CN1191898A - 自我增强的药物学上可控制的表达系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及构成自我增强的表达系统并含有下面的成分的核酸构建体:至少一个第一个编码活性化合物的结构基因;至少一个第二个编码转录因子蛋白的结构基因;和至少一个由至少一个结合转录因子蛋白的序列和至少一个启动子序列组成的活性序列;其中每个活性序列激活结构基因的表达和转录因子蛋白的表达;并涉及利用核酸构建体制备治疗疾病的药物。

Description

自我增强的药物学上可控制的表达系统
          发明背景
本发明涉及含有至少一个与至少一个结构基因和至少一个转录因子蛋白基因偶联的调节序列的自我增强的核酸构建体。
尽管基因治疗中采取了各种途径，至今得到的预临床和临床研究的结果表明两个基本的问题仍未解决。一个是由于细胞内的中止过程，不能从体外或体内的靶细胞充分地进行转基因表达。第二个是转基因表达的不适当的控制。
在尝试纠正现有技术的这些缺点时，Rivera等(自然医学2，1028(1996))，Belshaw等(PNAS USA 93,4604(1996))和Ho等(自然382,822(1996))已经开发了第一个外部控制转基因表达的技术。这些途径的基础是加入活性化合物纳巴霉素，该化合物将两个亚基偶联在一起。得到的偶联产物的作用是转录因子。第一个亚基构成在DNA结合蛋白和FK506结合蛋白(FKBP)之间形成的融合蛋白，该蛋白也结合纳巴霉素。第二个亚基是在也结合纳巴霉素的蛋白质FRAP和转录因子蛋白NF-kB的活性序列之间形成的融合蛋白。
由这两个亚基与纳巴霉素偶联产生的功能转录因子蛋白依次激活转移基因的序列以激活结构基因。
该外部途径的优点在于结构基因的表达可以通过分别加入或除去活性化合物纳巴霉素打开或关上。但是该途径不能解决结构基因不适当表达的问题。因而，仍然需要提高转基因表达的途径。
              本发明的概述
本发明通过提供核酸构建体，含有该构建体的组合物和利用它们获得高转基因表达的方法满足了本领域未满足的需要。本发明通过在核酸构建体本身内掺入阳性反馈系统来完成。本文将得到的系统称为“自我增强表达系统”。
在本发明的一个实施方案中，提供的核酸构建体包括：
至少一个编码活性化合物的第一个结构基因；
至少一个编码转录因子蛋白的第二个结构基因；和
至少一个由至少一个与转录因子蛋白结合的序列和至少一个启动子序列组成的活化序列；其中每个活化序列激活结构基因的表达和转录因子蛋白的表达。
在本发明的另一个实施方案中，提供的核酸构建体包含：
至少一个编码活性化合物的第一个结构基因；
至少一个编码转录因子蛋白的第二个结构基因；和
至少一个由至少一个与所述转录因子蛋白结合的序列和至少一个药物学控制单位组成的活化序列，该药物学控制单位依次包括，至少一个启动子，至少一个编码转录因子蛋白的活化区和编码偶联物质蛋白的融合蛋白基因，至少一个启动子，至少一个编码DNA结合蛋白和编码第二个偶联物质蛋白的融合蛋白基因，和至少一个含有DNA结合蛋白位点的活化序列，其中每个活化序列激活结构基因的表达和转录因子蛋白的表达。
仍然是本发明的另一个实施方案中，提供的核酸构建体包括：
至少一个编码活性化合物的第一个结构基因；
至少一个编码至少一个含有转录因子蛋白的活化区和结合偶联物质的序列的第一个融合蛋白的第二个结构基因；
至少一个编码至少一个含有结合偶联物质的蛋白和DNA结合蛋白的第二个融合蛋白的第三个结构基因；
至少一个由至少一个结合所述的通过偶联物质与所述的第一个融合蛋白偶联的第二个融合蛋白结合的序列和至少一个启动子序列组成的活化序列；其中每个活化序列激活至少一个所述结构基因的表达。
在阅读了本说明书和附加的权利要求后，其它实施方案对技术人员将是容易明白的。
                  自我增强表达系统
在它的最简单的实施方案中，新的自我增强表达系统包括下面成份：a)至少一个序列a)和/或a’)以结合转录因子蛋白d)，b)至少一个启动子序列b)和/或b’)，c)至少一个编码活性化合物的结构基因c)，和d)至少一个编码结合成份a)的转录因子蛋白d)的基因。
依照本发明，成份a)和/或a’)和b)和/或b’)构成激活结构基因c)的转录和激活转录因子蛋白d)的表达的序列。
在根据本发明的优选形式中，这些成份可以如图1描述排列。
结合序列a)和a’)可以是相同的或不同的，并结合转录因子d)。
启动子序列[成份b)和b’)]可以相同或不同。启动子序列b)和b’)的低水平活化导致低水平地表达结构基因[成份c)]和转录因子蛋白d)[成份d)]的基因的低水平表达。由此制造的转录因子蛋白d)依次结合于结合序列[成份a)和a’)]。这一结合依次激活启动子序列b)和b’)，引起结构基因和转录因子蛋白d)的基因的增强表达。这一增强表达本身导致更大量的转录因子蛋白d)，反馈和进一步刺激该系统。
根据本发明，可以在结构基因的3’末端用编码核输出信号(NES)和核输出因子(NEF)的基因补充(即，“附加”在上游末端)如图1描述的成份的排列。NEF的表达是在附加的启动子(成份b)的控制下的。该附加启动子序列可以与图2显示的活化序列[成份a)和b)和/或a’)和b’)]的任何部分相同或不同。
核输出信号(NES)是妨碍与它连接的前信使RNA运输通过核膜的核苷酸序列。因此NES独立地构成核滞留信号(NRS)。但是，如果NRS结合本文称为“核输出因子”或“NEF”的输出蛋白，NRS就获得NES的功能。这是因为核输出因子(NEF)介导含NES的前信使或信使RNA运出细胞核并进入细胞质的运输。因此如Fischer等，细胞82，475(1995)所述通过与NEF结合，含NES的前信使或信使RNA被分泌出细胞核。
根据本发明，成份c)和d)也可以通过内部核糖体入口位点(IRES)而不是通过与成份a’)和b’)键合彼此连接(即，“相互连接”)。这样的IRESs导致以IRES方式彼此连接的两个DNA序列的表达。
例如，如图3描述可以实现以IRES方式的连接。
这样的排列也在同样的程度上保证了当对启动子序列b)进行低水平激活时，也可以通过IRES序列表达转录因子蛋白[成份d)]的基因。这一表达发生在结构基因[成份c)]被表达时。另外，转录因子蛋白结合结合序列a)，该结合序列增强启动子序列b)的活化，增强结构基因c)的表达和，又一次通过IRES序列也增强转录因子蛋白d)基因的表达。
根据本发明，图1-3描述的各个成份的排列是如图4显示起操作作用的自我增强的表达系统。通过将几个相同或不同的结构基因[成份c)，c’)和c”)]的序列排列在一起使自我增强表达系统得到伸展。通过相同或不同的IRES序列或通过结合序列a)，启动子序列b’)和启动子序列b”)将这些结构基因互相连接起来。图5描述了一个代表性的排列。通过将几个相同或不同的转录因子蛋白d)[成份d)，d’)和d”)]的基因排列在一起也可以使自我增强表达系统得到伸展。图6显示了一个代表性的例子，它指出了通过IRES序列的连接。可选择地，IRES序列可以是相同的序列。
结合序列a)优选地是所有活化序列中的一种类型。所有转录因子蛋白d)，d’)和d”)应与该结合序列结合。当结合序列不是同一类型(如，当成份a与成份a’不同时)，则转录因子蛋白[成份d)，d’)和d”)]应与所有结合序列结合。优选地设计或选择活化序列使它们被所有转录因子蛋白d)，d’)和d”)的产物识别。
以图2显示的同样方式，用编码核输出信号(NES)和核输出因子的基因可以补充图3的成份。图7显示了结构基因[成份c)]的3’末端带有NES基因和带有NEF基因的这一排列。在这个最后的例子中，通过其它启动子序列成份b)独立地将NEF激活。成份b序列可以与成份a)和b)相同或不同。
             药物学上可控制的启动子单位
以最简单的形式，新药物学可控制启动子单位(“药物学控制单位”)包括下面成份：e)至少一个启动子序列，f)至少一个编码融合蛋白f)的基因，该融合蛋白包括转录因子蛋白的活化区和结合偶联物质[成份j)]的蛋白质A，g)至少一个其它的启动子序列[相同或不同于成份e)]或至少一个IRES，h)至少一个编码融合蛋白h)的基因，该融合蛋白包括DNA结合区和结合偶联物质[成份j)]的蛋白质B，i)至少一个含有结合融合蛋白h)的位点的活化序列，和j)至少一个包括融合蛋白f)[成份f)的表达产物]中的结合蛋白A的位点A)和融合蛋白h)[成份h)的表达产物]中的结合蛋白B)的位点B)的偶联物质j)。
成份e-i)可以根据如图8所示方案成序列地排列。这一排列保证当启动子序列e)和g)激活时，表达融合蛋白f)和h)[成份f)和h)]。当存在偶联物质[成份j)]时，两个融合蛋白彼此连接(“相互连接”)形成功能转录因子蛋白以激活活化系列[成份i)]。在本发明的这一实施方案中，在存在偶联物质如成份j)时，由单个成份组成的启动子单位起作用。该单位在附加了偶联物质成份j)的基础上变成有功能。图9显示了这一实施方案的例子。
        自我增强的，药物学上可控制的表达系统
自我增强的表达系统可以与药物学上可控制的启动子单位组合。通过例如在自我增强表达系统(参见图1，2，3或7)中插入药物学上可控制的启动子单位[成分e)到i)]代替启动子系列(成份b)和/或b’))就实现这种组合。通过图10中的例子说明了这一组合的核苷酸序列的构建。在该例子中，结构基因只在融合蛋白f)和h)[成份f)和h)的表达产物]被偶联物质成份j)连接时转录形成转录因子蛋白。
可替代地，或附加地，药物学上可控制的启动子单位可以插入到自我增强表达系统替代转录因子蛋白的基因[成份d)]，结合转录因子蛋白d)的序列[成份a)]和启动子序列b)[成份b)]。在这种情况下，至少应该将结合成份h)位点的5’末端连接于启动子序列e)和g)中的一个上。图11例举了这一组合核苷酸序列的构建。
自我增强系统也可以以其它方式与药物学上可控制的启动子单位组合。例如，图8显示了药物学上可控制的启动子单位可以替代NEF的启动子序列(成份b))(参见图2或7)。图12显示了构建这一核苷酸序列的一个方式。
本发明的核酸构建体有利的是由DNA组成。术语“核酸构建体”指含有核酸并可以在靶细胞中转录的人工结构。核酸构建体有利的是能插入载体中。在本文中，质粒载体或病毒载体是特别如人所愿的。
根据启动子序列的选择，一个新核酸构建体可以非特异地用于表达结构基因[成份c)]。可替代地，通过细胞特异性，病毒特异性，特定条件，或细胞周期条件可进一步控制表达。结构基因优选地编码药物学活性化合物或切割药物的非活性前体形成活性药物的酶。进一步可以设计结构基因表达酶-配体融合蛋白。在这种情况下，配体可以结合到细胞表面。在本文中最优选的是结合到增殖的内皮细胞或肿瘤细胞表面的配体。
本发明还涉及含有新核酸构建体的细胞，特别是酵母或哺乳动物细胞。在特别如人所愿的实施方案中，将核酸构建体导入通过偶联物质[成份j)]的加入或给药转染的细胞系。加入偶联物质刺激结构基因的表达。含有这些结构的细胞可用于制备药物组合物。但是细胞也可以作为治疗剂，或药物组合物对病人给药以治疗疾病。可替代地，新核酸构建体可以掺入载体和直接地给药，局部地或肠胃外地进入病人。在使用时，为特定的疾病设计构建体，以致构建体表达一种或多种防止或改善一种或多种疾病症状的蛋白质或核酸。如技术人员所知，由给药途径，病人的状态，疾病的性质确定本文中所用的核酸构建体的量。
在直接对病人给药的情况中，为了表达结构基因，偶联物质[成份j)]可以附加地给药。如图9所示，通过将融合蛋白f)与融合蛋白h)在转染细胞内偶联，偶联物质导致形成完全的转录因子蛋白。因此，只要体内存在偶联物质转染细胞只表达结构基因。通过施用偶联物质可以控制表达的持续性和强度。
结果是，随着药物的供应，包括通过施用偶联物质，在靶细胞中导入核酸构建体和以非特异的，特异于病毒的或特异于靶细胞的和/或特异于细胞周期的方式表达构建体，新核酸构建体的优选用途包含于疾病的治疗中。
本发明的核酸构建体可以用于通过细胞内合成的方式制备药物组合物。在本文中，用本发明的DNA构建体转化细胞。然后培养转化的细胞，得到细胞的克隆，从而产生多拷贝的DNA构建体。优选地，利用基因扩增增加每个细胞中的DNA构建体的拷贝数。在培养转化细胞得到多拷贝的DNA构建体后，可以从培养细胞中纯化DNA构建体。大肠杆菌是优选的得到多拷贝的DNA构建体的培养细胞。通过与其它物质如本领域已知的缓冲液，盐，或其它赋形剂混合可以将纯化的DNA用作药物组合物中的成份。
在自然界中，新核酸构建体不以这种形式，即活性化合物或酶或配体/酶融合蛋白的结构基因不是天然地与新核酸序列组合形成自我增强的表达系统，存在。该系统也不天然地与药物学上可控制的启动子单位组合。
掺入自我增强的，药物学上可控制的表达系统的优选的结构基因编码药物学活性化合物。这些活性化合物是从包括细胞因子，生长因子，受体细胞因子或生长因子，抗体或抗体片段，具有抗增殖或抑制细胞生长效应的蛋白质，血管生成抑制剂，诱导血栓形成的蛋白质，血凝固抑制剂，血浆蛋白，补体活化蛋白，病毒和细菌包被物质，激素，具有循环效应的肽，神经肽，酶和介导物的组中选择的蛋白质和糖蛋白和包含至少这些蛋白质或糖蛋白中的两个的融合蛋白。
自我增强的，药物学上可控制的表达系统的成份的详细叙述
1)自我增强的表达系统的活化序列和转录因子蛋白
在本发明的意义内，转录因子蛋白d)[成份d)的基因产物]特异地与相关的结合序列a)[成份a)]结合，其部分结合序列激活3’邻接的启动子序列b)(或b’或b”)。
所以，成份a)和成份b)构成含有结合相关转录因子蛋白d)的序列的活化序列。
在另一方面，转录因子蛋白d)必须含有特异于活化剂序列[成份a)]的对应的结合序列的结合区，以及反式激活区。一个附加的核定位信号(NLS)促进与活化序列a)的相互反应。
符合这一先决条件的核酸构建体的实例是：
实施方案A)，包括
1.活化序列，活化序列含有成份a)
