CN115948344A - 嵌合抗原受体nk细胞、制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新型嵌合抗原受体NK细胞、制备方法及其用途，其中包括对CAR结构的设计和调控CAR‑NK细胞的基因表达，从而增强CAR‑NK细胞的存活时间、增殖和杀伤能力；同时加入自杀基因，增强CAR‑NK细胞的可控性；其还包括靶向FAP、CD248的CAR‑NK细胞的制备和对心力衰竭等纤维化疾病的治疗；以及靶向uPAR的CAR‑NK细胞的制备和对衰老的治疗。

Description

嵌合抗原受体NK细胞、制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及医学免疫学技术领域，更具体地说，它涉及嵌合抗原受体NK细胞、制备方法及其用途。

背景技术

自然杀伤细胞(NK细胞)是机体重要的免疫细胞，与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节等多种过程有关，是与B、T细胞并列的第三类淋巴细胞。NK细胞对靶细胞的杀伤依靠NK细胞表面的多种受体，其分为激活性受体(KAR)和抑制性受体(KIR)。正常细胞的主要组织相容性复合体(MHC)可结合KIR，抑制NK细胞活性，避免误伤。但异己细胞和有害细胞的MHC会出现丢失或者不匹配，无法抑制NK细胞活性而成为了靶标。还有一部分异己细胞和有害细胞会大量表达KAR配体，直接激活了NK细胞的杀伤。NK细胞激活后产生2种免疫应答：与靶细胞特异性结合，释放穿孔素和颗粒酶，直接杀伤靶细胞；以及释放淋巴因子，增强免疫效应。

嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)指的是人工导入了CAR结构的NK细胞。CAR的结构包括抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、胞内结构域，其能特异性识别靶细胞抗原，直接激活NK细胞并杀伤靶细胞。CAR的靶向目标由人工设计决定，因此CAR-NK细胞有精准定位并杀伤任何预期靶细胞的潜力(如图1)。

但来源于原代NK细胞的CAR-NK细胞在体内的存活时间和增殖能力有限，因此需要较多的注射数量和注射次数。这增加了CAR-NK细胞的制备成本，同时也增加了个体差异导致的治疗过程的不确定性。来源于NK细胞系的CAR-NK细胞尽管可无限增殖，降低了制备成本，但其杀伤能力较低；并且其在体内的无限增殖将带来安全隐患。因此，存在对增强CAR-NK细胞存活时间、增殖能力以及降低安全隐患的方法的需要。

多种组织或者器官受到损伤以及发生病变时，内部的成纤维细胞、周细胞等被激活，分化为肌成纤维细胞，引起组织大量纤维化，是射血分数保留心力衰竭(HFpEF)、射血分数中间范围型心力衰竭(HFmrEF)、射血分数降低心力衰竭(HFrEF)、特发性肺纤维化、肝硬化、和肾病等疾病的重要发病因素。成纤维细胞活化蛋白(FAP)和内皮唾液酸蛋白(CD248)是肌成纤维细胞的特异性标志物，仅在肌成纤维细胞中大量表达，不表达或很低表达于机体其他正常细胞中。因此，靶向FAP或者CD248的CAR-NK细胞具有特异性杀伤肌成纤维细胞，减少甚至清除组织纤维化，从而治疗HFpEF、HFmrEF、HFrEF、特发性肺纤维化、肝硬化、和肾病的潜力。

人体中细胞的衰老将逐渐导致机体的衰老。衰老的细胞将特异性高表达尿激酶纤溶酶原激活剂受体(uPAR)。因此，靶向uPAR的CAR-NK细胞具有特异性杀伤衰老化细胞，延缓机体衰老过程的潜力，并有改善特发性肺纤维化、肝纤维化、动脉粥样硬化、糖尿病、骨关节炎等衰老相关并发症的潜力。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明在于提供嵌合抗原受体NK细胞、制备方法及其用途。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一方面，本发明提供了嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，包括向NK细胞导入用于编码CAR的核酸和调控CAR-NK细胞基因表达的核酸；所述调控CAR-NK细胞基因表达包括上调内源基因表达、下调内源基因表达和加入自杀基因；所述CAR的结构包括抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、胞内结构域，所述抗原结合结构域特异性识别并结合靶细胞上的抗原，激活胞内结构域。CAR-NK细胞可减少纤维化，从而治疗射血分数保留心力衰竭(HFpEF)、射血分数中间范围型心力衰竭(HFmrEF)、射血分数降低心力衰竭(HFrEF)、特发性肺纤维化、肝硬化、和肾病，或杀伤衰老化细胞，延缓机体衰老。

