CN116731972A - 嵌合抗原受体t细胞、制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了新型嵌合抗原受体T细胞、制备方法及其用途，其中包括对CAR结构的设计和调控CAR‑T细胞的基因表达，从而增强CAR‑T细胞的存活时间、增殖和杀伤能力，并降低副作用；同时，加入自杀基因，增强CAR‑T细胞的可控性；其还包括靶向FAP、CD248的CAR‑T细胞的制备和对心力衰竭等纤维化相关疾病的治疗，以及靶向uPAR的CAR‑T细胞的制备和对衰老的治疗。

Description

嵌合抗原受体T细胞、制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及医学免疫学技术领域，更具体地说，它涉及嵌合抗原受体T细胞、制备方法及其用途。

背景技术

T细胞作为淋巴细胞的主要组分，具有强大的免疫功能，可直接识别并杀伤靶细胞；也可释放淋巴因子，增强细胞杀伤能力或辅助B细胞产生抗体。当外源细胞或者有害细胞出现在体内时，抗原呈递细胞(APC)会识别其抗原并传递给T细胞，与T细胞表面受体(TCR)结合后激活T细胞，从而杀伤靶细胞。

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)可表达人工设计的CAR结构。CAR结构分为抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和胞内结构域。CAR能特异性识别并结合靶细胞抗原，代替TCR的功能激活T细胞，从而杀伤靶细胞。CAR-T细胞的靶向性由人工设计决定，因此其理论上可杀伤任何预期细胞(如图1)。

CAR-T细胞在体内的存活时间较短、增殖能力较弱，为了保证治疗效果需要注射大量细胞，并多次注射。这导致了CAR-T细胞昂贵的治疗成本，同时也增加了设计治疗方案的难度。但CAR-T细胞存活时间过长，则导致治疗结束后CAR-T细胞依旧存在，可能诱发其他副作用。此外，CAR-T细胞杀伤靶细胞时会产生大量的白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素6(IL-6)等细胞因子，诱发细胞因子风暴(CRS)，导致全身炎症和神经毒性等副作用。因此，探索增加CAR-T细胞寿命、增殖水平以及减少副作用的方法至关重要。

纤维化是机体受到损伤或者病变时非常常见的一种生理病理过程，其是射血分数保留心力衰竭(HFpEF)、射血分数中间范围型心力衰竭(HFmrEF)、射血分数降低心力衰竭(HFrEF)、特发性肺纤维化、肝硬化、和肾病等多种疾病的重要特征。成纤维细胞、周细胞等受到机体损伤、病变等刺激后将分化为肌成纤维细胞，从而分泌大量胶原纤维。肌成纤维细胞会特异性表达大量的成纤维细胞活化蛋白(FAP)和内皮唾液酸蛋白(CD248)，而这些标志物几乎不在其他正常细胞中表达。因此，靶向FAP或者CD248的CAR-T细胞可靶向并杀伤肌成纤维细胞，降低纤维化程度，从而治疗HFpEF、HFmrEF、HFrEF、特发性肺纤维化、肝硬化、和肾病。

衰老是机体不可避免的一种生理过程。机体衰老最初表现为细胞的老化。老化细胞会特异性表达大量的尿激酶纤溶酶原激活剂受体(uPAR)，并不利于机体发挥正常功能。因此，靶向uPAR的CAR-T细胞可靶向并杀伤老化细胞，从而缓解机体的衰老。此外，其还可治疗特发性肺纤维化、肝纤维化、动脉粥样硬化、糖尿病、骨关节炎等衰老引起的并发症。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明在于提供嵌合抗原受体T细胞、制备方法及其用途。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一方面，本发明提供了嵌合抗原受体T细胞，包括向T细胞导入用于编码CAR的核酸和调控CAR-T细胞基因表达的核酸；所述调控CAR-T细胞基因表达包括上调内源基因表达、下调内源基因表达和加入自杀基因；所述CAR的结构包括抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、胞内结构域，所述抗原结合结构域特异性识别并结合靶细胞上的抗原，激活胞内结构域；所述胞内结构域包括共刺激域和信号传导域。CAR-T细胞可减少纤维化，从而治疗射血分数保留心力衰竭(HFpEF)、射血分数中间范围型心力衰竭(HFmrEF)、射血分数降低心力衰竭(HFrEF)、特发性肺纤维化、肝硬化、和肾病；或者，杀伤衰老化细胞，延缓机体衰老。

