CZ121599A3 - Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů, způsob její přípravy a léčivo obsahující tuto molekulu - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká jednořetězcové molekuly vázající různé antigeny s odlišnými variabilními doménami těžkého a lehkého řetězce imunoglobulinu, které jsou spojeny ve formě konstruktu VH-VL, přičemž jsou spojeny po řadě dohromady prostřednictvím peptidu, a dále se týká přípravy této molekuly a jejího použití jako léčiva nebo diagnostického prostředku.

Dosavadní stav techniky

Protilátky s dvojí specifitou (dále v textu uváděny pro stručnost jako bispecifické protilátky), které rozpoznávají dva odlišné antigeny, například povrchový antigen nádorové buňky a efektorovou molekulu, jsou široce využívány v experimentální imunoterapii (Fanger et al., Crit. Rev. Immunol., 12, 101-124, 1992, van de Winkel et al., Immunol.

Efektorová činnost prováděná

Today, 18, 562-564, 1997).

bispecifickými protilátkami vyskytují v těle přirozeně, vykonávají cytotoxické a komplementu, cytokiny a zahrnuje funkce, které se jako například ty, které fagocytární buňky, složky trombolytické a fibrinolytické enzymy, a také exogenní efektorové molekuly, jako jsou konvertující předléky injekce bispecifických například toxiny, enzymy a radionuklidy. Tak například protilátek proti antigenu CD30 spojenému s Hodgkinovým tumorem a antigenům CD3 a CD28 T buněk v případě nádorů transplantovaných formou xenotransplantátů vede k mobilizaci a stimulaci cytotoxických T buněk a k indukci tumoricidní aktivity (Renner et al., Science, 264, 833, 1994). V dalším postupu byla použita bispecifická protilátka proti CD30 a alkalické fosfatáze pro zavedení enzymu do místa nádoru, a tím byl přeměněn netoxický prekurzor léku na toxický lék (Sahin et al., Cancer Res., 50, 6944-6948, 1990).

Alternativou k injekci purifikované bispecifické protilátky je exprese a sekrece těchto bispecifických protilátek buňkami transfekovanými in vitro nebo in vivo. Výhoda této strategie je, že produkce bispecifických protilátek transdukovanými buňkami probíhá in vivo, a tedy není potřeba komplikované produkce a purifikace bispecifické protilátky před injekcí. Kromě toho je možné výběrem vhodných expresních systémů kontrolovat expresi bispecifické protilátky lokálně, v orgánech nebo tumoru, nebo systémově.

Bispecifické protilátky mohou být připraveny například chemickým zesítěním (Nisonoff et al., Nátuře, 194, 355, 1962) . Při chemickém zesítění molekul monoklonálních nebo polyklonálních protilátek zvířecího původu může dojít k inaktivaci značného rozsahu. Kromě toho, tvoří se jak heterodimery tak i homodimery. Homodimery se' musí oddělit od požadovaných heterodimerů komplikovaným procesem. Hybridomové buňky, které produkují bispecifické protilátky, nazývané hybridní hybrídomy, mohou být připraveny pouze relativně složitým způsobem, protože je nezbytné fúzovat dva odlišné hybridomy (Milstein et al., Nátuře, 305, 537, 1983). Podíl funkčních heterodimerů je relativně nízký, teoreticky pouze 10 %, protože těžké a lehké řetězce dvou protilátkových molekul se mohou spojit dohromady jakkoliv. Převážně používaný počáteční materiál zahrnuje myší monoklonální protilátky, které jsou imunogenní pro člověka.

- 3 • » ·· · ·

Různé bivalentní nebo bispecifické protilátkové molekuly mohou být také připraveny rekombinantně a exprimovány v bakteriích nebo eukaryotických buňkách (WO 93/06217). Pro všechny rekombinantní protilátkové molekuly je společné to, že pro jejich přípravu mohou být použity jak myší tak i lidské výchozí molekuly. Byly vyvinuty různé metody, které umožňují co nejúčinnější přípravu bispecifických rekombinantních protilátkových molekul. Použitím těchto metod mohou být připraveny různé skupiny molekul.

V jedné skupině molekul jsou variabilní části protilátek fúzovány s konstantními doménami imunoglobulinů (Fc, CH3, CL), aby se dosáhlo dimerizace (Hu et al., Cancer Res., 56, 3055-3061, 1994, Hayden et al., Ther. Immunol., 1, 3-15, 1994). V tomto případě ale není žádná selekce heterodimerických molekul, takže se tímto způsobem vytvoří převážně bivalentní homodimery. Exprese těchto molekul ve funkční formě je kromě toho omezena na eukaryotické buňky.

V další skupině molekul jsou variabilní části protilátek fúzovány k peptidovým nebo proteinovým doménám jiných proteinů, čímž se připraví bivalentní nebo bispecifické molekuly (Plúckthun a Pack, Immunotechnol., 3, 83-105, 1997). V tomto případě je také obvyklá tvorba homodimerů a heterodimerů náhodnou asociací. Kromě toho tyto molekuly obsahují podíl cizích sekvencí, který je v některých případech značný, takže lze očekávat výraznou imunogenicitu.

Ve třetí skupině molekul jsou použity slabé modifikace rekombinantních fragmentů Fv, zpravidla jednořetězcové fragmenty Fv (scFv), pro přípravu bivalentních nebo bispecifických molekul (Holliger a Winter, Curr. Opin. Biotechnol., 4, 446-449, 1993). Ty zahrnují dimerizaci prostřednictvím dodatečně přidaných cysteinů na C-koncové části řetězců scFv (MacCartney et al., Protein Engin., 8, • · • · · · • · * · · · · • · ··· ···· • · · » · · 9 9 9 9

999 9999 9 999 999

9 9 9 9 9 9

301-314, 1994) . Ale to vede ke vzniku jak homodimerů tak heterodimerů a při expresi v bakteriálních buňkách se tvoří nefunkční agregáty. Tandemové molekuly scFv se strukturou scFv(A)-spojka-scFv(B) (Mallender a Voss, J. Biol. Chem., 269, 199-206, 1994) mohou být exprimovány jak v bakteriích, tak v eukaryotických buňkách. Avšak v některých případech se mohou také objevit nefunkční spojení těchto čtyř variabilních domén.

Technologie rekombinantních protilátek vedla v posledních letech k vývoji nových malých, bivalentních nebo bispecifických protilátkových fragmentů. Příklady molekul tohoto typu jsou „diabodies (protože neexistuje český ekvivalent, bude v textu nadále užíván původní termín) (Holliger et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 90, 6444-6448,

1993). Tyto diabodies obsahují variabilní domény VH a VL imunoglobulinů, které jsou spojeny velmi krátkou spojkou.· Tato spojka je příliš malá na to, aby vyvolala asociaci VH a VL domén řetězce, jak se stává u jednořetězcových fragmentů Fv. To znamená, že VH a VL domény dvou řetězců asociují a vytvářejí dimery, takže se tvoří molekuly se dvěma vazebnými místy (Perisic et al., Structure, 2, 1217-1226,

1994:

Bispecifické „diabodies jsou tvořeny expresí dvou řetězců se

VH(B)-VL(A) v jedné strukturou VH(A)-VL(B) tomto případě VL znamená variabilní (V) doménu (L) řetězce a VH znamená variabilní doménu (V) H) řetězce imunoglobulinu, tyto variabilní domény vážou antigen (A) nebo (B) . Spojení částí VH s částmi VL tvoří heterodimerické fragmenty s funkčně aktivními vazebnými místy. Bakteriálně exprimované bispecifické „diabodies již byly úspěšně použity pro zavedení různých efektorových molekul, imunoglobulinů, Clq nebo enzymů nebo efektorových buněk, jako jsou například cytotoxické T lymfocyty • · · · · · • · • · · · · · ···· ·· · ···· · · · · • · · · · · ···· 9 999 999

9 9 9 9 9 · · • 9 9 9 9 9 99 9 9

- 5 (Kontermann et al., Nátuře Biotechnol., 15, 629, 1997,

Holliger et al., Protein Engin., 9, 299, 1996, Nátuře

Biotechnol., 15, 632, 1997, Zhu et al., BioTechnol., 14, 192, 1996, FitzGerald et al., Protein Engin., 10, 1221, 1997,

Krebs et al., J. Biol. Chem., 273, 2858, 1998).

Avšak „diabodies mají také nevýhody, a sice následuj ící:

Protože dva řetězce VH(A)-VL(B) a VH(B)-VL(A) nejsou již nadále fyzicky spojeny, mohou se rovným dílem tvořit homodimery a heterodimery, tudíž pro získání heterodimerů je nezbytný velmi komplikovaný purifikační proces. Kromě toho se vyskytuje disociace dimerů, jak již bylo prokázáno pro fragmenty scFv (Glockshuber et al., Biochem., 29, 1362-1367,

1990) . Aby se vyřešil tento problém, byly vyvinuty „diabodies stabilizované disulfidem (FitzGerald et al., Protein Engin., 10, 1221-1225, 1997) nebo „diabodies nazývané „klíč v zámku (Zhu et al., Protein Sci., 6, 781-788, 1997). Ale jejich příprava je značně složitá. Kromě toho exprese bispecifických „diabodies metodami genetického inženýrství vyžaduje signální sekvenci a ribozomální vazebné místo pro každý řetězec, což je velmi komplikované. Navíc je možné, že se variabilní domény exprimují v neekvimolárním množství, což zvyšuje podíl nefunkčních homodimerů.

Cílem předkládaného vynálezu bylo proto nalézt molekuly vázající několik antigenu, které nemají výše uvedené nevýhody takzvaných „diabodies a které mohu být jednoduše připraveny v převážně homogenní formě.

• · · ·

- 6 Podstata vynálezu

Prvním aspektem předkládaného vynálezu je jednořetězcová molekula vázající několik antigenů, která obsahuje následující složky:

a) variabilní doménu těžkého řetězce imunoglobulinu (VH) s první specifitou (A) a její funkční části,

b) variabilní doménu lehkého řetězce imunoglobulinu (VL) s druhou specifitou (B) a její funkční části,

c) variabilní doménu těžkého řetězce imunoglobulinu (VH) se specifitou (B) a její funkční části, a

d) variabilní doménu lehkého řetězce imunoglobulinu (VL) se specifitou (A) a její funkční části, kde VH a VL domény jsou spojeny ve formě konstruktu VH-VL nebo konstruktu VL-VH a dva konstrukty VH-VL jsou spojeny prostřednictvím peptidu (P).

V-dalším-provedení molekula podle vynálezu obsahuje více než dva uvedené konstrukty VH-VL (např. VH(B)-peptid-VL(B)). To umožňuje získat molekuly, které obsahují několik specifit (A) , (Β) , (C) apod.

Ve výhodném provedení jsou jednotlivé konstrukty VH-VL spojeny prostřednictvím svých variabilních domén s toutéž specifitou. Obzvláště výhodná struktura molekuly podle vynálezu je zobrazena na obr. 1.

