RU2205029C2 - Генетически измененные клетки и их применение для профилактики или лечения заболеваний - Google Patents
Генетически измененные клетки и их применение для профилактики или лечения заболеваний Download PDFInfo
- Publication number
- RU2205029C2 RU2205029C2 RU98113791/14A RU98113791A RU2205029C2 RU 2205029 C2 RU2205029 C2 RU 2205029C2 RU 98113791/14 A RU98113791/14 A RU 98113791/14A RU 98113791 A RU98113791 A RU 98113791A RU 2205029 C2 RU2205029 C2 RU 2205029C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- cell
- gene
- virus
- protein
- Prior art date
Links
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title description 17
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 title description 3
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 title 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 145
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims abstract description 138
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims abstract description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 39
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 32
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims abstract description 29
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 21
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 12
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 108700025695 Suppressor Genes Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 10
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 claims abstract description 8
- 101100005789 Caenorhabditis elegans cdk-4 gene Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 7
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 claims abstract description 5
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims abstract description 5
- 101100439046 Caenorhabditis elegans cdk-2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 160
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 55
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 50
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 39
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 32
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 32
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 32
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 32
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 32
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 30
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 30
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 claims description 29
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 25
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 25
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 claims description 23
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 21
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 21
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 claims description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 18
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 16
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 claims description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 16
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 15
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 13
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims description 13
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 13
- -1 ECAF Proteins 0.000 claims description 12
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims description 12
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 12
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 12
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 10
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 claims description 8
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 8
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 7
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 6
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 6
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 6
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 6
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 5
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 claims description 5
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 claims description 5
- 241000724252 Cucumber mosaic virus Species 0.000 claims description 4
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 claims description 4
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 4
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 claims description 4
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 claims description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 3
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims description 3
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims description 3
- 101150012716 CDK1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 108010068192 Cyclin A Proteins 0.000 claims description 3
- 101100059559 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) nimX gene Proteins 0.000 claims description 3
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims description 3
- 101710115153 Myb-related protein B Proteins 0.000 claims description 3
- 101100273808 Xenopus laevis cdk1-b gene Proteins 0.000 claims description 3
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 claims description 3
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 claims description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims description 3
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 claims description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 claims description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 3
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 claims description 3
- 102100022987 Angiogenin Human genes 0.000 claims description 2
- 108091035710 E-box Proteins 0.000 claims description 2
- 108050002772 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000012199 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000368 Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 claims description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 claims description 2
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 claims description 2
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 claims description 2
- XDMCWZFLLGVIID-SXPRBRBTSA-N O-(3-O-D-galactosyl-N-acetyl-beta-D-galactosaminyl)-L-serine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](OC[C@H]([NH3+])C([O-])=O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 XDMCWZFLLGVIID-SXPRBRBTSA-N 0.000 claims description 2
- 102100039277 Pleiotrophin Human genes 0.000 claims description 2
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 claims description 2
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 claims description 2
- 108010072788 angiogenin Proteins 0.000 claims description 2
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003130 blood coagulation factor inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- 210000001736 capillary Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 claims description 2
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 claims 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 claims 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims 2
- 102000002554 Cyclin A Human genes 0.000 claims 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 claims 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 claims 1
- 102100020880 Kit ligand Human genes 0.000 claims 1
- 101710177504 Kit ligand Proteins 0.000 claims 1
- 102000000853 LDL receptors Human genes 0.000 claims 1
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 claims 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims 1
- 102100034670 Myb-related protein B Human genes 0.000 claims 1
- 210000004460 N cell Anatomy 0.000 claims 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 claims 1
- 108010057576 Papillomavirus E7 Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 101710098940 Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 claims 1
- 102100024026 Transcription factor E2F1 Human genes 0.000 claims 1
- 101710138750 Transcription factor E2F1 Proteins 0.000 claims 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 claims 1
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 claims 1
- 108700014844 flt3 ligand Proteins 0.000 claims 1
- 210000003281 pleural cavity Anatomy 0.000 claims 1
- 229940070376 protein Drugs 0.000 claims 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 claims 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 15
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 abstract description 11
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 abstract description 3
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 abstract description 2
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract 1
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 abstract 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 27
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 24
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 16
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 16
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 16
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 15
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 13
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 13
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 13
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 13
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 13
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 13
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 12
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 12
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 12
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 12
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 11
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 11
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 11
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 11
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 11
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 11
- 238000012552 review Methods 0.000 description 11
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 10
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 10
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 10
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 9
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 9
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 9
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 8
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 8
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 8
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 7
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 7
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 description 7
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 7
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 6
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 6
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 6
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 description 6
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 description 6
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 6
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 6
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000008731 Nuclear RNA export factor Human genes 0.000 description 6
- 108050000506 Nuclear RNA export factor Proteins 0.000 description 6
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 6
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 6
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 description 6
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 6
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 description 6
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 5
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 5
- 108010068250 Herpes Simplex Virus Protein Vmw65 Proteins 0.000 description 5
- 102000014429 Insulin-like growth factor Human genes 0.000 description 5
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 5
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 5
- 102100039364 Metalloproteinase inhibitor 1 Human genes 0.000 description 5
- 244000309464 bull Species 0.000 description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 5
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 5
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 4
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 4
- 101710172562 Cobra venom factor Proteins 0.000 description 4
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 4
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 4
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 4
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 4
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 4
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 4
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 4
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 4
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 4
- 229940119178 Interleukin 1 receptor antagonist Drugs 0.000 description 4
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 4
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 4
- 102000036243 Lymphocyte Specific Protein Tyrosine Kinase p56(lck) Human genes 0.000 description 4
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 4
- 102000006467 TATA-Box Binding Protein Human genes 0.000 description 4
- 108010044281 TATA-Box Binding Protein Proteins 0.000 description 4
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 4
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 4
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 4
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 4
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 4
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 4
- 102000016549 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Human genes 0.000 description 4
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 4
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 4
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 4
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 4
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 4
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 4
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 4
- 102100022749 Aminopeptidase N Human genes 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 3
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 3
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 3
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 3
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 3
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 3
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 description 3
- 101000757160 Homo sapiens Aminopeptidase N Proteins 0.000 description 3
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 3
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 description 3
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 3
- 101001076407 Homo sapiens Interleukin-1 receptor antagonist protein Proteins 0.000 description 3
- 101000934372 Homo sapiens Macrosialin Proteins 0.000 description 3
- 101000669513 Homo sapiens Metalloproteinase inhibitor 1 Proteins 0.000 description 3
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 3
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 description 3
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 3
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 3
- 102000051628 Interleukin-1 receptor antagonist Human genes 0.000 description 3
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 3
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 3
- 108010038486 Interleukin-4 Receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000010781 Interleukin-6 Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010038501 Interleukin-6 Receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 3
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 3
- 108010093008 Kinins Proteins 0.000 description 3
- 102000002397 Kinins Human genes 0.000 description 3
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 description 3
- 108010002481 Lymphocyte Specific Protein Tyrosine Kinase p56(lck) Proteins 0.000 description 3
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 3
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100025136 Macrosialin Human genes 0.000 description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- 108010022233 Plasminogen Activator Inhibitor 1 Proteins 0.000 description 3
- 102100039418 Plasminogen activator inhibitor 1 Human genes 0.000 description 3
- 102100039120 Retinoblastoma-like protein 1 Human genes 0.000 description 3
- 108050002592 Retinoblastoma-like protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 102100022828 Retinoblastoma-like protein 2 Human genes 0.000 description 3
- 108050002651 Retinoblastoma-like protein 2 Proteins 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 3
- 102100039127 Tyrosine-protein kinase receptor TYRO3 Human genes 0.000 description 3
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 3
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 3
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 3
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 3
- 210000000648 angioblast Anatomy 0.000 description 3
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 3
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 3
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 3
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 3
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003145 cytotoxic factor Substances 0.000 description 3
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000003407 interleukin 1 receptor blocking agent Substances 0.000 description 3
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 3
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 description 3
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 3
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000003966 vascular damage Effects 0.000 description 3
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 3
- AFWRJOYNLMVZQO-GMFATLNBSA-N (1r,2r,4as,8as)-1-[(1e,3e)-5-hydroxy-3-methylpenta-1,3-dienyl]-2,5,5,8a-tetramethyl-3,4,4a,6,7,8-hexahydro-1h-naphthalen-2-ol Chemical compound CC1(C)CCC[C@]2(C)[C@@H](/C=C/C(=C/CO)/C)[C@](C)(O)CC[C@H]21 AFWRJOYNLMVZQO-GMFATLNBSA-N 0.000 description 2
- LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N (2s,3r)-2-[[(2r)-1-[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N 0.000 description 2
- ZKRFOXLVOKTUTA-KQYNXXCUSA-N 9-(5-phosphoribofuranosyl)-6-mercaptopurine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(NC=NC2=S)=C2N=C1 ZKRFOXLVOKTUTA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 2
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 2
- 108010060273 Cyclin A2 Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 101800004490 Endothelin-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 2
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 2
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 2
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 2
- 241000724675 Hepatitis E virus Species 0.000 description 2
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 description 2
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 description 2
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 2
- 101000933465 Homo sapiens Beta-glucuronidase Proteins 0.000 description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 2
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 2
- 108010008212 Integrin alpha4beta1 Proteins 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 2
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 2
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 2
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 2
- 102000004125 Interleukin-1alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010082786 Interleukin-1alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000010787 Interleukin-4 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102100039897 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 2
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 2
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N Iron oxide Chemical compound [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003100 Magainin Proteins 0.000 description 2
- 102100026262 Metalloproteinase inhibitor 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100026261 Metalloproteinase inhibitor 3 Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010008707 Mucin-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000007298 Mucin-1 Human genes 0.000 description 2
- 102000004230 Neurotrophin 3 Human genes 0.000 description 2
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 2
- 102000003683 Neurotrophin-4 Human genes 0.000 description 2
- 108090000099 Neurotrophin-4 Proteins 0.000 description 2
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 description 2
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 102000004179 Plasminogen Activator Inhibitor 2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000614 Plasminogen Activator Inhibitor 2 Proteins 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 108050002653 Retinoblastoma protein Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 2
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 2
- 108010031374 Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 Proteins 0.000 description 2
- 108010031372 Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-2 Proteins 0.000 description 2
- 108010031429 Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-3 Proteins 0.000 description 2
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 2
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 2
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 2
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 2
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229960004676 antithrombotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000002473 artificial blood Substances 0.000 description 2
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 2
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 229940043378 cyclin-dependent kinase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 2
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 229940100602 interleukin-5 Drugs 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007514 neuronal growth Effects 0.000 description 2
- 229940032018 neurotrophin 3 Drugs 0.000 description 2
- 229940097998 neurotrophin 4 Drugs 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 2
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102100036664 Adenosine deaminase Human genes 0.000 description 1
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 241000212977 Andira Species 0.000 description 1
- 102100034594 Angiopoietin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010048154 Angiopoietin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102400000068 Angiostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 description 1
- 102000008873 Angiotensin II receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050000824 Angiotensin II receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 1
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 1
- 102100038238 Aromatic-L-amino-acid decarboxylase Human genes 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 description 1
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100032367 C-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100034871 C-C motif chemokine 8 Human genes 0.000 description 1
- 101710155833 C-C motif chemokine 8 Proteins 0.000 description 1
- 102000019063 CCAAT-Binding Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010026988 CCAAT-Binding Factor Proteins 0.000 description 1
- 108700012434 CCL3 Proteins 0.000 description 1
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091007914 CDKs Proteins 0.000 description 1
- 101100381481 Caenorhabditis elegans baz-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940123587 Cell cycle inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000000013 Chemokine CCL3 Human genes 0.000 description 1
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 102000003914 Cholinesterases Human genes 0.000 description 1
- 108090000322 Cholinesterases Proteins 0.000 description 1
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000016574 Complement C3-C5 Convertases Human genes 0.000 description 1
- 108010067641 Complement C3-C5 Convertases Proteins 0.000 description 1
- 108090000056 Complement factor B Proteins 0.000 description 1
- 102000003712 Complement factor B Human genes 0.000 description 1
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 description 1
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 1
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 1
- 108010068150 Cyclin B Proteins 0.000 description 1
- 102000002427 Cyclin B Human genes 0.000 description 1
- 102000006311 Cyclin D1 Human genes 0.000 description 1
- 108010058546 Cyclin D1 Proteins 0.000 description 1
- 102100025191 Cyclin-A2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000266 Cyclin-dependent kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000003903 Cyclin-dependent kinases Human genes 0.000 description 1
- 241000252233 Cyprinus carpio Species 0.000 description 1
- 208000026292 Cystic Kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000000311 Cytosine Deaminase Human genes 0.000 description 1
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 101710200158 DNA packaging protein Proteins 0.000 description 1
- 101100481404 Danio rerio tie1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100481408 Danio rerio tie2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000012085 Endoglin Human genes 0.000 description 1
- 108010036395 Endoglin Proteins 0.000 description 1
- 102000013128 Endothelin B Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010090557 Endothelin B Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000010180 Endothelin receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050001739 Endothelin receptor Proteins 0.000 description 1
- 102400000686 Endothelin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100023688 Eotaxin Human genes 0.000 description 1
- 101710139422 Eotaxin Proteins 0.000 description 1
- 108091008794 FGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000713800 Feline immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000044168 Fibroblast Growth Factor Receptor Human genes 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 102000054184 GADD45 Human genes 0.000 description 1
- 102000011852 GATA2 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010075641 GATA2 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 102000006587 Glutathione peroxidase Human genes 0.000 description 1
- 108700016172 Glutathione peroxidases Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 1
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 108010014594 Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein A1 Proteins 0.000 description 1
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 1
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 1
- 101000897480 Homo sapiens C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000715499 Homo sapiens Catalase Proteins 0.000 description 1
- 101000715942 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001066158 Homo sapiens Growth arrest and DNA damage-inducible protein GADD45 alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001054867 Homo sapiens Protein-lysine 6-oxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000934346 Homo sapiens T-cell surface antigen CD2 Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 101000799461 Homo sapiens Thrombopoietin Proteins 0.000 description 1
- 101000694103 Homo sapiens Thyroid peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000711920 Human orthopneumovirus Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 101000668058 Infectious salmon anemia virus (isolate Atlantic salmon/Norway/810/9/99) RNA-directed RNA polymerase catalytic subunit Proteins 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- 108010064600 Intercellular Adhesion Molecule-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100037871 Intercellular adhesion molecule 3 Human genes 0.000 description 1
- 102000003815 Interleukin-11 Human genes 0.000 description 1
- 108090000177 Interleukin-11 Proteins 0.000 description 1
- 102100039078 Interleukin-4 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100021592 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 102100026871 Interleukin-9 Human genes 0.000 description 1
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 description 1
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 1
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 108010092694 L-Selectin Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000016551 L-selectin Human genes 0.000 description 1
- 241000589248 Legionella Species 0.000 description 1
- 208000007764 Legionnaires' Disease Diseases 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000019218 Mannose-6-phosphate receptors Human genes 0.000 description 1
- 108050006616 Mannose-6-phosphate receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101100172512 Mus musculus Epha2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100481410 Mus musculus Tek gene Proteins 0.000 description 1
- 101100481406 Mus musculus Tie1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004459 Nitroreductase Human genes 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108091008606 PDGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102100024078 Plasma serine protease inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 102000004211 Platelet factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000778 Platelet factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000011653 Platelet-Derived Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 102000017033 Porins Human genes 0.000 description 1
- 108010013381 Porins Proteins 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 1
- 108010001953 Protein C Inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 101710142250 Protein p56 Proteins 0.000 description 1
- 102000009092 Proto-Oncogene Proteins c-myc Human genes 0.000 description 1
- 108010087705 Proto-Oncogene Proteins c-myc Proteins 0.000 description 1
- 108091008109 Pseudogenes Proteins 0.000 description 1
- 102000057361 Pseudogenes Human genes 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 1
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 101100372762 Rattus norvegicus Flt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 description 1
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 102000011971 Sphingomyelin Phosphodiesterase Human genes 0.000 description 1
- 108010061312 Sphingomyelin Phosphodiesterase Proteins 0.000 description 1
- 102100021669 Stromal cell-derived factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710088580 Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000027585 T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 description 1
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 101150052863 THY1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007591 Tartrate-Resistant Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010032050 Tartrate-Resistant Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010046722 Thrombospondin 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100036034 Thrombospondin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108090001097 Transcription Factor DP1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 1
- 206010054094 Tumour necrosis Diseases 0.000 description 1
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108010035075 Tyrosine decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 102000008790 VE-cadherin Human genes 0.000 description 1
- 206010046996 Varicose vein Diseases 0.000 description 1
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000010094 Visna Diseases 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 1
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001746 atrial effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 102000055574 bcl-2 Homologous Antagonist-Killer Human genes 0.000 description 1
- 108700039689 bcl-2 Homologous Antagonist-Killer Proteins 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 244000285940 beete Species 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 108010018828 cadherin 5 Proteins 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 235000011222 chang cao shi Nutrition 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- 229940048961 cholinesterase Drugs 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000021953 cytokinesis Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002327 eosinophilic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 1
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 102000045501 human CAT Human genes 0.000 description 1
- 102000048992 human CDK4 Human genes 0.000 description 1
- 102000051318 human LOX Human genes 0.000 description 1
- 102000053400 human TPO Human genes 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000000954 inflammatory inducer Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005732 intercellular adhesion Effects 0.000 description 1
- 229940074383 interleukin-11 Drugs 0.000 description 1
- 229940100994 interleukin-7 Drugs 0.000 description 1
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 description 1
- 229940118526 interleukin-9 Drugs 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 1
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N mcp 2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 1
- 108020001162 nitroreductase Proteins 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 108700004030 rev Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150098213 rev gene Proteins 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 108010078070 scavenger receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000014452 scavenger receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005630 sialyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 101150023847 tbp gene Proteins 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000002229 urogenital system Anatomy 0.000 description 1
- 208000027185 varicose disease Diseases 0.000 description 1
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000216 vascular lesion Toxicity 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Virology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
Abstract
Изобретение относится к генной терапии и касается способа получения генетически измененных клеток. Сущность изобретения заключается в выделении клеток из крови или жидкостей организма, культивировании полученных клеток в среде для культивирования клеток, содержащей ганглиозиды, фосфолипиды, гликолипиды и/или факторы роста эндотелиальных клеток, на выбор иммортализацию полученных клеток путем трансформации онкогеном, выбранным из группы, состоящей из мутированного cdk-4, cdk-6 и cdk-2, активации протоонкогена или инактивации супрессорного гена, трансфекции полученных клеток с помощью конструкции нуклеиновой кислоты для генной терапии, содержащей эффектор-ген, который можно активировать с помощью пригодных промоторных систем специфически к клетке, специфически к клеточному циклу, специфически к вирусу и/или путем гипоксии. Преимущество заключается в создании эндотелиальных клеток в качестве клеточных носителей трансгенов в генной терапии. 17 з.п.ф-лы, 1 ил. , 2 табл.
Description
Изобретение относится к клеткам для применения в генной терапии, получаемым путем
а) выделения мононуклеарных клеток из крови или содержащих клетки жидкостей организма;
б) культивирования полученных на стадии а) клеток в среде для культивирования клеток, содержащей ганглиозиды, фосфолипиды, гликолипиды и/или факторы роста эндотелиальных клеток, включая такие факторы, которые влияют на дифференциацию, выживание, миграцию и/или васкуляризацию;
в) на выбор иммортализации полученных на стадии а) или б) клеток путем трансформации с помощью онкогена, активации онкогена или инактивации супрессорного гена и
г) на выбор трансфекции полученных на стадиях а) и б) или на стадии в) клеток с помощью конструкции нуклеиновой кислоты для генной терапии, содержащей эффектор-ген, который можно активировать с помощью пригодных промоторных систем специфически к клетке, специфически к клеточному циклу, специфически к вирусу и/или путем гипоксии.
