KR19990045475A

KR19990045475A - 종양유전자- 또는 바이러스-조절된 발현 시스템

Info

Publication number: KR19990045475A
Application number: KR1019980050050A
Authority: KR
Inventors: 롤프 뮐러; 한스-하랄트 제드라체크
Original assignee: 로버트 흐라이탁, 미쉘 베스트; 훽스트 마리온 뤼쎌 도이치란드 게엠베하
Priority date: 1997-11-21
Filing date: 1998-11-21
Publication date: 1999-06-25
Also published as: AU9325698A; EP0922768A3; EP0922768A2; JP2000106886A; US6465246B1; AU745614B2; CZ376898A3; CA2251257A1; HU9802681D0; AR013772A1; HUP9802681A1; CN1221033A; BR9804720A; DE19751587A1

Abstract

본 발명은 핵산 작제물에 함유되어 있는 전사 인자 유전자(성분 b)의 발현을 조절하는 프로모터 I(성분 a)을 함유하고, 전사 인자 유전자의 유전자 생성물(전사 인자 유전자의 유전자 생성물의 활성은 당해 유전자 생성물에 특이적으로 결합하여 이의 활성에 영향을 주는 하나 이상의 세포성 조절 단백질에 의존한다)이 특이적으로 결합되어 있고 핵산 작제물에 함유되어 있는 작동 유전자(성분 d)의 발현을 조절하는 프로모터 II(성분 c)를 함유하는, 작용 유전자 발현용 핵산 작제물, 상기 핵산 작제물을 함유하는 분리된 세포, 질환 치료용 약물을 제조하기 위한 상기 작제물의 용도, 동일한 목적을 위한 상기 세포의 용도 및 당해 핵산 작제물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

종양유전자- 또는 바이러스-조절된 발현 시스템

본 발명은 핵산 작제물에 함유되어 있는 전사 인자 유전자(성분 b)의 발현을 조절하는 프로모터 I(성분 a)을 함유하고, 전사 인자 유전자의 유전자 생성물(전사 인자 유전자의 유전자 생성물의 활성은 당해 유전자 생성물에 특이적으로 결합하여 이의 활성에 영향을 주는 하나 이상의 세포성 조절 단백질에 의존한다)이 특이적으로 결합되어 있고 핵산 작제물에 함유되어 있는 작동 유전자(성분 d)의 발현을 조절하는 프로모터 II(성분 c)를 함유하는, 작용 유전자 발현용 핵산 작제물에 관한 것이다.

I. 서론

매우 불충분하게 해결된 유전자 치료에서의 문제점은, 특히 질환에 걸린 세포 또는 달리 변형되어 있는 세포에서 세포-특이적 방법으로 작동 유전자의 발현을 조절하는 것이다. 본 발명은 이러한 조절을 성취하기 위한 신규한 방법을 포함한다. 이는 변성 세포에서 조절 단백질이 이들의 제휴 파트너 분자에 더 이상 결합되어 있을 수 없고 이들과 상호작용하거나 제휴 파트너 분자 또는 다른 파트너 분자와의 새로운 결합 특성을 획득할 수 없는 방식으로 변형되거나 약화되어 나타난다는 발견[참고 문헌: Werness et al. Science 248, 76(1990)]을 기초로 한다.

또한, 상기 신규한 방법은 망막아종 단백질이, 예를 들어, E2F 전사 인자의 활성 도메인에 결합함으로써 이의 활성을 억제할 수 있다는 발견[참고 문헌: Flemington et al., PNAS USA 90, 6914(1993)]을 기초로 한다.

이러한 특성의 조절 단백질에 대한 유전자는 상기 조절 단백질의 억제제(inhibitor) 또는 자극제(simulator)를 조사하기 위한 발현 시스템에 이미 사용되어 오고 있다(예: WO 95/19367, WO 95/14777, WO 97/04092).

또한, 종양 서프레서(supressor) 단백질을 발현시키는 제1 벡터 및 종양 억제 단백질에 결합하여 이를 억제하는 단백질을 발현시키는 제2 벡터를 갖는 벡터 시스템도 이미 기술되어 있다(WO 95/16771). 양 벡터는 하나의 세포내로 유입시킨다. 2개의 벡터를 결합시킴으로써, 세포의 증식이 종양 서프레서 단백질에 의해 억제되지 않으면서, 종양 서프레서 단백질을 암호화하는 벡터를 세포내에서 생성시킬 수 있다.

또한, WO 97/12970에는 제1 유전자의 발현이, 기능이 비종양 세포내에서 억제되는 제1 프로모터에 의해 조절되고, 발현 생성물이 비종양 세포내에서 제1 유전자의 발현을 억제하는 제2 유전자의 발현이 비종양 세포내에서 향상 조절된 제2 프로모터에 의해 조절되는 발현 시스템이 기술되어 있다.

본 발명은 상기 조절 단백질이 약화되거나 변형된 형태로 나타나는 세포내에서 활성화시킬 수 있는 신규하고 단순한 발현 시스템에 관한 것이다. 이는 발현 시스템에 의해 암호화되는 작동 유전자의 전사를 활성화시킨다. 작동 유전자의 발현 생성물은 단독으로 또는 추가의 약제학적 활성 화합물과 함께 예방 또는 치료학적 효과를 가진다.

도 1: 신규한 핵산 작제물의 총 성분의 특성 및 배열.

도 2: 본 발명의 양태 A에 따른 신규한 핵산 작제물의 총 성분의 배열의 도표적 묘사.

도 3: 본 발명의 양태 B에 따른 신규한 핵산 작제물의 총 성분의 배열의 도표적 묘사.

II. 본 발명의 개괄적 설명

본 발명에 따른 발현 시스템은 종양유전자 또는 바이러스가 조절 단백질을 변형시키거나 이에 영향을 미침으로써 이들 종양유전자 또는 바이러스에 의해 발현이 조절되고 가장 단순한 경우에 하기 성분을 함유하는 핵산 작제물이다:

a) 하나 이상의 활성화 서열(프로모터 유니트 I),

b) 전사가 성분 a)에 의해 조절되는 전사 인자에 대한 하나 이상의 유전자,

c) 성분 b)에 의해 암호화되는 전사 인자를 결함시킴으로써 성분 d)의 발현을 조절하는 하나 이상의 추가의 활성화 서열(프로모터 유니트 II) 및

d) 하나 이상의 작동 유전자.

각각의 성분의 배열은 도 1에서 예시함으로써 나타낸다.

본 발명에 따라, 핵산 작제물의 2가지 특정 양태를 구별하고자 한다:

1) 양태 A)

본 양태는 하기 특성을 갖는 성분에 의해 특징지워진다:

성분 a)

- 하나 이상의 활성화 성분(프로모터 I)

성분 b)

- 다음 성분을 함유하는 융합 단백질을 포함하는 전사 인자에 대한 하나 이상의 유전자

· 성분 b₁) 전사 인자의 하나 이상의 활성화 도메인

· 성분 b₂) 조절 단백질에 대한 결합 단백질의 하나 이상의 결합 서열

· 성분 b₃) 전사 인자의 하나 이상의 DNA-결합 도메인

성분 c)

- 성분 b)에 의해 암호화되는 전사 인자를 결합시킴으로써 활성화되는 하나 이상의 활성화 서열(프로모터 II)

성분 d)

- 하나 이상의 작동 유전자.

각각의 성분의 배열은 도 2에서 예시함으로써 나타낸다. 본 발명에 따른, 발현 시스템의 작용성에 대한 필요 조건은 조절 단백질의 성분 b₂)에의 결합이 활성화 도메인(성분 b₁) 및/또는 DNA-결합 도메인(성분 b₃)의 작용성을 억제하도록 성분 b₂)를 성분 b₁) 및 b₃) 사이에 또는 그 위에 설치하는 것이다. 정상 세포에서, 즉, 조절 단백질이 정상 기능을 할 경우에, 이러한 억제는 작동 유전자의 발현의 억제를 유도한다. 조절 단백질이 제휴 결합 단백질과 더 이상 상호작용할 수 없거나, 더 이상 존재하지 않거나 단지 최소 범위로 존재할 정도로 변형되거나 복합화된, 변성되거나 감염된 세포에서 이러한 억제는 전사 인자(성분 b)가 방해받지 않는 방식으로 활성화 서열(성분 c)을 활성화시켜 작동 유전자의 전사를 개시할 수 있을 정도로 부족하다. 작동 유전자의 전사는 활성화 서열[성분 a)]이 활성화되어 전사 인자에 대한 유전자[성분 b)]의 발현을 일으킴으로써 개시된다. 전사 인자[성분 b)]는 교대로 작동 유전자[성분 d)]의 발현을 유도하는 활성화 서열[성분 c)]에 결합한다.

본 발명의 특정 양태에서, 성분 a)는 성분 c)와 동일하다. 상기 특정 양태에서, 활성화 서열[프로모터 I, 성분 a)]의 경미한 활성화는, 활성화 서열[프로모터 I, 성분 a)] 및 활성화 서열[프로모터 II, 성분 c)]을 둘다 활성화시킴으로써 둘다 작동 유전자[성분 d)]의 발현을 유도하고 전사 인자[성분 b)]의 발현을 증대시켜 작동 유전자[성분 d)]의 발현을 한 번 더 증대시키는 전사 인자[성분 b)]의 발현을 일으킨다.

2) 양태 B)

본 양태는 하기 특성을 갖는 성분으로 특징지워진다:

성분 a')

- 다음 성분을 함유하는 하나 이상의 활성화 성분(프로모터 I)

· 성분 a₁): 조절 단백질에 대한 하나 이상의 DNA-결합 서열 및

· 성분 a₂): 조절 단백질이 성분 a2)를 활성화시키는 성분 a1)에 결합되는 하나 이상의 기저 프로모터

성분 b')

- 이의 발현이 성분 a')에 의해 유도되는, 리프레서(repressor)로서 작용하는 전사 인자에 대한 하나 이상의 유전자

성분 c')

- 다음 성분을 함유하는 하나 이상의 활성화 서열(프로모터 II)

· 성분 c₁): 성분 d)의 전사를 유도하는 하나 이상의 활성화 서열 및

· 성분 c₂): 리프레서(성분 b')의 결합시켜 다운스트림 작동 유전자(성분 d)의 전사의 활성화를 억제하는 하나 이상의 DNA

성분 d)

- 하나 이상의 작동 유전자.

양태 B)의 성분의 배열은 도 3에서 예시함으로써 나타낸다.

양태 B)에 따른 발현 시스템의 본 발명에 따른 작용성에 대한 필요 조건은 정상 세포에서, 프로모터 유니트 I의 성분 a')에의 세포성 조절 단백질의 결합이 리프레서 유전자(성분 b')의 전사를 포함하고 발현된 리프레서가 프로모터 유니트 II의 성분 c₂)에 결합하여 프로모터 유니트 II에 의해 구조 유전자(성분 d)의 전사의 활성화를 억제하는 것이다.

조절 단백질이 프로모터 유니트 I내에서 DNA-결합 서열(성분 a₁)에 더 이상 결합 할 수 없거나, 더 이상 존재하지 않거나 단지 경미한 정도로만 존재할 정도로 변형되거나 복합화된, 변성되거나 감염된 세포에서, 리프레서에 대한 유전자는 발현되지 않고 연속적으로 억제되지 않고, 신규한 핵산 작제물도 발현되지 않는다.

신규한 핵산 작제물의 양태 B)에서, 상기한 변성되거나 감염된 세포내에서의 작동 유전자(성분 d)의 전사는 활성화된 프로모터 유니트 II의 활성화 서열(성분 c₁)에 의해 개시된다.

이러한 발현 시스템은,

- 작동 유전자[성분 d), d') 및 d")]에 대한 다수의 동일하거나 상이한 서열을, 각각의 경우에 동일하거나 상이한 IRES 서열 또는 활성화 서열[성분 c') 및 c")]에 의해 서로에게 결합시킴으로써 양태 A) 및 B)에서 전개시킬 수 있다.

양태 A)에서는,

- 전사 인자[성분 b)]에 대한 다수의 동일하거나 상이한 서열을, 각각의 경우에 동일하거나 상이한 IRES 서열 또는 활성화 서열[성분 a) 및 c)]에 의해 서로에게 결합시킴으로써 전개시킬 수 있다.

상이한 전사 인자에 대한 유전자를 서로 결합시킬 경우, 활성화 서열은, 전사 인자[성분 b)]가 결합할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 함유하도록 선택되어야 한다.

활성화 서열[성분 a) 또는 c₁)]의 선택에 따라, 신규한 핵산 작제물을 사용하여 작동 유전자[성분 d)]를 비특이적으로, 세포-특이적으로 또는 바이러스-특이적으로, 또는 특정 대사 조건하에 또는 세포 주기-특이적으로 발현시킬 수 있다. 작동 유전자는 약리학적으로 활성인 화합물 또는 약물의 불활성 전구체를 활성 약물로 절단하는 효소를 암호화하는 유전자이다. 예를 들어, 작동 유전자는 상기 활성 화합물 또는 상기 효소가 융합 단백질로서 리간드와 함께 발현되어, 상기 리간드가 세포, 예를 들어, 내피 세포, 종양 세포 또는 백혈구의 표면에 결합하도록 선택할 수 있다.

신규한 핵산 작제물은 바람직하게는 DNA로 구성되어 있다. 용어 "핵산 작제물"은 핵산으로 구성되어 있고 표적 세포내에서 전사시킬 수 있는 인공적인 구조를 의미하는 것으로 이해된다. 이들은 바람직하게는 벡터내로 삽입되며, 플라스미드 벡터 또는 바이러스성 벡터가 특히 바람직하다.

필요한 경우 벡터로 삽입된 핵산 작제물은 질환의 예방 또는 치료용으로 환자에게 투여한다. 당해 투여는 경구적으로, 국부적으로, 또는 주사 또는 주입에 의해 투여할 수 있다.

바이러스성 또는 비바이러스성 벡터를 사용할 수 있다. 예를 들어, 바이러스성 벡터는 RTV, AV, AAV 또는 HSV로부터 유래하거나[참고 문헌: Jolly, Cancer Gene Ther. 1, 51(1994)] 양이온성 지질 또는 양이온성 중합체와 착화된 플라스미드일 수 있다[참고 문헌: Ledley, Human Gene Ther. 6, 1129(1995)]. 이러한 벡터는 사람 알부민을 1% 내지 30%(바람직하게는 5%) 함유하는 생리식염수에 용해시킬 수 있다.