V dalším výhodném provedení jsou jednotlivé specifity v podstatě identické. Termín „v podstatě identické znamená podle předkládaného vynálezu, že je velmi dobře možné, aby se domény lišily v molekulové struktuře, ale podržely si svou specifitu, tj. specifickou vazbu antigenu. Výsledek toho je, že molekula podle vynálezu nemusí obsahovat pouze kompletní variabilní doménu těžkého nebo lehkého řetězce imunoglobulinu, ale může také obsahovat jejich funkční části, tj. části, které si podržely své vlastnosti pro specifickou ······ ·· · flfl ·· • · · · · · · · · · • · · · · · · flflflfl • · · · · · ···· fl flflfl flfl* • flfl flflfl · · • flfl flfl · flflflfl

- 7 vazbu antigenu. Například do rámce předkládaného vynálezu spadají také umělé konstrukty složené z jednotlivých částí CDR („complementary determining regions - oblasti určující komplementaritu) variabilních domén imunoglobulinu (Jones, P.T. et al., Nátuře, 321, 522, 1986, Riechmann, L. et al.,

Nátuře, 332, 323, 1988, Verhoyen, M. et al., Science, 239, 1534, 1988) .

Ve výhodném provedení jsou domény VH a VL spojeny prostřednictvím peptidového linkeru-spojky (L) ve formě konstruktu VH-L-VL nebo konstruktu VL-L-VH. Spojka by v tomto případě obecně měla být co nej kratší, výhodně je spojka dlouhá přibližně 1 až 20 aminokyselin, nejlépe přibližně 1 až 5 aminokyselin. Obzvláště výhodná spojka má sekvencí GGGGS.

Na rozdíl od spojky (L) může mít spojovací peptid (P) jakoukoliv vhodnou délku. Ale výhodně-- obsahuje peptid (P) přibližně 12 až 40 aminokyselin, nejlépe-. přibližně 12 až 20 aminokyselin, zejména 14 aminokyselin. Obzvláště výhodný peptid (P) obsahuje aminokyselinovou sekvenci GGGGSGGRASGGGS nebo GGGGSGGRASGGGGS, a je především peptidem (P) skládajícím se z uvedené aminokyselinové sekvence.

V dalším výhodném provedení obsahuje molekula podle vynálezu jako další složku efektor (E) . Tento efektor může být k molekule podle vynálezu připojen přímo, nebo kde je to vhodné, prostřednictvím konektoru (B) . Je zejména výhodné, aby konektor obsahoval proteázovou štěpnou sekvenci, výhodně štěpnou sekvenci PSA (prostatický specifický antigen) , katepsinu, plazminogenu a/nebo aktivátoru plazminogenu.

Proteázová štěpná sekvence je obzvláště výhodná, protože umožňuje oddělit efektor od molekuly podle vynálezu použitím proteázy. Separace je výhodná zejména když je aktivita efektoru inhibována kvůli tomu, že je efektor navázán přímo

- 8 • · · · · 4 • · 4 • · · • · · nebo nepřímo prostřednictvím konektoru k molekule podle vynálezu.

Protože proteázy se vyskytují zejména v oblastech zánětu nebo v tumorech, efektory, které jsou výhodně inaktivovány kvůli své vazbě k molekule podle vynálezu prostřednictvím štěpné sekvence, se zde lokálně rozsáhle uvolňují. Kromě toho je možné výběrem vhodných cílových struktur pro molekulu podle vynálezu, například která má specifitu pro antigeny na nádorových buňkách, jako jsou například lymfocyty nebo makrofágy, aby se například· dosáhla akumulace molekuly podle vynálezu s efektorem v oblasti zánětu nebo tumoru.

Podle předkládaného vynálezu je také možné, že na molekulu podle vynálezu může být navázáno přímo nebo nepřímo několik efektorů.

Proteázy nebo relevantní štěpné sekvence jsou detailně popsány například v patentové přihlášce DE1970430.1.

Jeden příklad výhodné molekuly podle vynálezu, která má efektor navázaný prostřednictvím konektoru k molekule, je schematicky zobrazen na obr. 2.

Výběr jednotlivých složek molekuly podle vynálezu obecně závisí na oblasti aplikace.

Jestliže má být molekula podle vynálezu použita jako diagnostický prostředek, pak, například v dalším provedení, je první specifita (A) namířena proti molekule, která má být analyzována, a druhá specifita (B) přímo nebo nepřímo proti analytu. Analyt může být například radioaktivní molekula, fluorescenční molekula nebo enzym, který konvertuje svou enzymatickou aktivitou prekurzor analytu do aktivního analytu.

V dalším výhodném provedení je první specifita (A) namířena proti molekule, která má být analyzována, druhá specifita (B) proti další molekule, která má být analyzována • · φ · φ φ

- 9 a efektor (E) je analyt, například radioaktivní molekula, fluorescenční molekula a/nebo enzym, jak již bylo detailněji vysvětleno výše.

Molekula podle vynálezu může být ale použita také jako ligand pro specifickou vazbu virového nebo nevirového vektoru k cílové buňce. Ve výhodném provedeni může být molekula podle vynálezu použita jako takzvaný multifunkční ligand. Pro tento účel je výhodné, jestliže peptid (P) a/nebo efektor (E) obsahuje fúzogenní peptid. Multifunkční ligand slouží pro přenos nukleotidových sekvencí specifický pro cílovou buňku a je to obecně protein, který obsahuje ligand specifický pro cílovou buňku, ligand specifický pro genový konstrukt a fúzogenní peptid. Multifunkční ligandy tohoto typu mohou být použity pro specifickou vazbu genových konstruktů, tj . konstruktů nukleových kyselin, k cílové buňce, přičemž fúzogenní peptid umožňuje konstruktu nukleové kyseliny proniknout přes buněčnou membránu do buněčného jádra a být také uvolněn z endozomu.

Při použití molekuly podle vynálezu jako ligandu pro vektor .nebo jako multifunkčního ligandu je výhodné, aby první specifita (A) byla namířena proti cílové buňce a druhá specifita (B) proti vektoru. Vektor je obecně nukleová kyselina, kationtový peptid nebo protein, kationtový lipid, kationtový peptid nebo kationtový porfyrin. V konkrétním provedení tohoto vynálezu je vektor virový vektor pocházející například z adenovirů (AdV) , virů přidružených k adenovirům (AAV), viru vakcinie, RSV, HSV, viru chřipky nebo lentiviru.

Příklady ligandů specifických pro cílovou buňku, membránových struktur na cílové buňce, ligandů specifických pro cílovou buňku a ligandů specifických pro genový konstrukt, které jsou odvozeny z imunoglobulinů, tj. obsahují •· ··»· ·· 9 nádorovým proteinům domény VH a VL, a také peptidů s fúzogenními vlastnostmi, jsou popsány detailně v patentové přihlášce DE19649645.4.

Molekula podle vynálezu je také vhodná pro profylaxi a/nebo jako léčebný přípravek.

Pro tyto účely je například první specifita (A) namířena proti buněčné membráně, jako například proti lymfocytům, makrofágům, monocytům, granulocytům, hematopoetickým buňkám, endoteiovým buňkám, buňkám hladkého svalstva, buňkám příčně pruhovaného svalstva, epitelovým buňkám, jaterním buňkám, buňkám ledvin, glíovým buňkám, buňkám podpůrných tkání, leukemickým buňkám, nebo proti hmoty, komplementového systému, koagulačního systému, kininového systému, krevní plazmy, podpůrné tkáně, nebo proti cytokinům či chemokinům, nebo proti endogenním či exogenním toxinům, nebo proti léčivům, jako je například digitalis, a/nebo proti patogenům, jako buňkám nebo mezibuněčné jsou například bakteriální, patogeny.

Druhá specifita (B) může virové a/nebo parazitární být například namířena proti buněčné membráně, například lymfocytů, makrofágů, monocytů nebo granulocytů s tím cílem, že její navázání na cílovou strukturu může zde vést k cytotoxickým, imunomodulačním nebo zánětlívým procesům.

Může být také namířena proti cytokinům, chemokinům nebo růstovým faktorům s takovým cílem, že její navázání na cílovou strukturu může indukovat ímunomodulační nebo proliferační procesy. Může být také namířena proti proteinům komplementového systému, které iniciují, zesilují nebo inhibuji jeho aktivaci. Navázání proteinu tohoto typu na cílovou strukturu může zde, v závislosti na výběru proteinu, indukovat zánětlivou a cytolytickou nebo protizánětlivou a cytoprotektivní reakci. Může být' také namířena proti • · ····

- 11 struktuře, hormonům, proti proti proteinům koagulačního systému, které iniciují, zesilují nebo inhibují jeho aktivaci. Navázání proteinu tohoto typu na cílovou strukturu může zde, v závislosti na výběru proteinu, vyvolat nebo zamezit trombóze. Může být dále namířena proti f ibrinolytickým. proteinům, které vedou k rozpuštění fibrinové sraženiny v cílové struktuře, proti enzymům, které jsou schopné konvertovat inaktivní prekurzor léčiva na aktivní například cytotoxický lék na cílové peptidovým hormonům nebo steroidním konstantní části imunoglobulinu, proti mediátoru, jako je například histamin, serotonin, leukotrien, prostacyklin nebo kinin, proti patogenům jako např. bakteriálním, virovým a/nebo parazitárním patogenům, nebo proti nádorovým buňkám.

Cytokiny jako cílové struktury nebo monocyty, makrofágy a/nebo lymfocyty jako cílové struktury mohou být obsazeny molekulou podle vynálezu s infekčními _ nebo nádorovými antigeny, a tím vyvolat ín vivo- zesílenou imunitní odpověď proti antigenů. V tomto spojení je výhodné přidat k molekule podle vynálezu konkrétní antigen patogenu nebo tumoru a tam, kde je to vodné, také cytokin, a podávat nebo injikovat lokálně navázaný a obsazený komplex.

Druhá specifita (B) může být také namířena proti endogenním nebo exogenním toxinům, takže může být vyvolána buď neutralizace toxinu a fagocytóza nebo jiná toxická reakce na cílové struktuře. Může být dále namířena proti léčivům, jako je například digitalis, takže může být vytvoření komplexu a vyloučení léčiva.

V dalším výhodném provedení molekula podle s efektorem umožňuje zesítění dvou identických nebo odlišných cílových struktur jedním nebo více efektory.

Příklady vhodných efektorů jsou transmembránová doména, glykofosfolipidová kotva, ligand vázající část receptorů, ligand pro receptor nebo částečná sekvence ligandu vázající vyvoláno vynálezu ·· 4 ···

«

• 4 · receptor, peptidový hormon, cytokin, růstový faktor, inhibitor růstového faktoru, chemokin, interferon, mediátor, peptid mající vliv na cirkulaci, enzym, který konvertuje inaktivní prekurzor léku na aktivní lék, protein, který aktivuje nebo inhibuje koagulaci, protein, který aktivuje nebo inhibuje fibrinolýzu, protein, který aktivuje nebo inhibuje komplementový systém, jedna nebo více konstantních domén imunoglobulinu, cytotoxický peptid nebo jiná jednořetšzcová, jeden nebo několik, konkrétně dva antigeny vázající molekula, nádorový antigen nebo antigen patogenu, jako je například bakteriální antigen nebo virový antigen, peptid obsahující cystein k tvorbě dimerů molekuly podle vynálezu, a/nebo dimerizující nebo multimerizující peptid (Pluckthun a Pack, Immunotechnol., 3, 83-105, 1997).

