JP2000106886A - ガン遺伝子またはウイルスにより制御された発現系 - Google Patents

ガン遺伝子またはウイルスにより制御された発現系

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ロルフ、ミューラー
Hans-Harald Sedlacek
ハンス‐ハラルト、ゼトラチェック
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Hoechst Marion Roussel Inc
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ガン遺伝子またはウイルスにより制御された
遺伝子治療用発現系の提供。 【解決手段】 核酸構築体に含まれる転写因子遺伝子
（構成要素b）の発現を制御するプロモーターＩ（構成
要素a）と、該転写因子遺伝子の遺伝子産物が特異的に
結合し、かつ核酸構築体に含まれるエフェクター遺伝子
（構成要素d）の発現を制御するプロモーターII（構成
要素c）とを含有してなり、該転写因子遺伝子の遺伝子
産物の活性がこの遺伝子産物に特異的に結合し、かつそ
の活性に影響を与える１以上の細胞調節タンパク質に依
存することを特徴とする、エフェクター遺伝子の発現の
ための核酸構築体。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本発明は、核酸構築体に含まれる転写因子遺伝子（構成
要素b）の発現を制御するプロモーターＩ（構成要素a）
と、転写因子遺伝子の遺伝子産物が特異的に結合し、か
つ核酸構築体に含まれるエフェクター遺伝子（構成要素
d）の発現を制御するプロモーターII（構成要素c）とを
含有してなり、該転写因子遺伝子の遺伝子産物の活性が
この遺伝子産物に特異的に結合してその活性に影響を与
える１以上の細胞調節タンパク質に依存することを特徴
とする、エフェクター遺伝子の発現のための核酸構築体
に関する。
【０００２】背景技術 拡大しつつある遺伝子治療において細胞、特に疾患細胞
または疾患によらずに変異した細胞、に特異的な方法に
おいて、エフェクター遺伝子の発現を制御することは十
分に解決されていない。本発明はこのような制御を達成
するための新規なプロセスを含むものである。本発明
は、変性細胞では、それらの密接に関連したパートナー
分子ともはや結合できなくなって、それらと相互作用で
きなくなるか、あるいはそれらの密接に関連したパート
ナー分子もしくは他のパートナー分子との新たな結合特
性を獲得するかの何れかの方法で、調節タンパク質の変
化もしくは減少が見られるという発見(Wernessら, Scie
nce 248, 76(1990))に基づくものである。
【０００３】さらにこの新規なプロセスは、網膜芽細胞
腫タンパク質が、例えばE2F転写因子の活性化ドメイン
に結合して、それによりその活性を阻害することができ
るという発見にも基づく(Flemingtonら, PNAS USA 90,6
914(1993))。
【０００４】この性質を有する調節タンパク質に対する
遺伝子は、既にこれらの調節タンパク質の阻害剤または
刺激剤の検索のための発現系に用いられている（例え
ば、WO95/19367, WO95/14777, WO97/04092）。
【０００５】さらに、腫瘍抑制タンパク質を発現する第
一のベクターと該腫瘍抑制タンパク質と結合し、それに
よってそれを阻害するタンパク質を発現する第二のベク
ターを有するベクター系が既に開示されている(WO95/16
771)。両ベクターは一つの細胞に導入される。この２つ
のベクターを組み合わせることにより、その細胞の増殖
を腫瘍抑制タンパク質によって阻害することなく、腫瘍
抑制タンパク質をコードするベクターを作製することが
できる。
【０００６】さらに、WO97/12970では、第一の遺伝子の
発現が、非腫瘍細胞ではその機能が抑制される第一のプ
ロモーターによって制御され、しかも非腫瘍細胞ではそ
の遺伝子産物が第一の遺伝子の発現を阻害する第二の遺
伝子の発現が、非腫瘍細胞でアップレギュレーションさ
れる第二のプロモーターにより制御される発現系が開示
されている。
【０００７】本発明は、かかる調節タンパク質が減少ま
たは変異という形で生じる細胞で唯一活性化可能な新規
かつ単純な発現系に関するものである。発現系は該発現
系によってコードされるエフェクター遺伝子の転写を活
性化する。該エフェクター遺伝子の発現産物はそれ自身
が、またはさらなる医薬活性化合物と組み合わせて予防
または治療上の効果を有する。
【０００８】
【発明の概説】本発明の発現系は、その発現が癌遺伝子
またはウイルスにより、すなわち調節タンパク質を変更
するか、またはそれに影響を及ぼすこれらの癌遺伝子ま
たはウイルスによって制御される核酸構築体である。本
発明の発現系は、最も単純な場合には以下の構成要素： a)少なくとも１つの活性化配列（プロモーターユニット
I）と b)その転写が構成要素a)によって制御される少なくとも
１つの転写因子に関する遺伝子と c)構成要素b)によってコードされる転写因子と結合する
ことによって構成要素d)の発現を制御する、少なくとも
１つのさらなる活性化配列（プロモーターユニットII）
と d)少なくとも１つのエフェクター遺伝子とを含む。
【０００９】個々の構成要素の配列は図1の例によって
示される。
【００１０】
【発明の具体的説明】本発明によれば、該核酸構築体の
２つの特定の具体例が区別されよう。 1)具体例A) 本具体例は以下の特性： 構成要素a) −少なくとも１つの活性化配列（プロモーターNo.I） 構成要素b) ・構成要素b1)少なくとも１つの転写因子の活性化ドメ
イン ・構成要素b2)少なくとも１つの調節タンパク質に対す
る結合タンパク質の結合配列 ・構成要素b3)少なくとも１つの転写因子のＤＮＡ結合
ドメイン を含む融合タンパク質を含む少なくとも１つの転写因子
に関する遺伝子 構成要素c) 構成要素b)によってコードされる転写因子と結合するこ
とにより活性化される少なくとも１つの活性化配列（プ
ロモーターNo.II） 構成要素d) 少なくとも１つのエフェクター遺伝子を有する構成要素
によって特徴付けられる。
【００１１】個々の構成要素の配列は図2の例によって
示される。本発明の発現系の機能性に関する必要条件
は、該タンパク質タンパク質の構成要素b2)への結合が
該活性化ドメイン（構成要素b1）および／またはＤＮＡ
結合ドメイン（構成要素b3）の機能性を阻害するよう
に、構成要素b2)を構成要素b1)と構成要素b3)の間また
はそれに適合させることである。正常細胞、すなわち、
該タンパク質タンパク質が正常に機能することができる
場合では、この阻害はエフェクター遺伝子の発現の阻害
につながる。該調節タンパク質が変更されたか、または
複合化されたかして、密接に関連した結合タンパク質と
もはや相互作用できないように、あるいはもはや存在し
ない、あるいは小範囲にしか存在しないようになった変
性細胞または罹患細胞では、この阻害はなく、転写因子
（構成要素b）はその活性化配列（構成要素c）を妨害を
受けない様式で活性化することができ、それによってエ
フェクター遺伝子の転写が開始する。
【００１２】該エフェクター遺伝子の転写は活性化配列
[構成要素a)]が活性化されることによって開始し、その
結果、転写因子[構成要素b)]に関する遺伝子が発現す
る。該転写因子[構成要素b)]は次に、エフェクター遺伝
子[構成要素d)]の発現を誘導する活性化配列[構成要素
c)]と結合する。
【００１３】本発明の特定の具体例では、構成要素a)は
構成要素c)と同一である。この特殊な具体例では、活性
化配列[プロモーターI、構成要素a)]のわずかな活性化
が、活性化配列[プロモーターI、構成要素a)]および活
性化配列[プロモーターII、構成要素c)]の双方を活性化
する転写因子[構成要素b)]の発現をもたらし、それによ
りエフェクター遺伝子[構成要素d)]の発現を誘導すると
ともに転写因子[構成要素b)]の発現を増強させ、それに
よってエフェクター遺伝子[構成要素d)]の発現を再び増
強させる。
【００１４】2)具体例B) 本具体例は、以下の特性： 構成要素a') ・構成要素a1)少なくとも１つの調節タンパク質に対す
るＤＮＡ結合配列、および ・構成要素a2)調節タンパク質の構成要素a1)への結合が
（構成要素a2）を活性化する、少なくとも１つの基本プ
ロモーターを含む少なくとも１つの活性化配列（プロモ
ーターI） 構成要素b') その発現が構成要素a')によって誘導される、リプレッ
サーとして働く、転写因子に対する少なくとも１つの遺
伝子 構成要素c') ・構成要素c1)構成要素d)の転写を誘導するための少な
くとも１つの活性化配列、および ・構成要素c2)この結合が下流のエフェクター遺伝子
（構成要素d）の転写の活性化を阻害する、リプレッサ
ー（構成要素b'）に結合するための少なくとも１つのＤ
ＮＡ配列 を含む少なくとも１つの活性化配列（プロモーターII） 構成要素d) エフェクター遺伝子を有する構成要素により特徴付けら
れる。
【００１５】具体例B)の構成要素の配列は図３の例によ
って示される。
【００１６】本発明によって機能する具体例B)の発現系
の必要条件は、正常細胞では、細胞調節タンパク質のプ
ロモーターユニットIである構成要素a')への結合がリプ
レッサー遺伝子（構成要素b'）の転写を誘導すること、
および発現したリプレッサーがプロモーターユニットII
である構成要素c2)へ結合し、それにより、プロモータ
ーユニットIIによる構造遺伝子（構成要素d）の転写の
活性化を阻害することである。
【００１７】該調節タンパク質が変更されるかまたは複
合化されたことによって、調節タンパク質がプロモータ
ーユニットＩのＤＮＡ結合配列（構成要素a1）ともはや
結合できなくなるか、あるいはもはや存在しなくなる
か、またはわずかな範囲でしか存在しなくなった変性細
胞または罹患細胞では、リプレッサーに対する遺伝子の
発現は見られず、結果として阻害も見られず、また、新
規な核酸構築体の発現も見られない。
【００１８】新規な核酸構築体の具体例B)では、これら
変性細胞または罹患細胞におけるエフェクター遺伝子
（構成要素d）の転写は、プロモーターユニットＩＩの
活性化配列（構成要素c1）が活性化されることにより開
始する。
【００１９】この発現系は各々の場合において同一のま
たは異なるIRES配列によって、もしくは活性化配列[構
成要素c')およびc")]によって互いに連結される、エフ
ェクター遺伝子[構成要素d)、d')、d")]に対するいくつ
かの同一または異なる配列を共に連結することにより具
体例A)およびB)に、各々の場合において、同一のまたは
異なるIRES配列、もしくは活性化配列[構成要素a)また
は構成要素c)]によって互いに連結される、転写因子[構
成要素b)]に対するいくつかの同一または異なる遺伝子
を共に連結することにより具体例A)に拡張できる。
【００２０】異なる転写因子に対する遺伝子を連結した
場合、その転写因子［構成要素b)］が結合することので
きるヌクレオチド配列がそれらの配列に含まれるように
活性化配列を選択する。
【００２１】活性化配列［構成要素a)もしくはC1)］の
選択により、この新規な核酸構築体を用いて、非特異
的、細胞特異的、もしくはウイルス特異的、もしくは特
定の代謝条件下で、もしくは細胞サイクル特異的にエフ
ェクター遺伝子［構成要素d)］を発現させることができ
る。該エフェクター遺伝子は、不活性な薬剤前駆体を活
性薬剤へと分割させる、薬理学的活性を有する組成物ま
たは酵素を部分的にコードする遺伝子である。例えば、
この活性組成物もしくはこの酵素がリガンドと共に融合
タンパク質として発現され、このリガンドが例えば内皮
細胞、腫瘍細胞、または白血球などの細胞表面に結合す
るように該エフェクター遺伝子を選択することができ
る。
【００２２】該新規核酸構築体は、好ましくはＤＮＡで
構成される。「核酸構築体」とは、核酸から構成され、
標的細胞において転写される得る人工的な構造を意味す
ると理解される。それらは好ましくはベクターに挿入さ
れるが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターが
特に好ましい。
【００２３】ベクターに適切に挿入された場合、該核酸
構築体は疾病の予防または治療のために患者に投与され
る。投与は、経口的、局所的もしくは注射または持続注
入によっても達成できる。
【００２４】ウイルスまたは非ウイルスベクターを用い
てよい。例えばウイルスベクターはRTV、AV、AAV、また
はHSV由来であってもよいし(Jolly, Cancer Gene Ther.
