そのレセプターに対する遺伝子が挙げられ、これらの遺
伝子は増血細胞または支質のような隣接細胞で発現され
る。

【００９４】これらの配列としては、例えば下記のサイ
トカインおよびそれらのレセプターに対するプロモータ
ー配列が挙げられる。

【００９５】幹細胞因子レセプター幹細胞因子ＩＬ−１α ＩＬ−１レセプターＩＬ−３ＩＬ−３レセプター（αサブユニット）ＩＬ−３レセプター（βサブユニット）ＩＬ−６ＩＬ−６レセプターＧＭ−ＣＳＦＧＭ−ＣＳＦレセプター（α鎖）インターフェロン制御配列１（ＩＲＦ−１）ＩＲＦ−１のプロモーターは、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β
またはＩＦＮ−γによってと同程度までＩＬ−６によっ
て活性化される。

【００９６】エリスロポエチンエリスロポエチンレセプターリンパ球および／またはマクロファージで活性化される
プロモーターおよび活性化因子配列これらには、例えばサイトカイン、サイトカインレセプ
ターおよび付着分子に対する遺伝子のプロモーター配列
および活性化員し配列、およびおよび抗体のＦｃ断片に
対するレセプターが挙げられる。

【００９７】これらの後者の例は、下記の通りである。ＩＬ−１レセプターＩＬ−１α ＩＬ−１β ＩＬ−２ＩＬ−２レセプターＩＬ−３ＩＬ−３レセプター（αサブユニット）ＩＬ−３レセプター（βサブユニット）ＩＬ−４ＩＬ−４レセプターＩＬ−５ＩＬ−６インターフェロン制御因子１（ＩＲＦ−１）（ＩＲＦ−１のプロモーターはＩＦＮ−αまたはＩＦＮ
−βによってと同程度までＩＬ−６によって活性化され
る）。ＩＦＮ−γ−応答性プロモーターＩＬ−７ＩＬ−８ＩＬ−１０ＩＬ−１１ＩＦＮ−γ ＧＭ−ＣＳＦＧＭ−ＣＳＦレセプター（α鎖）ＩＬ−１３ＬＩＦマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）レセプ
ターＩおよびII型スキャベンジャーマクロファージレセプタ
ーＭＡＣ−１（白血球機能抗原）ＬＦＡ−１α（白血球機能抗原）ｐ１５０，９５（白血球機能抗原）滑膜細胞で活性化されるプロモーター配列および活性化
因子配列これらには、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭ
Ｐ）、例えばＭＭＰ−１（間隙コラゲナーゼ）ＭＭＰ−３（支質リシン／トランシン）に対するプロモーター配列が挙げられる。

【００９８】また、これらには、メタロプロテイナーゼ
の組織阻害薬（ＴＩＭＰ）、例えばＴＩＭＰ−１ＴＩＭＰ−２ＴＩＭＰ−３に対するプロモーター配列が挙げられる。

【００９９】白血球細胞で活性化されるプロモーターお
よび活性化因子配列これらとしては、例えばｃ−ｍｙｃＨＳＰ−７０ｂｅ１−１／サイクリンＤ−１ｂｃ１−２ＩＬ−６１１−１０ＮＦα，ＴＮＦβ ＨＯＸ−１１ＢＣＲ−Ａｂ１Ｅ２Ａ−ＰＢＸ−１ＰＭＬ−ＲＡＲＡ（前骨髄細胞白血秒−レチン酸レセプター）ｃ−ｍｙｃに対するプロモーターが挙げられる。ｃ−ｍｙｃタンパ
クは、ｍｙｃＥボックスと呼ばれるヌクレオチド配列
のマルチマー（例えば、5'-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTC
C-3'（配列番号６））に結合して、活性化する。腫瘍細胞に対するプロモーターまたは活性化因子配列腫瘍細胞で形成されまたは活性である転写因子タンパク
質が相互作用する遺伝子制御ヌクレオチド配列は、プロ
モーター配列または活性化因子配列とする。

【０１００】本発明の意味では、好ましいプロモーター
または活性化因子配列としては、特に癌細胞または肉腫
細胞で形成されるタンパク質をコードする遺伝子由来の
それぞれ遺伝子制御配列または要素が挙げられる。従っ
て、小細胞気管支癌の場合には、Ｎ−ＣＡＭタンパク質
のプロモーターの使用が優先し、卵巣癌の場合には、肝
細胞成長因子レセプターまたはＬ−プラスチンのプロモ
ーターの使用が優先し、また膵臓癌の場合には、Ｌ−プ
ラスチンまたは多型上皮ムチン（ＰＥＭ）の使用が優先
する。

【０１０１】4) 核輸出シグナルおよび核輸出因子本発明の意味では、核輸出シグナル（ＮＥＳ）は、レト
ロウイルスｒｅｖ−応答性要素（ＲＲＥ）配列であるの
が好ましい。ＨＩＶ−１の場合には、このＲＲＥは、ｅ
ｎｖ遺伝子(Malim et al., Nature 338, 254 (1989); K
jems et al., PNAS 88, 683 (1991)) における２４３個
のヌクレオチド（ヌクレオチド７３６２〜７５９５; Mu
esing et al., Nature 313,450 (1985))の配列である。
しかしながら、本発明の意味では、核輸出シグナル（Ｎ
ＥＳ）は、任意の同種および／または機能的に同様な
（相似の）ヌクレオチド配列、例えばＨＢＶウイルスＲ
ＲＥ−相当要素(Huang et al., Mol. Cell Biol. 13, 7
476 (1993)) であることもできる。

【０１０２】新規な核酸構築物では、核輸出因子（ＮＥ
Ｆ）は、ＮＲＳのｍＲＮＡに結合し、細胞核から細胞質
への（または細胞質から細胞核への）ＮＲＳ含有プレメ
ッセンジャーＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡの輸送
を媒介するタンパク質をコードするヌクレオチド配列で
ある。本発明の意味では、特に、レトロウイルス、具体
的にはＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２ウイルスからのｒｅ
ｖ遺伝子が使用される(Daly et al., Nature 342, 816
(1989); Emerman et al., Cell 57, 1155 (1989); Felb
er et al., PNAS 86, 1495 (1989); Fischer et al., E
MBO J. 13, 4105 (1994)) 。

【０１０３】レトロウイルスｒｅｖ遺伝子のｒｅｖタン
パク質は、そのＮ末端ドメイン(Zapp et al., Nature 3
42, 7154 (1989); Malim et al., Cell 65, 241 (199
1)) によってプレ−ｍＲＮＡのＲＲＥに結合する(Iwai
et al., Nucl. Acids Rex. 20,6465 (1992)) 。ＲＲＥ
とｒｅｖタンパク質との結合により、未スプライスプレ
メッセンジャーＲＮＡ、およびＲＲＥを含む任意の他の
ＲＮＡの細胞核から細胞質への輸送が促進され(Fischer
et al., EMBO J. 13, 4105 (1994); Fischer etal., C
ell 82, 475 (1995))、これによって翻訳が実質的に促
進される。

【０１０４】本発明の意味では、ＨＩＶｒｅｖタンパ
ク質(Bogerd et al., Cell 82, 485(1995))、例えばビ
スナ−マエディウイルス（ＶＭＶ; Tiley et al., J. V
irol. 65, 3877 (1991))ｒｅｖ遺伝子またはヤギ関節炎
脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ; Tiley et al., J. Virol. 6
5, 3877 (1991))ｒｅｖ遺伝子に相同であり機能的に類
似のタンパク質をコードするヌクレオチド配列をＮＥＦ
として用いることもできる。

【０１０５】しかしながら、本発明の意味では、ｒｅｖ
タンパク質とわずかしかまたはまったく相同性を持たな
いが、機能的にはＨＩＶ−１ｒｅｖタンパク質に類似
しているタンパク質をコードする遺伝子を用いることも
できる。

【０１０６】これらの遺伝子としては、例えばＨＴＬＶ
−１ｒｅｖ遺伝子(Cullen, Microbiol. Rev. 56, 375
(1992))およびウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）お
よびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）のｒｅｖ遺伝子(M
anusco et al., J. Virol. 68, 1988 (1994)) が挙げら
れる。

【０１０７】もう一つの態様では、ＮＥＦはＮＲＳによ
って核に保持されるＲＮＡのないときでも核からＲＮＡ
の分泌を行うタンパク質のヌクレオチド配列であること
もできる。これらのタンパク質としては、例えば転写因
子タンパク質ＴＦIII Ａ(Gaddat et al., Cell 60, 619
(1990); Drew et al., Gene 159, 215 (1995)) 、また
は異種核リボ核タンパク質Ａ１（ｈｎＲＮＰＡ１タンパ
ク質; Pinol-Roma etal., Nature 355, 730 (1992))が
挙げられる。

【０１０８】広義には、核輸送タンパク質としては、熱
ショックタンパク質７０（ｈｓｐ７０; Mandell et a
l., J. Cell Biol. 111, 1775 (1990)) またはタンパク
質キナーゼ阻害薬ＣＰＫＩ(Fantozzi et al., J. Biol.
Chem. 269, 2676 (1994); Wenet al., J. Biol. Chem.
269, 32214 (1994))も挙げられる。

【０１０９】ＮＥＦおよびその相同および類似タンパク
質が普通に有する特徴は、ＮＲＳＲＮＡにモノマー性タ
ンパク質を結合するもう一つのアミノ末端に位置するド
メイン(J. Virol. 64, 881 (1990); Kjems et al., EMB
O J. 11, 119 (1992))、および通常はロイシン濃度が高
く（ｈｎＲｎＰＡ１はこの例外である）ＮＥＦの輸送機
能に必要なドメイン(Wen et al., Cell 82, 463 (199
5); Fischer et al.,Cell 82, 475 (1995); Malim et a
l., J. Virol. 65, 4248 (1991); Venkateshet al., Vi
rol. 178, 327 (1990)) の存在である。

【０１１０】本発明の意味では、ＮＥＦ遺伝子の発現
は、ＮＥＦ遺伝子（図２および７を参照されたい、上記
に既述）または薬理学的に制御可能なプロモーターモジ
ュール（図８および９を参照されたい）の５′末端上流
に位置しているプロモーター配列［成分b''') ］によっ
て制御される。