作为优选，所述抗原结合结构域包括：单链抗体(scFv)。CAR的抗原结合结构域由FAP、CD248、uPAR中的一种的scFv构成，可特异性识别并结合表达相应抗原的靶细胞。所述单链抗体的类型基于所述靶细胞上抗原的种类和数量确定；所述单链抗体特异性结合所述靶细胞的影响因素包括：铰链结构域的类型和长度。

作为优选，所述铰链结构域用于连接单链抗体和跨膜结构域，其包括CD8和CD28。

作为优选，所述跨膜结构域用于穿过细胞膜，将所述CAR锚定在细胞膜上，其包括CD8、CD28、NKG2D、程序化膜蛋白(proMP)。其中，proMP可减小CAR-T细胞副作用。

作为优选，所述胞内结构域用于传递并放大单链抗体的激活信号，从而激活NK细胞并杀伤靶细胞，其包括共刺激域和信号传导域。

作为优选，所述共刺激域包括：CD28、肿瘤坏死因子受体超家族成员9重组蛋白(4-1BB)、2B4。其中，CD28能带来短期、强效的杀伤能力；而4-1BB能带来持久的杀伤能力。

作为优选，所述信号传导域包括CD3 zeta。

另一方面，本发明还提供了嵌合抗原受体NK细胞的制备方法，包括如下步骤：提取NK细胞；将编码CAR的核酸导入NK细胞获得CAR-NK细胞；对所述CAR-NK细胞基因表达进行调控。通过调控CAR-NK细胞基因表达，可增强CAR-NK细胞的存活时间、增殖和杀伤能力，并降低CAR-NK细胞安全隐患。

作为优选，提取NK细胞包括：获取原代NK细胞或NK细胞系；或者，所述获取NK细胞系包括：使用NK-92、NK-92MI等细胞系，使用相应培养基扩增。NK细胞来源于外周血、脐带血或者NK-92、NK92MI等细胞系。

作为优选，所述获取原代NK细胞包括：从外周血或脐带血中提取淋巴细胞，使用CD56磁珠分选出NK细胞，使用含白细胞介素2(IL2)的培养基扩增NK细胞。

作为优选，所述编码CAR的核酸的导入包括：使用含CAR核酸序列的慢病毒或逆转录病毒转染所述NK细胞，以得到CAR-NK细胞。使用慢病毒或逆转录病毒转染，将能够编码IL15、IL7、CCR2、Bcl-2、MCL1、CD16、HSV-TK、iCasp9、利妥昔单抗结合表位的核酸导入CAR-NK细胞，实现相应基因的上调以及插入。

作为优选，对所述CAR-NK细胞的基因表达进行调控包括：上调内源基因表达、加入自杀基因和下调内源基因表达。

作为优选，所述上调内源基因表达和加入自杀基因步骤包括：在CAR核酸序列之后插入第一目的基因序列和自杀基因序列得到目标基因序列，再使用包含所述目标基因序列的慢病毒或逆转录病毒转染所述CAR-NK细胞。

作为优选，所述下调内源基因表达包括：使用CRISPR/Cas 9技术敲除第二目的基因序列。使用CRISPR/Cas 9系统可敲除EBAG9、RASA2。

作为优选，所述第一目的基因包括：白细胞介素15(IL15)、白细胞介素7(IL7)、CC趋化因子受体2(CCR2)、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、髓样细胞白血病蛋白1(MCL1)、CD16；所述自杀基因包括：单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、诱导性半胱天冬酶9(iCasp-9)、利妥昔单抗结合表位。

作为优选，所述第二目的基因包括：雌激素受体结合片段相关抗原9(EBAG9)、RASGTP酶激活蛋白2(RASA2)。

上调CAR-NK细胞的白细胞介素15(IL15)、白细胞介素7(IL7)、CC趋化因子受体2(CCR2)、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、髓样细胞白血病蛋白1(MCL1)、CD16中的一种，以及下调雌激素受体结合片段相关抗原9(EBAG9)、RAS GTP酶激活蛋白2(RASA2)中的一种或可增强CAR-NK细胞的存活时间、增殖和杀伤能力。