1,51(1994))、もしくは陽イオン性脂質または陽イオン
性ポリマーと複合体を形成したプラスミドであってもよ
い(Ledley, Human Gene Ther. 6, 1129(1995))。かかる
ベクターは、1%ないし30% （好ましくは5%）ヒトアルブ
ミンを含有する生理塩溶液に溶解すればよい。
【００２５】1×105ないし1×1010PFU（好ましくは1×1
08PFU）のウイルスベクター、または0.01mgないし50mg
のプラスミド（好ましくは1mg）を1mlのかかる培地に懸
濁し、患者に投与した。投与は注射（静脈内、動脈内、
皮下、筋肉内、腔内（胸膜、腹膜、クモ膜下、関節
内)、もしくは器官内、もしくは局所投与（気管支内、
鼻腔内、皮膚、結膜上、膣内、膀胱内）により行われて
よい。
【００２６】また本発明は、新規核酸構築体を含有する
哺乳類細胞にも関する。特に好ましい具体例において
は、該核酸構築体は細胞ラインに導入し、トランスフェ
クト後に新規発現系の担体としてエフェクター遺伝子を
発現するために使用することができる。かかる細胞は患
者のための薬剤を製造するために使用することができ
る。別法として、新規核酸構築体が導入された腫瘍細
胞、免疫細胞または内皮細胞等の細胞または細胞系を、
局所的または非経口的、例えば静脈内、動脈内、体腔
内、または器官内に、もしくは皮下注射により患者に投
与することができる。
【００２７】例としては、イン・ビトロにおいて形質導
入され、次いで患者の免疫感作のための皮内または皮下
注射された腫瘍細胞、もしくはその細胞障害性の再指向
のために新しい受容体を発現するように形質導入された
CD-4陽性Ｔ細胞、もしくはFIXを発現するようにイン・
ビトロにおいて形質導入され、次いでFIX産生不全の治
療のために再注射された筋肉細胞が挙げられる。
【００２８】従って、該新規核酸構築体の好ましい使用
は疾病の予防または治療にあり、本発明は、イン・ビト
ロにおける標的細胞への核酸構築体の挿入、標的細胞に
おける薬剤の非特異的、ウイルス特異的、標的細胞特異
的、代謝特異的および／または細胞周期特異的な発現、
および標的細胞の患者への局所または非経口投与、さも
なくばイン・ビボにおける標的細胞への核酸構築体の挿
入を目的とした該核酸構築体の患者への局所または非経
口投与を特徴とする。
【００２９】新規核酸構築体は、この形態では天然には
見出されない、すなわち、活性化合物または酵素の、も
しくはリガンド-活性化合物またはリガンド-酵素融合タ
ンパク質のエフェクター遺伝子は、該新規核酸構築体に
包含されているようには核酸配列とは自然には結合しな
い。
【００３０】本発明によれば、発現系に組み込まれるエ
フェクター遺伝子は薬理学的活性を有する化合物をコー
ドしていることが好ましい。この活性化合物はサイトカ
イン類、増殖因子、サイトカインまたは増殖因子の受容
体、抗体または抗体断片、抗増殖作用または細胞分裂抑
制作用を有するタンパク質、アポトーシス作用または抗
アポトーシス作用を有するタンパク質、腫瘍抗原、血管
形成阻害剤、血栓誘発タンパク質、凝固阻害剤、繊維素
溶解作用を有するタンパク質、血漿タンパク質、補体活
性化タンパク質、ウイルスおよび細菌のエンベロープ物
質、ホルモン、循環作用を有するペプチド、神経ペプチ
ド、酵素、メディエーター、天然に存在する未変性調節
タンパク質、およびリボザイム、もしくは遺伝子発現阻
害作用を有する（アンチセンス）リボヌクレオチドから
なる群より選択されるタンパク質および糖タンパク質に
より構成される。 導入遺伝子は、細胞周期調節タンパ
ク質、特にサイクリンA、サイクリンB、サイクリンD1、
サイクリンE、E2F1-5、cdc2、cdc25CまたはDP1、もしく
はウイルスタンパク質またはサイトカインまたは増殖因
子またはそれらの受容体からなる群より選択されるタン
パク質をコードするｍＲＮＡを不活化するリボザイムを
コードするエフェクター遺伝子が好ましい。
【００３１】さらなる具体例としては、該エフェクター
遺伝子はリガンド-活性化合物融合タンパク質をコード
することができ、このタンパク質はリガンドを抗体、抗
体断片、サイトカイン、増殖因子、接着分子またはペプ
チドホルモンとすることができ、前記のごとくに活性化
合物を薬理学的活性を有する化合物または酵素とするこ
とができる。例えば、該エフェクター遺伝子は、薬剤前
駆体を酵素へと分割する酵素と細胞表面、好ましくは内
皮細胞または腫瘍細胞に結合するリガンドとのリガンド
-酵素融合タンパク質をコードすることができる。
【００３２】具体例A)の特性の詳説 1) 構成要素b) 1.1)調節タンパク質［構成要素b2)］に対する結合配列 調節タンパク質に関する多数の細胞結合タンパク質はす
でに記載されている［ZwickerおよびMuller, Progress
in Cell Cycle Res. 1: 91(1995); Boulikesら, Int.
J. Oncol. 6: 271(1995); Pawson, Nature 373: 573(19
95); Cotter, Leuk. Lymph. 18:231(1995); Hesketh, t
he Oncogene Facts Book Acad. Press. ISBN 0-12-3445
50-7 (1995); MillerおよびSarver, Nature Med. 3:389
(1997)］。
【００３３】本発明の範囲内で適切な結合タンパク質ま
たはそれらの結合配列とは、特に、疾病細胞においてご
く僅かしか発現されず、その結合配列への結合が阻害さ
れ、過剰に存在する結合配列のために遊離状態では存在
しないか、もしくはごく僅かしか存在せず、もしくは、
その機能が例えば突然変異により損なわれているか変化
している調節タンパク質に対する結合タンパク質または
それらの結合配列である。
【００３４】これらの調節タンパク質には、例えば腫瘍
サプレッサー遺伝子により発現されるタンパク質が含ま
れる。
【００３５】本発明を限定するものではないが、この性
質を有する調節タンパク質およびそれらの密接に関連す
る結合タンパク質および後者の結合配列の選択は、以下
の例に挙げられている。 調節タンパク質 構成要素b2) （調節タンパク質に対する結合配列を有する細胞結合タンパク質） p53 ・MDM-2 pRb ・転写因子E2F,-1,-2,-3 ・サイクリン-D1,-D2,-D3,または-C ・サイクリン-A, -E ・転写因子PU-1 ・転写因子Elf-1 p130 ・転写因子E2F-5 ・サイクリンA,-E Max ・Myc MAD ・Myc VHL ・エロンガンC,-B cdk4 ・p14, p15, p16, p18, p27, p57, p21 MTS-1(p16) ・cdk4 WT-1 ・p53 SMAD2(MADR2) ・DPC4 DPC-4 ・SMAD2 β-カテニン ・LEF-1 LEF-1 ・β-カテニン 本発明の特定の具体例では、構成要素b2)は調節タンパ
ク質に対する非細胞特異的結合タンパク質の結合配列で
ある。かかる非細胞特異的結合配列は、例えば、ウイル
ス、細菌、または寄生虫起源で有り得る。
【００３６】かかる非細胞特異的結合配列の使用は、構
成要素b2)に結合している関連調節タンパク質により、
正常細胞で構成要素b)の機能を阻害することを可能にす
る。しかしながら感染細胞では、各感染性病原体が細胞
内で結合配列含有結合タンパク質を産生する結果とし
て、該関連調節タンパク質の大部分が結合するようにな
る。従って構成要素b)は遊離状態であり、これらの細胞
中で機能する。
【００３７】本発明のもう１つの特定の具体例では、構
成要素b2)は、調節タンパク質に対する結合配列(VHおよ
びVL)を有する抗体もしくは抗体の一部分である。
【００３８】本発明を限定するものではないが、非細胞
特異的結合配列は以下から選択できる。 調節タンパク質 構成要素b2) （調節タンパク質に対する結合配列を有するウイルス結合タンパク質） p53 ・CMVのIE 84 (Speirら, Science 265, 391 (1994) ・AVのE1B(55Kd) (Samowら, Cell 28, 387 (1982); Liuら, Cold Spring Harbor Symp.On Quantitative Biol. LIX, 215 (1995)) ・EBVのEBNA-5 (Szekelyら, PNAs USA 90, 5455 (1993)) ・EBVのBHFR1 (Theodorakisら, Oncogene 12, 1707 (1996)) ・HPV-16または-18のE6 (Dysonら, Science 243, 934 (1989); Howesら, Genes Dev.8, 1300 (1994)) ・HBVのHBXタンパク質 (Wangら, PNAS USA 91, 2230 (1994)) ・SV40のT抗原 (Laneら, Nature 278, 261 (1979); Linzerら, Cell 17, 43 (1979)) pRb ・AVのE1A (Nevins, Science 258, 424 (1992)) ・EBVのEBNA-2 ・EBVのEBNA-1または-5 ・HPVのE7 ・SV40のT抗原 p130 ・AVのE1A (Liuら, Genes Dev. 7, 2366 (1993) CBF-1(RBP-JK)・EBVのEBNA-2 (Zimber-Stroblら, EMBO J. 13, 4973 (1994)) NF-κB ・HIVのTax (Suzukiら, Oncogene 9, 3099 (1994)) Lyn-チロシンキナーセ゛・EBVのLMP-1 ・EBVのLMP-2AまたはLMP-2B bak ・AVのE1B (Farrowら, Nature 374, 731 (1995)) bax ・AVのE1b(19Kd) 調節タンパク質 調節タンパク質に対する結合配列(VH, VL)を有する抗体または 抗体断片 p53 ・非変異ＤＮＡ結合ドメインに特異的なモノクローナル抗体 (Legrosら, Oncogene 9, 2071 (1994); 9, 3689 (1994); Huppら, Cell 71, 875 (1992); Abarznaら, Cancer Res. 55, 3490 (1995); Bonsingら, Cytometry 28, 11 (1997); Thomasら, J. Clin. Path. 50, 143 (1997); Jannotら, BBRC 230, 242 (1997) ) pRb ・活性（非リン酸化）pRbに特異的なモノクローナル抗体 (Huら, Mol. Cell. Biol. 11, 5792 (1991))
【００３９】抗体を選択する場合、抗体のエピトープ結
合部分であるFVLFVH（それらがネズミ由来である場合に
はヒト化形態である）を、構成要素b2)として使用する
ことが好ましい。このヒト化は、Winterら(Nature 349,
293 (1991)およびHoogenboomsら(Rev. Tr. Transfus.
Hemobiol. 36. 19.(1993)によって記載された方法で達
成される。抗体断片は、技術の状態に従って、例えばWi
nterら, Nature 349,293 (1991)、Hoogenboomsら, Rev.
Tr. Transfus. Hemobiol. 36.19.(1993)、Girol. Mol.
Immunol. 28, 1379 (1991)またはHustonら, Int. Rev.
Immunol. 10,195 (1993)によって記載された方法で調
製される。抗体、抗体断片および組換え抗体断片の調製
は、ドイツ特許196 49 645.4に詳細に記載されていた。
【００４０】組換え抗体断片は、既存のハイブリドーマ
から直接調製されるか、または「ファージ展示」技術(W
interら, Annu. Rev. Immunol. 12, 433 (1994))を用い
てネズミまたはヒト抗体断片のライブラリーから単離さ
れる。次いでこれらの抗体断片は、構成要素b1)およびb
3)とのカップリングのために遺伝レベルで直接使用され
る。
【００４１】ハイブリドーマから組換え抗体断片を調製
するために、ｍＲＮＡを単離し、そのＲＮＡをｃＤＮＡ
に逆転写し、続いてポリメラーゼ連鎖反応および可変断
片のそれぞれ5'および3'末端に相補的であるオリゴヌク
レオチドによって増幅することによって、抗体の抗原結
合ドメイン(VH、VL)をコードする遺伝情報を得る。得ら
れたVHおよびVLをコードするＤＮＡ断片を、次いでバク
テリア発現ベクター中にクローン化し、それにより、例
えば、Fv断片、一本鎖Fv断片(scFv)またはFab断片を発
現することが可能となる。
【００４２】新しい抗体断片もまた、「ファージディス
プレ（phage display）」技術を用いてネズミまたはヒ
ト起源の抗体ライブラリー（免疫ライブラリー、天然ラ
イブラリー）から直接単離することができる。抗体断片
のファージディスプレイにおいて、抗原結合ドメインの
遺伝子は、繊維状バクテリオファージのg3Pコートタン
パク質に対する遺伝子との遺伝子複合体として、scFv断
片遺伝子の形態で、またはFab断片遺伝子としてファー
ジゲノム中か、またはファージミドベクター中かのいず
れかにクローン化される。抗原結合ファージは、抗原を
充填したプラスチック容器（パンニング）上で、抗原を
結合させた常磁性「ビーズ」上でまたは細胞表面へ結合
させることによって選択する。
【００４３】免疫ライブラリーは、免疫化した動物また
は患者のBリンパ球由来の可変抗体断片に対する遺伝子
をPCR増幅にかけることによって調製する。このため
に、ネズミまたはヒト免疫グロブリンに特異的なあるい
はヒト免疫グロブリン遺伝子ファミリーに特異的なオリ
ゴヌクレオチドを組み合わせたものを使用する。
【００４４】天然ライブラリーは、免疫グロブリン遺伝
子の供給源として非免疫化ドナーを用いることによって
調製することができる。別法として、免疫グロブリン生
殖系遺伝子を、その可変領域の相補性決定領域3が縮重
プライマーを用いるPCRによって増幅される、半合成抗
体レパートリー調製するために使用することができる。
これらのいわゆる単一ポットライブラリーは、免疫ライ
ブラリーに比べて、多数の抗原に対する抗体断片を１つ
の単一ライブラリーから単離することができるという利
点を有している。
【００４５】未処理レパートリー由来の断片のそれらを
有する個々のドメインの鎖をシャッフルすることによ
る、またはバクテリアミューテーター系統、およびスト
リンジェント条件下で再選択することによって単離され
る改良特性を有する抗体断片を用いることによる、ラン
ダム突然変異誘発、コドンに基づいた突然変異誘発、ま
たは位置指定突然変異誘発の手段によって既存の抗体断
片から調製された新しいライブラリーを用いたファージ
ディスプレイ技術により、抗体断片の親和性をさらに増
強することができる。さらに、ネズミ抗体断片を、可変
ドメインの１つをヒトレパートリーで段階的に置換し、
続いてもとの抗原を用いた選択（「ガイドセレクショ
ン」）によってヒト化することができる。別法として、
ヒト抗体の超可変領域のもとのネズミ抗体の対応領域で
の置換を標的化することによって、ネズミ抗体をヒト化
する。1.2) 活性化ドメイン[構成要素b1)]およびＤＮＡ
結合ドメイン[構成要素b3)]本発明の範囲内で、転写因
子の活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインとして入
手可能なすべての遺伝子を、構成要素b)に用いることが
できる。以下に例を示すが、それらの記載は本発明を限
定するものではない。
【００４６】活性化ドメイン[構成要素b1)] ・HSV1-VP16の酸性トランス活性化ドメイン(TAD)に対す
るｃＤＮＡ（アミノ酸406から488; Triezenbergら, Gen
es Developm. 2: 718 (1988);Triezenberg,Curr. Opin.