바이러스성 벡터의 1×10⁵내지 1×10¹⁰PFU(바람직하게는 1×10⁸PFU) 또는 플라스미드 0.01 내지 50mg(바람직하게는 1mg)을 상기 매질 1ml에 현탁시켜 환자에게 적용시킨다. 주사(정맥내, 복부내, 피하, 근육내, 강내로(늑막, 복막, 지방막하, 관절내로) 또는 기관내로) 또는 국부 적용에 의해(기관지내, 비내, 피부, 결막상, 질내, 방광내로) 적용시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 신규한 핵산 작제물을 함유하는 포유동물 세포에 관한 것이다. 특히 바람직한 양태에서, 핵산 작제물은, 형질감염 후에 작동 유전자를 발현시키기 위해 신규한 발현 시스템의 캐리어로서 사용할 수 있는 세포주내로 유입시킨다. 이러한 세포는 환자용 약물을 제조하는데 사용할 수 있다. 또한, 신규한 핵산 작제물을 유입시킨 종양 세포, 면역 세포 또는 내피 세포와 같은 세포 또는 세포주를 국부적으로 또는 비경구적으로, 예를 들어, 정맥내로, 동맥내로, 체강내로 또는 기관내로 투여하거나 피하로 주사할 수 있다.

예로는 시험관내에서 형질도입되고 환자의 면역을 위해 피내로 또는 피하로 주사된 종양 세포, 또는 형질도입되어 이의 세포독성을 재지시하기 위한 신규한 수용체를 발현시키는 CD4-포지티브 T-세포, 또는 시험관내에서 형질감염되어 F IX를 발현시키고 불완전한 F IX 생성의 치료를 위해 재주사된 근육 세포가 있다.

따라서, 신규한 핵산 작제물의 바람직한 사용은 질환의 예방 또는 치료에서 존재하고, 본 발명은 핵산 작제물의 표적 세포로의 시험관내 삽입, 표적 세포에서의 약물의 비특이적, 바이러스-특이적, 표적 세포-특이적, 대사적으로 특이적 및/또는 세포 주기-특이적 발현 및 환자에게 표적 세포의 국부 또는 비경구적 투여, 또는 핵산 작제물의 표적 세포로의 생체내 삽입을 위해 환자에게 핵산 작제물의 국부 또는 비경구적 투여를 포함한다.

신규한 핵산 작제물은 실제로 상기 형태로 발생하지 않는다, 즉, 활성 화합물, 효소, 리간드-활성 화합물 또는 리간드-효소 융합 단백질에 대한 작동 유전자는 신규한 핵산 작제물에 함유되어 있는 바와 같은 핵산 서열과 본질적으로 결합하지 않는다.

본 발명에 따른 발현 시스템내로 도입되는 바람직한 작동 유전자는 약리학적으로 활성인 화합물을 암호화한다. 상기 활성 화합물은 사이토킨, 증식 인자, 사이토킨 또는 증식 인자에 대한 수용체, 항체 또는 항체 단편, 항증식 또는 세포증식억제 효과를 갖는 단백질, 자가사멸 또는 항자가사멸 작용, 종양 항원, 맥관형성 억제제, 혈전증-유도 단백질, 응고 억제제, 섬유소용해 효과를 갖는 단백질, 혈장 단백질, 보체-활성화 단백질, 바이러스 및 세균의 외피 물질, 호르몬, 순환에 작용을 미치는 펩타이드, 뉴로펩타이드, 효소, 조절제, 천연의 비변형된 조절 단백질 및 리보자임, 및 유전자 발현에 억제 효과를 갖는 (안티센스) 리보뉴클레오티드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질 및 당단백질에 의해 구성된다.

전이유전자는 바람직하게는 세포 주기 조절 단백질, 특히 사이클린 A, 사이클린 B, 사이클린 D1, 사이클린 E, E2F1-5, cdc2, cdc25C 또는 DP1, 바이러스 단백질 또는 사이토킨, 증식 인자 및 이의 수용체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 mRNA를 불활성화시키는 리보자임을 암호화하는 작동 유전자이다.

추가의 양태에서, 작동 유전자는 리간드-활성 화합물 융합 단백질을 암호화할 수 있으며, 여기서, 리간드는 상기한 바와 같이 항체, 항체 단편, 사이토킨, 증식 인자, 접착 분자 또는 펩타이드 호르몬 및 약리학적으로 활성 화합물인 활성 화합물, 또는 효소일 수 있다. 예를 들어, 작동 유전자는 리간드-효소 융합 단백질을 암호화할 수 있으며, 여기서, 효소는 약물의 전구체를 약물로 절단하고, 리간드는 세포 표면, 바람직하게는 내피 세포 또는 종양 세포에 결합한다.

III. 양태 A)의 특성의 상세한 설명

1) 성분 b)

1.1) 조절 단백질에 대한 결합 서열[성분 b₂)]

다수의 조절 단백질에 대한 세포성 결합 단백질은 이미 문헌[참조: Zwicker 및 Muller, Progress in Cell Cycle Res. 1: 91(1995); Boulikas et al., Int. J. Oncol. 6: 271(1995); Pawson, Nature 373: 573(1995); Cotter, Leuk. Lymph. 18: 231(1995); Hesketh, the Oncogene Facts Book Acad. Press, ISBN 0-12-344550-7(1995); Miller 및 Sarver, Nature Med. 3: 389(1997)]에 기술되어 있다.

본 발명의 취지내에서 적합한 결합 단백질 또는 이의 결합 서열은, 특히 결합 서열에의 결합이 억제되고 기능이, 예를 들어, 변이에 의해 손상되거나 변형된, 질환에 걸린 세포내에서 단지 경미한 범위로 발현되거나, 결합 서열의 과다로 인해 유리 형태로 단지 하찮은 범위로 존재하는 조절 단백질에 대한 결합 단백질 또는 이의 결합 서열이다.

이러한 조절 단백질은, 예를 들어, 종양 서프레서 유전자에 의해 발현되는 단백질을 포함한다.

이러한 특성의 조절 단백질, 이들의 제휴 결합 단백질 및 제휴 결합 단백질의 결합 서열의, 본 발명을 제한하지 않는 선택은 하기 예에 기재되어 있다:

조절 단백질 성분b₂)

(조절 단백질에 대한 결합 서열을 갖는 세포성 결합 단백질)

p53 MDM-2

pRb · 전사 인자 E2F, -1, -2, -3

· 사이클린-D₁, D₂, -D₃또는 -C

· 사이클린-A, -E

· 전사 인자 PU.1

· 전사 인자 Elf-1

p130 · 전사 인자 E2F-5

· 사이클린 A, -E

Max · Myc

MAD · Myc

VHL · Elongin C, -B

cdk4 p14, p15, p16, p18, p27, p57, p21

MTS-1(p16) · cdk4

WT-1 · p53

SMAD2(MADR2) · DPC4

DPC-4 · SMAD2

β-카테닌 · LEF-1

LEF-1 · β-카테닌

본 발명의 특정 양태에서, 성분 b₂)는 조절 단백질에 대한 비-세포-특이적 결합 단백질의 결합 서열이다. 이러한 비-세포-특이적 서열은, 예를 들어, 바이러스, 세균 또는 기생충 기원일 수 있다.

이러한 비-세포-특이적 결합 서열의 사용으로 성분 b)의 작용을 성분 b₂)에 결합되어 있는 제휴 조절 단백질에 의해 정상 세포내에서 억제시킬 수 있다. 그러나, 감염된 세포에서는, 결합 서열-함유 결합 단백질을 세포내적으로 생성시키는 각각의 병원체의 결과로서 제휴 조절 단백질은 큰 범위로 결합된다. 따라서, 성분 b)는 상기 세포내에서 자유롭고 기능적이다.

본 발명의 또 다른 특정 양태에서, 성분 b₂)는 항체 또는 조절 단백질에 대한 결합 서열(V_H및 V_L)을 갖는 항체이다.

비-세포-특이적 결합 서열의, 본 발명을 제한하지 않는 선택은 하기 예에 기재되어 있다:

조절 단백질 성분b₂)

(조절 단백질에 대한 결합 서열을 갖는 바이러스성 결합 단백질)

p53 · CMV의 IE 84

[참고 문헌: Speir et al., Science265, 391(1994)]

· AV의 E1B(55kd)

[참고 문헌: Sarnow et al., Cell28, 387(1982);

Liu et al., Cold Spring Harbor Symp.

On Quantitative Biol.LIX, 215(1985)]

· EBV의 EBNA-5

[참고 문헌: Szekely et al., PANS USA90, 5455(1993)]

· EBV의 BHFR1

[참고 문헌: Theodorakis et al., Oncogene12, 1707(1996)]

· HPV-16 또는 -18의 E6

[참고 문헌: Dyson et al., Science243, 934(1989);

Howes et al., Genes Dev.8, 1300(1994)]

· HVB의 HBX 단백질

[참고 문헌: Wang et al., PNAS USA91, 2230(1994)]

· SV40의 T 항원

[참고 문헌: Lane et al., Nature278, 261(1979);

Linzer et al., Cell17, 43(1979)]

pRb · AV의 E1A

[참고 문헌: Nevins Science258, 424(1992)]

· EBV의 EBNA-2

· EBV의 EBNA-1 또는 -5

· HPV의 E7

· SV40의 T 항원

p130 · AV의 E1A[참고 문헌: Li et al., Genes Dev.7, 2366(1993)]

CBF-1(RBP-JK) · EBV의 EBNA-2

[참고 문헌: Zimber-Strobl et al., EMBO J.13, 4973(1994)]

NF-Kappa B · HIV의 Tax

[참고 문헌: Suzuki et al., Oncogene9, 3099(1994)]

Lyn-티로신 키나제 · EBV의 LMP-1

· EBV의 LMP-2A 또는 LMP-2B

bak · AV의 E1B(16kd)

[참고 문헌: Farrow et al., Nature374, 731(1995)]

bax · AV의 E1B(19kd)

[참고 문헌: Han et al., Genes Dev.10, 461(1996)]

조절 단백질 조절 단백질에 대한 결합 단백질(V_H, V_L)을 갖는

항체 또는 항체 단편

p53 변이되지 않은 DNA 결합 도메인에 대해 특이적인 모노클로날 항체

[참고 문헌: Legros et al., Oncogene9, 2071(1994);9, 3689(1994); Hupp et al., Cell71, 875(1992); Abarzna et al., Cancer Res.55, 3490(1995); Bonsing et al., Cytometry28, 11(1997); Thomas et al., J. Clin. Path.50, 143(1997); Jannot et al., BBRC230, 242(1997)]

pRb · 활성 (비-포스포릴화) pRb에 대해 특이적인 모노클로날 항체

[참고 문헌: Hu et al., Mol. Cell Biol.11, 5792(1991)]

항체를 선택할 경우, 항체의 에피토프-결합 부분인 FV_L, FV_H는 바람직하게는 성분 b₂)로서 사용하여야 하고, 이는 쥐 기원일 경우 사람화된 형태이다. 사람화는 문헌[참조: Winter et al., Nature349, 293(1991) 및 Hoogenbooms et al., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol.36, 19(1993)]에 기술된 방법으로 수행한다. 항체 단편은 당해 기술의 상태에 따라, 예를 들어 문헌[참조: Winter et al., Nature349, 293(1991), Hoogenbooms et al., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol.36, 19(1993), Girol. Mol. Immunol.28, 1379(1991) 또는 Huston et al., Int. Rev. Immunol.10, 195(1993)]에 기술된 방법으로 제조한다. 항체, 항체 단편 및 재조합 항체 단편의 제조는 특허원 DE 196 49 645.4에 상세히 기술되어 있다.

재조합 항체 단편은 현존하는 하이브리도마로부터 직접 제조하거나 "파아지 디스플레이(phage display)" 기술을 사용하여 쥐 또는 사람 항체 단편의 라이브러리로부터 분리한다[참고 문헌: Winter et al., Annu. Rev. Immunol.12, 433(1994)]. 다음, 이들 항체 단편을 성분 b₁) 및 b₃)와의 커플링을 위한 유전자 수준으로 직접 사용한다.

하이브리도마로부터 재조합 항체 단편을 제조하기 위해, 항체의 항원-결합 도메인(V_H, V_L)을 암호화하는 유전자 정보를, mRNA를 분리시키고, RNA를 cDNA로 역전사시킨 다음, 폴리머라제 쇄 반응 및 다양한 단편의 5' 및 3' 말단 각각에 상보적인 뉴클레오티드에 의해 증폭시킴으로써 수득한다. 다음, V_H및 V_L단편을 암호화하는, 생성된 DNA 단편을 세균성 발현 벡터로 클로닝시켜, 예를 들어, Fv 단편, 일본쇄 Fv 단편(scF_V) 또는 Fab 단편을 발현시킬 수 있다.

또한, 신규한 항체 단편을 "파아지 디스플레이" 기술을 사용하여 쥐 또는 사람 기원의 항체 라이브러리(면역 라이브러리, 천연 라이브러리)로부터 직접 분리시킬 수 있다. 항체 단편의 파아지 디스플레이에서, 항원-결합 도메인의 유전자를 사상 박테리오파아지의 g3P 피복 단백질에 대한 유전자와의 유전자 융합으로써 scF_V단편 유전자의 형태로 또는 Fab 단편 유전자로서 파아지 게놈 또는 파아지미드 벡터로 클로닝시킨다. 항원-결합 파아지는 항원-부하된 플라스틱 용기상에서 선택하거나(팬닝(panning)), 항원-결합된 상자성체성 "비드"상에서 또는 세포 표면에의 결합에 의해 선택한다.

면역 라이브러리는 면역화된 동물 또는 환자의 B 임파구로부터의 다양한 항체 단편에 대한 유전자를 PCR 증폭에 적용시킴으로써 제조한다. 이 경우, 쥐 또는 사람 면역글로불린 또는 사람 면역글로불린 유전자 패밀리에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드의 배합물을 사용한다.

