JP5306564B2 - 一本鎖多抗原結合分子並びにその製造方法および使用 - Google Patents

一本鎖多抗原結合分子並びにその製造方法および使用 Download PDF

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Description

発明の背景
発明の分野
本発明は、ペプチドを介して順々にともに連結された、VH-VL構築体の形態で連結された免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の種々の可変ドメインを有する一本鎖多抗原結合分子、ならびにその製造方法および医薬または診断補助薬としての使用に関する。
背景技術
２つの異なる抗原、例えば、腫瘍細胞表面抗原とエフェクター分子を認識する二重特異性抗体は、実験的免疫療法において広く使用されている(Fanger et al., Crit. Rev. Immunol. 12, 101-124 (1992); van de Winkel et al., Immunol. Today 18, 562-564 (1997))。二重特異性抗体により補充されるエフェクター機能体としては、例えば、細胞障害性細胞や食細胞、補足成分、サイトカイン類や血栓溶解酵素および繊維素溶解酵素などの体内で自然に生じるもの、ならびに例えば、毒素、前駆薬剤変換酵素および放射性核種などの外生エフェクター分子が挙げられる。このように、例えば、ホジキン腫瘍結合抗原CD30および異種移植腫瘍におけるＴ細胞抗原CD3やCD28に対する二重特異性抗体の注入は、細胞障害性Ｔ細胞の取り込みと刺激をもたらし、次いで、殺腫瘍活性の誘導をもたらす(Renner et al., Science 264, 833, 1994)。もう１つの試みでは、CD30に対する二重特異性抗体とアルカリ性ホスファターゼを用いて腫瘍部位に酵素を補充し、かくして、無毒の薬剤前駆体を有毒薬剤へと変換させた(Sahin et al., Cancer Res. 50, 6944-6948, 1990)。
精製二重特異性抗体の注入のための代替法としては、in vitroまたはin vivoでトランスフェクトされた細胞による、これら二重特異性抗体の発現および分泌が挙げられる。この戦略の利点は、形質導入細胞による二重特異性抗体の産生をin vivoで行い、従って、注入に先立ち、二重特異性抗体の精巧な製造および精製の必要がないことである。さらに、適切な発現系を選択することにより、局部的に器官または腫瘍で、または全身的に、二重特異性抗体の発現を制御することができる。
二重特異性抗体は、例えば、化学的架橋により製造できる(Nisonoff et al., Nature 194, 355, 1962)。動物器官のモノクローナルまたはポリクローナル抗体分子の化学的架橋の場合、決して少なくない割合で失活する可能性がある。さらに、ヘテロおよびホモ二量体の双方が製造される。ホモ二量体は精巧な工程により、必要とするヘテロ二量体から分離しなければならない。二重特性抗体を産生するハイブリドーマ細胞はハイブリッド・ハイブリドーマと呼ばれ、そのためには２種の異なるハイブリドーマをともに融合させる必要があるので、比較的精巧な方法でしか製造できない(Milstein et al., Nature 305, 537, 1983)。この２つの抗体分子の重鎖および軽鎖はどんな場合にでも互いに会合することができるので、機能的ヘテロ二量体の割合は相対的に低く、理論的には10%でしかない。使用される出発物質は主に、ヒトにもまた免疫原性のあるネズミ・モノクローナル抗体を含んでなる。
また、種々の二値または二重特異性抗体分子を組換えによって製造し、細菌または真核細胞で発現させることもできる(WO 93/06217)。通常、あらゆる組換え抗体分子のためには、ネズミおよびヒト出発分子の双方を用いてそれらを製造することが可能である。二重特異性組換え抗体分子をできる限り効率的に製造することを可能にする種々の方法が開発されている。これらの方法を用いて、種々の分子群が製造可能である。
ある分子群では、二量体形成を達成するために、種々の抗体部分を不変免疫グロブリンドメイン(Fc、CH3、CL)と融合させる(Hu et al., Cancer Res. 56, 3055-3061 (1994); Hayden et al., ther. Immunol. 1, 3-15 (1994))。しかしながらこの場合には、ヘテロ二量体分子に関する選択が行われず、その結果、このような場合には、主に二価ホモ二量体が産生される。さらに、これらの分子の機能的形態での発現は真核細胞に制限される。
もう１つの分子群では、種々の抗体部分を他のタンパク質に由来するペプチドまたはタンパク質ドメインと融合させて、二価または二重特異性分子を形成する(Pluckthun and Pack, Immunotechnol. 3, 83-105 (1997))。この場合もまた、ランダムに会合するため、通常、ホモおよびヘテロ二量体が形成する。さらに、これらの分子は、いくつかの場合では無視できないほどの割合の外来配列を含み、この結果、著しい免疫原性が期待される。
第三の分子群では、組換えFv断片、概して一本鎖Fv断片(scFv)をわずかに修飾して、二価または二重特異性分子を形成する(Holliger and Winter, Curr. Opin. Biotechnol. 4, 446-449 (1993))。これらには、scFv鎖のC末端へのシステインの付加による二量体化が含まれる(MacCartney et al., Protein Engin. 8, 301-314 (1994))。しかしながらこの結果、ホモおよびヘテロ二量体の双方が生じ、細菌細胞での発現において、機能を持たない複合体が生じる。scFv(A)-リンカー-scFv(B)構造(Mallender and Voss, J. Biol. Chem. 269, 199-206, 1994)の タンデム-scFv分子は、細菌および真核細胞の双方で発現可能である。しかしながら、これらの場合のいくつかでは、４つの可変ドメインの機能を持たない会合も生じうる。
近年、組換え抗体技術は、新規二価または二重特異性抗体の小断片の開発をもたらした。この種の分子の例としては、「ジアボディー(diabodies)」がある(Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448, 1993)。これらは、極めて短いリンカーによってともに連結された免疫グロブリンの可変VHおよびVLドメインを含んでなる。このリンカーは、一本鎖Fv断片を用いた場合に生じるような、鎖のVHとVLドメインの会合を引き起こすには短すぎる。このことは、２鎖のVHドメインとVLドメインが会合して二量体を形成し、その結果、２つの結合部位を有する分子が産生されることを意味するものである(Perisic et al., Structure 2, 1217-1226, 1994)。二重特異性「ジアボディー」は、１つの細胞のVH(A)-VL(B)およびVH(B)-VL(A)構造の２鎖の発現により産生される。この場合、VLは、免疫グロブリンの軽(L)鎖の可変(V)ドメインを意味し、VHは、重(H)鎖の可変ドメイン(V)を意味し、これら可変ドメインが抗原(A)または(B)に結合する。VH部分とVL部分の会合が、機能的に有効な結合部位を有するヘテロ二量体断片をもたらす。細菌で発現させた二重特異性「ジアボディー」は、種々のエフェクター分子、免疫グロブリン、C1qまたは酵素、もしくは例えば、細胞障害性Ｔリンパ球などのエフェクター細胞を補充するためにすでに首尾よく使用されている(Kontermann et al., Nature Biotechnol. 15, 629 (1997); Holliger et al., Protein Engin. 9, 299 (1996); Nature Biotecnol. 15, 632 (1997), Zhu et al., Bio Technol. 14, 192 (1996); FitzGerald et al., Protein Engin. 10, 1221 (1997); Krebs et al., J. Biol. Chem. 273, 2858 (1998))。
しかしながら、「ジアボディー」は以下の不利な点を有する：
２つのVH(A)-VL(B)およびVH(B)-VL(A)鎖はもはや物理的には結合しないので、ホモおよびヘテロ二量体が同じ程度で生産される可能性があり、これらがヘテロ二量体のために必要な極めて精巧な精製方法をなす。さらに、scFV断片に関してすでに示されたように、この二量体の解離が起こる(Glockshuber et al., Biochem. 29, 1362-1367 (1990))。この問題を解決するために、ジスルフィドで安定化させた「ジアボディー」(FitzGerald et al., Protein Engin. 10, 1221-1225, 1997)または「ノブ・イントゥー・ホール・ジアボディー(knob into hole diabodies)」(Zhu et al., Protein Sci. 6, 781-788, 1997)が開発された。しかしながら、それらの製造はかなりの複雑さを伴う。さらに、二重特異性「ジアボディー」の遺伝子工学的発現には、シグナル配列と各々の鎖についてリボソーム結合部位が必要であり、これが極めて煩雑である。さらに、等モル量でない可変ドメインが発現する可能性があり、このことが機能的でないホモ二量体の割合を増す。
従って本発明の目的は、記載のいわゆる「ジアボディー」の不利な点を持たず、しかも、ほぼ均一な形態で、簡単な方法で製造可能な多抗原結合分子を見出すことにあった。
従って本発明の１つの態様は、以下の構成要素：