Gen. Developm. 5: 190 (1995)またはアミノ酸413から
490;Regierら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 883
(1993)）の、または ・Oct 2の活性化ドメイン（アミノ酸438から479; Tanak
aら, Mol. Cell. Biol.14: 6046 (1994)またはアミノ酸
3から154; Dasら, Nature 374: 657 (195)）の、または ・SP1の活性化ドメイン（アミノ酸340から485; Courey
およびTijan, Cell 5 5, 887 (1988)）の、または ・NFYの活性化ドメイン（アミノ酸1から233;Liら, J. B
iol. Chem. 267, 8984 (1992); van Hujisduijnenら, E
MBO J. 9, 3119 (1990); Sinhaら, J.Biol.Chem. 92, 1
624 (1995); Coustryら, J. Biol. Chem. 270, 468 (19
95)）の、または ・ITF2の活性化ドメイン（アミノ酸2から452; Seipei
ら, EMBO J. 13, 4961,1992)）の、または ・C-Mycの活性化ドメイン（アミノ酸1から262; Eilera
ら）の、または ・CTFの活性化ドメイン（アミノ酸399から499; Mermod
ら, Cell 58, 741(199); DasおよびHerr, Nature 374,
657 (1995))の少なくとも１つの配列。
【００４７】ＤＮＡ結合ドメイン[構成要素b3)] ・Gal4タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸1か
ら147; ChasmanおよびKomberg, Mol. Cell. Biol. 10:2
916 (1990))の、または ・LexAタンパク質(アミノ酸1から81; Kimら, Science 2
55: 203 (1992)または全LexAタンパク質(アミノ酸1から
202; Brentら, Cell 43: 729 (1985))の、または ・lacリプレッサー(lac I)タンパク質(Brownら, Cell 4
9: 603 (1987); Fuerstら,PNAS USA 86: 2549 (1989))
の、または ・テトラサイクリンリプレッサー(tet R)タンパク質(Go
ssenら, PNAS USA 89:5547(1992); Dingermannら, EMBO
J. 11: 1487 (1992))の、または ・ZFHD1タンパク質(Pomerantzら, Science 267: 93 (19
95))の少なくとも１つの配列。
【００４８】本発明の範囲内で、ＤＮＡ結合ドメインの
3'末端に核局在化シグナル(NLS)を付加することが有利
である。
【００４９】2)構成要素b)によって活性化され得る活性
化配列プロモーターユニットII[構成要素c)] この活性化配列の選択は、転写因子[構成要素b)]に対す
る遺伝子におけるＤＮＡ結合ドメイン[構成要素b3)]の
選択に依存する。一例に、1.2で挙げたＤＮＡ結合ドメ
インの例として以下の可能性が順に存在する。
【００５０】2.1)可能性A) Gal4タンパク質(ChasmanおよびKornberg, Mol. Cell. B
iol. 10, 2916 (1990))に関する少なくとも１つの結合
配列[ヌクレオチド配列：5'-CGGACAACTGTT GACCG-3']
（配列番号1）を含み、さらに（その3'末端へ） ・SV40の基本プロモーター （ヌクレオチド48から5191; Tooze（編）,DNA Tumor Vi
ruses (Cold SpringHarbor New York, New York; Cold
Spring Harbor Laboratory) 、または ・c-fosのプロモーター(Dasら, Nature 374, 657 (199
5))、または ・U2 sn ＲＮＡプロモーター、または ・HSV TKのプロモーター(Papavassiliouら, J. Biol. C
hem. 265, 9402 (1990); Parkら, Molec. Endocrinol.
7, 319 (1993))が付加される活性化配列
【００５１】2.2)可能性B) −・LexAタンパク質[LexAオペレーター; Brentら, Natu
re 612, 312 (1984)]に関する少なくとも１つの結合配
列[ヌクレオチド配列5'-TACTGTATGTACA TACAGTA-3']
（配列番号2）を含み、さらに（その3'末端へ） ・SV40の基本プロモーター（ヌクレオチド48から5191;
Tooze（編）,DNATumor Viruses (Cold Spring Harbor N
ew York, New York; Cold SpringHarbor Laboratory）
または別のプロモーター（可能性Ａ参照）が付加される
活性化配列
【００５２】2.3)可能性C) ・lac I受容体タンパク質(Fuerstら, PNAS USA 86, 254
9 (1989); Simonsら,PNAS USA 81, 1624 (1984))に
関する少なくとも１つのLacオペレーター結合配列（ヌ
クレオチド配列：5'-GAATTGTGAGCGCTCACAATTC-3'）（配
列番号3）を含み、さらに（その3'末端へ） ・SV40の基本プロモーター（ヌクレオチド48から5191;
Tooze（編）,DNATumor Viruses (Cold Spring Harbor N
ew York, N.Y.; Cold Spring HarborLaboratory）また
は別のプロモーター（可能性A参照）が付加される活性
化配列
【００５３】2.4)可能性D) ・テトラサイクリン受容体(tet R)タンパク質に関する
少なくとも１つのテトラサイクリンオペレーター(tet
O)結合配列（ヌクレオチド配列：5'-TCGAGTTTACCACTCCC
TATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3'）（配列番号4）を含
み、さらに（その3'末端へ） ・SV40の基本プロモーター（ヌクレオチド48から5191;
Tooze（編）,DNATumor Viruses (Cold Spring Harbor N
ew York, N.Y.; Cold Spring HarborLaboratory）また
は別のプロモーター（可能性A参照）が付加される活性
化配列
【００５４】2.5)可能性E) ・ZFHD-1タンパク質(Pomerantzら, Science 267, 93 (1
995))に関する少なくとも１つの結合配列[ヌクレオチド
配列：5'-TAATGATGGCG-3']（配列番号５）を含み、さら
に（その3'末端へ） ・SV40の基本プロモーター（ヌクレオチド48から5191;
Tooze（編）,DNATumor Viruses (Cold Spring Harbor N
ew York, New York; Cold SpringHarbor Laboratory）
または別のプロモーター（可能性A参照）が付加される
活性化配列
【００５５】具体例B)の特殊な特徴に関する詳説 1)プロモーターユニットIの活性化配列[構成要素a')] 1.1)調節タンパク質に対するＤＮＡ結合配列[構成要素a
1)] これらの配列には、そのＤＮＡに結合する能力が突然変
異によって阻害されるか、もしくは細胞内で量的に増加
される、または減じられる転写因子に対するＤＮＡ結合
配列が含まれる。転写因子およびそれらの改変物は、例
えばNicholsら,Blood 80, 2953 (1992); Crepieuxら, C
rit. Rev. Oncogen. 5, 615 (1994); LaThangue, TIBS
19, 108 (1994); Lipton, Nature Med. 3, 20 (1997)に
より総論されている。
【００５６】これらのＤＮＡ結合配列には、例えばp53
タンパク質[ATAATTGGGCAAGTCTAGGAA-3';（配列番号6）K
ernら, Science 252, 1708 (1991), Choら, Science 26
5, 346 (1994)または-(G/A)-(G/A)-(G/A)-C-(A/T)-(T/
A)-G; Choら, Science 265, 346 (1994)]に対するWt-1
タンパク質(Wangら, Oncogene 10, 415 (1995); Borel
ら, Biochem. 35/3 7, 12070 (1996))に対するNFκBタン
パク質（ヌクレオチド配列5'-GGGACTTTCC-3'（配列番号
7）; Urbanら, Genes and Developm. 4, 1975 (1990);
Rougら, Virol. 189, 750 (1992)）またはHIV-LTR(Gimb
leら, J. Virol. 62, 4104 (1988))に対するE2F/DP-1複
合体（5'-TTTTCCCGCCAAAA（配列番号8）;または5'-TTTT
CCCGCCTTTTTT（配列番号9）もしくは5'-TTTTCCCGCGC TT
TTTT（配列番号10）(Ouelleteら, Oncogene 7, 1075 (1
992))のうち少なくとも１つのヌクレオチド配列に対す
るMyc/Maxタンパク質（5'-CACGTG-3'(Walhoutら, Nucl.
Acids Res. 25, 1493 (1997); Nozakiら, J. Biochem.
121, 550 (1997))または5'-CATGTG-3'(Fisherら, EMBO
J. 12, 5075 (1993))のうち少なくとも１つのヌクレオ
チド配列）に対する少なくとも１つのＤＮＡ結合配列が
含まれる。
【００５７】1.2)基本プロモーター[構成要素a2)] これら基本プロモーターの例としては、SV40の基本プロ
モーター（ヌクレオチド48から5191; Tooze（編）,DNAT
umor Viruses (Cold Spring Harbor New York, New Yor
k; Cold SpringHarbor Laboratory）またはc-fosのプロ
モーター(Dasら, Nature 374, 657 (1995))またはU2 sn
ＲＮＡプロモーターまたはHSV TKのプロモーター(Papa
vassiliouら, J. Biol. Chem. 265, 9402 (1990);Park
ら, Mol. Endocrin. 7, 319 (1993))がある。
【００５８】2)リプレッサー[構成要素b'] これらリプレッサーの例としては、lacリプレッサー(Br
ownら, Cell 49, 603 (1987); Furstら, PNAS USA 86,
2549 (1989))またはテトラサイクリンリプレッサー(Gos
senら, PNAS USA 89, 5549 (1992); Dingermannら, EMB
O J. 11, 1487 (1992))がある。
【００５９】3)構成要素b')によって影響を受ける活性
化配列[構成要素c1)] これら活性化配列には、例えば、後の第V)節に挙げられ
た活性化配列の全てが含まれる。 4)リプレッサーに対するＤＮＡ結合配列[構成要素c2)] これらＤＮＡ結合配列の例としては、lac Iリプレッサ
ータンパク質に対する少なくとも１つのLacオペレータ
ー結合配列（ヌクレオチド配列; 5'-GAATTGTGAGCGCTCAC
AATTC-3'）（配列番号3）(Furstら, PNAS USA 86, 2549
(1989); Simonら, PNAS USA 81, 1624 (1984))または
少なくとも１つのテトラサイクリンオペレーター(tet
O)結合配列（ヌクレオチド配列） テトラサイクリンリプレッサー(tet R)タンパク質に対
する5'-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-
3'（配列番号4）がある。
【００６０】活性化配列I[具体例A)の構成要素a)および
具体例B)の構成要素C1)] 本発明の範囲内で、転写因子に結合した後に3'末端に隣
接して位置する遺伝子の転写を活性化するヌクレオチド
配列は、活性化配列として用いられる。該活性化配列の
選択は治療される疾病に、さらには導入される標的細胞
に依存する。かくして、該活性化配列[構成要素a)]を、
制限されない様式で、標的細胞特異的に、特定の代謝条
件の下で、細胞周期特異的に、あるいはウイルス特異的
に活性化させることができる。これらプロモーター配列
は既に、欧州特許出願第95930524.4号、同第95931933.6
号、同第95931204.2号、同第95931205.9号、同第971015
07.8号、同第97102547.3、ドイツ特許出願第19639103.2
号および同第19651443.6号に詳細に記載されている。以
下は選択されるプロモーター配列の例である。 1)制限されないの様式で活性化され得るアクチベーター
配列およびプロモーター ＲＮＡポリメラーゼIIIのプロモーター ＲＮＡポリメラーゼIIのプロモーター CMVプロモーターおよびCMVエンハンサー SV40プロモーター 等 2)ウイルスプロモーターおよびアクチベーター配列 HBV HCV HSV HPV EBV HTLV HIV 等 HIVプロモーターが用いられる場合、TAR配列[-453から-
80位,Rosenら, Cell 4 1, 813 (1985)]を含む全LTR配列
がウイルス特異的プロモーターとして使用される。 3)低酸素症によって引き起こされ得るエンハンサーのよ
うな代謝的に活性化可能なプロモーターおよびエンハン
サー配列 4)細胞周期特異的に活性化可能なプロモーター これらの例としては、cdc25C遺伝子の、サイクリンA遺
伝子の、cdc2遺伝子の、B-myb遺伝子の、DHFR遺伝子
の、E2F-1遺伝子の、またはcdc25B遺伝子のプロモータ
ー、もしくは細胞増殖中に出現するか、または活性化さ
せる転写因子に対する他の結合配列がある。これら結合
配列には、例えば、c-mycタンパク質に対する結合配列
が含まれる。またこれら結合配列には、Myc Eボックス
[5'-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3'（配列番号11）; B
lackwoodおよびEisenmann, Science 251:1211 (1991)]
と呼ばれるヌクレオチド配列の単量体または多量体も含
まれる。
【００６１】5)相当するリプレッサーと組み合わせたテ
トラサイクリンオペレーターのような、テトラサイクリ
ン活性化可能プロモーター 6)キメラプロモーター キメラプロモーターとは、細胞特異的に、代謝的に、ま
たはウイルス特異的に活性化され得る上流アクチベータ
ー配列と、抑制タンパク質が結合し、それにより細胞周
期のＧ0およびＧ1期において該上流アクチベーター配列
の活性化を阻害することができる、ヌクレオチド配列CD
E-CHRまたはE2FBS-CHRを含む下流プロモーターモジュー
ルとの組み合わせである(PCT/GB94/17366; Lucibello
ら, EMBO J. 14, 12 (1994))。
【００６２】7)細胞特異的に活性化可能なプロモーター これらには好ましくは、選択細胞で選択的に形成される
タンパク質をコードするそれら遺伝子に由来するプロモ
ーターまたはアクチベーター配列、もしくはそれら遺伝
子のプロモーターまたはエンハンサーが含まれる。
【００６３】例えば、本発明の範囲内で、以下のタンパ