成份a)至少含有一个结合Gal4蛋白的序列[如，核苷酸序列：5’-CGGACAACTGTT-GACCG-3’](Chasman和Kornberg，Mol.CellBiol.10,2916(1990))和在它的3’末端含有成份b)，
成份b)含有基本的SV40启动子(核酸48-5191；Tooze(ed.)，DNA肿瘤病毒(纽约冷泉港，(1980)，纽约；冷泉港实验室)，
c-fos启动子(Das等，自然374，657(1995))和在它的3’末端的HSV1 VP16酸反式激活区(TAD)(氨基酸406-488；Treizenberg等，基因发展2,718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5，190(1995))，
U2snRNA启动子和它的3’末端的HSV1 VP16 TAD或至少含有Oct-2的活化区(氨基酸438-479；Tanaka等，Mol.Cell Biol.14，6046(1994)；；Das等，自然374，657(1995))的序列或
HSV TK启动子(Papavassiliou等，J.Biol.Chem.265,9402(1990)；Park等，Molec.Endocrinol.7,319(1993))或
另一个非特异的，特异于细胞的，特异于病毒的和特异于细胞周期的或可代谢激活的启动子，和
2.相关的转录因子蛋白d)的基因[成份d)]含有
Gal4蛋白的DNA结合区(氨基酸1-147；Chasman和Kornberg，Mol.Cell Biol.10.2916(1990))的cDNA，该cDNA的3’末端附着了SV40核定位信号(NLS)(SV40大T；氨基酸126-132：如，PKKKRKV；Dingwall等，TIBS16，478(1991))，该cDNA的3’末端附着了HSV-1VP16酸反式激活区(TAD)(氨基酸406-488；Triezenberg等，基因发展2，718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5,190(1995))。
实施方案B)含有
1.含有成份a)的活化序列，
成份a)至少含有一个结合LexA蛋白的序列[如，核苷酸序列5’-TACTGTATGTACA-TACAGTA-3’][LexA操纵子；Brent等，自然612，312(1984)]和在它的3’末端的成份b)，成份b)含有：SV40基本启动子(核酸48-5191；Tooze(ed.)，DNA肿瘤病毒(纽约冷泉港，(1980)纽约；冷泉港实验室)或另一个启动子(参见实施方案A)，和
2.被接纳的转录因子蛋白d)的基因[成份d)]，该基因含有LexA蛋白的DNA结合区(氨基酸1-81；Kim等，科学255，203(1992))或整个LexA蛋白(氨基酸1-202；Brent等，细胞43，729(1985))的cDNA，该cDNA的3’末端附着了SV40核定位信号(NLS)(SV40大T；氨基酸126-132：如，PKKKRKV；Dingwall等，TIBS 16，478(1991))，该cDNA的3’末端附着了HSV-1VP16酸反式激活区(TAD)(氨基酸406-488；Triezenberg等，基因发展，2，718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5，190(1995))。
实施方案C)含有
1.含有成份a)的活化序列，
成份a)至少含有一个结合lacI阻遏蛋白的lac操纵子序列(如，核苷酸序列：5’-GAATTGTGAGCGCTCACAATTC-3’)(Fuerst等，PNASUSA86，2549(1989)；Simons等，PNASUSA81，1624(1984))和它的3’末端的成份b)，
成份b)含有SV40基本启动子(核酸48-5191；Tooze(ed.)DNA肿瘤病毒(纽约冷泉港，纽约，(1980)冷泉港实验室)或另一个启动子(参见实施方案A)，和
2.被接纳的转录因子蛋白d)的基因[成份d)]，该基因含有lac阻遏(lacI)蛋白的cDNA(Brown等，细胞49，603(1987)；Fuerst等，PNASUSA86，2549(1989))，该cDNA的3’末端附着了SV40核定位信号(NLS)(SV40大T；氨基酸：126-132；如，PKKKRKV；Dingwall等，TIBS16，478(1991))，该cDNA的3’末端附着了HSV-1VP16酸反式激活区(TAD)(氨基酸：406-488；Triezenberg等，基因发展，2，718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5,190(1995))。
实施方案D)含有
1.含有成份a)的活化序列
成分a)至少含有一个结合四环素阻遏(tetR)蛋白的四环素操纵子(tetO)序列(如，核苷酸序列：5’-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3’)和它的3’末端的成份b)，
成份b)含有：SV40基本启动子(核酸48-5191；Tooze(ed.)DNA肿瘤病毒(纽约冷泉港，(1980)纽约，冷泉港实验室)或另一个启动子(参见实施方案A)和
2.被接纳的转录因子蛋白d)的基因[成份d)]，该基因含有
四环素阻遏(tetR)蛋白的cDNA(Gossen等，PNAS USA89,5547(1992)；Dingermann等，EMBOJ.11,1487(1992))和它的3’末端的SV40核定位信号(NLS)(SV40大T；氨基酸126-132；如，PKKKRKV；Dingwall等，TIBS16,478(1991))和它的3’末端的HSV-1VP16酸反式激活区(TAD)(氨基酸：406-488；Triezenberg等，基因发展，2,718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5,190(1995))。
实施方案E)含有
1.含有成份a)的活化序列
成分a)至少含有一个结合ZFHD-1蛋白的序列(如核苷酸序列5’-TAATGATGGGCG-3’)(Pomerantz等，科学267，93(1995))和它的3’末端的成份b)，成份b)含有：
基本SV40启动子(核酸48-5191；Tooze(ed.)，DNA肿瘤病毒(纽约冷泉港，(1980)纽约，冷泉港实验室)或另一个启动子(参见实施方案A)和
2.被接纳的转录因子蛋白d)的基因[成份d)]，该基因含有
ZFHD1蛋白的cDNA(Pomerantz等，科学267，93(1995))和它的3’末端的SV40核定位信号(NLS)(SV40大T；氨基酸126-132：如，PKKKRKV；Dingwall等，TIBS16，478(1991))和它的3’末端的HSV-1VP16酸反式激活区(TAD)(氨基酸406-488；Triezenberg等，基因发展2，718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5,190(1995))。
2)药物学上可控制的启动子单位
根据本发明，下面的基因是药物学上可控制的启动子单位的特异成份(参见图8和9)：
对于融合蛋白f)[成份f)]：
转录因子蛋白的活化区的基因，和至少一个结合偶联物质j)的蛋白质A的基因，其中适当补充了核定位信号(NLS)。
对于融合蛋白h)[成份h)]：
至少一个结合偶联物质j)的蛋白质B的基因和结合活化序列的DNA的蛋白质的基因[成份i)]。
对于偶联物质
成份j)至少含有一个结合蛋白质A和结合蛋白质B的位点。
对于成份i)，活化序列含有结合融合蛋白h)[成份h)]的位点和启动子元件。
偶联物质[成份j)]的选择不可避免地确定分别在成份f)和h)中的结合成份j)的蛋白质A和B的特性。在本文中，在成份f)和h)中的结合成份j)的蛋白质A和B可以是相同的或不同的。特别当偶联物质[成份j)]具有几个相同结合位点时可以利用相同的结合成份j)的蛋白质A和B。但是，在本发明的意义内，不同的结合成份j)的蛋白质A和B优选的是在成份f)和h)中。
这意味着偶联物质[成份j)]与融合蛋白f)[成份f)]在不同于与融合蛋白h)[成份h)]结合的位点上结合，以致融合蛋白f)和h)不会互相竞争结合偶联物质。
可以利用已知结合特殊细胞蛋白的偶联物质，在药物学上可控制的启动子的成份f)和h)中可以利用细胞蛋白的基因。
但是，本发明还特别涉及利用结合偶联物质j)的单克隆抗体，和起源于它们的重组抗体，或它们的片段。在融合蛋白f)和h)[成份f)和h)]中插入这些单克隆抗体特别是它们的重组Fv片段构成了本发明的特定特征。在本文中，在融合蛋白[成份f)和h)]中优选地利用识别偶联物质[成份j)]上不同结合位点(分别是结合A和B的位点的表位)的重组Fv片段。
在本发明的意义内，可以利用鼠的和人的单克隆抗体。鼠单克隆抗体优选地以人源化形式使用。以Winter等(自然349，293(1991))和Hoogenbooms等(Rev.Tr.Transfus.Hemobiol.36,19(1993))叙述的方式实现人源化。根据目前的工艺水平，例如以Winter等，自然349，293(1993)；Hoogenboom等，Rev.Tr.Trahsfus.Hemobiol.36,19(1993)；Girol.Mol.Immunol.28，1379(1991)和Huston等，Int.Rev.Immunol.10,195(1993)叙述的方式制备抗体片段。
利用噬菌体显示技术(Smith，科学228，1315(1985))可以直接从现存的杂交瘤制备或从鼠或人的抗体片段文库分离(Winter等，Annu.Rev.Immunol.12，433(1994))重组抗体片段。然后将这些抗体片段直接在遗传水平用于与其它蛋白质或肽[与转录因子蛋白(成份f)的活化区或与结合DNA的蛋白质(成份h)]融合。
为了从杂交瘤制备重组抗体片段，通过分离mRNA，逆转录RNA成cDNA并且然后利用分别与可变片段(Orlandi等，PNAS-USA86，3833(1989))的5’和3’末端互补的低聚核苷酸以聚合酶链反应(Saiki等，科学230，1350(1985))的途径扩增cDNA获得编码抗体的抗原结合区(VH和VL)的遗传信息。然后将VH和VL片段例如以Fv片段(Skerra和Plückthun，科学240，1038(1988))，单链Fv片段(scFv)(Bird等，科学242，423(1988)；Huston等，PNAS-USA85，5879(1988))或Fab片段(Better等，科学240，1041(1988))的形式克隆进细菌表达载体。
利用噬菌体显示技术也可以直接从鼠或人起源的抗体文库(免疫文库或天然文库)分离新抗体片段。在抗体片段的噬菌体显示中，以scFv片段(McCafferty等，自然348，552(1990))或Fab片段(Hoogenboom等，核酸研究，19，4133(1991)；Barbas等，PNAS USA88,7978(1991))的形式将抗原结合区克隆进噬菌体基因组(McCafferty等，自然348，552(1990))或噬菌体质粒载体(Breitling等，基因104，147(1991))与丝状细菌噬菌体的g3P包衣蛋白一起成为融合蛋白。在负载抗原的塑料接收器(锅)(Marks等，J.Mol.Biol.222,581(1991))上，在与抗原结合的，顺磁性珠(Hawkins等，J.Mol.Biol.226,889(1992))上或通过结合到细胞表面(Marks等，Bio/Technol.11,1145(1993))上筛选结合抗原的噬菌体。
通过PCR扩增来自免疫接种动物(Sastry等，PNAS-USA86,5728(1989)；Ward等，自然341,544(1989)；Clackson等，自然352,624(1991))或病人(Mullinax等，PNAS-USA87,8095(1990)；Barbas等，PNAS-USA88,7978(1991))的B淋巴细胞的可变抗体片段制备免疫文库。为此，利用了特异于鼠(Orlandi等，PNAS-USA86,3833(1989)；Sastry等，PNAS-USA86,5728(1989))或人的免疫球蛋白基因(Larrick等，BBRC160，1250(1989))，或特异于人的免疫球蛋白基因家族(Marks等，Eur.J.Immunol.21,985(1991))的低聚核苷酸的组合。
利用非免疫接种供体作为免疫球蛋白基因的来源可以制备天然文库(Marks等，J.Mol.Biol.222,581(1991))。可替代地，免疫球蛋白种系基因可用于制备半合成抗体所有组成成分，而可变片段的互补决定区3通过利用简并引物(Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.227,381(1992)；Barbas等，PNAS-USA89,4457(1992)；Nissim等，EMBOJ.13,692(1994)；Greffiths等，EMBO J.13,3245(1994))的PCR途径得到扩增。与免疫文库相比，所谓的单罐(single-pot)文库具有的优点是可以从一个单个文库分离抗大量抗原的抗体片段(Nissim等，EMBOJ.13,692(1994))。