Dalším aspektem předkládaného vynálezu je nukleová kyselina kódující molekulu podle vynálezu. Nukleová kyselina je obecně DNA nebo RNA, výhodně dvoj vláknová DNA.

Pro sekreci, která je vyžadována kde je to vhodné, expresního produktu podle vynálezu, obsahuje nukleová kyselina podle vynálezu na 5'-konci nukleotidovou sekvenci kódující signální nebo transmembránovou sekvenci (viz například patentové přihlášky DE 19639103.2 nebo DE 19651443.6). Jedním příkladem vhodných signálních nebo transmembránových sekvencí je signální sekvence pro imunoglobulin (pozice DNA < 63 až > 107), signální sekvence pro CEA (pozice DNA < 33 až > 134) nebo signální sekvence glykoproteinu lidského respiračního syncyciálního viru (cDNA pro aminokyselinové sekvence < 38 až > 50 nebo 48 až 65).

V dalším provedení předkládaného vynálezu nukleová kyselina podle vynálezu obsahuje na svém 5'-konci promotor a/nebo aktivátor. Aktivátor může být výhodně aktivován, nebo suprimován buněčně specificky, specificky pro buněčný cyklus,

- 13 • to toto·· • to · toto toto • · · · · · to • · · · to ' to · · • to · ···· · ·«· ··· • · · · · ·· * ·· ·· v patentových DE 19639103.2, a DE 19710643.9.

DE 19617851.7, EP 97102547.3 metabolicky specificky a/nebo léčivem. Aktivátorové sekvence tohoto typu včetně jejich kombinací, jsou popsány přihláškách EP 97101507.8,

DE 19651443.6,' DE 19704301.1,

Obzvláště výhodné konstrukty nukleové kyseliny podle vynálezu jsou schematicky zobrazeny na obr. 3 a obr. 4.

Ve výhodném provedení obsahuje nukleová kyselina podle vynálezu na 5'-konci startovacího kodonu. sekvenci GCCACC nebo GCCGCC, které mohou vyvolat zesílení translace.

Další provedení předkládaného vynálezu se týká vektoru obsahujícího nukleovou kyselinu podle vynálezu. Vektor může být v tomto případě virový nebo nevirový vektor, výhodně nevirový vektor, který je vybrán zejména z kationtového lipidu, kationtového polymeru, kationtového peptidu nebo kationtového porfyrinu.

Aby se připravily molekuly podle vynálezu, je popsaná nukleová kyselina klonována do expresního vektoru, například vhodného plazmidu, a zavedena do vhodné buňky, například do bakterie, kvasinky, hmyzí nebo savčí buňky, a dále buňka transformovaná nebo transfekovaná tímto způsobem je kultivována a expresní produkt je izolován, když je to vhodné. Obecně jsou metody odborníkovi známy a jsou detailně popsány například v Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press .

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu tyto buňky exprimují molekulu podle vynálezu, která má efektor, a tento efektor je výhodně transmembránové doména.

Tak například DNA sekvence kódující transmembránovou sekvenci lidského faktoru stimulujícího kolonii makrofágů (pozice DNA < 1485 až > 1554) nebo sekvence DNA kódující

* · · · · « · · · · · ···· β ··· · · · · · · · · ·

- 14 signální a transmembránovou oblast glykoproteinu G lidského respiračního syncyciálního viru (RSV) (aminokyseliny 1 až 63 nebo z toho částečná sekvence aminokyselin 38 až 63) nebo sekvence DNA kódující signální a transmembránovou oblast neuraminidázy viru chřipky (aminokyseliny 7 až 35 nebo částečná sekvence aminokyselin 7 až 27) může být vložena mezi promotorovou sekvenci a DNA sekvenci molekuly podle vynálezu nebo jinou na 3'-konci genu.

Avšak pro ukotvení léčiva v buněčné membráně· buněk exprimujících molekulu podle vynálezu, je také možné vložit nukleotidovou sekvenci kódující glykofosfolipidovou kotvu do konstruktu nukleové kyseliny.

Inzerce glykofosfolipidové kotvy se obecně provádí na 3'-konci nukleotidové sekvence kódující molekulu podle vynálezu a můře se také uskutečnit navíc ještě kromě vložení signální sekvence.

Glykofosfolipidové kotvy byly popsány například pro CEA, pro N-CAM a pro další membránové proteiny, jako je například Thy-1.

Díky této transmembránové oblasti exprimuje konkrétní buňka molekulu podle vynálezu na buněčné membráně a tak získá „receptor, který je specifický pro cílové nebo efektorové struktury, které jsou rozpoznávány částmi vázajícími antigen molekuly podle vynálezu.

Jiný výhodný receptor je transmembránová nebo signál převádějící doména receptoru, například receptor T buňky nebo receptor M-CSF. To umožňuje buňce exprimující molekulu podle vynálezu na buněčné membráně, že je vazbou na cílové struktury aktivována pro specifickou činnost. Specifická činnost tohoto typu může být například cytotoxická reakce T lymfocytů, fagocytóza makrofágů a granulocytů nebo exocytóza granulocytů, monocytů a makrofágů.

• · • · · · · · • · '» · · * · ····· 9 ··· · · · • : ..· ..·

- 15 Dalším aspektem předkládaného vynálezu je proto buňka obsahující nukleovou kyselinu podle vynálezu nebo vektor podle vynálezu, zejména bakteriální, hmyzí, nebo savčí buňka nebo kvasinka. Vhodné savčí buňky jsou kromě všeobecně známých buněk pro expresi nukleových kyselin, jako jsou například buňky CHO nebo BHK, také lymfocyt, makrofág, gliová buňka, epitelová buňka, jaterní buňka, buňky ledvin, buňky kostní dřeně, endotelová buňka, buňka hladkého nebo příčně pruhovaného svalstva nebo fibroblast.

Posledně zmíněné buňky jsou zejména vhodné pro aplikaci v genové terapii, protože tyto buňky, které obsahují konstrukt nukleové kyseliny podle vynálezu, mohou být injikovány pacientovi lokálně nebo parenterálně, například intravenózně, intraarteriálně, do tělesné sutiny, do orgánu nebo subkutánně pro profylaxi nebo .léčbu poruchy.

Ale pro léčbu poruch zdraví .genovou terapií je také možné podávat konstrukty nukleové kyseliny podle vynálezu pacientovi přímo lokálně, do tělesné sutiny, do orgánu, do oběhového systému, subkutánně nebo intramuskulárně.

Další aspekt předkládaného vynálezu je proto také léčivo obsahující molekulu podle vynálezu, nukleovou kyselinu podle vynálezu, vektor podle vynálezu nebo buňku podle vynálezu, a diagnostický prostředek obsahující molekulu podle vynálezu, který je také namířen proti analytu, jak již bylo detailně popsáno výše.

Molekula podle předkládaného vynálezu, nukleová kyselina podle vynálezu, vektor podle vynálezu nebo buňka podle vynálezu jsou také vhodné pro léčbu, profylaxi nebo diagnózu např. onkologických onemocnění, autoimunitních chorob, zánětlivých nemocí, krevních poruch, zejména krevní koagulace a/nebo oběhového systému, poruch nervového systému a/nebo infekčních nemocí.

- 16 Výběr jednotlivých složek v tomto spojení obecně závisí na použití prvků podle vynálezu. Jednotlivé složky a jejich užití jsou detailně popsány dále obecnou formou a pomocí příkladů.

Pro přípravu prvku podle vynálezu je možné, jak je uvedeno formou příkladu na obrázcích 3 a 4, spojit konstrukt nukleové kyseliny podle vynálezu na jeho 5'-konci ke 3'-konci nukleové kyseliny kódující signální sekvenci, a druhý prvek opět spojit na jeho 5'-konci ke 3'-konci promotorové sekvence.

Promotorové sekvence, které mohou být vybrány zahrnují například promotor RNA polymerázy III, promotor RNA polymerázy II, promotor a/nebo zesilovač CMV, promotor SV40, nebo virové promotorové a aktivátorové sekvence, jako jsou například sekvence z HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV, HIV.

Když je použit promotor z HIV, preferuje se použití cele sekvence LTR včetně sekvence TAR (pozice < -453 až > -80, Rosen et al., Cell, 41, 813, 1985) jako virově specifického promotoru.

Další promotorové sekvence pro výběr jsou například promotorové a zesilovací (enhancerové) sekvence, které mohou být aktivovány metabolicky, jako je například zesilovač indukovatelný hypoxií, promotory aktivovatelné specificky pro buněčný cyklus, jako například promotor genu cdc25C, genu cdc25B, genu cyklinu A, genu cdc2, genu B-myb, genu DHFR nebo genu E2F-1, nebo jiné vazebné sekvence pro transkripční faktory, které se objevují nebo jsou aktivovány specificky pro buněčný cyklus. Tyto vazebné sekvence zahrnují například vazebné sekvence pro proteiny c-myc. V těchto vazebných sekvencích jsou zahrnuty také monomery nebo multimery nukleotidové sekvence označované jako box E Myc (5'-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3') .

Další promotorové sekvence pro výběr jsou například promotory aktivovatelné tetracyklinem, jako je například tetracyklinový operátor v kombinaci s příslušným represorem, nebo chimérické promotory. Chimérický promotor je kombinace aktivátorové sekvence, která může být aktivována buněčně specificky, metabolický nebo virově specificky, a je lokalizována v protisměru čtení (upstream), s promotorovým modulem, a který který je obsahuj e lokalizován po směru nukleotidovou sekvenci E2FBS-CHR, ke které se váží supresorové proteiny, a je tedy schopná inhibovat aktivaci protisměrné aktivátorové sekvence v Go fázi a Gi fázi buněčného cyklu (W096/06943, Lucibello et al., EMBO J., 14, 132, 1995).

Jiné promotorové sekvence pro výběr jsou například promotory, které mohou být aktivovány buněčně specificky, jako jsou výhodně promotory nebo aktivátorové sekvence z promotorů nebo zesilovačů těch genů, které kódují proteiny, které jsou přednostně tvořeny ve vybraných buňkách.

Například promotory pro následující proteiny jsou výhodné pro použití pro účel vynálezu v následujících buňkách:

Promotorové a aktivátorové sekvence, které aktivovány v endotelových buňkách, jsou a aktivátorové sekvence genů, které kódují proteiny: pro mozek specifický endotelový přenašeč glukózy 1, endoglin, receptor VEGF 1 (flt-1), receptor VEGF 2 (flk-1,

KDR), til-1 nebo til-2, receptor B61 (receptor Eck), B61, endotelin, zejména endotelin B nebo endotelin 1, receptory endotelinu, zejména receptor endotelinu B, receptory manózo-6-fosfátu, von Willebrandův faktor, IL-la, IL-Ιβ, receptor IL-1, adhezivní molekula cévní buňky (VCAM-1) nebo syntetické aktivátorové sekvence, které obsahují downstream) , CDE-CHR nebo sou promotorové následuj ící • 9 « 99

9 9 9

9· 9 9 9

999 9 9 99 9 9 9 • ·

9· · I

- lí oligomerizovaná místa pro vazbu transkripčních faktorů, které jsou přednostně nebo selektivně aktivní například v endotelových buňkách GATA 2, jehož vazebné 5'-TTATCT-3'.