ク質に対するプロモーターが以下の細胞に使用されるこ
とが好ましい。
【００６４】7.1.内皮細胞で活性化されるプロモーター
およびアクチベーター配列 脳特異的内皮グルコース-1輸送体 エンドグリン VEGF受容体1(fit-1) VEGF受容体2(fit-1,KDR) tie-1またはtie-2 B61受容体（Eck受容体） B61 エンドセリン、特にエンドセリンBまたはエンドセリン1 エンドセリン受容体、特にはエンドセリンB受容体 マンノース6-リン酸受容体 フォンビルブラント因子 IL-1α,IL-1β IL-1受容体 血管細胞接着分子(VCAM-1) 合成アクチベーター配列 天然の内皮細胞特異的プロモーターの代替物として、内
皮細胞で優先的に、または選択的に活性化する転写因子
に対するオリゴマー化結合部位を含む合成アクチベータ
ー配列を作製して使用することもできる。例としては、
そのエンドセリン1遺伝子内の結合部位が5'-TTATCT-3'
である、転写因子GATA-2が挙げられる[Leeら, Bio. Che
m. 266, 16188 (1991); Dormannら, J. Biol. Chem. 26
7, 1279 (1992)およびWilsonら, Mol. Cell Biol.10, 4
854 (1990)]。
【００６５】7.2.活性化内皮細胞近傍の細胞で活性化さ
れるプロモーターまたはアクチベーター配列 VEGF VEGF遺伝子に対する遺伝子調節配列は5'フランキング領
域、3'フランキング領域、c-Src遺伝子またはv-Src遺伝
子である。
【００６６】マウス乳癌ウイルスプロモーターのステロ
イドホルモン受容体およびそれらのプロモーターエレメ
ント(TrussおよびBeato, Endocr. Rev.14, 459 (1993))
7.3.特定の平滑筋細胞における筋肉細胞で活性化される
プロモーターまたはアクチベーター配列 トロポミオシン α-アクチン α-ミオシン PDGFに対する受容体 FGFに対する受容体 MRF-4 ホスホフルクトキナーゼA ホスホグリセレートムターゼ トロポニンC ミオゲニン エンドセリンAに対する受容体 デスミン VEGF 該VEGFに対する遺伝子調節配列はすでに「活性化内皮細
胞近傍の細胞で活性化されるプロモーター」の節で挙げ
られている（前記参照） 「人工」プロモーター ヘリックス−ループ−ヘリックス(HLH)ファミリーの因
子（MyoD、 Myf-5、ミオゲニン、MRF4）は、筋肉特異的
転写因子であると報告されている。ジンクフィンガータ
ンパク質GATA-4もまた筋肉特異的転写因子である。
【００６７】HLHタンパク質およびまたGATA-4は筋肉特
異的遺伝子のプロモーターを用いた場合のみならず、異
なる情況で例えば同様に人工プロモーターを用いても筋
肉特異的転写を示す。このような人工プロモーターの例
としては、Eボックス(Myo D)等の筋肉特異的HLHタンパ
ク質に対する多重コピーの（ＤＮＡ）結合部位（例えば
4xAGCAGGTGTTGGGAGGC）、またはα-ミオシン重鎖遺伝子
のGATA-4に対する多重コピーのＤＮＡ結合部位（例えば
5'-GGCCGATGGGCA GATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG-3'）
（配列番号12）がある。
【００６８】7.4.グリア細胞で活性化されるプロモータ
ーおよびアクチベーター配列 これらには特に以下のタンパク質、例えば、 シュワン細胞特異的タンパク質ペリアキシン グルタミンシンターゼ グリア細胞特異的タンパク質（グリア繊維酸性タンパク
質＝GFAP） グリア細胞タンパク質S100b IL-6(CNTF) 5-HT受容体 TNFα IL-10 インスリン様増殖因子 VEGF VEGF遺伝子に対する遺伝子調節配列はすでに上に挙げら
れている。をコードする遺伝子に由来する遺伝子調節配
列またはエレメントが含まれる。
【００６９】7.5.造血細胞で活性化されるプロモーター
およびアクチベーター配列 この性質の遺伝子調節配列には、造血細胞で、またはス
トロマ等の隣接細胞で発現されるサイトカインに関する
遺伝子に対するプロモーター配列、もしくはその受容体
が含まれる。これらには以下のサイトカインおよびそれ
らの受容体、例えば、 幹細胞因子受容体 幹細胞因子 IL-1α IL-1受容体 IL-3 IL-3受容体(α-サブユニット) IL-3受容体(β-サブユニット) IL-6 IL-6受容体 GM-CSF GM-CSF受容体(α-鎖) インターフェロン調節因子1(IRF-1) IRF-1のプロモーターはIL-6により、IFNγまたはIFNβ
によるのと同様に十分に活性化される エリトロポエチン エリトロポエチン受容体 に対するプロモーター配列が含まれる。
【００７０】7.6.リンパ球および／またはマクロファー
ジで活性化されるプロモーターおよびアクチベーター配
列 これらには、例えば、サイトカイン、サイトカイン受容
体および接着分子、並びに抗体のFc断片に対する受容体
に対する遺伝子のプロモーターおよびアクチベーター配
列が含まれる。例としては： IL-1受容体 IL-1α IL-1β IL-2 IL-2受容体 IL-3 IL-3受容体(α-サブユニット) IL-3受容体(β-サブユニット) IL-4 IL-4受容体 IL-5 IL-6 IL-6受容体 インターフェロン調節因子1(IRF-1) IRF-1のプロモーターはIL-6により、IFNγまたはIFNβ
によるのと同様に十分に活性化される IFNγ-応答プロモーター IL-7 IL-8 IL-10 IL-11 IFNγ GM-CSF GM-CFS受容体(α-鎖) IL-13 LIF マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)受容体 マクロファージスカベンジャー受容体IおよびII型 MAC-1（白血球作用抗原） LFA-1α（白血球作用抗原） p150,95（白血球作用抗原） が挙げられる。
【００７１】7.7.滑膜細胞で活性化されるプロモーター
およびアクチベーター配列 これらには、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)、
例えば MMP-1（介在性コラゲナーゼ） MMP-3（ストロメライシン／トランシン） に対するプロモーター配列が含まれる。それらにはさら
に組織阻害剤メタロプロテアーゼ(TIMP)、例えば TIMP-1 TIMP-2 TIMP-3 に対するプロモーター配列が含まれる。 7.8.白血病細胞で活性化されるプロモーターおよびアク
チベーター配列 これらの例としては c-myc HSP-70 bcl-1/サイクリンD-1 bcl-2 IL-6 IL-10 TNFα,TNFβ HOX-11 BCR-Abl E2A-PBX-1 PML-RARA（前骨髄細胞性白血病-レチノイン酸受容体） c-myc c-mycタンパク質はMyc Eボックスと呼ばれる多量体ヌク
レオチド配列(5'-GGAAGCAGACCAGCTGGTCT GCTTCC-3')
（配列番号11）に結合してそれを活性化させるに対する
プロモーターが挙げられる。
【００７２】7.9.腫瘍細胞で活性化されるプロモーター
またはアクチベーター配列 腫瘍細胞で形成する、または活性化される転写因子がそ
れと相互作用する遺伝子調節ヌクレオチド配列が、プロ
モーターまたはアクチベーター配列であると認識されて
いる。本発明の範囲内で、好ましいプロモーターまたは
アクチベーター配列には、特に癌細胞または肉腫細胞で
形成されるタンパク質をコードする遺伝子由来の遺伝子
調節配列またはエレメントが含まれる。小細胞気管支癌
の場合にはN-CAMタンパク質のプロモーターを、卵巣癌
の場合には肝炎増殖因子受容体のまたはL-プラスチンの
プロモーターを、および膵臓癌の場合にはL-プラスチン
または多型性上皮ムチン(PEM)のプロモーターを使用す
ることが好ましい。 VI.エフェクター遺伝子[構成要素d)] 本発明の範囲内で、エフェクター遺伝子[構成要素d)]
は、疾病の予防および／または治療のための活性化合物
をコードする。エフェクター遺伝子およびプロモーター
配列は、疾病の治療の性質に関して、また導入されるべ
き標的細胞を考慮して選択される。
【００７３】例えば、以下の組み合わせのプロモーター
配列およびエフェクター遺伝子は、以下の疾病の場合に
選択される（詳しい記載は、欧州特許出願第95930524.4
号、同第95931933.6号、同第95931204.2号、同第959312
05.9号、同第97101507.5号、ドイツ特許第19617851.7
号、同第19639103.2号および同第19651443.6号にすでに
与えられており、これらは出典明示して本明細書の一部
とみなす）。
【００７４】1)腫瘍の治療 1.1)標的細胞：増殖内皮細胞または皮細胞に隣接してい
るストロマ細胞および筋細胞、または瘍細胞または白血
病細胞。 1.2)プロモーター：内皮細胞特異的かつ細胞周期特異
的、または細胞非特異的または筋細胞特異的かつ細胞周
期特異的、または腫瘍細胞特異的（固体腫瘍、白血病）
かつ細胞周期特異的 1.3)細胞増殖の阻害剤用のエフェクター遺伝子、例えば
網膜芽細胞腫タンパク質(pRb=p110)またはそれに関連す
るp107およびp130タンパク質 網膜芽細胞腫タンパク質(pRb/p110)およびそれに関連す
るp107およびp130タンパク質は、リン酸化によって不活
化されている。それによって損なわれた後者が機能する
ことなく発現したタンパク質の不活化部位に対する突然
変異を示すこれら細胞周期阻害剤のそれら遺伝子の使用
が優先的に与えられる。これらの突然変異の例はp110と
記載されている。
【００７５】p107タンパク質またはp130タンパク質に対
するＤＮＡ配列は、類似の方法で突然変異誘発される。
【００７６】p53タンパク質 タンパク質p53は、MDM2等の特別なタンパク質と結合す
ることによるか、または脱リン酸化したC末端セリンに
よってオリゴマー化したp53によるかのいずれかで細胞
中で不活化されている。結果として、セリン392によっ
てC末端で切断されているp53タンパク質に対するＤＮＡ
配列を用いることが優先的に与えられる。 p21(WAF-1) p16タンパク質 他のcdk阻害剤 GADD45タンパク質 bakタンパク質 調節タンパク質に対する結合タンパク質(II.1.を参照)
【００７７】1.4.凝固誘導因子および血管形成インヒビ
ターに対するエフェクター遺伝子、例えば： プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター(PAL-1) PAI-2 PAI-3 アンギオスタチン インターフェロン(IFNα,IFNβ,またはIFNγ） 血小板因子4 TIMP-1 TIMP-2 TIMP-3 白血病阻害因子(LIF) 組織因子(TF)およびその凝固活性断片 1.5)例えば パーフォリン グランザイム IL-2 IL-4 IL-12 IFNα,IFNβ,またはIFNγなどのインターフェロン TNFαまたはTNFβなどのTNF オンコスタチンM フィンゴミエリナーゼ マガイニンおよびマガイニン誘導体 に対する細胞増殖抑制タンパク質および細胞障害性タン
パク質に対するエフェクター遺伝子 1.6)細胞増殖抑制抗体または細胞障害性抗体に対する、
並びに抗原結合抗体断片と細胞増殖抑制タンパク質、細
胞障害性タンパク質または炎症性タンパク質、もしくは
酵素との間の融合タンパク質に対するエフェクター遺伝
子。 −細胞増殖抑制抗体または細胞障害性抗体には、例え
ば、Burrowsら (Pharmac.Ther. 64, 155 (1994))、Hugh
esら, (Cancer Res. 49, 6214 (1989))およびMaruyama
ら, (PNAS USA 87, 5744 (1990))により記載されている
ように、内皮細胞の膜構造に向けられるものが含まれ、
それらには特に、VEGF受容体に対する抗体が含まれる。 −またそれらには、腫瘍細胞上の膜構造に向けられる細
胞増殖抑制抗体または細胞障害性抗体が含まれる。この
性質を有する抗体は、例えば、Sedlacekら, Contrib. t
o Oncol. 32, Karger Verlag, Munich (1988)およびCon
trib. to Oncol.43, Karger Verlag, Munich (1992)に
よって概説されている。他の例としては、Sialyl Lewis
に対する、Ｔ細胞によって認識される腫瘍上のペプチド
に対する、癌遺伝子によって発現されるタンパク質に対
する、GD3、GD2、GM2、9-0-アセチルGD3およびフコシル
GM1等のガングリオシド類に対する、血液型抗原および
それらの前駆体に対する、多型性上皮ムチン上の抗原に
対する、並びに熱ショックタンパク質上の抗原に対する
抗体がある。 −さらにそれらには、白血病細胞の膜構造に向けられる
抗体が含まれる。この性質を有する多数のモノクローナ
ル抗体はすでに、診断および治療法として記載されてい
る（Kristensen, Danish Medical Bulletin 41, 52 (19
94); Schranz, Therapia Hungarica 38, 3 (1990); Dre
xlerら,Leuk. Res. 10, 279 (1986); Naeim, Dis. Mark
ers 7, 1 (1989); Stickneyら, Curr. Opin. Oncol. 4,
847 (1992); Drexlerら, Blut 57, 327 (1988); Freed
manら, Cancer Invest. 9, 69 (1991)で概説）。白血病
のタイプに依存して、以下の膜抗原に向けられるモノク
ローナル抗体、またはそれらの抗原結合抗体断片が、例
えばリガンドとして使用するのに適している。細胞 膜抗原 AML CD13 CD15 CD33 CAMAL シアロシル-Le B-CLL CD5 CD1c CD23 膜のイディオタイプおよびアイソタイプ 免疫グロブリン 細胞 膜抗原 T-CLL CD33 M38 IL-2受容体 Ｔ細胞受容体 ALL CALLA CD19 非ホジキンリンパ球 −ネズミ抗体のヒト化、並びにFabおよびrec. Fv断片に
対する遺伝子の調製および至適化は、当業者に公知の技
術によって達成される。rec. Fv断片の細胞増殖抑制タ
ンパク質、細胞障害性タンパク質または炎症性タンパク
質または酵素との融合も同様に、当業者に公知の技術の
状態に従って達成される。1.7)標的細胞結合リガンド、
並びに細胞増殖抑制タンパク質および細胞障害性タンパ
ク質を含む融合タンパク質に対するエフェクター遺伝
子。該リガンドには、内皮細胞上の膜構造または膜受容
体と結合するすべての物質が含まれる。例としては、IL
-1等のサイトカイン類、もしくは、内皮細胞によって発
現される受容体と結合する増殖因子、またはそれらの断
片、またはそれらの部分配列、例えば、PDGF、bFGF、VE
GFおよびTGF。
【００７８】またそれらには、活性化および／または増
殖内皮細胞と結合する接着分子が含まれる。これらの例
としては、SLex、LFA-1、MAC-1、LECAM-1、VLA-4または
ビトロネクチンがある。
【００７９】さらにそれらには、腫瘍または白血病細胞
の膜構造または膜受容体と結合する物質が含まれる。例
としては、ホルモン、もしくは白血病細胞または腫瘍細
胞によって発現される受容体と結合する増殖因子、また
はそれらの断片、またはそれらの部分配列がある。
【００８０】この性質を有する増殖因子はすでに記載さ
れている（Crossら, Cell 64, 271(1991)、Aulitzkyら,
Drugs 48, 667 （1994）、Moore, Clin. Cancer Res.