а) выделения мононуклеарных клеток из крови или содержащих клетки жидкостей организма;
б) культивирования полученных на стадии а) клеток в среде для культивирования клеток, содержащей ганглиозиды, фосфолипиды, гликолипиды и/или факторы роста эндотелиальных клеток, включая такие факторы, которые влияют на дифференциацию, выживание, миграцию и/или васкуляризацию;
в) на выбор иммортализации полученных на стадии а) или б) клеток путем трансформации с помощью онкогена, активации онкогена или инактивации супрессорного гена и
г) на выбор трансфекции полученных на стадиях а) и б) или на стадии в) клеток с помощью конструкции нуклеиновой кислоты для генной терапии, содержащей эффектор-ген, который можно активировать с помощью пригодных промоторных систем специфически к клетке, специфически к клеточному циклу, специфически к вирусу и/или путем гипоксии.
Введение трансфецированных ин витро соматических клеток, трансдуцированных для экспрессии биологически активного вещества, представляет собой в настоящее время широко используемый в клинической практике, а также для клинического исследования метод генной терапии. При этом используют различные клетки, включая фибробласты, лимфоциты, кератиноциты и опухолевые клетки.
Эндотелиальные клетки для этой цели впервые использовали в 1989 г. Для этого эндотелиальные клетки трансфецировали ин витро с помощью ретровирусного вектора (Zwiebel и др., Science, 243, 220 (1989)) для экспрессии биологически активного вещества.
Такого рода трансдуцированные эндотелиальные клетки, приросшие ин витро к искусственным кровеносным сосудам из синтетического материала, после трансплантации ин виво этих искусственных кровеносных сосудов способны экспрессировать трансген (Zwiebel и др., Science, 243, 220 (1989); Wilson и др., Science, 244, 1344 (1989)). Вследствие этого Zwiebel и Wilson предложили для целей генной терапии вводить пациентам трансдуцированные эндотелиальные клетки, сросшиеся с синтетическим материалом или коллагеновым носителем. Это предложение экспериментально осуществили Nathan и др. (PNAS USA, 92, 8130 (1995)).
В продолжение этого предложения Nabel и др. (Science, 244, 1342 (1989)) впервые изложили возможность введения суспензии трансдуцированных эндотелиальных клеток в кровоток в качестве генной терапии. Авторами показано, что эндотелиальные клетки, которые получены из сосудов живого млекопитающего путем соскабливания и трансдуцированы ин витро для экспрессии репортер-гена, после локального введения, например в кровеносные сосуды, срастаются там с местами повреждения эндотелиальных клеток и экспрессируют репортер-ген. На основании этих результатов авторами описана возможность введения генетически модифицированных эндотелиальных клеток в целях генной терапии, причем биологически активные вещества этими эндотелиальными клетками непосредственно выделяются в систему кровообращения в целях лечения системных или наследственных заболеваний. Эта идея далее была развита Bernstein и др. (FASEB. J. , 4, 2665 (1990)). Эндотелиальные клетки легких трансфецируют ин витро с помощью плазмид для экспрессии биологически активного вещества и затем вводят путем инъекции "голым" мышам внутрибрюшинно, внутривенно, подкожно или в капсулу почки. У таким образом обработанных животных локально (в кистах почек) или в крови (после введения внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно) обнаруживают продуцируемое трансплантатами эндотелиальных клеток биологически активное вещество, что доказывает пригодность введения ин виво трансдуцированных ин витро эндотелиальных клеток в целях генной терапии.
Далее, Zwiebel и др., 1992 (международная заявка с номером публикации 93/13807), и Ojeif о и др., (Cancer Res., 55, 2240 (1995)) на различных примерах показали возможность использования метода введения трансдуцированных ин витро эндотелиальных клеток в систему кровообращения для целей генной терапии.
Zwiebel и др. (1992) трансдуцировали ин витро человеческие эндотелиальные клетки пуповины и эндотелиальные клетки из жировой ткани крыс с помощью ретровирусного вектора для экспрессии биологически активного вещества и инъецировали эти эндотелиальные клетки внутривенно животным, у которых сначала за счет инъекции облученных, выделяющих FGF клеток были вызваны локальное повреждение сосудов и ангиогенез. Они показали, что инъецированные эндотелиальные клетки локализуются в месте поражения сосуда и ангиогенеза и там экспрессируют биологически активное вещество. На этом основании авторы в своей заявке на патент описывают применение трансдуцированных ин витро эндотелиальных клеток для экспрессии аденозиндезаминазы, факторов свертывания крови, гематопоэтических факторов роста, цитокинов, антитромботических средств, ингибиторов ферментов и гормонов.
Параллельно этим работам другими авторами усовершенствована технология выделения эндотелиальных клеток и также подробнее исследовано миграционное поведение трансдуцированных ин витро эндотелиальных клеток.
Так, Messina и др. (PNAS USA, 89, 12018 (1992)) показали, что трансфецированные ин витро эндотелиальные клетки после инъекции в систему кровообращения прикрепляются к интактному слою эндотелиальных клеток, а также могут интегрировать в него. Следовательно, с помощью этих результатов можно исключить исключительную локализацию интраваскулярно введенных эндотелиальных клеток в зонах с повреждениями сосудов и ангиогенеза. С другой стороны, показано, что инъецированные в смеси с опухолевыми клетками, трансфецированные ин витро эндотелиальные клетки участвуют в ангиогенезе ложа опухолевых сосудов (Lal и др., PNAS USA, 9, 9695 (1994); Nam и др., Brain Res., 731, 161 (1996)). Этим обусловлено то, что опухолевые клетки, трансплантированные в смеси с эндотелиальными клетками, показывают ин виво отчетливое преимущество роста (Stopeck и др., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 38, 265 (1997)).
С другой стороны, трансдуцированные эндотелиальные клетки, введенные локально, например в головной мозг или в опухоль мозга, за счет экспрессии кодируемого трансгеном биологически активного вещества могут быть фармакологически активны, соответственно, противоопухолево эффективны (Nam и др., Brain Res. , 731, 161 (1996); Quinonero и др., Gene Ther., 4, 111 (1997)). Например, Robertson и др. (Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 38, 382 (1997)) использовали человеческие эндотелиальные клетки (HUVEC), трансдуцированные ин витро с помощью AV-вектора, для экспрессии тимидинкиназы герпесвируса, в смеси с человеческими клетками рака яичника. После введения ганцикловира, который активируется в опухоли благодаря тимидинкиназе герпесвируса в цитостатическое средство, авторы наблюдали отчетливую регрессию опухоли у "голых" мышей.
Применение эндотелиальных клеток в качестве клеточных носителей трансгенов в генной терапии до сих пор, однако, в значительной мере ограничено двумя существенными областями проблем.
- Получение пригодных эндотелиальных клеток в достаточном количестве до сих пор оказывается крайне затруднительным. Аллогенные эндотелиальные клетки, правда, можно получать относительно просто из пуповины или из клеточных культур, однако, за счет их иммуногенности в реципиенте они применимы только ограниченно; во-вторых, их размножение в клеточной культуре возможно только в ограниченной мере. Аутоэндотелиальные клетки, правда, можно получать, например, механически путем "выскабливания" варикозно расширенных вен или из жировых тканей. Этот вид получения, однако, возможен не в случае всех пациентов и к тому же наносит значительный вред пациенту. Поэтому альтернативно можно получать ангиобласты или клетки-предшественники эндотелиальных клеток из периферической крови (Asahara и др., Science, 275, 964 (1997)). Необходимое для этой цели взятие крови, правда, для пациента немного обременительно, однако, выделение предполагаемых ангиобластов из мононуклеарных клеток крови и дифференциация этих ангиобластов в эндотелиальных клетках является очень дорогостоящей операцией. Так, мононуклеарные, из лейкоцитов крови (выделяют путем центрифугирования с градиентом плотности), CD34+ или Flk-1+ мононуклеарные клетки крови, которые имеются в крови только в незначительной концентрации (≤0,1%), обогащают путем иммуноадсорбции на связанных с носителем моноклональных антителах (специфических к CD34 или Flk-1). Затем эти клетки в чашках для культуры тканей, покрытых коллагеном типа 1 или фибронектином, инкубируют в течение примерно четырех недель в культуральной среде, содержащей головной мозг крупного рогатого скота, для дифференции в эндотелиальных клетках, а также для размножения. Размножение этих клеток, однако, возможно только очень ограниченно. Далее, инкубация эндотелиальных клеток с веществом головного мозга, например с головным мозгом крупного рогатого скота, вызывает значительные проблемы безопасности.
- Миграция эндотелиальных клеток и селективная экспрессия трансгена в желательной целевой области контролируются в недостаточной степени. После интраваскулярного введения эндотелиальных клеток они (как уже было описано выше) локализуются как в областях ангиогенеза, так и в покоящемся слое эндотелиальных клеток. Далее, неясно, дифференцируются ли обратно ин виво после инъекции снова в клетках-предшественниках эндотелиальные клетки, которые образовались в клеточной культуре из клеток-предшественников, и могут ли они распределяться по всему организму.
С помощью настоящего изобретения теперь решаются обе важные проблемы.
А) Изобретение заключается в
1) улучшенном, то есть простом и надежном способе выделения и культивирования мононуклеарных клеток, в особенности эндотелиальных клеток-предшественников, из крови и других, содержащих клетки жидкостей организма и применении этих клеток для профилактики или лечения заболевания;
2) выборе в специфической к клетке, в особенности специфической к эндотелиальной клетке, в случае необходимости, фармакологически контролируемой трансформации этих клеток, так что с помощью клеточной культуры можно легко получать гораздо большие количества таких клеток;
3) получении клеток, в особенности эндотелиальных клеток, в качестве векторов для эффектор-генов таким образом, что в эти клетки, полученные по пп. 1) или 1) и 2), встроен по крайней мере один эффектор-ген, который за счет выбора пригодных промоторных систем экспрессируется специфически к клетке, в особенности специфически к эндотелиальной клетке, и, в случае необходимости, путем гипоксии специфически к клеточному циклу и/или специфически к вирусу;
4) введении этих, таким образом полученных, генетически измененных клеток, в особенности эндотелиальных клеток, для профилактики или лечения заболевания.
1) улучшенном, то есть простом и надежном способе выделения и культивирования мононуклеарных клеток, в особенности эндотелиальных клеток-предшественников, из крови и других, содержащих клетки жидкостей организма и применении этих клеток для профилактики или лечения заболевания;
2) выборе в специфической к клетке, в особенности специфической к эндотелиальной клетке, в случае необходимости, фармакологически контролируемой трансформации этих клеток, так что с помощью клеточной культуры можно легко получать гораздо большие количества таких клеток;
3) получении клеток, в особенности эндотелиальных клеток, в качестве векторов для эффектор-генов таким образом, что в эти клетки, полученные по пп. 1) или 1) и 2), встроен по крайней мере один эффектор-ген, который за счет выбора пригодных промоторных систем экспрессируется специфически к клетке, в особенности специфически к эндотелиальной клетке, и, в случае необходимости, путем гипоксии специфически к клеточному циклу и/или специфически к вирусу;
4) введении этих, таким образом полученных, генетически измененных клеток, в особенности эндотелиальных клеток, для профилактики или лечения заболевания.
Предметом изобретения поэтому являются клетки для применения в генной терапии, получаемые путем
а) выделения мононуклеарных клеток из крови или содержащих клетки жидкостей организма;
б) культивирования полученных на стадии а) клеток в среде для культивирования клеток, содержащей ганглиозиды, фосфолипиды, гликолипиды и/или факторы роста эндотелиальных клеток, включая такие факторы, которые влияют на дифференциацию, выживание, миграцию и/или васкуляризацию;
в) на выбор иммортализации полученных на стадии а) или б) клеток путем трансформации с помощью онкогена, активации онкогена или инактивации супрессорного гена и
г) на выбор трансфекции полученных на стадиях а) и б) или на стадии в) клеток с помощью конструкции нуклеиновой кислоты для генной терапии, содержащей эффектор-ген, который можно активировать с помощью пригодных промоторных систем специфически к клетке, специфически к клеточному циклу, специфически к вирусу и/или путем гипоксии.
а) выделения мононуклеарных клеток из крови или содержащих клетки жидкостей организма;
б) культивирования полученных на стадии а) клеток в среде для культивирования клеток, содержащей ганглиозиды, фосфолипиды, гликолипиды и/или факторы роста эндотелиальных клеток, включая такие факторы, которые влияют на дифференциацию, выживание, миграцию и/или васкуляризацию;
в) на выбор иммортализации полученных на стадии а) или б) клеток путем трансформации с помощью онкогена, активации онкогена или инактивации супрессорного гена и
г) на выбор трансфекции полученных на стадиях а) и б) или на стадии в) клеток с помощью конструкции нуклеиновой кислоты для генной терапии, содержащей эффектор-ген, который можно активировать с помощью пригодных промоторных систем специфически к клетке, специфически к клеточному циклу, специфически к вирусу и/или путем гипоксии.
Ниже описываются остальные объекты изобретения, варианты осуществления изобретения, а также соответствующие примеры.
Получение эндотелиальных клеток
1) Выделение и культивирование клеток-предшественников эндотелиальных клеток
Предлагаемый согласно изобретению способ выделения клеток-предшественников эндотелиальных клеток можно разделить на следующие стадии.
1) Выделение и культивирование клеток-предшественников эндотелиальных клеток
Предлагаемый согласно изобретению способ выделения клеток-предшественников эндотелиальных клеток можно разделить на следующие стадии.
Жидкости организма, содержащие клетки, с помощью известных специалисту инвазивных способов отбирают из соответствующих органов. К этим жидкостям организма, содержащим клетки, относятся, например, кровь, получаемая из вен, капилляров, артерий или пуповины, соответственно, плаценты; суспензии клеток костного мозга; суспензии клеток селезенки; суспензии клеток лимфатических узлов; суспензии перитонеальных клеток; суспензии плевральных клеток; лимфа; жидкость соединительной ткани (выступающая, например, на поверхности механически поврежденного эпидермиса).
Эритроциты, гранулоциты и другие компоненты клеток выделяют из этих жидкостей организма путем центрифугирования с градиентом плотности, а тромбоциты - путем дифференциального центрифугирования соответственно известным специалисту способам.
Таким образом выделенные мононуклеарные (содержащие ядро) клетки суспендируют в содержащей сыворотку среде для культивирования клеток. Используемая среда для культивирования клеток содержит указанные ниже ганглиозиды, фосфолипиды и/или факторы роста.
В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения выделенные мононуклеарные (содержащие ядро) клетки культивируют в этой среде для культивирования клеток и дифференцируют до клеток, подобных эндотелиальным.
Согласно следующему предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения выделенные мононуклеарные (содержащие ядро) клетки инкубируют с антителом против типичных моноцитных/макрофаговых поверхностных маркеров (CD11, CD11b, CD13, CD14, CD34, CD64, CD68), которое связано с покрытой полисахаридом частицей железа, соответственно, оксида железа, промывают и затем таким образом нагруженные клетки получают с помощью магнита. Клетки вносят в среду для культивирования клеток, которая содержит указанные ниже ганглиозиды, фосфолипиды и/или факторы роста, и далее ин витро размножают и дифференцируют в эндотелиальные клетки. Иммортализацию и/или трансфекцию осуществляют после размножения и/или дифференциации клеток ин витро.
Согласно следующему варианту осуществления настоящего изобретения выделенные, содержащие ядро клетки предварительно инкубируют в указанной среде для культивирования клеток в течение более 1 часа для дальнейшей дифференциации и размножения. При этих условиях клетки, распознаваемые как эндотелиальные клетки-предшественники, в возрастающей мере экспрессируют типичные моноцитные/макрофаговые поверхностные маркеры (CD11, CD11b, CD13, CD14, CD34, CD64, CD68). Эти клетки затем выделяют, например, вместе с антителом, которое направлено против этих моноцитных маркеров (например, CD11, CD14) и которое связано с покрытой декстраном частицей железа, получают с помощью магнита. Клетки размножают далее и дифференцируют в эндотелиальные клетки.
Альтернативно этому из неприлипающих мононуклеарных клеток, как, например, описывается Asahara и др., Sciense, 275, 964 (1997), выделяют CD34-положительные клетки (гематопоэтические стволовые [исходные] клетки) и ин витро размножают далее и дифференцируют в эндотелиальные клетки.
В особом варианте осуществления изобретения выделенные, содержащие ядро клетки суспендируют в среде для культивирования клеток и остающиеся фагоцитирующие клетки (например, моноциты, макрофаги, гранулоциты) удаляют за счет сцепления с поверхностью, соответственно, путем фагоцитоза "нагруженных" протеином, покрытых декстраном частиц железа с помощью магнита и/или путем противоточного центрифугирования, соответственно известным специалисту способам, и содержащие остающиеся CD34-пoлoжитeльныe клетки мононуклеарные клетки культивируют в предлагаемой согласно изобретению среде для культивирования клеток и дифференцируют в подобные эндотелиальным клетки.
Чашки для культивирования клеток могут быть покрыты внеклеточным матричным компонентом (см. Связывающие и матричные факторы, например, фирмы Сигма), как, например, фибронектин. К среде для культивирования клеток добавляют или ганглиозиды, фосфолипиды и/или гликолипиды, и/или предпочтительно согласно настоящему изобретению добавляют факторы роста для эндотелиальных клеток, как, например:
- васкулярный эндотелиальный фактор роста (VEGF) и/или другие KDR или FLt-лиганды, как
- фибробластовый фактор роста (FGFα, FGFβ), и/или
- эпидермальный фактор роста (EGF), и/или
- инсулиноподобный фактор роста (IGF-1, IGF-2), и/или
- β-эндотелиальный клеточный фактор роста (ECGF), и/или
- эндотелиальный клеточный фактор связывания (ECAF), и/или
- интерлейкин-3 (IL-3), и/или
- GM-CSF, и/или
- G-CSF, и/или
- интерлейкин-4 (IL-4), и/или
- интерлейкин-1 (IL-1), и/или
- колониестимулируюший фактор (CSF-1), и/или
- интерлейкин-8 (IL-8), и/или
- фактор роста, полученный из тромбоцитов, (PDGF), и/или
- γ-интерферон, и/или
- онкостатин М, и/или
- фактор, подавляющий колониеобразование лейкоцитов (LIF), и/или
- В61, и/или
- тромбоцитарный эндотелиальный клеточный фактор роста (PDEGF), и/или
- фактор стволовых клеток (SCF), и/или
- трансформирующий β-фактор роста TGF-β, и/или
- ангиогенин, и/или
- плейотрофин, и/или
- Fit-3-лиганд (FL), и/или
- Fie-2-лиганды, как, например, ангиопоэтин-1, и/или
- стромальный фактор-1 (SDF-1), и/или
- мидкины.
- васкулярный эндотелиальный фактор роста (VEGF) и/или другие KDR или FLt-лиганды, как
- фибробластовый фактор роста (FGFα, FGFβ), и/или
- эпидермальный фактор роста (EGF), и/или
- инсулиноподобный фактор роста (IGF-1, IGF-2), и/или
- β-эндотелиальный клеточный фактор роста (ECGF), и/или
- эндотелиальный клеточный фактор связывания (ECAF), и/или
- интерлейкин-3 (IL-3), и/или
- GM-CSF, и/или
- G-CSF, и/или
- интерлейкин-4 (IL-4), и/или
- интерлейкин-1 (IL-1), и/или
- колониестимулируюший фактор (CSF-1), и/или
- интерлейкин-8 (IL-8), и/или
- фактор роста, полученный из тромбоцитов, (PDGF), и/или
- γ-интерферон, и/или
- онкостатин М, и/или
- фактор, подавляющий колониеобразование лейкоцитов (LIF), и/или
- В61, и/или
- тромбоцитарный эндотелиальный клеточный фактор роста (PDEGF), и/или
- фактор стволовых клеток (SCF), и/или
- трансформирующий β-фактор роста TGF-β, и/или
- ангиогенин, и/или
- плейотрофин, и/или
- Fit-3-лиганд (FL), и/или
- Fie-2-лиганды, как, например, ангиопоэтин-1, и/или
- стромальный фактор-1 (SDF-1), и/или
- мидкины.