천연 라이브러리는 비면역화된 도너를 면역글로불린 유전자의 공급원으로서 사용함으로써 제조할 수 있다. 또한, 면역글로불린 배아주 유전자를 반합성 항체 레퍼토리를 제조하는데 사용할 수 있고, 여기서, 다양한 단편의 상보성-결정 부위 3을 변성 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 증폭시킨다. 소위 단일-포트 라이브러리인 이들은 면역 라이브러리와 비교하여 다수의 항원에 대한 항체 단편을 단일 라이브러리로부터 분리시킬 수 있다는 이점을 갖는다.

또한, 항체 단편의 친화성을 파아지 디스플레이 기술에 의해 추가로 증대시킬 수 있으며, 여기서, 신규한 라이브러리는 랜덤, 코돈-기재 또는 부위-지시된 변이유발에 의해, 각각의 도메인의 쇄를 순수한 레퍼토리로부터의 단편의 쇄로 교체하거나, 세균성 변이체 균주를 사용함으로써 이미 존재하는 항체 단편으로부터 제조하고, 개선된 특성을 갖는 항체 단편을 엄격한 조건하에 재선택에 의해 분리시킨다. 또한, 쥐 항체 단편을 다양한 도메인 중 하나를 사람 레퍼토리로 단계적으로 대체한 다음, 원래의 항원을 사용하여 선택("유도 선택")함으로써 사람화시킬 수 있다. 또한, 쥐 항체는 사람 항체의 초가변성 부위를 원래의 쥐 항체의 상응하는 부위로 표적화 대체시킴으로써 사람화시킨다.

1.2) 활성화 도메인[성분 b₁)] 및 DNA-결합 도메인[성분 b₃)]

본 발명의 취지내에서, 전사 인자의 활성화 도메인 및 DNA-결합 도메인에 대해 이용가능한 모든 유전자를 성분 b)로서 사용할 수 있다. 그러나, 이하는 예로서 기술할 뿐이지, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다:

- 활성화 도메인[성분 b₁)]

· HSV1-VP16의 산 전이활성화 도메인(TAD)에 대한 cDNA(아미노산 406 내지 488; Triezenberg et al., Genes Developm.2: 718(1988); Trizenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5: 190(1995) 또는 아미노산 413 내지 490; Regier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA90, 883(1993));

· Oct 2의 활성화 도메인(아미노산 438 내지 479; Tanaka et al., Mol. Cell. Biol. 14: 6046(1994) 또는 아미노산 3 내지 154: Das et al., Nature 374: 657(1995));

· SP1의 활성화 도메인(아미노산 340 내지 485; Courey 및 Tijan, Cell55, 887(1988))

· NFY의 활성화 도메인(아미노산 1 내지 233; Li et al., J. Biol. Chem.267, 8984(1992); van Hujisduijnen et al., EMBO J.9, 3119(1990); Sinha et al., J. Biol. Chem.92, 1624(1995); Coustry et al., Biol. Chem.270, 468(1995));

· ITF2의 활성화 도메인(아미노산 2 내지 452; Seipel et al., EMBO J.13, 4961, 1992));

· c-Myc의 활성화 도메인(아미노산 1 내지 262; Eilers et al.) 또는

· CTF의 활성화 도메인(아미노산 399 내지 499; Mermod et al., Cell58, 741(1989); Das 및 Herr, Nature374, 657(1995)) 중 하나 이상의 서열.

- DNA-결합 도메인[성분 b₃)]

· Gal4 단백질의 DNA-결합 도메인에 대한 c-DNA(아미노산 1 내지 147; Chasman 및 Kornberg, Mol. Cell. Biol. 10: 2916(1990));

· LexA 단백질(아미노산 1 내지 81; Kim et al., Science 255: 203(1992) 또는 전체 LexA 단백질(아미노산 1 내지 202; Brent et al., Cell 43: 729(1985));

· lac 리프레서(lac I) 단백질(Brown et al., Cell 49: 603(1987); Fuerst et al., PNAS USA 86: 2549(1989));

· 테트라사이클린 리프레서(tet R) 단백질(Gossen et al., PNAS USA 89: 5547(1992); Dingermann et al., EMBO J. 11: 1487(1992)) 또는

· ZFHD1 단백질(Pomerantz et al., Science 267: 93(1995)) 중 하나 이상의 서열.

본 발명의 취지내에서는, 핵 정위 시그날(nuclear localization signal: NLS)을 DNA-결합 도메인의 3' 말단에 가하는 것이 유리하다.

2) 성분 b)에 의해 활성화시킬 수 있는 활성화 서열 프로모터 유니트 II[성분 c)]

상기 활성화 서열의 선택은 전사 인자[성분 b)]에 대한 유전자내의 DNA-결합 도메인[성분 b₃)]의 선택에 따른다.

또한, 다음 가능성은 1.2하에 기재된 DNA-결합 도메인의 예를 위해 예로써 나타낸다.

2.1) 가능성 A)

· SV40의 기저 프로모터(뉴클레오티드 48 내지 5191; Tooze(ed), DNA Tumor Viruses(Cold Spring Harbor New York, New York, Cold Spring Harbor Laboratory));

· c-fos의 프로모터(Das et al., Nature374, 657(1995));

· U2 sn RNA 프로모터 또는

· HSV TK의 프로모터(Papavassiliou et al., J. Biol. Chem.265, 9402(1990); Park et al., Molec. Endocrinol.7, 319(1993))가 (3' 말단에) 가해진, Gal4 단백질(Chasman 및 Kornberg, Mol. Cell. Biol.10: 2916(1990))에 대한 하나 이상의 결합 서열[뉴클레오티드 서열: 5'-CGGACAACTGTT GACCG-3'](서열 1)을 함유하는 활성화 서열.

2.2) 가능성 B)

· SV40의 기저 프로모터(뉴클레오티드 48 내지 5191; Tooze(ed), DNA Tumor Viruses(Cold Spring Harbor New York, New York, Cold Spring Harbor Laboratory) 또는 또 다른 프로모터(참조: 가능성 A)가 (3' 말단에) 가해진, LexA 단백질[LexA operator; Brent et al., Nature612, 312(1984)]에 대한 하나 이상의 결합 서열[뉴클레오티드 서열: 5'-TACTGTATGTACA TACAGTA-3'](서열 2)을 함유하는 활성화 서열.

2.3) 가능성 C)

· SV40의 기저 프로모터(뉴클레오티드 48 내지 5191; Tooze(ed), DNA Tumor Viruses(Cold Spring Harbor New York, New York, Cold Spring Harbor Laboratory) 또는 또 다른 프로모터(참조: 가능성 A)가 (3' 말단에) 가해진, lac I 리프레서 단백질(Fuerst et al., PNAS USA86, 2549(1989); Simons et al., PNAS USA81, 1624(1984))에 대한 하나 이상의 Lac 오퍼레이터 결합 서열(뉴클레오티드 서열: 5'-GAATTGTGAGCGCTCACAATTC-3'](서열 3)을 함유하는 활성화 서열.

2.4) 가능성 D)

· SV40의 기저 프로모터(뉴클레오티드 48 내지 5191; Tooze(ed), DNA Tumor Viruses(Cold Spring Harbor New York, N. Y., Cold Spring Harbor Laboratory) 또는 또 다른 프로모터(참조: 가능성 A)가 (3' 말단에) 가해진, 테트라사이클린 리프레서(tet R) 단백질에 대한 하나 이상의 테트라사이클린 오퍼레이터(tet O) 결합 서열(뉴클레오티드 서열: 5'-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3')(서열 4)을 함유하는 활성화 서열.

2.5) 가능성 E)

· SV40의 기저 프로모터(뉴클레오티드 48 내지 5191; Tooze(ed), DNA Tumor Viruses(Cold Spring Harbor New York, New York, Cold Spring Harbor Laboratory) 또는 또 다른 프로모터(참조: 가능성 A)가 (3' 말단에) 가해진, ZFHD-1 단백질(Pomerantz et al, Science267, 93(1995))에 대한 하나 이상의 결합 서열[뉴클레오티드 서열; 5'-TAATGATGGCG-3'](서열 5)을 함유하는 활성화 서열.

IV) 양태 B)의 특성의 상세한 설명

1) 프로모터 유니트 I[성분 a')]의 활성화 서열

1.1) 조절 단백질[성분 a₁)에 대한 DNA-결합 서열

상기 서열은 DNA를 결합하는 능력이 변이에 의해 감소되거나 세포내에서 정량적으로 증가 또는 감소되는 전사 인자에 대한 DNA-결합 서열을 포함한다. 전사 인자 및 이의 변형체는, 예를 들어, 문헌[참조: Nichols et al., Blood80, 2953(1992); Crepieux et al., Crit. Rev. Oncogen.5, 615(1994); LaThangue, TIBS19, 108(1994); Lipton, Nature Med.3, 20(1997))에 검토되어 있다.

상기 DNA-결합 서열은, 예를 들어,

- p53 단백질에 대한 DNA-결합 서열[ATAATTGGGCAAGTCTAGGAA-3'; (서열 6) Kern et al., Science252, 1708(1991), Cho et al., Science265, 346(1994) 또는 -(G/A)-(G/A)-(G/A)-C-(A/T)-(T/A)-G; Cho et al., Science265, 346(1994)]

- Wt-1 단백질에 대한 DNA-결합 서열(Wang et al., Oncogene10, 415(1995); Borel et al., Biochem.35/37, 12070(1996))

- NF kappa B 단백질에 대한 DNA-결합 서열(뉴클레오티드 서열 5'-GGGACTTTCC-3'(서열 7); Urban et al., Genes and Developm.4, 1975(1990); Roug et al., Virol.189, 750(1992)) 또는 HIV-LTR(Gimble et al., J. Virol.62, 4104(1988))

- E2F/DP-1 복합체에 대한 DNA-결합 서열(하나 이상의 뉴클레오티드 서열 5'-TTTTCCCGCCAAAA(서열 8); 또는 5'-TTTTCCCGCCTTTTTT(서열 9) 또는 5'-TTTTCCCGCGC TTTTTT)(서열 10)(Ouellete et al., Oncogene7, 1075(1992))

- Myc/Max 단백질에 대한 DNA-결합 서열(하나 이상의 뉴클레오티드 서열 5'-CACGTG-3')(Walhout et al., Nucl. Acids Res.25, 1493(1997); Nozaki et al., J. Biochem,121, 550(1997)) 또는 5'-CATGTG-3'(Fisher et al., EMBO J.12, 5075(1993))을 하나 이상 포함한다.

1.2) 기저 프로모터[성분 a₂)]

기저 프로모터의 예는:

- SV40의 기저 프로모터(뉴클레오티드 48 내지 5191; Tooze(ed), DNA Tumor Viruses(Cold Spring Harbor New York, New York, Cold Spring Harbor Laboratory));

- c-fos의 프로모터(Das et al., Nature374, 657(1995);

- U2 sn RNA 프로모터 또는

- HSV TK의 프로모터(Papavassiliou et al., J. Biol. Chem.265, 9402(1990); Park et al., Mol. Endocrin.7. 319(1993))이다.

2) 리프레서[성분 b')]

이러한 리프레서의 예는,

- lac 리프레서(Brown et al., Cell49, 603(1987); Furst et al., PNAS USA86, 2549(1989)) 또는

- 테트라사이클린 리프레서(Gossen et al., PNAS USA89, 5549(1992); Dingermann et al, EMBO J.11, 1487(1992))이다.

3) 성분 b')에 의해 영향을 받는 활성화 서열[성분 c₁)]

이러한 활성화 서열은, 예를 들어, 섹션 V)에 기재된 모든 활성화 서열을 포함한다.

4) 리프레서에 대한 DNA-결합 서열[성분 C₂)]

이러한 DNA-결합 서열의 예로는 다음이 있다:

- lac I 리프레서 단백질에 대한 하나 이상의 Lac 오퍼레이터 결합 서열(뉴클레오티드 서열: 5'-GAATTGTGAGCGCTCACAATTC-3')(서열 3)(Furst et al., PNAS USA 86, 2549(1989); Simons et al., PNAS USA 81, 1624(1984)) 또는

- 테트라사이클린 리프레서(tet R) 단백질에 대한 하나 이상의 테트라사이클린 오퍼레이터(tet O) 결합 서열(뉴클레오티드 서열: 5'-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3')(서열 4)

V) 활성화 서열 I[양태 A)에서의 성분 a) 및 양태 B)에서의 성분 c₁)]

본 발명의 취지내에서, 전사 인자를 결합한 후에, 3' 말단에서 인접하여 위치한 유전자의 전사를 활성화시키는 뉴클레오티드 서열을 활성화 서열로서 사용하여야 한다. 활성화 서열의 선택은 치료할 질환 및 형질도입시킬 표적 세포에 따라 다르다. 따라서, 활성화 서열[성분 a)]을 특정 대사 조건하에서 표적 세포-특이적으로, 세포 주기-특이적으로 또는 바이러스-특이적으로, 비제한적인 방법으로 활성화시킬 수 있다. 이러한 프로모터 서열은 이미 특허원 EP95930524.4, EP95931933.6, EP95931204.2, EP95931205.9, EP97101507.8, EP97102547.3, DE19639103.2 및 DE19651443.6에 상세히 기술되어 있다. 다음은 선택할 프로모터 서열의 예이다:

1) 비제한적인 방법으로 활성화시킬 수 있는 활성화제 서열 및 프로모터, 예를 들어,

- RNA 폴리머라제 III의 프로모터

- RNA 폴리머라제 II의 프로모터

- CMV 프로모터 및 CMV 인핸서

- SV40 프로모터

2) 바이러스성 프로모터 및 활성화제 서열, 예를 들어,

- HBV

- HCV

- HSV

- HPV

- EBV

- HTLV

- HIV

HIV 프로모터를 사용할 경우, TAR 서열을 포함하는 완전한 LTR 서열[위치 -453 내지 -80, Rosen et al., Cell41, 813(1985)]을 바이러스-특이적 프로모터로 사용한다.

3) 저산소증에 의해 유도될 수 있는 인핸서와 같이 대사적으로 활성화가능한 프로모터 및 인핸서 서열.