随着通过任意的(Hawkins等，J.Mol.Biol.226,889(1992)；Gram等，PNAS-USA89,3576(1992))，基于密码子的(Glaser等，免疫学杂志149,3903(1992))或位点特异性的诱变(Balint和Larrick，基因137,109(1993))的途径，通过将单个区的链与天然所有组成成分的片段的链混合(Marks等，生物/技术10,779(1992))或通过利用细菌突变体菌株(Low等，J.Mol.Biol.260,359(1996))，并通过在严格条件下重选择分离具有改良特性的抗体片段(Hawkins等，J.Mol.Biol.226,889(1992))，从预先存在的抗体片段中制备新文库，仍然可以利用噬菌体显示技术进一步提高抗体片段的亲和性。另外，通过用人所有组成成分逐步替代可变区中的一个并且随后利用原始抗体选择(控制选择)可以将鼠抗体片段人源化(Jespers等，Bio/Technol.12,889(1994))。可替代地，通过用原始鼠抗体的对应区特异地替代人抗体的超可变区可以将鼠抗体人源化(Jones等，自然321,522(1987))。
结果是，在本发明的意义内，偶联物质基本包括能渗透进细胞的所有物质。在本发明的意义内，特别优选的是那些已经独立地用作基因治疗的药品的偶联物质。
例如，这些偶联物质包括下面的偶联物质[成份j)]以及被接纳的蛋白质，它们结合特定的偶联物质并且为了分别表达融合蛋白f)和h)，它们的基因将要被插入到成份f)和h)中：
-偶联物质：纳巴霉素或纳巴霉素类似物，如L685818(Becker等，J.Biol.Chem.268,11335(1993))，以及下面的结合蛋白(和它们的基因)：
·FK506-结合蛋白(FKBP；Bierer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87,9231(1990))
·FKBP/纳巴霉素相关蛋白，该蛋白结合纳巴霉素/FKBP复合物，或它的结合纳巴霉素/FKBP复合物的部分序列(FRAP；Brown等，自然369,756(1994)；Chui等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91,12574(1994)；Sabatini等，细胞78,35(1994)；Sabers等，J.Biol.Chem.270,815(1995))。
·不利用FKBP和FRAP的基因，而利用结合纳巴霉素和/或抑制FKBP或FRAP与纳巴霉素的结合的重组Fv片段的基因。
-偶联物质：FK506的二聚体(FK1012)(Spencer等，科学262,1019(1993)；Pruschy等，Chem.Biol.1,163(1994))以及下面的结合蛋白(和它们的基因)：
·FK506-结合蛋白(FKBP，参见上面)；
·calcineurin(Lin等，细胞66,807(1991))或它的结合FK506复合物的部分序列(Clipstone等，J.Biol.Chem.269,26431(1994))；和
·抑制FK506与cakcineurin结合(Ho等，自然382,822(1996))并可以插入替代calcineurin基因的重组Fv片段的基因。
-偶联物质：环孢菌素A的二聚体(Belshaw等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,4604(1996))以及下面的结合蛋白(和它们的基因)：
亲环蛋白(Belshaw等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,4604(1996))；
calcineurin或它的结合环孢菌素A/亲环蛋白复合物(参见上面)的部分序列；和
抑制环孢菌素A与亲环蛋白的结合并且可以插入替代亲环蛋白的基因的重组Fv片段的基因。
-偶联物质：环孢菌素A的单体以及下面的结合蛋白(和它们的基因)：
·亲环蛋白；
·结合亲环蛋白/环孢菌素A复合物中的环孢菌素A的重组Fv片段的基因(Cacalano等，Molec.Immunol.29,107(1992))；
·作为亲环蛋白的替代，利用结合环孢菌素A的不同表位的不同重组Fv片段的基因(Vix等，蛋白质15,339(1993)；Cacalano等，Mol.Immunol.29,107(1992)；Rauffer等，Molec.Immunol.31,913(1994))。
-偶联物质：氨甲喋呤以及下面的结合蛋白(和它们的基因)：
·抗氨甲喋呤的抗体或抗体片段(重组Fv片段)(Pimm等，Brit.J.Cancer61,508(1990)；Kato等，免疫方法杂志67,321(1984))；
·抗喋啶基团的抗体或抗体片段(重组Fv片段)(Cot等，杂交瘤6,87(1987))；
·抗苯基基团的抗体或抗体片段(重组Fv片段)(Cot等，杂交瘤6,87(1987))；和
·二氢叶酸还原酶(Masters等，基因21,59(1983)；Swift等，Mol.Gen.Genetics 181,441(1981)；Goldsmith等，Mol.Cell Biol.6,878，(1986))。
-偶联物质：庆大霉素以及下面的结合蛋白(和它们的基因)：
·抗庆大霉素的抗体或抗体片段(重组Fv片段)(Sierra-Madero等，J.Clin.Microbiol.26,1904(1988)。
-偶联物质：头孢他啶以及下面的结合蛋白(和它们的基因)：
·抗头孢他啶的抗体或抗体片段(重组Fv片段)(Shimizu等，Int.Arch.Allergy Immunol.98,392(1992))。
-偶联物质：头孢氨苄以及下面的结合蛋白(和它们的基因)：
·抗头孢烯的C7位置的酰基侧链的抗体或抗体片段(重组Fv片段)(Nagakura等，Int.Arch.Allergy Applied Immunol.93,126(1990))。
-偶联物质：叶酸以及下面的结合蛋白(和它们的基因)：
·叶酸结合蛋白(Ratnam等，生物化学28,8249(1989)；Elwood，J.Biol.Chem.264,14893(1989)；Sadasivan等，Biochem.Biophys.Acta 1131,91(1992))；
·抗叶酸的抗体或抗体片段(重组Fv片段)(Rayburn等，临床化学，30,1007(1984))。
-偶联物质：视黄酸以及下面的结合蛋白(和它们的基因)：
·细胞的视黄酸结合蛋白的视黄酸结合区(Stoner等，癌症研究49,1497(1989)；Eller等，临床研究39,560A(1991))；和
·抗视黄酸的抗体或抗体片段(重组Fv片段)(Twal等，生物学发展168,225(1995)；Zhou等，免疫方法杂志138,211(1991))。
-偶联物质：青霉素以及下面的结合物质(和它们的基因)：
·抗羟氨苄青霉素的抗体或抗体片段(重组Fv片段)(Mayorga等，Toxicol.97,225(1995)；Mayorga等，Int.Arch.Allergy AppliedImmunol.99,443(1992))；
·抗苄青霉噻唑酰基团的抗体或抗体片段(重组Fv片段)(de Haan等，Int.Arch.Allergy Applied Immunol.76,42(1985)；Fukushima等，Clin.Exp.Immun.68,427(1987))；
·抗青霉素的抗体或抗体片段(重组Fv片段)(Sierra-Madero等，J.Clin.Microbiol.26,1904(1988))；和
·青霉素结合蛋白(Popham等，细菌学杂志177,326(1995)；细菌学杂志176,7197(1994))。
-偶联物质：4-羟基他莫昔芬或他莫昔芬以及下面的结合蛋白(和它们的基因)：
·雌激素受体蛋白的雌激素结合区(Spreafico等，Eur.J.Pharmacol.227,353(1992)；Green等，自然320，134(1986))；和
·抗雌激素受体/雌激素或4-羟基他莫昔芬复合物的抗体或抗体片段(重组Fv片段)(Giambiagi等，J.Steroid Biochem.30,213(1988)；
Biochim.Biophys.Acta 883，559(1986)；Katzenellenbogen等，Biochem.26,2364(1987)；Tate等，乳腺癌研究以及治疗3，267(1983))。
-偶联物质：四环素以及下面的蛋白(和它们的基因)：
·四环素阻遏蛋白(Gossen等，PNASUSA89，5547(1992))；和
·抗四环素的抗体或抗体片段。
-偶联物质：四环素和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的结合物以及下面的结合蛋白(和它们的基因)：
·四环素阻遏蛋白(Gossen等，PNAS USA89,5547(1992))；和
·lac阻遏(lacI)蛋白(Brow等，细胞49，603(1987))。
根据本发明，偶联物质[成份j)]结合蛋白A和B的基因
-在融合蛋白f)[成份f)，蛋白质A]中，与转录因子蛋白的活化区的基因连接，和
-在融合蛋白h)[成份h)，蛋白质B]中，与DNA结合蛋白的基因连接，选择该DNA结合蛋白使它与
-活化序列[成份i)]特异地结合(参见图8和9)。在本文中，“天然存在的蛋白质”是在自然界中发现的蛋白质。所以，来自“天然存在的蛋白质”的结合区与人设计的结合区不同。从自然界发现和分离天然存在的蛋白质。“结合区”的核酸序列信息可以独立地使用或与其它序列信息组合形成来自天然存在的蛋白质的结合区。
在本发明的意义内，例如下面的序列可以用作成份f)中的活化区的核苷酸序列：
-疱疹病毒VP16反式激活区(Greaves等，病毒学杂志64,2716(1990)；65,6705(1991))；
-NF-xB转录因子蛋白的p65亚基(Schmitz等，EMBO J，10，3805(1991))；和
-直接或间接地与Oct-2C末端脯氨酸丰富的Oct-2区连接的Oct-2N末端谷氨酰胺丰富的区(如，通过Gal4-结合蛋白)(Tanaka等，Mol.Cell Biol.14,6046(1994))。
例如，下面的可以用作融合蛋白h)[成份h)]中的DNA结合蛋白的核苷酸序列和用作为被接纳的活化序列[成份i)]：
实施方案F)，包括
1.在融合蛋白h)中的DNA结合蛋白的核苷酸序列，该序列包括
·Gal4蛋白的DNA结合区(氨基酸1-147；Chasman和Kornberg，Mol.Cell Biol.10,2916(1990))的cDNA和它的3’末端的SV40核定位信号(NLS)(SV40大T；氨基酸126-132：如，PKKKRKV；Dingwall等，TIBS16，478(1991))和它的3’末端的HSV-1VP16酸反式激活区(TAD)(氨基酸406-488；Triezenberg等，基因发展2，718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5,190(1995))。
2.被接纳的活化序列[成份i)]，该序列包括
·至少一个结合Gal4蛋白的序列(如，核苷酸序列5’-CGGACAACTGTTCACCG-3’)(Chasman和Kornberg，Mol.Cell Biol.10,2916(1989))和，它的3’末端的SV40基本启动子(核酸48-5191；Tooze(ed.)，DNA肿瘤病毒(纽约冷泉港，纽约；冷泉港实验室)，或
·c-fos启动子(Das等，自然374,657(1995))和，它的3’末端的HSV1 VP16酸反式激活区(TAD)(氨基酸406-488；Triezenberg等，基因发展2，718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5,190(1995))，或
·U2 sn RNA启动子和，它的3’末端的HSV1-VP16TAD或至少Oct-2活化区的序列(氨基酸438-479；Tanaka等，Mol.CellBiol.14,6046(1994)；Das等，自然374，657(1995))，或
·HSV启动子(Papavassiliou等，J.Biol.Chem.265,9402(1990)；Park等，Molec，.Endocrinol.7,319(1993))，或
·任何其它能被非特异地，特异于细胞地，特异于病毒地和/或特异于细胞周期地激活的启动子。
实施方案G)，包括
1.在融合蛋白h)中的DNA结合蛋白的核苷酸序列，该序列包括
·LexA蛋白的DNA结合区(氨基酸1-81；Kim等，科学255，203(1992))或整个LexA蛋白(氨基酸1-202；Brent等，细胞43，729(1985))的cDNA和它的3’末端的SV40核定位信号(NLS)(SV40大T；氨基酸126-132：如PKKKRKV；Dingwall等，TIBS16，478(1991))和它的3’末端的HSV-1VP16酸反式激活区(TAD)(氨基酸406-488；Triezenberg等，基因发展2，718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5,190(1995))和
2.被接纳的活化序列[成份i)]：
·结合Lex A蛋白(Lex A操纵子，Brent等，自然612，312(1984))的序列[如，核苷酸序列5’-TACTGTATGTACATACAGTA-3’)，它的3’末端附着的
·SV40基本启动子(核酸48-5191；Tooze(ed.)，DNA肿瘤病毒(纽约冷泉港，纽约；冷泉港实验室)或另一个启动子(参见实施方案F)。
实施方案H)，包括
1.在融合蛋白h)中的DNA结合蛋白的核苷酸序列，包括
·lac阻遏(lacI)蛋白的cDNA(Brown等，细胞49，603(1987)；Fruerst等，PNAS USA86,2549(1989))和，它的3’末端的SV40核定位信号(NLS)(SV40大T；氨基酸126-132；如PKKKRKV；Dingwall等，TIBS16，478(1991))和它的3’末端的HSV-1VP16酸反式激活区(TAD)(氨基酸：406-488；Triezenberg等，基因发展2，718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5,190(1995))，和