Promotorové nebo

Příkladem je transkripční faktor místo v genu endotelinu 1 je aktivátorové sekvence aktivované v buňkách v sousedství aktivovaných endotelových buněk jsou genově regulační sekvence genů, které kódují například následující proteiny: VEGF, přičemž genově regulační sekvence pro gen VEGF jsou 5'-hraniční oblast, 3'-hraniční oblast, gen c-Src nebo gen v-Src, nebo receptory steroidních hormonů a jejich promotorové prvky, zejména promotor viru myšího nádoru mléčné žlázy.

Promotorové nebo aktivátorové sekvence, které jsou aktivovány ve svalových buňkách, zejména v buňkách hladkého svalstva, jsou genově regulační sekvence genů, které kódují například následující proteiny: tropomyozin, a-aktin, α-myozin, receptor pro PDGF, receptor pro FGF, MRF-4, fosfofruktokinázu A, fosfoglycerátmutázu, troponin C, myogeny, receptory pro endotelin A, dezmin, VEGF (viz výše), syntetické promotory nebo promotory svalově specifických transkripčních faktorů, jako jsou faktory rodiny šroubovice-smyčka-šroubovice (helix-loop-helix, HLH) (MyoD, Myf-5, myogeny, MRF4) nebo protein „zinkového prstu GATA-4.

Proteiny HLH, a také GATA-4, projevují transkripci svalově specifickou nejenom s promotory genů specifických pro svaly, ale také v heterologním kontextu, a tedy také se syntetickými promotory. Příklady syntetických promotorů tohoto typu jsou mnohonásobné kopie vazebného místa (DNA) pro svalově specifické proteiny HLH, jako je box E (Myo D) (např. 4x AGCAGGTGTTGGGAGGC) nebo mnohonásobné kopie DNA

I» · · · » * · · • · · ·

- 19 « · ·· · β · « · · 9 4 4 9 £ ζ φ « · ·♦··»* 44 9 994 «·· · · · * * — » I» 9 9949 kyselý protein - GFAP), CNTF, receptory 5-HT, vazebného místa pro GATA-4 genu těžkého řetězce cc-myozinu (např. 5'-GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCA GATAGAGG-3') .

Promotory a aktivátorové sekvence, které jsou aktivovány v gliových buňkách, jsou například genově regulační sekvence genů, které například kódují následující proteiny: protein periaxin specifický pro Schwannovy buňky, glutaminsyntetázu, protein specifický pro gliové buňky, (gliový vláknitý protein SlOOb gliové buňky, IL-6, TNFa, IL-10, receptor růstového faktoru podobného inzulínu I a II nebo VEGF (viz výše).

Promotory a aktivátorové sekvence, které jsou. aktivovány v hematopoetických buňkách, jsou například promotorové sekvence pro geny cytokinu nebo jeho receptoru, které jsou exprimovány v hematopoetických buňkách nebo v sousedních buňkách, jako jsou například buňky stromatu.

Sem patří promotorové .sekvence- genů, které například kódují následující cytokiny a jejich receptory: receptor faktoru kmenové buňky, faktor kmenové buňky, IL-Ια, receptor IL-1, IL-3, receptor IL-3 (podjednotka a), receptor IL-3 (podjednotka β) , IL-6, receptor IL-6, GM-CSF, -receptor

GM-CSF (řetězec a), interferonový regulační faktor 1 (IRF-1), přičemž promotor IRF-1 je aktivován do stejné míry IL-6 a IFNy nebo IFNp, erytropoetin nebo receptor erytropoetinu.

Promotory a aktivátorové sekvence, které jsou aktivovány v lymfocytech a/nebo makrofázích, jsou například promotorové a aktivátorové sekvence genů kódujících cytokiny, cytokinové receptory a adhezivní molekuly a receptory pro Fc fragment protilátek, jako jsou například receptor IL-1, IL-la, IL-Ιβ, IL-2, receptor IL-2, IL-3, receptor IL-3 (podjednotka α) , receptor IL-3 (podjednotka β) , IL-4, receptor IL-4, IL-5,

IL-6, receptor IL-6, interferonový regulační faktor 1 (IRF1), přičemž promotor IRF-1 je aktivován do stejné míry IL-6 jako IFNy nebo ΙΕΝβ, promotor responzivní na IFNy, IL-7, IL8, IL-10, IL-11, IFNy, GM-CSF, receptor GM-CSF (řetězec a), IL-13, LIF, receptor faktoru stimulujícího kolonii makrofágů (M-CSF) , receptory makrofága I a II, MAC-1 (leukocytární funkční antigen), LFA-Ια (leukocytární funkční antigen) nebo pl50,95 (leukocytární funkční antigen).

Promotory a aktivátorové sekvence, které jsou aktivovány v synoviálních buňkách, jsou například promotorové sekvence genů kódujících metaloproteinázy mezibuněčné hmoty (MMP), například MMP-1 (intersticiální kolagenáza) nebo MMP-3 (stromelyzin/tranzin) nebo tkáňové inhibitory metaloproteináz (TIMP), jako TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3.

Promotory a aktivátorové sekvence, které jsou aktivovány v leukemických buňkách, jsou například promotory genů, které kódují následující proteiny: HSP-70, bcl-l/cyklin D-l, bcl-2, IL-6, IL-10, TNFa, TNFp, H0X11, BCR-Abl, E2A-PBX-1, PML-RARA (promyelocytární leukemie - receptor kyseliny retinové) nebo c-myc, přičemž proteiny c-myc se váží na multimery nukleotidové sekvence nazývané box E Myc (5'-GGAAGCAGACCAGCTGGTCTGCTTCC-3') a aktivují je.

Promotory nebo aktivátorové sekvence, které jsou aktivovány v nádorových buňkách, jsou například genově regulační nukleotidové sekvence, se kterými interagují transkripční faktory, které se tvoří nebo jsou aktivní v nádorových buňkách.

Pro účel tohoto vynálezu výhodné promotory nebo aktivátorové sekvence zahrnují genově regulační sekvence nebo prvky genů, které kódují zejména proteiny, které jsou tvořeny v rakovinných buňkách nebo buňkách sarkomů. Tedy pro malobuněčné bronchiální karcinomy je výhodně použit promotor proteinu N-CAM, pro ovariální karcinomy je promotor receptorů růstového faktoru hepatitidy nebo L-plastinu, a pro

• · · »·

4 · • · '· ·

4 4 9 9 9 49

9 .·» ·· « ··

- 21 pankreatické karcinomy je promotor L-plastinu nebo polymorfního epitelového mucinu (PEM).

Značnou výhodou předkládaného vynálezu je, že vazba jednotlivých složek podporuje heterodimerovou asociaci, takže se převážně tvoří jednořetězcové molekuly vázající různé antigeny. Je zde také snížení disociace dimerů, jak bylo ukázáno pro fragmenty scFv (viz například Glockshuber et al., Biochem., 29, 1362-1357, 1990). Je tedy možné připravit molekuly podle předkládaného vynálezu podstatně jednodušeji a v homogennější formě, než to umožňují takzvané „diabodies, dokonce i když jsou stabilizovány disulfidem nebo ve formě „klíč v zámku.

Kromě toho jsou pro přípravu molekuly podle vynálezu nezbytné pouze jedna signální sekvence a jedno ribozomální vazebné místo (RBS). Na rozdíl od toho pro každý řetězec v „diabodies je vyžadována signální sekvence i RBS. Další výhoda předkládaného vynálezu je, že u molekul podle vynálezu se exprimují v ekvimolárních množstvích variabilní domény, zatímco při expresi dvou řetězců „diabodies se mohou tvořit neekvimolární množství, a je tedy zvýšen podíl nefunkčních homodimerů.

Další výhodou molekuly podle vynálezu je, že může být exprimována jednoduše a ve funkční formě jak v bakteriích, tak i v kvasinkách, baculovirech a eukaryotických buňkách. Navíc kromě sekrece molekul podle vynálezu je také možnost exprimovat je uvnitř buněk nebo ve spojení s membránami (viz například Biocca & Cattaneo, Trends Cell Biol., 5, 248252,1995).

Další výhodou molekul podle vynálezu je, že mohou být široce použity jako diagnostický prostředek a jako léčivo pro profylaxi a/nebo léčbu poruch, jako bispecifické protilátky.

- 22 • 9 9 9 99

99 » · · ♦ » · · · ttt »9 9

Geny efektorů a promotorových sekvencí jsou vybrány se zřetelem na požadované použití a berou do úvahy cílovou buňku, která má být transdukována. V následujícím textu jsou uvedeny příklady kombinací promotorových sekvencí a genů pro efektory, které mohou být vybrány pro určité poruchy.

Léčba nádorů

Cílové buňky pro léčbu nádorů jsou například proliferující endotelové buňky nebo buňky stromatu a svalové buňky sousedící s endotelovými buňkami, nebo nádorové nebo leukemické buňky, použité promotory jsou například specifické pro endotelové buňky a specifické pro buněčný cyklus nebo buněčně nespecifické nebo specifické pro svalové buňky a specifické pro buněčný cyklus nebo specifické pro nádorové buňky (solidní nádory a leukémie) a specifické pro buněčný cyklus, a použité efektory jsou například následující geny:

Geny inhibitorů buněčné proliferace jsou například protein retinoblastomu (pRb=pllO) nebo příbuzné proteiny pl07 a pl30. Protein retinoblastomu (pRb/pllO) a příbuzné proteiny pl07 a pl30 jsou inaktivovány fosforylací. Dává se přednost použití takových genů těchto inhibitorů buněčného cyklu, které, projevují mutace pro inaktivační místa exprimováných proteinů, aniž by se tím zhoršila funkce těchto proteinů. Příklady těchto mutací jsou popsány pro pllO. Sekvence DNA proteinu pl07 nebo proteinu pl30 je mutována analogicky. Je také vhodný gen proteinu p53. V buňce je protein p53 inaktivován buď vazbou na specifické proteiny, jako je například MDM2, nebo oligomerizací p53 prostřednictvím defosforylovaného šeřinu na C-koncové části. Proto se dává přednost použití sekvence DNA pro protein p53, který byl na C-koncové části zkrácen odstraněním šeřinu 392. Další vhodné • · t • · 9

- 23 geny jsou gen p21 (WAF-1) , proteinu pl6, dalších inhibitorů cdk, proteinu GADD45 nebo proteinu bak.

Geny faktorů vyvolávající koagulaci a inhibitory angiogeneze jsou například geny pro inhibitor aktivátoru plazminogenu 1 (PAI-1) , PAI-2, PAI-3, angiostatin, interferony (IFNa, IFNfl nebo IFNy) , destičkový faktor 4, IL12, TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, leukemický inhibiční faktor (LIF) nebo tkáňový faktor (TF) a jeho fragmenty podporující koagulaci.

Geny cytostatických a cytotoxických proteinů jsou například geny pro perforin, granzym, IL-2, IL-4, IL-12, interferony, jako je například IFNa, IFN3 nebo IFNy, TNF, jako je TNFa nebo TNFfl, onkostatin M, sfingomyelináza nebo magainin a deriváty magaininu.