Развившиеся в течение времени между 6 часами и 8 неделями клетки обрабатывают дальше согласно изобретению.
Таким образом выделенные эндотелиальные клетки можно также непосредственно использовать для стимуляции эндотелизации поврежденных сосудов и для стимуляции ангиогенеза.
2) Выделение эндотелиальных клеток
Альтернативно предлагаемому согласно изобретению способу, представленному в разделе 1), эндотелиальные клетки также можно получать с помощью известных специалисту способов, например, из жировой ткани, путем выскабливания вен или путем отделения от эндотелия пуповины. Их культивирование осуществляют, как уже описано в разделе 1).
Альтернативно предлагаемому согласно изобретению способу, представленному в разделе 1), эндотелиальные клетки также можно получать с помощью известных специалисту способов, например, из жировой ткани, путем выскабливания вен или путем отделения от эндотелия пуповины. Их культивирование осуществляют, как уже описано в разделе 1).
3) Иммортализация эндотелиальных клеток
Согласно настоящему изобретению в одну или несколько предлагаемых согласно изобретению неприлипших мононуклеарных клеток или эндотелиальных клеток вводят нуклеотидную последовательность протеина (компонент а), который способствует тому, что эти клетки непрерывно проходят цикл цитокинеза и таким образом становятся нестареющей, "перманентно" делящейся клеточной линией. Такие иммортализирующие нуклеотидные последовательности, соответственно, гены, уже известны. К этим нуклеотидным последовательностям относятся, например, онкогены. Согласно настоящему изобретению онкогены могут быть клеточного или вирусного происхождения. Примеры клеточных онкогенов уже представлены в виде обзора Wynford-Thomas, J. Pathol., 165, 187, (1991); Harrington и др., Curr. Opin. Genet. Developm., 4, 120 (1994); Gonos и др., Anticancer Res., 13, 1117 (1993), и Baserga и др., Cancer Surveys, 16, 201 (1993).
Согласно настоящему изобретению в одну или несколько предлагаемых согласно изобретению неприлипших мононуклеарных клеток или эндотелиальных клеток вводят нуклеотидную последовательность протеина (компонент а), который способствует тому, что эти клетки непрерывно проходят цикл цитокинеза и таким образом становятся нестареющей, "перманентно" делящейся клеточной линией. Такие иммортализирующие нуклеотидные последовательности, соответственно, гены, уже известны. К этим нуклеотидным последовательностям относятся, например, онкогены. Согласно настоящему изобретению онкогены могут быть клеточного или вирусного происхождения. Примеры клеточных онкогенов уже представлены в виде обзора Wynford-Thomas, J. Pathol., 165, 187, (1991); Harrington и др., Curr. Opin. Genet. Developm., 4, 120 (1994); Gonos и др., Anticancer Res., 13, 1117 (1993), и Baserga и др., Cancer Surveys, 16, 201 (1993).
Такого рода онкогены можно вводить в клетку известными специалисту способами. Однако клетки в своем геноме содержат также протоонкогены, которые, согласно настоящему изобретению, можно активировать с помощью известных специалисту способов, то есть превращать в онкогены.
В особом варианте осуществления настоящего изобретения компонент а) представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую протеин, который инактивирует протеин супрессорного гена.
Примеры супрессорных генов уже представлены в виде обзора Каrр и Broder, Nature Med. , 4, 309 (1995); Skuse и Ludlow, The Lancet, 345, 902 (1995); Duan и др. , Science, 269, 1402 (1995); Huh и др., Cancer Res., 55, 2225 (1995); Knudson, PNAS USA, 90, 10914 (1993).
Примеры гена (компонент а)), кодирующего протеин, который инактивирует продукт экспрессии супрессорного гена, приведены в табл.1.
В следующем предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения компонент а) представляет собой мутированную нуклеотидную последовательность протеина регуляции клеточного цикла, который вследствие мутации изменен так, что он может еще полностью активировать клеточный цикл, однако, в этой функции более не является ингибируемым клеточными ингибиторами. Согласно настоящему изобретению сюда относятся мутированные нуклеотидные последовательности, кодирующие циклинзависимые киназы, которые, несмотря на мутацию, сохраняют свою киназную активность, однако теряют способность связываться с клеточными cdk-ингибиторами.
Примерами компонента а) являются следующие:
- cdk-4, мутированный таким образом, что р16, р15 и/или р21 более не могут ингибировать;
-cdk-6, мутированный таким образом, что р15 и/или р18 не могут более ингибировать;
cdk-2, мутированный таким образом, что р21 и/или р27 и/или WAF-1 не могут более ингибировать.
- cdk-4, мутированный таким образом, что р16, р15 и/или р21 более не могут ингибировать;
-cdk-6, мутированный таким образом, что р15 и/или р18 не могут более ингибировать;
cdk-2, мутированный таким образом, что р21 и/или р27 и/или WAF-1 не могут более ингибировать.
Например, мутация cdk-4 может представлять собой обмен аргинина на цистеин в положении 24, так что этот мутированный cdk-4 обладает киназной активностью, однако более не ингибируется за счет р15 и р16 (Wulfel и др., Science, 269, 1281 (1995)).
В следующем варианте осуществления настоящего изобретения компонент а) представляет собой трансформирующий ген, экспрессия которого регулируется самоусиливающим промоторным элементом, в случае необходимости в сочетании с фармакологически контролируемым промотором (см. по этому поводу раздел Иммортализация).
Согласно дальнейшему предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения в эндотелиальные клетки, особенно также в клетки-предшественники эндотелиальных клеток или в клетки смеси клеток, которая содержит долю эндотелиальных клеток или клеток-предшественников эндотелиальных клеток или повышенную, по сравнению с кровью, долю положительных клеток CD34, CD11, CD11b, CD14, CD13, CD64 и CD68, вводят нуклеотидную последовательность, которая состоит из специфической к эндотелиальным клеткам промоторной или энхансерной последовательности (компонент б)) и компонента а), причем транскрипцию компонента а) активируют за счет связывания факторов транскрипции эндотелиальной клетки с компонентом б).
Для лучшего удерживания продукта экспрессии компонента а) в клеточном ядре к компоненту а) можно присоединять нуклеарный сигнал локализации (компонент в)). Достигаемое в результате этого расположение компонентов представлено, например, на чертеже.
За счет введения конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей представленные на чертеже компоненты, только эндотелиальные клетки и предшественники эндотелиальных клеток, которые содержатся в гетерогенной смеси клеток, переводят в иммортализованную стадию, то есть в непрерывно делящиеся клетки, так что спустя несколько дней эти эндотелиальные клетки по количеству преобладают в клеточной культуре и спустя зависимое от условий культивирования, однако, обозримое время находятся исключительно в клеточной культуре.
С помощью этих предлагаемых согласно изобретению конструкций нуклеиновой кислоты и способа, таким образом, за относительно короткое время при небольших затратах и также из небольшого количества эндотелиальных клеток или из небольшого количества клеток-предшественников эндотелиальных клеток, а также в случае, когда они находятся в виде гетерогенной смеси клеток, можно получать большие количества единообразных эндотелиальных клеток для профилактики или лечения.
Получение ген-модифицированных эндотелиальных клеток для профилактики и/или лечения
Согласно изобретению в полученные по любому из предлагаемых в изобретении способов эндотелиальные клетки нужно вводить конструкцию нуклеиновой кислоты, которая по крайней мере содержит следующие компоненты:
- промотор (компонент г));
- структурный, ген, кодирующий биологически активное вещество, или фермент (компонент д)).
Согласно изобретению в полученные по любому из предлагаемых в изобретении способов эндотелиальные клетки нужно вводить конструкцию нуклеиновой кислоты, которая по крайней мере содержит следующие компоненты:
- промотор (компонент г));
- структурный, ген, кодирующий биологически активное вещество, или фермент (компонент д)).
Выбор промоторных последовательностей
Согласно изобретению в качестве промоторных последовательностей нужно использовать нуклеотидные последовательности, которые после связывания факторов транскрипции активируют транскрипцию расположенного вблизи 3'-конца трансгена, как, например, структурного гена. Согласно изобретению в эндотелиальную клетку вводят по крайней мере одну специфическую к эндотелиальной клетке промоторную последовательность (компонент б)) и/или компонент г). Эту специфическую к эндотелиальной клетке промоторную последовательность можно сочетать по крайней мере с одной другой промоторной последовательностью. Выбор сочетаемой со специфическим к эндотелиальной клетке промотором промоторной последовательности (последовательностей) осуществляют в зависимости от излечиваемого заболевания. Так, дополнительная промоторная последовательность может быть неограниченно, специфически к эндотелиальной клетке и при определенных метаболических условиях индуцируема, как, например, путем гипоксии, или индуцируема или "выключаема" с помощью фармакона, активируема специфически к вирусу и/или специфически к клеточному циклу. Такого рода промоторы уже указаны в следующих заявках на патенты: заявки на европейские патенты NoNo 95931204.2; 95930524.4; 95931205.9; 95931933.6; 96110962.2; 97101507.8; 97102547.3; 97110995.8; а также заявки на патент ФРГ NoNo 1970430.1 и 19710643.9. Эти заявки на патент включены в настоящее описание в виде ссылки. К выбираемым промоторным последовательностям, например, относятся следующие.
Согласно изобретению в качестве промоторных последовательностей нужно использовать нуклеотидные последовательности, которые после связывания факторов транскрипции активируют транскрипцию расположенного вблизи 3'-конца трансгена, как, например, структурного гена. Согласно изобретению в эндотелиальную клетку вводят по крайней мере одну специфическую к эндотелиальной клетке промоторную последовательность (компонент б)) и/или компонент г). Эту специфическую к эндотелиальной клетке промоторную последовательность можно сочетать по крайней мере с одной другой промоторной последовательностью. Выбор сочетаемой со специфическим к эндотелиальной клетке промотором промоторной последовательности (последовательностей) осуществляют в зависимости от излечиваемого заболевания. Так, дополнительная промоторная последовательность может быть неограниченно, специфически к эндотелиальной клетке и при определенных метаболических условиях индуцируема, как, например, путем гипоксии, или индуцируема или "выключаема" с помощью фармакона, активируема специфически к вирусу и/или специфически к клеточному циклу. Такого рода промоторы уже указаны в следующих заявках на патенты: заявки на европейские патенты NoNo 95931204.2; 95930524.4; 95931205.9; 95931933.6; 96110962.2; 97101507.8; 97102547.3; 97110995.8; а также заявки на патент ФРГ NoNo 1970430.1 и 19710643.9. Эти заявки на патент включены в настоящее описание в виде ссылки. К выбираемым промоторным последовательностям, например, относятся следующие.
1) Неограниченно активируемые промоторы и активаторные последовательности, как, например, промотор РНК-полимеразы III; промотор РНК-полимеразы II; промотор и энхансер вируса огуречной мозаики (CMV); промотор вируса дикого типа 40 (SV40-промотор).
2) Метаболически активируемые промоторные и энхансерные последовательности, как, например, индуцируемый путем гипоксии энхансер (Semenza и др., PNAS, 88, 5680 (1991); McBurney и др., Nucl. Acids Res., 19, 5755 (1991)).
3) Активируемые специфически к клетке промоторы.
Таковыми являются, например, промотор cdc258-гена, cdc25C-гена, циклин-А-гена, cdс2-гена, B-myb-гена, DHFR-гена, F2F-1-гена или, однако, связывающие последовательности образующихся во время пролиферации клеток или активированных факторов транскрипции. К этим связывающим последовательностям относятся, например, связывающие последовательности с-mус-протеинов. К этим связывающим последовательностям нужно причислить мономеры или мультимеры обозначаемой как Мус Е-Box нуклеотидной последовательности:
5'-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3' (последовательность No 2) (Blackwood и Eisenmann, Science, 251, 1211 (1991)).
5'-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3' (последовательность No 2) (Blackwood и Eisenmann, Science, 251, 1211 (1991)).
4) Самоусиливающие и/или фармакологически контролируемые промоторы.
В простейшем случае при сочетании одинаковых или разных промоторов один промотор может быть индуцируемым, например, в форме активируемого, соответственно, "выключаемого" тетрациклином промотора, в форме тетрациклинового оператора в сочетании с соответствующим репрессором.
Согласно изобретению, однако, промотор может быть также самоусиливающим с или также без фармакологически контролируемой промоторной единицы.
Такого рода самоусиливающие и/или фармакологически контролируемые промоторы уже описаны в заявке на патент ФРГ 19651443.6, которая включена в настоящее описание в виде ссылки.
5) Активируемые специфически к эндотелиальным клеткам промоторы.
К ним относятся промоторы или активаторные последовательности из промоторов или энхансеров таких генов, которые кодируют протеины, предпочтительно образующиеся в эндотелиальных клетках.
Согласно изобретению нужно использовать, например, промоторы генов следующих протеинов:
- специфический к головному мозгу, эндотелиальный глюкоза-1-транспортер;
- эндоглин;
- VEGF-рецептор-1 (flt-1);
- VEGF-рецептор-2 (flk-1, KDR);
- tie-1 или tie-2;
- В61-рецептор (Eck-рецептор);
- B61;
- эндотелии, особенно эндотелин-В или эндотелин-1;
- рецепторы эндотелина, в особенности рецептор эндотелина-В;
- манноза-6-фосфатные рецепторы;
- фактор Виллебранда;
- интерлейкин-1α, интерлейкин-1β;
- рецептор интерлейкина-1;
- фактор васкулярной клеточной адгезии (VCAM-1);
- фактор межклеточной адгезии (ICAM-3);
- синтетические активаторные последовательности.
- специфический к головному мозгу, эндотелиальный глюкоза-1-транспортер;
- эндоглин;
- VEGF-рецептор-1 (flt-1);
- VEGF-рецептор-2 (flk-1, KDR);
- tie-1 или tie-2;
- В61-рецептор (Eck-рецептор);
- B61;
- эндотелии, особенно эндотелин-В или эндотелин-1;
- рецепторы эндотелина, в особенности рецептор эндотелина-В;
- манноза-6-фосфатные рецепторы;
- фактор Виллебранда;
- интерлейкин-1α, интерлейкин-1β;
- рецептор интерлейкина-1;
- фактор васкулярной клеточной адгезии (VCAM-1);
- фактор межклеточной адгезии (ICAM-3);
- синтетические активаторные последовательности.
В качестве альтернативы природным, специфическим к эндотелиальным клеткам промоторам можно использовать также синтетические активаторные последовательности, которые состоят из олигомеризованных мест связывания факторов транскрипции, предпочтительно или селективно активных в эндотелиальных клетках. Примером их является фактор транскрипции GATA-2, местом связывания которого в эндотелин-1-гене является 5'-ТТАТСТ-3' (Lee и др., Biol. Chem. , 16188 (1991); Dormann и др., J. Biol. Chem., 1279 (1992), и Wilson и др., Mol. Cell Biol., 4854 (1990)).
Сочетание одинаковых или разных промоторов
Сочетание одинаковых промоторов осуществляют, например, путем последовательного соединения нескольких промоторов в направлении считывания от 5' к 3' нуклеотидной последовательности.
Сочетание одинаковых промоторов осуществляют, например, путем последовательного соединения нескольких промоторов в направлении считывания от 5' к 3' нуклеотидной последовательности.
Для сочетания одинаковых или разных промоторов, однако, предпочтительно используют технологии, которые уже подробно описаны в следующих заявках на патенты: заявка на патент Великобритании 9417366.3; заявка на европейский патент 97101507.8; заявка на европейский патент 97102547.3; заявки на патенты ФРГ NoNo19710643.9; 19617851.7; 19639103.2 и 19651443.6. Эти заявки на патенты включены в настоящее описание в виде ссылки. Примерами такого рода технологий являются следующие.
1) Химерные промоторы
Химерный промотор представляет собой сочетание расположенной выше, активируемой специфически к клетке, метаболически или специфически к вирусу активаторной последовательности с расположенным ниже промоторным модулем, который содержит нукдеотидную последовательность CDE-CHR или E2FBS-CHR, с которой связываются супрессорные протеины, которые благодаря этому могут ингибировать активацию последовательности, расположенной выше активаторной, в G0- и G1-фазе клеточного цикла (заявка на патент Великобритании 9417366.3; Lucibello и др., EMBO J., 12 (1994)).
Химерный промотор представляет собой сочетание расположенной выше, активируемой специфически к клетке, метаболически или специфически к вирусу активаторной последовательности с расположенным ниже промоторным модулем, который содержит нукдеотидную последовательность CDE-CHR или E2FBS-CHR, с которой связываются супрессорные протеины, которые благодаря этому могут ингибировать активацию последовательности, расположенной выше активаторной, в G0- и G1-фазе клеточного цикла (заявка на патент Великобритании 9417366.3; Lucibello и др., EMBO J., 12 (1994)).
Продолжающиеся исследования действия, в особенности промоторного элемента CDE-CHR, показывают, что зависимая от клеточного цикла благодаря CDE-CHR-элементу регуляция последовательности, расположенной выше активаторной, в значительной степени зависит от того, что активаторная последовательность факторов транскрипции активируется с помощью обогащенных глутамином доменов активации (Zwicker и др., Nucl. Acids Res., 3822 (1995)).
К такого рода факторам транскрипции относятся, например, Sp-1 и NF-Y.
Такой фактор консеквентно ограничивает использование промоторного элемента CDE-CHR для химерных промоторов. То же самое можно предполагать для промоторного элемента E2F-BS-CHB B-myb-гена (Zwicker и др., Nucl. Acids Res., 23, 3822 (1995)).
2) Гибридные промоторы
Гибридные промоторы уже описаны в заявке на патент ФРГ 19639103.2. Для сочетания специфического к эндотелиальной клетке промотора по крайней мере с одним другим промотором выбирают, например, ген-конструкцию, которая в целом содержит следующие компоненты:
нуклеотидную последовательность специфического к эндотелиальным клеткам промотора в форме, в которой мутировано по крайней мере одно место связывания фактора транскрипции. Благодаря этой мутации блокируется инициирование транскрипции эффектор-гена;
трансген, который кодирует в качестве эффектор-гена биологически активное вещество;
по крайней мере одну другую, активируемую неспецифически, специфически к клетке, специфически к вирусу, с помощью тетрациклина и/или специфически к клеточному циклу промоторную или энхансерную последовательность, которая активирует транскрипцию по крайней мере одного гена по крайней мере одного фактора транскрипции, который мутирован таким образом, что он может связываться с мутированным местом связывания (мутированными местами связывания) в специфическом к эндотелиальным клеткам промоторе и активировать его.
Гибридные промоторы уже описаны в заявке на патент ФРГ 19639103.2. Для сочетания специфического к эндотелиальной клетке промотора по крайней мере с одним другим промотором выбирают, например, ген-конструкцию, которая в целом содержит следующие компоненты:
нуклеотидную последовательность специфического к эндотелиальным клеткам промотора в форме, в которой мутировано по крайней мере одно место связывания фактора транскрипции. Благодаря этой мутации блокируется инициирование транскрипции эффектор-гена;
трансген, который кодирует в качестве эффектор-гена биологически активное вещество;
по крайней мере одну другую, активируемую неспецифически, специфически к клетке, специфически к вирусу, с помощью тетрациклина и/или специфически к клеточному циклу промоторную или энхансерную последовательность, которая активирует транскрипцию по крайней мере одного гена по крайней мере одного фактора транскрипции, который мутирован таким образом, что он может связываться с мутированным местом связывания (мутированными местами связывания) в специфическом к эндотелиальным клеткам промоторе и активировать его.