【０１１１】5) 内部リボソーム入口部位（ＩＲＥＳ）内部リボソームエントリー部位（entry site）によっ
て、ＩＲＥＳによって互いに連結（「相互連結」）して
いる２個のＤＮＡ配列を発現することができる。この性
質のＩＲＥＳは、例えばMontford and Smith TIG 11, 1
79 (1995); Kaufman et al., Nucl. Acids Res. 19, 44
85 (1991); Morgan et al., Natl. Acids Res. 20, 129
3 (1992); Dirks et al., Gene 128, 247 (1993); Pell
etier and Sonenberg, Nature 334, 320 (1988) 、およ
びSugimoto et al., Bio/Techn.12, 694 (1994)によっ
て報告されている。従って、例えばポリオウイルスＩＲ
ＥＳ配列（５′ＵＴＲの位置≦１４０〜≧６３０(Pelle
tier and Sonenberg, Nature 334, 320 (1988)) を用い
て、成分c)のＤＮＡを成分d)のＤＮＡに連結することが
できる。

【０１１２】6) 構造遺伝子本発明の意味では、構造遺伝子［成分c)］は、疾患の予
防および／または治療の目的で活性化合物をコードす
る。構造遺伝子およびプロモーター配列は、疾患の療法
の性質に関して、形質導入される標的細胞を考慮して選
択すべきである。例えば、プロモーター配列（例、節3)
を参照されたい）と構造遺伝子の下記の組み合わせが、
下記の疾患に関して選択される。 a) 腫瘍の治療標的細胞：増殖する内皮細胞、または内皮細胞に隣接す
る支質細胞および筋細胞、または腫瘍細胞または白血病
細胞プロモーター：内皮細胞特異的および細胞サイクル特異
的、または細胞非特異的または筋細胞特異的および細胞
サイクル特異的、または腫瘍細胞特異的（固形腫瘍およ
び白血病）細胞増殖の阻害薬、例えば網膜芽細胞腫タンパク質（ｐ
Ｒｂ＝ｐ１１０）または関連ｐ１０７およびｐ１３０タンパク質ｐ５３タンパク質ｐ２１（ＷＡＦ−１）タンパク質ｐ１６タンパク質他のｃｄｋ阻害薬ＧＡＤＤ４５タンパク質ｂａｋタンパク質に対する構造遺伝子。網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ
／ｐ１１０）および関連ｐ１０７およびｐ１３０タンパ
ク質は、リン酸化によって不活性化される。これらのタ
ンパク質の機能のない発現タンパク質の不活性化部位に
対する突然変異を示すことによって損傷しているこれら
の細胞サイクル阻害薬に対する遺伝子が優先的に用いら
れる。これらの突然変異の例は、ｐ１１０の場合に報告
されている。ｐ１０７タンパク質またはｐ１３０タンパ
ク質に対するＤＮＡ配列は、同様にして突然変異する。
細胞において、ｐ５３タンパク質は、ＭＤＭ２のような
特殊なタンパク質に結合することによって、または脱リ
ン酸化Ｃ末端セリン３９２によるｐ５３のオリゴマー化
によって不活性化される。従って、セリン３９２を除去
することによってＣ末端が切断されたｐ５３タンパク質
に対するＤＮＡ配列が優先的に用いられる。

【０１１３】凝固誘発因子および脈管形成阻害薬に対す
る構造遺伝子、例えばプラスミノーゲン活性化因子阻害薬−１（ＰＡＩ−１）ＰＡＩ−２ＰＡＩ−３アンギオスタチンインターフェロン、特に＊ＩＦＮα ＊ＩＦＮβ ＊ＩＦＮγ ＊血小板因子４＊ＩＬ−１２＊ＴＩＭＰ−１＊ＴＩＭＰ−２＊ＴＩＭＰ−３＊白血病阻止因子（ＬＩＦ）＊組織因子（ＴＦ）およびその凝固活性断片細胞増殖抑制および細胞毒性タンパク質、例えばパーホリングランチームＩＬ−２ＩＬ−４ＩＬ−１２インターフェロン、例えば＊ＩＦＮα ＊ＩＦＮβ ＊ＩＦＮγ ＴＮＦ、特に＊ＴＮＦα ＊ＴＮＦβ オンコスタチンＭスフィンゴミエリナーゼマガイニンおよびマガイニン誘導体に対する構造遺伝子。

【０１１４】細胞増殖抑制および細胞毒性抗体、および
抗原結合抗体断片と、細胞増殖抑制、細胞毒性または炎
症誘発タンパク質または酵素との融合タンパク質に対す
る構造遺伝子細胞増殖抑制または細胞毒性抗体としては、例えばBurr
ows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155 (1994))、Hughes
et al. (Cancer Res. 49, 6214 (1989)) 、およびMaru
yama et al. (PNAS USA 87, 5744 (1990))によって報告
された内皮細胞の膜構造に指向しているものが挙げられ
る。これらの抗体としては、特にＶＥＧＦレセプターに
対する抗体が挙げられる。

【０１１５】これらの抗体としては、腫瘍細胞上の膜構
造に対して指向した細胞増殖抑制または細胞毒性抗体も
挙げられる。この種の抗体は、例えばSedlacek et al.,
Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag,ミュンヘン(1
988)、およびContrib. to Oncol. 43, Karger Verlag,
ミュンヘン(1992)によって概説されている。他の例は、＊シアリル・ルイス(sialyl Lewis) ＊Ｔ細胞によって認識される腫瘍上のペプチド＊腫瘍遺伝子によって発現されるタンパク質＊ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＭ２、９−Ｏ−アセチル、ＧＤ
３、フコシルＧＭ１のようなガングリオシド＊血液型抗原およびその前駆体＊多型上皮ムチン上の抗原＊熱ショックタンパク質上の抗原に対する抗体である。

【０１１６】これらの抗体としては、白血病細胞の膜構
造に指向している抗体も挙げられる。この種の多数のモ
ノクローナル抗体は、診断および治療法について既に記
載されている（Kristensen, Danish Medical Bulletin
41, 52 (1994); Schranz, Therapia Hungarica 38, 3
(1990); Drexler et al., Leuk. Res. 10, 279 (1986);
Naeim, Dis. Markers 7, 1 (1989); Stickney et al.,
Curr. Opin. Oncol. 4, 847 (1992); Drexler et al.,
Blut 57 327 (1988); Freedman et al., Cancer Inves
t. 9, 69 (1991)の総説）。白血病の型によっては、下
記のモノクローナル抗体、またはその抗原結合抗体断片
は、例えばリガンドとしての使用に好適である。

【０１１７】

【表１】

【０１１８】ネズミ抗体のヒト化、およびＦａｂおよび
組換えＦｖ断片に対する遺伝子の作製および最適化は、
組換えＦｖ断片を作成する目的で既に記載されている方
法と同様にして行う（節２を参照されたい）。組換えＦ
ｖ断片を、当業者に知られている当該技術分野の状態に
従って細胞増殖抑制、細胞毒性または炎症誘発タンパク
質に対する遺伝子と融合させる。

【０１１９】標的細胞結合リガンドと細胞増殖抑制およ
び細胞毒性タンパク質との融合タンパク質に対する構造
遺伝子これらには、内皮細胞上の膜構造または膜レセプターに
結合する総ての物質が挙げられる。例えば、それらとし
ては、ＩＬ−１または成長因子、またはそれらの断片ま
たはそれらの部分配列であって、ＰＤＧＦ、ｂＦＧＦ、
ＶＥＧＦ、およびＴＧＦβのような内皮細胞によって発
現されるレセプターに結合するものが挙げられる(Puszt
ain et al., J. Pathol. 169, 191 (1993)) 。

【０１２０】それらとしては、活性化および／または増
殖内皮細胞に結合する付着分子も挙げられる。この種の
付着分子、例えばＳｌｅｘ、ＬＦＡ−１、ＭＡＣ−１、
ＬＥＣＡＭ−１、ＶＬＡ−４またはビトロネクチンは、
既に報告されている（Augustin-Voss et al., J. Cell
Biol. 119, 483 (1992), Pauli et al. Cancer Metas.
Rev. 9, 175 (1990), Honn et al., Cancer Metast. Re
v. 11, 353 (1992),およびVarner et al., Cell Adh. C
ommun. 3, 367 (1995)の総説）。

【０１２１】これらには、腫瘍細胞または白血病細胞の
膜構造または膜レセプターに結合する物質も挙げられ
る。例えば、それらの物質としては、成長因子、または
それらの断片またはそれらの部分配列であって、白血病
細胞または腫瘍細胞によって発現されるレセプターに結
合するものが挙げられる。この種の成長因子は、既に報
告されている（Cross et al., Cell 64, 271 (1991), A
ulitzky et al., Drugs 48, 667 (1994), Moore, Clin.
Cancer Res. 1,3 (1995)およびVan Kooten et al., Le
uk. Lymph. 12, 27 (1993) の総説）。

【０１２２】標的細胞に結合するこれらのリガンドに対
する遺伝子は、当該技術分野の状態に従って、当業者に
知られている方法を用いて、細胞増殖抑制、細胞毒性、
または炎症誘発タンパク質または酵素に対する遺伝子と
融合する。

【０１２３】炎症の誘発因子に対する構造遺伝子、例え
ば下記のものに対するものＲＮＡＴＥＳ（ＭＣＰ−２）単球走化性および活性化因子（ＭＣＡＦ）ＩＬ−８マクロファージ炎症タンパク質−１（ＭＩＰ−１α，−
β）好中球活性化タンパク質−２（ＮＡＰ−２）ＩＬ−３ＩＬ−５ヒト白血病阻止因子（ＬＩＦ）ＩＬ−７ＩＬ−１１ＩＬ−１３ＧＭ−ＣＳＦＧ−ＣＳＦＭ−ＣＳＦコブラ毒因子（ＣＶＦ）またはＣＶＦの部分配列であっ
て、機能的にヒト補体因子Ｃ３ｂに相当するもの、すな
わち補体因子Ｂに結合することができ、かつ因子Ｄによ
る開裂の後にＣ３コンベルターゼを構成するもの。ヒト
補体因子Ｃ３またはその部分配列Ｃ３ｂ。機能的および
構造的にＣＶＦに似ているヒト補体因子Ｃ３の開裂生成
物。補体を活性化するまたは炎症を誘導する細菌性タン
パク質、例えばSalmonella typhimurium porins, Staph
ylococcus aureus凝固因子、モジュリン、特にグラム陰
性菌のもの、レジュネラまたは血友病インフルエンザＢ
型、またはクレブシエラの主要な外膜タンパク質、また
は群ＧのスタフィロコッカスのＭ分子。