Geny induktorů zánětů jsou například geny pro IL-1, IL-2, RANTES (MCP-2), monocytářní chemotaktický a aktivační faktor (MCAF), IL-8, makrofágový zánětlivý protein 1 (ΜΙΡ-Ια, ΜΙΡ-1β) , neutrofilový aktivační protein 2 (NAP-2) , IL-3, IL-5, lidský leukemický inhibiční faktor (LIF), IL-7, IL-11, IL-13, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, faktor kobřího jedu (CVF) nebo částečné sekvence CVF, které funkčně odpovídají lidskému komplementovému faktoru C3b, tj . které jsou schopny se vázat ke komplementovému faktoru B a které tvoří konvertázu C3 po štěpení faktorem D, lidský komplementový faktor C3 nebo jeho částečná sekvence C3b, štěpné produkty lidského komplementového faktoru C3, které jsou funkčně a strukturně podobné CVF, nebo bakteriální proteiny, které aktivují komplement nebo vyvolávají záněty, například poriny ze Salmonella typhimurium, srážlivé faktory ze Staphylococcus aureus, moduliny, zejména z gramnegativních bakterií, hlavní vnější membránový protein legionel nebo z Haemophilus

- 24 influenzae typu B nebo z klebsiel, nebo M molekuly streptokoků skupiny G.

Geny enzymů pro aktivaci prekurzorů cytostatických agens jsou například geny pro enzymy, které štěpí inaktivní prekurzory (předléky) na aktivní cytostatické léky. Látky tohoto typu a příslušné předléky a léky již byly uvedeny v přehledech autorů: Deonarain et al., (Br. J. Cancer, 70, 786, 1994), Mullen (Pharmac. Ther., 63, 199, 1994) a Harris et al. (Gene Ther., 1, 170, 1994) . Například mohou být použity sekvence DNA pro jakýkoliv z následujících enzymů: thymidinkináza viru herpes simplex, thymidinkináza viru varicella zoster, bakteriální nitroreduktáza, bakteriální β-glukuronidáza, rostlinná β-glukuronidáza ze Secale cereale, lidská β-glukuronidáza, lidská karboxypeptidáza (CB) , například CB-A mastocytů, pankreatická CB-B nebo bakteriální karboxypeptidáza, bakteriální β-laktamáza, - .bakteriální cytosindeamináza, lidská kataláza nebo peroxidáza, fosfatáza, zejména lidská alkalická fosfatáza, lidská kyselá prostatická fosfatáza nebo kyselá fosfatáza typu 5, oxidáza, zejména lidská lysyloxidáza nebo lidská kyselá D-aminooxidáza, peroxidáza, zejména lidská glutathionperoxidáza, lidská eosinofilní peroxidáza nebo lidská thyroidní peroxidáza, β-galaktosidáza nebo α-galaktosidáza. Obzvláště je výhodná β-galaktosidáza, protože konvertuje předlék daunomycin β-D-galaktopyranosid na cytostatikum daunomycin.

Léčba autoimunitních nemocí a zánětů

Cílové buňky pro léčbu autoimunitních nemocí a zánětů jsou například proliferující endotelové buňky nebo makrofágy a/nebo lymfocyty nebo synoviální buňky, použité promotory jsou například specifické pro endotelové buňky a specifické • ·

- 25 pro buněčný cyklus nebo specifické pro makrofágy a/nebo specifické pro lymfocyty a/nebo specifické pro buněčný cyklus nebo specifické pro synoviální buňky a/nebo specifické pro buněčný cyklus a použité efektory jsou například následující geny:

Geny pro léčbu alergií jsou například geny pro ΙΕΤίβ, IFNy, IL-10, protilátky nebo protilátkové fragmenty proti IL-4, rozpustným receptorům IL-4, IL-12 nebo TGFp.

Geny pro prevenci odvržení (rejekce) transplantovaných orgánů jsou například geny pro IL-10, TGFP, rozpustné receptory IL-1, rozpustné receptory IL-2, antagonisté receptoru IL-1 nebo rozpustné receptory IL-6.

Geny pro léčbu autoimunitních nemocí zprostředkovaných protilátkami jsou například geny pro TFGP, IFNa, IFNP, IFNy, IL-12, rozpustné receptory IL-4, rozpustné receptory IL-6, imunosupresivní protilátky nebo jejich fragmenty obsahující V_H a V_l.

Geny pro léčbu autoimunitních nemocí zprostředkovaných buňkami jsou například geny pro IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, TNFa nebo TNFP, IL-13, imunosupresivní protilátku nebo její fragmenty obsahující V_H a V_L.

Geny inhibitorů buněčné proliferace, cytostatické nebo cytotoxické proteiny a enzymy pro aktivaci prekurzorů cytostatických přípravků již byly detailně popsány výše.

Geny pro léčbu artritidy jsou například strukturní geny, jejichž exprimovaný protein inhibuje zánět, například v kloubu, přímo nebo nepřímo, a/nebo podporuje rekonstituci mezibuněčné hmoty (chrupavky, vazivové tkáně) v kloubu.

Příklady těchto proteinů jsou antagonista receptoru IL-1 (IL-l-RA), protože IL-l-RA inhibuje tvorbu IL-la, IL-Ιβ; rozpustný receptor IL-1, protože rozpustný receptor IL-1 váže a inaktivuje IL-1; IL-6, protože IL-6 zvyšuje sekreci TIMP

synoviálními TNF, protože IL-4, protože • · · « · · • « · · · • · 9 · *

- 26 a superoxidů a snižuje sekreci IL-1 a TNFa buňkami a chondrocyty; rozpustný receptor rozpustný receptor TNF váže a inaktivuje TNF;

IL-4 inhibuje tvorbu a sekreci IL-1, TNFa a MMP; IL-10, protože IL-10 inhibuje tvorbu a sekreci IL-1, TNFa a MMP a zvyšuje sekreci TIMP; růstový faktor podobný inzulínu (IGF-1), protože IGF-1 stimuluje syntézu mezibuněčné hmoty; TGFp, zejména TGFpi a TGFP2, protože TGFP stimuluje syntézu mezibuněčné hmoty; superoxiddismutáza nebo TIMP, zejména TIMP-1, TIMP-2 nebo TIMP-3.

Léčba hematopoetického systému

Cílové buňky pro léčbu nedostatečné tvorby krvinek jsou například, proliferující nezralé buňky hematopoetického systému nebo buňky stromatu sousedící s hematopoetickými buňkami; použité promotory jsou například specifické pro hematopoetické buňky a/nebo specifické pro buněčný cyklus nebo buněčně nespecifické a specifické pro buněčný cyklus a použité efektory jsou například následující geny:

Geny pro léčbu anémie jsou například gen pro erytropoetín.

Geny pro léčbu leukopenie jsou například G-CSF, GM-CSF nebo M-CSF.

Geny pro léčbu trombocytopenie jsou například IL-3, leukemický inhibiční faktor (LIF), IL-11 nebo trombopoetin.

Léčba nervového systému

Cílové buňky pro léčbu poškození nervového systému jsou například gliové buňky nebo proliferující endotelové buňky, použité promotory jsou například specifické pro gliové buňky • · · · · * • «

- 27 a specifické pro buněčný cyklus nebo specifické pro endotelové buňky a specifické pro buněčný cyklus nebo nespecifické a specifické pro buněčný cyklus a použité efektory jsou například následující geny:

Geny pro neuronové růstové faktory jsou například geny pro FGF, nervový růstový faktor (NGF), neurotrofický faktor pocházející z mozku (BDNF), neurotrofin 3 (NT-3), neurotrofin 4 (NT-4) nebo ciliární neurotrofický faktor (CNTF).

Geny pro enzymy jsou například geny pro tyrosinhydroxylázu nebo dopadekarboxylázu.

Geny pro cytokiny a jejich inhibitory, které inhibují nebo neutralizují neurotoxický účinek TNFa jsou například geny pro TGF3; rozpustné receptory TNF, protože receptory TNF neutralizují TNFa; IL-10, protože IL-10 inhibuje tvorbu IFNy, TNFa, IL-2 a IL-4; rozpustné .receptory IL-1, jako je IL-1 receptor I nebo IL-1 - receptor II, protože rozpustné receptory IL-1 neutralizují aktivitu IL-1; antagonista receptoru IL-1 nebo rozpustné receptory IL-6.

Léčba poruch krevní koagulace a oběhového systému

Cílové buňky pro léčbu poruch krevní koagulace a oběhového systému jsou například endotelové buňky, proliferující endotelové buňky, somatické buňky v sousedství endotelových buněk a buňky hladkého svalstva nebo makrofágy, použité promotory jsou například buněčně nespecifické a specifické pro buněčný cyklus nebo promotory specifické pro endotelové buňky, buňky hladkého svalstva nebo makrofágy a specifické pro buněčný cyklus a použité efektory jsou například následující geny:

Geny pro inhibici koagulace nebo pro podporu fibrinolýzy jsou například geny pro tkáňový aktivátor plazminogenu (tPA), • · • · β ·

- 28 aktivátor plazminogenu urokinázového typu (uPA), hybridy tPA a uPA, protein C, hirudin, - inhibitory serinové proteázy (serpiny), jako je například inhibitor C-1S, al-antitrypsin nebo antitrombin III nebo inhibitor dráhy tkáňového faktoru (TFPI) .

Geny pro podporu koagulace jsou například F VIII, F IX, von Willebrandův faktor, F XIII, PAI-1, PAI-2 nebo tkáňový faktor a jeho fragmenty.

Geny pro faktory angiogeneze jsou například VEGF nebo

FGF.

Geny pro snížení krevního tlaku jsou například geny pro kalikrein nebo syntázu oxidu dusičného endotelových buněk.

Geny pro inhibici proliferace buněk hladkého svalstva po poranění vrstvy endotelu jsou například geny pro antiproliferační, cytostatický nebo cytotoxický protein nebo enzym pro štěpení prekurzorů cytostatických' přípravků na cytostatické přípravky, jak již bylo uvedeno výše, nebo fúzní protein jednoho z těchto léčiv s ligandem, například s protilátkou nebo protilátkovými fragmenty, které jsou specifické pro svalové buňky.

Geny pro další proteiny krevní plazmy jsou například geny pro albumin, inaktivátor Cl, sérovou cholinesterázu, transferin nebo al-antitrypsin.

Profylaxe a/nebo léčba infekčních nemocí

Cílové buňky pro očkování jsou například svalové buňky nebo makrofágy a/nebo lymfocyty, použité promotory jsou například nespecifické a specifické pro buněčný cyklus nebo specifické pro cílovou buňku a promotory specifické pro buněčný cyklus, a použité efektory jsou například geny pro profylaxi infekčních nemocí.

«· · · · · • · · · · · • · · · · · · • · ······ · · · ·« • · · · a · · · * · ¹

Vybraná aktivní látka je obecně DNA pro protein, který je tvořen patogenem a který vede vyvoláním imunitní reakce, tj . pomocí vazby protilátky a/nebo prostřednictvím cytotoxických lymfocytů T, k neutralizaci a/nebo destrukci patogenu. Tyto -takzvané neutralizační antigeny jsou již používány jako vakcinační antigeny (viz přehled v Ellis, Adv. Exp. Med. Biol., 327, 263, 1992).