作为优选，所述胞内结构域用于传递并放大单链抗体的激活信号，从而激活T细胞并杀伤靶细胞。

作为优选，所述共刺激域包括：CD28、4-1BB、2B4；所述信号传导域包括CD3 zeta。其中，CD28能带来短期、强效的杀伤能力；而4-1BB能带来持久的杀伤能力。

作为优选，所述抗原结合结构域包括：scFv；所述铰链结构域包括CD8和CD28；所述跨膜结构域包括CD8、CD28、NKG2D、proMP。CAR的抗原结合结构域由FAP、CD248、uPAR中的一种的scFv构成，可特异性识别并结合表达相应抗原的靶细胞；所述单链抗体的类型基于所述靶细胞上抗原的种类和数量确定；所述单链抗体特异性结合所述靶细胞的影响因素包括：铰链结构域的类型和长度。

所述跨膜结构域用于穿过细胞膜，将所述CAR锚定在细胞膜上；其中，proMP可减小CAR-T细胞副作用。

另一方面，本发明还提供了嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括如下步骤：提取淋巴细胞；对所述淋巴细胞进行分选和纯化后获得T细胞；将编码CAR的核酸导入T细胞生成CAR-T细胞；对所述CAR-T细胞的基因表达进行调控。通过调控CAR-T细胞基因表达，可增强CAR-T细胞的存活时间、增殖和杀伤能力，并降低CAR-T细胞的副作用。

作为优选，对所述淋巴细胞进行分选和纯化后还包括；对纯化后获得的T细胞进行激活和扩增。进一步的，对所述淋巴细胞进行纯化、激活、扩增的步骤中包括：使用CD3磁珠对所述淋巴细胞进行纯化，使用CD3/CD28磁珠激活所述T细胞，使用含白细胞介素2(IL2)的培养基扩增所述T细胞。

作为优选，所述淋巴细胞提取于外周血或者脾脏。

作为优选，所述编码CAR的核酸的导入包括：使用含CAR核酸序列的慢病毒或逆转录病毒转染所述T细胞，以得到CAR-T细胞。使用慢病毒或逆转录病毒转染，将能够编码IL15、IL7、CCR2、Bcl-2、HSV-TK、iCasp9、利妥昔单抗结合表位的核酸导入CAR-T细胞，实现相应基因的上调以及插入。

作为优选，对所述CAR-T细胞的基因表达进行调控包括：上调内源基因表达、加入自杀基因和下调内源基因表达。

作为优选，所述上调内源基因表达和加入自杀基因步骤包括：在CAR核酸序列之后插入第一目的基因序列和自杀基因序列得到目标基因序列，再使用包含所述目标基因序列的慢病毒或逆转录病毒转染所述CAR-T细胞。

作为优选，所述下调内源基因表达包括：使用CRISPR/Cas 9技术敲除第二目的基因序列。

作为优选，所述第一目的基因包括白细胞介素15(IL15)、白细胞介素7(IL7)、CC趋化因子受体2(CCR2)、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)；所述自杀基因包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、诱导性半胱天冬酶9(iCasp-9)、利妥昔单抗结合表位。

作为优选，所述第二目的基因包括：雌激素受体结合片段相关抗原9(EBAG9)、RASGTP酶激活蛋白2(RASA2)、CD7、白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素6(IL-6)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

上调CAR-T细胞的白细胞介素15(IL15)、白细胞介素7(IL7)、CC趋化因子受体2(CCR2)、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)中的一种，以及下调雌激素受体结合片段相关抗原9(EBAG9)、RAS GTP酶激活蛋白2(RASA2)中的一种或可增强CAR-T细胞的存活时间、增殖和杀伤能力。

下调CAR-T细胞的CD7、IL-1、IL-6和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)中的一种可减少CAR-T细胞的细胞因子风暴、神经毒性等副作用。

向CAR-T细胞导入单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、诱导性半胱天冬酶9(iCasp-9)、利妥昔单抗结合表位中的一种，可作为CAR-T细胞的自杀基因，增强CAR-T细胞的可控性。