a)第１の特異性(A)を有する免疫グロブリンの重鎖の可変ドメイン(VH)およびその機能的部分、
b)第２の特異性(B)を有する免疫グロブリンの軽鎖の可変ドメイン(VL)およびその機能的部分、
c)特異性(B)を有する免疫グロブリンの重鎖の可変ドメイン(VH)およびその機能的部分、および
d)特異性(A)を有する免疫グロブリンの軽鎖の可変ドメイン(VL)およびその機能的部分、
（ここで、VHおよびVLドメインはVH-VL構築体またはVL-VH構築体の形態で連結し、かつ、この２つのVH-VL構築体はペプチド(P)を介して連結している）を含んでなる一本鎖多抗原結合分子である。
 発明の具体的説明
もう１つの具体例では、本発明の分子は、２つより多い該VH-VL構築体（例えば、ＶＨ（Ｂ）‐ペプチド‐ＶＬ（Ｂ））含んでなる。これが、いくつかの特異性(A)、(B)、(C)などを有してなる分子を得ることを可能にする。
好ましい具体例では、個々のVH-VL構築体は、同じ特異性を有するそれらの可変ドメインを介して結合している。本発明の分子の特に好ましい構造は図１に示されている。
もう１つの好ましい具体例では、個々の特異性は本質的に同一である。「本質的に同一」とは、本発明によれば、そのドメインが分子構造においては異なるが、それらの特異性、すなわち、特異的抗原結合機能は維持していることが申し分なく可能であることを意味する。この結果、本発明の分子は、必ずしも完全な免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の可変ドメインを含んでならなくともよく、その機能的部分、すなわち、それらの特異的抗原結合特性を維持している部分を含んでなればよいことになる。例えば、免疫グロブリンの可変ドメインの個々のCDR部分（「相補性決定領域」）からなる人工構築体(Jones, P.T.et al. Nature, 321, 522, 1986; Riechmann, L. et al., Nature 332, 323, 1988; Verhoeyen, M. et al. Science, 239, 1534, 1988)も、本発明の目的に含まれる。
好ましい具体例では、VHおよびVLドメインは、VH-L-VL構築体またはVL-L-VH構築体の形態でペプチドリンカー(L)を介して連結している。このリンカーはこの場合、通常、できる限り短くあるべきであり、好ましくは約1〜20のアミノ酸、特に好ましくは約1〜5のアミノ酸長である。配列GGGGS（配列番号８）を有するリンカーが特に好ましい。
リンカー(L)とは対照的に、連結ペプチド(P)はいずれの適切な長さでもよい。しかしながら、ペプチド(P)は、好ましくは約12〜40個のアミノ酸、特には約12〜20個のアミノ酸、特定には約14個のアミノ酸を有する。特に好ましいペプチド(P)は、アミノ酸配列GGGGSGGRASGGGS（配列番号１）またはGGGGSGGRASGGGGS（配列番号２）を含んでなり、特には、該アミノ酸配列からなるペプチド(P)である。
もう１つの好ましい具体例では、本発明の分子はさらなる構成要素としてエフェクター(E)を含んでなる。このエフェクターは直接、あるいは適当であれば、コネクター(B)を介して本発明の分子に連結させることができる。コネクター(B)はプロテアーゼ切断配列、好ましくはPSA（プロテアーゼ特異的抗原）カテプシン、プラスミノーゲンおよび／またはプラスミノーゲンアクチベーター切断配列を含んでなることが特に好ましい。
プロテアーゼ切断配列は、プロテアーゼの使用により、本発明の分子からエフェクターを分離することを可能にするので特に好ましい。エフェクターの活性が直接、またはコネクターによって間接的に本発明の分子に結合しているエフェクターのために阻害される場合、この分離は特に有利である。
プロテアーゼは特に炎症領域内、または腫瘍内に存在するので、プロテアーゼ切断配列を介する本発明の分子へのそれらの結合のために優先的に不活性化されているエフェクターは、そこで大量の局所遊離を受ける。さらに、例えば、腫瘍細胞上の抗原、腫瘍を伴う内皮細胞上の抗原、または例えば、リンパ球またはマクロファージなどの炎症細胞上の抗原に対して特異性を有する本発明の分子に適した標的構造を選択することにより、例えば炎症領域または腫瘍領域で、エフェクターとともに本発明の分子を集積することが達成できる。
また、本発明によれば、いくつかのエフェクターを本発明の分子に直接または間接的に結合させることができる。
プロテアーゼまたは適切な切断配列については、例えばDE1970430.1に詳細に記載されている。
分子にコネクターを介して結合するエフェクターを有する本発明の好ましい分子の一例は、図２に図示されている。
本発明の分子における個々の構成要素は、通常、適用される範囲に従って選択される。
そこで、例えばさらなる具体例において、本発明の分子を診断目的として用いれば、第１の特異性(A)は分析すべき分子に向けられ、第２の特異性(B)は直接または間接的に分析物質に向けられる。分析物質は例えば、放射性分子、蛍光分子、またはその酵素活性によって分析物質の前駆体を活性のある分析物質に変換する酵素であり得る。
もう１つの具体例では、第１の特異性(A)は分析すべき分子に向けられ、第２の特異性(B)は分析すべき別の分子に向けられ、また、エフェクター(E)は分析物質、例えば、放射性分子、蛍光分子および／またはずでに前記で詳細に説明したような酵素である。
しかしながら、本発明の分子を、ウイルスまたは非ウイルスベクターの標的細胞特異的結合のためのリガンドとして用いることもできる。好ましい具体例では、本発明の分子をいわゆる多機能性リガンドとして用いることができる。ペプチド(P)およびエフェクター(E)がフゾジェニックペプチドを含めば、この目的には都合がよい。多機能性リガンドはヌクレオチド配列の標的細胞特異的導入のために働き、これは一般に、標的細胞特異的リガンド、遺伝子構築体特異的リガンドおよびフゾジェニックペプチドを含んでなるタンパク質である。この種の多機能性リガンドは、遺伝子構築体、すなわち核酸構築体を標的細胞に特異的に結合させるために用いることができ、フゾジェニックペプチドが、核酸構築体を細胞膜を通じて細胞核へと透過させ、次いでエンドソームから遊離させることも可能にする。
本発明の分子の、ベクターのリガンドとしての、または多機能性リガンドとしての使用においては、第１の特異性(A)を標的細胞に向け、第２の特異性(B)をベクターに向けることが有利である。このベクターは一般に、核酸、陽イオンペプチドまたはタンパク質、陽イオン脂質、陽イオンペプチドまたは陽イオンポルフィリンである。本発明の特に好ましい具体例では、ベクターは、例えばアデノウイルス(AdV)、アデノ随伴ウイルス(AAV)、ワクシニアウイルス、RSV、HSV、インフルエンザウイルスまたはレンチウイルスに由来するウイルスベクターである。
免疫グロブリンに由来する、すなわち、VHおよびVLドメインを含んでなる標的細胞特異的リガンド、標的細胞の膜構造、標的細胞特異的リガンド、および遺伝子構造特異的リガンド、ならびにフゾジェニック特性を有するペプチドの例はDE19649645.4に詳細に記載されている。
また本発明の分子は、予防および／または治療薬として適している。
これらの目的のためには、例えば、第１の特異性(A)は、例えば、リンパ球、マクロファージ、単球、顆粒球、造血細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、横紋筋細胞、上皮細胞、肝細胞、腎細胞、グリア細胞、組織を支持する細胞、腫瘍細胞、または白血病細胞など細胞膜に対して、もしくは細胞外マトリックス、補体系、凝固系、キニン系、血漿系、支持組織系のタンパク質に対して、もしくはサイトカイン類またはケモキニン類に対して、もしくは内または外の毒素に対して、もしくは医薬、例えばジギタリスに対して、および／または例えば、細菌、ウイルスおよび／または寄生性病原体などの病原体に対して向けられる。
例えば第２の特異性(B)は、例えば、リンパ球、マクロファージ、単球、または顆粒球の細胞膜に対して向けられ、その結果、その標的構造との架橋がそこで細胞障害過程、免疫調節過程または炎症過程を導くことができる。
またそれを、サイトカイン類、ケモカイン類または成長因子類に向けることも可能で、その結果、その標的構造との架橋がそこで免疫調節過程または増殖過程を誘導し得る。またそれを、その活性化を開始、促進または阻害する補体系のタンパク質に対して向けてもよい。この種のタンパク質の標的構造との架橋は、タンパク質の選択により、血栓症を誘導または回避し得る。さらにそれを、標的構造の繊維素塊の溶解のもたらす繊維素溶解タンパク質に、不活性な薬剤前駆体を標的構造に対して活性のある、例えば毒性のある薬剤に変換することが可能な酵素に、ペプチドホルモンまたはステロイドホルモンに、免疫グロブリンの不変部分に、例えば、ヒスタミン、セロトニン、ロイコトリエン、プロスタシクリンまたはキニンなどの伝達物質に、細菌、ウイルスおよび／または病原寄生生物などの病原体に、もしくは腫瘍細胞に向けてもよい。
標的構造としてのサイトカイン類、もしくは標的構造としての単球、マクロファージおよび／またはリンパ球は、本発明の分子により感染性抗原または腫瘍抗原と架橋し、それによりin vivoでその抗原に対する免疫応答をの増強を誘導することができる。この連結においては、病原体の、または腫瘍の特定の抗原、および適当であればサイトカインをも、本発明の分子に付加し、さらに、この架橋複合体を局所投与または注射することが有利である。
また第２の特異性(B)を、標的細胞に対する毒素および食作用、またはその他の毒性反応の中和のいずれかを引き起こし得るよう、内または外毒素に向けることもできる。さらに、その医薬の複合体化および排出を引き起こすよう、例えばジギタリスなどの医薬に向けてもよい。