Pro účel vynálezu je výhodná nukleová kyselina, která kóduje neutralizační antigeny pro následující patogeny: virus chřipky A, HIV, virus rabies, virus HSV (virus herpes simplex), RSV (respirační syncyciální virus), virus parainfluenzy, rotavirus, VZV (cytomegalovirus), virus papilomavirus) , HBV (virus HDV (virus virus varicella zoster), CMV spalniček, HPV (lidský

B), HCV hepatitidy hepatitidy

D)

HEV virus virus hepatitidy C), hepatitidy E) , HAV (virus hepatitidy A) , antigen Vibrio cholerae, Borrelia burgdorferi nebo Helicobacter pylori nebo antigen malárie.

Aktivní látky tohoto typu pro účel předkládaného vynálezu také zahrnují DNA pro antiidiotypovou protilátku nebo její fragmenty vázající antigen, jejichž struktury vázající antigen (oblasti určující komplementaritu) tvoří kopie proteinové struktury nebo sacharidové struktury neutralizačního antigenu patogenu (viz výše).

Ántiidiotypové protilátky tohoto typu a jejich štěpné produkty mohou nahradit zejména sacharidové antigeny pro bakteriální patogeny a jsou uvedeny například v přehledech , (J. Immunother., 14, 273, 1993)

ISpringer Seminars in Immunopathol., autoru: Hawkins et al a Westerink a Apicella 15, 227, 1993) .

Příklady dalších efektorů jsou geny pro ,nádorové vakcíny. Ty zahrnují antigeny na nádorových buňkách, jak • to to ·

- 30 bylo uvedeno například v přehledu Sedlaček et al., Contrib. to Oncol., 32, Karger Verlag, Munich, 1988, a Contrib. to Oncol., 43, Karger Verlag, Munich, 1992.

Další příklady jsou geny pro následující antigeny nebo následující antiidiotypové protilátky: sialyl Lewis; peptidy na nádorech, které jsou rozpoznávány T buňkami; proteiny, které jsou exprimované onkogeny; antigeny krevních skupin a jejich prekurzory; antigeny na polymorfním epitelovém mucinu nebo antigeny na proteinech tepelného šoku.

Cílové buňky pro léčbu chronických infekčních nemocí jsou například jaterní buňky, lymfocyty a/nebo makrofágy, epitelové buňky nebo endotelové buňky, použité promotory jsou například virově specifické nebo buněčně specifické a promotory specifické pro buněčný cyklus a použité efektory jsou například následující geny:

Geny kódující protein, který má cytostatické, apoptotické nebo cytotoxické účinky nebo kódující enzym, který štěpí prekurzor' antivirové nebo cytotoxické látky na aktivní látku.

Geny kódující antivirové proteiny, jako antivirově aktivní cytokiny a růstové faktory, jako jsou například geny pro IFNa, IFNp, IFNy, TNFP, TNFa, IL-1 nebo TGFP nebo protilátky se specifitou, která inaktivuje příslušný virus nebo její fragmenty obsahující V_H a V_L, nebo její fragmenty V_H a V_L, spojené prostřednictvím spojky, jak již bylo popsáno. Příklady protilátek proti virovým antigenům jsou: anti-HBV, anti-HCV, anti-HSV, anti-HPV, anti-HIV, anti-EBV, anti-HTLV, anti-coxsackievirus nebo anti-hantavirus.

Další příklad antivirově aktivního proteinu je protein vázající rev. Tyto proteiny se váží k rev RNA a inhibují kroky následující po transkripci závislé na rev v expresi

• ·

- 31 retrovirových genů. Příklady proteinů vázajících rev jsou RBP9-27, RBP1-8U, RBP1-8D nebo pseudogeny RBPl-8.

Geny kódující antibakteriální proteiny, jako jsou například protilátky, které neutralizují bakteriální toxiny nebo které opsonizují bakterie. Příklady těchto protilátek jsou protilátky proti meningokokům C nebo Β, E. coli, Borrelia, Pseudomonas, Helicobacter pylorí, nebo Staphylococcus aureus.

Vynález je dále podrobněji vysvětlen a ilustrován pomocí následujících obrázků a příkladů, aniž by však byl jimi vynález jakkoliv omezován.

Popis obrázků

Obr. 1 schematicky popisuje strukturu jednořetězcové molekuly vázající dva antigeny.

Obr. 2 schematicky popisuje jednořetězcovou molekulu vázající dva antigeny s efektorem.

Obr. 3 a obr. 5 schematicky popisují konstrukty nukleové kyseliny kódující jednořetězcovou molekulu vázající dva antigeny.

Obr. 4 schematicky popisuje konstrukt nukleové kyseliny kódující jednořetězcovou molekulu vázající dva antigeny s efektorem.

Obr. 6 ukazuje vychytání β-galaktosidázy na CEA navázaný na plastické hmotě prostřednictvím jednořetězcového proteinu vázajícího dva antigeny podle vynálezu (scDb-CEAGal), ve srovnání s „diabodies proti CEA a β-galaktosidázou E. coli (CEAGal). Jako negativní kontrola byla mikrotitrační destička povlečená BSA.

Obr

Obr

Obr ukazuje vychytání β-galaktosidázy prostřednictvím scDb-CEAGal, secernovaným savčími buňkami, s různými množstvími scDb-CEAGal a β-galaktosidázy použitými na mikrotitrační destičky povlečené CEA. Použitý substrát byl o-nitrofenyl-fi-D-galaktopyranosid. Jako negativní kontrola byla mikrotitrační destička povlečená BSA.

8A ukazuje smrt buněk LoVo v přítomnosti jednořetězcového proteinu vázajícího dva antigeny podle vynálezu (scDb), β-galaktosidázy (β-Gal), daunomycin β-D-galaktopyranosidu (předlék) a/nebo daunomycinu (lék).

8B ukazuje kontrolní pokusy s CEA-negativní buněčnou linií (A549) .

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 uříprava a bakteriální exprese vázajícího dva antigeny j ednořetězcového proteinu

Příprava jednořetězcového proteinu vázajícího dva antigeny je popsána na příkladu proteinu, který rozpoznává dva antigeny - karcinomembryonální antigen (CEA) a β-galaktosidázu E. coli.

Následující sekvence DNA byly spolu spojeny ve směru od 5'-konce ke 3'-konci:

- promotor LacZ

- bakteriální struktura vázající ribozom (AAGGAG)

- bakteriální signální sekvence pelB (Power et al., Gene, 113, 95-99, 1992)

- 33 - VH anti-CEA (Kontermann et al., Immunotechnol., 3, 137,

1997)

- spojka GGGS (Kontermann et al., 1997)

- VL anti-p-galaktosidázy (Kontermann et al., 1997)

- spojující peptid GGGGSGGTASGGGGS

- VH anti-3-galaktosidázy (Kontermann et al., 1997)

- spojka GGGGS

- VL anti-CEA (Kontermann et al., 1997)

- epitop Myc pro protilátku 9E10 EQKLISEEDLN (Munro a Pelham, Cell, 46, 291-300, 1986)

- polyhistidin HHHHHH purifikace IMAC (Kontermann et al., 1997)

Navázaní jednotlivých složek konstruktu bylo umožněno vhodnými restrikčními místy, která byla vložena prostřednictvím amplifikace PCR na konce různých sekvencí DNA (Kontermann et al., Immunotechnol., 3, 137, 1997).

Navázání se uskutečnilo použitím enzymů specifických pro restrikční místa a DNA ligáz, které jsou odborníkovi známy. Enzymy mohou být zakoupeny komerčně. Konstrukt byl klonován do bakteriálního expresního vektoru pABl (Kontermann et al., 1997) .

Klonování se provádělo pomocí oligonukleotidových primerů LBM2 a LBM3 (Kontermann, R.E., 1997) a

VK-NotFor: 5'-TTG TTC TGC GGC CGC CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT GCC AGC ACC-3', scDb-AscBack: 5'-TGC ATG CTA GGG CGC GCC TCG GGC GGA GGT GGC TCA CAG GTG CAG CTG GTG CAA TGT GG-3', scDb-AscForK: GCT CGG TAA GGC GCG CCC ACC GCT GCC ACC GCC TCC ACC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC-3' a pelB-Metminus: 5'- TTA CTC GCG GCC CAG CCG GCC ACG GCC CAG

GT-3 ' .

- 34 ·«··

Pro tento účel byly amplifikovány fragmenty VHB-VLA (fragment 1) a VHA-VLB (fragment 2) z „diabodies CEAGal (Kontermann, R.E., 1997) za použití primerů LMB2 a LMB3 a byly purifikovány v gelu. Fragment 1 byl poté amplifikován za použití primerů VK-NotFor a scDb-AscBack, aby se vložilo místo AscI a 7 aminokyselin spojky. Fragment 2 byl amplifikován za použití primerů LMB3 a scDb-AscForX, aby se vložilo místo AscI a 8 aminokyselin spojky. Fragmenty se hydrolyzovaly s AscI a Notl (fragment 1) a Sfil a AscI (fragment 2) a klonovaly do bakteriálního expresního vektoru pABl (Kontermann, R.E., 1997). Výsledný inzert kóduje jednořetězcový polypeptid, ve kterém je VHA-VLB spojen prostřednictvím spojky o délce 15 aminokyselin se sekvencí GGGGSGGRASGGGGS k VHB-VLA.

Plazmid byl poté vložen do bakterií TG1, které se pěstovaly metodami odborníkovi známými (Kontermann et al., 1997) .

Bakterie se rozrušily a jednořetězcový protein vázající dva antigeny se purifikoval z peripiazmatického preparátu afinitní chromatografií s imobilizovaným kovem (IMAC) (Hochuli et al., Bio/Techn., 6, 1321-1325, 1988. Detaily této metody jsou popsány Kontermannem et al. (1997).

Purifikovaný protein měl molekulovou hmotnost 60kD, jak bylo prokázáno elektroforézou na SDS polyakrylamidovém gelu a gelovou filtrací. Bylo možné purifikovat přibližně 200 až 300 μg této molekuly na litr bakteriální kultury. Bakteriálně exprimovaný jednořetězcoý protein vázající dva antigeny reaguje v testu ELISA s CEA a β-galaktosidázou a byl schopný nachytat enzym na CEA navázaný na plastické hmotě, jak bylo ukázáno konverzí o-nitrofenyl β-D-galaktopyranosidu (obr. 6). Kromě toho byl tento jednořetězcoý protein vázající dva antigeny- schopný označit živé a fixované buňky LoVo

- 35 ·· ···· • t · • to to • · · · to » · ······ ·· • to · ·· · ·· exprimující CEA tím, že vychytal β-galaktosidázu a konvertoval substrát 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-p-D-galaktopyranosid (X-Gal). Kvůli tomu se buňky LoVo inkubovaly s 10 μg/ml příslušného proteinu vázajícího antigen a s 10 μς/ηΐ β-galaktosidázy a X-Gal (0,8 mg/ml v PBS, 3mM kyanid draselnoželezitý, 3mM kyanid draselnoželeznatý) . Žádné značení nebylo pozorováno u různých kontrolních buněk (A549, HEK293) nebo u „diabodies proti lysozymu slepičího vejce a β-galaktosidáze (HELGal, Kontermann et al., 1997).