【０１２４】細胞増殖抑制剤の前駆体を活性化する酵
素、例えば不活性な前駆物質（プロドラッグ）を開裂す
ることによって活性な細胞増殖抑制剤（ドラッグ）を形
成する酵素に対する構造遺伝子。

【０１２５】この種の物質、および互いに関連している
プロドラッグおよびドラッグは、Deonarain et al. (B
r. J. Cancer 70, 786 (1994)) 、Mullen (Pharmac. Th
er. 63, 199(1994)) 、およびHarris et al. (Gene The
r. 1, 170 (1994))によって概説されている。例えば、
下記の酵素の一つに対するＤＮＡ配列が用いられる。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ細菌性ニトロレダクターゼ細菌性β−グルクロニダーゼ Scale cereale 由来の植物β−グルクロニダーゼヒトβ−グルクロニダーゼヒトカルボキシペプチダーゼ（ＣＢ）、例えば＊マスト細胞ＣＢ−Ａ＊膵臓ＣＢ−Ｂ＊細菌性カルボキシペプチダーゼ＊細菌性β−ラクタマーゼ＊細菌性シトシンデアミナーゼ＊ヒトカタラーゼまたはペルオキシダーゼ＊ホスファターゼ、特に＊ヒトアルカリホスファターゼ＊ヒト酸性前立腺ホスファターゼ＊５型酸性ホスファターゼ＊オキシダーゼ、特に＊ヒトリシルオキシダーゼ＊ヒト酸性Ｄ−アミノオキシダーゼペルオキシダーゼ、特に＊ヒトグルタチオンペルオキシダーゼ＊ヒト好酸性ペルオキシダーゼ＊ヒト甲状腺ペルオキシダーゼ β−ガラクトシダーゼ

【０１２６】b) 自己免疫疾患および炎症の治療標的細胞：増殖する内皮細胞、またはマクロファージお
よび／またはリンパ球、または滑膜細胞プロモーター：内皮細胞特異的および細胞サイクル特異
的、またはマクロファージ特異的および／またはリンパ
球特異的および／または細胞サイクル特異的滑膜細胞特異的および／または細胞サイクル特異的アレルギーの治療に対する構造遺伝子、例えば下記のも
のに対するものＩＦＮ−β ＩＦＮ−γ ＩＬ−１０ＩＬ−４に対する抗体または抗体断片可溶性ＩＬ−４レセプターＬ−１２ＴＧＦβ 移植した期間の拒絶を防止するための構造遺伝子、例え
ば下記のものに対するものＩＬ−１０ＴＧＦβ 可溶性ＩＬ−１レセプター可溶性ＩＬ−２レセプターＩＬ−１レセプター拮抗薬可溶性ＩＬ−６レセプター免疫抑制性抗体またはそれらのＶ_Ｈ−およびＶ_Ｌ−含有
断片、またはまたは例えばMarasco et al. (Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 90, 7889 (1993)) によって記載さ
れた方法に従って作成されるリンカーによって接続され
ているそれらのＶ_ＨおよびＶ_Ｌ断片。免疫抑制抗体およ
びの例は、下記のような抗体である。＊Ｔ細胞レセプターまたはそのＣＤ３複合体に特異的＊ＣＤ４またはＣＤ８に指向、および＊ＩＬ−２レセプター、ＩＬ−１レセプターまたはＩ
Ｌ−４レセプターに指向、または＊付着分子ＣＤ２、ＬＦＡ−１、ＣＤ２８またはＣＤ
４０に指向したもの。

【０１２７】抗体によって媒介される自己免疫疾患の治
療のための構造遺伝子、例えばＴＦＧβ ＩＦＮ−α ＩＦＮ−β ＩＦＮ−γ ＩＬ−１２可溶性ＩＬ−４レセプター可溶性ＩＬ−６レセプター免疫抑制抗体またはそれらのＶ_Ｈ−およびＶ_Ｌ−含有断
片細胞によって媒介される自己免疫疾患の治療のための構
造遺伝子、例えばＩＬ−６ＩＬ−９ＩＬ−１０ＩＬ−１３ＴＮＦα ＩＬ−４ＴＮＦβ 免疫抑制抗体またはそれらのＶ_Ｈ−およびＶ_Ｌ−含有断
片細胞増殖、細胞増殖抑制または細胞毒性タンパク質の阻
害剤および細胞増殖抑制剤の前駆体を活性化する酵素の
構造遺伝子。

【０１２８】この種のタンパク質をコードする遺伝子の
例は、既に「腫瘍の治療のための構造遺伝子」という標
題の節に引用されている。

【０１２９】本発明の意味では、抗体、またはこれらの
抗体のＦａｂ断片または組換えＦｖ断片または標的細胞
に特異的な他のリガンドを含んでなる融合タンパク質、
および上記のサイトカイン、成長因子、レセプター細胞
増殖抑制または細胞毒性タンパク質および酵素をコード
する構造遺伝子を、既にその点で記載したのと同じ形態
で、使用することができる。

【０１３０】関節炎の治療のための構造遺伝子本発明の意味では、例えば関節などの炎症を直接または
間接的に抑制し、および／または関節の細胞外マトリッ
クス（軟骨および結合組織）の再構成を促進するタンパ
ク質を発現した構造遺伝子が選択される。

【０１３１】これらのタンパク質の例は、下記の通りで
ある。ＩＬ−１レセプター拮抗薬（ＩＬ−１−ＲＡ）；ＩＬ−
１−ＲＡはＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの結合を阻害す
る。可溶性ＩＬ−１レセプター；可溶性ＩＬ−１レセプター
はＩＬ−１に結合して不活性化する。ＩＬ−６；ＩＬ−６はＴＩＭＰおよびスーパーオキシド
の分泌を増加し、滑膜細胞および軟骨細胞によるＩＬ−
１およびＴＮＦαの分泌を減少する。可溶性ＴＮＦレセプター；可溶性ＴＮＦレセプターはＴ
ＮＦに結合して、不活性化する。ＩＬ−４；ＩＬ−４は、ＩＬ−１、ＴＮＦαおよびＭＭ
Ｐの形成および分泌を阻害する。ＩＬ−１０；ＩＬ−１０はＩＬ−１、ＴＮＦαおよびＭ
ＭＰの形成および分泌を阻害し、ＴＩＭＰの分泌を増加
する。インシュリン様成長因子（ＩＧＦ−１）ＩＧＦ−１は、細胞外マトリックスの合成を促進する。ＴＧＦβ、具体的にはＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２ＴＧＦβは、細胞外マトリックスの合成を促進する。スーパーオキシドジスムターゼＴＩＭＰ（メタロプロテイナーゼの組織阻害薬）具体的には＊ＴＩＭＰ−１＊ＴＩＭＰ−２＊ＴＩＭＰ−３

【０１３２】c) 造血不全の治療標的細胞：造血系の増殖する未成熟細胞、または造血細
胞に隣接している支質細胞プロモーター：造血細胞に特異的および／または細胞サイクル特異的細胞非特異的貧血の治療のための構造遺伝子、例えばエリスロポエチン白血球減少症の治療のための構造遺伝子、例えばＧ−ＣＳＦＧＭ−ＣＳＦ血小板減少症の治療のための構造遺伝子、例えばＩＬ−３白血病阻止因子（ＬＩＦ）ＩＬ−１１トロンボポエチン

【０１３３】d) 神経系の損傷の治療標的細胞：グリア細胞、または増殖する内皮細胞プロモーター：グリア細胞特異的、または内皮細胞特異
的、および細胞サイクル特異的、または非特異的および
細胞サイクル特異的神経成長因子の構造遺伝子、例えばＦＧＦ神経成長因子（ＮＧＦ）脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）酵素の構造遺伝子、例えばチロシンヒドロキシラーゼドーパデカルボキシラーゼサイトカインおよびＴＮＦαの神経毒性効果を阻害しま
たは中和する阻害薬の構造遺伝子、例えばＴＧＦβ 可溶性ＴＮＦレセプターＴＮＦレセプターはＴＮＦαを中和するＩＬ−１０；ＩＬ−１０は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ
−２およびＩＬ−４の形成を阻害する。可溶性ＩＬ−１レセプターＩＬ−１レセプターＩＩＬ−１レセプターII 可溶性ＩＬ−１レセプターは、ＩＬ−１の活性を中和す
る。ＩＬ−１レセプター拮抗薬可溶性ＩＬ−６レセプター

【０１３４】e) 血液凝固系および血液循環系のの障害
の治療標的細胞：内皮細胞、または増殖する内皮細胞、または
内皮細胞および平滑筋細胞に隣接する体細胞、またはマ
クロファージプロモーター：細胞非特異的、または細胞非特異的およ
び細胞サイクル特異的、または内皮細胞、平滑筋細胞ま
たはマクロファージに特異的、または内皮細胞、平滑筋
細胞またはマクロファージに特異的、かつ細胞サイクル
特異的凝固を阻害し、またはフィブリン溶解を促進する構造遺
伝子、例えば組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）ｔＰＡおよびｕＰＡのハイブリッドプロテインＣヒルジンセリンプロテイナーゼ阻害薬（セルピン）、例えば＊Ｃ−１Ｓ阻害薬＊ α１−アンチトリプシン＊アンチトロンビンIII 組織因子通路阻害薬（ＴＦＰＩ）凝固を促進するための構造遺伝子、例えばＦ VIII Ｆ IX フォン・ビルブランド因子Ｆ XIII ＰＡＩ−１ＰＡＩ−２脈管形成因子のための構造遺伝子、例えばＶＥＧＦＦＧＦ低血圧に対する構造遺伝子、例えばカリクレイン内皮細胞酸化窒素シンタ−ゼ内皮層の損傷の後の平滑筋細胞の増殖の阻害のための構
造遺伝子、例えば増殖抑制、細胞増殖抑制、または細胞毒性タンパク質、
または細胞増殖抑制剤の前駆体を開裂することにより上
記（腫瘍について）に既述しているように、細胞増殖抑
制剤を形成する酵素、およびこれらの活性化合物と、筋
細胞に特異的な抗体または抗体断片との融合タンパク
質。他の血漿タンパク質の構造遺伝子、例えばアルブミンＣ１不活性化物血清コリンエステラーゼトランスフェリン α１−アンチトリプシン