В одном приводимом в качестве примера варианте осуществления настоящего изобретения мутация в промоторной последовательности может представлять собой, например, мутацию ТАТА-Вох cdc258-пpомотоpa.
Мутацией ТАТА может быть, например, TGTATAA. Благодаря этой мутации более нельзя распознавать место связывания ДНК нормального, связывающего ТАТА-Вох протеина (ТВР) и эффекторный ген более нельзя эффективно транскрибировать. Соответственно, кодирующая ТВР нуклеотидная последовательность должна обладать комутацией. Благодаря этой комутации ТВР связывается с мутированным ТАТА-Вох (например, в TGTATAA) и таким образом приводит к эффективной транскрипции эффектор-гена. Такого рода комутации ТВР-гена, например, описаны Strubin и Struhl (Cell, 721 (1992)) и Heard и др., (EMBO J., 3519 (1993)).
3) Множественные промоторы в сочетании с нуклеарным сигналом удерживания и нуклеарным экспорт-фактором
Эта технология уже описана в заявке на патент ФРГ 19617851.7. Эта заявка на патент включена в настоящее описание в виде ссылки.
Эта технология уже описана в заявке на патент ФРГ 19617851.7. Эта заявка на патент включена в настоящее описание в виде ссылки.
Такого рода промотор содержит согласно изобретению следующие компоненты:
- первая, специфическая к эндотелиальным клеткам, активируемая промоторная или энхансерная последовательность, которая активирует базальную транскрипцию трансгена;
- трансген, который кодирует в качестве эффектор-гена биологически активное вещество;
- нуклеарный сигнал удерживания (NRS), кДНК которого по 5'-концу прямо или косвенно связана с 3'-концом структурного гена (б);
- предпочтительно продукт транскрипции нуклеарного сигнала удерживания имеет структуру связывания нуклеарного экспорт-фактора;
- другая неспецифическая, специфическая к клетке, специфическая к вирусу, активируемая метаболически и/или специфически к клеточному циклу промоторная или энхансерная последовательность, которая активирует базальную транскрипцию нуклеарного экспорт-фактора;
- нуклеиновая кислота, кодирующая нуклеарный экспорт-фактор (NEF), который связывается с продуктом транскрипции нуклеарного сигнала удерживания и благодаря этому способствует транспорту продукта транскрипции трансгена из клеточного ядра.
- первая, специфическая к эндотелиальным клеткам, активируемая промоторная или энхансерная последовательность, которая активирует базальную транскрипцию трансгена;
- трансген, который кодирует в качестве эффектор-гена биологически активное вещество;
- нуклеарный сигнал удерживания (NRS), кДНК которого по 5'-концу прямо или косвенно связана с 3'-концом структурного гена (б);
- предпочтительно продукт транскрипции нуклеарного сигнала удерживания имеет структуру связывания нуклеарного экспорт-фактора;
- другая неспецифическая, специфическая к клетке, специфическая к вирусу, активируемая метаболически и/или специфически к клеточному циклу промоторная или энхансерная последовательность, которая активирует базальную транскрипцию нуклеарного экспорт-фактора;
- нуклеиновая кислота, кодирующая нуклеарный экспорт-фактор (NEF), который связывается с продуктом транскрипции нуклеарного сигнала удерживания и благодаря этому способствует транспорту продукта транскрипции трансгена из клеточного ядра.
Ген, кодирующий нуклеарный сигнал удерживания, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из Rev-реактивного элемента (RRE) ВИЧ-1 или ВИЧ-2, эквивалентного RRE сигнала удерживания ретровирусов или эквивалентного RRE сигнала удерживания вируса гепатита В.
Нуклеарный экспорт-фактор предпочтительно представляет собой ген, выбираемый из группы, состоящей из Rev-гена вирусов ВИЧ-1, ВИЧ-2, вируса Maedl-Visna, артритного вируса энцефалита Caprine, вируса инфекционной анемии лошади, вируса иммунодефицита кошек, ретровирусов, Т-клеточного лимфотрофического вируса человека или гена hnRNP-A1-протеина или гена фактора транскрипции TFIII-A.
Активатор-реактивная промоторная единица
Активатор-реактивные промоторные единицы уже подробно описаны в заявке на патент ФРГ 19617851. Эта заявка на патент включена в настоящее описание в виде ссылки.
Активатор-реактивные промоторные единицы уже подробно описаны в заявке на патент ФРГ 19617851. Эта заявка на патент включена в настоящее описание в виде ссылки.
Активатор-реактивная промоторная единица состоит из следующих компонентов:
- одна или несколько одинаковых или разных промоторных или энхансерных последовательностей, которые активируются, например, специфически к клеточному циклу, в зависимости от пролиферации клеток, метаболически, специфически к эндотели-альным клеткам или специфически к вирусу или как специфически к клеточному циклу, так и также метаболически, специфически к эндотелиальным клеткам или специфически к вирусу (так называемые химерные промоторы);
- одна или несколько одинаковых или разных активаторных субъединиц, которые находятся, смотря по обстоятельствам, ниже промоторных или энхансерных последовательностей и активируются ими при их базальной транскрипции;
- активатор-реактивный промотор, который активируется продуктами экспрессии одной или нескольких активаторных субъединиц.
- одна или несколько одинаковых или разных промоторных или энхансерных последовательностей, которые активируются, например, специфически к клеточному циклу, в зависимости от пролиферации клеток, метаболически, специфически к эндотели-альным клеткам или специфически к вирусу или как специфически к клеточному циклу, так и также метаболически, специфически к эндотелиальным клеткам или специфически к вирусу (так называемые химерные промоторы);
- одна или несколько одинаковых или разных активаторных субъединиц, которые находятся, смотря по обстоятельствам, ниже промоторных или энхансерных последовательностей и активируются ими при их базальной транскрипции;
- активатор-реактивный промотор, который активируется продуктами экспрессии одной или нескольких активаторных субъединиц.
В предпочтительном варианте осуществления предлагаемые согласно изобретению активатор-реактивные промоторные единицы могут представлять собой места связывания химерных факторов транскрипции из ДНК-доменов связывания, доменов взаимодействия протеин-протеин и доменов трансактивации. Все указанные в заявке места связывания фактора транскрипции могут присутствовать однократно (мономеры) или в виде нескольких копий (мультимеры, например, включающие вплоть до 10 копий).
Примером активатор-реактивного промотора, активированного двумя активаторными субъединицами, является LexA-оператор в сочетании с SV40-промотором, причем
- первая активаторная субъединица включает кДНК LexA-ДНК-связывающего протеина (Bindeprotein), кодирующего аминокислоты 1-81 или 1-202, 3'-конец которой связан с 5'-концом кДНК Gal 80-протеина (аминокислоты 1-435);
- вторая активаторная субъединица включает кДНК домена связывания Gal80 Gal4-протеина, кодирующего аминокислоты 851-881, 3'-конец которой связан с 5'-концом кДНК "широкого" Т-антигена SV40, кодирующего аминокислоты 126-132, в свою очередь, 3'-конец которой связан с 5"-концом кДНК домена трансактивации VP16 человеческого герпесвируса-1, кодирующего аминокислоты 406-488.
- первая активаторная субъединица включает кДНК LexA-ДНК-связывающего протеина (Bindeprotein), кодирующего аминокислоты 1-81 или 1-202, 3'-конец которой связан с 5'-концом кДНК Gal 80-протеина (аминокислоты 1-435);
- вторая активаторная субъединица включает кДНК домена связывания Gal80 Gal4-протеина, кодирующего аминокислоты 851-881, 3'-конец которой связан с 5'-концом кДНК "широкого" Т-антигена SV40, кодирующего аминокислоты 126-132, в свою очередь, 3'-конец которой связан с 5"-концом кДНК домена трансактивации VP16 человеческого герпесвируса-1, кодирующего аминокислоты 406-488.
Другим примером активатор-реактивного промотора, активированного двумя активаторными субъединицами, является связывающая последовательность Gаl4-протеина в сочетании с SV40-пpомотором, причем
- первая активаторная единица включает кДНК ДНК-связывающего домена Gа14-протеина (аминокислоты 1-147), 3'-конец которой связан с 5'-концом кДНК Gal4-протеина (аминокислоты 1-435);
- вторая активаторная субъединица включает кДНК домена связывания Gal80 Gal4 (аминокислоты 851-881), 3'-конец которой связан с 5'-концом кДНК нуклеарного сигнала локализации SV40 ("широкий" Т SV40; аминокислоты 126-132), в свою очередь, 3'-конец которой связан с 5'-концом кДНК домена трансактивации VP16 человеческого герпесвируса-1, кодирующего аминокислоты 406-488.
- первая активаторная единица включает кДНК ДНК-связывающего домена Gа14-протеина (аминокислоты 1-147), 3'-конец которой связан с 5'-концом кДНК Gal4-протеина (аминокислоты 1-435);
- вторая активаторная субъединица включает кДНК домена связывания Gal80 Gal4 (аминокислоты 851-881), 3'-конец которой связан с 5'-концом кДНК нуклеарного сигнала локализации SV40 ("широкий" Т SV40; аминокислоты 126-132), в свою очередь, 3'-конец которой связан с 5'-концом кДНК домена трансактивации VP16 человеческого герпесвируса-1, кодирующего аминокислоты 406-488.
Дальнейшим примером двух активаторных субъединиц, которые активируют активатор-реактивный промотор, состоящий из связывающей последовательности Gа14-протеина и SV40-промотора, является:
- первая активаторная единица, которая включает кДНК цитоплазматического домена CD4-Т-клеточного антигена (аминокислоты 397-435), 5'-конец которой связан с 3'-концом кДНК домена трансактивации VP16 человеческого герпесвируса-1 (аминокислоты 406-488), в свою очередь, 5'-конец которой снова связан с 3'-концом кДНК нуклеарного сигнала локализации SV40 ("широкий" Т SV40; аминокислоты 16-32), и
- вторая активаторная единица, включающая кДНК нуклеарного сигнала локализации SV40 ("широкий" Т SV40; аминокислоты 126-132), кДНК домена связывания ДНК Gа14-протеина (аминокислоты 1-147), 3'-конец которой связан с 5'-концом кДНК CD4-связывающей последовательности р56 lck-протеина (аминокислоты 1-71).
- первая активаторная единица, которая включает кДНК цитоплазматического домена CD4-Т-клеточного антигена (аминокислоты 397-435), 5'-конец которой связан с 3'-концом кДНК домена трансактивации VP16 человеческого герпесвируса-1 (аминокислоты 406-488), в свою очередь, 5'-конец которой снова связан с 3'-концом кДНК нуклеарного сигнала локализации SV40 ("широкий" Т SV40; аминокислоты 16-32), и
- вторая активаторная единица, включающая кДНК нуклеарного сигнала локализации SV40 ("широкий" Т SV40; аминокислоты 126-132), кДНК домена связывания ДНК Gа14-протеина (аминокислоты 1-147), 3'-конец которой связан с 5'-концом кДНК CD4-связывающей последовательности р56 lck-протеина (аминокислоты 1-71).
Выбор эффектор-гена
Предлагаемая согласно изобретению нукдеотидная последовательность содержит по крайней мере один эффектор-ген (компонент д)), который кодирует фармакологически активное вещество для профилактики и/или лечения заболевания. Это биологически активное вещество выбирают из группы, состоящей из цитокинов, факторов роста, антител или фрагментов антител, рецепторов цитокинов или факторов роста, антипролиферативно, апоптотически или цитостатически действующих протеинов, ингибиторов ангиогенеза, ингибиторов свертывания, фибринолитически действующих веществ, протеинов плазмы, дополнительно активирующих протеинов, пептидных гормонов, протеинов вирусных оболочек, бактериальных антигенов и паразитарных антигенов, воздействующих на кровообращение протеинов и рибозимов.
Предлагаемая согласно изобретению нукдеотидная последовательность содержит по крайней мере один эффектор-ген (компонент д)), который кодирует фармакологически активное вещество для профилактики и/или лечения заболевания. Это биологически активное вещество выбирают из группы, состоящей из цитокинов, факторов роста, антител или фрагментов антител, рецепторов цитокинов или факторов роста, антипролиферативно, апоптотически или цитостатически действующих протеинов, ингибиторов ангиогенеза, ингибиторов свертывания, фибринолитически действующих веществ, протеинов плазмы, дополнительно активирующих протеинов, пептидных гормонов, протеинов вирусных оболочек, бактериальных антигенов и паразитарных антигенов, воздействующих на кровообращение протеинов и рибозимов.
В случае трансгена речь идет предпочтительно о структурном гене, который кодирует рибозим, инактивирующий мРНК, которая кодирует протеин, выбираемый из группы, состоящей из контрольных протеинов клеточного цикла, в особенности таких, как циклин-А, циклин-В, циклин-D1, циклин-Е, E2F1-5, cdc2, cdc25C или DP1, или вирусных протеинов, или цитокинов, или факторов роста, или их рецепторов.
В следующем варианте осуществления эффектор-ген может кодировать фермент, который расщепляет предшественника фармакона с образованием фармакона.
Согласно дальнейшему варианту осуществления эффектор-ген может кодировать слитый протеин лиганд-эффектор, причем лигандом может быть антитело, фрагмент антитела, цитокин, фактор роста, адгезионная молекула или пептидный гормон, а эффектор может представлять собой фармакологически активное, как описанное выше, вещество или фермент. Например, структурный ген может кодировать слитый протеин лиганд-фермент, причем фермент расщепляет предшественника фармакона с образованием фармакона, а лиганд связывается с поверхностью клетки, предпочтительно с эндотелиальными клетками или опухолевыми клетками.
Согласно изобретению выбор эффектор-гена и, в случае необходимости, сочетаемого со специфическим к эндотелиальным клеткам промотором, другого промоторного элемента осуществляют в зависимости от рода профилактики и/или лечения соответствующего заболевания.
Например, при следующих заболеваниях нужно выбирать нижеследующие сочетания промоторных последовательностей и эффектор-генов (более подробное описание уже представлено в следующих заявках на патенты, которые включены в настоящее описание в виде ссылки: заявки на европейские патенты NoNo
97101507.8; 97102547.3; заявки на патенты ФРГ NoNo 19710643.9; 197704301.1; 19617851.7; 19639103.2; 19651443.6; заявки на европейские патенты NoNo 95931204.2; 95930524.4; 95931205.9; 95931933.6 и 19701141.1).
97101507.8; 97102547.3; заявки на патенты ФРГ NoNo 19710643.9; 197704301.1; 19617851.7; 19639103.2; 19651443.6; заявки на европейские патенты NoNo 95931204.2; 95930524.4; 95931205.9; 95931933.6 и 19701141.1).
1. Терапия опухолей
1.1) Добавочные промоторы, активируемые
- неспецифически и/или
- специфически к клеточному циклу и/или
- метаболически.
1.1) Добавочные промоторы, активируемые
- неспецифически и/или
- специфически к клеточному циклу и/или
- метаболически.
1.2) Эффектор-гены ингибиторов пролиферации клеток, например, таких как:
- протеин ретинобластомы (pRb/p110) или родственные р107 и р130 протеины;
- протеин ретинобластомы (pRb/p110) и родственные р107 и р130 протеины инактивируют путем фосфорилирования. Предпочтительно нужно использовать такие гены этих ингибиторов клеточного цикла, которые обладают мутациями сайтов инактивации экспрессированных протеинов, не затрагивая, таким образом, их функции. Примеры этих мутаций описаны для р110. Аналогичным образом мутируют ДНК-последовательность р107-протеина или р130-протеина;
- протеин р53;
- протеин р53 инактивируется в клетке либо за счет связывания со специальными протеинами, как, например, MDM2, либо путем олигомеризации р53 по дефосфорилированному С-концевому серину. Таким образом, предпочтительно используют ДНК-последовательность протеина р53, С-конец которой укорочен на серин 392;
- протеин р21 (WAF-1);
- протеин р16;
- другие cdk-ингибиторы;
- протеин GADD45;
- bak-протеин.
- протеин ретинобластомы (pRb/p110) или родственные р107 и р130 протеины;
- протеин ретинобластомы (pRb/p110) и родственные р107 и р130 протеины инактивируют путем фосфорилирования. Предпочтительно нужно использовать такие гены этих ингибиторов клеточного цикла, которые обладают мутациями сайтов инактивации экспрессированных протеинов, не затрагивая, таким образом, их функции. Примеры этих мутаций описаны для р110. Аналогичным образом мутируют ДНК-последовательность р107-протеина или р130-протеина;
- протеин р53;
- протеин р53 инактивируется в клетке либо за счет связывания со специальными протеинами, как, например, MDM2, либо путем олигомеризации р53 по дефосфорилированному С-концевому серину. Таким образом, предпочтительно используют ДНК-последовательность протеина р53, С-конец которой укорочен на серин 392;
- протеин р21 (WAF-1);
- протеин р16;
- другие cdk-ингибиторы;
- протеин GADD45;
- bak-протеин.
1.3) Эффектор-гены индуцирующих свертывание факторов и ингибиторов ангиогенеза, например, таких как:
- ингибитор-1 плазминогенного активатора (PAI-1);
- PAI-2;
- PAI-3;
- ангиостатин;
- интерфероны (IFNα, IFNβ или IFNγ);
- тромбоцитарный фактор-4;
- TIMP-1;
- TIMP-2;
- ТIMP-3;
- фактор ингибирования лейкемии (LIF);
- тканевый фактор (TF) и его активные в отношении свертывания фрагменты;
- фактор Х или мутации фактора X, согласно заявке на патент D 19701141.1, которая включена в настоящее описание в виде ссылки.
- ингибитор-1 плазминогенного активатора (PAI-1);
- PAI-2;
- PAI-3;
- ангиостатин;
- интерфероны (IFNα, IFNβ или IFNγ);
- тромбоцитарный фактор-4;
- TIMP-1;
- TIMP-2;
- ТIMP-3;
- фактор ингибирования лейкемии (LIF);
- тканевый фактор (TF) и его активные в отношении свертывания фрагменты;
- фактор Х или мутации фактора X, согласно заявке на патент D 19701141.1, которая включена в настоящее описание в виде ссылки.
1.4) Эффектор-гены цитостатических или цитотоксических протеинов, например, таких как:
- перфорин;
- гранзим;
- интерлейкин-2;
- интерлейкин-4;
- интерлейкин-12;
- интерфероны, как, например, IFNα, IFNβ или IFNγ;
- фактор некроза опухоли (TNF), как TNFα или TNFβ;
- онкостатин М;
- сфингомиелиназа;
- магаинин и производные магаинина.
- перфорин;
- гранзим;
- интерлейкин-2;
- интерлейкин-4;
- интерлейкин-12;
- интерфероны, как, например, IFNα, IFNβ или IFNγ;
- фактор некроза опухоли (TNF), как TNFα или TNFβ;
- онкостатин М;
- сфингомиелиназа;
- магаинин и производные магаинина.
1.5) Эффектор-гены цитостатических или цитотоксических антител и слитых протеинов из антигенсвязывающих фрагментов антител с цитостатическими, цитотоксическими или возбуждающими воспаление протеинами или ферментами.
- К цитостатическим или цитотоксическим антителам относятся таковые, направленные против мембранных структур эндотелиальных клеток, которые, например, описаны Burrous и др. (Pharmac. Ther., 64, 155 (1994)), Hughes и др. (Cancer Res., 49, 6214 (1989)) и Maruyama и др. (PNAS USA, 87, 5744 (1990)). В особенности к ним причисляют антитела против VEGF-рецепторов.