Příklad 2

Eukaryotická exprese jednořetězcového proteinu vázajícího dva antigeny

Pro expresi v eukaryotických buňkách byla kódující oblast jednořetězcového proteinu vázajícího dva antigeny klonována do eukaryotického expresního vektoru (pSecTagA, Invitrogen), bakteriální signální sekvence byla nahrazena signální sekvencí Ig-κ ve vektoru již přítomnou.

Kvůli tomu se jednořetězcový konstrukt amplifikoval pomocí primerů LMB2 a pelB-Metminus, čímž byl methionin ve vedoucí sekvenci pelB (pozice 21) nahrazen threoninem. To bylo následováno hydrolýzou se Sfil a EcoRI a klonováním do vektoru pSecTagA. Zralý jednořetězcový protein vázající dva antigeny obsahuje 7 dalších aminokyselin (AAQPATA) na N-koncové části domény VHA.

Plazmid byl přechodně transfekován s Lipofectaminem (Gíbco) do eukaryotických buněk HEK 293. Stabilní buňky se vybíraly v přítomnosti zeocinu. V imunofluorescenčních pokusech s těmito buňkami bylo možné detekovat značení endoplazmatického retikula a Golgih-o aparátu. Dále bylo možné

- 36 • fl flflflfl • · • · fl • ···· fl fl • flfl • · • flfl • · detekovat sekreci jednořetězcového proteinu vázajícího dva antigeny imunoprecipitací proteinu o velikosti 60kD ze supernatantu buněk značených 35 S-Met a purifikací afinitní chromatografii s imobilizovaným kovem (IMAC). Purifikovaný protein je funkčně aktivní ve vazbě β-galaktosidázy a CEA povlečeného na mikrotitračních destičkách a ve vychytávání β-galaktosidázy na CEA navázaný na plastické hmotě (obr. 7) .

Příklad 3

Vychytávání enzymu in vitro společnou kultivací s buňkami secernujícími jednořetězcový protein vázající dva antigeny

Vychytávání in vitro se vyšetřovalo společnou kultivací buněk HEK 293 produkujících jednořetězcový protein vázající dva antigeny a CEA-pozitivních buněk LoVo. Za tímto účelem byly nejdříve buňky tvořící protein podle vynálezu kultivovány s buňkami LoVo v nádobách na tkáňové kultury buněčné linie byla přidána se detekovalo

Transwell (Costar), ve kterých jsou dvě odděleny membránou. Po dvou dnech β-galaktosidáza (10 pg/ml) a vychytávání přidáním substrátu X-Gal. Při společné kultivaci s buňkami produkujícími jednořetězcový protein vázající dva antigeny bylo nalezeno specifické značení, zatímco kontrolní pokusy s netransfekovanými buňkami HEK 293 neprokazovaly žádné značení.

Pokusy, ve kterých byly buňky LoVo nahrazeny buňkami A549 (CEA-negativní), a pokusy, ve kterých byly buňky tvořící jednořetězcový protein vázající dva antigeny inkubovány s enzymem a substrátem, byly podobně negativní. Posledně uvedené dokládá, že buňky produkující jednořetězcový protein vázající dva antigeny nejsou samy o sobě schopny vázat enzym.

• 44 *··

- 37 ·· 4444 ·· * ·· » » 4 9 » · · · » 4 4444 » 4 4

4

V dalším pokuse byly buňky HEK 293 secernující jednořetězcový protein vázající dva antigeny a buňky LoVo kultivovány společně přímo s inokulačním poměrem od 1:4 až 1:24. Aby se odlišily buňky HEK 293 od buněk LoVo, byly buňky HEK 293 před přidáním k buňkám LoVo označeny CM-Dil (Molecular Probes) (červená fluorescence). Po dvou dnech byla přidána β-galaktosidáza, a vazba na buňky se detekovala přidáním X-Gal (10 μg/ml) a přímou imunofluorescencí s protilátkou anti^-galaktosidáza (Biotrend). Tyto pokusy také ukázaly specifické vychytávání enzymu buňkami LoVo, zatímco buňky HEK . 293 nebyly označeny. Kontrolní enzymy s netransfekovanými buňkami HEK 293 byly negativní. Tyto pokusy prokázaly, že jednořetězcový protein vázající dva antigeny specificky a selektivně rozpoznává nádorové buňky.

V dalších pokusech se vyšetřovala konverze netoxického β-D-galaktopyranosidu na cytotoxický daunomycin. Inkubací buněk LoVo s purifikovaným jednořetězcovým proteinem vázajícím dva antigeny (10 μg/ml) jednu hodinu a následnou inkubací s β-galaktosidázou (1 μg/ml) a daunomycin-p-D-galaktopyranosidem (2 μΜ) při 37 °C jednu hodinu bylo možné detekovat specifickou lokalizaci výsledného v jádru autofluorescencí látky, srovnatelnou daunomycinu s označením způsobeným přímou inkubací s daunomycinem. Při nepřítomnosti jednořetězcového proteinu vázajícího dva antigeny nebo β-galaktosidázy a u kontrolních buněk (HEK 293, HEK tvořících jednořetězcový protein vázající dva antigeny) nebylo detekovatelné žádné jaderné značení. Tyto pokusy prokázaly, že jednořetězcový protein vázající dva antigeny je schopný zachytit a navázat enzym k nádorové buňce a že tento enzym může být použit pro konverzi netoxického prekurzoru na toxickou látku.

·· · ··· ···· • · · ···· · · · · • · ? · · · ···· · ··· ··* ··· · · · * · • · · · » · ·· · ·

- 38 Tento účinek může být využit v dalších pokusech pro specifickou destrukci nádorových buněk.

Za tímto účelem byly buňky LoVo inkubovány na 96-jamkových destičkách s jednořetězcovým proteinem vázajícím dva antigeny (10 pg/ml), a poté s daunomycin-p-D-galaktopyranosidem (5 μΜ) při 37 °C jednu hodinu. Smrt buněk se analyzovala po 2 dnech za použití testu WST (Boehringer Mannheim) (obr. 8) . V tomto případě bylo smrti buněk při konverzi předléku na lék dosahováno přibližně stejně jako v přítomnosti léku (obr. 8A). Při chybění jedné složky nebo u CEA-negativních buněk A549 nebyl nalezen v podstatě žádný účinek (obr. 8B).

I

Příklad 4

Příprava konstruktů pro intracelulární expresi jednořetězcových proteinů vázajících dva antigeny

Pro intracelulární expresi jednořetězcového proteinu vázajícího dva antigeny je DNA genu pro jednořetězcový protein vázající dva antigeny amplifikována s různými primery:

- Transmembránový jednořetězcový protein vázající dva antigeny (TM-scDAP). Je použit primer, který vkládá transmembránovou doménu PDGFR na 3'-konec genu.

(LPFKWVISAIIALWLTI ISLI ILIMLWQKKPRYES )

- Jednořetězcový protein vázající dva antigeny lokalizovaný v endoplazmatickém retikulu (ER-scDAP). Je použit primer, který vkládá ER retenční signál (SEKDEL) na 3'-konec genu.

- Jednořetězcový protein vázající dva antigeny lokalizovaný v cytoplazmě (cyto-scDAP). Je použit primer, který

- 39 ·· · · · · · · · · · • · · · · · ···· · ··· ··· ··· ··· · · ·· · ·· * ·.· ·· nahrazuje signální sekvenci na 5'-konci genu methioninem a Kozákovou sekvenci pro optimální iniciaci translace. Jednořetězcový protein vázající dva antigeny lokalizovaný v jádře (nuc-scDb). Jsou použity primery, které nahrazují signální sekvenci na 5'-konci genu

methioninem a	Kozákovou	sekvenci	pro optimální	iniciaci
translace, a	vkládáj i	j adernou	lokalizační	signální
sekvenci na	3'-konec	genu	(PKKKRKVGGGT,	j aderná

lokalizační sekvence je podtržena).

Tyto fragmenty jsou klonovány do vhodných eukaryotických expresních vektorů (pSecTagA a pcDNA3, Invitrogen). Výsledné konstrukty (TM-scDAP, ER-scDAP, cyto-scDAP, nuc-scDAP a sec-sc-DAP (= secernovaný protein, viz příklad 2) jsou poté přechodně transfekovány do eukaryotických buněk (3T3) a'lokalizace exprimovaného proteinu se vyšetřuje imunofluorescencí za použití anti-Myc protilátky proti epitopu Myc. Značení typické pro sekreční dráhu může být detekováno u konstruktů sec-sc-DAP, ER-scDAP a TM-scDAP, zatímco cyto-scDAP vykazuje difúzní lokalizaci v cytoplazmě a nuc-scDAP vykazuje lokalizaci v jádru.

• * · · · ·

• · · · · · · • ··· · · · · • ······ ··· ··· • · · · · • · · ·« · ·

- 40 SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) (B) (C) (D)	DÉLKA: 14 aminokyselin TYP: aminokyselina TYP VLÁKNA: jednoduché
TOPOLOGIE:	lineární
TYP	MOLEKULY:	peptid
TYP	FRAGMENTU:	vnitřní fragment

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1

GGGGSGGRAS GGGS 14 (2) INFORMACE. PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 15 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní fragment (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2

GGGGSGGRAS GGGGS 15 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26
(B)	TYP: nukleotid
(C)	TYP VLÁKNA: dvojité
(D)	TOPOLOGIE: lineární

* » ···· ·· ♦ · · · · • · · · · · · · · · • · · ···· · · · · « · » · · · ···· · ·♦· ··· ··· · · · · · • · « ·« * ·· ·*

- 41 (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina: Myc E-box (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

GGAAGCAGAC CACGTGGTCT GCTTCC 26 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina: E-Box (Myo D) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

AGCAGGTGTT GGGAGGC 17 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 41 (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina: GATA-4 vazebná (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

GGCCGATGGG CAGATAGAGG GGGCCGATGG GCAGATAGAG G • flflfl • fl · · · · ♦··· • fl · ···· · · · · • · · flflfl flflflfl · ··· flflfl • flfl flflfl · · flflfl flfl * flflflfl

- 42 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina: Myc E-Box (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6

GGAAGCAGAC CAGCTGGTCT GCTTCC 26 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 13 (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní fragment (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7

GGGSGGRASG GGS 13 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 4 (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní fragment

- 43 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8

Β Β · <*·· Β · · · ·

Β Β · · · Β · ····

Β Β Β ΒΒΒ ···· Β ΒΒΒ ΒΒΒ

ΒΒΒ · · · · ·

ΒΒΒ ΒΒ · ΟΒ ΒΒ

GGGS (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 11
(B)	TYP: aminokyselina
(C)	TYP VLÁKNA	: jednoduché
(D)	TOPOLOGIE:	lineární
TYP	MOLEKULY:	peptid

(v) TYP FRAGMENTU: vnitřní fragment (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9

EQKLISEEDL N 11 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní fragment (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 10:

HHHHHH 6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:

-(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 45 • · • · • · · ·

- 44 • · · ··· · · · · • · · ···· · · · · • · · * · ····»» · · · ·· · ··· · · · · · »· « ·· » ·· · · (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina: DNA primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 11