【０１３５】f) 代謝疾患および遺伝学的疾患の治療標的細胞：内皮細胞筋細胞肝細胞気管支上皮細胞支質細胞、またはマクロファージプロモーター：標的細胞非特異的、または標的細胞特異
的構造遺伝子、例えばシスチン線維症に関するトランスメンブランコンダクタ
ンスレギュレーター（ＣＦＴＣＲ）ファンコニ貧血の遺伝子ウロポルフィリノーゲンIII シンタ−ゼイデュロネート２−スルファターゼ（ムコホリサッカリ
ドーシスII型） β−グルクロニダーゼ（ムコホリサッカリドーシスVIII
型）グルコセレブロシダーゼ（ゴーチャー病）フェニルアラニルヒドロキシラーゼジストロフィン（ドゥチェン型筋ジストロフィー）インシュリンレセプターヒト成長ホルモン界面活性剤ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｂ−結合タンパク質ＬＤＬレセプターアポリポプロテインＢｍＲＮＡ欠失タンパク質アデノシンデアミナーゼ

【０１３６】g) 接種標的細胞：筋細胞、またはマクロファージプロモーター：標的細胞非特異的、または標的細胞特異
的、または標的細胞特異的および細胞サイクル特異的感染症の予防のための構造遺伝子有効なワクチンを製造する可能性は、従来は限定されて
いる(Brown, Int. J.Technol. Assessm. Health Care 1
0, 161 (1994), Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 26
3 (1992), Arcon et al., FASEB J. 6, 3265 (1992))
。

【０１３７】従って、ＤＮＡワクチンの技術が開発され
た。しかしながら、これらのＤＮＡワクチンは、その薬
効の強度に関して問題がある(Fynan et al., Int. J. I
mmunopharm. 17, 7 (1995); Donnelly et al., Immuno
l. 2, 20 (1994)) 。

【０１３８】本発明によれば、自己促進性の発現系は、
ＤＮＡワクチンの薬効を増加する。活性物質として選択
されるＤＮＡは、感染性薬剤によって形成され、かつ免
疫反応を誘導することによって、すなわち抗体結合によ
っておよび／または細胞毒性Ｔリンパ球によって、薬剤
を中和しおよび／または破壊するタンパク質のＤＮＡで
ある。この種のいわゆる中和抗原は、既にワクチン化抗
原として用いられている（Ellis, Adv. Exp. Med. Bio
l. 327, 263 (1992) の総説を参照されたい）。下記の
研究は、中和抗原をコードするＤＮＡ配列の例を提供す
る：インフルエンザＡウイルス抗原(Ulmer et al., Science
259, 1745 (1993), Robinson et al., Vaccine 11, 95
7 (1993), Fynan et al., Int. J. Immunopharmac. 17,
79 (1995)) ＨＩＶ抗原(Wang et al., PNAS USA 90, 4156 (1993)) 狂犬病ウイルス抗原(Donnelly et al., Immunol. 2/1,
20 (1994)) ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）抗原(Fleckenstein et
al., Nauture 274, 57 (1978)) ＲＳＶ（呼吸器多角体ウイルス）抗原(Du et al., Bio/
Tech. 12, 813(1994),Hall, Science 265, 1393(1993)) パラインフルエンザウイルス抗原(Du et al., Bio/Tec
h. 12, 813 (1994)) ロタウイルス抗原(Albert et al., J. Clin. Microbio
l. 25, 183(1987), Anderson et al.,J. Infect. Dis.
153, 823 (1986), Battaglia et al., J. Infect. Dis.
155,140(1987), Chanock et al., J. Infect. Dis. 14
8, 49(1983), Dyall-Smith etal., J. Virol. 38, 1099
(1981), Glass et al., Science 265, 1389(1994)) ＶＺＶ（帯状疱疹ウイルス）抗原(Straus et al., Ann.
Intern. Med. 109, 438 (1988), Gershon, Pediatr.In
fec. Dis. 2, 171 (1991), Kinchington et al., J. Vi
rol. 64, 4540 (1990)) ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）抗原(Plotkin, Scienc
e 265, 1383 (1994)) 麻疹ウイルス抗原(Katz and Kellin, Science 265, 139
1 (1994)) ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）抗原(Tindl and Fra
zer, Curr. Topics Microbiol. Immunol. 186, 217 (19
94)) ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）抗原(Valenzuela et al.,
Nature 280, 815 (1979), Heerman et al., J. Virol.
52, 396 (1984)) ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）抗原(Cerny et al., Curr.
Topics Microbiol. Immunol. 189, 169 (1994), Esteb
an et al., Progr. Liver Dis. 10, 253 (1992), Jung
et al., Eur. J. Clin. Invest. 24, 641 (1994)) ＨＤＶ（Ｄ型肝炎ウイルス）抗原(Iwarson, Scand. J.
Infect. Dis. 24, 129 (1992), Consolo et al., Nephr
on. 61, 251 (1992)) ＨＥＶ（Ｅ型肝炎ウイルス）抗原(Iwarson, Scand. J.
Infect. Dis. 24, 129 (1992), Consolo et al., Nephr
on. 61, 251 (1992)) ＨＡＶ（Ａ型肝炎ウイルス）抗原(D'Hondt, Vaccine 1
0, 48 (1992), Andre, J. Infect. Dis. 171, 33 (199
5),Lemon et al., Vaccine 10, 40 (1992), Melnick et
al., Vaccine 10, 24 (1992), Flehmig, Baillieres C
lin. Gastroenterol. 4, 707 (1990)) Vibrio cholera抗原(Levine and Kaper, Vaccine 11, 2
07 (1933)) Borrelia burgdorferi抗原(Schaible et al., Immunol.
Letters 36, 219 (1993), Wallich et al., Lab. Med.
17, 669 (1993)) Helicobacter pylori 抗原(Crabtree et al., Lancet 3
38, 332 (1991), Blater, J. Infect. Dis. 161, 626
(1990), Cover and Blaser, J. Biol. Chem. 267, 1057
0 (1993), Coveret al., Infect. Immunol. 58, 603 (1
990), Dunn et al., J. Biol. Chem. 265, 9464 (199
0), Dunn et al., Infect. Immunol. 60, 1946 (1992),
Lage et al., Acta Gastroenterol. Belg. 56 (supp
l.), 61 (1993), Mobley et al., Scand. J. Gastroin
t. 26 (suppl. 187), 39 (1991)) マラリア抗原(Nussenzweig and Long, Science 265, 13
81 (1994), Maurice, Science 267,320 (1995), Enders
et al., Vaccines 10, 920 (1992), Knapp et al., In
fect. Imm. 60, 2397 (1992)) 。

【０１３９】しかしながら、本発明の意味では、この種
の活性物質としては、アンチイディオタイプ抗体のＤＮ
Ａ、またはその抗原結合断片であって、その構造結合構
造（相補組成決定領域）が感染性薬剤の中和抗原のタン
パク質構造または炭水化物構造のコピーを構成するもの
も挙げられる。

【０１４０】この種のアンチイディオタイプ抗体は、特
に細菌性感染性薬剤の場合には炭水化物抗原を置換する
ことができる。

【０１４１】この種のアンチイディオタイプ抗体、およ
びそれらの開裂生成物は、Hawkins et al. (J. Immunot
her. 14, 273 (1993) およびWesterink and Apicella
(Springer Seminars in Immunophthol. 15, 227 (199
3))によって概説されている。

【０１４２】「腫瘍ワクチン」の構造遺伝子これらの遺伝子としては、腫瘍細胞における抗原が挙げ
られる。この種の抗原は、例えばSedlacek et al., Con
trib. to Oncol. 32, Karger Verlag,ミュンヘン(198
8)、およびContrib. to Oncol. 43, Karger Verlag, ミ
ュンヘン(1992)によって概説されている。

【０１４３】他の例は、下記の抗原または下記の抗原に
対応するアンチイディオタイプ抗体の遺伝子によって構
成される：シアリル・ルイスＴ細胞によって認識される腫瘍上のペプチド腫瘍遺伝子によって発現されるタンパク質血液型抗原およびそれらの前駆体多型上皮ムチンおよび他の腫瘍関連ムチン上の抗原熱ショックタンパク質上の抗原ガングリオシド h) 慢性感染症の治療標的細胞：肝細胞リンパ球および／またはマクロファージ上皮細胞内皮細胞プロモーター：ウイルス特異的細胞特異的ウイルス特異的または細胞特異的かつ細胞サイクル特異
的構造遺伝子、例えば細胞増殖抑制または細胞毒性作用を示すタンパク質（細
胞毒性または細胞増殖抑制タンパク質の例は、腫瘍の治
療という標題の節で既に引用されている）。

【０１４４】酵素（これに関しては、腫瘍の治療という
標題の節を参照されたい）であって、抗ウイルス性また
は細胞毒性物質の前駆体を開裂することによって、活性
物質を形成するもの。

【０１４５】抗ウイルスタンパク質の構造遺伝子抗ウイルス活性を有するサイトカインおよび成長因子。
これらの例は、下記の通りである。＊ＩＦＮ−α ＊ＩＦＮ−β ＊ＩＦＮ−γ ＊ＴＮＦβ ＊ＴＮＦα ＊ＩＬ−１＊ＴＧＦβ 関連ウイルスを不活性化する特異性を有する抗体、また
はそのＶ_Ｈ−およびＶ_Ｌ−含有断片、またはリンカーに
よって接続されるそのＶ_ＨおよびＶ_Ｌ断片であって、こ
れらの断片は節2)に既に記載されている方法で作製する
ことができる。

【０１４６】ウイルス抗原に対する抗体の例は、下記の
通りである。＊アンチ−ＨＢＶ＊アンチ−ＨＣＶ＊アンチ−ＨＳＶ＊アンチ−ＨＰＶ＊アンチ−ＨＩＶ＊アンチ−ＥＢＶ＊アンチ−ＨＴＬＶ＊アンチ−コクサッキー（Coxackie）ウイルス＊アンチ−ハンターン（Hanttaan）ウイルスｒｅｖ−結合タンパク質。これらのタンパク質はｒｅｖ
ＲＮＡに結合し、レトロウイルス遺伝子発現における
ｒｅｖ−依存性の後転写段階を示す。ｒｅｖ−結合タン
パク質の例は、下記の通りである。＊ＲＢＰ９−２７＊ＲＢＰ１−８Ｕ＊ＲＢＰ１−８Ｄ＊ＲＢＰ１−８の擬似遺伝子細胞サイクル制御タンパク質の遺伝子のｍＲＮＡまたは
ウイルスのｍＲＮＡを消化するリボザイムについて。Ｈ
ＩＶを触媒するリボザイムは、例えばChristoffersen e
t al., J. Med. Chem. 38, 2033 (1995)によって概説さ
れている。