- Далее, сюда относятся цитостатические или цитотоксические антитела, направленные против мембранных структур опухолевых клеток. Такого рода антитела представлены в виде обзора, например, Sedlacek и др., Contrlb. to Oncol. , 43, Karger Verlag, Мюнхен (1992). Другими примерами являются антитела против Sialyl Lewis; против пептидов опухолей, которые распознаются Т-клетками; против экспрессированных онкогенами протеинов; против ганглиозидов, как GD3, GD2, GM2, 9-O-ацетил-GD3, фукозил-GM1; против антигенов групп крови и их предшественников; против антигенов полиморфного эпителиального муцина; против антигенов протеинов теплового шока.
- Далее, сюда относятся антитела, направленные против мембранных структур лейкемических клеток. Большое количество такого рода моноклональных антител уже описано для способов диагностики и терапии (обзоры Kristensen, Danish Medical Bulletin, 41, 52 (1994); Schranz Therapia Hungarica, 38, 3 (1990); Drexsler и др., Leuk. Res., 10, 279 (1986); Naeim, Dis. Markers., 7, 1 (1989); Stickney и др., Curr. Opin. Oncol., 4, 847 (1992); Drexsler и др., Blut, 57, 327 (1988); Freedman и др.. Cancer Invest., 9, 69 (1991)). В зависимости от типа лейкемии в качестве лигандов, например, пригодны моноклональные антитела или связывающие антигены фрагменты антител, направленные против мембранных антигенов, приведенных в табл.2.
- Гуманизацию мышиных антител, получение и оптимизирование генов Fab- и rek. Fv-фрагментов осуществляют в соответствии с известными специалисту способами (Winter и др., Nature, 349, 293 (1991); Hoogenbooms и др., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. , 36, 19 (1993); Girol, Mol. Immunol., 28, 1379 (1991), или Huston и др., Intern. Rev.Immunol., 10, 195 (1993)). Слияние rek.Fv - фрагментов с генами цитостатических, цитотоксических или возбуждающих воспаление протеинов или ферментов осуществляют равным образом соответственно известному специалисту уровню техники.
1.6) Эффектор-гены слитых протеинов из других, связывающих эндотелиальные клетки или опухолевые клетки лигандов с цитостатическими и цитотоксическими протеинами или ферментами. К лигандам относятся, например, все вещества, которые связываются с мембранными структурами или мембранными рецепторами эндотелиальных клеток. Например, к ним относятся:
- антитела или фрагменты антител;
- цитокины, как, например, интерлейкин-1, или факторы роста или их фрагменты, соответственно, их неполные последовательности, которые связываются с рецепторами, экспрессированными эндотелиальными клетками, как, например, PDGF, bFGF, VEGF, TGF.
- антитела или фрагменты антител;
- цитокины, как, например, интерлейкин-1, или факторы роста или их фрагменты, соответственно, их неполные последовательности, которые связываются с рецепторами, экспрессированными эндотелиальными клетками, как, например, PDGF, bFGF, VEGF, TGF.
- Далее, к ним относятся адгезионные молекулы, которые связываются с активированными и/или пролиферирующими эндотелиальными клетками. К ним относятся, например, Slex, LFA-1, LECAV-1, VLA-4 или витронектин.
- Сюда относятся другие вещества, которые связываются с мембранными структурами или мембранными рецепторами опухолевых или лейкемических клеток. Например, к ним относятся факторы роста или их фрагменты, соответственно, их неполные последовательности, которые связываются с рецепторами, выраженными лейкемическими или опухолевыми клетками. Такого рода факторы роста уже описаны (Обзоры Cross и др., Cell, 64, 271 (1991); Aulitzky и др., Drugs, 48, 667 (1994); Moore, Clin. Cancer Res., 1, 3 (1995); Van Kooten и др., Leuk. Lymph., 12, 27 (1993)).
- Слияние генов этих связывающихся с клеткой-мишенью лигандов с цитостатическими, цитотоксическими или возбуждающими воспаление протеинами или ферментами осуществляют соответственно уровню техники известными специалисту способами.
1.7) Эффектор-гены индукторов воспалений, например, таких как:
- интерлейкин-1;
- интерлейкин-2;
- RANTES (МСР-2);
- хемотактический и активирующий фактор моноцитов (MCAF);
- интерлейкин-8;
- макрофаговый протеин-1 воспаления (MIP-1α, -β);
- нейтрофильный активирующий протеин-2 (NAP-2);
- интерлейкин-3;
- интерлейкин-5;
- фактор ингибирования лейкемии человека (LIF);
- интерлейкин-7;
- интерлейкин-5;
- эотаксин;
- интерлейкин-13;
- GM-CSF;
- G-CSF;
- M-CSF;
- фактор яда кобры (CVF) или неполные последовательности CVF, которому функционально соответствует человеческий комплементарный фактор С3b, то есть которые могут связываться с комплементарным фактором В и после расщепления за счет фактора D представляют собой С3-конвертазу;
- человеческий комплементарный фактор С3 или его неполная последовательность С3b;
- продукты расщепления человеческого комплементарного фактора C3, которые функционально и структурно подобны CVF;
- бактериальные протеины, которые активируют комплементы или вызывают воспаления, например порины Salmonella typhimurium, факторы слипания Staphylococcus aureus, модулины, особенно грамотрицательных бактерий, "главный наружный мембранный протеин" легионелл или Haemophilus influenza типа В или клебсиелл или М-молекулы стрептококков группы G.
- интерлейкин-1;
- интерлейкин-2;
- RANTES (МСР-2);
- хемотактический и активирующий фактор моноцитов (MCAF);
- интерлейкин-8;
- макрофаговый протеин-1 воспаления (MIP-1α, -β);
- нейтрофильный активирующий протеин-2 (NAP-2);
- интерлейкин-3;
- интерлейкин-5;
- фактор ингибирования лейкемии человека (LIF);
- интерлейкин-7;
- интерлейкин-5;
- эотаксин;
- интерлейкин-13;
- GM-CSF;
- G-CSF;
- M-CSF;
- фактор яда кобры (CVF) или неполные последовательности CVF, которому функционально соответствует человеческий комплементарный фактор С3b, то есть которые могут связываться с комплементарным фактором В и после расщепления за счет фактора D представляют собой С3-конвертазу;
- человеческий комплементарный фактор С3 или его неполная последовательность С3b;
- продукты расщепления человеческого комплементарного фактора C3, которые функционально и структурно подобны CVF;
- бактериальные протеины, которые активируют комплементы или вызывают воспаления, например порины Salmonella typhimurium, факторы слипания Staphylococcus aureus, модулины, особенно грамотрицательных бактерий, "главный наружный мембранный протеин" легионелл или Haemophilus influenza типа В или клебсиелл или М-молекулы стрептококков группы G.
1.8) Эффектор-гены ферментов активации предшественников цитостатических средств, например ферментов, которые расщепляют неактивные вещества-предшественники (пролекарства) с образованием активных цитостатических средств (лекарства).
Такого рода вещества и относящиеся к ним, смотря по обстоятельствам, пролекарства и лекарства уже описаны в обзоре Deonarain и др. (Br. J. Cancer, 70, 786 (1994); Mullen (Pharmac. Ther., 63, 199 (1994), и Harris и др. (Gene Ther. , 1, 170 (1994)). Например, можно использовать ДНК-последовательность одного из следующих ферментов:
- тимидинкиназа герпесвируса;
- тимидинкиназа вируса ветряной оспы;
- бактериальная нитроредуктаза;
- бактериальная β-глюкуронидаза;
- растительная β-глюкуронидаза из Secale cereale;
- человеческая β-глюкуронидаза;
- человеческая карбоксипептидаза (СВ), например, СВ-А тучной клетки, СВ-В поджелудочной железы или бактериальная карбоксипептидаза;
- бактериальная β-лактамаза;
- бактериальная цитозиндезаминаза;
- человеческая каталаза, соответственно, пероксидаза;
- фосфатаза, в особенности человеческая щелочная фосфатаза, человеческая кислая фосфатаза простаты или кислая фосфатаза типа 5;
- оксидаза, в особенности человеческая лизилоксидаза или человеческая кислая D-аминооксидаза;
- пероксидаза, в особенности человеческая глутатион-пероксидаза, человеческая эозинофильная пероксидаза или человеческая пероксидаза щитовидной железы;
- галактозидаза.
- тимидинкиназа герпесвируса;
- тимидинкиназа вируса ветряной оспы;
- бактериальная нитроредуктаза;
- бактериальная β-глюкуронидаза;
- растительная β-глюкуронидаза из Secale cereale;
- человеческая β-глюкуронидаза;
- человеческая карбоксипептидаза (СВ), например, СВ-А тучной клетки, СВ-В поджелудочной железы или бактериальная карбоксипептидаза;
- бактериальная β-лактамаза;
- бактериальная цитозиндезаминаза;
- человеческая каталаза, соответственно, пероксидаза;
- фосфатаза, в особенности человеческая щелочная фосфатаза, человеческая кислая фосфатаза простаты или кислая фосфатаза типа 5;
- оксидаза, в особенности человеческая лизилоксидаза или человеческая кислая D-аминооксидаза;
- пероксидаза, в особенности человеческая глутатион-пероксидаза, человеческая эозинофильная пероксидаза или человеческая пероксидаза щитовидной железы;
- галактозидаза.
2) Терапия аутоиммунных заболеваний и воспалений
2.1) Добавочные промоторы, активируемые
- неспецифически и/или
- специфически к клеточному циклу и/или
- метаболически.
2.1) Добавочные промоторы, активируемые
- неспецифически и/или
- специфически к клеточному циклу и/или
- метаболически.
2.2) Эффектор-гены для лечения аллергий, например, таковые β-интерферона; γ-интерферона; интерлейкина-10; антител, соответственно, фрагментов антител против интерлейкина-4; растворимых рецепторов интерлейкина-4; интерлейкина-12; TGF-β,
2.3) Эффектор-гены для предотвращения отторжения трансплантированных органов, например таковые интерлейкина-10; TGF-β; растворимых рецепторов интерлейкина-1; растворимых рецепторов интерлейкина-2; антагонистов рецепторов интерлейкина-1; растворимых рецепторов интерлейкина-6; иммуносупрессорных антител или их VH - и VL -содержащих фрагментов. Иммуносупрессорными антителами являются, например, специфическое к Т-клеточному рецептору или его CD3-комплексу антитело против CD4 или CD8, далее, против рецептора интерлейкина-2, рецептора интерлейкина-1 или рецептора интерлейкина-4 или против адгезионных молекул CD2, LFA-1, CD28 или CD40.
2.3) Эффектор-гены для предотвращения отторжения трансплантированных органов, например таковые интерлейкина-10; TGF-β; растворимых рецепторов интерлейкина-1; растворимых рецепторов интерлейкина-2; антагонистов рецепторов интерлейкина-1; растворимых рецепторов интерлейкина-6; иммуносупрессорных антител или их VH - и VL -содержащих фрагментов. Иммуносупрессорными антителами являются, например, специфическое к Т-клеточному рецептору или его CD3-комплексу антитело против CD4 или CD8, далее, против рецептора интерлейкина-2, рецептора интерлейкина-1 или рецептора интерлейкина-4 или против адгезионных молекул CD2, LFA-1, CD28 или CD40.
2.4) Эффектор-гены для лечения опосредованных антителами аутоиммунных заболеваний, например, таковые TGF-β; α-интерферона; β-интерферона; γ-интерферона; интерлейкина-12; растворимых рецепторов интерлейкина-4; растворимых рецепторов интерлейкина-6; иммуносупрессорного антитела или его VH- и VL - содержащих фрагментов.
2.5) Эффектор-гены для лечения опосредованных клеткой аутоиммунных заболеваний, например, таковые интерлейкина-6; интерлейкина-9; интерлейкина-10; интерлейкина-13; α-фактора некроза опухоли или β-фактора некроза опухоли; иммуносупрессивного антитела или его VH- и VL - содержащих фрагментов.
2.6) Эффектор-гены ингибиторов пролиферации клеток, цитостатических или цитотоксических протеинов, индукторов воспалений и ферментов активации предшественников цитостатических средств.
Примеры генов, кодирующих такого рода протеины, уже указаны в разделе "Структурные гены для терапии опухолей".
В такой же форме, как там уже описано, согласно изобретению можно применять структурные гены, которые кодируют слитые протеины из антител, соответственно. Fab- или rek. Fv-фрагментов этих антител или других лигандов специфически к клетке-мишени и вышеуказанные цитокины, факторы роста, рецепторы, цитостатические или цитотоксические протеины и ферменты.
2.7) Структурные гены для лечения артрита.
Согласно изобретению выбирают структурные гены, выраженный протеин которых прямо или косвенно подавляет воспаление, например, в суставе и/или способствует восстановлению внеклеточной матрицы (хрящ, соединительная ткань) в суставе.
К ним относятся, например, следующие:
- антагонист рецептора интерлейкина-1 (IL-1-RA), причем IL-1-RA ингибирует связывание IL-1α, β;
- растворимый рецептор интерлейкина-1, причем растворимый рецептор IL-1 связывает и инактивирует интерлейкин-1;
- интерлейкин-6, причем интерлейкин-6 повышает выделение ТIMP и пероксидов и снижает выделение интерлейкина-1 и α-фактора некроза опухоли за счет синовиальных клеток и хондроцитов;
- растворимый рецептор фактора некроза опухоли, причем растворимый рецептор фактора некроза опухоли связывает и инактивирует фактор некроза опухоли;
- интерлейкин-4, интерлейкин-4 ингибирует образование и выделение интерлейкина-1, α-фактора некроза опухоли и ММР;
- интерлейкин-10, интерлейкин-10 ингибирует образование и выделение интерлейкина-1, α-фактора некроза опухоли и ММР и повышает выделение ТIMP;
- инсулиноподобный фактор роста (IGF-1); IGF-1 стимулирует синтез внеклеточной матрицы;
- пероксиддисмутаза;
- TIMP, в особенности TIMP-1, TIMP-2 или TIMP-3.
- антагонист рецептора интерлейкина-1 (IL-1-RA), причем IL-1-RA ингибирует связывание IL-1α, β;
- растворимый рецептор интерлейкина-1, причем растворимый рецептор IL-1 связывает и инактивирует интерлейкин-1;
- интерлейкин-6, причем интерлейкин-6 повышает выделение ТIMP и пероксидов и снижает выделение интерлейкина-1 и α-фактора некроза опухоли за счет синовиальных клеток и хондроцитов;
- растворимый рецептор фактора некроза опухоли, причем растворимый рецептор фактора некроза опухоли связывает и инактивирует фактор некроза опухоли;
- интерлейкин-4, интерлейкин-4 ингибирует образование и выделение интерлейкина-1, α-фактора некроза опухоли и ММР;
- интерлейкин-10, интерлейкин-10 ингибирует образование и выделение интерлейкина-1, α-фактора некроза опухоли и ММР и повышает выделение ТIMP;
- инсулиноподобный фактор роста (IGF-1); IGF-1 стимулирует синтез внеклеточной матрицы;
- пероксиддисмутаза;
- TIMP, в особенности TIMP-1, TIMP-2 или TIMP-3.
3) Терапия недостаточного образования клеток крови
3.1) Добавочные промоторы, активируемые
- неспецифически к клетке и/или
- специфически к клеточному циклу и/или
- метаболически.
3.1) Добавочные промоторы, активируемые
- неспецифически к клетке и/или
- специфически к клеточному циклу и/или
- метаболически.
3.2) Эффектор-гены для лечения анемии, например таковые эритропоэтина.
3.3) Эффектор-гены для лечения лейкопении, например таковые G-CSF, GM-CSF, M-CSF.
3.4) Эффектор-гены для лечения тромбоцитопении, например таковые интерлейкина-3; фактора подавления лейкемии (LIF); интерлейкина-11; тромбопоэтина.
4) Терапия поражения нервной системы
4.1) Добавочные промоторы, активируемые
- неспецифически и/или
- специфически к клеточному циклу и/или
- метаболически.
4.1) Добавочные промоторы, активируемые
- неспецифически и/или
- специфически к клеточному циклу и/или
- метаболически.
4.2) Эффектор-гены нейрональных факторов роста, например, таковые FGF; фактора роста нервной ткани (NGF); происходящего из головного мозга нейротрофического фактора (BDNF); нейротрофина-3 (NT-3); нейротрофина-4 (NT-4); мерцательного нейротрофического фактора (CNTF).
4.3) Эффектор-гены ферментов, например, таких как тирозингидроксилаза; допадекарбоксилаза.
4.4) Эффектор-гены цитокинов и их ингибиторов, которые ингибируют или нейтрализуют нейротоксическое действие α-фактора некроза опухоли, например, таких как:
- TGF-β;
- растворимые рецепторы фактора некроза опухоли; рецепторы фактора некроза опухоли нейтрализуют α-фактор некроза опухоли;
- интерлейкин-10, интерлейкин-10 подавляет образование α-фактора некроза опухоли; γ-интерферон, интерлейкин-2 и интерлейкин-4;
- растворимые рецепторы интерлейкина-1;
- рецептор-I интерлейкина-1;
- рецептор интерлейкина-1;
растворимые рецепторы интерлейкина-1 нейтрализуют активность интерлейкина-1;
- антагонист рецептора интерлейкина-1;
- растворимые рецепторы интерлейкина-6.
- TGF-β;
- растворимые рецепторы фактора некроза опухоли; рецепторы фактора некроза опухоли нейтрализуют α-фактор некроза опухоли;
- интерлейкин-10, интерлейкин-10 подавляет образование α-фактора некроза опухоли; γ-интерферон, интерлейкин-2 и интерлейкин-4;
- растворимые рецепторы интерлейкина-1;
- рецептор-I интерлейкина-1;
- рецептор интерлейкина-1;
растворимые рецепторы интерлейкина-1 нейтрализуют активность интерлейкина-1;
- антагонист рецептора интерлейкина-1;
- растворимые рецепторы интерлейкина-6.
5) Терапия нарушений системы свертывания крови и кровообращения
5.1) Добавочные промоторы, активируемые
- специфически к клеточному циклу и/или
- неспецифически к клетке и/или
- метаболически.
5.1) Добавочные промоторы, активируемые
- специфически к клеточному циклу и/или
- неспецифически к клетке и/или
- метаболически.
5.2) Эффектор-гены для ингибирования свертывания или для стимуляции фибринолиза, например, таковые:
- тканевого плазминогенного активатора (tPA);
- плазминогенного активатора урокиназного типа (uРА);
- гибрида tPA и иРА;
- протеина С;
- гирудина;
- ингибиторов серинпротеиназы (серфины), как, например, С-1S-ингибитор; α1-антитрипсин или антитромбин-III;
- ингибитора метаболического пути тканевого фактора (TFPI).
- тканевого плазминогенного активатора (tPA);
- плазминогенного активатора урокиназного типа (uРА);
- гибрида tPA и иРА;
- протеина С;
- гирудина;
- ингибиторов серинпротеиназы (серфины), как, например, С-1S-ингибитор; α1-антитрипсин или антитромбин-III;
- ингибитора метаболического пути тканевого фактора (TFPI).
5.3) Эффектор-гены для стимуляции свертывания, например, таковые F-VIII; F-IX; фактора Виллебранда; F-XIII; PAI-1; PAI-2; тканевого фактора и его фрагментов.
5.4) Эффектор-гены факторов ангиогенеза, например, как VEGF, FGF.
5.5) Эффектор-гены для снижения кровяного давления, например, таковые калликреина, эндотелиальной клетки "оксид азота (NО)-синтаза".