2.被接纳的活化序列(成份i))
·至少含有结合lacI阻遏蛋白(Fuerst等，PNAS USA86，2549(1989)；Simons等，PNAS USA81,1624(1984))的lac操纵子序列(如核苷酸序列：5’-GAATTGTGAGCGCTCACAATTC-3’)和它的3’末端的SV40基本启动子(核酸48-5191；Tooze(ed.)DNA肿瘤病毒(纽约冷泉港，N.Y.，冷泉港实验室)或另一个启动子(参见实施方案F)。
实施方案I)，包括
1.在融合蛋白h)中的DNA结合蛋白的核苷酸序列，该序列包括
·四环素阻遏(tetR)蛋白的cDNA(Gossen等，PNAS USA89,5547(1992)；Dingermann等，EMBO J.11,1487(1992))和它的3’末端的SV40核定位信号(NLS)(SV40大T；氨基酸126-132；如PKKKRKV；Dingwall等，TIBS16,478(1991))和它的3’末端的HSV-1VP16酸反式激活区(TAD)(氨基酸：405-488；Triezenberg等，基因发展2,718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5,190(1995))，和
2.被接纳的活化序列[成份i)]
·至少含有结合四环素阻遏(tetR)蛋白的四环素操纵子(tetO)序列(如核酸序列：5’-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3’)和它的3’末端的
·基本SV40启动子(核酸48-5191；Tooze(ed.)DNA肿瘤病毒(纽约冷泉港，N.Y.，冷泉港实验室)或另一个启动子(参见实施方案F)。
实施方案J)，包括
1.在融合蛋白h)中的DNA结合蛋白的核苷酸序列，该序列包括
·ZFHD1蛋白的cDNA(Pomerantz等，科学267,93(1995))和它的3’末端的SV40核定位信号(NLS)(SV40大T；氨基酸126-132；如PKKKRKV；Dingwall等，TIBS16,478(1991))和它的3’末端的HSV-1VP16酸反式激活区(TAD)(氨基酸406-488；Triezenberg等，基因发展2,718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5,190(1995))，和
2.被接纳的活化序列[成份i)]，
·至少包括一个结合ZFHD-1蛋白(Pomerantz等，科学267,93(1995))的序列(如核苷酸序列5’-TAATGATGGGCG-3’)和它的3’末端的基本SV40启动子(核酸48-5191；Tooze(ed.)，DNA肿瘤病毒(纽约冷泉港，纽约；冷泉港实验室)或另一个启动子(可能参见F)。
3)启动子序列
在本发明的意义内，将在结合转录因子蛋白后激活定位于3’末端的邻接位置的结构基因的转录的核苷酸序列用作启动子序列[成份b)，e)，g)和i)]。启动子序列的选择依赖于所治疗的疾病和所转导的靶细胞。所以，以不受限制的方式，以特异于靶细胞的方式，在特定的代谢条件下，以特异于细胞周期的方式或以特异于病毒的方式可以将启动子序列激活。另外，相同或不同的启动子序列可以用于成份b)，e)和/或g)和成份i)中。这些启动子序列的例子，除了已经在实施方案A)-J)中引用的启动子序列以外，还有：-可以以不受限制的方式激活的启动子和激活剂序列
·RNA聚合酶III启动子
·RNA聚合酶II启动子
·CMV启动子和CMV增强子
·SV40启动子-病毒启动子序列和激活剂序列，如
·HBV
·HCV
·HSV
·HPV
·EBV
·HTLV
·HIV
当利用HIV启动子时，将包括TAR序列(位置≤-453-≥+80，Rosen等，细胞41,813(1985))的整个LTR序列用作特异于病毒的启动子。
-可以从代谢上激活的启动子序列或增强子序列，如可以被缺氧诱导的增强子或启动子。
-可以以特异于细胞周期的方式激活的启动子如cdc25C基因启动子，细胞周期蛋白A基因启动子，cdc2基因启动子，B-myb基因启动子，DHFR基因启动子或E2F-1启动子，或在细胞增殖过程中出现或激活的转录因子蛋白的结合序列。这些结合序列包括，例如c-myc-蛋白的结合序列。这些结合序列也包括称为myc E盒的核苷酸序列的单体或多体，如[5’-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3’，Blackwood和Eisenmann，科学251,1211，(1991))。
-可以被四环素激活的启动子，如与对应的阻遏物组合的四环素操纵子。
-嵌合启动子。
嵌合启动子构成可以特异于细胞，代谢或特异于病毒激活的上游激活剂序列与可以结合CDF和CHF或E2F和CHF家族的转录因子蛋白的下游启动子单位的组合，并且因此能够在细胞周期的G0和G1态时抑制上游激活剂序列的活化。
-杂交启动子，例如以启动子的TATA盒突变的形式，而TATA-结合蛋白的基因中的相应的突变补偿了该突变，并且该TATA-结合蛋白是在另一个启动子的控制下的。
-可以以特异于细胞的方式激活的启动子，这些启动子优选地包括启动子或来自优选地编码选定细胞中的蛋白的基因的激活剂序列。
例如，在本发明的意义内，可以优选地利用下面细胞中的下面的蛋白的启动子：
-在内皮细胞中激活的启动子序列或激活剂序列
·特异于脑的，内皮葡糖-1-转运子
·endoglin
·VEGF受体1(flt-1)
·VEGF受体2(flk-1，KDR)
·til-1或til-2
·B61受体(Eck受体)
·B61
·内皮素，特别是
·内皮素B
·内皮素-1
·内皮素受体，特别是内皮素B受体
·IL-1α，IL-1β
·IL-1受体
·血管细胞粘连分子(VCAM-1)
·合成的激活剂序列
作为天然的特异于内皮的启动子的另一种选择，也可以利用合成激活剂序列，该序列包括优选地或有选择地在内皮细胞中有活性的转录因子蛋白的低聚化结合位点。这些转录因子蛋白的一个例子是转录因子蛋白GATA-2，它的在内皮素-1基因中的结合位点例如是5’-TTATCT-3’。
-在邻近活化内皮细胞的细胞中活化的启动子或激活剂序列
·VEGF
VEGF基因的基因调节序列是
·5’侧接区，或
·3’侧接区，或
·c-Src基因，或
·v-Scr基因。
类固醇激素受体和它们的启动子元件(Truss和Beato，Endocr.Rev.14,459 (1993))，特别是鼠哺乳动物肿瘤病毒启动子。
-在肌肉细胞，特别是平滑肌肉细胞中激活的启动子或激活剂序列
·原肌球蛋白
·α-肌动蛋白
·α-肌球蛋白
·PDGF受体
·FGF受体
·MRF-4
·磷酸果糖激酶A
·磷酸甘油酸变位酶
·肌钙蛋白C
·生肌素
·内皮素A的受体
·结合蛋白
·VEGF
VEGF基因的基因调节序列已经列在题目为“在活化内皮细胞的邻近细胞中活化的启动子”部分(参见上面)。
·“人工”启动子
据报道螺旋-环-螺旋(HLH)家族(MyoD，Myf-5，生肌素和MRF4)的因子是特异于肌肉的转录激活剂。特异于肌肉的转录激活剂也包括锌指蛋白GATA-4和MEF转录因子基团。
HLH蛋白和GATA-4不仅在有特异于肌肉基因的启动子而且在有异源的即人工启动子时显示特异于肌肉的转录。这些人工启动子的例子是：
·结合特异于肌肉的HLH蛋白的DNA位点的多重拷贝，如E盒(MyoD)(如4×AGCAGGTGTTGGGAGGC)
·结合α-生肌素重链基因的GATA-4的DNA位点的多重拷贝(如5’-GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG3’)
-在神经胶质细胞中激活的启动子和激活剂序列。这些分别特别包括来自例如编码下面的蛋白质的基因调节序列或元件：
·特异于Schwann细胞的蛋白质periaxin
·谷氨酰胺合成酶
·特异于神经胶质细胞的蛋白质
(神经胶质的原纤维酸性蛋白＝GFAP)
·神经胶质细胞蛋白S100b
·IL-6(CNTF)
·5-HT受体
·TNFα
·IL-10
·类胰岛素生长因子受体I和II
·VEGF
VEGF基因的基因调节序列已经列于上面。
-在造血细胞中激活的启动子和激活剂序列。
这些基因调节序列包括细胞因子或它的受体的基因的启动子序列，该基因在造血细胞或邻近细胞如基质中表达。
这些序列包括例如下面的细胞因子和它们的受体的启动子序列：
·干细胞因子受体
·干细胞因子
·IL-1α
·IL-1受体
·IL-3
·IL-3受体(α亚基)
·IL-3受体(β亚基)
·IL-6
·IL-6受体
·GM-CSF
·GM-CFS受体(α链)
·干扰素调节因子1(IRF-1)
IL-6激活IRF-1的启动子到同样于IFN-α，IFN-β或IFN-γ激活的程度。
·红细胞生成素
·红细胞生成素受体
-在淋巴细胞和/或巨噬细胞中激活的启动子和激活剂序列
这些包括例如，细胞因子，细胞因子受体和抗体的Fc片段的粘连分子和受体的基因的启动子序列和激活剂序列。
后面这些的例子有：
·IL-1受体
·IL-1α
·IL-1β
·IL-2
·IL-2受体
·IL-3
·IL-3受体(α亚基)
·IL-3受体(β亚基)
·IL-4
·IL-4受体
·IL-5
·IL-6
·干扰素调节因子1(IRF-1)
(IL-6激活IRF-1的启动子到同样于IFN-α或IFN-β激活的程度)。
·IFN-γ-反应性启动子
·IL-7
·IL-8
·IL-10
·IL-11
·IFN-γ
·GM-CSF
·GM-CSF受体(α链)
·IL-13
·LIF
·巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)受体
·I和II型清除剂巨噬细胞受体
·MAC-1(白细胞功能抗原)
·LFA-1α(白细胞功能抗原)
·p150,95(白细胞功能抗原)
-在滑液细胞中激活的启动子序列和激活剂序列
这些包括基质金属蛋白酶(MMP)例如
·MMP-1(间质的胶原酶)
·MMP-3(基质溶细胞因子/转移素)的启动子序列
这些进一步包括金属蛋白酶(TIMP)的组织抑制剂例如
·TIMP-1
·TIMP-2
·TIMP-3
的启动子序列。
-在白血病细胞中激活的启动子和激活剂序列
这些包括例如，
·c-myc
·HSP-70
·bcl-1/细胞周期蛋白D-1
·bcl-2
·IL-6
·11-10
·NFα，TNFβ
·HOX-11
·BCR-Ab1
·E2A-PBX-1
·PML-RARA
(前髓细胞白血病-视黄酸受体)
·c-myc
的启动子
c-myc蛋白结合和激活称为myc E盒的核苷酸序列的多体(如5’-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3’)
-肿瘤细胞的启动子或激活剂序列
将与在肿瘤细胞中形成或是有活性的转录因子蛋白相互作用的基因调节核苷酸序列设想为启动子序列或激活剂序列。
在本发明的意义内，优选的启动子或激活剂序列分别包括来自编码特别是在癌细胞或肉瘤细胞中形成的蛋白质的基因的基因调节序列或元件。所以在小细胞支气管癌的情况中，优选的是利用N-CAM蛋白的启动子，在子宫癌的情况中，优选的是利用肝炎生长因子受体或L-网质的启动子，在胰腺癌的情况中，优选的是利用L-网质或多型核白细胞上皮粘蛋白(PEM)的启动子。
4)核输出信号和核输出因子
在本发明的意义内，核输出信号(NES)优选地是逆转录病毒rev-应答元件(RRE)序列。在HIV-1的情况中，该RRE是在env基因(Malim等，自然338,254(1989)；Kjem等，PNAS88,683(1991))中的243个核苷酸的序列(核苷酸7362-7595；Muesing等，自然313,450(1985))。但是，在本发明的意义内，核输出信号(NES)也可以是同源的和/或功能相似的(类似的)核苷酸序列如，HBV病毒RRE-等同元件(Huang等，Mol.Cell Biol.13,7476(1993))。
在新核酸构建体中，核输出因子(NEF)是编码结合NRS的mRNA并介导含NRS的前信使RNA或信使RNA出细胞核进入细胞质(或出细胞质进入细胞核)的运输的蛋白质的核苷酸序列。在本发明的意义内，特别可利用专门来自HIV-1或HIV-2病毒的逆转录病毒的rev基因(Daly等，自然342,816(1989)；Emerman等，细胞57,1155(1989)；Felber等，PNAS86,1495(1989)；Fischer等，EMBOJ.13,4105(1994))。
逆转录病毒的rev基因的rev蛋白通过它的N-末端区(Zapp等，自然342,7154(1989)；Malim等，细胞65,241(1991))与前mRNA中的RRE结合(Iwai等，核酸研究20,6465(1992))。RRE和rev蛋白之间的结合促进了非拼接前信使RNA和任何其它含有RRE的RNA，出细胞核进入细胞质的运输(Fischer等，EMBOJ.13,4105(1994)；Fischer等，细胞82,475(1995))，从而实质上增强了转译。
在本发明的意义内，也可以利用编码同源于和功能相似于HIV-1rev蛋白(Bogerd等，细胞82,485(1995))的蛋白质的核苷酸序列如visna-maedi病毒(VMV；Tiley等，病毒学杂志65,3877(1991))rev基因或羊关节炎脑炎病毒(CAEV；Tiley等，病毒学杂志65,3877(1991))rev基因作为NEF。
但是，在本发明的意义内，也可以利用那些编码，当与rev蛋白只具有微小的，或没有同源性时，是与HIV-1rev蛋白功能相似的蛋白质的基因。