【０１４７】抗細菌タンパク質の構造遺伝子抗細菌タンパク質の例は、細菌毒素を中和するまたは細
菌にオプソニンを作用させる抗体である。これらの抗体
の例は、下記のものに対する抗体である。ＣＣまたはＢ髄膜炎菌 E. coli ボレリアシュドモナス Helicobactor pylori Staphilococcus aureus

【０１４８】7) 同一または異なる構造遺伝子の組み合
わせ本発明は、自己促進性で、適当な場合には薬理学滴に制
御可能な発現系であって、２個の同一または２個の異な
る構造遺伝子｛成分c)およびc') ］のＤＮＡ配列を組み
合わせたことを特徴とするものに関する。２種類のＤＮ
Ａ配列を発現するためには、内部リボソームエントリー
部位（ＩＲＥＳ）のｃＤＮＡを、制御要素として２個の
構造遺伝子の間でインターカレーションするのが好まし
い。この種のＩＲＥＳ配列の例は、節C5) において既に
記載されている。

【０１４９】本発明の意味では、下記のものが下記の療
法についての構造遺伝子の好ましい組み合わせの例であ
る。腫瘍の治療異なる増殖防止、細胞増殖抑制、細胞毒性、炎症誘発タ
ンパク質、または細胞増殖抑制剤の前駆体を開裂するた
めの同一の酵素自己免疫疾患の治療細胞性および／または体液性免疫反応を阻害するための
層状効果を有する異なるサイトカインまたはレセプタ
ー、または異なるまたは同一のＴＩＭＰ造血不全の治療異なる階層的に連続なサイトカイン、例えばＩＬ−１、
ＩＬ−３、ＩＬ−６またはＧＭ−ＣＳＦおよびエリスロ
ポエチン、Ｇ−ＣＳＦまたはトロンボポエチン神経細胞の損傷の治療神経成長因子およびサイトカインまたはサイトカインの
阻害剤血液凝固系および血液循環系の障害の治療血栓防止剤およびフィブリン溶解剤（ｔＰＡまたはｕＰ
Ａ）、または増殖防止、細胞増殖抑制または細胞毒性タ
ンパク質（または酵素）、および血栓防止剤およびフィ
ブリン溶解剤ワクチン化抗原、および免疫刺激サイトカイン、例えば＊ＩＬ−１α ＊ＩＬ−１β ＊ＩＬ−２＊ＧＭ−ＣＳＦ＊ＩＬ−３、または＊ＩＬ−４レセプター様々な抗原＊１つの感染性薬剤のまたは異なる感染性薬剤の、ま
たは＊１つの腫瘍型のまたは異なる腫瘍型のウイルス感染症の治療抗ウイルス性タンパク質、および細胞増殖抑制または細
胞毒性タンパク質１種のウイルスまたは数種のウイルスの様々な表面抗原
に対する抗体細菌感染症の治療生物の様々な表面抗原および／または毒素に対する抗体

【０１５０】8) シグナル配列および膜貫通領域の挿入構造遺伝子の発現生成物の分泌を促進するために、構造
遺伝子のＤＮＡ配列に含まれていることがある相同シグ
ナル配列を、細胞外分泌を改良する異種シグナル配列で
置換することができる。

【０１５１】従って、例えば免疫グロブリンに対するシ
グナル配列（ＤＮＡ位置≦６３〜≧１０７; Riechmann
et al., Nature 332, 323 (1988)) 、またはＣＥＡに対
するシグナル配列（ＤＮＡ位置≦３３〜≧１３４; Sch
rewe et al., Mol. Cell Biol. 10, 2738 (1990); Berl
ing et al., Cancer Res. 50, 6534 (1990))、またはヒ
ト呼吸器多角体ウイルス糖タンパク質のシグナル配列
（アミノ酸≦３８〜≧５０、または４８〜６５に対する
ｃＤＮＡ; Lichtenstein et al., J. Gen. Virol. 77,
107 (1996)) を挿入することができる。

【０１５２】あるいは、または更に、シグナル配列に対
して、トランスメンブランドメインに対する配列を挿入
して、活性化合物を形成している軽質導入した細胞の細
胞膜に活性化合物を固定することができる。

【０１５３】従って、例えばヒトマクロファージコロニ
ー刺激因子のトランスメンブラン配列（ＤＮＡ位置≦１
４８５〜≧１５５４；Cosman et al., Behring Inst. M
itt.83, 15 (1988)) 、またはヒト呼吸器多角体ウイル
ス（ＲＳＶ）糖タンパク質Ｇのシグナルおよびトランス
メンブラン領域のＤＮＡ配列（アミノ酸１〜６３または
その部分配列、アミノ酸３８〜６３; Vijaya et al., M
ol. Cell Biol. 8, 1709 (1988); Lichtenstein et a
l., J. Gen. Virol. 77, 109 (1996))、またはインフル
エンザウイルスノイラミニダーゼのシグナルおよびトラ
ンスメンブラン領域のＤＮＡ配列（アミノ酸７〜３５、
または部分配列アミノ酸７〜２７; Brownet al., J. Vi
rol. 62, 3824 (1988) ）を、プロモーター配列と構造
遺伝子の配列との間に挿入することができる。

【０１５４】翻訳を促進するため、ヌクレオチド配列Ｇ
ＣＣＡＣＣまたはＧＣＣＧＣＣを、例えばプロモーター
配列の３′末端に、およびシグナル配列またはトランス
メンブラン配列の開始シグナル（ＡＴＧ）の５′末端に
直接挿入することができる(Kozak, J. Cell Biol. 108,
209 (1989))。

【０１５５】しかしながら、糖リン脂質アンカーを、活
性化合物を形成している形質導入細胞の細胞膜に活性化
合物を固定する目的で挿入することもできる。

【０１５６】この挿入をシグナル配列の挿入に加えて行
うことが可能であれば、糖リン脂質アンカーは、構造遺
伝子のヌクレオチド配列の３′末端に挿入される。

【０１５７】糖リン脂質アンカーは、例えばＣＥＡにつ
いて（ＤＮＡ位置≦８９３〜≧１０７９; Berling et a
l., Cancer Res. 50, 6534 (1990))、Ｎ−ＣＡＭについ
て(Cuningham et al., Science 236, 799 (1987)) 、お
よびＴｈｙ−１(Clissold, Biochem. J. 281, 129 (199
2)) またはＣＤ１６(Selvaray et al., Nature 333,565
(1988)) のような他の膜タンパク質について記載され
ている。

【０１５８】Ferguson et al. (Ann. Rev. Biochem. 5
7, 285 (1988)) は、糖リン脂質の総説を公表してい
る。

【０１５９】活性化合物を細胞膜上に固定するためのも
う一つの方法は、本発明によれば、リガンド／活性化合
物融合タンパク質のＤＮＡ配列を用いる方法である。こ
の融合タンパク質のリガンドの特異性は、選択された標
的細胞の細胞膜上の膜構造に対するものである。

【０１６０】細胞の表面に結合するリガンドの例は、例
えば内皮細胞、特にＶＥＧＦレセプターに対する抗体な
ど、または筋細胞の表面上の構造に対する抗体または抗
体断片であり、例えば＊アクチンに対する抗体、または＊アンジオテンシンIIレセプターに対する抗体、また
は＊成長因子のレセプターに対する抗体、例えば、 ◇ ＥＧＦレセプターに対する、または ◇ ＰＤＧＦレセプターに対する、または ◇ ＦＧＦレセプターに対する、または ◇ エンドセリンＡレセプターに対する抗体である。

【０１６１】ネズミのモノクローナル抗体は、ヒト化し
た形態で用いるのが好ましい。Ｆａｂ断片および組換え
Ｆｖ断片、およびそれらの融合生成物は、上記で既に説
明した方法で作成される。

【０１６２】リガンドとしては、総ての活性化合物、例
えばサイトカインまたは付着分子、成長因子、またはそ
れらの断片若しくはその部分配列、またはモジュレータ
ーであって、選択された特定の細胞の膜構造または膜レ
セプターに結合しているものが挙げられる。これらのリ
ガンドの例は、内皮細胞のリガンド、例えばＩＬ−１、
ＰＤＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＧβ(Pusztain et
al., J. Pathol. 169,191 (1993)）、またはキニン、
およびキニンの誘導体または類似体である。リガンドと
しては、付着分子も挙げられる。Ｓｌｅｘ、ＬＦＡ−
１、ＭＡＣ−１、ＬｅＣＡＭ−１、ＶＬＡ−４またはビ
トロネクチン、およびビトロネクチンの誘導体または類
似体のようなこの種の付着分子は、内皮細胞に関して既
に報告されている（Austtin-Voss et al.,J. Cell Bio
l. 119, 483 (1992); Pauli et al.,Cancer Metast. Re
v. 9, 175 (1990); Honn et al., Cancer Metast. Rev.
11,353 (1992) ; Vaner et al., Cell Adh. Commun.
3, 367 (1995))の総説）。

【０１６３】リガンドとしては、腫瘍細胞膜上の腫瘍特
異性または腫瘍関連抗原に対して向けられる抗体または
それらの断片も挙げられる。この種の抗体は、節C6a)で
既に説明されている。

【０１６４】本発明は、新規な核酸構築物と、成分f)の
プロテインＡおよび成分h)のプロテインＢに対する結合
部位を有するカップリング物質j)とを含んでなる組成物
にも関する。カップリング物質j)は、医薬組成物、特に
細胞膜を通って、細胞中に浸透することができる物質、
特にラパマイシン、ＦＫ５０６、シクロスポリンＡ、メ
トトレキセート、葉酸、レチン酸、ペニシリン、４−ヒ
ドロキシタモキシフェン、タモキシフェン、またはテト
ラサイクリンまたはテトラサイクリン／イソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトシド接合体であるのが好ましい。

【０１６５】本発明は、新規な核酸構築物を含む細胞、
特に酵母細胞または哺乳類細胞、および新規な核酸構築
物の製造法であって、個々の成分が互いに連結している
ことを特徴とする方法にも関する。