向CAR-NK细胞导入单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、诱导性半胱天冬酶9(iCasp-9)、利妥昔单抗结合表位中的一种，可作为CAR-NK细胞的自杀基因，增强CAR-NK细胞的可控性。

上述所述的嵌合抗原受体NK细胞在制备减少纤维化或延缓衰老的药物中的用途。

作为优选，靶向成纤维细胞活化蛋白(FAP)或内皮唾液酸蛋白(CD248)的CAR-NK细胞在制备减少纤维化的药物中的用途。

作为优选，用于减少纤维化包含有所述CAR-NK细胞的药物治疗心力衰竭(包括：HFpEF、HFmrEF、HFrEF)、特发性肺纤维化、肝硬化、和肾病。

作为优选，靶向尿激酶纤溶酶原激活剂受体(uPAR)的CAR-NK细胞在制备延缓机体衰老的药物中的用途。

作为优选，CAR-NK细胞采用静脉注射的方式运输至体内；注射量为10⁵-10¹¹个/次，每1-4周注射一次，一共注射1-6次，具体可根据患者使用情况进行调整。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供了新型CAR-NK细胞，其增强了CAR-NK细胞的存活时间、增殖和杀伤能力，降低了CAR-NK细胞的副作用；

2、本发明设计了CAR-NK细胞的自杀基因，增强了CAR-NK细胞的可控性；

3、本发明中靶向FAP或者CD248的CAR-NK细胞可减少组织纤维化，从而改善HFpEF、HFmrEF、HFrEF、特发性肺纤维化、肝硬化、和肾病；

4、本发明中靶向uPAR的CAR-NK细胞可延缓机体的衰老过程，并可治疗特发性肺纤维化、肝纤维化、动脉粥样硬化、糖尿病、骨关节炎等衰老相关并发症。

附图说明

图1：CAR-NK细胞示意图及作用机制；

CAR结构的scFv可特异性识别并结合靶细胞抗原，并诱导共刺激结构域和信号传导域(CD3 zeta)释放激活信号，从而活化NK细胞；NK细胞活化后释放IL2，大量增殖；同时释放穿孔素和颗粒酶等细胞杀伤因子，从而杀伤靶细胞；CAR：嵌合抗原受体，scFv：单链抗体，ITAM：免疫受体络氨酸激活序列，IL2:白细胞介素2；

图2：新型CAR-NK细胞的设计和制备；

A：新型CAR的结构设计示意图；B：CAR-NK细胞的制备流程：使用CD56磁珠从淋巴细胞中分选出原代NK细胞；或直接使用NK-92等细胞系；并在培养基中使用IL2扩增NK细胞；再加入含CAR的核酸的慢病毒或逆转录转染NK细胞，经过进一步的培养、扩增最后得到CAR-NK细胞；

图3：靶向FAP和CD248的CAR-NK细胞可显著减少组织纤维化；

A：马松染色的代表性图像(红色：细胞质，蓝色：胶原纤维)；B：胶原纤维面积占比的定量分析；C：I型胶原纤维和III型胶原纤维的mRNA相对表达；C：对照组；F：纤维化组；CARNK：CAR-NK细胞治疗组；*P<0.05。

具体实施方式

参照附图对本发明做进一步说明。

定义：

提供以下定义以更好界定本发明并指导本领域普通技术人员实施本发明。除非另有说明，术语根据相关领域普通技术人员的常规用法理解。

术语“CRISPR”是指成簇的规律间隔的短回文重复序列。CRISPR最初被描述为含有短重复碱基序列的原核DNA片段。在回文重复序列中，核苷酸的序列在两个方向上是相同的。每个重复序列之后是来自于先前暴露于外源DNA(例如病毒或质粒)的间隔区DNA短片段。CRISPR位点通常由以下组成：一组成簇的CRISPR-相关(Cas)基因和特征性的CRISPR阵列-由可变序列(间隔区)间隔的一系列重复序列(直接重复序列)，所述可变序列对应于外源基因组元件中的序列(原间隔区)。当Cas基因翻译为蛋白质，大多数CRISPR阵列首先转录为单个RNA，其随后被加工成较短的CRISPR RNA(crRNA)，所述crRNA引导某些Cas酶靶向并降解目标核酸片段。