上述所述的嵌合抗原受体T细胞在制备减少纤维化或延缓衰老的药物中的用途。

作为优选，靶向成纤维细胞活化蛋白(FAP)或内皮唾液酸蛋白(CD248)的CAR-T细胞在制备减少纤维化的药物中的用途。

作为优选，用于减少纤维化的包含有所述CAR-T细胞的药物治疗心力衰竭(包括：HFpEF、HFmrEF、HFrEF)、特发性肺纤维化、肝硬化、和肾病。

作为优选，靶向尿激酶纤溶酶原激活剂受体(uPAR)的CAR-T细胞在制备延缓机体衰老的药物中的用途。

作为优选，CAR-T细胞采用静脉注射的方式运输至体内；注射量为10⁵-10¹¹个/次，每1-6周注射一次，一共注射1-6次，具体可根据患者使用情况进行调整。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供了新型CAR-T细胞，其增强了CAR-T细胞的存活时间、增殖和杀伤能力，降低了CAR-T细胞的副作用；

2、本发明设计了CAR-T细胞的自杀基因，增强了CAR-T细胞的可控性；

3、本发明中靶向FAP或者CD248的CAR-T细胞可减少组织纤维化，从而改善HFpEF、HFmrEF、HFrEF、特发性肺纤维化、肝硬化、和肾病；

4、本发明中靶向uPAR的CAR-T细胞可延缓机体的衰老过程，并可治疗特发性肺纤维化、肝纤维化、动脉粥样硬化、糖尿病、骨关节炎等衰老相关并发症。

附图说明

图1：CAR-T细胞示意图及作用机制；

CAR结构的scFv可特异性识别并结合靶细胞抗原，并诱导共刺激结构域和信号传导域(CD3 zeta)释放激活信号，从而活化T细胞；T细胞活化后释放IL2，大量增殖；同时释放穿孔素和颗粒酶等细胞杀伤因子，从而杀伤靶细胞；CAR：嵌合抗原受体，scFv：单链抗体，ITAM：免疫受体络氨酸激活序列，IL2：白细胞介素2；

图2：新型CAR-T细胞的设计和制备；

A：新型CAR的结构设计示意图；B：CAR-T细胞的制备流程：使用CD3磁珠从淋巴细胞中分选T细胞；并在培养基中使用CD3/CD28磁珠激活和IL2激活、扩增T细胞；再加入含CAR的核酸的慢病毒或逆转录转染T细胞，经过进一步的培养、扩增最后得到CAR-T细胞；

图3：靶向FAP和CD248的CAR-T细胞可显著减少组织纤维化；

A：马松染色的代表性图像(红色：细胞质，蓝色：胶原纤维)；B：胶原纤维面积占比的定量分析；C：I型胶原纤维和III型胶原纤维的mRNA相对表达；C：对照组；F：纤维化组；CART：CAR-T细胞治疗组；*P<0.05。

具体实施方式

参照附图对本发明做进一步说明。

本发明的具体实施方式主要包括CAR-T细胞的制备和CAR-T细胞的治疗方法。

一、CAR-T细胞的制备(如图2所示)

1、T细胞的获取

从外周血单个核细胞(PBMC)或脾脏中提取出淋巴细胞。使用CD3磁珠从淋巴细胞中分选出T细胞，并使用含10％胎牛血清(FBS)、50μMβ-巯基乙醇、1mM丙酮酸钠、1％青-链霉素的RPMI 1640培养基；之后将CD3/CD28激活磁珠和100U/mL白介素2(IL2)加入培养基中激活、扩增T细胞。培养环境为37℃、95％空气、5％ CO₂。

2、编码CAR的核酸的获得

CAR的抗原结合结构域由FAP、CD248、uPAR中的一种的scFv构成。scFv由相应抗体可变区的一条重链和一条轻链组成，并使用连接肽将重链轻链相连；连接肽为甘氨酸和丝氨酸的多聚体。铰链结构域由CD8、CD28中的一种构成。CD8、CD28、NKG2D、proMP中的一种构成。CAR的共刺激域由CD28、4-1BB、2B4中的一种构成。CAR的信号传导域由CD3 zeta构成。

此外，CAR的最前端还有一段CD8构成的信号肽，可将T细胞合成好的CAR运输至预期位置。根据需要选择及设计好CAR的核酸序列后，通过人工基因合成的方法获得编码CAR的核酸。

3、内源基因表达的上调以及自杀基因的导入

使用PCR技术得到第一目的基因和自杀基因的核酸后，通过酶切连接技术将其接入到CAR核酸序列之后，并使用T2A、P2A序列将CAR、第一目的基因、自杀基因单独翻译和表达，得到新型的编码CAR的核酸。第一目的基因包括：IL15、IL7、CCR2、Bcl-2。自杀基因包括：HSV-TK、iCasp-9、利妥昔单抗结合表位。