1,3 (1995), Van Kootenら, Leuk. Lymph. 12, 27 (199
3)で概説）。
【００８１】標的細胞と結合するこれらのリガンドの遺
伝子を、当業者に公知である方法を用いる技術の状態に
従って、細胞増殖抑制タンパク質、細胞障害性タンパク
質または炎症性タンパク質または酵素と融合させる。 1.8)例えば、 IL-1 IL-2 RANTES(MCP-2) 単球走化性因子および活性化因子(MCAF) IL-8 マクロファージ炎症タンパク質-1(MIP-1α、-β) 好中球活性化タンパク質-2(NAP-2) IL-3 IL-5 ヒト白血病阻害因子(LIF) IL-7 IL-11 IL-13 GM-CSF G-CSF M-CSF の炎症性インデューサーに対するエフェクター遺伝子 機能的にヒト補体因子C3bに相当するコブラ毒因子(CVF)
またはCVFの部分配列、すなわち補体因子Bと結合するこ
とができ、D因子による分割の後にC3変換酵素を構成す
る。
【００８２】ヒト補体因子C3またはその部分配列C3b CVFと機能的にも構造的にも類似したヒト補体因子C3の
分割産物 サルモネラ・チフィムリウム・ポリンス(Salmonella ty
phimurium porins)、スタフィロコッカス・オーレウス
(Staphylococcus aureus)凝集因子、モジュリン、特に
グラム陰性菌モジュリン、レジュネラ菌またはB型イン
フルエンザ菌またはクレブシエラ菌の主要外部膜タンパ
ク質、またはG群連鎖球菌のM分子等の補体を活性化す
る、または炎症を誘発する細菌タンパク質 1.9.)細胞分裂抑制剤の前駆体を活性化する酵素に対す
る、例えば、不活性な前駆体を（前駆薬剤）を活性細胞
分裂抑制剤（薬）へと分割する酵素に対するエフェクタ
ー遺伝子。
【００８３】この性質を有する物質、並びにそれらと密
接に関連している場合の前駆薬剤および薬剤がすでにDe
onarainら, (Br. J. Cancer 70, 786 (1994)、Mullen,
Pharmac.Ther. 63, 199 (1994)およびHarrisら(Gene Th
er. 1, 170 (1994))によって概説されている。例えば、
以下の酵素： 単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ 水痘ウイルスチミジンキナーゼ 細菌ニトロレダクターゼ 細菌β-グルクロニダーゼ セカル・セレアレ(Secale cereale)由来の植物β-グル
クロニダーゼ ヒトβ-グルクロニダーゼ ヒトカルボキシペプチダーゼ(CB)、例えばマスト細胞CB
-A、膵臓CB-B、細菌カルボキシペプチダーゼ 細菌β-ラクタマーゼ 細菌シトシンデアミナーゼ ヒトカタラーゼまたはペルオキシダーゼ ホスファターゼ、特にヒトアルカリ性ホスファターゼ、
ヒト酸性前立腺ホスファターゼ、または５型酸性ホスフ
ァターゼ オキシダーゼ、特にヒトリシルオキシダーゼ、またはヒ
ト酸性D-アミノオキシダーゼ ペルオキシダーゼ、特にヒトグルタチオンペルオキシダ
ーゼ、ヒト好酸球ペルオキシダーゼ、またはヒト甲状腺
ペルオキシダーゼ ガラクトシダーゼ の一つに対するＤＮＡ配列が使用される。 2)自己免疫疾患および炎症の治療 2.1)標的細胞： 増殖内皮細胞 マクロファージおよび／またはリンパ球、または滑膜細
胞 2.2)プロモーター：内皮細胞特異的または細胞周期特異
的、もしくはマクロファージ特異的かつ／またはリンパ
球特異的かつ／または細胞周期特異的、もしくは滑膜細
胞特異的かつ／または細胞周期特異的 2.3)例えば、 IFNβ INFγ IL-10 IL-4に対する抗体または抗体断片 可溶性IL-4受容体 IL-2 TGFβ のアレルギーの治療に関するエフェクター遺伝子 2.4)例えば、 IL-10 TGFβ 可溶性IL-1受容体 可溶性IL-2受容体 IL-1受容体アンタゴニスト 可溶性IL-6受容体 リンカーによって連結される免疫抑制抗体またはそれら
のVHおよびVL含有断片、もしくはそれらのVHおよびVL断
片。免疫抑制抗体の例としては、Ｔ細胞受容体またはそ
のCD3複合体に特異的であるか、もしくはCD4またはCD8
に対して、加えてIL-2受容体、IL-1受容体またはIL-4受
容体に対して、もしくは接着分子CD2、LFA-1,CD28また
はCD40に対して向けられる抗体があるに対する移植器官
の拒絶を防ぐためのエフェクター遺伝子 2.5)例えば、 TGFβ IFNα IFNβ INFγ IL-12 可溶性IL-4受容体 可溶性IL-6受容体 免疫抑制抗体またはそれらのVHおよびVL含有断片 に関する抗体介在自己免疫疾患の治療のためのエフェク
ター遺伝子 2.6)例えば、 IL-6 IL-9 IL-10 IL-13 TNFαまたはTNFβ 免疫抑制抗体またはそのVHおよびVL含有断片に関する細
胞介在自己免疫疾患の治療のためのエフェクター遺伝子 2. 7)細胞増殖、細胞分裂抑制タンパク質または細胞障
害性タンパク質および細胞分裂抑制剤の前駆体を活性化
する酵素の阻害剤に対するエフェクター遺伝子 この性質を有するタンパク質をコードする遺伝子の例
は、すでに「腫瘍治療のためのエフェクター遺伝子」で
挙げられている。
【００８４】その節においてすでに記載されたものと同
様の形態で、本発明の範囲内で、抗体またはこれら抗体
のFabまたはrec. Fv断片もしくは標的細胞に特異的な他
のリガンド、および前記したサイトカイン、増殖因子、
受容体、細胞分裂抑制タンパク質または細胞障害性タン
パク質、および酵素からなる融合タンパク質をコードす
るエフェクター遺伝子を使用することができる。 2. 8)関節炎の治療のためのエフェクター遺伝子 本発明の範囲内で、その発現タンパク質が直接的もしく
は間接的に例えば関節の炎症を阻害する、および／また
は関節内における細胞外マトリックス（軟骨、結合組
織）の再構成を促進するエフェクター遺伝子が選択され
る。
【００８５】例としては、 IL-1受容体アンタゴニスト(IL-1 RA); IL-1 RAはIL-1α、βの結合を阻害する 可溶性IL-1受容体； 可溶性IL-1受容体はIL-1に結合してこれを不活化する IL-6 IL-6は滑膜細胞および軟骨細胞によってTIMPおよびスパ
ーオキシドの分泌を増加させ、かつIL-1およびTNFαを
減少させる 可溶性TNF受容体 可溶性TNF受容体はTNFに結合してこれを不活化する IL-4 IL-4はLI-1、TNFαおよびMMPの形成、並びに分泌を阻害
する IL-10 IL-10はIL-1、TNFαおよびMMPの形成並びに分泌を阻害
し、かつTIMPの分泌を増加させる インスリン様増殖因子(IGF-1) IGF-1は細胞外マトリックスの合成を刺激する TGFβ、特にTGFβ1およびTGFβ2 TGFβは細胞外マトリックスの合成を刺激する スーパーオキシドジスムターゼ TIMP、特にTIMP-1、TIMP-2またはTIMP-3がある。 3)造血不全の治療 31)標的細胞：造血系の増殖未熟細胞、または造血細胞
に隣接するストロマ細胞 3.2)プロモーター：造血細胞に特異的かつ／または細胞
周期特異的細胞非特異的かつ細胞周期特異的 3.3)例えば エリトロポエチン に関する貧血症の治療のためのエフェクター遺伝子 3.4)例えば G-CSF GM-CSF M-CSF に関する白血球減少症の治療のためのエフェクター遺伝
子 3.5)例えば IL-3 白血病阻害因子(LIF) IL-11 トロンボポエチン に関する血小板減少症の治療のためのエフェクター遺伝
子 4)神経系に対する損傷の治療 4.1)標的細胞：グリア細胞または増殖内皮細胞 4.2)プロモーター：グリア細胞特異的かつ細胞周期特異
的、または内皮細胞特異的かつ細胞周期特異的、または
非特異的かつ細胞周期特異的 4.3)神経増殖因子に対するエフェクター遺伝子、例えば FGF 神経増殖因子(NGF) 脳由来神経栄養因子(BDNF) ニューロトロフィン3(NT-3) ニューロトロフィン4(NT-4) 毛様体神経栄養因子(CNTF) 4.4)例えば チロシンヒドロキシラーゼ ドーパデカルボキシラーゼ に関する酵素に対するエフェクター遺伝子 4.5)サイトカイン類および、例えば TGFβ 可溶性TNF受容体 TNF受容体はTNFαを無効にする IL-10 IL-10はIFNγ、TNFα、IL-2およびIL-4の形成を阻害す
る 可溶性IL-1受容体 IL-1受容体I IL-1受容体II 可溶性IL-1受容体はIL-1の活性を無効にする IL-1受容体アンタゴニスト 可溶性IL-6受容体 に対するTNFαの神経毒作用を阻害する、または無効に
するそれらのインヒビターに対するエフェクター遺伝子 5)血液凝固および血液循環系障害の治療 5.1)標的細胞：内皮細胞、または増殖内皮細胞、または
内皮細胞および平滑筋細胞近傍の体細胞、またはマクロ
ファージ 5.2)プロモーター：細胞非特異的かつ細胞周期特異的、
または内皮細胞、平滑筋細胞またはマクロファージ特異
的、かつ細胞周期特異的 5.3)例えば 組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA) ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター(uPA) tPAおよびuPAのハイブリッド Cタンパク質 ヒルジン C-1Sインヒビター、α1-アンチ抗トリプシン、またはア
ンチトロンビンIII等のセリンプロテナーゼインヒビタ
ー（セルピン類） 組織因子経路インヒビター(TFPI) に対する凝固阻害、または繊維素溶解誘導に関するエフ
ェクター遺伝子 5.4)例えば F VIII F IX フォンビルブラント因子 F XIII PAI-1 PAI-2 組織因子およびその断片 に関する凝固を誘導するエフェクター遺伝子 5.5)例えば VEGF FGF の血管形成因子に対するエフェクター遺伝子 5.6)例えば カリクレイン 内皮細胞ＮＯシンターゼ に関する血圧低下のためのエフェクター遺伝子 5.7)例えば抗増殖タンパク質、細胞分裂抑制タンパク
質、または細胞障害性タンパク質、もしくはすでに上に
挙げたような細胞分裂抑制剤前駆体の細胞分裂抑制剤へ
の分割のための酵素（腫瘍下）もしくはこれらの活性化
合物の一つとリガンド、例えば、筋細胞に特異的な抗体
または抗体断片との融合タンパク質に関する内皮層の損
傷に続く、平滑筋細胞の増殖を阻害するエフェクター遺
伝子 5.8)例えば アルブミン C1インアクチベーター 血清コリンエステラーゼ トランスフェリン 1-アンチトリプシン に関する他の血漿タンパク質に対するエフェクター遺伝
子 6)予防接種 6.1)標的細胞：筋細胞またはマクロファージおよび／ま
たはリンパ球 内皮細胞 6.2)プロモーター：非特異的かつ細胞周期特異的、もし
くは標的細胞特異的かつ細胞周期特異的 6.3)感染症の予防のためのエフェクター遺伝子
【００８６】従来、有効なワクチンの製造の可能性は制
限されてきた。従って、ＤＮＡワクチンの技術が開発さ
れた。しかしながら、これらＤＮＡワクチンは効力の点
で問題が生じる。
【００８７】本発明によって製造されるＤＮＡワクチン
は、より効果的となることが期待できる。
【００８８】選択されるべき活性物質とは、感染性病原
体によって形成され、免疫反応を引き起こすことによっ
て、すなわち抗体形成によって、および／または細胞障
害性Ｔリンパ球によって、その病原体の中和化および／
または妨害をもたらすタンパク質に対するＤＮＡであ
る。この性質を有するいわゆる中和抗原は、予防接種抗
原としてすでに使用されている（Ellis, Adv. Exp. Me
d. Biol. 327, 263 (1992)の概説を参照）。
【００８９】本発明の範囲内で、好ましくは、以下の病
原体の中和抗原をコードするＤＮＡが挙げられる： Ａ型インフルエンザウイルス HIV 狂犬病ウイルス HSV（単純ヘルペスウイルス） RSV（RSウイルス） パラインフルエンザウイルス ロタウイルス VZV（水痘帯状ヘルペスウイルス） CMV（サイトメガロウイルス） はしかウイルス HPV（ヒトパピローマウイルス） HBV（Ｂ型肝炎ウイルス） HCV（Ｃ型肝炎ウイルス） HDV（Ｄ型肝炎ウイルス） HEV（Ｅ型肝炎ウイルス） HAV（Ａ型肝炎ウイルス） コレラ菌抗原 ボレリア・ブルグドレエフィリ(Borrelia burgdorferi) ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori) マラリア抗原。
【００９０】しかしながら、本発明の範囲内で、この性
質を有する活性物質にはまた、その抗原結合構造（相補
性決定領域）が感染性病原体の中和抗原（neutralizati
on antigen）のタンパク質または炭水化物構造のコピー
からなる抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片
が含まれる。この性質を有する抗イディオタイプ抗体
は、特に細菌性の感染性病原体の場合には、炭水化物抗
原に置き換わる。
【００９１】この性質を有する抗イディオタイプ抗体お
よびそれらの切断産物は、Hawkisら, (J. Immunother.