5.6) Эффектор-гены для ингибирования пролиферации гладкомышечных клеток после повреждений слоя эндотелия, например, таковые:
- антипролиферативного, цитостатического или цитотоксического протеина или
- фермента для расщепления предшественников цитостатических средств с образованием цитостатических средств, как уже указано выше (в случае опухоли), или
- слитого протеина одного из этих биологически активных веществ с лигандом, например, антителом или фрагментами антител, специфически к мышечным клеткам.
- антипролиферативного, цитостатического или цитотоксического протеина или
- фермента для расщепления предшественников цитостатических средств с образованием цитостатических средств, как уже указано выше (в случае опухоли), или
- слитого протеина одного из этих биологически активных веществ с лигандом, например, антителом или фрагментами антител, специфически к мышечным клеткам.
5.7) Эффектор-гены других протеинов плазмы крови, например, таковые альбумина, C1-инактиватора; сывороточной холинэстеразы; трансферрина; 1-антитрипсина.
6) Вакцинации
6.1) Добавочные промоторы:
- неспецифические и/или
- специфические к клеточному циклу.
6.1) Добавочные промоторы:
- неспецифические и/или
- специфические к клеточному циклу.
6.2) Эффектор-гены для профилактики инфекционных заболеваний.
Возможности получения эффективных вакцин обычным путем ограничены.
Вследствие этого разработана технология ДНК-вакцины. В случае этих ДНК-вакцин, однако, возникают вопросы в отношении степени эффективности (Fynan и др., Int. J. Immunopharm., 17, 79 (1995); Donnelly и др., Immunol., 2, 20 (1994)).
Согласно настоящему изобретению нужно ожидать большей эффективности ДНК-вакцины.
В качестве активного вещества нужно выбирать ДНК образованного возбудителем инфекции протеина, который путем провоцирования иммунной реакции, то есть путем связывания антитела и/или благодаря цитотоксическим Т-лимфоцитам, приводит к нейтрализации и/или гибели возбудителя. Такого рода так называемые нейтрализующие антигены уже используют в качестве антигенов вакцин (см. обзор Ellis, Adv. Exp. Med. Biol., 327, 263 (1992)).
Согласно изобретению предпочтительна ДНК, кодирующая нейтрализующие антигены следующих возбудителей:
- вирус гриппа А;
- вирус иммунодефицита человека;
- вирус Толлвута;
- герпесвирус (вирус простого герпеса);
- респираторно-синтициальный вирус;
- вирус парагриппа;
- ротавирус;
- вирус ветряной оспы (VZV);
- цитомегаловирус (CMV);
- вирус кори;
- вирус папилломы человека (HPV);
- вирус гепатита В (HBV);
- вирус гепатита С (HCV);
- вирус гепатита D (HDV);
- вирус гепатита Е (HEV);
- вирус гепатита A (HAV);
- антиген холерного вибриона;
- Borrelia burgdorferi;
- Helicobacter pylori,
- антиген малярии.
- вирус гриппа А;
- вирус иммунодефицита человека;
- вирус Толлвута;
- герпесвирус (вирус простого герпеса);
- респираторно-синтициальный вирус;
- вирус парагриппа;
- ротавирус;
- вирус ветряной оспы (VZV);
- цитомегаловирус (CMV);
- вирус кори;
- вирус папилломы человека (HPV);
- вирус гепатита В (HBV);
- вирус гепатита С (HCV);
- вирус гепатита D (HDV);
- вирус гепатита Е (HEV);
- вирус гепатита A (HAV);
- антиген холерного вибриона;
- Borrelia burgdorferi;
- Helicobacter pylori,
- антиген малярии.
К такого рода биологически активным веществам согласно изобретению, однако, также относится ДНК антиидиотипического антитела или его антигенсвязыващих фрагментов, структуры связывания антигена которого ("гипервариабельные участки") представляют собой копии протеиновой или углеводной структуры нейтрализующего антигена возбудителя инфекции.
Такого рода антиидиотипические антитела могут заменять особенно углеводные антигены в случае бактериальных возбудителей инфекции.
Такого рода антиидиотипические антитела и продукты их расщепления описаны в обзоре Hawkins и др. (J. Immunother., 14, 273 (1993)) и Westerink и Apsella (Springer Seminars in Immunopathol., 15, 227 (1993)).
6.3) Эффектор-гены "опухолевых вакцин".
К ним относятся антигены опухолевых клеток. Такого рода антигены представлены, например, в обзоре Sedlacek и др., Contrib. to Oncol., 32, изд. Karger, Мюнхен (1988), и Contrib. to Oncol., 43, изд. Karger, Мюнхен (1992).
Другими примерами генов, соответственно, следующих антигенов, соответственно, следующих антиидиотипических антител являются:
- Sialyl Lewis;
- пептиды опухолей, которые распознаются Т-клетками;
- экспрессированные онкогенами протеины;
- антигены групп крови и их предшественники;
- антигены полиморфного эпителиального муцина;
- антигены протеинов теплового шока.
- Sialyl Lewis;
- пептиды опухолей, которые распознаются Т-клетками;
- экспрессированные онкогенами протеины;
- антигены групп крови и их предшественники;
- антигены полиморфного эпителиального муцина;
- антигены протеинов теплового шока.
7) Терапия хронических инфекционных заболеваний
7.1) Добавочные промоторы:
- специфические к вирусу и/или
- специфические к клеточному циклу и/или
- неспецифические.
7.1) Добавочные промоторы:
- специфические к вирусу и/или
- специфические к клеточному циклу и/или
- неспецифические.
7.2) Эффектор-гены, например,
- протеина, который оказывает цитостатические, апоптотические или цитотоксические воздействия;
- фермента, который расщепляет предшественника антивирусного или цитотоксического вещества с образованием активного вещества.
- протеина, который оказывает цитостатические, апоптотические или цитотоксические воздействия;
- фермента, который расщепляет предшественника антивирусного или цитотоксического вещества с образованием активного вещества.
7.3) Эффектор-гены антивирусных протеинов, таких как:
- антивирусно активные цитокины и факторы роста; к ним относятся, например, α-интерферон, β-интерферон, γ-интерферон, β-фактор некроза опухоли, α-фактор некроза опухоли, интерлейкин-1 или TGF-β;
- антитело со специфичностью, которая инактивирует соответствующий вирус, или его VH- и VL - содержащие фрагменты, или его, связанные через линкер, VH- и VL - фрагменты, получаемое, как уже описано.
- антивирусно активные цитокины и факторы роста; к ним относятся, например, α-интерферон, β-интерферон, γ-интерферон, β-фактор некроза опухоли, α-фактор некроза опухоли, интерлейкин-1 или TGF-β;
- антитело со специфичностью, которая инактивирует соответствующий вирус, или его VH- и VL - содержащие фрагменты, или его, связанные через линкер, VH- и VL - фрагменты, получаемое, как уже описано.
Антителами против вирусного антигена являются, например, следующие: против вируса гепатита человека В, против вируса гепатита человека С, против вируса герпеса человека, против вируса папилломы человека, против вируса иммунодефицита человека, против вируса Эпстайна-Барра, против вируса Т-клеточной лимфомы человека, против вируса Коксаки, против вируса Хантаана.
- Rev-связывающий протеин. Эти протеины связываются с Rev-РНК и ингибируют Rev-зависимые посттранскрипционные стадии экспрессии ретровирусного гена. Примерами Rev-связывающих протеинов являются: RBP9-27; RBP1-8U; RBP1-8D; псевдогены RBP1-8;
- рибозимы, которые переваривают мРНК генов контрольных протеинов клеточного цикла или мРНК вирусов. Каталитически действующие для ВИЧ рибозимы описаны в виде обзора, например, Christoffersen и др., J. Med. Chem., 38, 2033 (1995).
- рибозимы, которые переваривают мРНК генов контрольных протеинов клеточного цикла или мРНК вирусов. Каталитически действующие для ВИЧ рибозимы описаны в виде обзора, например, Christoffersen и др., J. Med. Chem., 38, 2033 (1995).
7.4) Эффектор-гены антибактериальных протеинов
К антибактериальным протеинам относятся, например, антитела, которые нейтрализуют бактериальные токсины или опсонизируют бактерии. Например, к ним относятся антитела против менингококков С или В, coil, Borrelia, Pseudomonas, Helicobacter pylori, Staphylococcus aureus.
К антибактериальным протеинам относятся, например, антитела, которые нейтрализуют бактериальные токсины или опсонизируют бактерии. Например, к ним относятся антитела против менингококков С или В, coil, Borrelia, Pseudomonas, Helicobacter pylori, Staphylococcus aureus.
Сочетание одинаковых или разных структурных генов
Предметом изобретения, далее, является конструкция нуклеиновой кислоты, в которой имеется сочетание ДНК-последовательностей двух одинаковых или двух разных структурных генов. Для экспрессии обеих ДНК-последовательностей включают другую промоторную последовательность или предпочтительно кДНК "внутреннего рибосомного аминоациального сайта" (IRES) в качестве регуляторного элемента обоих структурных генов.
Предметом изобретения, далее, является конструкция нуклеиновой кислоты, в которой имеется сочетание ДНК-последовательностей двух одинаковых или двух разных структурных генов. Для экспрессии обеих ДНК-последовательностей включают другую промоторную последовательность или предпочтительно кДНК "внутреннего рибосомного аминоациального сайта" (IRES) в качестве регуляторного элемента обоих структурных генов.
IRES позволяет осуществлять экспрессию двух связанных друг с другом через IRES ДНК-последовательностей.
Такого рода IRES описаны, например, Montford и Smith, TIG, 11, 179 (1995); Kaufman и др. , Nucl. Acids Res., 19, 4485 (1991); Morgan и др., Nucl. Acids Res., 20, 1293 (1992); Dirks и др.. Gene, 128, 247 (1993); Pelletier и Sonenberg, Nature, 334, 320 (1988), и Sugitomo и др., BioTechn., 12, 694 (1994).
Так, например, можно использовать кДНК IRES-последовательности вируса полиомиелита (положение ≤140-≥630 5'-UTR).
Согласно изобретению предпочтительно нужно связывать через другие промоторные последовательности или IRES-последовательность структурные гены, которые обладают аддитивным действием.
Согласно изобретению предпочтительными являются сочетания структурных генов, например, для
1) терапии опухолей:
- одинаковые или разные, цитостатические, апоптотические, цитотоксические или возбуждающие воспаление протеины или
- одинаковые или разные ферменты для расщепления предшественника цитостатического средства;
2) терапии аутоиммунных заболеваний:
- различные цитокины или рецепторы с синергическим действием для ингибирования клеточной и/или гуморальной иммунной реакции или
- разные или одинаковые TIMPs;
3) терапии недостаточного образования клеток крови:
- разные, иерархически следующие друг за другом цитокины, как, например, интерлейкин-1, интерлейкин-3, интерлейкин-6 или CM-CSF и эритропоэтин, G-CSF или тромбопоэтин;
4) терапии поражений нервных клеток:
- нейрональный фактор роста и цитокин или ингибитор цитокина;
5) терапии нарушений системы свертывания крови и системы кровообращения:
- антитромботическое средство и фибринолитическое средство (например, tPA и uРА) или
- цитостатический, апоптотический или цитотоксический протеин и антитромботическое или фибринолитическое средство;
- некоторые различные, синергически действующие факторы свертывания крови, например F-VIII и vWF или F-VIII и F-IX;
6) вакцинации:
- антиген и иммуностимулирующий цитокин, как, например, интерлейкин-1α, интерлейкин-1β, интерлейкин-2, GM-CSF, рецептор интерлейкина-3 или интерлейкина-4;
- различные антигены одного опухолевого типа или различных опухолевых типов;
7) терапии вирусных инфекционных заболеваний:
- антивирусный протеин и цитостатический, апоптотический или цитотоксический протеин;
- антитела против различных поверхностных антигенов одного вируса или нескольких вирусов;
8) терапии бактериальных инфекционных заболеваний:
- антитела против различных поверхностных антигенов и/или токсинов микроба.
1) терапии опухолей:
- одинаковые или разные, цитостатические, апоптотические, цитотоксические или возбуждающие воспаление протеины или
- одинаковые или разные ферменты для расщепления предшественника цитостатического средства;
2) терапии аутоиммунных заболеваний:
- различные цитокины или рецепторы с синергическим действием для ингибирования клеточной и/или гуморальной иммунной реакции или
- разные или одинаковые TIMPs;
3) терапии недостаточного образования клеток крови:
- разные, иерархически следующие друг за другом цитокины, как, например, интерлейкин-1, интерлейкин-3, интерлейкин-6 или CM-CSF и эритропоэтин, G-CSF или тромбопоэтин;
4) терапии поражений нервных клеток:
- нейрональный фактор роста и цитокин или ингибитор цитокина;
5) терапии нарушений системы свертывания крови и системы кровообращения:
- антитромботическое средство и фибринолитическое средство (например, tPA и uРА) или
- цитостатический, апоптотический или цитотоксический протеин и антитромботическое или фибринолитическое средство;
- некоторые различные, синергически действующие факторы свертывания крови, например F-VIII и vWF или F-VIII и F-IX;
6) вакцинации:
- антиген и иммуностимулирующий цитокин, как, например, интерлейкин-1α, интерлейкин-1β, интерлейкин-2, GM-CSF, рецептор интерлейкина-3 или интерлейкина-4;
- различные антигены одного опухолевого типа или различных опухолевых типов;
7) терапии вирусных инфекционных заболеваний:
- антивирусный протеин и цитостатический, апоптотический или цитотоксический протеин;
- антитела против различных поверхностных антигенов одного вируса или нескольких вирусов;
8) терапии бактериальных инфекционных заболеваний:
- антитела против различных поверхностных антигенов и/или токсинов микроба.
Вставка сигнальных последовательностей и трансмембранных доменов
Подробное описание технологии уже представлено в заявках на патенты ФРГ NoNo 19639103.2 и 19651443.6, которые включены в настоящее описание в виде ссылки.
Подробное описание технологии уже представлено в заявках на патенты ФРГ NoNo 19639103.2 и 19651443.6, которые включены в настоящее описание в виде ссылки.
1) Для усиления трансляции в 3'-конец промоторной последовательности и непосредственно в 5'-конец стартового сигнала (ATG) сигнальной, соответственно, трансмембранной последовательности можно вставлять нуклеотидную последовательность GCCACC или GCCGCC (Kozak, J. Cell Biol., 108, 299 (1989)).
2) Для облегчения выделения продукта экспрессии структурного гена, при известных условиях содержащуюся в ДНК-последовательности структурного гена гомологичную сигнальную последовательность можно заменять гетерологичной, улучшающей внутриклеточное выведение сигнальной последовательностью.
Так, например, можно вставлять сигнальную последовательность иммуноглобулина (ДНК-положение ≤63-≥107; Riechmann и др., Nature, 332, 323 (1988)) или сигнальную последовательность СЕА (ДНК-положение ≤33-≥134; Screwe и др., Mol. Cell Blol. , 10, 2738 (1990); Berling и др., Cancer Res., 50, 6534 (1990)) или сигнальную последовательность гликопротеина человеческого респираторно-синтициального вируса (кДНК из аминокислот ≤38-≥50 или 48-65; Lichtenstein и др., J. Gen. Virol., 77, 109 (1996)).
3) Для анкеровки биологического активного вещества в клеточной мембране, образующей биологически активное вещество трансдуцированной, клетки можно вводить, альтернативно или дополнительно к сигнальной последовательности, последовательность трансмембранного домена.
Так, например, между промоторной последовательностью и последовательностью структурного гена можно вставлять трансмембранную последовательность человеческого, стимулирующего макрофаговую колонию фактора (ДНК-положение: ≤1485-≥1554; Cosman и др., Behring. Inst. Mitt., 83, 15 (1988)) или ДНК-последовательность сигнального и трансмембранного участка человеческого респираторно-синцитиального вирусного (RSV)-гликопротеина G (аминокислоты 1-63 или их неполные последовательности, аминокислоты 38-63; Vijaya и др., Mol. Cell Biol. , 8, 1709 (1988); Lichtenstein и др., J.Gen. Virol., 77, 109 (1966)) или ДНК-последовательность сигнального и трансмембранного участка нейраминидазы вируса гриппа (аминокислоты 7-35 или неполная последовательность аминокислот 7-27; Brown и др., J. Virol., 62, 3824 (1988)).
4) Для анкеровки биологически активного вещества в клеточной мембране образующих биологически активное вещество, трансдуцированных клеток, однако, можно вставлять также нуклеотидную последовательность гликофосфолипидного анкера.
Вставку гликофосфолипидного анкера осуществляют в 3' - конец нукдеотидной последовательности структурного гена и дополнительно можно осуществлять к вставке сигнальной последовательности.
Гликофосфолипидные анкеры, например, для СЕА, N-CAM и других мембранных протеинов, как, например, Thy-1, описаны (см. обзор Ferguson и др., Ann. Rev. Blochem., 57, 285 (1988)).
5) Другой возможностью анкеровки биологически активных веществ в клеточной мембране согласно настоящему изобретению является использование ДНК-последовательности для слитого протеина лиганд-биологически активное вещество. Специфичность лиганда этого слитого протеина направлена против мембранной структуры клеточной мембраны выбранной клетки-мишени.
5.1) К лигандам, которые связываются с поверхностью клеток, относятся, например, антитела или фрагменты антител, направленные против структур на поверхности, например,
- эндотелиальных клеток, в особенности к ним причисляют антитела против VEGF-рецепторов или против рецепторов кинина;
- или мышечных клеток, как антитела против актина, или антитела против рецепторов ангиотензина-II, или антитела против рецепторов факторов роста, как, например, против EGF-рецепторов, или против PDGF-рецепторов, или против FGF-рецепторов, или антитела против рецепторов эндотелина-А.
- эндотелиальных клеток, в особенности к ним причисляют антитела против VEGF-рецепторов или против рецепторов кинина;
- или мышечных клеток, как антитела против актина, или антитела против рецепторов ангиотензина-II, или антитела против рецепторов факторов роста, как, например, против EGF-рецепторов, или против PDGF-рецепторов, или против FGF-рецепторов, или антитела против рецепторов эндотелина-А.
К лигандам также относятся антитела или их фрагменты, которые направлены против специфических к опухоли или ассоциированных с опухолью антигенов опухолевой клеточной мембраны. Такого рода антитела уже описаны.
Мышиные моноклональные антитела предпочтительно нужно использовать в гуманизированной форме. Fab- и rek.Fv-фрагменты и продукты их слияния получают, как уже описано, с помощью известной специалисту технологии.
5.2) К лигандам относятся, далее, все биологически активные вещества, как, например, цитокины или адгезионные молекулы, факторы роста или их фрагменты, соответственно, их неполные последовательности, медиаторы или пептидные гормоны, которые связываются с мембранными структурами или мембранными рецепторами соответствующих выбранных клеток (клеток-мишеней). Например, к ним относятся:
- лиганды эндотелиальных клеток, как интерлейкин-1, PDGF, bFGF, VEGF, TGGTGGβ (Pusztain и др. , J. Pathol., 169, 191 (1993)) или кинин и производные или аналоги кинина;
- далее, к ним относятся адгезионные молекулы. Такого рода адгезионные молекулы, как например, Slex, LFA-1, VAC-1, LeCAM-1, VLA-4 или витронектин и производные или аналоги витронектина, уже описаны для эндотелиальных клеток (обзоры Augustin-Voss и др. , J. Cell Blol., 119, 483 (1992); Paul и др., Cancer Vetast. Rev., 9, 175 (1990); Honn и др., Cancer Vetast. Rev., 11, 353 (1992); Varner и др., Cell Adh. Commun., 3, 367 (1995)).