もう１つの具体例では、エフェクターを伴う本発明の分子は、２つの同一のまたは異なる標的構造と１以上のエフェクターとの架橋を可能にする。
適切なエフェクターの例としては、受容体のトランスメンブランドメイン、糖リン脂質アンカー、リガンド結合部；受容体のリガンド、またはリガンドの受容体結合部配列；ペプチドホルモン；サイトカイン；成長因子；成長因子阻害剤；ケモカイン；インターフェロン；伝達物質；循環に作用するペプチド；不活性な薬剤前駆体を活性薬剤に変換する酵素；凝固を活性化または阻害するタンパク質；繊維素溶解を活性化または阻害するタンパク質；補体系を活性化または阻害するタンパク質；免疫グロブリンの１以上の不変ドメイン；細胞障害性ペプチド、他の一本鎖の、一または多、特に二抗原結合分子；腫瘍抗原、または例えば、細菌抗原またはウイルス抗原などの病原体の抗原；システインを含んでなり、本発明の分子の二量体を形成するペプチド；および／または二量体または多量体ペプチドがある(Pluckthun and Pack, Immunotechnol. 3, 83-105 (1997))。
本発明のもう１つの態様は、本発明の分子をコードする核酸である。核酸は一般に、ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくは二重らせんＤＮＡである。
適当であれば必要とされる、本発明の発現産物の分泌のためには、本発明の核酸は5'末端にシグナルまたはトランスメンブラン配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなる（例えば、DE19639103.2またはDE19651443.6を参照）。適切なシグナルまたはトランスメンブラン配列の一例には、免疫グロブリンのシグナル配列（ＤＮＡ位63〜107）、CEAのシグナル配列（ＤＮＡ位33〜134）、またはヒト気道融合ウイルス糖タンパク質（アミノ酸配列38〜50または48〜65のｃＤＮＡ）がある。
もう１つの具体例では、本発明の核酸は5'末端にプロモーターおよび／またはアクチベーターを含んでなる。このアクチベーターは、細胞特異的に、細胞周期特異的に、代謝特異的に、および／または薬剤により活性化、もしくは抑制され得ることが好ましい。この種のアクチベーターは、その組み合わせも含め、EP97101507.8、DE19617851.7、DE19639103.2、DE19651443.6、DE19704301.1、EP97102547.3およびDE19710643.9に記載されている。本発明の特に好ましい核酸構築体は、図３および４に図式で示されている。
  好ましい具体例では、本発明の核酸は、開始コドンの5'末端に配列GCCACCまたはGCCGCCを含んでなり、これが転写の増強をもたらし得る。
本発明のもう１つの具体例は、本発明の核酸を含んでなるベクターに関する。ベクターはこの場合、ウイルスまたは非ウイルスベクターであってよく、特に陽イオン脂質、陽イオンポリマー、陽イオンペプチド、または陽イオンポルフィリンから選択される非ウイルスであることが好ましい。
本発明の分子を製造するためには、記載の核酸を発現ベクター、例えば、適切なプラスミド中にクローン化し、次いで適切な細胞、例えば、細菌、酵母、昆虫または哺乳類細胞に導入し、このようにして形質転換またはトランスフェクトされた細胞を培養し、適当であればその発現産物を単離する。この方法は一般に当業者に公知であり、例えば、Sambrook J. et al. Molecular Cloning, A Laboratory Handbook 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に詳細に記載されている。
本発明の特に好ましい具体例では、これらの細胞はエフェクターを有する本発明の分子を発現し、このエフェクターは好ましくはトランスメンブランドメインである。
このように、例えば、ヒトマクロファージコロニー刺激因子のトランスメンブラン配列をコードするＤＮＡ配列（ＤＮＡ位1485〜1554）、またはヒト気道融合ウイルス(RSV)糖タンパク質Gのシグナルおよびトランスメンブラン領域をコードするＤＮＡ配列（アミノ酸1〜63、またはその部分配列アミノ酸38〜63）、またはインフルエンザウイルス・ノイラミニダーゼのシグナルおよびトランスメンブランをコードするＤＮＡ配列（アミノ酸7〜35またはその部分配列アミノ酸7〜27）を、遺伝子の3'において本発明の分子のプロモーター配列とＤＮＡ配列その他の間に挿入することができる。
しかしながら、本発明の分子を発現する細胞の細胞膜に薬剤をつなぎ留めるために、核酸構築体へ糖リン脂質アンカーをコードするヌクレオチド配列を挿入することもできる。
糖リン脂質アンカーの挿入は通常、本発明の分子をコードするヌクレオチド配列の3'末端で起こり、さらにシグナル配列の挿入も起こり得る。
糖リン脂質アンカーは、例えば、CEAに関して、N-CAMに関して、また例えばThy-1などの膜タンパク質に関して記載されている。
このトランスメンブラン領域のために、特定の細胞がその細胞膜上で本発明の分子を発現し、かくして、本発明の分子の抗原結合部分により認識される標的またはエフェクター構造に特異的な「受容体」をつなぎ留める。
もう１つの好ましい受容体は、受容体、例えばＴ細胞受容体またはM-CSF受容体のトランスメンブラン形質導入ドメインまたはシグナル形質導入ドメインである。これによりその細胞膜上で本発明の分子を発現する細胞を、標的構造の特異的官能基への結合により活性化させることができる。この種の特異的作用は、例えば、Ｔリンパ球の細胞障害性反応、マクロファージおよび顆粒球の食作用反応、ならびに顆粒球、単球およびマクロファージのエキソサイトーシスであり得る。
従って、本発明のもう１つの態様は、本発明の核酸、または本発明のベクター、特に細菌、昆虫、酵母または哺乳類細胞を含んでなる細胞である。適切な哺乳類細胞としては、例えば、CHOまたはBHK細胞など、核酸を発現するものとして一般に知られている細胞の他、リンパ球、マクロファージ、グリア細胞、上皮細胞、肝細胞、腎細胞、骨髄細胞、内皮細胞、平滑または横紋筋細胞、または繊維素がある。
直前に記載した細胞は、遺伝子治療への適用に特に適している。なぜなら、本発明核酸構築体を含んでなるこれらの細胞は、疾患の予防または治療のため、患者へ局所的または非経口的、例えば、静脈内、動脈内、体腔内、器官内または皮下注射可能であるからである。
しかしながら、遺伝子治療による疾患の治療については、本発明の核酸構築体を患者に局所、体腔内、器官内、循環系内、皮下または筋肉内投与することも可能である。
従って、本発明のもう１つの態様はまた、本発明の分子、本発明の核酸、本発明のベクター、または本発明の細胞を含んでなる医薬、ならびにすでに詳細に前記したような分析物質にもまた向けられる、本発明の分子を含んでなる診断補助剤である。
従って、本発明の分子、本発明の核酸、本発明のベクター、または本発明の細胞は、例えば、腫瘍症、自己免疫疾患、炎症性疾患、特に血液凝固および／または循環系の血液疾患、神経系疾患、および／または感染症の治療、予防または診断に適している。
この連結における個々の構成要素の選択は、一般に、本発明の部材の使用に依存する。以下、例を挙げて個々の構成要素およびそれら使用を詳しく説明する。
本発明の部材を製造するためには、すでに図３および４において例示により示したように、本発明の核酸構築体を5'末端で、シグナル配列をコードする核酸の3'末端に連結し、次いで、後者をその5'末端でプロモーター配列の3'末端に連結することができる。
選択されるプロモーター配列としては、例えば、ＲＮＡポリメラーゼIIIのプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼIIのプロモーター、CMVプロモーターおよび／またはエンハンサーであるSV40プロモーターなど、非限定的な活性化が可能なプロモーターおよびアクチベーター配列；または、例えば、HBV、HCV、HSV、HPV、EBV、HTLV、HIVなどのウイルスプロモーターおよびアクチベーター配列が挙げられる。
HIVプロモーターの使用の際には、TAR配列[≦-453 bis≧-80位,Rosen et al., Cell 41, 813 (1985)を含む全LTR配列をウイルス特異的プロモーターとして使用することが好ましい。
選択される他のプロモーター配列としては、例えば、低酸素症により誘導可能なエンハンサーなどの代謝的に活性化され得るプロモーターおよびエンハンサー配列、例えば、cdc25C遺伝子の、cdc25B遺伝子の、サイクリンA遺伝子の、cdc2遺伝子の、B-myb遺伝子の、DHFR遺伝子の、またはE2F-1遺伝子のプロモーターなどの細胞周期特異的に活性化され得るプロモーター、もしくは細胞周期特異的に生じるか、または活性化される転写因子の結合配列がある。これらの結合配列には、例えば、c-mycタンパク質の結合配列がある。Myc E-ボックス[5'-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3']（配列番号３）として好ましい核酸配列の単量体または多量体が、これらの結合配列に含まれる。
さらに、選択されるプロモーター配列としては、例えば、対応するリプレッサーと組み合わせたテトラサイクリンオペレーターなどの、テトラサイクリンにより活性化され得るプロモーター、またはキメラプロモーターがある。キメラプロモーターとは、細胞特異的に、代謝またはウイルス特異的に活性化が可能で、上流に置かれたアクチベーター配列と、下流に置かれプロモーターモジュールとの組み合わせであり、これは、サプレッサータンパク質が結合し、それにより細胞周期のGOおよびG1期において、上流に置かれたアクチベーター配列の活性化を阻害することができるCDE-CHRまたはE2FBS-CHR核酸配列を含んでなる(WO96/06943;Lucibello et al., EMBO J. 14, 132(1995))。