14, 273 (1993))およびWesterinkおよびApicella(Sprin
gerSeminars in Immunopathol. 15, 227 (1993))によっ
て概説されている。 6.4)「腫瘍ワクチン」のエフェクター遺伝子 これらには腫瘍細胞上の抗原が含まれる。この性質を有
する抗原は、例えば、Sedlacekら, Contrib. to Oncol.
32, Karger Verlag, Munich (1988)およびContrib. to
Oncol 43, Karger Verlag, Munich (1992)により概説さ
れている。
【００９２】他の例としては、以下のタンパク質抗原ま
たは以下の非タンパク質抗原： ガングリオシド シアリル・ルイス Ｔ細胞により認識される腫瘍上のペプチド 癌遺伝子により発現されるタンパク質 血液型抗原およびそれらの前駆体 腫瘍関連ムチン上の抗原に相当するアンチイディオタイ
プ抗体の可変領域(VL,VH)に対する遺伝子がある。 7)慢性感染症の治療 7.1)標的細胞： 肝細胞 リンパ球および／またはマクロファージ 上皮細胞 内皮細胞 7.2)プロモーター：ウイルス特異的、または細胞特異
的、かつ細胞周期特異的 7.3)例えば細胞分裂抑制作用、アポトーシス作用、また
は細胞障害作用を示すタンパク質抗ウイルス性物質また
は細胞障害性物質の前駆体をその活性物質へと分割する
酵素 7.4)抗ウイルスタンパク質に対するエフェクター遺伝子 抗ウイルス作用を有するサイトカイン類および増殖因子 これらには、例えば、IFNα、INFβ、INFγ、TNFβ、TN
Fα、IL-1、またはTGFβがある。
【００９３】各ウイルスを不活化する特異性を有する抗
体、またはそれらのVHおよびVL含有断片、またはそれら
のVHおよびVL断片、それらはリンカーによって連結さ
れ、すでに記載されたように調製される。
【００９４】以下はウイルス抗原に対する抗体の例であ
る： 抗HBV 抗HCV 抗HSV 抗HPV 抗HIV 抗EBV 抗HTLV 抗コキサッキーウイルス 抗ハンタンウイルス −Rev結合タンパク質。これらタンパク質はRevＲＮＡに
結合して、レトロウイルス遺伝子発現におけるRev依存
転写後段階を阻害する。 RBP9-27 RBP1-8U RBP1-8D RBP1-8の偽遺伝子 −細胞周期制御タンパク質に関する遺伝子のｍＲＮＡ、
またはウイルスのｍＲＮＡを消化するリボザイム。HIV
に対して触媒効果を有するリボザイムは、例えば、Chri
stoffersenら,J. Med. Chem. 38, 2033 (1995)により概
説されている。 5)抗菌タンパク質に対するエフェクター遺伝子 抗菌タンパク質には、例えば、細菌毒性を中和するか、
または細菌にオプソニンを作用させる抗体が含まれる。
例としては、 髄膜炎菌(Meningococci)CおよびB 大腸菌(E.coli) ボレリア(Borrelia) シュードモナス(Pseudomonas) ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori) スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aure
us) Vll.同一のまたは異なるエフェクター遺伝子の組み合わ
せ さらに本発明は、２つの同一または２つの異なるエフェ
クター遺伝子ｃ[構成要素c)およびc')]のＤＮＡ配列が
組み合わされる、薬理学的に制御可能な発現系に関す
る。発現されるべき２つのＤＮＡ配列については、その
２つのエフェクター因子の間に、さらに調節要素として
プロモーター配列、または好ましくは「インターナル・
リボゾーム・エントリー・サイト(internal ribosome e
ntry site(IRES)」に対するｃＤＮＡが挿入される。
【００９５】IRESはIRESによって互いに連結される２つ
のＤＮＡ配列を発現することが可能にする。
【００９６】この性質を有するIRESは、例えば、Montfo
rdおよびSmith(TIG 11, 179 (1995); Kaufmanら, Nucl.
Acids Res. 20, 1293 (1992); Dirksら, Gene 128, 24
7 (1993); PelletierおよびSonenberg, Nature 334, 32
0 (1988)およびSugitomoら,BioTechn. 12, 694 (1994))
により記載されている。
【００９７】例えばポリオウイルスのIRES配列（5'UTR
の140以上630以下位）に対するｃＤＮＡが用いられる。
【００９８】本発明の範囲内で、付加的な効果を示すエ
フェクター遺伝子は付加的プロモーター配列またはIRES
配列により連結されることが好ましい。
【００９９】本発明によれば、好ましくは、以下のよう
にエフェクター遺伝子を組み合わせることができる。 1)腫瘍の治療 同一または異なる、細胞分裂抑制、アポトーシス、細胞
障害性または炎症性タンパク質、もしくは細胞分裂抑制
剤の前駆体を分割する同一または異なる酵素 2)自己免疫疾患の治療 異なるサイトカイン類または細胞性および／またはホル
モン性免疫反応の阻害に相乗効果を有する受容体異なる
または同一のTIMP 3)造血不全の治療 IL-1、IL-3、IL-6、またはGM-CSF等の異なる階層分類上
連続したサイトカイン類、およびエリトロポエチン、G-
CSFまたはトロンボポエチン 4)神経細胞損傷の治療 神経増殖因子およびサイトカイン、またはサイトカイン
のインヒビター 5)血液凝固および血液循環系障害の治療 抗血栓剤および繊維素溶解剤（例えばtPAまたはuPA）ま
たは細胞分裂抑制、アポトーシスまたは細胞障害性タン
パク質および抗血栓剤または繊維素溶解剤相乗的に作用
するいくつかの異なる血液凝固因子、例えばF VIIIおよ
びvWFまたはF VIIIおよびF IX 6)予防接種 抗原およびIL-1α、IL-1β、IL-2、GM-CSF、IL-3または
IL-4受容体等の免疫刺激性サイトカイン ある感染性病原体の、または異なる感染性病原体の異な
る抗原、もしくはある腫瘍種の、または異なる腫瘍種の
異なる抗原 7)ウイルス感染症の治療 抗ウイルスタンパク質および細胞分裂抑制、アポトーシ
スまたは細胞障害性タンパク質 あるウイルスまたはいくつかのウイルスの異なる表面抗
原に対する抗体 8)細菌感染症の治療 微生物の異なる表面抗原および／または毒素に対する抗
体。
【０１００】シグナル配列の挿入およびトランスメンブ
レンドメイン（transmembrane） 1) 翻訳の増強 翻訳を増強するために、該ヌクレオチド配列GCCACCもし
くはGCCGCC(Kozak,, J. Cell Biol. 108, 299 (1989))
を、プロモーター配列の3'末端、および直接的にそのシ
グナルの開始シグナル(ATG)の5'末端、もしくはトラン
スメンブレン配列に挿入することができる。 2) 分泌の促進 エフェクター遺伝子の発現産物の分泌を促進するため
に、そのエフェクター遺伝子のＤＮＡ配列に存在すると
考えられる相同シグナル配列を、細胞外放出を増進する
異種シグナル配列に置換することができる。例えば、免
疫グロブリンシグナル配列（ＤＮＡ63ないし107位; Rie
chmannら,Nature 332, 323 (1988)）またはCEAシグナル
配列（ＤＮＡ33ないし134位, Schreweら, Mol. Cell Bi
ol. 10, 2738 (1990); Berlingら, Cancer Res. 50, 65
34(1990))またはヒト・レスピレーター・シンシシャル
・ウイルス糖蛋白シグナル配列（アミノ酸のｃＤＮＡ38
ないし50、または48ないし65位; Lichtensteinら,J. Ge
n. Virol. 77, 109 (1996))を挿入することができる。
【０１０１】3) 活性化合物の固定 3. 1)別法として、またはシグナル配列に加えて、該活
性化合物を生成する形質導入細胞の細胞膜に該活性化合
物を固定化することを目的として、トランスメンブレン
ドメインに対する配列を挿入することができる。かくし
て、例えば、ヒトマクロファージコロニー刺激因子のト
ランスメンブレン配列（ＤＮＡ1485ないし1554位; Cosm
anら, Behring Inst. Mitt. 83, 15 (1988))、またはヒ
トレスピレーター・シンシシャル・ウイルス(RSV)糖タ
ンパク質Gのシグナルおよびトランスメンブレン領域に
対するＤＮＡ配列（アミノ酸1ないし63、もしくはその
部分配列アミノ酸38ないし63; Vijayaら, Mol. Cell Bi
ol.8, 1709 (1988); Lichtensteinら, J. Gen. Virol.
77, 109 (1996))、またはインフルエンザウイルス・ノ
イラミニダーゼのシグナルおよびトランスメンブレン領
域に対するＤＮＡ配列（アミノ酸7ないし35、もしくは
その部分配列アミノ酸7ないし27; Brownら, J. Virol.