4) 세포 주기-특이적으로 활성화가능한 프로모터

이들의 예로는 cdc25C 유전자, 사이클린 A 유전자, cdc2 유전자, B-myb 유전자, DHFR 유전자, E2F-1 유전자 또는 cdc25B 유전자의 프로모터, 또는 그밖의 세포 증식 동안 나타나거나 활성화되는 전사 인자에 대한 결합 서열이 있다. 이들 결합 서열은, 예를 들어, c-myc 단백질에 대한 결합 서열을 포함한다. 이들 결합 서열은 또한 Myc E 박스로 불리는 뉴클레오티드 서열[5'-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3'(서열 11); Blackwood 및 Eisenmann, Science 251: 1211(1991)]의 단량체 또는 다량체를 포함한다.

5) 테트라사이클린 오퍼레이터와 상응하는 리프레서와의 배합물과 같은 테트라사이클린-활성화가능한 프로모터.

6) 키메라성 프로모터

키메라성 프로모터는, 억제 단백질이 결합되어 있어 업스트림 활성화제 서열의 활성화를 세포 주기의 G₀내지 G₁기에서 억제시킬 수 있는, 세포-특이적으로, 대사적으로 또는 바이러스-특이적으로 활성화시킬 수 있는 업스트림 활성화 서열과 뉴클레오티드 서열 CDE-CHR 또는 E2FBS-CHR을 함유하는 다운스트림 프로모터 모듈의 배합물이다[참고 문헌: PCT/GB94/17366; Lucibello et al., EMBO J.14, 12(1994)].

7) 세포-특이적으로 활성화시킬 수 있는 프로모터

이들은 바람직하게는 선택된 세포내에 우선적으로 형성되는 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터 또는 인핸서로부터의 프로모터 또는 활성화제 서열을 포함한다.

예를 들어, 본 발명의 취지내에서, 다음 단백질에 대한 프로모터는 바람직하게는 다음 세포내에서 사용하여야 한다:

7.1. 내피 세포내에서 활성화되는 프로모터 및 활성화제 서열

- 뇌-특이적인 내피 글루코스-1 트랜스포터

- 엔도글린

- VEGF 수용체 1(flt-1)

- VEGF 수용체 2(flk-1, KDR)

- tie-1 또는 tie-2

- B61 수용체(Eck 수용체)

- B61

- 엔도테린, 특히 엔도테린 B 또는 엔도테린 1

- 엔도테린 수용체, 특히 엔도테린 B 수용체

- 만노스 6-포스페이트 수용체

- 폰 빌레브란트(von Willebrand) 인자

- IL-1α, IL-1β

- IL-1 수용체

- 맥관 세포 접착 분자(VCAM-1)

- 합성 활성화제 서열

천연 내피 세포-특이적 프로모터에 대한 대체물로서, 내피 세포내에서 우선적으로 또는 선택적으로 활성인 전사 인자에 대한 올리고머화된 결합 부위를 포함하는 합성 활성화제 서열을 사용할 수 있다. 예로는, 내피 1 유전자내의 결합 부위가 5'-TTATCT-3'인 전사 인자 GATA-2가 있다[참고 문헌: Lee et al., Biol. Chem.266, 16188(1991), Dormann et al., J. Biol. Chem.267, 1279(1992) 및 Wilson et al., Mol. Cell Biol.10, 4854(1990)].

7.2. 활성화된 내피 세포의 주변의 세포내에서 활성화되는 프로모터 또는 활성화제 서열

- VEGF

VEGF 유전자에 대한 유전자 조절 서열은 5'-플랭킹 부위, 3'-플랭킹 부위, c-Src 유전자 또는 v-Src 유전자이다.

- 스테로이드 호르몬 수용체 및 이의 프로모터 성분[참조: Truss 및 Beato, Endocr. Rev.14, 459(1993)], 특히 마우스의 유방 종양 바이러스 프로모터

7.3. 근육 세포, 특히 평활근 세포내에서 활성화되는 프로모터 또는 활성화제 서열

- 트로포마이오신

- α-액틴

- α-마이오신

- PDGF에 대한 수용체

- FGF에 대한 수용체

- MRF-4

- 포스포프럭토키나제 A

- 포스포글리세레이트 뮤타제

- 트로포닌 C

- 마이오게닌

- 엔도테린 A에 대한 수용체

- 데스민

- VEGF

VEGF 유전자에 대한 유전자 조절 서열은 섹션 "활성화된 내피 세포의 주변의 세포내에서 활성화되는 프로모터"에 이미 기재되어 있다(상기 참조).

- "인공적인" 프로모터

헬릭스-루프-헬릭스(HLH) 패밀리의 인자(MyoD, Myf-5, 마이오게닌, MRF4)는 근육-특이적 전사 인자로 보고되어 있다. 아연 핑거 단백질 GATA-4 또한 근육-특이적 전사 인자이다.

HLH 단백질 및 GATA-4는 근육-특이적 유전자와 뿐만 아니라 이종성 상황, 예를 들어, 인공적인 프로모터와도 근육-특이적 전사를 나타낸다. 이러한 인공적인 프로모터의 예로는 E 박스(Myo D)와 같은 근육-특이적 HLH 단백질에 대한 (DNA) 결합 부위의 다중 복제물(예: 4×AGCAGGTGTTGGGAGGC) 또는 α-마이오신 중쇄 유전자의 GATA-4에 대한 DNA 결합 부위의 다중 복제물(예: 5'-GGCCGATGGGCA GATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG-3')(서열 12)이 있다.

7.4. 신경교 세포내에서 활성화되는 프로모터 및 활성화제 서열

이들은, 예를 들어, 다음 단백질을 암호화하는 유전자로부터의 유전자 조절 서열 또는 성분을 특히 포함한다:

- 슈반(Schwann) 세포-특이적 단백질 Periaxin

- 글루타민 합성효소

- 신경교 세포-특이적 단백질(원섬유성 신경교 산 단백질 = GFAP)

- 신경교 세포 단백질 S100b

- IL-6(CNTF)

- 5-HT 수용체

- TNFα

- IL-10

- 인슐린형 증식 인자 수용체 I 및 II

- VEGF

VEGF 유전자에 대한 유전자 조절 서열은 이미 위에서 기재하였다.

7.5. 조혈 세포에서 활성화되는 프로모터 및 활성화제 서열

이러한 특정의 유전자 조절 서열은 조혈 세포 또는 기질과 같은 인접 세포에서 발현되는 사이토킨 또는 이의 수용체에 대한 프로모터 서열을 포함한다.

이들은, 예를 들어, 다음 사이토킨 및 이의 수용체에 대한 프로모터를 포함한다:

- 간(stem) 세포 인자 수용체

- 간 세포 인자

- IL-1α

- IL-1 수용체

- IL-3

- IL-3 수용체(α-서브유니트)

- IL-3 수용체(β-서브유니트)

- IL-6

- IL-6 수용체

- GM-CSF

- GM-CSF 수용체(α-쇄)

- 인터페론 조절 인자 1(IRF-1)

IRF-1의 프로모터는 IFNγ 또는 IFNβ에 의해서 활성화되는 바와 동일하게 IL-6에 의해서도 활성화된다.

- 에리트로포이에틴

- 에리트로포이에틴 수용체

7.6. 임파구 및/또는 대식세포내에서 활성화되는 프로모터 및 활성화제 서열

이들은, 예를 들어, 사이토킨, 사이토킨 수용체 및 접착 분자에 대한 유전자 및 항체의 Fc 단편에 대한 수용체의 프로모터 및 활성화제 서열을 포함한다.

예로는 다음이 있다:

- IL-1 수용체

- IL-1α

- IL-1β

- IL-2

- IL-2 수용체

- IL-3

- IL-3 수용체(α-서브유니트)

- IL-3 수용체(β-서브유니트)

- IL-4

- IL-4 수용체

- IL-5

- IL-6

- IL-6 수용체

- 인터페론 조절 인자 1(IRF-1)

(IRF-1의 프로모터는 IFNγ 또는 IFNβ에 의해서 활성화되는 바와 동일하게 IL-6에 의해서도 활성화된다).

- IFNγ-민감성 프로모터

- IL-7

- IL-8

- IL-10

- IL-11

- IFNγ

- GM-CSF

- GM-CSF 수용체(α-쇄)

- IL-13

- LIF

- 인자(M-CSF) 수용체를 자극하는 대식세포 콜로니

- 제I형 및 제II형 대식세포 스캐빈저(scavenger) 수용체

- MAC-1(백혈구 작용 항원)

- LFA-1α(백혈구 작용 항원)

- p150,95(백혈구 작용 항원)

7.7. 활액 세포내에서 활성화되는 프로모터 및 활성화제 서열

이들은 매트릭스 금속단백질분해효소(MMP), 예를 들어, 다음에 대한 프로모터 서열을 포함한다:

- MMP-1(간질(interstitial) 콜라게나제)

- MMP-3(스트로메라이신/트란신)에 대한 프로모터 서열을 포함한다.

또한, 이들은 금속단백질분해효소의 조직 억제제(TIMP), 예를 들어:

- TIMP-1

- TIMP-2

- TIMP-3

7.8. 백혈병 세포내에서 활성화되는 프로모터 및 활성화제 서열

이들의 예로는 다음에 대한 프로모터가 있다.

- c-myc

- HSP-70

- bcl-1/사이클린 D-1

- bcl-2

- IL-6

- IL-10

- TNFα, TNFβ

- HOX-11

- BCR-Abl

- E2A-PBX-1

- PML-RARA(전골수구 백혈병 - 레티노산 수용체)

- c-myc

- Myc E 박스로 불리는 뉴클레오티드 서열(5'-GGAAGCAGACCAGCTGGTCT GCTTCC-3')(서열 11)의 단량체에 결합하고, 이를 활성화시키는 c-myc

7.9. 종양 세포내에서 활성화되는 프로모터 또는 활성화제 서열

종양 세포내에서 형성되거나 활성인 전사 인자가 상호작용하는 유전자 조절 뉴클레오티드 서열은 프로모터 또는 활성화제 서열로서 고려된다.

본 발명의 취지내에서, 바람직한 프로모터 또는 활성화제 서열은 암종 세포 또는 육종 세포내에서 특히 형성되는 단백질을 암호화하는 유전자로부터의 유전자 조절 서열 또는 성분을 포함한다. 따라서, 소형 세포 기관지 암종의 경우에 N-CAM 단백질의 프로모터, 난소 암종의 경우에 간염 증식 인자 수용체 또는 L-플라스틴의 프로모터, 및 췌장 암종의 경우에 L-플라스틴 또는 다형 상피 뮤신(PEM)의 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다.

VI. 작동 유전자[성분 d)]

본 발명의 취지내에서, 작동 유전자[성분 d)]는 질환의 예방 및/또는 치료용 활성 화합물을 암호화한다. 작동 유전자 및 프로모터 서열은 질환의 치료 특성과 형질도입시킬 표적 세포를 고려하여 선택하여야 한다.

예를 들어, 프로모터 서열과 작동 유전자의 다음 배합물은 하기 질환의 경우에 선택된다(상세한 설명은 분원에 참조 문헌으로 인용된 특허원 EP95930524.4, EP95931933.6, EP95931204.2, EP95931205.9, EP97101507.8, DE19617851.7, DE19639103.2 및 DE19651443.6에 이미 기술되어 있다).

1) 종양의 치료

1.1) 표적 세포:

- 내피 세포의 증식;

- 내피 세포에 인접해 있는 간질 세포 및 근육 세포 또는

- 종양 세포 또는 백혈병 세포

1.2) 프로모터:

- 내피-세포 특이적 및 세포 주기-특이적;

- 세포-비특이적 또는 근육 세포-특이적 및 세포 주기 특이적 또는

- 종양 세포-특이적(충실성 종양, 백혈병) 및 세포 주기-특이적

1.3) 세포 증식의 억제제, 예를 들어, 다음에 대한 작동 유전자:

- 망막아종 단백질(pRb=p100) 또는 관련된 p107 및 p130 단백질

망막아종 단백질(pRb/p100) 및 관련된 p107 및 p130 단백질은 포스포릴화에 의해 불활성화시킨다. 후자의 기능을 손상시키지 않으면서, 발현된 단백질의 불활성화 부위에 대한 변이를 나타내는 이들 세포 주기 억제제의 유전자를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 변이의 예는 p110에 대해 기술되어 있다. p107 단백질 또는 p130 단백질에 대한 DNA 서열은 유사한 방법으로 변이시킨다.

- p53 단백질

단백질 p53은 MDM2와 같은 특정 단백질에의 결합 또는 탈포스포릴화된 C-말단 세린에 의한 올리고머화에 의해 불활성화시킨다. 결과적으로, 세린 392에 의해 C-말단이 절단된 p53 단백질에 대한 DNA 서열을 사용하는 것이 바람직하다.

- p21(WAF-1)

- p16 단백질

- 이외의 cdk 억제제

- GADD45 단백질

- bak 단백질

- 조절 단백질에 대한 결합 단백질(참조 II.1.)

1.4.) 응집-유도 인자 및 맥관형성 억제제, 예를 들어, 다음에 대한 작동 유전자:

- 플라스미노겐 활성화제 억제제 1(PAI-1)

- PAI-2

- PAI-3

- 안지오스태틴

- 인터페론(IFNα, IFNβ 또는 IFNγ)

- 혈소판 인자 4

- TIMP-1

- TIMP-2

- TIMP-3

- 백혈병 억제 인자(LIF)

- 조직 인자(TF) 및 이의 응집-활성 단편

1.5) 세포증식억제 및 세포독성 단백질, 예를 들어, 다음에 대한 작동 유전자:

- 페르포린

- 그랜자임

- IL-2

- IL-4

- IL-12

- IFN-α, INFβ 또는 INFγ와 같은 인터페론

- TNFα 또는 TNFβ와 같은 TNF

- 온코스태틴 M

- 스핑고마이엘리나제

- 마가이닌 및 마가이닌 유도체

1.6) 세포증식억제 또는 세포독성 항체 및 항원-결합 항체 단편과 세포증식억제, 세포독성 또는 염증성 단백질 또는 효소와의 융합 단백질에 대한 작동 유전자

- 당해 세포증식억제 또는 세포독성 항체는, 예를 들어, 문헌[참조: Burrows et al., Pharmac. Ther.64, 155(1994); Hughes et al., Cancer Res.49, 6214(1989) 및 Maruyama et al., PNAS USA87, 5744(1990)]에 기술되어 있는 바와 같은, 내피 세포의 막 구조에 대해 지시된 것을 포함한다. 이들은 특히 VEGF 수용체에 대한 항체를 포함한다.