这些基因包括，例如，HTLV-1rev基因(Cullen，Microbiol.Rev.56,375(1992))和马感染的贫血症病毒(EIAV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)(Manusco等，病毒学杂志68,1988(1994))的rev基因。
在可替代的实施方案中，NEFs也可以是编码甚至不需要通过NRS保留于核中的RNA而实现将RNA分泌出核的蛋白质的核苷酸序列。这些蛋白质包括，例如，转录因子蛋白TFIIIA(Gaddat等，细胞60,619(1990)；Drew等，基因159,215(1995))或异源的核核糖核蛋白A1(hnRNPA1蛋白；Pinol-Roma等，自然335,730(1992))。
在广义上，核运输蛋白也可以包括热休克蛋白70(hsp70；Mandell等，J.Cell Biol.111,1775(1990))或蛋白激酶抑制剂CPKI(Fantozzi等，J.Biol.Chem.269,2676(1994)；Wen等，J.Biol.Chem.269,32214(1994))。
NEF和它的同源和类似蛋白共同具有的特征是存在将单体蛋白与NRS RNA结合的定位于更接近氨基末端的区(J.Virol.64,881(1990)；Kjems等，EMBOJ.11,119(1992))和通常有丰富的亮氨酸(hnRnPA1除外)并是NEF运输功能必需的区(Wen等，细胞82,463(1995)；Fischer等，细胞82,475(1995)；Malim等，病毒学杂志65,4248(1991)；Venkatesh等，病毒学178,327(1990))。
在本发明的意义内，NEF基因的表达是在定位于NEF基因的5’末端(参见图2和7，和已经叙述在上面的)或药物学上可控制的启动子单位(参见图8和9)的5’末端的上游的启动子序列(成份b))的控制下的。
5)内部核糖体入口位点(IRES)
内部核糖体入口位点使表达两个通过IRES彼此连接(“相互连接”)的DNA序列成为可能。
例如Montford和Smith TIG11,179(1995)；Kaufman等，核酸研究19,4485(1991)；Morgan等，核酸研究20,1293(1992)；Dirks等，基因128,247(1993)；Pelletier和Sonenberg，自然334,320(1988)和Sugitomo等，生物技术12,694(1994)叙述过这一特性的IRES。
所以，例如可以利用脊髓灰质炎病毒IRES序列的cDNA(5’UTR的位置≤140-≥630(Pelletier和Sonenberg，自然334,320(1988))将成份c)的DNA与成份d)的DNA连接。
6)结构基因
在本发明的意义内，结构基因[成份c)]编码预防和/或治疗疾病的活性化合物。针对疾病治疗的特性和考虑将要转导的靶细胞选择结构基因和启动子序列。
例如，下面选择的启动子序列(实施例，参见部分3)和结构基因的组合与下面的疾病有关：
a)肿瘤的治疗
-靶细胞：
·增殖的内皮细胞，或
·与内皮细胞邻接的基质细胞和肌肉细胞，或
·肿瘤细胞或白血病细胞
-启动子：
·特异于内皮细胞和特异于细胞周期，或
·非特异于细胞或特异于肌肉细胞和特异于细胞周期，或
·特异于肿瘤细胞(固态肿瘤和白血病)
-编码细胞增殖的抑制剂，例如
·成视网膜细胞瘤蛋白(pKb＝p110)或相关的p107和p130蛋白
·p53蛋白
·p21(WWAF-1)蛋白
·p16蛋白
·其它cdk抑制剂
·GADD45蛋白
·bak蛋白
·被磷酸化失活的成视网膜细胞瘤蛋白(pRb/p110)和相关的p107和p130蛋白的结构基因。
优选的是利用那些编码这些细胞周期抑制剂的基因，这些抑制性显示没有因此损害这些蛋白的功能的表达蛋白的失活位点的突变。这些突变的例子已经叙述在p110的情况中。
p107蛋白或p130蛋白的DNA序列以类似的方式突变。
·在细胞中，通过结合特殊的蛋白如MDM2或通过去磷酸化的C末端的丝氨酸392使p53寡聚化失活p53蛋白。所以，优选的是利用编码p53蛋白的DNA序列，该蛋白已经通过去除C末端的丝氨酸392被截短。
-诱导凝血的因子和血管生成抑制剂，例如
·纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)
·PAI-2
·PAI-3
·angiostatin
·干扰素，特别是
*IFNα
*IFNβ
*IFNγ
*血小板因子4
*IL-12
*TIMP-1
*TIMP-2
*TIMP-3
*白血病抑制因子(LIF)
*组织因子(TF)和它的凝血活性片段的结构基因
-编码抑制细胞生长的和有细胞毒性的蛋白，例如
·穿孔素
·粒酶
·IL-2
·IL-4
·IL-12
·干扰素，如
*IFNα
*IFNβ
*IFNγ
·TNF，特别是
*TNFα
*TNFβ
·制瘤素M
·鞘磷脂酶
·爪蟾抗菌肽和爪蟾抗菌肽衍生物的结构基因
-编码抑制细胞生长或有细胞毒性的抗体和结合抗原的抗体片段和抑制细胞生长的，有细胞毒性的或诱导炎症的蛋白或酶之间的融合蛋白的结构基因
·例如Burrows等(药物治疗64,155(1994))，Hughes等，(癌症研究49,6214(1989))和Maruyama等，(PNAS USA87,5744(1990))所述，抑制细胞生长的或有细胞毒性的抗体包括针对于内皮细胞膜结构的那些。这些抗体特别包括抗VEGF受体的抗体。
·这些抗体进一步包括抗肿瘤细胞的膜结构的抑制细胞生长的或有细胞毒性的抗体。例如Sedlacek等，Contrib.to Oncol.32，KargerVerlag，Munich(1988)和Contrib.to Oncol.43，Karger Verlag，Munich(1992)总结了这一特性的抗体。其它例子是抗下列物质的抗体：
*  唾液酸Lewis
*  T细胞识别的肿瘤上的肽
*癌基因表达的蛋白质
*神经节苷脂如GD3，GD2，GM2，9-0-乙酰基GD3，岩藻糖GM1
*血液基团抗原和它们的前体
*多型核上皮粘蛋白上的抗原
*热休克蛋白上的抗原
·这些抗体进一步包括针对于白血病细胞的膜结构的抗体。已经有叙述大量的这一特性的单克隆抗体用于诊断和治疗方法(Kristensen，丹麦医学手册41,52(1994)；Schranz，Therapia Hungarica 38,3(1990)；Drexler等，Leuk.Res.10,279(1986)；Naeim，Dis.Markers 7,1(1989)；Stickney等，Curr.Opin.Oncol.4,847(1992)；Drexler等，Blut57,327(1988)；Freedman等，癌症研究9,69(1991))。依据白血病的类型，例如下面的单克隆抗体，或它们的结合抗原的抗体片段适于用作配体：
细胞 膜抗原 描述的单克隆抗体
AML CD13 Kaneko et al.，Leuk.Lymph.14,219(1994)
CD14 Ball骨髓移植3，387(1988)
CD15  Campos et al.，Eur.J.Cancer28，37(1992)
CD33 Jurcic et al.，白血病9，244(1995)
CAMAL Shellard et al.，Exp.Hematol.19，136(1991)
Sialosyl-Le Muroietal.，血液79，713(1992)
B-CLL CD5 Tassone et al.，Immunol.Lett.39，137(1994)
CD1cCD23 Orazi et al.，Eur.J.Haematol.47，28(1991)
膜免疫球蛋白的个体基因型和同种型 Schroeder et al.，今日免疫学15，289(1994)
T-CLL CD33M38 Imai et al.，免疫学杂志151，6470(1993)
IL-2-受体T细胞受体 Waldmann et al.，血液学82，1701(1993)
ALL  CALLA Morishima et al.，骨髓移植11，255(1993)
CD19 Anderson et al.，血液学80，84(1993)
非霍奇金淋巴瘤 Okazaki et al.，血液学80，84(1993)
以类似于制备重组Fv片段(参见部分2)已经叙述的方法进行鼠抗体的人源化，和编码Fab和重组Fv片段的基因的制备和最佳化。根据技术人员已知的目前工艺水平将重组FV片段与编码抑制细胞生长的，有细胞毒性的或诱导炎症的蛋白或酶的基因融合。
-编码在结合靶细胞的配体和抑制细胞生长和有细胞毒性的蛋白之间的融合蛋白的结构基因。
·这些包括结合内皮细胞上的膜结构或膜受体的所有物质。例如，它们包括结合内皮细胞表达的受体如PDGF，bFGF，VEGF和TGFβ的IL-1或生长因子，或它们的片段或其部分的序列(Pusztain等，J.Pathol.169,191(1993))。
·它们进一步包括结合激活的和/或增殖的内皮细胞的粘连分子。这一特性的粘连分子如Slex，LFA-1，MAC-1，LECAM-1，VLA-4或玻璃体结合蛋白已有叙述(Augustin-Voss等，细胞生物学杂志119,483(1992)，Pauli等，Cancer Metast.Rev.9,175(1990)，Honn等，CancerMetast.Rev.11,353(1992)和Varner等，Cell Adh.Commun.3,367(1995)中的综述)。
·它们进一步包括结合肿瘤细胞或白血病细胞的膜结构或膜受体的物质。例如它们包括结合白血病细胞或肿瘤细胞表达的受体的生长因子或它们的片段或其部分的序列。
这一特性的生长因子已有叙述(Cross等，细胞64,271(1991)，Aulitzky等，药物48,667(1994)，Moore，癌症临床研究1，3(1995)和Van Kooten等，Leuk.Lymph.12,27(1993)中的综述)。
·根据利用技术人员已知的方法的目前工艺水平将结合靶细胞的这些配体的基因与抑制细胞生长的，有细胞毒性的或诱导炎症的蛋白或酶的基因融合。
-编码炎症的诱导物，例如
·RANTES(MCP-2)
·单细胞趋药性的和活化因子(MCAF)
·IL-8
·巨噬细胞炎症蛋白-1(MIP-1α，-β)
·嗜中性白细胞活化蛋白-2(NAP-2)
·IL-3
·IL-5
·人白血病抑制因子(LIF)
·IL-7
·IL-11
·IL-13
·GM-CSF
·G-CSF
·M-CSF
·眼镜蛇毒液因子(CVF)，或CVF的部分序列，它们功能上对应于人补体因子C3b，即能结合补体因子B并且在因子D切割后构成C3转化酶。
·人补体因子C3或它的部分序列C3b。
·在功能上和结构上与CVF相似的人补体因子C3的切割产物。
·激活补体或引发炎症的细菌蛋白如鼠伤寒沙门氏菌外膜蛋白，金黄色葡萄球菌凝集因子，调节素，特别是革兰氏阴性细菌，军团菌或B型流感嗜血菌或克雷伯氏菌的主要的外膜蛋白或G组链球菌的M分子的结构基因。
-编码活化抑制细胞生长的试剂的前体的酶如裂解无活性的前体物质(前药物)从而形成有活性的抑制细胞生长试剂(药物)的酶的结构基因。
Deonarain等(Br.J.Cancer 70,786(1994))，Mullen(药物治疗63,199(1994))和Harris等(基因治疗1,170(1994))已经总结了这一特性的物质和在每种情况下接纳的前药物和药物。例如，将用到下面的酶中的一个的DNA序列：
·单纯疱疹病毒胸苷激酶
·水痘带状疱疹病毒胸苷激酶
·细菌硝基还原酶
·细菌β-葡糖苷酸酶
·来自Secale谷物的植物β-葡糖苷酸酶
·人β-葡糖苷酸酶
·人羧肽酶(CB)，例如
乳腺细胞CB-A
*胰腺CB-B
*细菌β-内酰胺酶
*细菌羧肽酶
*细菌胞嘧啶脱氨酶
*人触酶或过氧化物酶
*磷酸酶，特别是
*人碱性磷酸酶
*人酸性前列腺磷酸酶
*5型酸性磷酸酶
*氧化酶，特别是
*人赖氨酰氧化酶
*人酸性D-氨基氧化酶
·过氧化物酶，特别是
*人谷胱甘肽过氧化物酶
*人嗜曙红细胞过氧化物酶
*人甲状腺过氧化物酶
·β-半乳糖苷酶
b)自身免疫疾病和炎症的治疗
-靶细胞：
·增殖的内皮细胞，或
·巨噬细胞和/或淋巴细胞，或
·滑膜细胞
-启动子：
·特异于内皮细胞和特异于细胞周期的，或
·特异于巨噬细胞和/或特异于淋巴细胞和/或特异于细胞周期的
·特异于滑膜细胞和/或特异于细胞周期的
-用于治疗变态反应，例如
·IFN-β
·IFN-γ
·IL-10
·抗IL-4的抗体或抗体片段
·可溶的IL-4受体
·IL-12
·TGFβ的结构基因
-用于防止移植的器官的排斥性如，
·IL-10
·TGFβ
·可溶的IL-1受体
·可溶的IL-2受体
·IL-1受体拮抗物
·可溶的IL-6受体
·通过例如根据Marasco等叙述的方法制备的接头连接的免疫阻遏抗体或它们的含VH和VL的片段或它们的VH和VL片段(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,7889(1993))的结构基因。免疫抑制抗体的例子是
*特异于T细胞受体或它的CD3复合物
*抗CD4或CD8的抗体，和另外
*抗IL-2受体，IL-1受体或IL-4受体，或
*抗粘连分子CD2，LFA-1，CD28或CD40的抗体。
-用于治疗抗体介导的自身免疫疾病，如
·TFGβ
·IFN-α
·IFN-β
·IFN-γ
·IL-12
·可溶的IL-4受体
·可溶的IL-6受体
·免疫抑制抗体或它们的含VH和VL的片段的结构基因
-用于细胞介导的自身免疫疾病的治疗如
·IL-6
·IL-9
·IL-10
·IL-13
·TNFα
·IL-4
·TNFβ
·免疫抑制抗体或它含VH和VL的片段的结构基因
-编码细胞增殖的抑制剂，抑制细胞生长或有细胞毒性的蛋白质和用于激活抑制细胞生长的试剂的前体的酶的结构基因。