62, 3824 (1988)）をプロモーター配列とエフェクター
遺伝子配列の間に挿入することができる。 3. 2)しかしながら、活性化合物を生成する形質導入細
胞の細胞膜に活性化合物を固定化する目的で、また、糖
リン脂質アンカーに対するヌクレオチド配列を挿入する
こともできる。
【０１０２】糖リン脂質アンカーはエフェクター遺伝子
に対するヌクレオチド配列の3'末端に挿入され、この挿
入はシグナル配列の挿入に加えて起こり得る。糖リン脂
質アンカーは、例えばCEAに関して、N-CAMおよびThy-1
等の他の膜タンパク質に関して記載されている（Fergus
onら, Ann. Rev. Biochem. 57, 285 (1988)の総説を参
照）。
【０１０３】3. 3)本発明によれば、リガンド−活性化
合物融合タンパク質のＤＮＡ配列の使用は、活性化合物
の細胞膜への固定のためのもう１つの選択を提示する。
この融合タンパク質のリガンドの特異性は、選択された
標的細胞の細胞膜の膜構造に向けられる。
【０１０４】細胞表面に結合するリガンドには、表面構
造に対して向けられる抗体もしくは抗体断片が含まれ
る。例えば −内皮細胞。これらの抗体には、特にVEGF受容体に対す
る、またはキニン受容体に対する抗体が含まれる。 −アクチンに対する抗体、もしくはアンギオテンシンII
受容体に対する抗体、もしくはEGF受容体やPDGF受容体
やFGF受容体などの増殖因子受容体に対する抗体、もし
くはエンドセリンA受容体に対する抗体等の筋肉細胞に
関するもの −リガンドはまた、腫瘍細胞膜上の腫瘍特異的もしくは
腫瘍会合抗原に対して向けられる抗体もしくはその断片
も含む。この性質を有する抗体は、すでに記載されてい
る。
【０１０５】ネズミモノクローナル抗体は、ヒト化され
た形態で用いるのが好ましい。当業者によく知られてい
る技術を用いて、すでに記載されているように、Fabお
よびrec.Fv断片およびそれらの融合産物が調製される。
【０１０６】さらに、該リガンドには選択された特定の
細胞上の膜構造または膜受容体に結合するサイトカイン
類、接着分子、増殖因子またはそれらの断片、またはそ
の部分配列、メディエーターもしくはペプチドホルモン
等のすべての活性化合物が含まれる。これらのリガンド
の例としては、 −IL-1、PDGF、bFGF、VEGF、TGGβもしくはキニンおよ
びキニンの誘導体または類似体等、内皮細胞のリガンド −加えて、該リガンドは接着分子を含む。SLex、LFA-
1、MAC-1、LeCAM-1、VLA-4もしくはビトロネクチンおよ
びビトロネクチンの誘導体または類似体等、この性質を
有する接着分子は、すでに内皮細胞に関して記載されて
いる（Augustin-Vossら, J. Cell Biol. 119, 483 (199
2); Pauliら, Cancer Metast. Rev. 9, 175(1990); Hon
nら, Cancer Metast. Rev. 11, 353 (1992); Varnerら,
Cell Adh.Commun. 3, 367(1995)に概説）。
【０１０７】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明する。
【０１０８】1)癌遺伝子調節発現系の調製 本発明によれば、癌遺伝子調節発現系は以下、互いに下
流方向に続く異なるヌクレオチド配列を含有する。 構成要素a) ・cdc25C遺伝子のプロモーター（核酸-290ないし+121;
Zwickerら, EMBO J. 14,4514 (1995); Zwickerら, Nuc
l. Acids Res. 23, 3822 (1995)) 構成要素b) ・SV40の核局在化シグナル(NLS) (SV40ラージT, アミノ
酸126ないし132; PKKKRKV(配列番号13); Dingwallら, T
IBS 16, 478 (1991)) ・HSV-1 VP16の酸トランス活性化ドメイン(TAD)（アミ
ノ酸406ないし488; Triezenbergら, Genes Developm.
2, 718 (1998); Triezenberg, Curr. Opin. Gene Devel
opm. 5, 190 (1995)) ・E2F-1タンパク質のRB結合配列（アミノ酸409ないし42
6 (LDYHFGLEEGEGIRDLFD)（配列番号14）; Flemington
ら, PNAS USA 90, 6914 (1993); Helinら, Cell 70, 33
7 (1992)) ・Gal4タンパク質のＤＮＡ結合ドメインに対するｃＤＮ
Ａ（アミノ酸1ないし147; ChasmanおよびKornberg, Mo
l. Cell Biol. 10, 2916 (1990)） 構成要素c) ・ヌクレオチド配列5'-CGGACAATGTTGACCG-3'を有するGa
l4ＤＮＡ結合配列に対する10x結合配列(配列番号1)(Cha
smanおよびKornberg, Mol.Cell Biol. 10, 2916(1990)) ・SV40基本プロモーター（核酸48ないし5191; Toose
(編) DNA Tumor Viruses; Cold Spring Harbor, New Yo
rk, New York, Cold Spring Harbor Laboratory） 構成要素d) ・配列GCCACC(Kodak, J. Cell Biol. 108, 229 (1989)) ・免疫グロブリンシグナルペプチドに対するｃＤＮＡ
（ヌクレオチド配列63ないし107; Riechmannら, Nature
332, 323 (1988)) ・β-グルクロニダーゼに対するｃＤＮＡ（ヌクレオチ
ド配列93ないし1982; Oshimeら, PNAS USA 84, 685 (19
87)) 該構築体の個々の構成要素は、PCR増幅によって異なる
要素の末端に導入される適切な制限部位によって連結さ
れる。該連結は、制限部位、およびＤＮＡリガーゼに対
して特異的である酵素を用いて達成され、このことは当
業者にとっては公知である。これらの酵素は、商業的に
入手することが可能である。
【０１０９】このようにして調製されたヌクレオチド構
築体を、pXP2プラスミドベクター(Nordeen, BioTechniq
ues 454 (1988))中にクローン化し、これを直接または
コロイド分散系のいずれかでイン・ビボでの適用に用い
る。
【０１１０】培養で維持されている3T3繊維芽細胞（RB
陽性）および骨肉腫細胞（SAOS-2、RB陰性）を、当業者
に公知の方法(Lucibelloら, EMBO J. 132 (1995))を用
いて先前記したプラスミドでトランスフェクトして、該
繊維芽細胞によってまたは骨肉腫細胞によって産生され
たβ-グルクロニダーゼの量を、基質として4-メチルア
ンベリフェリル-β-グルクロニドを用いて測定する。
【０１１１】細胞周期特異性を調べるために、48時間メ
チオニンを除去することによって骨肉腫細胞をG0/G1に
同調化する。該細胞のＤＮＡ含量を、Hoechst 33258で
染色した後に蛍光活性化細胞ソーターで測定する(Lucib
elloら, EMBO J. 132 (1995))。以下の結果が得られ
る。
【０１１２】非トランスフェクト繊維芽細胞と比較する
と、トランスフェクト繊維芽細胞（RB陽性）ではβ-グ
ルクロニダーゼが増加しないことが明らかである。
【０１１３】トランスフェクト骨肉腫細胞（RB陰性）
は、非トランスフェクト骨肉腫細胞よりも著しく多いβ
-グルクロニダーゼを発現する。
【０１１４】増殖骨肉腫細胞(ＤＮＡ>2S; S=染色体の単
一セット)は、G0/G1に同調化した骨肉腫細胞(ＤＮＡ=2
S）よりも著しく多いβ-グルクロニダーゼを分泌する。
【０１１５】続いて、前記した発現系は、例えばプロモ
ーター配列の選択による細胞周期に依存する様式で調節
され得る構造遺伝子β-グルクロニダーゼのRB依存性発
現を生ずる。2) ウイルス調節発現系の調製本発明のウ
イルス制御発現系は、互いに下流方向に続く以下の異な
るヌクレオチド配列を含有する。
【０１１６】構成要素a) ・cdc25C遺伝子のプロモーター（核酸-290ないし+121;
Zwickerら, EMBO J. 14,4514 (1995); Zwickerら, Nuc
l. Acads Res. 23, 3822 (1995)) 構成要素b) ・SV40の核局在化シグナル(NLS)（SV40ラージT、アミノ
酸126ないし132; PKKKRKV （配列番号13）; Dingwall
ら, TIBS 16, 478 (1991)） ・HSV-1 VP16の酸性トランス活性化ドメイン(TAD)（ア
ミノ酸406ないし488; Triezenbergら, Genes Developm.
2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Genes Dev
elopm. 5, 190 (1995)) ・HPV-18ウイルスのE6タンパク質（ヌクレオチド配列10
0ないし578; Roggenbuckら, J. Virol. 65, 5068 (199
1)) ・Gal4タンパク質のＤＮＡ結合ドメインに対するｃＤＮ
Ａ（アミノ酸1ないし147; ChasmanおよびKoenberg, Mo
l. Cell Biol. 10, 2916 (1990)） 構成要素c) ・ヌクレオチド配列5'-CGGACAATGTTGACCG-3'（配列番号
1）を有するGal4 ＤＮＡ結合配列に対する10x結合配列
(ChasmanおよびKoenberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916
(1990) ・SV40基本プロモーター（核酸48ないし5191; Toose
(編) DNA Tumor Viruses;Cold Spring Harbor, New Yor
k, New York,Cold Spring Harbor Laboratory) 構成要素d） ・配列GCCACC (Kodak, J. Cell Biol. 108, 229 (198
9)) ・免疫グロブリンシグナルペプチドに対するｃＤＮＡ
（ヌクレオチド配列63ないし107; Riechmannら, Nature
332, 323 (1988)) ・β-グルクロニダーゼに対するｃＤＮＡ（ヌクレオチ
ド配列93ないし1982; Oshimaら, PNAS USA 84, 685 (19
87)） 該構築体の個々の構成要素は、PCR増幅によって異なる
構成要素の末端に導入される適切な制限部位によって連
結している。該連結は、制限部位、およびＤＮＡリガー
ゼに対して特異的である酵素を用いて達成され、このこ
とは当業者にとっては公知である。これらの酵素は、商
業的に入手することが可能である。
【０１１７】このようにして調製されたヌクレオチド構
築体を、pUC18/19プラスミドベクター中にクローン化
し、これを直接またはコロイド分散系のいずれかでイン
・ビボでの適用に用いる。
【０１１８】培養で維持されているるヒト繊維芽細胞
（WI-38、E6/E7陰性）および子宮頸癌細胞（HeLa,HPV-1
8-E6/E7陽性）を、当業者に公知の方法(Lucibelloら, E
MBO J.132 (1995))を用いて先に記載したプラスミドで
トランスフェクトして、これらの細胞によって生成した
β-グルクロニダーゼの量を、基質として4-メチルアン
ベリフェリル-β-グルクロニドを用いて測定する。
【０１１９】細胞周期特異性を調べるために、48時間メ
チオニンを除去することによってHeLa細胞をG0/G1に同
調化する。該細胞のＤＮＡ含量を、Hoechst 33258で染
色した後に蛍光活性化細胞ソーターで測定する(Lucibel
loら, EMBO J. 132 (1995))。以下の結果が得られる。
【０１２０】非トランスフェクト繊維芽細胞と比較する
と、トランスフェクト繊維芽細胞ではβ-グルクロニダ
ーゼが増加しないことが明らかである。
【０１２１】トランスフェクトHeLa細胞は、非トランス
フェクトHeLa細胞よりも著しく多くβ-グルクロニダー
ゼを発現する。
【０１２２】増殖HeLa細胞(ＤＮＡ>2S; S=染色体の単一
セット)は、G0/G1に同調化したHeLa細胞(ＤＮＡ=2S)よ
りも著しく多くβ-グルクロニダーゼを分泌する。
【０１２３】続いて、前記した発現系は、例えばプロモ
ーター配列の選択による細胞周期に依存した方法で調節
され得る構造遺伝子β-グルクロニダーゼのウイルス特
異的(HPV18)発現を生ずる。
【０１２４】その後局所投与、例えば腫瘍部位への投
与、あるいはその後の頭蓋内もしくはクモ膜下投与また
は全身投与、好ましくは静脈内もしくは動脈内投与にお
いて、実施例1および2の活性化合物が、独占的ではない
場合には主として、β−グルクロニダーゼを分泌する癌
遺伝子の変異またはウイルス感染を示す細胞のみを示す
ことは確かである。このβ-グルクロニダーゼは、注入
した十分耐性があるドキソルビシン-β-グルクロニド(J
acquesyら, EP0511 917 A1)を、細胞分裂抑制的に作用
するドキソルビシンへと分割する。後者は内皮細胞増殖
を阻害し、かつこれらの細胞上でおよび隣接する腫瘍細
胞上でも細胞増殖抑制的に作用する。このことによっ
て、腫瘍の増殖が阻害される。
【０１２５】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Hoechst Marion Roussel Deutshland GmbH <120> Oncogene- or virus-controlled expression systems <130> 118068 <140> <141> <160> 14 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:binding sequence for gal-4 prot ein <400> 1 CGGACAACTG TTGACCG 17 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:binding sequence for LexA prote in <400> 2 TACTGTATGT ACATACAGTA 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:lac operator binding sequence <400> 3 GAATTGTGAG CGCTCACAAT TC 22 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:tet O binding sequence <400> 4 TCGAGTTTAC CACTCCCTAT CAGTGATAGA GAAAAGTGAA AG 42 <210> 5 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:binding sequence for ZFHD-1 pro tein <400> 5 TAATGATGGC G 11 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:binding sequence for p53 protei n <400> 6 ATAATTGGGC AAGTCTAGGA A 21 <210> 7 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:binding sequence for NF kappa B protein <400> 7 GGGACTTTCC 10 <210> 8 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:binding sequence for E2F/DP-1 <400> 8 TTTTCCCGCC AAAA 14 <210> 9 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:binding sequence for E2F/DP-1 <400> 9 TTTTCCCGCC TTTTTT 16 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:binding sequence for E2F/DP-1 <400> 10 TTTTCCCGCG CTTTTTT 17 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Myc E box <400> 11 GGAAGCAGAC CACGTGGTCT GCTTCC 26 <210> 12 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:binding sequence for GATA-4 <400> 12 GGCCGATGGG CAGATAGAGG GGGCCGATGG GCAGATAGAG G 41 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:SV40 large T (126-132) <400> 13 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 14 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:E2F-1 protein (409-426) <400> 14 Leu Asp Tyr His Phe Gly Leu Glu Glu Gly Glu Gly Ile Arg Asp Leu 1 5 10 15 Phe Asp