【０１６６】本発明は、また、腫瘍、白血病、自己免疫
疾患、炎症、神経系の損傷、血液凝固系および血液循環
系の障害、代謝疾患、遺伝子損傷、ウイルスまたは細菌
感染症、および／または造血不全の予防および／または
治療のための、および／またはウイルス、細菌または寄
生虫感染症、および／または腫瘍に対する予防接種のた
めの局所的、例えば経皮、鼻内、経口、消化管、気管支
内、小胞内、腟内、子宮内、皮下、筋肉内、皮内、関節
周囲または関節内投与用の、脳脊髄液中、脳中、肝臓
中、腎臓中、腸中または舌中へ投与用の、または腹腔
内、胸膜腔内、または全身、例えば静脈内、動脈内、門
脈内または心臓内投与用の薬剤を製造するための新規な
核酸構築物の使用、および疾患の予防および／または治
療のための局所または全身投与用薬剤を製造するための
本発明による細胞の使用に関する。

【０１６７】

【実施例】本発明を、下記の例によって更に詳細に説明
する。実施例１自己促進発現系の構築図１３に示される略図による自己促進発現系を、細胞サ
イクル特異的および細胞特異的にβ−グルクロニダーゼ
を発現する目的で製造する。個々の成分のＤＮＡ配列
を、下記のようにして５′から３′への方向で互いに結
合させる。

【０１６８】成分a)：Ｇａｌ４タンパク質と結合する配
列［ヌクレオチド配列：5'-CGGACAACTGTTGACCG-3'（配
列番号１）］(Chasman and Kornberg, Mol. Cell Biol.
10, 2916 (1990)) 成分b)：ｃｄｃ２５Ｃ遺伝子のプロモーター配列［核
酸：−２９０〜＋１２１; Lucibello et al., EMBO J.
14, 132 (1995); Zwicker et al., Nucl. Acids Res. 2
3,3822 (1955); EMBO J. 14, 4514 (1995) ］成分c)：配列ＧＣＣＡＣＣ(Kodak, J. Cell Biol. 108,
229 (1989)) 免疫グロブリンシグナルペプチドのｃＤＮＡ［ヌクレオ
チド配列≦６３〜≧１０７; Riechmann et al., Nature
332, 323 (1988)) ヒトβ−グルクロニダーゼのｃＤＮＡ［ヌクレオチド配
列≦９３〜≧１９８２; Oshima et al., PNAS USA 84,
685 (1987)］成分a') ：Ｇａｌ４タンパク質と結合する配列(Chasman
and Korberg, Mol. Cell Biol.10, 2916 (1990)) 成分b') ：ＶＥＧＦレセプター遺伝子のプロモーター配
列［核酸−１１９５〜＋≧１００; Morishita et al.,
J. Biol. Chem. 270, 27948 (1995)］成分d)：Ｇａｌ４タンパク質のＤＮＡ−結合ドメインの
ｃＤＮＡ［アミノ酸１〜１４７; (Chasman and Korber
g, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990)) ＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）のｃＤＮＡ（ＳＶ
４０ラージＴ；アミノ酸１２６〜１３２：ＰＫＫＫＲＫ
Ｖ; Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991)) ＨＳＶ−１ＶＰ１６酸トランス活性化ドメイン（ＴＡ
Ｄ）のｃＤＮＡ［アミノ酸４０６〜４８８; Triezenber
g et al., Genes Developm. 2, 718 (1988); Triezenbe
rg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5, 190 (1995)］構築物の個々の成分は、適当な制限部位を介して連結さ
れ、これは同時にＰＣＲ増幅の際に異なる要素の末端に
導入される。成分同士は、制限部位に特異的な酵素、お
よび当業者には知られているＤＮＡリガーゼを用いて連
結される。これらの酵素は、商業的に得ることができ
る。

【０１６９】ヒト臍帯内皮細胞および線維芽細胞（Ｗｉ
−３８）であって、培養状態に保持されているものを、
当業者に知られている方法を用いて上記のプラスミドを
用いてトランスフェクションし(Lucibello et al., EMB
O J. 14, 132 (1995))、内皮細胞によって産生されるβ
−グルクロニダーゼの量を４−メチルウンベリフェリル
−β−グルクロニドを基質として用いて測定する。

【０１７０】細胞サイクル特異性をチェックする目的
で、内皮細胞をＧ０／Ｇ１でメチオニンを除去すること
によって４８時間同期させる。細胞のＤＮＡ含量を、Ho
echst33258 (Hoechst AG 、フランクフルト）で染色し
た後、蛍光活性化細胞ソーターで測定する(Lucibello e
t al., EMBO J. 14, 132 (1995))。

【０１７１】下記の結果が得られる。トランスフェクシ
ョンした線維芽細胞では、トランスフェクションしてい
ない線維芽細胞と比較して、β−グルクロニダーゼの増
加は見られない。トランスフェクションした内皮細胞
は、トランスフェクションしていない内皮細胞よりも顕
著に多量のβ−グルクロニダーゼを発現する。増殖して
いる内皮細胞（ＤＮＡ＞２Ｓ）は、Ｇ０／Ｇ１で同期し
た内皮細胞（ＤＮＡ＝２Ｓ）よりも多量のβ−グルクロ
ニダーゼを顕著に分泌する。従って、記載されている自
己促進発現系は、構造遺伝子β−グルクロニダーゼの細
胞特異的で細胞サイクル依存性発現を生じる。

【０１７２】新規な自己促進発現系による発現の強度
を、自己促進性でない２種類の発現系による強度と比較
する。これらの後者の系は、図１４および１５に示され
る略図に従って製造する。

【０１７３】この場合に、成分b)、b') およびc)の構成
要素は、図１３に示される略図について既述したものと
同一である。

【０１７４】構築物の個々の成分は、適当な制限部位を
介して連結され、これは同時にＰＣＲ増幅の際に異なる
要素の末端に導入される。成分同士は、制限部位に特異
的な酵素、および当業者には知られているＤＮＡリガー
ゼを用いて連結される。これらの酵素は、商業的に得る
ことができる。

【０１７５】この方法で製造したヌクレオチド構築物
を、ｐＵＣ１８／１９またはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来
のプラスミドベクターにクローニングする。

【０１７６】培養状態に保持されているヒト臍帯内皮細
胞を、当業者に知られている方法を用いて上記のプラス
ミドを用いてトランスフェクションし(Lucibello et a
l., EMBO J. 14, 132 (1995))、内皮細胞によって産生
されるβ−グルクロニダーゼの量を４−メチルウンベリ
フェリル−β−グルクロニドを基質として用いて測定す
る。

【０１７７】下記の結果が得られる。図１４および１５
に示される核酸構築物を含んでなるプラスミドでトラン
スフェクションした増殖している内皮細胞は、図１３に
示される新規な核酸構築物を含んでなるプラスミドでト
ランスフェクションした増殖している内皮細胞よりも顕
著に少ないβ−グルクロニダーゼを発現する。上記の自
己促進発現系は、構造遺伝子β−グルクロニダーゼを著
しく増強して発現する。

【０１７８】実施例２自己促進性の薬理学的に制御可
能な発現系の構築図１１の略図に示される構造に相当する自己促進性の薬
理学的に制御可能な発現系を、図１６に示されるβ−グ
ルクロニダーゼの細胞サイクル特異的で薬理学的に制御
可能な発現の目的で製造する。

【０１７９】個々の成分のＤＮＡ配列を、下記のように
して５′から３′への方向で互いに結合させる。

【０１８０】成分i)：Ｇａｌ４タンパク質と結合する配
列［ヌクレオチド配列：5'-CGGACAACTGTTGACCG-3'（配
列番号１）］(Chasman and Kornberg, Mol. Cell Biol.
10, 2916 (1990)) ＳＶ４０基本プロモーター［ヌクレオチド４８〜５１９
１; Tooze （監修），ＤＮＡ腫瘍ウイルス(DNA Tumor V
iruses) （コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨ
ーク、ニューヨーク、Cold Spring Harbor Laboratory
）］成分c)：配列ＧＣＣＡＣＣ(Kodak, J. Cell Biol. 108,
229 (1989)) 免疫グロブリンシグナルペプチドのｃＤＮＡ［ヌクレオ
チド配列≦６３〜≧１０７; Riechmann et al., Nature
332, 323 (1988)］ヒトβ−グルクロニダーゼのｃＤＮＡ［ヌクレオチド配
列≦９３〜≧１９８２; Oshima et al., PNAS USA 84,
685 (1987)］成分e)：Ｇａｌタンパク質と結合する配列(Chasman and
Korberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990)) ｃｄｃ２５Ｃ遺伝子のプロモーター配列［核酸：−２９
０〜＋１２１; Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1
995); Zwicker et al., Nucl. Acids Res. 23,3822 (19
55); EMBO J. 14, 4514 (1995) ］成分f)：ヘルペスウイルスＶＰ１６活性化ドメインのｃ
ＤＮＡ(Greaves et al., J. Virol. 64, 2716 (1990);
65, 6705 (1991)) 組換えアンチ−シクロスポリンＡＦｖ（Ａ）（プロテ
インＡ）のｃＤＮＡ成分g)：成分e)に相当する成分h)：組換えアンチ−シクロスポリンＡＦｖ（Ｂ）
（プロテインＢ）のｃＤＮＡＧａｌ４タンパク質のＤＮ
Ａ−結合ドメインのｃＤＮＡ［アミノ酸１〜１４７; (C
hasman and Korberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (199
0)) ＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）のｃＤＮＡ（ＳＶ
４０ラージＴ；アミノ酸１２６〜１３２：ＰＫＫＫＲＫ
Ｖ; Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991)) ＨＳＶ−１ＶＰ１６酸トランス活性化ドメイン（ＴＡ
Ｄ）のｃＤＮＡ［アミノ酸４０６〜４８８; Triezenber
g et al., Genes Developm. 2, 718 (1988); Triezenbe
rg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5, 190 (1995)］。