编码这一特性的蛋白质的基因的实例已经引入题目为“治疗肿瘤的结构基因”的章节中。
在本发明的意义内，在这点上可以以同样于已经叙述的形式利用那些结构基因，它们编码包括特异于靶细胞的抗体，或这些抗体的Fab片段或重组Fv片段，或其它配体的融合蛋白质，和上面提到的细胞因子，生长因子，受体，抑制细胞生长的或有细胞毒性的蛋白质和酶。
-用于治疗关节炎的结构基因
在本发明的意义内，选择它的表达蛋白直接或间接抑制例如关节的炎症，和/或促进关节的细胞外基质(软骨和结缔组织)重组的结构基因。
这些蛋白的例子是
·IL-1受体拮抗物(IL-1-RA)；IL-1-RA抑制IL-1α和IL-1β的结合
·可溶的IL-1受体；可溶的IL-1受体结合和激活IL-1
·IL-6；IL-6增强TIMP和超氧化物的分泌，并降低滑膜细胞和软骨细胞分泌IL-1和TNFα
·可溶的TNF受体；可溶的TNF受体结合和激活TNF。
·IL-4；IL-4抑制IL-1，TNFα和MMP的形成和分泌
·IL-10；IL-10抑制IL-1，TNFα和MMP的形成和分泌并且增强TIMP的分泌
·类胰岛素生长因子(IGF-1)；IGF-1刺激细胞外基质的合成
·TGFβ，特别是TGFβ1和TGFβ2；TGFβ刺激细胞外基质的合成
·超氧化物歧化酶
·TIMP(金属蛋白酶的组织抑制剂)，特别是
*TIMP-1
*TIMP-2
*TIMP-3
c)造血缺陷的治疗
-靶细胞：
·造血系统的增殖的，未成熟的细胞，或
·其定位邻接造血细胞的基质细胞
-启动子：
·特异于造血细胞和/或特异于细胞周期的
·非特异于细胞的
-用于治疗贫血症例如
·促红细胞生成素的结构基因
-用于治疗白细胞减少例如
·G-CSF
·GM-CSF的结构基因
-治疗血小板减少例如
·IL-3
·白血病抑制因子(LIF)
·IL-11
·血小板生成素的结构基因
d)神经系统损坏的治疗
-靶细胞：
·神经胶质细胞，或
·增殖的内皮细胞
-启动子：
·特异于神经胶质细胞，或
·特异于内皮细胞和特异于细胞周期，或
·非特异和特异于细胞周期
-编码神经元生长因子，例如
·FGF
·神经生长因子(NGF)
·起源于脑的嗜神经组织因子(BDNF)
·嗜神经组织素-3(NT-3)
·嗜神经组织素-4(NT-4)
·睫状嗜神经组织因子(CNTF)的结构基因
-酶例如
·酪氨酸羟化酶
·多巴脱羧酶的结构基因
-编码抑制或中和TNFα的神经毒性效应的细胞因子和它们的抑制剂例如
·TGFβ
·可溶的TNF受体；
TNF受体中和TNFα
·IL-10；IL-10抑制IFNγ，TNFα，IL-2和IL-4的形成
·可溶性IL-1受体
·IL-1受体I
·IL-1受体II；
·可溶的IL-1受体中和IL-1的活性
·IL-1受体的拮抗物
·可溶的IL-6受体的结构基因
e)血液凝固系统和血液循环系统紊乱的治疗
-靶细胞：
·内皮细胞，或
·增殖的内皮细胞，或
·邻近内皮细胞和平滑肌细胞的体细胞，或
·巨噬细胞
-启动子：
·不特异于细胞的，或
·不特异于细胞和特异于细胞周期的，或
·特异于内皮细胞，平滑肌细胞或巨噬细胞，或
·特异于内皮细胞，平滑肌细胞或巨噬细胞和特异于细胞周期的
-用于抑制凝血或促进血纤维蛋白溶解例如
·组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)
·尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂(uPA)
·tPA和uPA的杂合物
·蛋白质C
·水蛭素
·丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpins)，如
*C-1S抑制剂
*α1-抗胰蛋白酶
*抗凝血酶素III
·组织因子途径抑制剂(TFPI)的结构基因
-促凝血例如
·FVIII
·FIX
·von Willebrand因子
·FXIII
·PAI-1
·PAI-2的结构基因
-编码血管生成因子例如
·VEGF
·FGF的结构基因
-用于降低血压例如
·激肽释放酶
·内皮细胞-氧化氮合成酶的结构基因
-在损害内皮层后抑制平滑肌细胞增殖例如
·抗增殖，抑制细胞生长或有细胞毒性的蛋白质，或如上面已经引证用于(在肿瘤)裂解抑制细胞生长剂前体，从而形成抑制细胞生长剂的酶，和这些活性化合物以及特异于肌肉细胞的抗体或抗体片段的融合蛋白的结构基因。
-编码其它血浆蛋白例如
·清蛋白
·C1失活剂
·血清胆碱酯酶
·转铁蛋白
·α1-抗胰蛋白酶的结构基因
f)代谢疾病和遗传疾病的治疗
-靶细胞：
·内皮细胞
·肌肉细胞
·肝细胞
·支气管上皮细胞
·基质细胞，或
·巨噬细胞
-启动子：
·特异于非靶细胞，或
·特异于靶细胞
-编码例如
·与胆囊纤维变性相关的跨膜传导调节物(CFTCR)
·Faneoni’s贫血症的基因
·尿卟啉原III合成酶
·艾杜糖醛酸2-硫化酶(II型粘多糖病)
·β-葡糖苷酸酶(粘多糖病VIII)
·葡糖脑苷脂酶(Gaucher’s病)
·苯丙氨酸羟化酶
·营养不良症(Duchenne型肌肉营养不良)
·胰岛素受体
·人生长激素
·与表面活性剂SP-A和SP-B相关的蛋白质
·LDL受体
·编辑家族性载脂蛋白B mRNA的蛋白质
·腺苷脱氨酶的结构基因
g)接种
-靶细胞：
·肌肉细胞，或
·巨噬细胞
-启动子：
·特异于非靶细胞，或
·特异于靶细胞，或
·特异于靶细胞和特异于细胞周期
-用于感染疾病的预防的结构基因
制备有效的疫苗的可能性通常是受限制的(Brown，Int.J.Technol.Assessm.Health Care10，161(1994)，Ellis，Adv.Exp.Med.Biol.327，263(1992)，Arnon等，FASEBJ.6,3265(1992))。
结果是开发了DNA疫苗的技术。但是，这些DNA疫苗存在有关加强它们的效力的问题(Fynan等，Int.J.Immunopharm.17,79(1995)；Donnelly等，Immunol.2,20(1994))。
根据本发明，自我增强表达系统增强DNA疫苗的效力。
被选择作为活性物质的DNA是编码由感染试剂形成的蛋白质的DNA，并且所述蛋白质通过引发免疫反应，即通过抗体结合和/或通过有细胞毒性的T淋巴细胞，导致该试剂的中和和/或分解。所谓这一特性的中和抗原已经用作接种抗原(参见Ellis，Adv.Exp.Med.Biol.327，263(1992)的综述)。下面的研究提供了编码中和抗原的DNA序列的实例：
·流行性感冒A病毒抗原(Ulmer等，科学259,1745(1993)，Robinson等，疫苗11,957(1993)，Fynan等，Int.J.Immunopharmac.17,79(1995))
·HIV抗原(Wang等，PNAS USA90,4156(1993))
·狂犬病病毒抗原(Donnelly等，Immunol.2/1,20(1994))
·HSV(单纯疱疹病毒)抗原(Fleckenstein等，自然274,57(1978))
·RSV(呼吸合胞体病毒)抗原(Du等，生物/技术12,813(1994)，Hall，科学265,1393(1993))
·副流行性感冒病毒抗原(Du等，生物/技术12,813(1994))
·轮状病毒抗原(Albert等，J.Clin.Microbiol.25,183(1987)，Anderson等，J.Infect.Dis.153,823(1986)，Battaglia等，J.Infect.Dis.155,140(1987)，Chanock等，J.Infct.Dis.148,49(1983)，Dyall-Smith等，病毒学杂志38,1099(1981)，Glass等，科学265,1389(1994))
·VZV(水痘带状病毒)抗原(Straus等，Ann.Intern.Med.109,438(1988)，Gershon.Pediatr.Infect.Dis.2,171(1991)，Kinchington等，J.Virol.64,4540(1990))
·CMV(细胞肥大病毒)抗原(Plotkin，科学265,1383(1994))
·麻疹病毒抗原(Katz和Kellin，科学265,1391(1994))
·HPV(人乳头状瘤病毒)抗原(Tindl和Frazer，Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.186,217(1994))
·HBV(乙型肝炎病毒)抗原(Valenzuela等，自然280,815(1979)，Heerman等，病毒学杂志52,396(1984))
·HCV(丙型肝炎病毒)抗原(Cerny等，Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.189,169(1994)，Esteban等，Progr，Liver Dis.10，253(1992)，Jung等，Eur.J.Clin.Invest.24,641(1994))
·HDV(丁型肝炎病毒)抗原(Iwarson，Scand.J.Infect.Dis.24,129(1992)，Consolo等，Nephron.61，251(1992))
·HEV(戊型肝炎病毒)抗原(Iwarson，Scand.J.Infect.Dis.24,129(1992)，Consolo等，Nephron.61,251(1992))
·HAV(甲型肝炎病毒)抗原(d’Hondt，疫苗10,48(1992)，Andre，J.Infect.Dis.171,33(1995)，Lemon等，疫苗10,40(1992)，Melnick等，疫苗10,24(1992)，Flehmig，BaillieresClin.Gastroenterol.4,707(1990))
·霍乱弧菌抗原(Levine和Kaper，疫苗11,207(1993))
·包柔氏螺旋体菌burgdorferi抗原(Schaible等，Immunol.Letters36,219(1993).Wallich等，Lab.Med.17,669(1993))
·幽门螺旋菌抗原(Crabtree等，Lancet338,332(1991)，Blaser，J.Infect.Dis.161.626(1990)，Cover和Blaser，J.Biol.Chem.267,10570(1993)，Cover等，Infect.Immunol.58，603(1990)，Dunn等，J.Biol.Chem.265,9464(1990)，Dunn等，Infect.Immunnol.60,1946(1992)，Lage等，Acta Gastroenterol.Belg.56(suppl.)，61(1993)，Mobley等，Scand.J.Gastroint.26(suppl.187)，39(1991))
·疟疾抗原(Nussenzweig和Long，科学265,1381(1994)，Maurice，科学267,320(1995)，Enders等，疫苗10,920(1992)，Knapp等，Infect.Imm.60,2397(1992))。
但是，在本发明的意义内，这一特性的活性物质也包括抗个体基因型抗体，或它的抗原结合片段的DNA，它的抗原结合结构(互补决定区)构成感染剂的中和抗原的蛋白质结构或碳水化合物结构的拷贝。
特别是，这一特性的抗个体基因型抗体可以替代细菌感染剂中的碳水化合物抗原。
Hawkins等(免疫治疗杂志14,273(1993))和Westerink和Apicella(Springer Seminars in Immunopathol.15,227(1993))已经综述了这一特性的抗个体基因型抗体和它们的裂解产物。
-编码“肿瘤疫苗”的结构基因；这些包括肿瘤细胞上的抗原。例如Sedlacek等，Contrib.to Oncol.32，Karger Verlag，Munich(1988)和Contrib.to Oncol43，Karger Verlag，Munich(1992)已经综述了这一特性的抗原。
其它实例由下面的抗原或对应于下面的抗原的抗个体基因型抗体的基因构成：
·唾液酸Lewis
·T细胞识别的肿瘤上的肽
·癌基因表达的蛋白质
·血液基团抗原和它们的前体
·多型核上皮粘蛋白和其它与肿瘤相关的粘蛋白上的抗原
·热休克蛋白上的抗原
·神经节苷脂
h)慢性感染疾病的治疗
-靶细胞：
·肝细胞
·淋巴细胞和/或巨噬细胞
·上皮细胞
·内皮细胞
-启动子：
·特异于病毒的
·特异于细胞的
·特异于病毒或特异于细胞和特异于细胞周期-编码例如
·显示抑制细胞生长的或有细胞毒性效应的蛋白质(有细胞毒性或抑制细胞生长的蛋白质的例子已经引入题目为肿瘤治疗的章节)
·切割抗病毒或有细胞毒性的物质的前体从而形成活化物质的酶(在这点上，参见题目为肿瘤治疗的章节)的结构基因。-编码抗病毒蛋白的结构基因
·具有抗病毒活性的细胞因子和生长因子，这些的例子是
*IFN-α
*IFN-β
*IFN-γ
*TNFβ
*TNFα
*IL-1
*TGFβ
·具有失活通过接头连接的相关病毒或它的含VH和VL的片段，或它的VH和VL片段的特异性的抗体，它的片段可以如章节2)所述制备。
抗病毒抗原的抗体的例子是：
*抗-HBV
*抗-HCV
*抗-HSV
*抗-HPV
*抗-HIV
*抗-EBV
*抗-HTLV
*抗-Coxsackie病毒
*抗-汉坦病毒
rev结合蛋白。这些蛋白结合rev RNA和在逆转录病毒基因表达中抑制依赖rev的转录后步骤。结合rev蛋白的例子有：
*RBP9-27
*RRP1-8U
*RBP1-8D
*RBP1-8的假基因
消化细胞周期控制蛋白的基因的mRNA或病毒的mRNA的核酶。例如Christoffer-sen等，J.Med.Chem.38,2033(1995)已经总结了催化HIV的核酶。