選択される他のプロモーター配列には、例えば、好ましくは選択された細胞で産生されることが好ましいタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー由来のプロモーターまたはアクチベーター配列などの、細胞特異的に活性化され得るプロモーターがある。
例えば、好ましくは、以下の細胞において、以下のタンパク質のプロモーターを、本発明の目的のために使用する：
内皮細胞で活性化されるプロモーターおよびアクチベーター配列としては、例えば、下記タンパク質：脳特異的内皮グルコース1輸送体、エンドグリン、VEFG受容体1(flt-1)、VEGF受容体2(flk-1, KDR)、til-1、またはtil-2、B61受容体(Eck受容体)、B16、エンドセリン、特にはエンドセリンBまたはエンドセリン1、エンドセリン受容体、特にはエンドセリンB受容体、マンノース6-リン酸受容体、フォンビルブラント因子（von Willebrand factor）、IL-α、IL-1β、IL-1受容体、血管細胞接着分子(VCAM-1)をコードする遺伝子由来の遺伝子調節配列、あるいは内皮細胞で優先的にまたは選択的に活性を有する転写因子の結合部位がオリゴマー化したものからなる合成アクチベーター配列がある。それらの一例は、その結合部位がエンドセリン1遺伝子の5'-TTATCT-3'である、転写因子GATA-2である。
活性化された内皮細胞に隣接した細胞で活性化されるプロモーターまたはアクチベーター配列としては、例えば、下記タンパク質：VEGF（この場合、このVEGF遺伝子の遺伝子調節配列は、5'フランキング領域、3'フランキング領域、c-Src遺伝子またはv-Src遺伝子である）をコードする遺伝子由来の遺伝子調節配列、もしくはステロイドホルモン受容体およびそれらのプロモーターエレメント、特にはマウス乳癌ウイルスプロモーターがある。
筋細胞、特に平滑筋細胞で活性化されるプロモーターまたはアクチベーター配列としては、例えば、下記タンパク質：トロポミオシン、α-アクチン、α-ミオシン、PDGFの受容体、FGFの受容体、MRF-4、ホスホフルクトキナーゼA、ホスホグリセレートムターゼ、トロポニンC、ミオゲン、エンドセリンAの受容体、デスミン、VEGF（前記参照）をコードする遺伝子由来の遺伝子調節配列、「人工」プロモーター、またはヘリックス・ループ・ヘリックス(HLH)ファミリー(MyoD、Myf-5、ミオゲン、MRF4)またはジンクフィンガータンパク質GATA-4の因子などの筋肉特異的転写因子のプロモーターがある。
HLHタンパク質およびGATA-4は、筋肉特異的遺伝子のプロモーターを伴って筋肉特異的転写を示すばかりでなく、異種の場合でも、さらには人工プロモーターを伴っても筋肉特異的転写を示す。この種の人工プロモーターの例としては、Eボックス(Myo D)などの筋肉特異的HLHタンパク質の（ＤＮＡ）結合部位の多重コピー（例えば、4x AGCAGGTGTTGGGAGGC）（配列番号４）、またはα-ミオシン重鎖遺伝子GATA-4のＤＮＡ結合部位の多重コピー（例えば、5'-GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG3'）（配列番号５）がある。
グリア細胞で活性化されるプロモーターおよびアクチベーター配列には、例えば、下記タンパク質：シュワン細胞特異的タンパク質ペリアキシン、グルタミンシンテターゼ、グリア細胞特異的タンパク質（グリア繊維酸性タンパク質=GFAP）、グリア細胞タンパク質S100b、IL-6、CNTF、5-HT受容体、TNFα、IL-10、インスリン様成長因子受容体IおよびII、またはVEGF（前記参照）をコードする遺伝子由来の遺伝子調節配列がある。
造血細胞で活性化されるプロモーターおよびアクチベーター配列としては、例えば、造血細胞、または例えばストロマなどの近傍細胞で発現するサイトカインまたはその受容体の遺伝子のプロモーター配列がある。
これらは、例えば、下記サイトカイン類およびそれらの受容体：幹細胞因子受容体、幹細胞因子、IL-1α、IL-1受容体、IL-3、IL-3受容体、（αサブユニット）、IL-3受容体（βサブユニット）、IL-6、IL-6受容体、GM-CSF、GM-CSF受容体、（α鎖）、IL-6によりIFNγまたはIFNβによるのと同程度まで活性化されるIRF-1のプロモーターを伴うインターフェロン調節因子1(IRF-1)、エリトロポエチンまたはエリトロポエチン受容体をコードする遺伝子由来のプロモーター配列を含む。
リンパ球および／またはマクロファージで活性化されるプロモーターおよびアクチベーター配列としては、例えば、サイトカイン類、サイトカイン受容体、および接着分子、ならびに例えば、IL-1受容体、IL-1α、IL-1a、IL-2、IL-2受容体、IL-3、IL-3受容体（αサブユニット）、IL-3受容体（βサブユニット）、IL-4、IL-4受容体、IL-5、IL-6、IL-6受容体、インターフェロン調節因子1(IRF-1)、IL-6によりIFNγまたはINFβによるのと同程度まで活性化されるIRF-1のプロモーター、IFNγ応答プロモーター、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IFNγ、GM-CSF、GM-CSF受容体（α鎖）IL-3、LIF、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)受容体、I型およびII型マクロファージスカベンジャー受容体、MAC-1（白血球機能に関連する抗原）、LFA-1α（白血球機能に関連する抗原）またはp150,95（白血球機能に関連する抗原）をコードする遺伝子のプロモーターおよびアクチベーター配列がある。
骨膜細胞で活性化されるプロモーターおよびアクチベーター配列としては、例えば、MMP-1（間質性コラゲナーゼ）、MMP-3（ストロメライシン／トランシン）などのマトリックスメタロプロテナーゼ(MMP)、またはTIMP-1、TIMP-2、TIMP-3などのメタロプロテナーゼ(TIMP)の組織阻害剤をコードする遺伝子のプロモーター配列がある。
白血病細胞で活性化されるプロモーターおよびアクチベーター配列としては、例えば、下記タンパク質：HSP-70、bcl-1/サイクリンD-1、bcl-2、IL-6、IL-10、TNFα、TNFβ、HOX-11、BCR-Abl、E2A-PBX-1、PML-RAR（前骨髄性白血病レチノイン酸受容体）、またはc-myc（ここで、c-mycタンパク質は、MycEボックス(5'-GGAAGCAGACCAGCTGGTCTGCTTCC-3')（配列番号６）と呼ばれる多量体核酸配列に結合して、これを活性化する）をコードする遺伝子のプロモーターがある。
腫瘍細胞で活性化されるプロモーターおよびアクチベータ一配列としては、例えば、腫瘍細胞で形成されるか、または活性を有する転写因子が相互作用する遺伝子調節核酸配列がある。
本発明の目的のために好ましいプロモーターまたはアクチベーター配列としては、特に腫瘍細胞または肉腫細胞で産生されるタンパク質をコードする遺伝子調節配列または遺伝子エレメントがある。このように、好ましくは、小細胞気管支癌にはN-CAMタンパク質のプロモーターが用いられ、子宮癌には肝炎増殖因子またはL-プラスチンのプロモーターが、そして、膵臓癌にはL-プラスチンまたは多型性上皮ムチン(PEM)のプロモーターが用いられる。
本発明の顕著な利点は、個々の成分の結合がヘテロ二量体の会合に有利であり、その結果一本鎖多抗原結合分子が優先的に形成されることにある。scFv断片に関して示したように、二量体の解離もまた低下する（例えば、Glockshuber et al., Biochem. 29, 1362-1367, 1990参照）。このように、本発明の分子は、いわゆる「ジアボディー」よりも、たとえそれがジスルフィドで安定化されていたり、または「ノブ・イントゥー・ホールジアボディー」の形態であったとしても、比較的煩雑でなく、かつ、均一な形態で製造することができる。
さらに、本発明の分子を製造するためには、１つのシグナル配列と１つのリボソーム結合部位(RBS)しか必要としない。これに対し、本発明の「ジアボディー」の場合には、各鎖に、シグナル配列とRBSが必要とされる。本発明のもう１つの利点は、「ジアボディー」の２鎖の発現の際には、等モル量でない可変ドメインが発現し、かくして、機能のないホモ二量体の産生が増加する本発明の分子を用いると等モル量の可変ドメインが発現することである。
本発明の分子のもう１つの利点は、簡単、かつ、細菌と酵母、バキュロウイルスと真核細胞の双方の機能的形態で発現し得ることである。さらには、本発明の分子の分泌の他にも、細胞内の、または膜と結合しているそれらを発現させることができる可能性がある（例えば、Biocca & Cattaneo, Trends Cell Biol.5, 248-252(1995)を参照）。
本発明の分子のもう１つの利点は、二重特異性抗体と同様、診断目的として、また疾患の予防および／治療薬として使用することができることである。
エフェクターおよびプロモーター配列の遺伝子は、所望される使用のために、また、形質導入される標的細胞を考慮して選択すべきである。例えば、下記の疾患のために選択されるプロモーター配列およびエフェクター遺伝子は以下の通りである。
腫瘍治療
腫瘍治療のための標的細胞は、例えば、増殖内皮細胞または内皮細胞近傍のストロマ細胞および筋細胞、あるいは腫瘍細胞または白血病細胞であり、用いられるプロモーターは、例えば、内皮細胞特異的かつ細胞周期特異的、または細胞非特異的または筋細胞特異的かつ細胞周期特異的、または腫瘍細胞特異的（固形腫瘍、白血病）かつ細胞周期特異的プロモーターであり、用いられるエフェクターは、例えば、下記遺伝子である：