【０１８１】シクロスポリンＡに対する抗体は、Cacala
no et al., Mol. Immunol. 29, 107(1992) に記載の方
法で製造する。このために、シクロスポリンＡを、４−
ベンゾイル安息香酸および紫外線を用いてウシ血清アル
ブミンにカップリングする。カップリング生成物を、Ｂ
ａｌｂ／ｃマウスに数回皮下投与する。最後の免疫化か
ら１４日後に、脾臓細胞を単離する。ｍＲＮＡを、これ
らの細胞からｍＲＮＡ抽出キット(Pharmacia製、フライ
ブルク）を用いて抽出する。次に、逆転写を用いて、ｃ
ＤＮＡ合成キットとランダムヘキサオリゴヌクレオチド
（Pharmacia 製、フライブルク）とにより、このｍＲＮ
ＡをｃＤＮＡへ転写する。このｃＤＮＡは、特異的なプ
ライマー(Clackson et al., Nature 352, 624 (1991);
Sastry et al., PNAS USA 86, 5728 (1989); Ward et a
l., Nature 341, 544 (1989); Orlandi et al., PNAS U
SA 86, 3833 (1989)) を用いるポリメラーゼ連鎖反応(S
aiki et al., Science 230, 1350 (1985))によって免疫
グロブリンの可変重鎖または可変軽鎖を増幅するための
出発材料として働く。

【０１８２】これらのプライマーを用いて、同時に、制
限開裂部位を導入して、細菌性発現ベクターｐＨＥＮＩ
Ｓ（ｐＨＥＮ１から誘導される；Hoogenboom et al., N
ucl.Acids Res. 19, 4133 (1991);図１を参照）に断片
をクローニングする。このベクターは、ペリプラズム分
泌のためのｐｅｌＢシグナル配列、モノクローナル抗体
９Ｅ１０で検出のためのｍｙｃタグ、固定化金属アフィ
ニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）による精製のため
のヒスチジンタグ、並びに重鎖および軽鎖のためのクロ
ーニング領域、および長さが１４アミノ酸のグリシン−
セリンリンカーをコードする短配列を含んでいる。遺伝
子３タンパク質（ｇ３Ｐ）との融合は、バクテリオファ
ージの表面上でディスプレイする目的でも行う。重鎖お
よび軽鎖を適当な制限酵素（ＳｆｉＩおよびＳｈｏＩで
ＶＨ、ＡｐａＬＩおよびＮｏｔＩでＶＬ）で消化して、
ベクター中に連続的にクローニングする。これにより、
可変重鎖と可変軽鎖とを含んでなり、これらが短いペプ
チド配列によって共有的に連結されている組換え一本鎖
Ｆｖ断片を生じる。

【０１８３】抗体断片のファージディスプレイにより、
抗原結合ドメインを、糸状バクテリオファージコートタ
ンパク質ｇ３Ｐとの融合タンパク質としてｓｃＦｖ断片
(McCafferty et al., Nature 348, 552 (1990)) の形態
で、ファージミドベクター(Breitling et al., Gene 10
4, 147 (1994))にクローニングする。抗原結合ファージ
は、シクロスポリンＡを載荷したプラスチック容器で選
択する（パンニング）(Marks et al., J. Mol. Biol. 2
22, 581 (1991)) 。

【０１８４】シクロスポリンＡに結合しているファージ
をクローニングして、増殖させた後、シクロスポリンＡ
を載荷したプラスチック容器で再度選択する。４回選択
した後、シクロスポリンＡへの互いの結合を阻害しない
２個のクローン（プロテインＡおよびＢ）を選択する。

【０１８５】ネズミ組換えＦｖ断片（プロテインＡおよ
びＢ）を、ヒト抗体の超可変領域をこのネズミ組換えＦ
ｖ断片の相当する領域で特異的に置換することによって
ヒト化する(Jones et al., Nature 321, 522 (1987))。

【０１８６】この構築物をＰＣＲ増幅中に異なる要素の
末端に導入される適当な制限部位を介して連結する。連
結は、制限部位に特異的な酵素、および当業者に知られ
ているＤＮＡリガーゼを用いて行う。これらの酵素は、
商業的に得ることができる。

【０１８７】この方法で製造したヌクレオチド構築物を
ｐＵＣ１８／１９由来のまたはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由
来のプラスミドベクターにクローニングする。

【０１８８】培養状態に保持されているヒト臍帯内皮細
胞を、当業者に知られている方法を用いて上記のプラス
ミドでトランスフェクションし(Lucibello et al., EMB
O J.14, 132 (1995))、シクロスポリンＡを添加して
（０．０１〜１．０μｇ／ｍｌ培地）および添加せず
に、内皮細胞によって産生されるβ−グルクロニダーゼ
の量を４−メチルウンベリフェリル−β−グルクロニド
を基質として用いて測定する。

【０１８９】細胞サイクル特異性をチェックする目的
で、内皮細胞をＧ０／Ｇ１でメチオニンを除去すること
によって４８時間同期させる。細胞のＤＮＡ含量を、Ho
echst33258 (Hoechst AG 、フランクフルト）で染色し
た後、蛍光活性化細胞ソーターで測定する(Lucibello e
t al., EMBO J. 14, 132 (1995))。

【０１９０】下記の結果が得られる。シクロスポリンＡ
が存在しない場合には、トランスフェクションした内皮
細胞は、トランスフェクションしていない内皮細胞より
も著しく多量のβ−グルクロニダーゼを発現する。増殖
している内皮細胞（ＤＮＡ＞２Ｓ）は、Ｇ０／Ｇ１で同
期した内皮細胞（ＤＮＡ＝２Ｓ）よりも著しく多量のβ
−グルクロニダーゼを分泌する。

【０１９１】上記の自己促進発現系は、細胞サイクルに
依存し、シクロスポリンＡを添加することによって制御
することができる構造遺伝子β−グルクロニダーゼを発
現する。

【０１９２】新規な自己促進性の薬理学的に制御可能な
発現系によって達成される発現の強度は、図１４に示さ
れる略図に従って実施例１で製造した非自己促進発現系
によって達成される強度よりも大きい。

【０１９３】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列 CGGACAACTG TTGACCG 17

【０１９４】配列番号：２配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列 TACTGTATGT ACATACAGTA 20

【０１９５】配列番号：３配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列 GAATTGTGAG CGCTCACAAT TC 22

【０１９６】配列番号：４配列の長さ：４２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列 TCGAGTTTAC CACTCCCTAT CAGTGATAGA GAAAAGTGAA AG 42

【０１９７】配列番号：５配列の長さ：１２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列 TAATGATGGG CG 12

【０１９８】配列番号：６配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列 GGAAGCAGAC CACGTGGTCT GCTTCC 26

【０１９９】配列番号：７配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 AGCAGGTGTT GGGAGGC 17

【０２００】配列番号：８配列の長さ：４１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GGCCGATGGG CAGATAGAGG GGGCCGATGG GCAGATAGAG G 41

【図面の簡単な説明】

【図１】最も単純な形態での新規な核酸構築物を示す。

【図２】核輸出シグナル（ＮＥＳ）をコードする遺伝子
および核輸出因子（ＮＥＦ）をコードする遺伝子を補足
した後の、図１に示される核酸構築物を示す。

【図３】ＩＲＥＳを介した成分c)およびd)の連結を示
す。

【図４】図１〜３に示した個々の成分が反応することに
よる工程を示す。

【図５】追加の構造遺伝子を有する核酸構築物の拡大し
て示す。

【図６】転写因子タンパク質の追加の遺伝子を有する核
酸構築物の拡大して示す。

【図７】ＮＥＳおよびＮＥＦをコードする遺伝子を補足
した後の、図３に示される核酸構築物を示す。

【図８】最も単純な形態での薬理学的に制御可能なプロ
モーターモジュールを示す。

【図９】図８に示した個々の成分が反応することによる
工程を示す。

【図１０】自己促進性の薬理学的に制御可能な発現系を
示す。

【図１１】成分a)およびb)の成分i)による置換、および
成分d)をＩＲＥＳ領域と共に成分e)、f)、g)およびh)を
含む薬理学的に制御可能なプロモーターモジュールによ
る置換を示す。