术语“CRISPR/Cas系统”是指赋予对外源基因组元件(例如质粒和噬菌体中存在的那些)抗性的原核免疫系统，其提供一种形式的获得性免疫。通常，CRISPR/Cas系统包含至少一个Cas核酸内切酶和向导RNA。携带间隔序列的RNA帮助Cas(CRISPR-相关)蛋白识别并切割外源DNA。因此，当Cas蛋白质是Cas 9时，该系统称为CRISPR/Cas 9系统。

术语“Cas9”是指在化脓性链球菌中发现的一种Cas蛋白质。Cas 9核酸内切酶可与CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)两个小RNA分子组成复合体，从而切割目标核酸。

术语“CAR”或“嵌合抗原受体”是指将任意特异性抗原抗体移植到免疫效应细胞(T细胞)上并添加相应功能元件，从而形成的工程化受体。通常，这种受体可赋予T细胞人工设定的靶向性和特异性，其中通过逆转录病毒载体促进其编码序列的转移。这种受体被称为嵌合体，因为它们由不同来源的部分组成。

术语“CAR-T细胞”或“嵌合抗原受体T细胞”是指具有嵌合抗原受体的工程化T细胞，其对所选靶标具有预定义的靶向性和特异性。一旦遇到靶细胞，例如癌细胞，CAR-T细胞通过例如以下机制破坏癌细胞：广泛刺激的细胞增殖、增加细胞对其他活细胞有毒的程度(即细胞毒性)，和增加由免疫系统中的细胞分泌的因子的产生，这些因子对生物体内的其他细胞有影响。

“单链抗体”和“scFv”在本文中可互换使用，是指由抗体可变区重链(VH)和可变区轻链(VL)通过连接肽连接而成的抗体。可以选择连接肽的最佳长度和/或氨基酸组成。连接肽的长度会明显影响scFv的可变区折叠和相互作用情况。事实上，如果使用较短的连接肽(例如在5-10个氨基酸之间)，则可以防止链内折叠。关于连接肽的大小和组成的选择。

术语“铰链区”一般是指作用为连接跨膜结构域至抗原结合区的任何寡肽或多肽。具体地，铰链区用来为抗原结合区提供更大的灵活性和可及性。铰链区可以包含最多达300个氨基酸，优选10至100个氨基酸并且最优选25至50个氨基酸。铰链区可以全部或部分源自天然分子，如全部或部分源自CD8、CD4或CD28的胞外区，或全部或部分源自抗体恒定区。或者，铰链区可以是对应于天然存在的铰链序列的合成序列，或可以是完全合成的铰链序列。

术语“跨膜结构域”是指能够使嵌合抗原受体在免疫细胞(例如淋巴细胞、NK细胞或NKT细胞)表面上表达，并且引导免疫细胞针对靶细胞的细胞应答的多肽结构。跨膜结构域可以是天然或合成的，也可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。当嵌合抗原受体与靶抗原结合时，跨膜结构域能够进行信号传导。

术语“4-1BB”是指具有如GenBank登录号AAA62478.2所提供的氨基酸序列或来自非人物种，例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等效残基的TNFR超家族的成员；并且“4-1BB共刺激性结构域”定义为GenBank登录号AAA62478.2的氨基酸残基214-255，或来自非人物种，例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等效残基。

2B4也称为CD244，是一种膜蛋白，广泛表达于NK细胞、CD8⁺T细胞、单核细胞和粒细胞表面。2B4的胞外区具有一个V型免疫球蛋白结构域和一个C2型免疫球蛋白样结构域，跨膜区不含任何带电荷的氨基酸，胞内区含有免疫受体酪氨酸转换基序(Immunoreceptortyrosine-based inhibitory switch motif,ITSM)，该基序可被衔接蛋白SAP、EAT-2、DRT等的胞质SH2区域识别。2B4交联使ITSM中的酪氨酸磷酸化，并募集衔接蛋白，其中2B4与SAP形成的复合物可以激活NK细胞。2B4并不是独立的受体，其作为NK细胞的辅助活化性受体，启动依赖于同其他NCR受体的共同作用。2B4的配体是CD48，高表达于造血细胞系和部分B淋巴细胞上。

本发明的具体实施方式主要包括CAR-NK细胞的制备和CAR-NK细胞的治疗方法。

一、CAR-NK细胞的制备(如图2所示)