細胞増殖阻害剤の遺伝子は、例えば、網膜芽細胞腫タンパク質(pRb＝p110)または関連のp107およびp130タンパク質の遺伝子である。網膜芽細胞腫タンパク質(pRb/p110)および関連のp107およびp130タンパク質はリン酸化により不活性化させる。好ましく用いられると考えられる細胞周期阻害剤の遺伝子は、発現タンパク質の不活性化部位に対して突然変異を有し、その機能がそれによって損なわれることのないものである。これらの突然変異の例が、p110について記載されている。p107タンパク質またはp130タンパク質のＤＮＡ配列も、同様の方法で変異する。P53タンパク質の遺伝子もまた適している。p53タンパク質は、例えばMDM2のような特異的なタンパク質と結合することによるか、または脱リン酸化されたC末端セリンを介してp53がオリゴマー化するかのいずれかにより、細胞内で不活性化される。このように、C末端でセリン392によりトランケートされたp53タンパク質のＤＮＡ配列を使用することが好ましい。さらに適した遺伝子としては、p21(WAF-1)の、p16タンパク質の、他のcdk阻害剤の、GADD45タンパク質またはbakタンパク質の遺伝子がある。
凝固誘導因子および血管形成阻害剤の遺伝子としては、例えば、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤1(PAI-1)、PAI-2、PAI-3、アンギオスタチン、インターフェロン(IFNα、IFNβまたはIFNγ)、血小板因子4、IL-12、TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、白血病阻害因子(LIF)、または組織因子(TF)およびその凝固促進断片の遺伝子がある。
細胞増殖抑制タンパク質および細胞障害タンパク質の遺伝子としては、例えば、パーフォリン、グランザイム、IL-2、IL-4、IL-12、例えば、そしてIFN-α、IFNβ、またはIFNγなどのインターフェロン、TNFαまたはTNFβなどのTNF、オンコスタチンM、スフィンゴミエリナーゼ、またはマガイニンおよびマガイニン誘導体の遺伝子がある。
炎症誘導物質の遺伝子としては、例えば、IL-1、IL-2、RANTES(MCP-2)単球走化性および活性化因子(MCAF)、IL-8、マクロファージ炎症性タンパク質1(MIP-1α、-β)、好中球活性化タンパク質-2(NAP-2)、IL-3、IL-5、ヒト白血病阻害因子(LIF)、IL-7、IL-11、IL-13、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、コブラ毒因子(CVF)またはヒト補体因子C3bに機能的に相当する、すなわち補体因子Bと結合することができ、因子Dによる切断の後には、C3変換酵素に相当するCVFの部分配列、ヒト補体因子C3またはその部分配列C3bの遺伝子、機能的および構造的にCVFに似たヒト補体因子C3の切断生成物の遺伝子、または例えば、サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimurium)のポーリン、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)の凝固因子、特にグラム陰性菌のモジュリン、レジオネラ属(legionellae)またはヘモフィラス・インフルエンザB型(Haemophilus influenzatype B)またはクレブシエラ属(klebsiellae)の主要外膜タンパク質またはG群ストレプトコッカス(streptococci)のM分子のような、補体を活性化するか、または炎症を誘導する細菌性タンパク質の遺伝子がある。
細胞増殖抑制物質の前駆体を活性化する酵素の遺伝子としては、例えば、不活性な前駆体（前駆薬剤）を切断して活性のある細胞増殖抑制物質（薬剤）にする酵素の遺伝子がある。この種の物質および前駆薬剤、ならびにそれら各々に関する薬剤はすでにDeonarain et al.(Br. J. Cancer 70, 786 (1994))、Mullen(Pharmac. Ther. 63, 199(1994))およびHarris et al.(Gene.Ther. 1, 170(1994))により概説されている。例えば、下記の酵素の１つのＤＮＡ配列を用いることができる：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、水痘帯状ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、細菌ニトロレダクターゼ、細菌β-グルクロニダーゼ、セカレ・セレアル(Secale cereale)由来の植物β-グルクロニダーゼ、ヒトβ-グルクロニダーゼ、例えば、マスト細胞CB-A、膵臓細胞CB-Bなどのヒト・カルボキシペプチダーゼ(CB)、または細菌カルボキシペプチダーゼ、細菌β-ラクタマーゼ、細菌シトシンデアミナーゼ、ヒト・カタラーゼまたはペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、特にヒト・アルカリ性ホスファターゼ、ヒト・プロスタチン酸ホスファターゼまたは5型酸性ホスファターゼ、オキシダーゼ、特にヒト・リシルオキシダーゼまたはヒトD−アミノ酸オキシダーゼ、特にヒト・グルタチオンペルオキシダーゼ、ヒト好酸球ペルオキシダーゼまたはヒト甲状腺ペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼまたはα-ガラクトシダーゼ。特に好ましいものは、前駆薬剤であるダウノマイシンβ-D-ガラクトピラノシドを細胞増殖抑制性ダウノマイシンに変換するためのβ-ガラクトシダーゼである。
自己免疫疾患および炎症の治療
自己免疫疾患および炎症の治療のための標的細胞としては、例えば、増殖性内皮細胞またはマクロファージおよび／またはリンパ球、あるいは骨膜細胞があり、用いられるプロモーターは、例えば、内皮細胞特異的かつ細胞周期特異的、またはマクロファージおよび／またはリンパ球特異的および／または細胞周期特異的、または骨膜細胞特異的および／または細胞周期特異的プロモーターであり、用いられるエフェクターには、例えば、下記遺伝子がある：
アレルギー治療のための遺伝子としては、例えば、IFNβ、IFNγ、IL-10、IL-4に対する抗体または抗体断片、可溶性IL-4受容体、IL-12またはTGFβの遺伝子がある。
移植器官の拒絶反応防止のための遺伝子としては、例えば、IL-10、TGFβ、可溶性IL-1受容体、可溶性IL-2受容体、IL-1受容体アンタゴニストまたは可溶性IL-6受容体の遺伝子がある。
抗体介在性の自己免疫疾患の治療のための遺伝子としては、例えば、TGFβ、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-12、可溶性IL-4受容体、可溶性IL-6受容体、免疫抑制抗体またはそのVHおよびVL含有断片の遺伝子がある。
細胞介在性の自己免疫疾患の治療のための遺伝子としては、例えば、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、TNFαまたはTNFβ、IL-13、免疫抑制抗体またはそのVHおよびVL含有断片の遺伝子がある。
細胞増殖、細胞増殖抑制または細胞障害タンパク質、および細胞増殖抑制物質の前駆体を活性化する酵素の阻害剤の遺伝子は、すでに前記にて詳細に記載されている。
関節炎の治療のための遺伝子としては、例えば、その発現タンパク質が、例えば間接部において直接または間接的に炎症を抑制し、かつ／または関節部において細胞外マトリックス（軟骨部組織、結合組織）の再構成を促進する構造遺伝子がある。
これらには、例えば、IL-1-RAがIL-1α、βの生成を阻害するがゆえに、IL-1受容体アンタゴニスト(IL-1-RA)；可溶性IL-1受容体がIL-1と結合して不活性化するがゆえに、可溶性IL-1受容体；IL-6がTIMPおよびスーパーオキシドの分泌を増加させ、かつ、骨膜細胞および軟骨細胞によるIL-1およびTNFαの分泌を減少させるがゆえに、IL-6；可溶性TNF受容体がTNFと結合して不活性化するがゆえに、可溶性TNF受容体；IL-4がIL-1、TNFαおよびMMPの生成および分泌を阻害するがゆえに、IL-4；IL-10がIL-1、TNFαおよびMMPの生成および分泌を阻害し、かつ、TIMPの分泌を増加させるがゆえに、IL-10；IGF-1が細胞外マトリックスの合成を刺激するがゆえに、インスリン様成長因子(IGF-1)；TGFβが細胞外マトリックスの合成を刺激するがゆえに、TGFβ、特にTGFβ1およびTGFβ2；スーパーオキシドジスムターゼまたはTIMP、特にTIMP-1、TIMP-2またはTIMP-3が含まれる。
造血系の治療
血球細胞の欠陥形成の治療のための標的細胞としては、例えば、造血系の増殖性未熟細胞または造血細胞近傍のストロマ細胞があり；用いられるプロモーターは、例えば、造血細胞に特異的であり、かつ／または細胞周期特異的、または細胞非特異的かつ細胞周期特異的なプロモーターであり、用いられるエフェクターは、例えば、下記遺伝子である：貧血症治療のための遺伝子としては、例えば、エリトロポエチンの遺伝子がある。
白血球減少症治療のための遺伝子としては、例えば、G-CSF、GM-CSFまたはM-CSFの遺伝子がある。
血小板減少症治療のための遺伝子としては、例えば、IL-3、白血病阻害因子(LIF)、IL-11またはトロンボポエチンの遺伝子がある。
神経系の治療