4、将新型的编码CAR的核酸导入T细胞

得到新型的编码CAR的核酸后，通过酶切连接的方式将其导入慢病毒或逆转录病毒的转移质粒(含有慢病毒或逆转录病毒的基因组序列等)中，之后进行病毒的包装。将转移质粒、包装质粒(含慢病毒或逆转录病毒衣壳蛋白、结构蛋白等)和膜蛋白质粒(含慢病毒或逆转录病毒外膜等)一起转染293T细胞，最后得到包装好的含新型的CAR的核酸的慢病毒或逆转录病毒。

T细胞被激活48小时后，将细胞接种到RetroNectin(5ug/cm)包被的24孔板中。之后加入含新型的CAR的核酸的病毒和Polybrene(7ug/ml)转染T细胞；在室温下1000g离心1小时后将细胞放入培养箱中。孵育过夜后，更换新鲜培养基扩增T细胞，最终获得CAR-T细胞。

5、下调CAR-T细胞内源基因表达

通过CRISPR/Cas 9技术下调CAR-T细胞内源基因的表达。设计好第二目的基因的gRNA序列后，使用人工基因合成的方法得到gRNA序列对应的DNA片段，并使用PCR技术得到Cas9的核酸。通过酶切连接技术将其中一种第二目的基因的gRNA的DNA片段与Cas9的核酸相连，再将其通过慢病毒或者逆转录病毒导入CAR-T细胞，从而实现CAR-T细胞内源基因表达的下调。第二目的基因包括：EBAG9、RASA2、CD7、IL-1、IL-6和GM-CSF。

二、CAR-T细胞的治疗方法

1、CAR-T细胞对纤维化相关疾病的治疗

制备好靶向FAP或者CD248的CAR-T细胞后，采用静脉注射的方式将细胞运输至HFpEF、HFmrEF、HFrEF、特发性肺纤维化、肝硬化、和肾病等患者或动物体内。注射量为10⁵-10¹¹个/次，每1～4周注射一次，一共注射1-6次。治疗完全结束后，可使用AP1903等小分子诱导药物激活CAR-T细胞的自杀基因，诱导CAR-T细胞凋亡。另外，实验结果发现：细胞注射量低于10⁵-10¹¹个/次时，达不到预期的技术效果，高于10⁵-10¹¹个/次时，副作用会增加。

2、CAR-T细胞对衰老及其相关疾病的治疗

制备好靶向uPAR的CAR-T细胞后，采用静脉注射的方式将细胞运输至衰老患者或动物体内。注射量为10⁵-10¹¹个/次，每1-4周注射一次，一共注射1-6次。治疗完全结束后，可使用AP1903等小分子诱导药物激活CAR-T细胞的自杀基因，诱导CAR-T细胞凋亡。同样的，实验结果发现：细胞注射量低于10⁵个/次时，达不到预期的技术效果，高于10¹¹个/次时，副作用会增加，具体可根据患者使用情况进行调整。

上述实施例只为说明本申请的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本申请的内容并据以实施，并不能以此限制本申请的保护范围。凡根据本申请精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

应该理解，以上描述是为了进行图示说明而不是为了进行限制。通过阅读上述描述，在所提供的示例之外的许多实施方式和许多应用对本领域技术人员来说都将是显而易见的。出于全面之目的，所有文章和参考包括专利申请和公告的公开都通过参考结合在本文中。

结果分析：

CAR-T细胞由于其存活时间、增殖能力有限，并具有CRS等副作用，导致其治疗成本较大、存在安全隐患。而我们的结果显示，本发明的新型CAR-T细胞的存活时间、增殖能力、杀伤能力显著增强，CRS等副作用降低。并且，使用AP1903等小分子诱导药物后，自杀基因诱导CAR-T细胞凋亡，增强了CAR-T细胞的可控性。

在HFpEF、HFmrEF、HFrEF、特发性肺纤维化、肝硬化、和肾病等患者和动物中，都出现了显著的组织纤维化。我们的结果显示，靶向FAP的CAR-T细胞和靶向CD248的CAR-T细胞显著减少甚至清除了组织纤维化(如图3所示)，增强了病变器官的功能，从而改善了HFpEF、HFmrEF、HFrEF、特发性肺纤维化、肝硬化、和肾病等纤维化相关疾病。

此外，衰老细胞的产生是引起机体衰老的重要因素。我们的结果显示，靶向uPAR的CAR-T细胞可有效特异性杀伤衰老化细胞，增强了机体机能，从而显著延缓了衰老过程并增加了寿命。同时还改善了特发性肺纤维化、肝纤维化、动脉粥样硬化、糖尿病、骨关节炎等由衰老引起的并发症。