-抗细菌蛋白的结构基因
抗细菌蛋白的实例有中和细菌毒素或调理细菌的抗体。这些抗体的例子有抗
·C或B脑膜炎球菌
·大肠杆菌
·包柔氏螺旋菌
·假单胞菌
·幽门螺旋菌
·金黄色葡萄球菌的抗体
7)相同或不同的结构基因的组合
本发明进一步涉及自我增强的，适当的药物学上可控制的表达系统，其中组合了两个相同或两个不同的结构基因[成份c)和c’)]的DNA序列。为了表达这两个DNA序列的目的，优选地将内部核糖体入口位点(IRES)的cDNA作为调节元件插入两个结构基因之间。
章节C5)已经叙述了这一特性的IRES序列的实例。
在本发明的意义内，下面是用于
-肿瘤治疗
·不同的抗增殖，抑制细胞生长，有细胞毒性，诱导炎症的蛋白，或
·裂解抑制细胞生长剂的前体的相同的酶
-自身免疫疾病的治疗
·具有抑制细胞和/或肿瘤的免疫反应的协同效应的不同的细胞因子或受体，或
·不同或相同的TIMP
-造血缺陷的治疗
·不同的，成等级地相邻的细胞因子，如IL-1，IL-3，IL-6或GM-CSF和成红细胞生成素，G-CSF或血小板生成素
-神经细胞损坏的治疗
·神经元生长因子和细胞因子或细胞因子的抑制剂
-血液凝固系统和血液循环系统的紊乱的治疗
·抗血栓形成剂和纤维蛋白溶解剂(tPA或uPA)，或
·抗增殖，抑制细胞生长或有细胞毒性的蛋白质(或酶)和抗血栓形成剂或纤维蛋白溶解剂
-接种
·抗原和刺激免疫的细胞因子，如
*IL-1α
*IL-1β
*IL-2
*GM-CSF
*IL-3，或
*IL-4受体
·不同抗原
*一种感染剂或不同感染剂的，或
*一种肿瘤类型或不同肿瘤类型的
-病毒感染性疾病的治疗
·抗病毒蛋白和抑制细胞生长或有细胞毒性的蛋白质
·抗一种病毒或几种病毒的不同表面抗原的抗体
-细菌感染性疾病的治疗
·抗有机体的不同表面抗原和/或毒素的抗体
的结构基因的优选组合的例子
8)信号序列和跨膜区的插入
-为了促进结构基因的表达产物的分泌，可以用改善细胞外分泌的异源信号序列替代可能存在于结构基因的DNA序列中的同源信号序列。
所以，例如，可以插入免疫球蛋白的信号序列(DNA位置≤63-≥107；Riechmann等，自然332,323(1988))或CEA的信号序列(DNA位置≤33-≥134；Schrewe等，Mol.Cell Biol.10,2738(1990)；；Berling等，癌症研究50,6534(1990))或人呼吸合胞体病毒糖蛋白的信号序列(氨基酸≤38-≥50或48-65的cDNA；Lichtenstein等，J.Gen.Virol.77,109(1996))。
-可替代地，或另外，为了在形成活化化合物的转导细胞的细胞膜中固定活化化合物可以在信号序列中插入跨膜区的序列。
所以，例如，可以在启动子序列和结构基因的序列之间插入刺激人巨噬细胞集落的因子的跨膜序列(DNA位置≤1485-≥1554；Cosman等，Behring Inst.Mitt.83,15(1988))或人呼吸合胞体病毒(RSV)糖蛋白G(氨基酸1-63或它们的部分序列，氨基酸38-63；Vijaya等，Mol.Cell Biol.8,1709(1988)；Lichtenstein等，J.Gen.Virol.77,109(1996))，或流行性感冒病毒神经氨酸酶的信号和跨膜区的DNA序列(氨基酸7-35或部分序列氨基酸7-27；Brown等，病毒学杂志62，3824(1988))。
-为了增强转译，例如可以在启动子序列的3’末端和紧接信号序列或跨膜序列的起始信号(ATG)的5’末端插入核苷酸序列GCCACC或GCCGCC(Kozak，细胞生物学杂志108,209(1989))。
-但是，为了在正在形成活性化合物的转导细胞的细胞膜中固定活化化合物也可以插入糖磷脂的锚状物的核苷酸序列。
在结构基因的核苷酸序列的3’末端插入糖磷脂的锚状物，而这一插入是除了信号序列的插入外可能产生的插入。
例如对于CEA(DNA位置≤893-≥1079；Berling等，癌症研究50,6534(1990))，对于N-CAM(Cunningham等，科学236,799(1987))和对于其它膜蛋白如Thy-1(Clissold，Biochem.J.281,129(1992))或CD16(Selvaray等，自然333,565(1988))已经叙述了糖磷脂的锚状物。
Ferguson等(Ann.Rev.Biochem.57,285(1988))已经发表了固定糖磷脂的膜蛋白的综述。
-根据本发明，在细胞膜上固定活性化合物的另一个选择是利用配体/活性化合物的融合蛋白的DNA序列。这一融合蛋白的配体的特异性针对于选定的靶细胞的细胞膜上的膜结构。
结合细胞表面的配体的例子有抗例如；
·内皮细胞的表面的结构的抗体或抗体片段，特别是包括抗VEGF受体的，
·或肌细胞的表面的结构的抗体或抗体片段，例如
*抗肌动蛋白的抗体，或
*抗血管紧张素II受体的抗体，或
*抗生长因子的受体，如抗
◆EGF受体
◆或PDGF受体
◆或FGF受体
◆或抗内皮素A受体的抗体。
鼠单克隆抗体优选地以人源化形式使用。如上所述制备了Fab片段和重组Fv片段和它们的融合产物。
配体进一步包括所有结合特定选定细胞上的膜结构或膜受体的活性化合物如细胞因子或粘连分子，生长因子，或它们的片段或其部分序列或介导体。这些配体的例子有内皮细胞的配体，如IL-1，PDGF，bFGF，VEGF，TGGβ(Pusztain等，病理学杂志169,191(1993))或细胞分裂素，和细胞分裂素的衍生物或类似物。配体进一步包括粘连分子。对于内皮细胞已经叙述了这一特性的粘连分子如Slex，LFA-1，MAC-1，LeCAM-1，VLA-4或玻璃体结合蛋白，和玻璃体结合蛋白的衍生物或类似物(Augustin-Voss等，细胞生物学杂志119,483(1992)；Pauli等，Cancer Metast.Rev.9,175(1990)；Honn等，CancerMetast.Rev.11,353(1992)；Varner等，Cell Adh.Commun.3,367(1995)中的综述)。
配体也包括抗肿瘤细胞膜上的特异于肿瘤或相关于肿瘤的抗原的抗体或它们的片段。在部分C6a)中已经叙述了这一特性的抗体。
本发明还涉及包含新核酸构建体和具有成份f)的蛋白质A和成份h)的蛋白质B的结合位点的偶联物质j)的组合物。偶联物质j)优选地是药物组合物，特别是能渗透过细胞膜并进入细胞的物质，特别是纳巴霉素，FK506，环孢菌素A，甲氨喋呤，叶酸，视黄酸，青霉素，4-羟基他莫昔芬，他莫昔芬或四环素或四环素/异丙基-β-D-硫代半乳糖苷结合物。
本发明还涉及含有新核酸构建体的细胞，特别是酵母细胞或哺乳动物细胞并涉及制备新核酸构建体的方法，其中单个成份相互连接。
本发明也涉及为了预防和/或治疗肿瘤，白血病，自身免疫疾病，炎症，神经系统损坏，血液凝固系统和血液循环系统紊乱，代谢疾病，遗传损坏，病毒或细菌感染疾病和/或造血缺陷和/或为了抗病毒，细菌或寄生感染和/或抗肿瘤的接种，利用新的核酸构建体制备用于局部的如，经皮的，鼻的，口服的，肠胃的，支气管内的，膀胱内的，阴道内的，子宫内的，皮下的，肌肉内的，皮内的，关节周的或关节内的给药的药物，用于进入脑脊髓液，进入脑，进入肝，进入肾，进入肠或进入舌的给药的药物，或用于腹膜内的，胸膜内的或全身的，如静脉内的，动脉内的，门静脉内的或心脏内的给药的药物，并涉及为了预防和/或治疗疾病，利用根据本发明的细胞制备用于局部或全身给药的药物。
附图的说明图1显示最简单形式的新核酸构建体的图。图2显示用编码核输出信号(NES)的基因和编码核输出因子(NEF)的基因补充后，图1所示的核酸构建体的图。图3显示通过IRES连接成份c)和成份d)的图。图4显示图1-3描述的单个成份反应的方案的图。图5显示用其它结构基因增大核酸构建体的图。图6显示用其它转录因子蛋白的基因增大核酸构建体的图。图7显示在用编码NES和NEF的基因补充后的图3中描述的核酸构
建体的图。图8显示最简单形式的药物可控制启动子单位的图。图9显示图8描述的单个成份反应的方案的图。图10显示自我增强，药物学上可控制的表达系统的图。图11显示用成份i)替代成份a)和b)和用IRES区以及用含有成份
e)，f)，g)和h)的药物学上可控制的启动子单位替代成份d)的图。图12显示用含有成份e)，f)，g)，h)和i)的药物学上可控制的启动子单位
替代成份b)的图。图13显示用于特异于细胞周期和特异于细胞的β-葡糖苷酸酶的表
达的自我增强的表达系统的图。图14和15显示两个不是自我增强的表达系统的图。图16显示用于特异于细胞周期和药物学上可控制的β-葡糖苷酸酶
的表达的自我增强，药物学上可控制的表达系统。
本发明借助于下面实施例进行详细的描述。
              实施例
      1.自我增强的表达系统的构建
为了以特异于细胞周期和特异于细胞的方式表达β-葡糖苷酸酶，根据图13描述的方案制备了自我增强的表达系统。
以5’-3’的方向将单个成份的DNA序列如下结合在一起：
-成份a)：
·结合Gal4蛋白的序列[核苷酸序列：5’-CGGACAACTGTTGACCG-3’](Chasman和Kornberg，Mol.CellBiol.10,2916(1990))
-成份b)：
·cdc25C基因的启动子序列[核酸：-290-+121；Lucibello等，EMBOJ.14,132(1995)；Zwicker等，核酸研究23,3822(1995)；EMBOJ.14,4514(1995))
-成份c)：
·序列GCCACC(Kodak，细胞生物学杂志108,229(1989))
·免疫球蛋白信号肽的cDNA[核苷酸序列≤63-≥107；Riechmann等，自然332,323(1988))
·人β-葡糖苷酸酶的cDNA[核苷酸序列≤93-≥1982；Oshima等，PNAS USA84,685(1987))
-成份a’)：
·结合Gal4蛋白的序列(Chasman和Kornberg，Mol.Cell Biol.10,2916(1990))
-成份b’)：
·VEGF的受体基因的启动子序列[核酸-1195-+≥110；Morishita等，J.Biol.Chem.270,27948(1995))
-成份d)：
·Gal4蛋白的DNA结合区[氨基酸1-147；Chasman和Kornberg，Mol.Cell Biol.10,2916(1990))的cDNA
·SV40核定位信号(NLS)(SV40大T：氨基酸126-132：PKKKRKV；Dingwall等，TIBS16,478(1991))的cDNA
·HSV-1VP16酸反式激活区(TAD)(氨基酸406-488；Triezenberg等，基因发展2,718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5,190(1995))的cDNA
通过在PCR扩增过程中伴随着导入在不同元件的末端的适当限制位点将构建体单个成份连接起来。利用技术人员已知的特异于限制位点的酶和DNA连接酶将这些成份连接起来。这些酶可以从市场购买。
利用技术人员已知的方法用所述的质粒转染保持在培养物中的人脐带内皮细胞和成纤维细胞(Wi-38)(Lucibello等，EMBO J.14,132(1995))并且利用4-甲基lumbelliferyl-β-葡糖苷酸作为底物测量内皮细胞产生的β-葡糖苷酸酶的量。
为了检查细胞周期特异性，通过除去甲硫氨酸使内皮细胞以G0/G1同步48小时。在用Hoeehst 33258(Hoeehst AG，Frankfurt)染色后，在荧光活化细胞分析器中确定细胞中DNA的含量(Lucibello等，EMBOJ.14,132(1995))。
得到下面的结果：
与未转染的成纤维细胞相比在转染的成纤维细胞中不可能检测到任何β-葡糖苷酸酶的增加。
转染的内皮细胞明显地比未转染的内皮细胞表达更多的β-葡糖苷酸酶。
增殖的内皮细胞(DNA＞2S)明显地比以G0/G1同步的内皮细胞(DNA＝2S)分泌更多的β-葡糖苷酸酶。
结果是，已经叙述的自我增强的表达系统导致结构基因β-葡糖苷酸酶的特异于细胞的，依赖于细胞周期的表达。
现在将新的自我增强的表达系统的表达强度和两个不是自我增强的表达系统的表达强度进行比较。这些后面的系统是根据图14和15描述的方案制备的。
在这种情况中，如图13描述的方案已经叙述的，成份b)，b’)和c)的组成是相同的。
构建体的这些各个成份通过在PCR扩增过程中伴随着导入不同元件的末端的适当的限制位点连接起来。利用技术人员已知的特异于限制位点的酶和DNA连接酶将这些成份连接起来。这些酶可以从市场购买。
将以这种方式制备的核苷酸构建体克隆进pUC18/19或起源于Bluescript的质粒载体。
利用技术人员已知的方法用所述的质粒转染保持在培养物中的人脐带内皮细胞(Lucibello等，EMBO J.14,132(1995))并且利用4-甲基lumbelliferyl-β-葡糖苷酸作为底物测量内皮细胞产生的β-葡糖苷酸酶的量。
得到下面的结果：
用含有图14和15描述的核酸构建体的质粒转染的增殖的内皮细胞明显地比用含有图13描述的新核酸构建体的质粒转染的增殖的内皮细胞表达更少的β-葡糖苷酸酶。
已经叙述的自我增强的表达系统对结构基因β-葡糖苷酸酶的表达明显增强。
2.构建自我增强的，药物学上可控制的表达系统
如图16描述，制备了对应于图11的图显示的结构的自我增强的，药物学上可控制的表达系统用于特异于细胞周期和药物学上可控制的β-葡糖苷酸酶的表达。
以5’-3’的方向如下将单个成份的DNA序列连接起来：
-成份i)：
·结合Gal4蛋白的序列[核苷酸序列：5’-CGGACAACTGTTGACCG-3’](Chasman和Kornberg，Mol.CellBiol.10,2916(1990))
·SV40基本启动子[核苷酸48-5191；Tooze(ed.)，DNA肿瘤病毒(纽约冷泉港，纽约，冷泉港实验室)]