TTGTTCTGCG GCCGCCCGTT TCAGCTCCAG CTTGGTGCCA GCACC 45 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 59 (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP'MOLEKULY: jiná nukleová kyselina: DNA primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 12

TGCATGCTAG GGCGCGCCTC GGGCGGAGGT GGCTCACAGG 40

TGCAGCTGGT GCAATCTGG 59 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 60 (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina: DNA primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 13

GCTCGGTAAG GCGCGCCCAC CGCTGCCACC GCCTCCACCT AGGACGGTCA GCTTGGTCCC

- 45 • · · · · · • · · · · · · • · · «« ···· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina: DNA primer . (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 14

TTACTCGCGG CCCAGCCGGC CACGGCCCAG GT 32 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 7 (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: N-koncová část (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 15

AAQPATA 7 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 37 (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: C-koncová část • · · · • ·

- 46 • · · ·· · (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO

LPFKWVISA IIALWLTII SLIILIMLWQ KKPRYES (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

ČÍSLA 16 s

:

	(A)	DÉLKA: 11
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	TYP VLÁKNA: jednoduché
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
ii)	TYP	MOLEKULY: peptid
V)	TYP	FRAGMENTU: C-koncová část

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO

ČÍSLA 17

PKKKRKVGGG T ·· · · · · • to to • to

Claims (36)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů, která obsahuje následující složky:

   a) variabilní doménu těžkého řetězce imunoglobulinu (VH) s první specifitou (A) a její funkční části,

   b) variabilní doménu lehkého řetězce imunoglobulinu (VL) s druhou specifitou (B) a její funkční části,

   c) variabilní doménu těžkého 'řetězce imunoglobulinu (VH) se specifitou (B) a její funkční části, a

   d) variabilní doménu lehkého řetězce imunoglobulinu (VL) se specifitou (A) a její funkční části, přičemž VH a VL domény jsou spojeny ve formě konstruktu VH-VL nebo konstruktu VL-VH a dva konstrukty VH-VL jsou spojeny prostřednictvím peptidu (P).
2. 2. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle nároku 1, která obsahuje více než konstrukty VH-VL.
3. 3. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle nároku 1 nebo 2, ve které jsou konstrukty VH-VL spojeny prostřednictvím domén se stejnou specifitou.
4. 4. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 3, kde specifity (A) a (B) jsou v podstatě shodné.
5. 5. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 4, kde VH a VL domény jsou spojeny prostřednictvím peptidové spojky (L) ve formě konstruktu VH-L-VL nebo konstruktu VL-L-VH.

   • · · · • ·

   - 48 • toto·· · to · · • to · · toto·· · ··· ···
6. 6. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle nároku 5, kde spojka (L) je tvořena 1 až 20 aminokyselinami, výhodně 1 až 5 aminokyselinami.

   Jednořetězcová nároku 5, kde

   GGGGS.

   molekula vázající několik antigenů podle spojka (L) obsahuje sekvenci aminokyselin
7. 8. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 7, kde peptid (P) je tvořen 12 až 40 aminokyselinami, výhodně 12 až 20 aminokyselinami a zvláště výhodně 14 aminokyselinami.
8. 9. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle nároku 8, kde peptid (P) obsahuje sekvenci aminokyselin GGGGSGGRASGGGS nebo GGGGSGGRASGGGGS.
9. 10. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 9, kde uvedená molekula obsahuje jako další složku jeden nebo několik efektorů (E).
10. 11. ' Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle nároku 10, kde efektor (E) je spojen s uvedenou molekulou prostřednictvím konektoru (B).
11. 12. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle nároku 11, kde konektor (B) obsahuje proteázovou štěpnou sekvenci, výhodně štěpnou sekvenci PSA, katepsinu, plazminogenu a/nebo aktivátoru plazminogenu.

    • · · ·
12. 13. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, kde první specifita (A) je namířena proti molekule, která má být analyzována, a druhá specifita (B) proti molekule analytu.
13. 14. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle nároku 13, kde analytem je radioaktivní molekula, fluorescenční molekula a/nebo enzym.
14. 15. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z nároků 10 až 12, kde první specifita (A) je namířena proti molekule, která má být analyzována, druhá specifita (B) je namířena proti jiné molekule, která má být analyzována, a efektor (E) je analyt.
15. 16,. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle nároku 15, kde analytem je radioaktivní molekula, fluorescenční molekula a/nebo enzym.
16. 17. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 12, kde peptid (P) a/nebo efektor (E) obsahuje fúzogenní peptid.
17. 18. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 17, kde první specifita (A) je namířena proti cílové buňce a druhá specifita (B) je namířena proti vektoru.
18. 19. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle nároku 18, kde vektor je nukleová kyselina, kationtový peptid nebo protein, kationtový lipid, kationtový polymer, kationtový porfyrin nebo je to virový vektor • · · · · · ···· · ··· ··· ··· · · · · · ·· · · · · · · · ·

    - 50 vybraný ze skupiny obsahující vektory AdV, AAV, vakcinie,

    RSV, HSV, chřipky nebo lentiviru.
19. 20. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, kde první specifita (A) je namířena proti buněčné membráně, zvláště proti lymfocytům, makrofágům, monocytům, granulocytům, hematopoetickým buňkám, endotelovým buňkám, buňkám hladkého svalstva, buňkám příčně pruhovaného svalstva, epitelovým buňkám, jaterním buňkám, buňkám ledvin, gliovým buňkám, buňkám podpůrných tkání, nádorovým buňkám nebo leukemickým buňkám, nebo proti proteinům mezibuněčné hmoty, komplementového systému, koagulačního systému, kininového systému, krevní plazmy, podpůrné tkáně, nebo proti cytokinům či chemokinům, nebo proti endogenním či exogenním toxinům, ‘ nebo proti léčivům, zejména digitalisu, a/nebo proti patogenům, jako jsou například bakteriální, virové a/nebo parazitární patogeny.
20. 21. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12 a 20, kde druhá specifita (B) je namířena proti buněčné membráně, zvláště proti lymfocytům, makrofágům, monocytům nebo granulocytům, proti cytokinům, chemokinům nebo růstovým faktorům, proti proteinům komplementového systému, proti proteinům koagulačního systému, proti fibrinolytickým proteinům, proti enzymům, které jsou schopné konvertovat inaktivní prekurzor léčiva na aktivní zejména cytotoxický lék na cílové struktuře, proti peptidovým hormonům nebo steroidním hormonům, proti konstantní části imunoglobulinu, proti mediátoru, jako je zejména histamin, serotonin, leukotrien, prost^cyklin nebo kinin,

    -519 9 9 9 9 9 9 9 9 9

    9 9 9 9 9

    999 99 · proti patogenům, proti nádorovým buňkám, proti endogenním nebo exogenním toxinům, proti léčivům, zejména digitalisu.
21. 22. Jednořetězcová molekula vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 12, 20 a 21, kde efektor (E) je vybrán z transmembránové domény, glykofosfolipidové kotvy, části receptoru vázající ligand, ligandů pro receptor nebo části ligandů vázajícího se na receptor, peptidového hormonu, cytokinů, růstového faktoru, inhibitoru růstového faktoru, chemokinu, interferonu, mediátoru, peptidu ovlivňujícího cirkulaci, enzymu, který konvertuje inaktivní prekurzor léku na aktivní lék, proteinu, který aktivuje nebo koagulaci, proteinu, který aktivuje nebo fibrinolýzu, proteinu, který aktivuje- nebo komplementový systém, jedné nebo více_ konstantních domén imunoglobulinu, cytotoxického peptidu, jiné jednořetězcové, jeden nebo několik, konkrétně dva antigeny vázající molekuly, nádorového antigenu nebo antigenu patogenu, jako je například bakteriální antigen nebo virový antigen, peptidu obsahujícího cystein a/nebo dimerizujícího nebo multimerizujícího peptidu.

    inhibuj e inhibuj e inhibuj e
22. 23. Nukleová kyselina, která kóduje jednořetězcovou molekulu vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 22 .
23. 24. Nukleová kyselina podle nároku 23, která obsahuje na svém 5'-konci nukleotidovou sekvenci kódující signální nebo transmembránovou sekvenci.

    •fl ···· • · • fl « flflfl ···· • fl · ···· ···· •flfl flflfl ···· fl flflfl flflfl • flfl flflfl · · • flfl flfl · flfl flfl

    - 52
24. 25. Nukleová kyselina podle nároku 23 nebo 24, která obsahuje na svém 5'-konci promotor a/nebo aktivátor.
25. 26. Nukleová kyselina podle nároku 25, kde aktivátor může být aktivován nebo utlumen buněčně specificky, specificky pro buněčný cyklus, metabolicky specificky a/nebo prostřednictvím léčiva.
26. 27. Nukleová kyselina podle kteréhokoliv z nároků 23 až 26, která obsahuje na 5'-konci startovacího kodonu sekvenci GCCACC nebo GCCGCC.
27. 28. Vektor, který obsahuje nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 23 až 27.
28. 29. Vektor podle nároku 28, který je virový nebo nevirový vektor.
29. 30. Vektor podle nároku 29, kde nevirový vektor je vybrán ze skupiny obsahující kationtový lipid, kationtový polymer, kationtový peptid nebo kationtový porfyrin.
30. 31. Buňka, která obsahuje nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 23 až 27 nebo vektor podle nároku 28 nebo 29.
31. 32. Buňka podle nároku 31, která je bakteriální, kvasinková, hmyzí nebo savčí buňka.
32. 33. Buňka podle nároku 32, kde savčí buňka je lymfocyt, makrcfág, gliová buňka, epitelová buňka, jaterní buňka, • fl flflflfl • fl · ·· ·· • fl · flflfl ···· • fl · flflflfl flflflfl • flfl flflfl flflflfl · flflfl flflfl flflfl · · · 9 · flflfl ·· · flflflfl

    - 53 buňky ledvin, buňky kostní dřeně, endotelové buňka, buňka hladkého nebo příčně pruhovaného svalstva nebo fibroblast.
33. 34. Způsob přípravy jednořetězcové molekuly vázající několik antigenů vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se kultivuje buňka podle nároku 31 nebo 32 a kdy se izoluje expresní produkt, pokud je to žádoucí.
34. 35. Léčivo vyznačující se tím, že obsahuje jednořetězcovou molekulu vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12 a 17 až 22, nukleovou kyselinu podle kteréhokoliv z nároků 23 až 27, vektor podle kteréhokoliv z nároků 28 až 30 nebo buňku podle kteréhokoliv z nároků 31 až 33.
35. 36. Diagnostický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje jednořetězcovou molekulu vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z nároků 13 až 16.
36. 37. Použití jednořetězcové molekuly vázající několik antigenů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 22, nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 23 až 27, vektoru podle kteréhokoliv z nároků 28 až 30 nebo buňky podle kteréhokoliv z nároků 31 až 33, pro léčbu, profylaxi nebo diagnózu onkologických onemocnění, autoimunitních nemocí, zánětlivých nemocí, krevních poruch, zejména krevní koagulace a/nebo oběhového systému, poruch nervového systému a/nebo infekčních nemocí.

    >· ··