神経系損傷の治療のための標的細胞としては、例えば、グリア細胞または増殖性内皮細胞があり、用いられるプロモーターは、例えば、グリア細胞特異的かつ細胞周期特異的、または内皮細胞特異的かつ細胞周期特異的、または非特異的かつ細胞周期特異的プロモーターであり、用いられるエフェクターは、例えば、下記遺伝子である：
ニューロン成長因子遺伝子としては、例えば、FGF、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン-3(NT-3)、ニューロトロフィン-4(NT-4)または繊毛神経栄養因子(CNTF)の遺伝子がある。
酵素遺伝子としては、例えば、チロシンヒドロキシラーゼまたはドーパデカルボキシラーゼの遺伝子がある。
サイトカイン類およびTNFαの神経障害作用を阻害または中和するそれらの阻害剤の遺伝子としては、例えば、TGFβの遺伝子；TNF受容体がTNFαを中和するがゆえに、可溶性TNF受容体の遺伝子；IL-10がIFNγ、TNFα、IL-2およびIL-4の生成を阻害するがゆえに、IL-10の遺伝子；可溶性IL-1受容体がIL-1の活性を中和するがゆえに、IL-1受容体IまたはIL-1受容体IIなどの可溶性IL-1受容体の遺伝子；IL-1 受容体アンタゴニストまたは可溶性IL-6受容体の遺伝子がある。
血液凝固および循環系の治療
血液凝固および循環系障害の治療のための標的細胞としては、例えば、内皮細胞、増殖性内皮細胞、内皮細胞の近傍にある体細胞および平滑筋細胞またはマクロファージがあり、用いられるプロモーターは、例えば、細胞非特異的かつ細胞周期特異的プロモーター、または内皮細胞、平滑筋細胞またはマクロファージ特異的かつ細胞周期特異的プロモーターであり、用いられるエフェクターは、例えば、下記遺伝子である：
凝固を阻害または繊維素を溶解する遺伝子としては、例えば、組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター(uPA)の遺伝子、tPAとuPAのハイブリッドの遺伝子、タンパク質C、ヒルジンの遺伝子、例えば、C-1S阻害剤のようなセリンプロテナーゼ阻害剤（セルピン）、α1-抗トリプシンまたは抗トロンビンIIIの遺伝子、または組織因子経路阻害剤(TFPI)の遺伝子がある。
凝固を促進する遺伝子としては、例えば、FVIII、FIX、フォンビルブラント因子、FXIII、PAI-1、PAI-2または組織因子およびその断片の遺伝子がある。
血管形成因子の遺伝子としては、例えば、VEGFまたはFGFの遺伝子がある。
血圧を低下させる遺伝子としては、例えば、カリクレインまたは内皮細胞「酸化窒素シンターゼ」の遺伝子がある。
内皮層の損傷後の平滑筋細胞の増殖を阻害する遺伝子としては、例えば、抗増殖タンパク質、細胞増殖抑制タンパク質または細胞障害タンパク質の遺伝子、またはすでに前記したような細胞増殖抑制物質の前駆体を細胞増殖抑制物質へと分割する酵素の遺伝子、または例えば、筋細胞に特異的な抗体または抗体断片などの、リガンドを有するこれらの薬剤の１つの融合タンパク質の遺伝子がある。
他の血漿タンパク質遺伝子としては、例えば、アルブミン、C1インアクチベーター、血清コリンエステラーゼ、トランスフェリンまたは1-アンチトリプシンの遺伝子がある。
感染症の予防および／または治療
接種用標的細胞としては、例えば、筋細胞またはマクロファージおよび／またはリンパ球があり、用いられるプロモーターは、例えば、非特異的かつ細胞周期特異的、または標的細胞特異的かつ細胞周期特異的プロモーターであり、用いられるエフェクターは、例えば、感染症の予防のための遺伝子がある。
一般に選択される活性物質は、病原体により産生され、かつ、免疫応答を導入することにより、すなわち抗体結合および／または細胞障害性Ｔリンパ球によって、病原体の中和および／または死滅に導くタンパク質のＤＮＡである。いわゆるこの種の抗原の中和はすでにワクチン抗原として使用されている（例えば、Ellis, Adv. Exp. Med. Bio.327, 263 (1992)を参照）。
本発明の目的のためには下記病原体の抗原を中和する核酸コーディングが好ましい：インフルエンザAウイルス、HIV、狂犬病ウイルス、HSV（単純ヘルペスウイルス）、RSV（気道融合ウイルス）、パラインフルエンザウイルス、ロタウイルス、VZV（水痘・帯状ヘルペスウイルス）、CMV（サイトメガロウイルス）、はしかウイルス、HPV（ヒトパピローマウイルス）、HBV（B型肝炎ウイルス）、HCV（C型肝炎ウイルス）、HDV（D型肝炎ウイルス）、HEV（E型肝炎ウイルス）、HAV（A型肝炎ウイルス）、ビブリオ・コレラ(Vibrio cholerae)抗原、ボレリア・バーグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)またはマラリア抗原。
本発明の目的のためのこの種の活性物質もまた、抗イディオタイプ抗体のＤＮＡ、またはその抗原結合断片のＤＮＡを包み、この抗体の抗原結合構造（相補性決定領域）は病原体の抗原を中和するタンパク質または炭水化物構造の複写に相当する（前記参照）。
この種の抗イディオタイプ抗体およびそれらの切断生成物は、特に病原菌の炭水化物抗原を置換することができ、例えばHawkins et al.(J. Immunother. 14, 273 (1993))およびWesterink and Apicella(Springer Seminars in Immunopathol. 15, 227 (1993))により概説されている。
他のエフェクターの例としては、「腫瘍ワクチン」遺伝子がある。これらには、例えば、Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, Munich (1988)およびContrib. to Oncol. 43, Karger Verlag, Munich (1992)によい概説されているように、腫瘍細胞の抗原が含まれる。
他の例としては、下記抗原または下記抗イディオタイプ抗体の遺伝子がある：シアリルールイス；T細胞により認識される腫瘍のペプチド；癌遺伝子により発現されるタンパク質；血液型抗原およびそれらの前駆体；多型性上皮ムチンの抗原；または熱ショックタンパク質の抗原。
慢性感染症の治療のための標的細胞としては、例えば、肝細胞、リンパ球および／またはマクロファージ、上皮細胞または内皮細胞であり、用いられるプロモーターは、例えば、ウイルス特異的または細胞特異的かつ細胞周期特異的プロモーターであり、用いられるエフェクターは、例えば、下記遺伝子である：
細胞増殖抑制作用、アポトーシス作用または細胞障害作用を有するタンパク質をコードする遺伝子、または抗ウイルスまたは細胞障害性物質の前駆体を、活性物質へと切断する酵素をコードする遺伝子。
抗ウイルス活性を有するサイトカイン類のような抗ウイルスタンパク質、および、例えば、IFNα、IFNβ、IFNγ、TNFβ、TNFα、IL-1またはTGFβなどの成長因子、または特定のウイルスを不活性化する特異性を有する抗体、またはそのVHおよびVL含有断片、またはすでに記載されているように、リンカーを介して連結されたそのVHおよびVL断片をコードする遺伝子。ウイルス抗原に対する抗体の例としては、抗HBV、抗HCV、抗HSV、抗HPV、抗HIV、抗EBV、抗HTLV、抗コクサッキーウイルスまたは抗ハンタンウイルスがある。
もう１つの抗ウイルス活性を有するタンパク質としては、rev結合タンパク質がある。これらのタンパク質はrevＲＮＡと結合し、レトロウイルス遺伝子発現のrev依存性転写後段階を阻害する。rev結合タンパク質の例としては、RBP9-27、RBP1-8U、RBP1-8DまたはRBP1-8の偽遺伝子がある。
例えば、細菌毒素を中和する、または細菌にオプソニンを作用させる抗体のような抗菌タンパク質をコードする遺伝子。これらの例としては、メニンゴコッキ(meningococci)CまたはB、大腸菌、ボレリア、シュードモナス(Pseudomonas)、ヘリコバクター・ピロリまたはスタフィロコッカス・アウレウスに対する抗体がある。
以下、図面および実施例により本発明を詳しく説明するが、それらに限定するものではない。
実施例1 ：一本鎖二価抗原結合タンパク質の製造および細菌による発現
癌胎児性抗原(CEA)および大腸菌β-ガラクトシダーゼなどの抗原を認識するタンパク質の例を用いる一本鎖二価抗原結合タンパク質の製造方法を記載する。
下記ＤＮＡ配列は、以下のように5'から3'方向に共に連結した：
LacZプロモーター
細菌リボソーム結合構造体(AAGGAG)
細菌シグナル配列pelB(Power et al., Gene 113, 95-99(1992))
VH抗CEA(Kontermann et al., Immunotechnol. 3, 137(1997))
リンカーGGGS（配列番号８）(Kontermann et al., (1997))
VL抗β-ガラクトシダーゼ(Kontermann et al., (1997))
結合ペプチドGGGGSGGRASGGGGS（配列番号２）
VH抗β-ガラクトシダーゼ(Kontermann et al., (1997))
リンカーGGGGS
VL抗CEA(Kontermann et al., (1997)）
抗体9E10 EQKLISEEDLN（配列番号９）のMycエピトープ(Munro & Pelham, Cell 46, 291-300(1986))
-IMACによるポリヒスチジンHHHHHH（配列番号１０）精製物(Kontermann et al., (1997))
この構築体の結合は、種々のＤＮＡ配列の末端におけるPCR増幅により包含された適切な制限部位により可能となる(Kontermann et al., Immunotechnol. 3, 137(1997))。