- 이들은 또한 종양 세포상의 막 구조에 대해 지시된 세포증식억제 또는 세포독성 항체를 포함한다. 이러한 특성의 항체는, 예를 들어, 문헌[참조: Sedlacek et al., Contrib. to Oncol.32, Karger Verlag, Munich(1988) 및 Contrib. to Oncol.43, Karger Verlag, Munich(1992)]에 검토되어 있다. 다른 예로는 시알릴 루이스(Sialyl Lewis); T 세포에 의해 인식되는 종양상의 펩타이드; 종양유전자에 의해 발현되는 단백질; GD3, GD2, GM2, 9-0-아세틸 GD3 및 푸코실 GM1과 같은 강글리오사이드; 혈액형 항원 및 이의 전구체; 다형 상피 뮤신상의 항원; 및 열 쇽 단백질상의 항원에 대한 항체가 있다.

- 이들은 또는 백혈병 세포의 막 구조에 대해 지시된 항체를 포함한다. 이러한 특성의 다수의 모노클로날 항체는 이미 진단 및 치료 방법에 대해 문헌[참조: Kristensen, Danish Medical Bulletin41, 52(1994); Schranz, Therapia Hungarica38, 3(1990); Drexler et al., Leuk. Res.10. 279(1986); Naeim, Dis. Markers7, 1(1989); Stickney et al., Curr. Opin. Oncol.4, 847(1992); Drexler et al., Blut57, 327(1988); Fredman et al., Cancer Invest.9. 69(1991)]에 기술되어 있다. 백혈병의 유형에 따라, 모노클로날 항체, 또는 다음 막 항원에 대해 지시된 이의 항원-결합 항체 단편이, 예를 들어, 리간드로서 사용하기에 적합하다:

세포 막 항원

AML CD13

CD15

CD33

CAMAL

시알로실-Le

B-CLL CD5

CD1c

CD23

막 면역글로불린의 이디오타입 또는 이소타입

세포 막 항원

T-CL CD33

M38

IL-2 수용체

T 세포 수용체

ALL CALLA

CD19

비-호지킨 임파종

- 쥐 항체의 사람화, 및 Fab 및 rec. Fv 단편에 대한 유전자의 제조 및 최적화는 숙련가에게 공지된 기술에 따라 수행한다. rec. Fv 단편의 세포증식억제, 세포독성 또는 염증성 단백질 또는 효소에 대한 유전자와의 융합은 숙련가에게 공지된 당해 분야의 상태에 따라 유사하게 수행한다.

1.7) 표적 세포-결합 리간드, 및 세포증식억제 및 세포독성 단백질을 포함하는 융합 단백질에 대한 작동 유전자. 상기 리간드는 막 구조 또는 내피 세포상의 막 수용체에 결합되는 모든 물질을 포함한다. 예로는,

- 내피 세포에 의해 발현되는 수용체에 결합하는 IL-1과 같은 사이토킨 또는 증식 인자 또는 이의 단편 또는 이의 부분 물질, 예를 들어. PDGF, bFGF, VEGF 및 TGF가 있다.

- 이들은 또한 활성화되고/되거나 증식 내피 세포에 결합된 접착 분자를 포함한다. 이들의 예로는 SLex, LFA-1, MAC-1, LECAM-1, VLA-4 또는 비트로넥틴이 있다.

- 이들은 또한 종양 또는 백혈병 세포의 막 구조 또는 막 수용체에 결합된 물질을 포함한다. 예로는 백혈병 세포, 또는 종양 세포에 의해 발현되는 수용체에 결합하는 호르몬 또는 증식 인자 또는 이의 단편이 있다. 이러한 특성의 증식 인자는 문헌[참조: Cross et al., Cell64, 271(1991), Aulitzky et al., Drugs48, 667(1994), Moore, Clin. Cancer Res.1, 3(1995), Van Kooten et al., Leuk. Lymph.12, 27(1993)]에 이미 기술되어 있다.

- 표적 세포에 결합되어 있는 상기 리간드의 유전자는 숙련가에게 공지되어 있는 방법을 사용하여 당해 분야의 상태에 따라 세포증식억제, 세포독성 또는 염증성 단백질 또는 효소에 융합시킨다.

1.8) 염증 유도제, 예를 들어, 다음에 대한 작동 유전자:

- IL-1

- IL-2

- RANTES(MCP-2)

- 단핵구 주화성 및 활성화 인자(MCAF)

- IL-8

- 대식세포 염증성 단백질-1(MIP-1α, -β)

- 호중구 활성화 단백질-2(NAP-2)

- IL-3

- IL-5

- 사람 백혈병 억제 인자(LIF)

- IL-7

- IL-11

- IL-13

- GM-CSF

- G-CSF

- M-CSF

- 코브라 독 인자(CVF) 또는 사람 보체 인자 C3b에 기능적으로 상응하는, 즉 보체 인자 B에 결합할 수 있고, 인자 D에 의한 절단 후에 C3 전환효소를 구성하는 CVF의 부분 서열

- 사람 보체 인자 C3 또는 이의 부분 서열 C3b

- CVF와 기능적으로 및 구조적으로 유사한 사람 보체 인자 C3의 절단 생성물

- 보체를 활성화시키거나 염증을 유도하는 세균성 단백질, 예를 들어, 살로넬라 피리뮤리움(Salmonella typhimurium) 포린, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 응집 인자, 모듈린, 특히 그램-음성 세균성 모듈린, 레지오넬라스(Legionellas) 또는 해모필루스(Haemophilus) 인플루엔자 B형 또는 클렙실라스(Klebsiellas)의 주요 외막 단백질 또는 그룹 G 스트렙토코카이(Streptococci)의 M 분자.

1.9) 세포증식억전구체를 활성화시키는 효소, 예를 들어 불활성 전구체(프로드럭)를 활성 세포증식억제제(드럭)으로 절단하는 효소에 대한 작동 유전자.

이러한 특성의 물질, 및 이들과 관련된 각각의 경우의 프로드럭 및 드럭은 문헌[참조: Deonarain et al., Br. J. Cancer70, 786(1994); Mullen, Pharmac. Ther.63. 199(1994) 및 Harris et al., Gene Ther.1, 170(1994)]에서 이미 검토되어 있다. 예를 들어, 다음 효소 중 하나에 대한 DNA 서열을 사용한다:

- 간염 단순 바이러스 티미딘 키나제

- 수두 대상포진 바이러스 티미딘 키나제

- 세균성 니트로리덕타제

- 세균성 β-글루쿠로니다제

- 호밀로부터의 식물 β-글루쿠로니다제

- 사람 β-글로쿠로니다제

- 사람 카복시펩타이다제(CB), 예를 들어 마스트 세포 CB-A, 췌장 CB-B 또는 세균성 카복시펩타이다제

- 세균성 β-락타마제

- 세균성 사이토신 데아미나제

- 사람 카탈라제 또는 퍼옥시다제

- 포스파타제 또는 퍼옥시다제

- 포스파타제, 특히 사람 알칼리성 포스파타제, 사람 산 전립선 포스파타제 또는 5형 산 포스파타제

- 옥시다제, 특히 사람 리실 옥시다제 또는 사람 산 D-아미노 옥시다제

- 퍼옥시다제, 특히 사람 글루타티온 퍼옥시다제, 사람 호산구 퍼옥시다제 또는 사람 티로이드 퍼옥시다제

- 갈락토사이다제

2) 자가면역 질환 및 염증의 치료

2.1) 표적 세포:

- 증식하고 있는 내피 세포;

- 대식세포 및/또는 임파구 또는

- 활액 세포

2.2) 프로모터:

- 내피 세포-특이적 및 세포 주기-특이적;

- 대식세포- 및/또는 임파구-특이적 및/또는 세포 주기-특이적 또는

- 활액 세포-특이적 및/또는 세포 주기-특이적

2.3) 알레르기의 치료, 예를 들어, 다음에 대한 작동 유전자:

- IFNβ

- IFNγ

- IL-10

- IL-4에 대한 항체 또는 항체 단편

- 가용성 IL-4 수용체

- IL-12

- TGFβ

2.4) 이식된 기관의 거부반응의 예방, 예를 들어, 다음에 대한 작동 유전자:

- IL-10

- TGFβ

- 가용성 IL-1 수용체

- 가용성 IL-2 수용체

- IL-1 수용체 길항제

- 가용성 IL-6 수용체

- 링커에 의해 결합된 면역 억제 항체 또는 이의 V_H- 및 V_L-함유 단편 또는 이의 V_H- 및 V_L단편. 면역억제 항체의 예로는 T 세포 수용체 또는 이의 CD3 복합체에 대한 특이적이거나, CD4 또는 CD8에 대해, 또는 IL-2 수용체, IL-1 수용체 또는 IL-4 수용체, 또는 접착 분자 CD2, LFA-1, CD28 또는 CD40에 대해 지시적인 항체가 있다.

2.5) 항체-매개된 자가 면역 질환의 치료, 예를 들어, 다음에 대한 작동 유전자:

- TGFβ

- IFNα

- IFNβ

- IFNγ

- IL-12

- 가용성 IL-4 수용체

- 가용성 IL-6 수용체

- 면역억제 항체 또는 이의 V_H- 및 V_L-함유 단편

2.6) 세포-매개된 자가면역 질환, 예를 들어, 다음에 대한 작동 유전자:

- IL-6

- IL-9

- IL-10

- IL-13

- TNFα 또는 TNFβ

- 면역억제 항체 또는 이의 V_H- 및 V_L-함유 단편

2.7) 세포 증식의 억제제, 세포증식억제제의 전구체를 활성화시키는 세포증식억제 또는 세포독성 단백질 및 효소에 대한 작동 유전자

이러한 특성의 단백질을 암호화하는 유전자의 예는 "종양의 치료에 대한 작동 유전자" 섹션에 이미 기재되어 있다.

상기 섹션에 이미 기술된 바와 동일한 형태에서, 본 발명의 취지내에서 항체 또는 이들 항체의 Fab 또는 rec. Fv 단편, 또는 표적 세포에 대해 특이적인 이외의 리간드, 및 상기 언급한 사이토킨, 증식 인자, 수용체, 세포증식억제 또는 세포독성 단백질 및 효소로 이루어진 융합 단백질을 암호화하는 작동 유전자를 사용할 수 있다.

2.8) 관절염의 치료에 대한 작동 유전자

본 발명의 취지내에서, 발현된 단백질이, 예를 들어 관절내의 염증을 직접적으로 또는 간접적으로 억제하고/하거나 세포외 매트릭스(연골, 결합 조직)의 재구성을 촉진하는 작동 유전자를 선택한다.

예로는,

- IL-1 수용체 길합제(IL-1 RA)

IL-1 RA는 IL-1α, β를 억제한다.

- 가용성 IL-1 수용체

가용성 IL-1 수용체는 결합하여 IL-1을 불활성화시킨다.

- IL-6

IL-6은 활액 세포 및 연골세포에 의해 TIMP 및 수퍼옥사이드의 분비를 증가시키고 IL-1 및 TNFα의 분비를 감소시킨다.

- 가용성 TNF 수용체

가용성 TNF 수용체는 결합하여 TNF를 불활성화시킨다.

- IL-4

IL-4는 IL-1, TNFα 및 MMP의 형성 및 분비를 억제한다.

- IL-10

IL-10은 IL-1, TNFα 및 MMP의 형성 및 분비를 억제하고 TIMP의 분비를 증가시킨다.

- 인슐린형 증식 인자(IGF-1)

IGF-1은 세포외 매트릭스의 합성을 자극한다.

- TGFβ, 특히 TGFβ1 및 TGFβ2

TGFβ는 세포외 매트릭스의 합성을 자극한다.

- 수퍼옥사이드 디스뮤타제

- TIMP, 특히 TIMP-1, TIMP-2 또는 TIMP-3이 있다.

3) 결핍성 조혈의 치료

3.1) 표적 세포:

- 조혈 시스템의 증식하고 있는 미숙한 세포

- 조혈 세포에 인접한 간질 세포

3.2) 프로모터:

- 조혈 세포-특이적 및/또는 세포 주기 특이적

- 세포-비특이적 및 세포 주기-특이적

3.3) 빈혈증의 치료, 예를 들어, 다음에 대한 작동 유전자:

- 에리트로포이에틴

3.4) 백혈구 감소증의 치료, 예를 들어, 다음에 대한 작동 유전자:

- G-CSF

- GM-CSF

- M-CSF

3.5) 혈소판 감소증의 치료, 예를 들어, 다음에 대한 작동 유전자:

- IL-3

- 빈혈증 억제 인자(LIF)

- IL-11

- 트롬보포이에틴

4) 신경계에 입은 손상의 치료

4.1) 표적 세포:

- 신경교 세포 또는

- 증식하고 있는 내피 세포

4.2) 프로모터:

- 신경교 세포-특이적 및 세포 주기-특이적;

- 내피 세포-특이적 및 세포 주기-특이적 또는

- 비특이적 및 세포 주기- 특이적

4.3) 뉴론의 증식 인자, 예를 들어:

- FGF

- 신경섬유 증식(NSF)

- 뇌-유래된 향신경성 인자(BDNF)

- 뉴로트로핀 3(neurothrophin 3: NT-3)

- 뉴로트로핀 4(NT-4)

- 모양체 향신경성 인자(CNTF)

4.4) 효소, 예를 들어, 다음에 대한 작동 유전자:

- 티로신 하이드록실라제 또는

- 도파 하이츠록실라제

4.5) 사이토킨 및 TNFα의 신경독성 작용을 억제하거나 상쇄시키는 이들의 억제제, 예를 들어, 다음에 대한 작동 유전자:

- TGFβ

- 가용성 TNF 수용체

TNF 수용체는 TNFα를 상쇄시킨다.

- IL-10

IL-10은 IFNγ, TNFα, IL-2 및 IL-4의 형성을 억제한다.