-成份c)：
·序列GCCACC(Kodak，细胞生物学杂志108,229(1989))
·免疫球蛋白信号肽的cDNA[核苷酸序列≤63-≥107；Riechmann等，自然332,323(1988)]
·人β-葡糖苷酸酶的cDNA[核苷酸序列≤93-≥1982；Oshima等，PNAS USA84,685(1987)]
-成份e)：
·结合Gal蛋白的序列(Chasman和Kornberg，Mol.Cell Biol.10,2916(1990))
·cdc25C基因的启动子序列[核苷酸-290-+121；Lucibello等，EMBOJ.14,132(1995)；Zwicker等，核酸研究23,3822(1995)；EMBO J.14,4514(1995)]
-成份f)：
.疱疹病毒VP16活化区的cDNA(Greaves等，病毒学杂志64,2716(1990)；65,6705(1991))
·重组抗-环孢菌素A Fv(A)(蛋白质A)的cDNA
-成份g)：
·对应于成份e)
-成份h)：
·重组的抗环孢菌素A Fv(B)(蛋白质B)的cDNA
·Gal4蛋白的DNA-结合区[氨基酸1-147；Chasman和Kornberg，Mo1.Cell Biol.10,2916(1990)]的cDNA
·SV40核定位信号(NLS)[SV40大T；氨基酸126-132：PKKKRKV；Dingwall等，TIBS16,478(1991)]的cDNA
·HSV-1VP16酸反式激活区(TAD)[氨基酸406-488；Triezenberg等，基因发展2,718(1988)；Triezenberg，Curr.Opin.Gen.Developm.5,190(1995)]的cDNA。
如Cacalano等，分子免疫学29,107(1992)所述制备了抗环孢菌素A的抗体。为此，利用4-苯甲酰苯甲酸和UV光将环孢菌素A与牛血清白蛋白偶联。对Balb/c鼠皮下施用偶联产物几次。在最后免疫后14天分离脾细胞。利用mRNA提取试剂盒(来自Pharmacia，Freiburg)从这些细胞中提取mRNA。然后在cDNA合成试剂盒和随机的六低聚核苷酸(来自Pharmacia，Freiburg)的帮助下利用逆转录将该mRNA转录成cDNA。通过利用特异引物(Clackson等，自然，352,624(1991)；Sastry等，PNAS USA86,5728(1989)；Ward等，自然341,544(1989)；Orlandi等，PNAS USA86,3833(1989))的聚合酶链反应(Saiki等，科学230,1350(1985))将该cDNA作为起始物质用于扩增免疫球蛋白的可变的重链或可变的轻链。
为了将这些片段克隆进细菌表达载体pHENIS(起源于pHEN1；Hoogenboom等，核酸研究19,4133(1991)；参见图1))，在同时利用引物导入限制切割位点。这一载体含有用于周质分泌的pelB信号序列，用于检测单克隆抗体9E10的myc标记，用于通过固定金属亲和层析(IMAC)的纯化的组氨酸标记，以及重链和轻链的克隆区和编码14个氨基酸长度的甘氨酸-丝氨酸接头的短序列。为了在噬菌体表面显示的目的也进行与基因3蛋白质(g3P)的融合。用适当的限制酶消化重和轻链(用SfiI和ShoI对VH；用ApaLI和NotI对VL)并连续地克隆进载体。这产生了含有通过短肽序列共价地连接的可变重链和可变轻链的重组单链Fv片段。
依照抗体片段的噬菌体显示，将结合抗原区以scFv片段(McCafferty等，自然348,552(1990))的形式，作为与丝状噬菌体包衣蛋白g3P的融合蛋白克隆进噬菌粒载体(Breitling等，基因104,147(1994))。在负载环孢菌素A的塑料托盘(锅)上选择结合抗原的噬菌体(Marks等，J.Mol.Biol.222,581(1991))。
将结合环孢菌素A的噬菌体克隆并增殖，然后再一次在负载环孢菌素A的塑料托盘上选择。在选择4次后，选择两个相互不抑制的结合环孢菌素A的克隆(蛋白质A和B)。
通过用这一鼠重组Fv片段的对应区(Jones等，自然321,522(1987))替代人抗体中的超可变区将鼠重组Fv片段(蛋白质A和B)人源化。
通过在PCR扩增过程中在不同元件的末端导入适当的限制位点将构建体连接起来。利用特异于限制位点的酶和技术人员已知的DNA连接酶实现连接。这些酶可以从市场购买。
将以这种方式制备的核苷酸构建体克隆进起源于pUC18/19或起源于Bluescript的质粒载体。
利用技术人员已知的方法(Lucibello等，EMBOJ.14,132(1995))用所述的质粒转染保持在培养物中的人脐带内皮细胞并且利用4-甲基lumbelliferyl-β-葡糖苷酸作为底物测量有和没有添加环孢菌素A(0.01-1.0μg/ml的培养基)的内皮细胞产生的β-葡糖苷酸酶的量。
为了检查细胞周期特异性，通过除去甲硫氨酸将内皮细胞以G0/G1同步48小时。在用Hoechst 33258(Hoeehst AG，Frankfurt)染色后，在荧光活化细胞分析器中确定细胞中DNA的含量(Lucibello等，EMBOJ.14,132(1995))。
得到下面的结果：
在缺乏加入的环孢菌素A时，与未转染的内皮细胞相比，在转染的内皮细胞中不可能检测到β-葡糖苷酸酶的任何增加。
在加入环孢菌素A后，转染的内皮细胞明显地此未转染的内皮细胞表达更多的β-葡糖苷酸酶。
增殖的内皮细胞(DNA＞2S)明显地比以G0/G1同步的内皮细胞(DNA＝2S)分泌更多的β-葡糖苷酸酶。
已经叙述的自我增强的表达系统导致依赖于细胞周期的并通过加入环孢菌素A可控制的结构基因β-葡糖苷酸酶的表达。
根据图14描述的图通过新的，自我增强的，药物学上可控制的表达系统获得的表达强度比通过实施例1)制备的非自我增强的表达系统获得的表达强度大。

Claims (31)

1.核酸构建体，它含有至少一个编码活性化合物的第一个结构基因；至少一个编码转录因子蛋白的第二个结构基因；和至少一个由至少一个结合转录因子蛋白的序列和至少一个启动子序列组成的活化序列；其中每个活化序列激活结构基因的表达和转录因子蛋白的表达。
2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中一个活化序列连接于第一个结构基因的5’末端并且一个活化序列连接于转录因子蛋白基因的5’末端。
3.根据权利要求1或2所述的核酸构建体，含有两个相同的转录因子蛋白结合序列和两个不同的启动子。
4.根据权利要求1所述的核酸构建体，进一步包括内部核糖体入口位点，其中内部核糖体入口位点参与活化序列对转录因子蛋白的表达的激活。
5.根据权利要求1-4之一所述的核酸构建体，进一步包括：
附加于第一个结构基因上的核输出信号序列；第三个启动子；和核输出因子基因序列。
6.根据权利要求1-5之一所述的核酸构建体，其中至少两个结构基因由IRES序列或由活化序列相互连接。
7.根据权利要求1-6之一所述的核酸构建体，其中至少两个转录因子蛋白基因由IRES序列或活化序列相互连接。
8.根据权利要求7所述的核酸构建体，其中所述的转录因子蛋白基因是不同的，并且从所述基因的转录因子蛋白在核酸构建体中结合所述转录因子蛋白结合序列。
9.根据权利要求1-8所述的核酸构建体，进一步包括药物学上可控制单位，该单位依次包括：
至少一个启动子；
至少一个融合蛋白基因，该基因包括转录因子蛋白的活化区，和
结合偶联蛋白的序列；
至少一个启动子；
至少一个融合蛋白基因，其中融合蛋白包括DNA结合蛋白，和结合偶联物质的蛋白；
和至少一个包括DNA结合蛋白的位点的活化序列。
10.根据权利要求1-9任一项所述的核酸构建体，包括
至少一个编码活性化合物的第一个结构基因；
至少一个编码转录因子蛋白的第二个结构基因；和
至少一个由至少一个结合所述的转录因子蛋白的序列和至少一个依次包括至少一个启动子，至少一个编码转录因子蛋白的活化区和编码偶联物质蛋白的融合蛋白基因，至少一个启动子，至少一个编码DNA结合蛋白和编码第二个偶联物质蛋白的融合蛋白基因，和至少一个含有DNA结合蛋白位点的活化序列组成的活化序列，其中每个活化序列激活结构基因的表达和转录因子蛋白的表达。
11.根据权利要求1-10任一项所述的核酸构建体，包括至少一个编码活性化合物的第一个结构基因；至少一个编码至少一个第一个融合蛋白的第二个结构基因，该融合蛋白含有转录因子蛋白的活化区和结合偶联物质的序列；至少一个编码至少一个第二个融合蛋白的第三结构基因，该融合蛋白包括结合偶联物质的蛋白和DNA结合蛋白；至少一个由至少一个结合所述第二个融合蛋白的活化序列，该融合蛋白通过偶联物质与所述的第一个融合蛋白偶联，和至少一个启动子序列组成的活化序列；其中每个活化序列激活至少一个所述结构基因的表达。
12.根据权利要求1-11任一项所述的核酸构建体，其中所述的活化序列含有结合转录因子蛋白的序列，选自含有Gal4蛋白基因，LexA蛋白基因，LacI阻遏蛋白基因，四环素阻遏蛋白基因，和ZFHD-1蛋白基因的组的序列；选自含有与HSV-1VP16的反式激活区结合的基本c-fos启动子，与Oct-2活化区的序列结合的U2snRNA启动子和HSV TK启动子的组的启动子序列；和选自含有Gal4蛋白的DNA结合区，LexA蛋白的DNA结合区，LacI阻遏蛋白基因，四环素阻遏蛋白基因和ZFHD1蛋白基因的组的转录因子蛋白基因。
13.根据权利要求12所述的核酸构建体，其中所述的转录因子蛋白含有SV40核定位信号和HSV-1VP16酸反式激活区。
14.根据权利要求9-11任一项所述的核酸构建体，其中所述第一个融合蛋白编码序列选自含有疱疹病毒VP16反式激活区，NF-κB转录因子的p65亚基，和直接或间接地与Oct-2C末端脯氨酰胺丰富的Oct-2区连接的Oct-2N末端谷氨酰胺丰富区的组；
所述的第二个融合蛋白编码序列选自含有Gal4蛋白的DNA结合区，LexA蛋白的DNA结合区，LacI阻遏蛋白，四环素阻遏蛋白，ZFHD1蛋白的组；
所述的结合蛋白的活化序列选自含有Gal4蛋白，LexA蛋白，LacI阻遏蛋白，四环素阻遏蛋白和ZFHD1蛋白的组；和
其中结合蛋白质的活化序列与选自含有基本SV40启动子，与HSV-1VP16反式激活区结合的c-fos启动子，与HSV-1VP16反式激活区或至少一个Oct-2活化区的序列结合的U2snRNA启动子的组的启动子，和HSV TK启动子连接。
15.根据权利要求14所述的核酸构建体，进一步包括SV40核定位信号和HSV-1VP16酸反式激活区，其中SV40核定位信号和HSV-1VP16酸反式激活区存在于编码融合蛋白的基因中。
16.根据权利要求9-15之一所述的核酸构建体，其中至少一个融合蛋白含有抗体或抗体片段。
17.根据权利要求16所述的核酸构建体，其中所述的抗体片段含有具有可变链和轻链的单链Fv片段，其中可变和轻链与短肽序列共价地连接。
18.根据权利要求9-15之一所述的核酸构建体，其中至少一个融合蛋白含有天然存在的蛋白的结合区。
19.根据权利要求1-18之一所述的核酸构建体，其中至少一个启动子选自含有RNA聚合酶III，RNA聚合酶II，CMV启动子和增强子，SV40启动子，HBV启动子，HCV启动子，HSV启动子，HPV启动子，EBV启动子，HTLV启动子，HIV启动子，cdc25C启动子，细胞周期蛋白A启动子，cdc2启动子，bmyb启动子，DHFR启动子和E2F-1启动子的组。
20.根据权利要求5所述的核酸构建体，其中核输出信号和对应的核输出因子选自逆转录病毒的rev-反应元件/rev蛋白，该逆转录病毒选自含有HIV-1，HIV-2，HTLV-1和HBV的组。
21.根据权利要求1-20之一所述的核酸构建体，其中结构基因编码选自含有细胞增殖抑制剂，抑制细胞生长或有细胞毒性的蛋白，切割前药物的酶，抗体，抗体片段和其它蛋白质之间的融合蛋白，细胞因子，生长因子，激素，细胞因子和生长因子的受体，细胞因子拮抗物，炎症诱导物，诱导凝固的因子，凝固抑制剂，诱导血纤维蛋白溶解的蛋白，血管形成抑制剂，血管形成因子，超张力的肽，血浆蛋白，胰岛素受体，LDL受体，缺少时导致代谢疾病或免疫阻遏的酶，病毒抗原，细菌抗原，寄生抗原或肿瘤抗原，这些抗原的抗个体基因型抗体，和起源于这些的任何组合的融合蛋白的组的化合物。
22.根据权利要求9-21之一的核酸构建体，其中至少两个结构基因由IRES序列或活化序列相互连接。
23.含有根据权利要求1-22之一所述的核酸构建体的载体。
24.含有根据权利要求1-22之一所述的核酸构建体和药物学上可接受的载体的药物组合物。
25.根据权利要求24所述的药物组合物，进一步包括结合融合蛋白的偶联物质。
26.根据权利要求25所述的药物组合物，其中所述偶联物质渗透过细胞膜，进入细胞。
27.根据权利要求25所述的药物组合物，其中所述偶联物质选自含有纳巴霉素，FK506，环孢菌素A，氨甲喋呤，叶酸，视黄酸，青霉素，4-羟基他莫昔芬，他莫昔芬，四环素，和四环素/异丙基-β-D-硫代半乳糖苷结合物的组。
28.含有权利要求1-22之一所述的核酸构建体的细胞。
29.制备权利要求1-22之一所述的核酸构建体的方法，包括：
将结合转录因子蛋白的序列与启动子序列连接形成活化序列；和将活化序列与至少一个结构基因和至少一个编码转录因子蛋白的基因连接。
30.根据权利要求1-22之一所述的核酸构建体，根据权利要求23所述的载体，根据权利要求24-27之一所述的药物组合物，或根据权利要求28所述的细胞制备防止或改善疾病的药物的应用。
31.制备药物组合物的方法，包括：用权利要求1一22之一所述的DNA构建体体外转化细胞；培养转化细胞以获得多重拷贝的DNA构建体；和从培养细胞纯化DNA。
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