【図面の簡単な説明】
【図１】核酸構築体の構成要素および配置を表した図で
ある。
【図２】具体例Aの核酸構築体の構成要素の配置を模式
的に表した図である。
【図３】具体例Bの核酸構築体の構成要素の配置を模式
的に表した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロルフ、ミューラー ドイツ連邦共和国マールブルク、ポイティ エールシュトラーセ、８ (72)発明者 ハンス‐ハラルト、ゼトラチェック ドイツ連邦共和国マールブルク、ゾネンハ ンク、３ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA07 CA04 DA02 EA02 EA04 FA02 FA06 GA18 HA17 4B065 AA90X AA93X AB01 AC14 BA02 CA27 CA44

Claims (34)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】エフェクター遺伝子の発現用核酸構築体で
    あって、核酸構築体に含まれる転写因子遺伝子（構成要
    素b）の発現を制御するプロモーターＩ（構成要素a）
    と、該転写因子遺伝子の遺伝子産物が特異的に結合し、
    かつ、核酸構築体に含まれるエフェクター遺伝子（構成
    要素d）の発現を制御するプロモーターII（構成要素c）
    とを含有してなり、該転写因子遺伝子の遺伝子産物の活
    性がこの遺伝子産物に特異的に結合し、かつその活性に
    影響を与える１以上の細胞調節タンパク質に依存する、
    核酸構築体。
  2. 【請求項２】構成要素a)が構成要素b)の転写に対する活
    性化配列であり；構成要素b)が b1)活性化ドメイン、 b2)細胞調節タンパク質に対する結合配列、 b3)ＤＮＡ結合ドメイン を含む転写因子であり；構成要素c)が構成要素b)の発現
    産物と結合することによって活性化され、かつ構成要素
    d)の転写を活性化する活性化配列であり；構成要素d)が
    エフェクター遺伝子である請求項１記載の核酸構築体。
  3. 【請求項３】構成要素a、bおよびcが下記構成要素a'、
    b'およびc'： 構成要素a')：a1)細胞調節タンパク質に対するＤＮＡ結
    合配列と a2)基本プロモーターとを含む構成要素b')の転写に対す
    る活性化配列 構成要素b')：リプレッサータンパク質を構成し、かつ
    構成要素c')を阻害する転写因子 構成要素c')：c1)構成要素d)の転写に対する活性化配列
    と c2)該リプレッサータンパク質[構成要素b')]と結合し、
    それによって構成要素d)の転写の活性化を阻害するＤＮ
    Ａ配列とを含む活性化配列 構成要素d)：エフェクター遺伝子の形態である、請求項
    １記載の核酸構築体。
  4. 【請求項４】構成要素a)が構成要素c)と同一である、請
    求項２記載の核酸構築体。
  5. 【請求項５】構成要素a)または構成要素c1)が、非特異
    的、細胞特異的、代謝特異的、ウイルス特異的および／
    または細胞周期特異的に活性化され得るプロモーター配
    列である、請求項２または３記載の核酸構築体。
  6. 【請求項６】構成要素a)または構成要素c1)が−内皮細
    胞、腹膜細胞、胸膜細胞、皮膚、肺、胃腸管、腎臓およ
    び尿道の上皮細胞、筋肉細胞、結合組織細胞、造血細
    胞、マクロファージ、リンパ球、白血病細胞、腫瘍細胞
    またはグリア細胞で活性化されるプロモーター、もしく
    はHBV、HCV、HSV、HPV、EBV、HTLV、CMVまたはHIV等の
    ウイルス由来プロモーター低酸素症によって活性化され
    るプロモーターまたはエンハンサー配列、もしくはcdc2
    5C、サイクリンA、cdc2、E2F-1、B-mybおよびDHFRに対
    する遺伝子の細胞周期特異的活性化配列単量体または多
    量体Myc Eボックス等の、細胞増殖に依存する様式で形
    成されるか、または活性化される転写因子に対する結合
    配列からなる群より選択される、請求項５記載の核酸構
    築体。
  7. 【請求項７】構成要素b)の活性化ドメイン[構成要素
    b1)]が、転写因子Oct-2、Sp1、NFY、ITF-2、VP-16、c-M
    ycおよびCTFの活性化ドメインからなる群より選択され
    る請求項２〜６のいずれか１項に記載の核酸構築体。
  8. 【請求項８】細胞調節タンパク質に対する結合配列[構
    成要素b)の構成要素b2)]が細胞結合タンパク質またはこ
    の結合タンパク質の一部である、請求項２〜７のいずれ
    か１項に記載の核酸構築体。
  9. 【請求項９】細胞結合タンパク質またはこの結合タンパ
    ク質の一部が、p53、pRb、p130、Max、MAD、VHL、cdk-
    4、MTS-1(p16)、WT-1、SMAD-2およびDPC-4からなる群よ
    り選択される細胞調節タンパク質に結合する、請求項８
    記載の核酸構築体。
  10. 【請求項１０】構成要素b')がE2F-1、-2、-3、-4、-5、
    サイクリン-D1、-D2、-D3、または-C、サイクリンA、-
    E、Myc、転写因子PU.1またはElf-1、エロンガン-B、-
    C、p14、p15、p16、p18、p21、p27、p53、Myc、cdk-4、
    DPC-4およびSMAD-2からなる細胞結合タンパク質の群よ
    り選択される、請求項9記載の核酸構築体。
  11. 【請求項１１】細胞調節タンパク質に対する結合配列
    [構成要素b)の構成要素b2)]がウイルス結合タンパク質
    またはこの結合タンパク質の一部である、請求項７記載
    の核酸構築体。
  12. 【請求項１２】ウイルス結合タンパク質またはこの結合
    タンパク質の一部が、p53、pRb(p110)、NFKB、p130、CB
    F-1、Lynチロシンキナーゼ、bakおよびbaxからなる群よ
    り選択される細胞調節タンパク質に結合する、請求項１
    １記載の核酸構築体。
  13. 【請求項１３】構成要素b2)がCMVのIE 84、AVのE1B(55k
    D)、EBVのEBNA-5、EBVのBHFR、HPV-16または-18のE6、H
    BVのxタンパク質、SV40のT抗原、AVのE14、EBVのEBNA-
    2、EBVのEBNA-1、HPVのE7、HIVのTax、EBVのLMP-1、EBV
    のLMP-2AまたはLMP-2B、AVのE1B(16kD)、およびAVのE1B
    (10kB)からなるウイルス結合タンパク質の群より選択さ
    れる、請求項１２記載の核酸構築体。
  14. 【請求項１４】細胞調節タンパク質に対する結合配列
    [構成要素b)の構成要素b2)]が抗体またはこの抗体の一
    部である、請求項７記載の核酸構築体。
  15. 【請求項１５】構成要素c)が構成要素b)と結合するため
    の少なくとも１つのＤＮＡ配列を含み、かつこの結合の
    結果として構成要素d)の発現を活性化する、請求項１〜
    １４のいずれか１項記載の核酸構築体。
  16. 【請求項１６】ＤＮＡ配列がGal4タンパク質に対する結
    合配列(5'-CGGACAACTGTTGACCCG-3',配列番号1)、LexAタ
    ンパク質に対する結合配列(5'-TACTGTATGTACATACAGTA-
    3',配列番号2)、Lac I受容体タンパク質に対する結合配
    列(5'-GAATTGTGAGCGCGCACAATTC-3',配列番号3)、テトラ
    サイクリン受容体タンパク質に対する結合配列(5'-TCGA
    GTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAA GTGAAAG-3',配列番
    号4)、およびZFHD-1タンパク質に対する結合配列(5'-TA
    ATGATGGGCG-3',配列番号5)からなる群より選択される、
    請求項１５記載の核酸構築体。
  17. 【請求項１７】細胞調節タンパク質に対するＤＮＡ結合
    配列[構成要素a1)]が、p53、Ｗ4-1、NFκB、E2F/DPまた
    はMyc/Maxタンパク質からなる群より選択されるＤＮＡ
    結合配列である、請求項１１〜１４のいずれか１項に記
    載の核酸構築体。
  18. 【請求項１８】該基本プロモーター[構成要素a2)]がSV4
    0、c-fos、U2 sn ＲＮＡおよびHSV-TKからなる群より選
    択される、請求項１７記載の核酸構築体。
  19. 【請求項１９】リプレッサー[構成要素b')]がlac受容体
    遺伝子またはテトラサイクリンリプレッサー遺伝子から
    なる群より選択される、請求項１８記載の核酸構築体。
  20. 【請求項２０】リプレッサーに対するＤＮＡ結合配列
    [構成要素c')]が少なくとも１つのlacオペレーター結合
    配列、または少なくとも１つのテトラサイクリンオペレ
    ーター結合配列を含む、請求項１９記載の核酸構築体。
  21. 【請求項２１】エフェクター遺伝子（構成要素d）が、
    サイトカイン；ケモカイン；成長因子、サイトカイン、
    ケモカインまたは成長因子に対する受容体；抗増殖作
    用、細胞分裂抑制作用またはアポトーシス作用を有する
    タンパク質；抗体；抗体断片；血管形成阻害剤；ペプチ
    ドホルモン；凝固因子；凝固阻害剤；繊維素溶解タンパ
    ク質；血液循環に作用を有するペプチドまたはタンパク
    質；血漿タンパク質；および免疫反応を引き起こす選択
    抗原を有する感染性病原体の、または細胞の、または腫
    瘍の抗原からなる群より選択される活性化合物をコード
    する遺伝子である請求項１〜２０のいずれか１項に記載
    の核酸構築体。
  22. 【請求項２２】エフェクター遺伝子が薬剤の前駆体を薬
    剤へ分割する酵素をコードする遺伝子である、請求項１
    〜２０のいずれか１項に記載の核酸構築体。
  23. 【請求項２３】エフェクター遺伝子が、そのリガンドが
    サイトカイン、成長因子、抗体、抗体断片、ペプチドホ
    ルモン、メディエーター、および細胞接着分子からなる
    群より選択される、リガンド−活性化合物融合タンパク
    質またはリガンド−酵素融合タンパク質をコードする遺
    伝子である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の核
    酸構築体。
  24. 【請求項２４】構成要素a)、b)、c)およびd)が以下： 構成要素a) ・cdc25C遺伝子のプロモーター（核酸-290から+121） 構成要素b) ・SV40の核局在化シグナル(NLS)（SV40ラージT、アミノ
    酸126から132；PKKKRKV（配列番号13）） ・HSV-1 VP16の酸トランス活性化ドメイン(TAD)（アミ
    ノ酸406から488） ・E2F-1タンパク質のRB結合配列（アミノ酸409から426
    (LDYHFGLEEGEGIRDLFD)（配列番号14）） ・Gal4タンパク質のＤＮＡ結合ドメインに対するｃＤＮ
    Ａ（アミノ酸1から147） 構成要素c) ・ヌクレオチド配列5'-CGGACAATGTTGACCG-3'を有するGa
    l4 ＤＮＡ結合配列に対する10x結合配列（配列番号1） ・SV40基本プロモーター（核酸48から5191） 構成要素d) ・配列GCCACC ・免疫グロブリンシグナルペプチドに対するｃＤＮＡ
    （ヌクレオチド配列63から107） ・β-グルクロニダーゼに対するｃＤＮＡ（ヌクレオチ
    ド配列93から1982）である、請求項２記載の核酸構築
    体。
  25. 【請求項２５】構成要素a)、b)、c)およびd)が以下： 構成要素a) ・cdc25C遺伝子のプロモーター（核酸-290から+121） 構成要素b) ・SV40の核局在化シグナル(NLS)（SV40ラージT,アミノ
    酸126から132；PKKKRKV（配列番号13）） ・HSV-1 VP16の酸トランス活性化ドメイン(TAD)（アミ
    ノ酸406から488） ・HPV-18ウイルスのE6タンパク質（ヌクレオチド配列10
    0から578） ・Gal4タンパク質のＤＮＡ結合ドメインに対するｃＤＮ
    Ａ（アミノ酸1から147） 構成要素c) ・ヌクレオチド配列5'-CGGACAATGTTGACCG-3'を有するGa
    l4 ＤＮＡ結合配列に対する10x結合配列（配列番号1） ・SV40基本プロモーター（核酸48から5191） 構成要素d) ・配列GCCACC ・免疫グロブリンシグナルペプチドに対するｃＤＮＡ
    （ヌクレオチド配列63から107） ・β-グルクロニダーゼに対するｃＤＮＡ（ヌクレオチ
    ド配列93から1982）である、請求項２記載の核酸構築
    体。
  26. 【請求項２６】核酸がＤＮＡである、請求項１〜２５の
    いずれか１項に記載の核酸構築体。
  27. 【請求項２７】核酸構築体がベクターに挿入されてい
    る、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の核酸構築
    体。
  28. 【請求項２８】ベクターがプラスミドベクターである、
    請求項２７記載の核酸構築体。
  29. 【請求項２９】ベクターがウイルスベクターである、請
    求項２７記載の核酸構築体。
  30. 【請求項３０】疾病の予防または治療のために、外用、
    経口、膀胱内、鼻腔内、気管支内または胃腸管内に投与
    されるか、もしくは器官、体腔、筋肉組織、皮下または
    血液循環系に注射される、請求項１〜２９のいずれか１
    項に記載の核酸構築体。
  31. 【請求項３１】請求項１〜２９のいずれか１項に記載の
    核酸構築体を含有する単離細胞。
  32. 【請求項３２】感染症、腫瘍、白血病、自己免疫疾患、
    アレルギー、関節炎、炎症、器官拒絶、移植片に対する
    宿主の反応、血液凝固疾患、循環疾患、貧血症、ホルモ
    ン障害およびCNS損傷からなる群より選択される疾病の
    治療用薬剤を製造するための、請求項１〜２９のいずれ
    か１項に記載の核酸構築体または請求項３１記載の細胞
    の使用。
  33. 【請求項３３】個々の要素を段階的に連結することを含
    む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の核酸構築体
    の製造法。
  34. 【請求項３４】少なくとも１つの細胞が外用、膀胱内、
    鼻腔内、気管支内、経口または胃腸管内に投与される
    か、もしくは器官、体腔、筋肉組織、皮下または血液循
    環に注射される薬剤を製造するための、請求項３１記載
    の細胞の使用。
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