【図１２】成分b''') の成分e)、f)、g)、h)およびi)を
含む薬理学的に制御可能なプロモーターモジュールによ
る置換を示す。

【図１３】β−グルクロニダーゼの細胞サイクル特異的
で細胞特異的発現のための自己促進発現系を示す。

【図１４】自己促進性でない２種類の発現系を示す。

【図１５】自己促進性でない２種類の発現系を示す。

【図１６】β−グルクロニダーゼの細胞サイクル特異的
で薬理学的に制御可能な発現のための自己促進性の薬理
学的に制御可能な発現系を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 31/70 ＡＤＤＡ６１Ｋ 31/70 ＡＤＤＡＤＶＡＤＶＡＤＹＡＤＹＡＤＺＡＤＺＡＥＡＡＥＡ 38/00 ＡＤＵ 48/00 ＡＣＢ 48/00 ＡＣＢＣ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 16/18 19/00 19/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】活性化合物をコードする少なくとも１個の
第一の構造遺伝子と、転写因子タンパク質をコードする少なくとも１個の第二
の構造遺伝子と、転写因子タンパク質と結合する少なくとも１個の配列と
少なくとも１個のプロモーター配列とを含む少なくとも
１個の活性化配列とを含んでなる核酸構築物であって、それぞれの活性化配列が構造遺伝子の発現および転写因
子タンパク質の発現を活性化することを特徴とする、核
酸構築物。
【請求項２】活性化配列が第一の構造遺伝子の５′末端
に結合し、活性化配列が転写因子タンパク質遺伝子の
５′末端に結合している、請求項１に記載の核酸構築
物。
【請求項３】２個の同一な転写因子タンパク質結合配列
と２個の非同一プロモーターとを含む、請求項１または
２に記載の核酸構築物。
【請求項４】内部リボソームエントリー部位を有し、該
内部リボソームエントリー部位が活性化配列による転写
因子タンパク質の発現の活性化に関与している、請求項
１に記載の核酸構築物。
【請求項５】第一の構造遺伝子に付加した核輸出シグナ
ル配列、第三のプロモーター、および核輸出因子遺伝子配列を更
に有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸構
築物。
【請求項６】構造遺伝子の少なくとも２個が、ＩＲＥＳ
配列または活性化配列によって相互に連結している、請
求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項７】少なくとも２個の転写因子タンパク質遺伝
子が、ＩＲＥＳ配列または活性化配列によって相互に連
結している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸
構築物。
【請求項８】上記転写因子タンパク質遺伝子が非同一で
あり、該遺伝子から産生される転写因子タンパク質が核
酸構築物の上記転写因子タンパク質結合配列と結合して
いる、請求項７に記載の核酸構築物。
【請求項９】少なくとも１個のプロモーターと、転写因子タンパク質の活性化ドメインとカップリングタ
ンパク質に結合している配列とを含む少なくとも１個の
融合タンパク質遺伝子と、少なくとも１個のプロモーターと、少なくとも１個の融合タンパク質遺伝子（融合タンパク
質はＤＮＡ結合タンパク質とカップリング物質に結合す
るタンパク質とを含む）と、ＤＮＡ結合タンパク質の部位を含む少なくとも１個の活
性化配列とを順次含んでなる薬理学的制御モジュールを
更に含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸構
築物。
【請求項１０】活性化合物をコードする少なくとも１個
の第一の構造遺伝子と、転写因子タンパク質をコードする少なくとも１個の第二
の構造遺伝子と、上記転写因子タンパク質に結合する少なくとも１個の配
列と、少なくとも１個のプロモーター、転写因子タンパ
ク質の活性化ドメインをコードしかつカップリング物質
タンパク質をコードする少なくとも１個の融合タンパク
質遺伝子、少なくとも１個のプロモーター、ＤＮＡ結合
タンパク質をコードしかつ第二のカップリング物質タン
パク質をコードする少なくとも１個の融合タンパク質遺
伝子、およびＤＮＡ結合タンパク質の部位を含む少なく
とも１個の活性化配列を順次含んでなる少なくとも１個
の薬理学的制御モジュールとを含んでなる少なくとも１
個の活性化配列とを含んでなり、それぞれの活性化配列が構造遺伝子の発現および転写因
子タンパク質の発現を活性化する、請求項１〜９のいず
れか一項に記載の核酸構築物。
【請求項１１】活性化合物をコードする少なくとも１個
の第一の構造遺伝子と、転写因子タンパク質の活性化ドメインとカップリング物
質に結合する配列とを含んでなる少なくとも１個の第一
の融合タンパク質をコードする少なくとも１個の第二の
構造遺伝子と、カップリング物質に結合するタンパク質とＤＮＡ結合タ
ンパク質とを含んでなる少なくとも１個の第二の融合タ
ンパク質をコードする少なくとも１個の第三の構造遺伝
子と、カップリング物質によって上記第一の融合タンパク質に
カップリングした上記第二の融合タンパク質に結合する
少なくとも１個の配列と、少なくとも１個のプロモータ
ー配列とを含んでなる少なくとも１個の活性化配列とを
含んでなり、それぞれの活性化配列が上記構造遺伝子の少なくとも１
個の発現を活性化する、請求項１〜１０のいずれか一項
に記載の核酸構築物。
【請求項１２】上記活性化配列が、転写因子タンパク質に結合する配列であって、Ｇａ１４
タンパク質遺伝子、ＬｅｘＡタンパク質遺伝子、Ｌａｃ
Ｉリプレッサータンパク質遺伝子、テトラサイクリン
リプレッサータンパク質遺伝子、およびＺＦＨＤ−１タ
ンパク質遺伝子からなる群から選択される配列と、ＨＳＶ−１ＶＰ１６トランス活性化ドメインと組み合
わせた基本ｃ−ｆｏｓプロモーター、Ｏｃｔ−２活性化
ドメインの配列と組み合わせたＵ２ｓｎＲＮＡプロ
モーター、およびＨＳＶＴＫプロモーターからなる群
から選択されるプロモーター配列と、Ｇａ１４タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、ＬｅｘＡタ
ンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、ＬａｃＩリプレッサ
ータンパク質遺伝子、テトラサイクリンリプレッサータ
ンパク質遺伝子、およびＺＦＨＤ１タンパク質遺伝子か
らなる群から選択される転写因子タンパク質遺伝子とを
含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の核
酸構築物。
【請求項１３】上記転写因子タンパク質が、ＳＶ４０核
局在化シグナルとＨＳＶ−１ＶＰ１６酸トランス活性
化ドメインとを含んでなる、請求項１２に記載の核酸構
築物。
【請求項１４】上記第一の融合タンパク質コード配列
が、ヘルペスウイルスＶＰ１６トランス活性化ドメイ
ン、ＮＦ−κＢ転写因子のｐ６５サブユニット、および
Ｏｃｔ−２Ｎ末端グルタミンリッチドメインであってＯ
ｃｔ−２Ｃ末端プロリンリッチＯｃｔ−２ドメインに直
接または間接的に連結しているものからなる群から選択
され、上記第二の融合タンパク質コード配列が、Ｇａｌ４タン
パク質のＤＮＡ結合ドメイン、ＬｅｘＡタンパク質のＤ
ＮＡ結合ドメイン、ＬａｃＩリプレッサータンパク
質、テトラサイクリンリプレッサータンパク質、および
ＺＦＨＤ１タンパク質からなる群から選択され、タンパク質に結合する上記活性化配列が、Ｇａｌ４タン
パク質、ＬｅｘＡタンパク質、ＬａｃＩリプレッサータ
ンパク質、テトラサイクリンリプレッサータンパク質、
およびＺＦＨＤ１タンパク質からなる群から選択され、タンパク質に結合する活性化配列が、基本ＳＶ４０プロ
モーター、ＨＳＶ−１ＶＰ１６トランス活性化ドメイン
と組み合わせたｃ−ｆｏｓプロモーター、ＨＳＶ−１
ＶＰ１６トランス活性化ドメインまたはＯｃｔ−２活性
化ドメインの少なくとも１つの配列と組み合わせたＵ２
ｓｎＲＮＡプロモーター、およびＨＳＶＴＫプロ
モーターからなる群から選択されるプロモーターに連結
されている、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の核
酸構築物。
【請求項１５】ＳＶ核局在化シグナルおよびＨＳＶ−１
ＶＰ１６酸トランス活性化ドメインをも含んでなり、
ＳＶ４０核局在化シグナルおよびＨＳＶ−１ＶＰ１６
酸トランス活性化ドメインが融合タンパク質をコードす
る遺伝子に含まれている、請求項１４に記載の核酸構築
物。
【請求項１６】少なくとも１個の融合タンパク質が抗体
または抗体断片を含む、請求項９〜１５のいずれか一項
に記載の核酸構築物。
【請求項１７】上記抗体断片が、可変鎖と軽鎖とを有す
る一本鎖Ｆｖ断片を含み、可変および軽鎖が短いペプチ
ド配列によって共有結合で連結されている、請求項１６
に記載の核酸構築物。
【請求項１８】少なくとも１個の融合タンパク質が、天
然に存在するタンパク質の結合ドメインを含む、請求項
９〜１５のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項１９】少なくとも１個のプロモーターが、ＲＮ
ＡポリメラーゼIII 、ＲＮＡポリメラーゼII、ＣＭＶプ
ロモーターおよびエンハンサー、ＳＶ４０プロモータ
ー、ＨＢＶプロモーター、ＨＣＶプロモーター、ＨＳＶ
プロモーター、ＨＰＶプロモーター、ＥＢＶプロモータ
ー、ＨＴＬＶプロモーター、ＨＩＶプロモーター、ｃｄ
ｃ２５Ｃプロモーター、サイクリンＡプロモーター、ｃ
ｄｃ２プロモーター、ｂｍｙｂプロモーター、ＤＨＦＲ
プロモーター、およびＥ２Ｆ−１プロモーターからなる
群から選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記
載の核酸構築物。
【請求項２０】核輸出シグナルおよびこれに対応する核
輸出因子が、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１お
よびＨＢＶからなる群から選択されるレトロウイルスの
ｒｅｖ応答要素／ｒｅｖタンパク質から選択される、請
求項５に記載の核酸構築物。
【請求項２１】構造遺伝子が、細胞増殖の阻害剤、細胞
増殖抑制または細胞毒性タンパク質、プロドラッグを開
裂する酵素、抗体、抗体断片と他のタンパク質との間の
融合タンパク質、サイトカイン、成長因子、ホルモン、
サイトカインおよび成長因子のレセプター、サイトカイ
ン拮抗薬、炎症誘発剤、凝固誘発因子、凝固阻害剤、フ
ィブリン溶解誘発タンパク質、脈管形成阻害剤、脈管形
成因子、血圧降下ペプチド、血漿タンパク質、インシュ
リンレセプター、ＬＤＬレセプター、不存在により代謝
疾患または免疫抑制を生じる酵素、ウイルス性抗原、細
菌性抗原、寄生虫性抗原、または腫瘍抗原、これらの抗
原に対する抗イディオタイプ抗体、およびこれらの任意
の組み合わせから誘導される融合タンパク質からなる群
から選択される化合物をコードする、請求項１〜２０の
いずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項２２】少なくとも２個の構造遺伝子がＩＲＥＳ
配列または活性化配列によって相互に連結されている、
請求項９〜２１のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項２３】請求項１〜２２のいずれか一項に記載の
核酸構築物を含んでなるベクター。
【請求項２４】請求項１〜２２のいずれか一項に記載の
核酸構築物と薬学上許容可能なキャリヤーとを含んでな
る医薬組成物。
【請求項２５】融合タンパク質に結合しているカップリ
ング物質を更に含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】上記カップリング物質が細胞膜を透過し
て細胞に入る、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】上記カップリング物質が、ラパマイシ
ン、ＦＫ５０６、シクロスポリンＡ、メトトレキセー
ト、葉酸、レチン酸、ペニシリン、４−ヒドロキシタモ
キシフェン、タモキシフェン、テトラサイクリン、およ
びテトラサイクリン／イソプロピル−β−Ｄ−チオガラ
クトシド結合体からなる群から選択される、請求項２５
に記載の医薬組成物。
【請求項２８】請求項１〜２２のいずれか一項に記載の
核酸構築物を含んでなる細胞。
【請求項２９】転写因子タンパク質に結合する配列をプ
ロモーター配列に連結して活性化配列を形成し、活性化配列を少なくとも１個の構造遺伝子および転写因
子タンパク質をコードする少なくとも１個の遺伝子に連
結することを含んでなる、請求項１〜２２のいずれか一
項に記載の核酸構築物の製造法。
【請求項３０】疾患を予防しまたは改善するための薬剤
を製造するための請求項１〜２２のいずれか一項に記載
の核酸構築物、請求項２３に記載のベクター、請求項２
４〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請
求項２８に記載の細胞の使用。
【請求項３１】請求項１〜２２のいずれか一項に記載の
ＤＮＡ構築物を有する細胞をイン・ビトロで形質転換
し、形質転換細胞を培養して、ＤＮＡ構築物の多数のコピー
を得て、ＤＮＡを培養細胞から精製することを含んでなる医薬組
成物の製造法。