- лиганды эндотелиальных клеток, как интерлейкин-1, PDGF, bFGF, VEGF, TGGTGGβ (Pusztain и др. , J. Pathol., 169, 191 (1993)) или кинин и производные или аналоги кинина;
- далее, к ним относятся адгезионные молекулы. Такого рода адгезионные молекулы, как например, Slex, LFA-1, VAC-1, LeCAM-1, VLA-4 или витронектин и производные или аналоги витронектина, уже описаны для эндотелиальных клеток (обзоры Augustin-Voss и др. , J. Cell Blol., 119, 483 (1992); Paul и др., Cancer Vetast. Rev., 9, 175 (1990); Honn и др., Cancer Vetast. Rev., 11, 353 (1992); Varner и др., Cell Adh. Commun., 3, 367 (1995)).
Изобретение поясняется подробнее следующими примерами, не ограничивающими его объема.
Получение и применение конструкции нуклеиновой кислоты
Конструкции нуклеиновых кислот предпочтительно состоят из ДНК. Под термином "конструкции нуклеиновых кислот" нужно понимать искусственные образования из нуклеиновой кислоты, которые могут транскрибироваться в клетках-мишенях. Они предпочтительно вставлены в вектор, причем особенно предпочтительны плазмидные векторы или закомплексованные с невирусными носителями плазмиды (Fritz и др., Hum. Gene Ther., 7, 1395 (1996); Sоlоdin и др., Biochem., 34, 13537 (1995); Abdallak и др., Hum. Gene Ther., 7, 1947 (1996); Ledley, Hum. Gene Ther. , 6, 1129 (1995); Schofield и др., Вr. Med. Bull., 51, 56 (1995); Behr, Bioconj. Chem., 5, 382 (1994); Gotten и др., Curr. Opin. Biotechnol. , 4, 705 (1993); Hodgsan и др., Nature Biotechnol., 14, 339 (1996)). Векторы вводят в клетку-предшественник эндотелиальных клеток или в эндотелиальные клетки с помощью известных специалисту технологий (Cotten и др., Curr. Opin. Biotechnol. , 4, 705 (1993); Scheffield и др., Br. Med. Bull., 51, 56 (-1995); Ledley, Hum. Gene Ther., 6, 1129 (1995)).
Конструкции нуклеиновых кислот предпочтительно состоят из ДНК. Под термином "конструкции нуклеиновых кислот" нужно понимать искусственные образования из нуклеиновой кислоты, которые могут транскрибироваться в клетках-мишенях. Они предпочтительно вставлены в вектор, причем особенно предпочтительны плазмидные векторы или закомплексованные с невирусными носителями плазмиды (Fritz и др., Hum. Gene Ther., 7, 1395 (1996); Sоlоdin и др., Biochem., 34, 13537 (1995); Abdallak и др., Hum. Gene Ther., 7, 1947 (1996); Ledley, Hum. Gene Ther. , 6, 1129 (1995); Schofield и др., Вr. Med. Bull., 51, 56 (1995); Behr, Bioconj. Chem., 5, 382 (1994); Gotten и др., Curr. Opin. Biotechnol. , 4, 705 (1993); Hodgsan и др., Nature Biotechnol., 14, 339 (1996)). Векторы вводят в клетку-предшественник эндотелиальных клеток или в эндотелиальные клетки с помощью известных специалисту технологий (Cotten и др., Curr. Opin. Biotechnol. , 4, 705 (1993); Scheffield и др., Br. Med. Bull., 51, 56 (-1995); Ledley, Hum. Gene Ther., 6, 1129 (1995)).
Согласно другому варианту осуществления предлагаемые согласно изобретению конструкции нуклеиновых кислот вставляют в вирусный вектор (Weir и др., Hum. Gene Ther. , 7, 1331 (1996); Flotte и др., Gene Ther., 2, 357 (1995); Efstathion и др. , Br. Med. Bull., 51, 45 (1995); Kremer и др., Br. Med. Bull. , 51, 31 (1995); Vile и др., Br. Med. Bull., 51, 12 (1995); Randrianarison и др. , Biologicals, 23, 145 (1995); Jolly, Cancer Gene Ther., 1, 51 (1994)) и трансфецируют с помощью этих эндотелиальных клеток. Таким образом трансдуцированные клетки вводят пациентам наружно иди внутрь, локально, в полость тела, в орган, в кровообращение, в дыхательный путь, в желудочно-кишечный тракт, в мочеполовую систему, в полость раны или внутримышечно или подкожно.
Благодаря предлагаемым согласно изобретению конструкциям нуклеиновых кислот структурный ген может экспрессироваться в эндотелиальных клетках или клетках-предшественниках эндотелиальных клеток специфически к клетке и, в случае необходимости, также специфически к вирусу, при определенных метаболических условиях, и/или специфически к клеточному циклу, и/или индуцированно за счет лекарственного средства, причем в случае структурного гена речь идет предпочтительно о гене, который кодирует фармакологически активное вещество иди фермент, который расщепляет неактивный предшественник фармакона с образованием активного фармакона.Структурный ген может быть выбран таким образом, что фармакологически активное вещество или фермент экспрессируются в виде слитого протеина с лигандом, и этот лиганд связывается с поверхностью клеток, например, пролиферирующих эндотелиальных или опухолевых клеток.
Изобретение ниже описывается более подробно с помощью фигуры и примеров, однако, не ограничивающих его объема.
На чертеже изображена конструкция нуклеиновой кислоты для трансформации клеток
Примеры для пояснения сущности изобретения
1) Культивирование эндотелиальъных клеток из СD34-положительных клеток крови без использования фибронектина и головного мозга крупного рогатого скота
СD34-положительные клетки крови, выделенные по методике, описанной Asahara и др., Science, 275, 964 (1997), культивируют в культуральной среде (среда 199) при температуре 37oС и в атмосфере с 5% диоксида углерода,
- либо, как описано Asahara (смесь а)), в пластмассовых чашках, покрытых фибронектином и при добавке экстракта из головного мозга крупного рогатого скота (100 мкг/мл);
- либо согласно настоящему изобретению (смесь б)) в пластмассовых чашках без фибронектинового покрытия и без добавки экстракта из головного мозга крупного рогатого скота, однако, с добавкой VEGF и bFGF (фирма Сигма; 1 об.% каждого), смотря по обстоятельствам, при добавке фетальной телячьей сыворотки (FKS, 20%).
Примеры для пояснения сущности изобретения
1) Культивирование эндотелиальъных клеток из СD34-положительных клеток крови без использования фибронектина и головного мозга крупного рогатого скота
СD34-положительные клетки крови, выделенные по методике, описанной Asahara и др., Science, 275, 964 (1997), культивируют в культуральной среде (среда 199) при температуре 37oС и в атмосфере с 5% диоксида углерода,
- либо, как описано Asahara (смесь а)), в пластмассовых чашках, покрытых фибронектином и при добавке экстракта из головного мозга крупного рогатого скота (100 мкг/мл);
- либо согласно настоящему изобретению (смесь б)) в пластмассовых чашках без фибронектинового покрытия и без добавки экстракта из головного мозга крупного рогатого скота, однако, с добавкой VEGF и bFGF (фирма Сигма; 1 об.% каждого), смотря по обстоятельствам, при добавке фетальной телячьей сыворотки (FKS, 20%).
Спустя 6 дней с помощью микроскопа определяют долю адгезивно растущих, образующих веретенообразные и капилляроподобные структуры клеток, а долю эндотелиальных клеток находят путем маркировки с помощью специфических к эндотелиальным клеткам антител (анти-СD31, анти-vWF, анти-Flik-1) путем анализа при помощи клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (FACS-анализ). Никакого различия в количестве и морфологии этих клеток между смесью а) и смесью б) не обнаружено. В серии испытаний обеих смесей доля эндотелиальных клеток колеблется в диапазоне 1-10%, что подтверждает, что добавка факторов роста VEGF и bFGF может заменять покрытие чашек для культивирования фибронектином и добавку экстракта из головного мозга крупного рогатого скота.
2) Культивирование эндотелиальных клеток из мононуклеарных клеток крови
Из 120 мл крови путем центрифугирования с градиентом плотности фиколла выделяют мононуклеарные клетки и путем инкубации в течение 1 часа в чашках для культивирования клеток и последующей декантации отделяют неприлипшие мононуклеарные клетки.
Из 120 мл крови путем центрифугирования с градиентом плотности фиколла выделяют мононуклеарные клетки и путем инкубации в течение 1 часа в чашках для культивирования клеток и последующей декантации отделяют неприлипшие мононуклеарные клетки.
Эти клетки высевают в чашки для культивирования соответственно смеси б) и культивируют в течение 6 дней при температуре 37oС и в атмосфере с 5% диоксида углерода.
Спустя 6 дней определяют долю эндотелиальных клеток, как описано выше в п.1). В различных сериях опытов она составляет 2-20%.
3) Культивирование эндотелиальных клеток из CD14-положительных клеток крови.
Из 120 мл крови здорового донора путем центрифугирования с градиентом плотности фиколла (Ficoll-Paque, Pharmacia, Uppsala) выделяют мононуклеарные клетки и путем инкубации в течение 60 минут в чашках для культивирования клеток и последующей декантации отделяют неприлипшие мононуклеарные клетки крови. Таким образом выделенные, неприлипшие мононуклеарные клетки (NMZ) содержат 0,3-0,05% CD34-положительных и 5-10% СD14-положительных (моноциты и моноцитоподобные клетки) клеток.
Используют мононуклеарные клетки из расчета по 1•106 клеток на 1 мл среды 199, содержащей 20% фетальной телячьей сыворотки (и то, и другое фирмы Гибко) и 100 мкг ECGS (Harbor Bioproducts, Норвуд, Марокко) или VEGF (Рерrо Techn. , Лондон, Англия), и инкубируют в течение 1-3 часов при 37oС в покрытых фибронектином (Harbor Bioproducts, Норвуд, Марокко) пластмассовых чашках. За счет этой инкубации увеличивается доля CD14-положительных клеток с 5-10% до 25-30%.
Мононуклеарные клетки отделяют путем осторожной промывки и CD14-положительные или CD11-положительные клетки выделяют с помощью магнитных шариков, покрытых анти-CD14, соответственно, анти-CD11 (CD14/CD11 Micro Beads, Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Германия), согласно инструкциям изготовителя.
Мононуклеарные клетки, содержащие примерно ≥80% CD14-положительных клеток, в указанной среде 199, дополненной фетальной телячьей сывороткой и ECGS или VEGF, инкубируют в покрытых фибронектином пластмассовых чашках при температуре 37oС во влажной атмосфере с 5% диоксида углерода.
Клетки в культуре исследуют спустя 6 часов, 3 дня и 5 дней с помощью моноклональных антител и путем полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой.
Спустя 6 часов уже обнаруживают маленькие мононуклеарные CD14-положительные клетки, которые положительны к специфическим к эндотелиальным клеткам маркерам: ацетил-LDL-peцепторам, CD34, Flk-1 и фактору Виллебранда. На третий день эти клетки проявляют сильные признаки пролиферации.
На 5-й день можно наблюдать прилипшие большие зернистые овальные клетки и веретенообразные клетки, которые все несут указанные маркеры эндотелиальных клеток, но более не содержат СD14-маркера.
Как только эти эндотелиальные клетки срастаются, они дополнительно экспрессируют VE-кадгерин. Спустя 1-2 недели в культуре эндотелиальных клеток находятся более 80% клеток.
4) Специфическая к эндотелиальным клеткам трансформация и культивирование эндотелиальных клеток из мононуклеарных клеток крови.
Из 120 мл крови путем центрифугирования с градиентом
плотности фиколла выделяют мононуклеарные клетки и путем инкубации в течение 1 часа в чашках для культивирования клеток и последующей декантации отделяют неприлипшие мононуклеарные клетки крови. Эти клетки крови доводят до концентрации 1х107 на 1 мл культуральной среды, высеивают в чашки для культивирования диаметром 60 мм и с комплексом из предлагаемой согласно изобретению плазмиды и Суперфекта (фирма Quiagen) инкубируют в течение 10 минут при температуре 37oС.
плотности фиколла выделяют мононуклеарные клетки и путем инкубации в течение 1 часа в чашках для культивирования клеток и последующей декантации отделяют неприлипшие мононуклеарные клетки крови. Эти клетки крови доводят до концентрации 1х107 на 1 мл культуральной среды, высеивают в чашки для культивирования диаметром 60 мм и с комплексом из предлагаемой согласно изобретению плазмиды и Суперфекта (фирма Quiagen) инкубируют в течение 10 минут при температуре 37oС.
Комплекс получают согласно инструкциям изготовителя Суперфекта.
Предлагаемая согласно изобретению плазмида содержит в направлении считывания от 5'-конца к 3'-концу следующие ДНК-последовательности:
- промотор человеческого эндоглин-гена (NS1-2415; заявка на патент D 19704301.1);
- кДНК человеческой циклинзависимой киназы-4 (cdk-4) с мутацией в кодоне-24 [обмен аргинина (СGТ) на цистеин (TGT).; и др., Science, 269, 1281 (1997)];
- нуклеарный сигнал локализации (NLS) от SV40 ["широкий" Т SV40; аминокислоты 126-132; PKKKRKV (последовательность No 3); Dingwall и др., TIBS, 16, 478 (1991)].
- промотор человеческого эндоглин-гена (NS1-2415; заявка на патент D 19704301.1);
- кДНК человеческой циклинзависимой киназы-4 (cdk-4) с мутацией в кодоне-24 [обмен аргинина (СGТ) на цистеин (TGT).; и др., Science, 269, 1281 (1997)];
- нуклеарный сигнал локализации (NLS) от SV40 ["широкий" Т SV40; аминокислоты 126-132; PKKKRKV (последовательность No 3); Dingwall и др., TIBS, 16, 478 (1991)].
Связывание отдельных составных частей конструкции осуществляют через пригодные сайты рестрикции, которые имеются за счет амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) на концах различных элементов. Связывание осуществляют с помощью известных специалисту, специфических к сайтам рестрикции ферментов и ДНК-лигаз. Эти ферменты имеются в продаже. Таким образом полученный нуклеотид однократно клонируют с помощью этих ферментов.
После инкубации мононуклеарных клеток крови с комплексом Суперфект/плазмида клетки крови промывают и культивируют в среде для культивирования клеток, как описано в разделе 2.
Спустя 6 дней определяют долю эндотедиальных клеток, как описано в разделе 1. В различных сериях опытов она колеблется в диапазоне 10-60%.
5) Получение и применение трансдуцированных эндотелиальных клеток в качестве векторов
Выделенные, трансдуцированные и размноженные, как описано в разделе 4), эндотелиальные клетки высевают в чашки для культивирования диаметром 60 мм и с комплексом из другой, предлагаемой согласно изобретению плазмиды и Суперфекта (фирма Quiagen), инкубируют в течение 10 минут при температуре 37oС.
Выделенные, трансдуцированные и размноженные, как описано в разделе 4), эндотелиальные клетки высевают в чашки для культивирования диаметром 60 мм и с комплексом из другой, предлагаемой согласно изобретению плазмиды и Суперфекта (фирма Quiagen), инкубируют в течение 10 минут при температуре 37oС.
Этот комплекс получают согласно инструкциям изготовителя Суперфекта.
Предлагаемая согласно изобретению плазмида содержит в направлении считывания от 5'-конца к 3'-концу следующие ДНК-последовательности.
Активаторная субъединица А)
- промотор cdk25C-reHa (нуклеиновые кислоты 290 до +121; Zwicker и др., EMBO J., 14, 4514 (1995); Zwicker и др., Nucl. Acids Res., 23, 3822 (1995));
- нуклеарный сигнал локализации (NLS) SV40 ("широкий" Т SV40; аминокислоты 126-132; PKKKRKV (последовательность No 3); Dingwall и др., TIBS, 16, 478 (1991));
- кислый домен трансактивации (TAD) HSV-1 VP16 (аминокислоты 406-488; Triezenberg и др., Genes Developm., 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm., 5, 190 (1995));
- кДНК цитоплазматической части CD4-глипротеина (аминокислоты 397-435; Simpson и др., Oncogene, 4, 1141 (1989); Maddon и др., Cell, 42, 93 (1985)).
- промотор cdk25C-reHa (нуклеиновые кислоты 290 до +121; Zwicker и др., EMBO J., 14, 4514 (1995); Zwicker и др., Nucl. Acids Res., 23, 3822 (1995));
- нуклеарный сигнал локализации (NLS) SV40 ("широкий" Т SV40; аминокислоты 126-132; PKKKRKV (последовательность No 3); Dingwall и др., TIBS, 16, 478 (1991));
- кислый домен трансактивации (TAD) HSV-1 VP16 (аминокислоты 406-488; Triezenberg и др., Genes Developm., 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm., 5, 190 (1995));
- кДНК цитоплазматической части CD4-глипротеина (аминокислоты 397-435; Simpson и др., Oncogene, 4, 1141 (1989); Maddon и др., Cell, 42, 93 (1985)).
Активаторная субъединица В)
- промотор человеческого эндоглин-гена (нуклеиновые кислоты 1-2415; заявка на патент D 19704301.1);
- нуклеарный сигнал локализации (NLS) SV40 ("широкий" Т SV40; аминокислоты 126-132 PKKKRKV (последовательность No3); Dingwall и др., TIBS, 16, 478 (1991));
- кДНК домена связывания ДНК протеина Gal4 (аминокислоты 1-147; Chasman и Kornberg, Mol. Cell Blol., 10, 2916 (1990);
- кДНК связывающей последовательности CD4 протеина р56 lck (аминокислоты 1-71; Shaw и др.. Cell, 59, 627 (1989);
Turner и др., Cell, 60, 755 (1990); Perlmutter и др., J. Cell Biochem., 38, 117 (1988)).
- промотор человеческого эндоглин-гена (нуклеиновые кислоты 1-2415; заявка на патент D 19704301.1);
- нуклеарный сигнал локализации (NLS) SV40 ("широкий" Т SV40; аминокислоты 126-132 PKKKRKV (последовательность No3); Dingwall и др., TIBS, 16, 478 (1991));
- кДНК домена связывания ДНК протеина Gal4 (аминокислоты 1-147; Chasman и Kornberg, Mol. Cell Blol., 10, 2916 (1990);
- кДНК связывающей последовательности CD4 протеина р56 lck (аминокислоты 1-71; Shaw и др.. Cell, 59, 627 (1989);
Turner и др., Cell, 60, 755 (1990); Perlmutter и др., J. Cell Biochem., 38, 117 (1988)).
Активатор-реактивные промоторы
- 10х связывающая последовательность Ga14-протеина связывания с нуклеотидной последовательностью 5'-CGGACAATGTTGACCG-3' (последовательность No 4; Chasman и Kornberg, Mol. Cell Biol., 10, 2916 (1989));
- базальный промотор SV40 (нуклеиновые кислоты 48-5191; Tooze (изд.) "DNA Tumor Viruses" (Cold Spring- Harbor New York, New York, Cold Spring Harbor Laboratory).
- 10х связывающая последовательность Ga14-протеина связывания с нуклеотидной последовательностью 5'-CGGACAATGTTGACCG-3' (последовательность No 4; Chasman и Kornberg, Mol. Cell Biol., 10, 2916 (1989));
- базальный промотор SV40 (нуклеиновые кислоты 48-5191; Tooze (изд.) "DNA Tumor Viruses" (Cold Spring- Harbor New York, New York, Cold Spring Harbor Laboratory).
Эффектор-ген
- кДНК человеческой β-глюкуронидазы (нуклеотидная последовательность 93-1982; Oshlrna и др., PNAS USA, 84, 65 (1987)).
- кДНК человеческой β-глюкуронидазы (нуклеотидная последовательность 93-1982; Oshlrna и др., PNAS USA, 84, 65 (1987)).