1.NK细胞的获取

从人或动物外周血、脐带血提取出淋巴细胞。使用CD56磁珠从淋巴细胞中分选出NK细胞。或直接使用NK-92、NK-92MI等细胞系。将细胞放入含0.2mM肌醇、0.1mMβ-巯基乙醇、0.02mM、200U/mL白介素2(IL2)、12.5％马血清、12.5％胎牛血清、1％青-链霉素的MEMα培养基中扩增。培养环境为37℃、95％空气、5％ CO2。

2.编码CAR的核酸的获得

CAR的抗原结合结构域由FAP、CD248、uPAR中的一种的scFv构成。scFv由相应抗体可变区的一条重链和一条轻链组成，并使用连接肽将重链轻链相连；连接肽为甘氨酸和丝氨酸的多聚体。铰链结构域由CD8、CD28中的一种构成。CD8、CD28、NKG2D、proMP中的一种构成。CAR的共刺激域由CD28、4-1BB、2B4中的一种构成。CAR的信号传导域由CD3 zeta构成；

此外CAR的最前端还有一段CD8构成的信号肽，可将NK细胞合成好的CAR运输至预期位置。根据需要选择及设计好CAR的核酸序列后，通过人工基因合成的方法获得编码CAR的核酸。

3.内源基因表达的上调以及自杀基因的导入

使用PCR技术得到第一目的基因和自杀基因的核酸后，通过酶切连接技术将其接入到CAR核酸序列之后，并使用T2A、P2A序列将CAR、第一目的基因、自杀基因单独翻译和表达，得到新型的编码CAR的核酸。第一目的基因包括：IL15、IL7、CCR2、Bcl-2、MCL1、CD16。自杀基因包括：HSV-TK、iCasp-9、利妥昔单抗结合表位。

4.将新型的编码CAR的核酸导入NK细胞

得到新型的编码CAR的核酸后，通过酶切连接的方式将其导入慢病毒或逆转录病毒的转移质粒(含有慢病毒或逆转录病毒的基因组序列等)中，之后进行病毒的包装。将转移质粒、包装质粒(含慢病毒或逆转录病毒衣壳蛋白、结构蛋白等)和膜蛋白质粒(含慢病毒或逆转录病毒外膜等)一起转染293T细胞，最后得到包装好的含新型的CAR的核酸的慢病毒或逆转录病毒。

将NK细胞接种到RetroNectin(5ug/cm)包被的24孔板中。之后加入含新型的CAR的核酸的病毒和Polybrene(7ug/ml)转染NK细胞；在室温下1000g离心1小时后将细胞放入培养箱中。孵育过夜后，更换新鲜培养基扩增NK细胞，最终获得CAR-NK细胞。

5.下调CAR-NK细胞内源基因表达

通过CRISPR/Cas 9技术下调CAR-NK细胞内源基因的表达。设计好第二目的基因的gRNA序列后，使用人工基因合成的方法得到gRNA序列对应的DNA片段，并使用PCR技术得到Cas9的核酸。通过酶切连接技术将其中一种第二目的基因的gRNA的DNA片段与Cas9的核酸相连，再将其通过慢病毒或者逆转录病毒导入CAR-NK细胞，从而实现CAR-NK细胞内源基因表达的下调。第二目的基因包括：EBAG9、RASA2。

二、CAR-NK细胞的治疗方法

1.CAR-NK细胞对纤维化相关疾病的治疗

制备好靶向FAP或者CD248的CAR-NK细胞后，采用静脉注射的方式将细胞运输至HFpEF、HFmrEF、HFrEF、特发性肺纤维化、肝硬化、和肾病等患者或动物体内。注射量为10⁵-10¹¹个/次，每1-4周注射一次，一共注射1-6次。治疗完全结束后，可使用AP1903等小分子诱导药物激活CAR-NK细胞的自杀基因，诱导CAR-NK细胞凋亡。

2.CAR-NK细胞对衰老及其相关疾病的治疗

制备好靶向uPAR的CAR-NK细胞后，采用静脉注射的方式将细胞运输至衰老患者或动物体内。注射量为10⁵-10¹¹个/次，每1-4周注射一次，一共注射1-6次。治疗完全结束后，可使用AP1903等小分子诱导药物激活CAR-NK细胞的自杀基因，诱导CAR-NK细胞凋亡。同样的，实验结果发现：细胞注射量低于10⁵个/次时，达不到预期的技术效果，高于10¹¹个/次时，副作用会增加，具体可根据患者使用情况进行调整。

上述实施例只为说明本申请的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本申请的内容并据以实施，并不能以此限制本申请的保护范围。凡根据本申请精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