总之，本发明成功增加了CAR-T细胞的存活时间、增殖能力，降低了副作用；并成功制备了可治疗HFpEF、HFmrEF、HFrEF等纤维化相关疾病的CAR-T细胞和延缓衰老的CAR-T细胞。

另外，CD8信号肽、连接肽和T2A等的序列如下：

CD8信号肽(SEQ ID NO：1)：

5‘-ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCT CCACGCCGCTCGGCCC-3’。

连接肽(SEQ ID NO：2)：

5‘-GGCGGCGGAGGAAGCGGAGGCGGAGGATCTGGTGGTGGTGGATCT-3’。

T2A(SEQ ID NO：3)：

5‘-AGGGCAGAGGCAGCCTGCTGACATGTGGCGACGTGGAAGAGAAC CCTGGCCCC-3’

P2A(SEQ ID NO：4)：

5‘-GGAAGCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCTATG-3’

EBAG9 gRNA(SEQ ID NO：5)：5‘-UUUAGACAGAUGUUGAAGAG-3’

RASA2 gRNA(SEQ ID NO：6)：5‘-AUUUUGUGGGGUCCAAGAUA-3’

CD7 gRNA(SEQ ID NO：7)：5‘-CACGGGGACAGUCGUGCAGU-3’

IL-1gRNA(SEQ ID NO：8)：5‘-GCCAUAGCUUACAUGAUAGA-3’

IL-6gRNA(SEQ ID NO：9)：5‘-GGAGAAGGCAACUGGACCGA-3’

GM-CSF gRNA(SEQ ID NO：10)：5‘-GAUCUGCAAGGAGCGGGCAC-3’

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (14)

1.嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，包括向T细胞导入用于编码CAR的核酸和调控CAR-T细胞基因表达的核酸；所述调控CAR-T细胞基因表达包括上调内源基因表达、下调内源基因表达和加入自杀基因；所述CAR的结构包括抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、胞内结构域，所述抗原结合结构域特异性识别并结合靶细胞上的抗原，激活胞内结构域；所述胞内结构域包括共刺激域和信号传导域。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述胞内结构域用于传递并放大单链抗体的激活信号，从而激活T细胞并杀伤靶细胞。

3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述共刺激域包括：CD28、4-1BB、2B4；所述信号传导域包括CD3 zeta。

4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述抗原结合结构域包括：scFv；所述铰链结构域包括CD8和CD28；所述跨膜结构域包括CD8、CD28、NKG2D、proMP。

5.权利要求1～4任一项所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：提取淋巴细胞；对所述淋巴细胞进行分选和纯化后获得T细胞；将编码CAR的核酸导入T细胞生成CAR-T细胞；对所述CAR-T细胞的基因表达进行调控。

6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，对所述淋巴细胞进行分选和纯化后还包括；对纯化后获得的T细胞进行激活和扩增。

7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述淋巴细胞提取于外周血或者脾脏。

8.根据权利要求7所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述编码CAR的核酸的导入包括：使用含CAR核酸序列的慢病毒或逆转录病毒转染所述T细胞，以得到CAR-T细胞。

9.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，对所述CAR-T细胞的基因表达进行调控包括：上调内源基因表达、加入自杀基因和下调内源基因表达。

10.根据权利要求9所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述上调内源基因表达和加入自杀基因步骤包括：在CAR核酸序列之后插入第一目的基因序列和自杀基因序列得到目标基因序列，再使用包含所述目标基因序列的慢病毒或逆转录病毒转染所述CAR-T细胞。

11.根据权利要求9所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述下调内源基因表达包括：使用CRISPR/Cas 9技术敲除第二目的基因序列。

12.根据权利要求10所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述第一目的基因包括IL15、IL7、CCR2、Bcl-2；所述自杀基因包括HSV-TK、iCasp-9、利妥昔单抗结合表位。

13.根据权利要求11所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述第二目的基因包括：EBAG9、RASA2、CD7、IL-1、IL-6和GM-CSF。

14.权利要求1～13任一项所述的嵌合抗原受体T细胞在制备减少纤维化或延缓衰老的药物中的用途，包括靶向FAP或CD248的CAR-T细胞在制备减少纤维化的药物中的用途、和\或靶向uPAR的CAR-T细胞在制备延缓机体衰老的药物中的用途。