この結合は、当業者に公知の制限部位に特異的な酵素およびＤＮＡリガーゼを用いて行った。これらの酵素は商業的に入手可能である。この構築体を、細菌発現ベクターpAB1中にクローン化した(Kontermann et al., (1997))。
クローニングは、オリゴヌクレオチドプライマーLMB2およびLMB3(Kontermann,RE. (1997), 同上)および
VK-NotFor：5'-TTG TTC TGC GGC CGC CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT GCC AGC ACC-3'（配列番号１１）、
scDb-AscBack：5'-TGC ATG CTA GGG CGC GCC TCG GGC GGA GGT GGC TCA CAG GTG CAG CTG GTG CAA TCT GG-3'（配列番号１２）、
scDb-AscForK：GCT CGG TAA GGC GCG CCC ACC GCT GCC ACC GCC TCC ACC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC-3'（配列番号１３）および
pelB-Metminus：5'-TTA CTC GCG GCC CAG CCG GCC ACG GCC CAG GT-3'（配列番号１４）を用いて行った。
この目的のために、ジアボディーCEAGal(Kontermann, R.E. (1997))由来の断片VHB-VLA(断片1)およびVHA-VLB(断片2)を、プライマーLMB2およびLMB3を用いて増幅し、ゲル精製した。次いで、Ascl部位およびリンカーの7個のアミノ酸を導入するために、断片1をプライマーVK-NotForおよびscDb-AscBackを用いて増幅した。Asc1部位およびリンカーの8個のアミノ酸を導入するためには、断片2をプライマーLMB3およびscDb-AscForλを用いて増幅した。これらの断片をAsclおよびNotl(断片1)、およびSfilおよびAscl(断片2)とともに加水分解して、細菌発現ベクターpAB1中にクローン化した(Kontermann, R.E. (1997))。得られた挿入配列は、VHA-VLBが15個のアミノ酸長の配列GGGGSGGRASGGGGS（配列番号２）を有するリンカーを介してVHB-VLAと結合している一本鎖ポリペプチドをコードする。
次いで、このプラスミドをTG1細菌に挿入し、当業者に公知の方法によりこれらを培養した(Kontermann, R.E. (1997))。
この細菌を破砕し、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)(Hochuli et al., Bio/Techn. 6, 1321-1325(1988))により、一本鎖二価抗原結合タンパク質を細胞周辺調製物から精製した。この方法の詳細については、Kontermann et al., (1997)に記載されている。
精製タンパク質の分子量は60kDaであることがSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲル濾過により示されている。細菌培養液1リットルにつき、この分子を約200ないし300μｇ精製することが可能である。細菌により発現された一本鎖二価抗原結合タンパク質は、ELISAにおいてCEAおよびβ-ガラクトシダーゼと反応し、O-ニトロフェニルβ-D-ガラクトピラノシドの変換により示されたように、プラスチック結合CEAに酵素を補充することができる（図6）。さらに、この一本鎖二価抗原結合タンパク質は、β-ガラクトシダーゼの補充および基質5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-D-ガラクトピラノシド(X-Gal)の変換により生存および固定CEA発現LoVo細胞を染色することができた。このために、LoVo細胞を、10μg/mlの適切な抗原結合タンパク質と10μg/mlβ-ガラクトシダーゼおよびX-Gal(PBS中0.8mg/ml、3mMシアン化カリウム鉄(III)、3mMシアン化カリウム鉄(II)とともにインキュベートした。種々の対照細胞(A549、HEK293)で、または鶏卵ライソザイムおよびβ-ガラクトシダーゼに対するジアボディー(HEL Gal；Kontermann et al.,(1997))では染色は認められなかった。
実施例2 ：一本鎖二価抗原結合タンパク質の真核細胞による発現
真核細胞における発現のためには、一本鎖二価抗原結合タンパク質のコーディング領域を真核細胞発現ベクター(pSecTagA, Invitrogen)中にクローン化し、細菌シグナル配列は、すでにベクター中に存在するIg-κシグナル配列と置換しておいた。
このためには、一本鎖構築体をプライマーLMB2およびpelB-Metminusを用いて増幅し、それによりpelBリーダー(21位)におけるメチオニンをトレオニンに置換した。次いで、これをSfilおよびEcoRIで加水分解し、ベクターpSecTagA中にクローン化した。成熟一本鎖抗原結合タンパク質は、VHAドメインのN末端に7個のアミノ酸付加(AAQPATA)（配列番号１５）を含む。
このプラスミドを、一時的にリポフェクタミン(Gibco)を用いて真核HEK293細胞にトランスフェクトした。安定した細胞をゼオシンの存在下で選択した。これらの細胞を用いる免疫蛍光実験において、小胞体ERおよびゴルジ体の染色を検出することが可能であった。さらに、35S-Met-標識細胞の上清に由来する60kDaタンパク質の免疫沈降および固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)による精製による、一本鎖二価抗原結合タンパク質の分泌を検出することも可能であった。精製タンパク質は、β-ガラクトシダーゼとCEA被覆マイクロタイタープレートとの結合、およびβ-ガラクトシダーゼのプラスチック結合CEAへの補充において機能的に活性を有する（図7）。
実施例3 ：一本鎖二価抗原結合タンパク質を分泌する細胞との共存培養によるin vitroにおける酵素の補充
in vitroにおいて一本鎖二価抗原結合タンパク質を産生するHEK293細胞およびCEA陽性LoVo細胞を共存培養することにより、補充を検討した。このために、まず、本発明のタンパク質を産生する細胞をLoVo細胞とともにトランスウェル細胞培養ディッシュ(Costar)中で培養し、膜により2つの細胞ラインを分離した。2日後にβ-ガラクトシダーゼ(10μg/ml)を加え、基質X-Galを加えることによりその補充を検出した。一本鎖二価抗原結合タンパク質を産生する細胞との共存培養時には特異的染色が認められたが、非トランスフェクトHEK293細胞を用いる対照実験においては染色は認められなかった。
LoVo細胞がA549細胞(CEA陰性)により置換される実験、および一本鎖二価抗原結合タンパク質を産生する細胞が酵素および基質とともにインキュベートされる実験でもまた同様に陰性であった。後者は、一本鎖二価抗原結合タンパク質を産生する細胞がそれ自身、酵素に結合できないことを示している。
もう１つの実験においては、一本鎖二価抗原結合タンパク質を分泌するHEK293細胞、およびLoVo細胞を、播種比率1:4〜1:24で直に共存培養した。LoVo細胞からHEK293細胞を区別するために、LoVo細胞を加える前に前者をCM-Dil(Molecular Probes)(赤色蛍光)で染色した。2日後に、β-ガラクトシダーゼを加え、X-Gal(10μg/ml)の添加および抗β-ガラクトシダーゼ抗体(Biotrend)による直接免疫蛍光により、細胞への結合を検出した。これらの実験もまた、この酵素のLoVo細胞への特異的補充を示したが、HEK293細胞は染色されなかった。非トランスフェクトHEK293細胞を用いる対照実験は陰性であった。これらの実験は、一本鎖二価抗原結合タンパク質が特異的かつ選択的に腫瘍細胞を認識することを証明するものである。
さらなる実験では、無毒なダウノマイシンβ-D-ガラクトピラノシドの細胞傷害性ダウノマイシンへの変換を検討した。LoVo細胞を精製一本鎖二価抗原結合タンパク質(10μg/ml)とともに1時間インキュベートし、次いでβ-ガラクトシダーゼ(1μg/ml)およびダウノマイシンβ-D-ガラクトピラノシド(2μM)とともに37℃で1時間インキュベートすることにより、得られるダウノマイシンの核内における特異的局在を、ダウノマイシンとの直接的インキュベーションによる染色に匹敵する、基質の自己蛍光により検出することが可能であった。一本鎖二価抗原結合タンパク質またはβ-ガラクトシダーゼの不在下、および対照細胞(HEK293；一本鎖二値抗原結合タンパク質産生HEK)において核染色は検出されなかった。これらの実験は一本鎖二価抗原結合タンパク質が腫瘍細胞に酵素を補充することができ、またこの酵素は無毒の前駆体を毒性物質に変換するのに使用できることを証明している。
この作用をさらなる実験で利用して、腫瘍細胞を特異的に殺傷することが可能である。
この目的で、LoVo細胞を96ウェルプレート中で一本鎖二価抗原結合タンパク質と(10μg/ml)、次いでダウノマイシンβ-D-ガラクトピラノシド(5μM)とともに37℃にて1時間インキュベートした。2日後に、WST試験(Boehringer Mannheim)を用いて細胞の死滅を分析した（図8）。この場合、前駆薬剤の薬剤への変換の際の細胞の死滅は、薬剤の存在下とほぼ同様に良好であった（図8A）。ある成分の不在下、またはCEA陰性A549細胞を用いた場合には、実質的作用は認められなかった。（図8B）。
実施例4 ：一本鎖二価抗原結合タンパク質の細胞内発現のための構築体の製造
一本鎖二価抗原結合タンパク質の細胞内発現のために、一本鎖二価抗原結合タンパク質遺伝子のＤＮＡを種々のプライマーを用いて増幅する。