Действие описанной активаторной последовательности следующее:
- промотор cdc258 регулирует специфически к клеточному циклу транскрипцию комбинированных кДНК домена активации VP16 и цитоплазматической части CD4 (активаторная субъединица А));
- промотор человеческого эндоглин-гена регулирует специфически к эндотелиальным клеткам транскрипцию комбинированных кДНК ДНК-протеина связывания Gal4 и CD4-связывающей части протеина р56 lck (активаторная субъединица В));
- продукты экспрессии активаторных субъединиц А и В димеризуются за счет связывания CD4-домена с доменом р56 lck;
- димерный протеин представляет собой химерный фактор транскрипции активатор-реактивного промотора (ДНК-последовательность Gа14-домена связывания/промотора SV40) для транскрипции эффектор-гена (=люцифераза-ген).
- промотор cdc258 регулирует специфически к клеточному циклу транскрипцию комбинированных кДНК домена активации VP16 и цитоплазматической части CD4 (активаторная субъединица А));
- промотор человеческого эндоглин-гена регулирует специфически к эндотелиальным клеткам транскрипцию комбинированных кДНК ДНК-протеина связывания Gal4 и CD4-связывающей части протеина р56 lck (активаторная субъединица В));
- продукты экспрессии активаторных субъединиц А и В димеризуются за счет связывания CD4-домена с доменом р56 lck;
- димерный протеин представляет собой химерный фактор транскрипции активатор-реактивного промотора (ДНК-последовательность Gа14-домена связывания/промотора SV40) для транскрипции эффектор-гена (=люцифераза-ген).
Связывание отдельных составных частей конструкции осуществляют через пригодные сайты рестрикции, которые за счет ПЦР-амплификации имеются на концах различных элементов. Связывание осуществляют с помощью известных специалисту специфических к сайтам рестрикции ферментов и ДНК-лигаз. Эти ферменты имеются в продаже.
Таким образом полученную нуклеотидную конструкцию с помощью этих ферментов однократно клонируют в плазмидном векторе рХР2 (Nordeen, BioTechniques, 6, 454 (1988)). После инкубации мононуклеарных клеток крови с комплексом Супер-фект/плазмида клетки крови промывают и культивируют в среде для культивирования клеток, как описано в разделе 2.
Спустя 6 дней определяют количество β-глюкуронидазы, продуцированное эндотелиальными клетками, с помощью 4-мети-лумбеллиферил-β-глюкуронида в качестве субстрата.
Для проверки специфичности к клеточному циклу эндотелиальные клетки синхронизируют путем удаления метионина через 48 часов в G0/G1. Содержание ДНК в клетках определяют по окрашиванию с помощью красителя 33258 фирмы ХЕХСТ в клеточном сортере с возбуждением флуоресценции (Lucibello и др., ЕМВО J., 14, 132 (1995)).
Получают следующие результаты.
В трансфецированных эндотелиальных клетках нельзя определить никакого увеличения содержания β-глюкуронидазы по сравнению с нетрансфецированными фибробластами.
Трансфецированные эндотелиальные клетки отчетливо экспрессируют больше β-глюкуронидазы, чем нетрансфецированные эндотелиальные клетки.
Пролиферирующие эндотелиальные клетки (ДНК>2S; S=набор хромосом) выделяют отчетливо больше β-глюкуронидазы, чем синхронизированные в G0/G1 эндотелиальные клетки (ДНК=2S).
Таким образом, описанная активатор-реактивная промоторная единица приводит к специфической клетке, зависимой от клеточного цикла экспрессии структурного гена β-глюкуронидазы.
Эндотелиальные клетки согласно настоящему изобретению после локального введения, например, в место опухоли, или после внутричерепного, соответственно, субарахноидального введения или системного, предпочтительно внутривенного или внутриартериального введения, делают возможным то, что эти эндотелиальные клетки располагаются предпочтительно в областях с повреждением сосудов и за счет специфичности к клеточному циклу и специфичности к эндотелиальным клеткам активатор-реактивной промоторной единицы только пролиферирующие эндотелиальные клетки преобладающе, если не исключительно, выделяют β-глюкуронидазу. Эта β-глюкуронидаза расщепляет теперь инъецированный, хорошо совместимый доксорубицин. Он подавляет пролиферацию эндотелиадьных клеток и действует цитостатически на эти клетки, а также на соседние опухолевые клетки. Благодаря этому приходят к торможению роста опухоли.
Claims (18)
1. Способ получения генетически измененных клеток, отличающийся тем, что осуществляют следующие стадии: а) выделение клеток из крови или жидкостей организма, содержащих клетки; б) культивирование полученных на стадии а) клеток в среде для культивирования, содержащей ганглиозиды, фосфолипиды, гликолипиды и/или факторы роста; в) на выбор иммортализацию полученных на стадии а) или б) клеток путем трансформации с помощью онкогена, который мутирован таким образом, что генный продукт, вырабатываемый онкогеном, еще может полностью активировать клеточный цикл, однако эта активация клеточного цикла более не ингибируется клеточными ингибиторами, в частности онкоген выбран из группы, состоящей из мутированных cdk-4, cdk-6 и cdk-2, активации протоонкогена или инактивации супрессорного гена путем трансформации клеток с помощью нуклеотидной последовательности, кодирующей протеин, который инактивирует по крайней мере один генный продукт, вырабатываемый супрессорным геном, и г) трансфекцию полученных на стадиях а) и б) или на стадии в) клеток с помощью конструкции нуклеиновой кислоты для генной терапии, содержащей эффектор-ген, который можно активировать с помощью пригодных промоторных систем специфически к клетке, специфически к клеточному циклу, специфически к вирусу и/или путем гипоксии.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что клетки являются CD34-, CD14-, CD11-, CD11b-, CD13-, CD64- или CD68- положительными или эндотелиальными клетками.
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что клетки являются клетками крови венозной, капиллярной, артериальной, пуповины или плаценты, клетками костного мозга, селезенки, лимфатических узлов, перитонеального пространства, плеврального пространства, лимфы, вен, артерий, капилляров и/или жидкости соединительной ткани.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что фактор роста на стадии б) выбирают из группы, состоящей из ECGF, FGFαFGFβ, VEGF, ECAF, IGF-1, IGF-2, SC-3, EGF, SCF, TGF, ангиогенина, плейотрофина и Flt-3-лиганда.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что онкоген представляет собой нуклеотидную последовательность cdk-4, в положении 24 мутированную таким образом, что первоначально кодированный аргинин заменен на цистеин.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что протеин, инактивирующий генный продукт, вырабатываемый супрессорным геном, выбирают из группы, состоящей из ElA-протеина аденовируса, ElB-протеина аденовируса, "широкого" Т-антигена SV40-вируса, E6-протеина вируса папилломы, Е7-протеина вируса папилломы, MDM-2-протеина и протеина, содержащего по крайней мере одну аминокислотную последовательность LXDXLXXL-II-LXCXEXXXXXSDDE, в которой Х означает заменимую аминокислоту и -II- означает любую аминокислотную цепь из 7-80 аминокислот.
7. Способ по любому из пп. 1, 5 или 6, отличающийся тем, что клетка представляет собой эндотелиальную клетку и используемый для трансформации онкоген или используемая для инактивации супрессорного гена нуклеотидная последовательность связаны со специфической к эндотелию активаторной последовательностью, которая регулирует транскрипцию онкогена или указанной нуклеотидной последовательности.
8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что конструкция нуклеиновой кислоты на стадии г) содержит по крайней мере одну неограниченно активируемую, специфическую к эндотелиальным клеткам, специфическую к вирусу, метаболически активируемую и/или активируемую специфически к клеточному циклу активаторную последовательность и по крайней мере один эффектор-ген, экспрессия которого регулируется активаторной последовательностью.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что экспрессия эффектор-гена регулируется по крайней мере двумя одинаковыми или разными активаторными последовательностями.
10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что вторую активаторную последовательность выбирают из группы, состоящей из промоторных последовательностей вирусов, таких, как вирус гепатита В человека, вирус гепатита С человека, вирус герпеса человека, вирус папилломы человека, вирус Эпстайна-Барра, вирус N-клеточной лимфомы человека, вирус огуречной мозаики или вирус иммунодефицита человека; промоторных или энхансерных последовательностей, активированных путем гипоксии или с помощью специфических к клеточному циклу активаторных последовательностей генов cdc25C, cdc25B, циклина А, cdc2, E2F-1, B-myb и DHFR; связывающих последовательностей факторов транскрипции, которые зависят от клеточной пролиферации или активированы, как мономеры или мультимеры Myc E-Вох.
11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что эффектор-ген представляет собой ген, кодирующий биологически активное вещество, выбранное из группы, состоящей из цитокинов, хемокинов, факторов роста, рецепторов цитокинов, хемокинов или факторов роста, антипролиферативно, или цитостатически, или апоптотически действующих протеинов, антител, фрагментов антител, ингибиторов ангиогенеза, пептидных гормонов, факторов свертывания, ингибиторов свертывания, фибринолитических протеинов, пептидов или протеинов, воздействующих на кровообращение, протеинов плазмы крови и антигенов возбудителей инфекции, или клеток, или опухолей, причем выбранный антиген провоцирует иммунную реакцию.
12. Способ по п. 10 или 11, отличающийся тем, что эффектор-ген представляет собой ген, кодирующий фермент, который расщепляет предшественника фармакона с образованием фармакона.
13. Способ по п. 11 или 12, отличающийся тем, что эффектор-ген представляет собой ген, кодирующий слитый протеин лиганд-биологически активное вещество или слитый протеин лиганд-фермент, причем лиганд выбран из группы, состоящей из цитокинов, факторов роста, антител, фрагментов антител, пептидных гормонов, медиаторов, клеточных адгезионных протеинов и протеинов, связывающих LDL-рецептор.
14. Способ по любому из пп. 1-13, отличающийся тем, что вводимая в эндотелиальную клетку конструкция нуклеиновой кислоты представляет собой ДНК.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что конструкция нуклеиновой кислоты встроена в вектор.
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что вектор представляет собой плазмидный вектор.
17. Способ по п. 15, отличающийся тем, что вектор представляет собой вирусный вектор.
18. Способ по любому из пп. 1-17, отличающийся тем, что получают клетки для эндотелизации поврежденных сосудов.
Приоритет по пунктам:
21.07.1997 по пп. 1, 3-17;
26.11.1997 по пп. 2 и 18.
21.07.1997 по пп. 1, 3-17;
26.11.1997 по пп. 2 и 18.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19731154A DE19731154C2 (de) | 1997-07-21 | 1997-07-21 | Genetisch veränderte Endothelzellen und deren Verwendung in der Prophylaxe oder Therapie von Erkrankungen |
DE19731154.7 | 1997-07-21 | ||
DE19752299 | 1997-11-26 | ||
DE19752299.8 | 1997-11-26 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU98113791A RU98113791A (ru) | 2000-04-10 |
RU2205029C2 true RU2205029C2 (ru) | 2003-05-27 |
Family
ID=26038441
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU98113791/14A RU2205029C2 (ru) | 1997-07-21 | 1998-07-20 | Генетически измененные клетки и их применение для профилактики или лечения заболеваний |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20020098166A1 (ru) |
EP (1) | EP0893493A3 (ru) |
JP (1) | JPH1189587A (ru) |
KR (1) | KR19990014018A (ru) |
AR (1) | AR015926A1 (ru) |
AU (1) | AU757960B2 (ru) |
BR (1) | BR9802542A (ru) |
CA (1) | CA2237698A1 (ru) |
CZ (1) | CZ227198A3 (ru) |
HU (1) | HUP9801634A3 (ru) |
ID (1) | ID20600A (ru) |
PL (1) | PL327624A1 (ru) |
RU (1) | RU2205029C2 (ru) |
TR (1) | TR199801395A2 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2573906C2 (ru) * | 2008-11-25 | 2016-01-27 | Оцука Фармасьютикал Ко., Лтд. | Полученная из моноцита человека стволовая клетка для терапевтического применения и способ ее индукции |
Families Citing this family (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2787464B1 (fr) * | 1998-12-21 | 2003-01-10 | Neurotech | Compositions pharmaceutiques comprenant des cellules endotheliales immortalisees pour la detection et/ou le traitement des sources angiogeniques et tout particulierement des cancers |
US6815430B1 (en) | 1999-04-02 | 2004-11-09 | Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. | Gene expression base sequences for therapeutic use and drugs for gene therapy |
ATE364387T1 (de) * | 1999-09-23 | 2007-07-15 | An Go Gen Inc | Zellbasierte gentherapie für das lungensystem |
US20030049635A1 (en) * | 2000-11-08 | 2003-03-13 | City Of Hope | Measurement of mutation load using the p53 gene in human cells from paraffin embedded tissues |
ZA200305980B (en) | 2001-02-12 | 2007-01-31 | Res Dev Foundation | Modified proteins, designer toxins, and methods of making thereof |
EP1414471B1 (en) | 2001-07-17 | 2012-06-13 | Research Development Foundation | Therapeutic agents comprising pro-apoptotic proteins |
WO2003078597A2 (en) * | 2002-03-15 | 2003-09-25 | Duke University | Tissue engineering |
WO2003084385A2 (en) * | 2002-04-02 | 2003-10-16 | William Marsh Rice University | Redifferentiated cells for repairing cartilage defects |
IL165250A0 (en) * | 2002-05-16 | 2005-12-18 | Absorber Ab | Methods of donor specific crossmatching |
WO2005010157A2 (en) * | 2003-07-15 | 2005-02-03 | Cedars-Sinai Medical Center | Use of pleiotrophin in the diagnosis, treatment and prevention of disease |
KR100676922B1 (ko) * | 2005-06-29 | 2007-02-05 | 정하철 | 혈 표시용 반지 |
US8883507B2 (en) | 2005-10-18 | 2014-11-11 | The Regents Of The University Of Colorado | Conditionally immortalized long-term hematopoietic stem cells and methods of making and using such cells |
AU2008307643B9 (en) * | 2007-09-28 | 2014-04-17 | Intrexon Corporation | Therapeutic gene-switch constructs and bioreactors for the expression of biotherapeutic molecules, and uses thereof |
KR101803099B1 (ko) * | 2008-05-16 | 2017-11-30 | 타이가 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 | 항체 및 그 제조 방법 |
ES2525411T3 (es) * | 2008-07-21 | 2014-12-22 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Células anucleadas diferenciadas y método para preparar las mismas |
JP5812861B2 (ja) | 2008-08-28 | 2015-11-17 | タイガ バイオテクノロジーズ,インク. | Mycの修飾物質、該mycの修飾物質を使用する方法、およびmycを調節する薬剤を同定する方法 |
IN2012DE01792A (ru) | 2012-06-11 | 2015-10-16 | Council Scient Ind Res | |
EP3868387A1 (en) | 2012-07-20 | 2021-08-25 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Enhanced reconstitution and autoreconstitution of the hematopoietic compartment |
US9365825B2 (en) | 2013-03-11 | 2016-06-14 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Expansion of adult stem cells in vitro |
US10272115B2 (en) | 2013-03-11 | 2019-04-30 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Production and use of red blood cells |
CA2999140A1 (en) | 2015-09-24 | 2017-03-30 | Cellect Biotherapeutics Ltd. | Methods for propagating mesenchymal stem cells (msc) for use in transplantation |
WO2018102678A1 (en) | 2016-12-02 | 2018-06-07 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Nanoparticle formulations |
US10149898B2 (en) | 2017-08-03 | 2018-12-11 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Methods and compositions for the treatment of melanoma |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2107559A1 (en) * | 1991-04-04 | 1992-10-05 | Edwin W. Ades | Immortalization of endothelial cells |
FR2681609B1 (fr) * | 1991-09-24 | 1994-12-30 | Centre Nat Rech Scient | Lignees de cellules endotheliales cerebrales immortalisees, leur procede de preparation et leurs applications en tant que modele d'etude de la physiopathologie cerebrale. |
-
1998
- 1998-07-15 EP EP98113137A patent/EP0893493A3/de not_active Withdrawn
- 1998-07-17 AR ARP980103512A patent/AR015926A1/es unknown
- 1998-07-17 ID IDP981018A patent/ID20600A/id unknown
- 1998-07-20 CZ CZ982271A patent/CZ227198A3/cs unknown
- 1998-07-20 TR TR1998/01395A patent/TR199801395A2/xx unknown
- 1998-07-20 RU RU98113791/14A patent/RU2205029C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-07-20 CA CA002237698A patent/CA2237698A1/en not_active Abandoned
- 1998-07-20 AU AU77466/98A patent/AU757960B2/en not_active Ceased
- 1998-07-20 HU HU9801634A patent/HUP9801634A3/hu unknown
- 1998-07-21 US US09/119,659 patent/US20020098166A1/en not_active Abandoned
- 1998-07-21 JP JP10205261A patent/JPH1189587A/ja active Pending
- 1998-07-21 KR KR1019980029235A patent/KR19990014018A/ko not_active Application Discontinuation
- 1998-07-21 BR BR9802542-2A patent/BR9802542A/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-07-21 PL PL98327624A patent/PL327624A1/xx not_active Application Discontinuation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
THOMPSON et al. Heparin - binding grouth factor 1 induced the formation of organoid neovascular structures in vivo. PNAS USA. - 1989, v.86, pp.7928-7932. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2573906C2 (ru) * | 2008-11-25 | 2016-01-27 | Оцука Фармасьютикал Ко., Лтд. | Полученная из моноцита человека стволовая клетка для терапевтического применения и способ ее индукции |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HUP9801634A2 (hu) | 1999-06-28 |
AR015926A1 (es) | 2001-05-30 |
HUP9801634A3 (en) | 2003-07-28 |
HU9801634D0 (en) | 1998-09-28 |
BR9802542A (pt) | 2000-01-11 |
AU7746698A (en) | 1999-02-04 |
ID20600A (id) | 1999-01-21 |
EP0893493A3 (de) | 2002-12-04 |
CZ227198A3 (cs) | 1999-02-17 |
CA2237698A1 (en) | 1999-01-21 |
EP0893493A2 (de) | 1999-01-27 |
KR19990014018A (ko) | 1999-02-25 |
US20020098166A1 (en) | 2002-07-25 |
JPH1189587A (ja) | 1999-04-06 |
AU757960B2 (en) | 2003-03-13 |
TR199801395A2 (xx) | 1999-02-22 |
PL327624A1 (en) | 1999-02-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2205029C2 (ru) | Генетически измененные клетки и их применение для профилактики или лечения заболеваний | |
Haskill et al. | Adherence induces selective mRNA expression of monocyte mediators and proto-oncogenes. | |
CN101792732A (zh) | 人多能干细胞生长和分化的技术 | |
JP6861438B2 (ja) | Ets転写因子を発現する改変内皮細胞 | |
US6380170B1 (en) | Nucleic acid construct for the cell cycle regulated expression of structural genes | |
US6576758B1 (en) | Nucleic acid constructs containing hybrid promoters | |
WO2009139413A1 (ja) | サイトカイン誘導キラー細胞含有細胞集団の製造方法 | |
US6033856A (en) | Promoter of the cdc25B gene, its preparation and use | |
AU745614B2 (en) | Oncogene- or virus-controlled expression systems | |
JP3410738B2 (ja) | ミクログリアからなる医薬用キャリアー | |
MXPA98005835A (en) | Cells genetically modified and their utilization in prophylaxy or therapy of the enfermeda | |
DE19731154C2 (de) | Genetisch veränderte Endothelzellen und deren Verwendung in der Prophylaxe oder Therapie von Erkrankungen | |
AU717974B2 (en) | Transduced human hematopoietic stem cells | |
CN116731972A (zh) | 嵌合抗原受体t细胞、制备方法及其用途 | |
AU2005200383B2 (en) | TGFbeta1-responsive cells from bone marrow | |
EP0859008A2 (en) | Nucleic acid construct for the cell cycle regulated expression of structural genes | |
Nordon et al. | Summary and Future Directions | |
MXPA98001957A (en) | Promoter of the cdc25b gene, its preparation and |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20040721 |