- 가용성 IL-1 수용체

- IL-1 수용체 I

- IL-1 수용체 II

가용성 IL-1 수용체는 IL-1의 활성을 상쇄시킨다.

- IL-1 수용체 길항제

- 가용성 IL-6 수용체

5) 혈액 응고 및 혈액 순환 시스템의 장해의 치료

5.1) 표적 세포:

- 내피 세포;

- 증식하고 있는 내피 세포;

- 내피 세포 및 평활근 세포에 인접한 체세포 또는

- 대식세포

5.2) 프로모터:

- 세포-비특이적 및 세포 주기-특이적 또는

- 내피 세포, 평활근 세포 또는 대식 세포에 특이적 및 세포 주기-특이적

5.3) 응집의 억제 또는 섬유소용해의 촉진, 예를 들어, 다음에 대한 구조 유전자:

- 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA)

- 우로키나제형 플라스미노겐 활성화제(uPA)

- tPA 및 uPA의 하이브리드

- 단백질 C

- 히루딘

- C-1S 억제제, α1-안티트립신 또는 안티트롬빈 III와 같은 세린 단백질분해효소 억제제(세르핀)

- 조직 인자 경로 억제제(TFPI)

5.4) 응고의 촉진, 예를 들어, 다음에 대한 작동 유전자:

- F VIII

- F IX

- 폰 빌러브란트 인자

- F VIII

- PAI-1

- PAI-2

- 조직 인자 및 이의 단편

5.5) 맥관형성 인자, 예를 들어, 다음에 대한 작동 유전자:

- VEGF 또는

- FGF

5.6) 혈압 강하, 예를 들어, 다음에 대한 작동 유전자:

- 칼리크레인 또는

- 내피 세포 산화질소 합성효소

5.7) 내피 층에 입은 상해에 따른 평활근 세포의 증식의 억제, 예를 들어, 다음에 대한 작동 유전자:

- 항증식, 세포증식억제 또는 세포독성 단백질;

- 위에서 이미 기재한 바와 같이 (종양하에서) 세포증식억제제의 전구체를 세포증식억제제로 절단하는 효소 또는

- 이러한 활성 화합물 중 하나와 리간드, 예를 들어 근육 세포에 특이적인 항체 또는 항체 단편과의 융합 단백질

5.8) 다른 혈장 단백질, 예를 들어, 다음에 대한 작동 유전자:

- 알부민

- C1 불활성화제

- 혈청 콜린스테라제

- 트랜스페린

- 1-안티트립신

6) 백신접종

6.1) 표적 세포:

- 근육 세포;

- 대식세포 및/또는 임파구 또는

- 내피 세포

6.2) 프로모터:

- 비특이적 및 세포 주기-특이적 또는

- 표적 세포-특이적 및 세포 주기-특이적

6.3) 감염성 질환의 예방에 대한 작동 유전자

통상적으로 유효한 백신을 제조할 가능성은 제한된다.

따라서, DNA 백신의 기술이 개발되었다. 그러나, 이들 DNA 백신은 효능과 관련하여 의문스럽다.

본 발명에 따라 제조된 DNA 백신은 보다 유효할 것으로 기대할 수 있다.

선택할 활성 물질은 병원체에 의해 형성되고 면역 반응을 유도하는 방식, 즉 항체 형성 및/또는 세포독성 T 임파구의 방식에 의해 병원균의 상쇄 및/또는 파괴를 유발하는 단백질에 대한 DNA이다. 이러한 특성을 갖는 소위 상쇄 항원은 이미 백신 접종 항원으로 사용되고 있다[참고 문헌: Ellis, Adv. Exp. Med. Biol.327, 263(1992)].

본 발명의 취지내에서, 다음 병원균의 상쇄 항원을 암호화하는 DNA가 바람직하다:

- 인플루엔자 A 바이러스

- HIV

- 광견병 바이러스

- HSV(간염 단순 바이러스)

- RSV(호흡기관 합포체 바이러스)

- 파라인플루엔자 바이러스

- 로타바이러스

- VZV(수두 대상포진 바이러스)

- CMV(사이토메갈로바이러스)

- 홍역 바이러스

- HPV(사람 유두종 바이러스)

- HBV(B형 간염 바이러스)

- HCV(C형 간염 바이러스)

- HDV(D형 간염 바이러스)

- HEV(E형 간염 바이러스)

- HAV(A형 간염 바이러스)

- 비브리오 콜레라 항원

- 보렐리아 버그도르페리(Borrelia burgdorferi)

- 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)

- 말라리아 항원

- 그러나, 본 발명의 취지내에서, 이러한 특성의 활성 물질은 또는 안티이디오타입 항체 또는 항원-결합 구조(보체성 결정 부위)가 병원체의 상쇄 항원의 단백질 또는 탄수화물 구조의 복제물을 구성하는 이의 항원-결합 단편에 대한 DNA를 포함한다. 이러한 특성의 안티이디오타입 항체는, 특히 세균성인 병원체의 경우에 탄수화물 항원을 대체시킬 수 있다.

이러한 특성의 안티이디오타입 항체 및 절단 생성물은 문헌[참조: Hawkins et al., J. Immunother.14, 273(1993) 및 Westerink and Apicella, Springer Seminars in Immunopathol.15, 227(1993)]에 검토되어 있다.

6.4) "종양 백신"에 대한 작동 유전자

- 이들은 종양상의 항원을 포함한다. 이러한 특성의 항원은 문헌[참조: Sedlacek et al., Contrb. to Oncol.32, Karger Verlag, Munich(1988) 및 Contrib. to Oncol.43, Karger Verlag, Munich(1992)]에 검토되어 있다.

이외의 예로는 하기 단백질 항원 또는 다음 비-단백질 항원에 상응하는 안티이디오타입 항체의 다양한 부위(V_H, V_L)에 대한 유전자가 있다:

- 강글리오사이드

- 시알릴 루이스

- T 세포에 의해 인식되는 종양상의 펩타이드

- 종양유전자에 의해 발현되는 단백질

- 혈액형 항원 및 이의 전구체

- 종양-관련 뮤신상의 항원

- 열 쇽 단백질상의 항원

7) 만성 감염성 질환의 치료

7.1) 표적 세포:

- 간 세포

- 임파구 및/또는 대식세포

- 상피 세포

- 내피 세포

7.2) 프로모터:

- 바이러스-특이적 또는 세포-특이적 및 세포 주기-특이적

7.3) 예를 들어, 다음에 대한 작동 유전자:

- 세포증식억제, 자가사멸 또는 세포독성 효과를 나타내는 단백질

- 항바이러스성 또는 세포독성 물질을 활성 물질로 절단하는 효소

7.4) 하기의 항바이러스성 단백질에 대한 작동 유전자

- 항바이러스성 효과를 갖는 사이토킨 및 증식 인자에 대한 작동 유전자.

이들은, 예를 들어, IFNα, IFNβ, IFNγ, TNFβ, TNFα, IL-1 또는 TGFβ를 포함한다.

- 각각의 바이러스를 비활성화시키는 특이성의 항체, 또는 이들의 V_H- 및 V_L-함유 단편, 또는 링커에 의해 결합되고 이미 기술한 바와 같이 제조되는 이들의 V_H및 V_L단편.

다음은 바이러스 항원에 대한 항체의 예이다:

항-HBV

항-HCV

항-HSV

항-HPV

항-HIV

항-EBV

항-HTLV

항-콕스사키(Coxsackie) 바이러스

항-한탄(Hantaan) 바이러스

- Rev-결합 단백질. 이들 단백질은 Rev RNA에 결합하여 레트로바이러스 유전자 발현에서 Rev-의존성 전사후 단계를 억제한다. Rev-결합 단백질의 예는:

RBP9-27

RBP1-8U

RBP1-8D

RBP1-8의 위유전자(pseudogene)

- 세포 주기 조절 단백질에 대한 유전자의 mRNA 또는 바이러스의 mRNA를 분해하는 리보자임. HIV에 대해 촉매적인 리보자임은, 예를 들어, 문헌[참조: Christoffersen et al., J. Med. Chem.38, 2033(1995)]에 검토되어 있다.

5) 항세균성 단백질에 대한 작동 유전자

당해 항세균성 단백질은, 예를 들어, 세균성 독소를 상쇄시키거나 세균에 옵소닌작용을 하는 항체를 포함한다. 이들의 예로는:

메닌고코카이(Meningococci) C 또는 B

이. 콜라이(E. Coli)

보렐리아

슈도모나스(Pseudomonas)

헬리코박터 파이로리

스타필로코커스 아우레우스가 있다.

VII. 동일하거나 상이한 작동 유전자의 배합물

본 발명은 또한 2개의 상일하거나 2개의 상이한 작동 유전자[성분 c) 및 c')]의 DNA 서열이 배합된 자가-증강하는, 필요한 경우, 약리학적으로 조절가능한 발현 시스템에 관한 것이다. 발현시킬 2개의 DNA 서열의 경우, 추가의 프로모터 서열 또는 바람직하게는 "내부 리보좀 유입 부위"(IRES)에 대한 cDNA를 조절 성분으로서 2개의 작동 유전자 사이에 삽입한다.

IRES는, IRES에 의해 서로에게 결합되어 있는 2개의 DNA 서열을 발현시킬 수 있다.

이러한 특성의 IRES는, 예를 들어, 문헌[참조: Montford 및 Smith, TIG11, 179(1995); Kaufman et al., Nucl. Acids Res.19, 4485(1991); Morgan et al., Nucl. Acids Res.20, 1293(1992); Dirks et al., Gene128, 247(1993); Pelletier 및 Sonenberg, Nature334, 320(1988) 및 Sugitomo et al., Biotechn.12, 694(1994)]에 기술되어 있다.

이와 같이, 예를 들어, 폴리오바이러스의 IRES 서열(5' UTR의 위치≤140 내지 ≥630)에 대한 cDNA를 사용할 수 있다.

본 발명의 취지내에서, 부가적인 작용을 나타내는 작동 유전자를 바람직하게는 추가의 프로모터 서열 또는 IRES 서열에 의해 결합시켜야 한다.

본 발명의 취지내에서, 다음은, 하기에 대한 작동 유전자의 바람직한 배합물의 예이다:

1) 종양의 치료

- 동일하거나 상이한, 세포증식억제, 자가사멸, 세포독성 또는 염증성 단백질 또는

- 세포증식억제제의 전구체를 절단하는 동일하거나 상이한 효소

2) 자가면역 질환의 치료

- 세포 및/또는 체액의 면역 반응의 억제에 대해 공동상승 효과를 갖는 상이한 사이토킨 또는 수용체 또는

- 상이하거나 동일한 TIMP

3) 결핍성 조혈의 치료

- 상이하거나, 체계적으로 연속적인 사이토킨, 예를 들어 IL-1, IL-3, IL-6 또는 GM-CSF 및 에리트로포이에틴, G-CSF 또는 트롬보포이에틴

4) 신경 세포 손상의 치료

- 뉴론의 증식 인자 및 사이토킨 또는 사이토킨의 억제제

5) 혈액 응고 및 혈액 순환 시스템의 장해의 치료

- 섬유소용해제(예: tPA 또는 uPA) 또는

- 세포증식억제, 자가사멸 또는 세포독성 단백질 및 항트롬빈제 또는 섬유소용해제

공동상승적으로 작용하는 여러 상이한 혈액 응고 인자, 예를 들어, F VIII 및 vWF 또는 F VIII 및 F IX

6) 백신접종

- 항원 및 사이토킨, 예를 들어, IL-1α, IL-1β, IL-2, GM-CSF, IL-3 또는 IL-4 수용체

- 하나의 병원체 또는 상이한 병원체의 상이한 항원 또는

- 하나의 종양 유형 또는 상이한 종양 유형의 상이한 항원

7) 바이러스성 감염성 질환의 치료

- 항바이러스성 단백질 및 세포증식억제, 자가사멸 또는 세포독성 단백질

- 하나의 바이러스 또는 여러 바이러스의 상이한 표면 항원에 대한 항체

8) 세균성 감염성 질환의 치료

- 상이한 표면 항원 및/또는 기관의 독소에 대한 항체

시그날 서열 및 경막 도메인의 삽입

1) 해독 증진

해독을 증진시키기 위해, 뉴클레오티드 서열 GCCACC 또는 GCCGCC[참조 문헌: Kozak, J. Cell Biol.108, 299(1989)]을 프로모터 서열의 3' 말단 및 직접적으로 시그날 또는 경막 서열의 개시 시그날(ATG)의 5' 말단에 삽입시킬 수 있다.

2) 분비 촉진

작동 유전자의 발현 생성물의 분비를 촉진시키기 위해, 작동 유전자의 DNA 서열내에 존재할 수 있는 동종의 시그날 서열을 세포외 방출을 개선시키는 이종의 시그날 서열로 대체시킬 수 있다.

이와 같이, 면역글로불린 시그날 서열(DNA 위치≤63 내지 ≥107; Riechmann et al., Nature332, 323(19988)) 또는 CEA 시그날 서열((DNA 위치≤33 내지 ≥134; Schrewe et al., Mol. Cell Biol.10, 2738(1990); Berling et al., Cancer Res.50, 6534(1990)) 또는 사람 호흡기관 합포체 바이러스 당단백질 시그날 서열(아미노산 ≤38 내지 ≥50 또는 48 내지 65에 대한 cDNA; Lichtenstein et al., J. Gen. Virol.77, 109(1996))을, 예를 들어 삽입시킬 수 있다.

3) 활성 화합물 고정

3.1) 시그날 서열에 대한 대체물로서 또는 부가하여, 경막 도메인에 대한 서열을, 활성 화합물을 형성하는 형질도입된 세포 막에의 활성 화합물의 고정을 목적으로 삽입시킬 수 있다.

이와 같이, 사람 대식세포 콜로리-자극 인자의 경막 서열(DNA 위치≤1485 내지 ≥1554; Cosman et al., Behring Inst. Mitt.83, 15(1988)) 또는 사람 호흡기관 합포체 바이러스(RSV) 당단백질 G의 시그날 및 경막 부위에 대한 DNA 서열(아미노산1내지63또는 이의 부분 서열, 아미노산 38 내지 63; Vijaya et al., Mol. Cell Biol.8, 1709(1988); Lichtenstein et al., J. Gen. Virol.77, 109(1996)) 또는 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제의 시그날 및 경막 부위에 대한 DNA 서열(아미노산 7 내지 35 또는 부분 서열 아미노산 7 내지 27; Brown et al., J. Virol.62, 3824(1988))을, 예를 들어, 프로모터 서열과 작동 유전자의 서열 사이에 삽입시킬 수 있다.