トランスメンブラン一本鎖二価抗原結合タンパク質(TM-scDAP)。このためには、遺伝子の3'末端においてトランスメンブランドメインPDGFRを挿入するプライマーが使用される。
(LPFKVVVISAIIALVVLTIISLIILIMLWQKKPRYES)（配列番号１６）
小胞体に局在する一本鎖二価抗原結合タンパク質(ER-scDAP)。このためには、遺伝子の3'末端にER保持シグナル(SEKDEL)を挿入するプライマーが使用される。
細胞質に局在する一本鎖二価抗原結合タンパク質(cyto-scDAP)。このためには、遺伝子の5'末端のシグナル配列をメチオニンおよび最適な翻訳開始のためのKozak配列に置換するプライマーが使用される。
核に局在する一本鎖二価抗原結合タンパク質(nuc-scDb)。このためには、遺伝子の5'末端のシグナル配列をメチオニンおよび最適な翻訳開始のためのKozak配列に置換するプライマー、および遺伝子の3'末端に核局在配列(PKKKRKVGGGT（配列番号１７）；核局在配列は下線)を挿入するプライマーが使用される。
これらの断片を適切な真核細胞発現ベクター中にクローン化する(pSecTagAおよびpcDNA3；Invitrogen)。次いで、得られた構築体(TM-scDAP、ER-scDAP、cyto-scDAP、nuc-scDAPおよびsec-scDAP(=分泌タンパク質；実施例2を参照))を一時的に真核細胞(3T3)中にトランスフェクトし、発現タンパク質の局在を抗Mycエピトープ抗体を用いる免疫蛍光法により調べる。分泌経路に典型的な染色は、構築体sec-scDAP、ER-scDAPおよびTM-scDAPに関して検出可能であるが、cyto-scDAPは細胞質に拡散して局在しており、nuc-scDAPは核中に局在している。
 配列表
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一本鎖二抗原結合分子の構造を図示したものである。 エフェクターを有する一本鎖二抗原結合分子の構造を図示したものである。 一本鎖二抗原結合分子をコードする核酸構築体を図示したものである。 エフェクターを有する一本鎖二抗原結合分子をコードする核酸構築体を図示したものである。 一本鎖二抗原結合分子をコードする核酸構築体を図示したものである。 本発明の一本鎖二抗原結合タンパク質によるプラスチック結合CEAに対するβ-ガラクトシダーゼの補充(scDb-CEAGal)を、CEAおよび大腸菌β-ガラクトシダーゼ(CEAGal)に対するジアボディーとの比較において示す。負の対照としては、マイクロタイタープレートをBSAで被覆した。 CEAを被覆したマイクロタイタープレートに使用されている種々の量のscDb-CEAGalおよびβ-ガラクトシダーゼを用いて、哺乳類細胞により分泌されたscDb-CEAGalによるβ−ガラクトシダーゼの補充を示す。使用した基質はo-ニトロフェニルβ-D-ガラクトピラノシドであった。負の対照としては、マイクロタイタープレートをBSAで被覆した。 Ａは、本発明の一本鎖二抗原結合タンパク質(scDb)、β-ガラクトシダーゼ（β-Gal）、ダウノマイシンβ-D-ガラクトピラノシド（前駆薬剤）および／またはダウノマイシン（薬剤）の存在下でのLoVo細胞の死滅を示す。Ｂは、CEA陰性細胞ライン(A549)を用いた対照実験を示す。

Claims (20)

  1. 下記構成要素：
    (a)第１の特異性(A)を有する免疫グロブリンの重鎖の可変ドメイン(VH)、
    (b)第２の特異性(B)を有する免疫グロブリンの軽鎖の可変ドメイン(VL)、
    (c)特異性(B)を有する免疫グロブリンの重鎖の可変ドメイン(VH)、および
    (d)特異性(A)を有する免疫グロブリンの軽鎖の可変ドメイン(VL)、（ここで、VHおよびVLドメインはVH(A)-L-VL(B)-P-VH(B)-L-VL(A)構築体の形態で連結し、特異性(A)および(B)が異なり、ペプチドリンカー(L)はそれぞれ独立して1〜5個のアミノ酸長を有し、かつペプチド(P)は12〜20個のアミノ酸長である）を含んでなる一本鎖多抗原結合分子。
  2. 該分子がさらなる構成要素として１以上のエフェクター(E)を含んでなる、請求項１に記載の一本鎖多抗原結合分子。
  3. エフェクター(E)がコネクター(B)を介して該分子に連結されている、請求項２記載の一本鎖多抗原結合分子。
  4. コネクター(B)がプロテアーゼ切断配列、好ましくはPSA、カテプシン、プラスミノーゲン、および／またはプラスミノーゲンアクチベーター切断配列を含んでなる、請求項３記載の一本鎖多抗原結合分子。
  5. 第１の特異性(A)が分析すべき分子に向けられ、かつ、第２の特異性(B)が分析物質（analyte）に向けられる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の一本鎖多抗原結合分子。
  6. 第１の特異性(A)が分析すべき分子に向けられ、第２の特異性(B)が別の分析すべき分子に向けられ、かつ、エフェクター(E)が分析物質である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の一本鎖多抗原結合分子。
  7. ペプチド(P)および／またはエフェクター(E)がフゾジェニックペプチド（fusogenic peptide）を含んでなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の一本鎖多抗原結合分子。
  8. 第１の特異性(A)が標的細胞に向けられ、かつ、第２の特異性(B)がベクターに向けられている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の一本鎖多抗原結合分子。
  9. ベクターが核酸、陽イオンペプチド、タンパク質、陽イオン脂質、陽イオンポリマー、陽イオンポルフィリン、またはAdV、AAV、ワクシニア、RSV、HSV、インフルエンザおよびレンチウイルスベクターからなる群より選択される、請求項８記載の一本鎖多抗原結合分子。
  10. 第１の特異性(A)が、細胞膜に、特にリンパ球、マクロファージ、単球、顆粒球、造血細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、横紋筋細胞、上皮細胞、肝細胞、腎細胞、グリア細胞、支持組織の細胞、腫瘍細胞または白血病細胞に、あるいは細胞外マトリックスの、補体系の、凝固系の、キニン系の、血漿の、支持組織のタンパク質に、あるいはサイトカイン類またはケモキニン類に、あるいは内または外毒素に、あるいは医薬、特にジギタリスに、および／または、特に細菌、ウイルスおよび／または病原寄生生物などの病原体に向けられる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の一本鎖多抗原結合分子。
  11. 第２の特異性(B)が、細胞膜に、特にリンパ球、マクロファージ、単球または顆粒球に、サイトカイン類、ケモカイン類または成長因子に、補体系のタンパク質に、凝固系のタンパク質に、繊維素溶解タンパク質に、不活性な薬剤前駆体を標的構造に対して活性のある、特に細胞障害性である、薬剤へと変換することができる酵素に、ペプチドホルモンまたはステロイドホルモンに、免疫グロブリンの不変部分に、特にヒスタミン、セロトニン、ロイコトリエン、プロスタシクリンまたはキニンなどの伝達物質に、病原体に、腫瘍細胞に、内または外毒素に、医薬、特にジギタリスに向けられる、請求項１〜４および１０のいずれか１項に記載の一本鎖多抗原結合分子。
  12. エフェクター(E)が、トランスメンブランドメイン、糖リン脂質アンカー、受容体のリガンド結合部分、受容体のリガンドまたはリガンドの受容体結合部分、ペプチドホルモン、サイトカイン、成長因子、成長因子阻害剤、ケモカイン、インターフェロン、伝達物質、循環に作用するペプチド、不活性な薬剤前駆体を活性のある薬剤へと変換する酵素；凝固を活性化または阻害するタンパク質；繊維素溶解を活性化または阻害するタンパク質；補体系を活性化または阻害するタンパク質；免疫グロブリンの１以上の不変ドメイン；細胞障害ペプチド；別の一本鎖、一価または多価、特に二抗原結合分子；腫瘍抗原または、例えば、細菌抗原またはウイルス抗原などの病原体の抗原；システインおよび／またはジ-または多量体形成ペプチドを含んでなるペプチドから選択される、請求項１〜４、１０および１１のいずれか１項に記載の一本鎖多抗原結合分子。
  13. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の一本鎖多抗原結合分子をコードする核酸。
  14. 請求項１３記載の核酸を含んでなるベクター。
  15. 請求項１３記載の核酸、もしくは請求項１４記載のベクターを含んでなる細胞。
  16. 請求項１５記載の細胞を培養した後、必要であれば、発現産物を単離する、一本鎖多抗原結合分子の製造方法。
  17. 請求項１〜４および１０〜１２のいずれか１項に記載の一本鎖多抗原結合分子、請求項１３記載の核酸、請求項１４記載のベクター、または請求項１５記載の細胞を含んでなる医薬。
  18. 請求項５または６に記載の一本鎖多抗原結合分子を含んでなる診断補助剤。
  19. 腫瘍、自己免疫疾患、炎症性疾患、血液の、特に血液凝固および／または循環系の疾患、神経系疾患および／または感染症の治療または予防に使用するための請求項１７に記載の医薬。
  20. 腫瘍、自己免疫疾患、炎症性疾患、血液の、特に血液凝固および／または循環系の疾患、神経系疾患および／または感染症の診断に使用するための請求項１８に記載の診断補助剤。
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