3.2) 그러나, 당인지질 앵커에 대한 뉴클레오티드 서열도, 활성 화합물을 형성하는 형질도입된 서열의 세포 막내에의 활성 화합물의 고정을 목적으로 삽입시킬 수 있다.

당인지질 앵커를 작동 유전자의 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 삽입시킬 수 있으며, 이러한 삽입은 시그날 서열의 삽입에 부가하여 발생할 수 있다.

당인지질 앵커는, 예를 들어, CEA, N-CAM, 및 Thy-1과 같은 이외의 막 단백질에 대해 기술되어 있다[참고 문헌: Ferguson et al., Ann. Res. Biochem.57, 285(1988)].

3.3) 리간드-활성 화합물 융합 단백질에 대한 DNA 서열의 사용은 본 발명에 따라 활성 화합물을 세포 막에 고정시키기 위한 또 다른 선택을 제시한다. 상기 융합 단백질의 리간드의 특이성은 선택된 표적 세포의 세포 막상의 막 구조에 따른다.

세포의 표면에 결합하는 리간드는, 예를 들어, 다음의 예의 표면상의 구조에 따른 항체 또는 항체 단편을 포함한다:

- 내피 세포. 이들 항체는, 특히 VEGF 수용체 또는 키닌 수용체에 대한 항체를 포함한다.

- 근육 세포, 예를 들어, 액틴에 대한 항체 또는 안지오텐신 II 수용체에 대한 항체 또는 증식 인자에 대한 수용체, 예를 들어, EGF 수용체, PDGF 수용체 또는 FGF 수용체에 대한 항체 또는 엔도텔린 A 수용체에 대한 항체

- 상기 리간드는 또한 종양-특이적 또는 종양 세포 막상의 종양-관련 항원에 대한 항체 또는 이들의 단편을 포함한다. 이러한 특성의 항체는 이미 기술되어 있다.

쥐 모노클로날 항체는 바람직하게는 사람화된 형태로 사용하여야 한다. Fab 및 rec. Fv 단편 및 이의 융합 생성물은 숙련가가 정통한 기술을 사용하여, 이미 기술되어 있는 바와 같이 제조한다.

리간드는 또한 사이토킨 또는 접착 분자, 증식 인자 또는 이의 단편 또는 이의 부분 서열, 매개체 또는 선택된 특정 세포상의 막 구조 또는 막 수용체에 결합되어 있는 펩타이드 호르몬과 같은 활성 화합물을 포함한다. 이러한 리간드의 예는,

- 내피 세포에 대한 리간드, 예를 들어 IL-1, PDGF, bFGF, VEGF, TGGβ 또는 키닌 및 키닌의 유도체 또는 유사체가 있다.

- 또한, 리간드는 접착 분자를 포함한다. 이러한 특성의 접착 분자, 예를 들어, SLex. LFA-1, MAC-1, LeCAM-1, VLA-4 또는 비트로넥틴 및 비트로넥틴의 유도체 또는 유사체는 내피 세포에 대해 이미 기술되어 있다[참조 문헌: Augustin-Voss et al., J. Cell Biol.119, 483(1992); Pauli et al., Cancer Metast. Rev.9, 175(1990); Honn et al., Cancer Metast. Rev.11, 353(1992); Varner et al., Cell Adh. Commun.3, 367(1995)].

본 발명은 하기 예에 보다 상세히 기술되어 있다.

IX. 본 발명의 주제르 포다 상세히 기술하는 예

1) 종양유전자-조절된 발현 시스템의 제조

본 발명에 따른 종양유전자-조절된 발현 시스템은 다운스트림 방향으로 서로 이어지는 다음의 상이한 뉴클레오티드 서열로 구성된다:

- 성분 a)

· cdc25C 유전자의 프로모터(핵산 -290 내지 +121; Zwicker et al., EMBO J.14, 4514(1995); Zwicker et al., Nucl. Acids Res.23, 3822(1995))

- 성분 b)

· SV40의 핵 정위 시그날(NLS)(SV40 large T, 아미노산 126 내지 132; PKKKRKV(서열 13); Dingwall et al. TIBS16, 478(1991))

· HSV-1 VP16의 산 전이활성화 도메인(TAD)(아미노산 406 내지 488; Triezenberg et al., Genes Developm.2: 718(1988); Trizenberg, Curr. Opin. Gen. Developm.5: 190(1995))

· E2F-1 단백질의 RB 결합 서열(아미노산 409 내지 426(LDYHFGLEEGEGIRDLFD)(서열 14); Flemington et al., PNAS USA90, 6914(1993); Helin et al., Cell70, 337(1992))

· Gal4 단백질의 DNA 결합 도메인에 대한 cDNA(아미노산 1 내지 147; Chasman 및 Kornberg, Mol. Cell Biol.10, 2916(1990))

- 성분 c)

· 뉴클레오티드 서열 5'-CGGACAACTGTTGACCG-3'(서열 1)을 갖는 Gal4 DNA-결합 서열에 대한 10×결합 서열(Chasman 및 Kornberg, Mol. Cell Biol.10, 2916(1990))

· SV40 기저 프로모터(핵산 48 내지 5191; Toose(ed) DNA Tumor Viruses; Cold Spring Harbor New York, New York, Cold Spring Harbor Laboratory)

- 성분 d)

· 서열 GCCACC(Kodak, J. Cell Biol.108, 229(1989))

· 면역글로불린 시그날 펩타이드에 대한 cDNA(뉴클레오티드 서열 63 내지 107; Riechmann et al., Nature332, 323(1988))

· β-글루쿠로니다제에 대한 c-DNA(뉴클레오티드 서열 93 내지 1982; Oshima et al., PNAS USA84, 685(1987))

작제물의 각각의 성분을 PCR 증폭에 의해 상이한 성분의 말단에서 유입되는 적합한 제한 부위에 통해 결합시킨다. 결합은 숙련가에게 공지되어 있는, 제한 부위에 특이적인 효소 및 DNA 리가제를 사용하여 수행한다. 상기 효소는 상업적으로 구입할 수 있다.

이와 같이 제조한 뉴클레오티드 작제물을 직접적으로 또는 콜로이드성 분산액 시스템내에서 생체내용으로 사용되는 pXP2 플라스미드 벡터[참고 문헌: Nordeen, Bio Techniques 454(1988)]내로 클로닝시킨다.

배양시 유지되는 3T3 섬유아세포(RB-포지티브) 및 골육종 세포(SAOS-2, RB-네가티브)를 숙련가에게 공지된 방법[참조: Lucibello et al., EMBO J. 132(1995)]을 사용하여 상기한 플라스미드로 형질감염시키고, 섬유아세포 또는 골육종 세포에 의해 생성된 β-글루쿠로니다제의 양을 4-메틸움벨리페릴-β-글루쿠로니드를 기질로서 사용하여 측정한다.

세포 주기 특이성을 확인하기 위해, 골육종 세포를 48시간 동안 메티오닌을 제거함으로써 G₀/G₁에서 동시화시킨다. 상기 세포의 DNA 함량을, Hoechst 33258로 염색시킨 후 형광-활성화 세포 분류기에서 측정한다[참조: Lucibello et al., EMBO J. 132(1995)].

다음 결과를 수득한다:

형질감염되지 않은 섬유아세포와 비교할 경우, 형질감염된 섬유아세포(RB-포지티브)내에서 β-글루쿠로니다제의 증가를 탐지할 수 없다.

형질감염된 골육종 세포(RB-네가티브)는 형질감염되지 않은 세포보다 β-글루쿠로니다제를 현저하게 많이 발현시킨다.

증식하고 있는 골육종 세포(DNA＞2S; S = 염색체의 단일 세트)는 G₀/G₁(DNA=2S)에서 동시화된 골육종 세포보다 β-글루쿠로니다제를 현저하게 많이 분비한다.

결과적으로, 상기한 발현 시스템은 조절할 수 있는 구조 유전자 β-글루쿠로니다제의 RB-의존성 발현을, 예를 들어, 프로모터 서열의 선택에 따른 세포 주기-의존성 방식으로 일으킨다.

2) 바이러스-조절된 발현 시스템의 제조

본 발명에 따른 바이러스-조절된 발현 시스템은 다운스트림 방향으로 서로 이어지는 다음의 상이한 뉴클레오티드 서열로 구성된다:

- 성분 a)

- 성분 b)

· HSV-1 VP16의 산 전이활성화 도메인(TAD)(아미노산 406 내지 488; Triezenberg et al., Genes Developm.2: 718(1988); Trizenberg, Curr. Opin. Gene Developm.5: 190(1995))

· HPV-18 바이러스의 E6 단백질(뉴클레오티드 서열 100 내지 578; Roggenbuck et al., J. Virol.65, 5068(1991))

- 성분 c)

- 성분 d)

· 서열 GCCACC(Kodak, J. Cell Biol. 108, 229(1989))

이와 같이 제조한 뉴클레오티드 작제물을 직접적으로 또는 콜로이드성 분산액 시스템내에서 생체내용으로 사용되는 pUC18/19 플라스미드 벡터내로 클로닝시킨다.

배양시 유지되는 사람 섬유아세포(Wi-38, E6/E7-네가티브) 및 경부 암종 세포(HeLa, HPV-18-E6/E7-포지티브)를 숙련가에게 공지된 방법[참조: Lucibello et al., EMBO J. 132(1995)]을 사용하여 상기한 플라스미드로 형질감염시키고, 섬유아세포 또는 골육종 세포에 의해 생성된 β-글루쿠로니다제의 양을 4-메틸움벨리페릴-β-글루쿠로니드를 기질로서 사용하여 측정한다.

다음 결과를 수득한다:

형질감염되지 않은 섬유아세포와 비교할 경우, 형질감염된 섬유아세포내에서 β-글루쿠로니다제의 증가를 탐지할 수 없다.

형질감염된 HeLa 세포는 형질감염되지 않은 세포보다 β-글루쿠로니다제를 현저하게 많이 발현시킨다.

결과적으로, 상기한 발현 시스템은 조절할 수 있는 구조 유전자 β-글루쿠로니다제의 바이러스-특이적(HPV18) 발현을, 예를 들어, 프로모터 서열의 선택에 따른 세포 주기-의존성 방식으로 일으킨다.

예를 들어, 종양의 부위에서의 국부 투여, 또는 두개내 또는 지주막하 투여 또는 전신, 바람직하게는 정맥내 또는 동맥내 투여의 결과로, 실시예 1 및 2에 따른 활성 화합물은, 독점적이지 않을 경우, 주로 변이된 종양유전자 또는 β-글루쿠로니다제를 분비하는 바이러스 감염을 나타내는 세포만이라는 것은 확실하다. 이들 β-글루쿠로니다제는 지금 주사된, 충분히-내성인 독소루비신-β-글루쿠로니드[참고 문헌: Jacquesy et al., EP 0 511 917 A1]를 세포증식억제적으로 작용하는 독소루비신으로 절단한다. 독소루비신은 내피 세포 증식을 억제하고 이들 세포상에서 및 또한 인접한 종양 세포상에서 세포증식억제적으로 작용한다. 이의 결과로 종양의 증식이 억제된다.

본 발명은 조절 단백질이 약화되거나 변형된 형태로 나타나는 세포내에서 활성화시킬 수 있는 신규하고 단순한 발현 시스템을 제공한다.

서열 목록

(1) 일반적 정보:

(i) 출원인:

(A) 성명: 훽스트 마리온 러쎌 도이칠란트 게엠베하

(B) 거리: -

(C) 시: 프랑크푸르트

(D) 주: -

(E) 국가: 독일

(F) 우편번호(ZIP): 65926

(G) 전화: 069-305-3005

(H) 팩스: 069-35-7175

(I) 텔렉스: -

(ii) 발명의 명칭: 종양유전자- 또는 바이러스-조절된 발현 시스템

(iii) 서열수: 14

(iv) 컴퓨터 판독형:

(A) 매체 유형: 플로피 디스크

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종

(C) 운영 시스템: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, 버젼 #1.30(EPO)

(2) 서열 1에 대한 정보:

(i) 서열 특징

(A) 길이: 17개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 유형: DNA(게놈)

(ix) 특성:

(A) 명칭/키(key): 엑손

(B) 존재 위치: 1..17

(xi) 서열 기술:

(2) 서열 2에 대한 정보:

(i) 서열 특징

(A) 길이: 20개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 유형: DNA(게놈)

(ix) 특성:

(A) 명칭/키: 엑손

(B) 존재 위치: 1..20

(xi) 서열 기술:

(2) 서열 3에 대한 정보:

(i) 서열 특징

(A) 길이: 22개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 유형: DNA(게놈)

(ix) 특성:

(A) 명칭/키: 엑손

(B) 존재 위치: 1..22

(xi) 서열 기술:

(2) 서열 4에 대한 정보:

(i) 서열 특징

(A) 길이: 42개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 유형: DNA(게놈)

(ix) 특성:

(A) 명칭/키: 엑손

(B) 존재 위치: 1..42

(xi) 서열 기술:

(2) 서열 5에 대한 정보:

(i) 서열 특징

(A) 길이: 11개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 유형: DNA(게놈)

(ix) 특성:

(A) 명칭/키: 엑손

(B) 존재 위치: 1..11

(xi) 서열 기술:

(2) 서열 6에 대한 정보:

(i) 서열 특징

(A) 길이: 21개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 유형: DNA(게놈)

(ix) 특성:

(A) 명칭/키: 엑손

(B) 존재 위치: 1..21

(xi) 서열 기술:

(2) 서열 7에 대한 정보:

(i) 서열 특징

(A) 길이: 10개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 유형: DNA(게놈)

(ix) 특성:

(A) 명칭/키: 엑손

(B) 존재 위치: 1..10

(xi) 서열 기술:

(2) 서열 8에 대한 정보:

(i) 서열 특징

(A) 길이: 14개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 유형: DNA(게놈)

(ix) 특성:

(A) 명칭/키: 엑손

(B) 존재 위치: 1..14

(xi) 서열 기술:

(2) 서열 9에 대한 정보:

(i) 서열 특징

(A) 길이: 16개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 유형: DNA(게놈)

(ix) 특성:

(A) 명칭/키: 엑손

(B) 존재 위치: 1..16

(xi) 서열 기술:

(2) 서열 10에 대한 정보:

(i) 서열 특징

(A) 길이: 17개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 유형: DNA(게놈)

(ix) 특성:

(A) 명칭/키: 엑손

(B) 존재 위치: 1..17

(xi) 서열 기술:

(2) 서열 11에 대한 정보:

(i) 서열 특징

(A) 길이: 26개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 유형: DNA(게놈)

(ix) 특성:

(A) 명칭/키: 엑손

(B) 존재 위치: 1..26

(xi) 서열 기술:

(2) 서열 12에 대한 정보:

(i) 서열 특징

(A) 길이: 41개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 유형: DNA(게놈)

(ix) 특성:

(A) 명칭/키: 엑손

(B) 존재 위치: 1..41

(xi) 서열 기술:

(2) 서열 13에 대한 정보:

(i) 서열 특징

(A) 길이: 7개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 유형: 단백질

(ix) 특성:

(A) 명칭/키: 펩타이드

(B) 존재 위치: 1..7

(xi) 서열 기술:

(2) 서열 14에 대한 정보:

(i) 서열 특징

(A) 길이: 18개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 유형: 단백질

(ix) 특성:

(A) 명칭/키: 펩타이드

(B) 존재 위치: 1..18

(xi) 서열 기술:

Claims

핵산 작제물에 함유되어 있는 전사 인자 유전자(성분 b)의 발현을 조절하는 프로모터 I(성분 a)을 함유하고, 전사 인자 유전자의 유전자 생성물(전사 인자 유전자의 유전자 생성물의 활성은 당해 유전자 생성물에 특이적으로 결합하여 이의 활성에 영향을 주는 하나 이상의 세포성 조절 단백질에 의존한다)이 특이적으로 결합되어 있고 핵산 작제물에 함유되어 있는 작동 유전자(성분 d)의 발현을 조절하는 프로모터 II(성분 c)를 함유하는, 작용 유전자 발현용 핵산 작제물.
제1항에 있어서,

성분 a)가 성분 b)의 전사에 대한 활성화 성분이고;

성분 b)가 전사 인자의 하나 이상의 활성화 도메인인 성분 b₁), 조절 단백질에 대한 결합 단백질의 하나 이상의 결합 서열인 성분 b₂) 및 DNA-결합 도메인인 성분 b₃)을 함유하는 전사 인자이고;

성분 c)가 성분 b)의 발현 생성물을 결합시킴으로써 활성화되고 성분 d)의 전사를 활성화시키는 활성화 서열이고;

성분 d)가 작동 유전자인 핵산 작제물.
제1항에 있어서, 성분 a, b 및 c가,

- 성분 a'): 성분 a₁) 세포성 조절 단백질에 대한 DNA-결합 서열 및 성분 a₂) 기저 프로모터를 함유하는, 성분 b')의 전사에 대한 활성화 서열

- 성분 b'): 리프레서 단백질을 구성하고 성분 c')를 억제하는 전사 인자

- 성분 c'): 성분 c₁) 성분 d)의 전사에 대한 활성화 서열 및 성분 c₂) 리프레서 단백질[성분 b')]을 결합시켜 성분 d)의 전사의 활성화를 억제하는 DNA 서열을 함유하는 활성화 서열

- 성분 d): 작동 유전자인 성분 a', b' 및 c'의 형태로 작용하는 핵산 작제물.
제2항에 있어서, 성분 a)가 성분 c)와 동일한 핵산 작제물.
제2항 또는 제3항에 있어서, 성분 a) 또는 성분 c₁)이 비특이적으로, 세포-특이적으로, 대사적으로 특이적인 방법으로, 바이러스-특이적으로 및/또는 세포 주기-특이적으로 활성화될 수 있는 프로모터 서열인 핵산 작제물.
제5항에 있어서, 성분 a) 또는 성분 c₁)이,

- 피부, 폐, 위장관 또는 신장, 및 비뇨기관의 내피 세포, 복막 세포, 늑막 세포, 상피 세포, 근육 세포, 결합 조직 세포, 조혈 세포, 대식세포, 임파구, 백혈병 세포, 종양 세포 또는 신경교 세포내에서 활성화되는 프로모터,

- HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV, CMV 또는 HIV와 같은 바이러스로부터의 프로모터 서열

- 저산소증에 의해 활성화되는 프로모터 또는 인핸서 서열

- cdc25C, 사이클린 A, cdc2, E2F-1, B-myb 및 DHFR에 대한 유전자의 세포 주기-특이적 활성화 서열 및

- Myc E 박스의 단량체 또는 다량체와 같은, 세포 증식-의존 방식으로 발생하거나 활성화되는 전사 인자에 대한 결합 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 핵산 작제물.
제2항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 성분 b)의 활성화 도메인[성분 b₁)]이 전사 인자 Oct-2, Sp1, NFY, ITF-2, VP-16, c-Myc 및 CTF로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 핵산 작제물.
제2항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포성 조절 단백질에 대한 결합 서열[성분 b)의 성분 b₂)]이 세포성 결합 단백질 또는 이 결합 단백질의 부분인 핵산 작제물.
제8항에 있어서, 세포성 결합 단백질 또는 이 결합 단백질의 부분이 p53, pRb, p130, Max, MAD, VHL, cdk-4, MTS-1(p16), WT-1, SMAD-2 및 DPC-4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 세포성 조절 단백질에 결합하는 핵산 작제물.
제9항에 있어서, 성분 b')가 E2F-1, -2, -3, -4, -5, 사이클린-D₁, -D₂, -D₃또는 -C, 사이클린 A, -E, Myc, 전사 인자 PU.1 또는 Elf-1, 엘롱긴-B, -C, p14, p15, p16, p18, p21, p27, p53, Myc, cdk-4, DPC-4 및 SMAD-2로 이루어진 세포성 결합 단백질의 그룹으로부터 선택되는 핵산 작제물.
제7항에 있어서, 세포성 조절 단백질에 대한 결합 서열[성분 b)의 성분 b₂)]이 바이러스성 결합 단백질 또는 이 결합 단백질의 부분인 핵산 작제물.
제11항에 있어서, 바이러스성 결합 단백질 또는 이 결합 단백질의 부분이 p53, pRb(p110), NFKB, p-130, CBF-1, Lyn 티로신 키나제, bak 및 bax로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포성 조절 단백질에 결합하는 핵산 작제물.
제12항에 있어서, 성분 b₂)가 CMV의 IE 84, AV의 E1B(55kd), EBV의 EBNA-5, EBV의 BHFR, HPV-16 또는 -18의 E6, HBV의 x 단백질, SV40의 T 항원, AV의 E1A, EBV의 EBNA-2, EBV의 EBNA-1, HPV의 E7, HIV의 Tax, EBV의 LMP-1, EBV의 LMP-2A 또는 LMP-2B, AV의 E1B(16kd), AV의 E1B(10kd)로 이루어진 바이러스성 결합 단백질의 그룹으로부터 선택되는 핵산 작제물.
제7항에 있어서, 세포성 조절 단백질에 대한 결합 서열[성분 b)의 성분 b₂)]이 항체 또는 이 항체의 부분인 핵산 작제물.
제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 성분 c)가 결합 성분 b)에 대한 하나 이상의 DNA 서열을 함유하고 이 결합의 결과로서 성분 d)의 발현을 활성화시키는 핵산 작제물.
제15항에 있어서, DNA 서열이 Gal4 단백질에 대한 결합 서열(5'-CGGACAACTGTTGACCG-3': 서열 1); LexA 단백질에 대한 결합 서열(5'-TACTGTATGTACATACAGTA-3': 서열 2); Lac I 리프레서 단백질에 대한 결합 서열(5'-GAATTGTGAGCGCTCACAATTC-3': 서열 3); 테트라사이클린 리프레서 단백질에 대한 결합 서열(5'-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3': 서열 4) 및 ZFHD-1 단백질에 대한 결합 서열(5'-TAATGATGGCG-3': 서열 5)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 핵산 작제물.
제11항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포성 조절 단백질에 대한 DNA-결합 서열[성분 a₁)]이 p53, W4-1, NF kappa B, E2F/DP 및 Myc/Max 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 DNA-결합 서열인 핵산 작제물.
제17항에 있어서, 기저 프로모터[성분 a₂)]가 SV40, c-fos, U2 sn RNA 및 HSV-TK로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 핵산 작제물.
제18항에 있어서, 리프레서[성분 b')]가 lac 리프레서 유전자 및 테트라사이클른 리프레서 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 핵산 작제물.
제19항에 있어서, 리프레서에 대한 DNA-결합 서열[성분 c')]이 하나 이상의 lac 오퍼레이터 결합 서열 또는 하나 이상의 테트라사이클린 오퍼레이터 결합 서열을 함유하는 핵산 작제물.
제1항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, 작동 유전자(성분 d)가 사이토킨; 케모킨; 증식 인자; 사이토킨, 케모킨 또는 증식 인자에 대한 수용체; 항증식성, 세포증식억제 또는 자가사멸 효과를 갖는 단백질; 항체; 항체 단편; 맥관형성 억제제; 펩타이드 호르몬; 응고 인자; 응고 억제제; 섬유소용해 단백질; 혈액 순환에 영향을 미치는 펩타이드 또는 단백질; 혈장 단백질; 및 병원체, 세포 또는 종양의 항원으로 이루어진 그룹으로 선택되는 활성 화합물을 암호화하는 유전자이고, 선택된 항원이 면역 반응을 일으키는 핵산 작제물.
제1항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, 작동 유전자가, 약물의 전구 체를 약물로 절단하는 효소를 암호화하는 유전자인 핵산 작제물.
제1항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, 작동 유전자가 리간드-활성 화합물 융합 단백질 또는 리간드-효소 융합 단백질을 암호화하는 유전자이고, 리간드가 사이토킨, 증식 인자, 항체, 항체 단편, 펩타이드 호르몬, 매개체 및 세포 접착 분자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 핵산 작제물.
제2항에 있어서, 성분 a), b), c) 및 d)가 다음 특성을 갖는 핵산 작제물.

- 성분 a)

· cdc25C 유전자의 프로모터(핵산 -290 내지 +121)

- 성분 b)

· SV40의 핵 정위 시그날(NLS)(SV40 large T, 아미노산 126 내지 132; PKKKRKV(서열 13))

· HSV-1 VP16의 산 전이활성화 도메인(TAD)(아미노산 406 내지 488)

· E2F-1 단백질의 RB 결합 서열(아미노산 409 내지 426(LDYHFGLEEGEGIRDLFD)(서열 14))

· Gal4 단백질의 DNA 결합 도메인에 대한 cDNA(아미노산 1 내지 147)

- 성분 c)

· 뉴클레오티드 서열 5'-CGGACAACTGTTGACCG-3'(서열 1)을 갖는 Gal4 DNA-결합 서열에 대한 10×결합 서열

· SV40 기저 프로모터(핵산 48 내지 5191)

- 성분 d)

· 서열 GCCACC

· 면역글로불린 시그날 펩타이드에 대한 cDNA(뉴클레오티드 서열 63 내지 107)

· β-글루쿠로니다제에 대한 c-DNA(뉴클레오티드 서열 93 내지 1982)
제2항에 있어서, 성분 a), b), c) 및 d)가 다음 특성을 갖는 핵산 작제물.

- 성분 a)

· cdc25C 유전자의 프로모터(핵산 -290 내지 +121)

- 성분 b)

· SV40의 핵 정위 시그날(NLS)(SV40 large T, 아미노산 126 내지 132; PKKKRKV(서열 13))

· HSV-1 VP16의 산 전이활성화 도메인(TAD)(아미노산 406 내지 488)

· HSV-18 바이러스의 E6 단백질(뉴클레오티드 100 내지 578)

· Gal4 단백질의 DNA 결합 도메인에 대한 cDNA(아미노산 1 내지 147)

- 성분 c)

· 뉴클레오티드 서열 5'-CGGACAACTGTTGACCG-3'(서열 1)을 갖는 Gal4 DNA-결합 서열에 대한 10×결합 서열

· SV40 기저 프로모터(핵산 48 내지 5191)

- 성분 d)

· 서열 GCCACC

· 면역글로불린 시그날 펩타이드에 대한 cDNA(뉴클레오티드 서열 63 내지 107)

· β-글루쿠로니다제에 대한 c-DNA(뉴클레오티드 서열 93 내지 1982)
제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 있어서, 핵산이 DNA인 핵산 작제물.
제1항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물이 벡터내에 삽입된 핵산 작제물.
제27항에 있어서, 벡터가 플라스미드 벡터인 핵산 작제물.
제27항에 있어서, 벡터가 바이러스성 벡터인 핵산 작제물.
제1항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 있어서, 질환의 예방 또는 치료를 위해 핵산 작제물을 외측, 경구, 방광내, 비내, 기관지내 또는 위장관내로 투여하거나, 기관, 체강, 근육조직, 피하 또는 혈액 순환내로 주사하는 핵산 작제물.
제1항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 따른 핵산 작제물을 함유하는 분리된 세포.
감염, 종양, 백혈병, 자가면역 질환, 알레르기, 관절염, 염증, 기관 거부반응, 이식 대 숙주 반응, 혈액 응고 질환, 순환성 질환, 빈혈증, 호르몬 질환 및 CNS 손상으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환 치료용 약물을 제조하기 위한 제1항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 따른 핵산 작제물 또는 제31항에 따른 세포의 용도.
각각의 성분을 함께 단계식으로 결합시킴을 포함하는, 제1항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 따른 핵산 작제물을 제조하는 방법.
하나 이상의 세포를 외측, 방광내, 비내, 기관지내, 경구 또는 위장관내로 투여하거나, 기관, 체강, 근육조직, 피하 또는 혈액 순환내로 주사하는, 제32항에 따른 질환의 예방 또는 치료용 약물을 제조하기 위한 제31항에 따른 세포의 용도.