应该理解，以上描述是为了进行图示说明而不是为了进行限制。通过阅读上述描述，在所提供的示例之外的许多实施方式和许多应用对本领域技术人员来说都将是显而易见的。出于全面之目的，所有文章和参考包括专利申请和公告的公开都通过参考结合在本文中。

结果分析：

原代CAR-NK细胞由于其存活时间、增殖能力有限，导致其治疗成本较大；CAR-NK细胞系则杀伤能力较低，并由于其无限增殖而存在安全隐患。而我们的结果显示，本发明的新型CAR-NK细胞的存活时间、增殖能力、杀伤能力显著增强。并且，使用AP1903等小分子诱导药物后，自杀基因诱导CAR-NK细胞凋亡，增强了CAR-NK细胞的可控性。

在HFpEF、HFmrEF、HFrEF、特发性肺纤维化、肝硬化、和肾病等患者和动物中，都出现了显著的组织纤维化。我们的结果显示，靶向FAP的CAR-NK细胞和靶向CD248的CAR-NK细胞显著减少甚至清除了组织纤维化(图3)，增强了病变器官的功能，从而改善了HFpEF、HFmrEF、HFrEF、特发性肺纤维化、肝硬化、和肾病等纤维化相关疾病。

此外，衰老细胞的产生是引起机体衰老的重要因素。我们的结果显示，靶向uPAR的CAR-NK细胞可有效特异性杀伤衰老化细胞，增强了机体机能，从而显著延缓了衰老过程并增加了寿命。同时还改善了特发性肺纤维化、肝纤维化、动脉粥样硬化、糖尿病、骨关节炎等由衰老引起的并发症。

总之，本发明成功增加了CAR-NK细胞的存活时间、增殖和杀伤能力；同时加入自杀基因，增强了CAR-NK细胞的可控性。并成功制备了可治疗HFpEF、HFmrEF、HFrEF等纤维化相关疾病的CAR-NK细胞和延缓衰老的CAR-NK细胞。

另外，CD8信号肽、连接肽和T2A等的序列如下：

CD8信号肽(SEQ ID NO：1)：

5‘-ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCT CCACGCCGCTCGGCCC-3’。

连接肽(SEQ ID NO：2)：

5‘-GGCGGCGGAGGAAGCGGAGGCGGAGGATCTGGTGGTGGTGGATCT-3’。

T2A(SEQ ID NO：3)：

5‘-AGGGCAGAGGCAGCCTGCTGACATGTGGCGACGTGGAAGAGAAC CCTGGCCCC-3’

P2A(SEQ ID NO：4)：

5‘-GGAAGCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCTATG-3’

EBAG9 gRNA(SEQ ID NO：5)：5‘-UUUAGACAGAUGUUGAAGAG-3’

RASA2 gRNA(SEQ ID NO：6)：5‘-AUUUUGUGGGGUCCAAGAUA-3’

CD7 gRNA(SEQ ID NO：7)：5‘-CACGGGGACAGUCGUGCAGU-3’

IL-1gRNA(SEQ ID NO：8)：5‘-GCCAUAGCUUACAUGAUAGA-3’

IL-6gRNA(SEQ ID NO：9)：5‘-GGAGAAGGCAACUGGACCGA-3’

GM-CSF gRNA(SEQ ID NO：10)：5‘-GAUCUGCAAGGAGCGGGCAC-3’

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (20)

1.嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，包括向NK细胞导入用于编码CAR的核酸和调控CAR-NK细胞基因表达的核酸；所述调控CAR-NK细胞基因表达包括上调内源基因表达、下调内源基因表达和加入自杀基因；所述CAR的结构包括抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、胞内结构域，所述抗原结合结构域特异性识别并结合靶细胞上的抗原，激活胞内结构域。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述抗原结合结构域包括：scFv。

3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述铰链结构域用于连接单链抗体和跨膜结构域，其包括CD8和CD28。

4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述跨膜结构域用于穿过细胞膜，将所述CAR锚定在细胞膜上，其包括CD8、CD28、NKG2D、proMP。

5.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述胞内结构域用于传递并放大单链抗体的激活信号，从而激活NK细胞并杀伤靶细胞，其包括共刺激域和信号传导域。

6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述共刺激域包括：CD28、4-1BB、2B4。

7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体NK细胞，其特征在于，所述信号传导域包括CD3zeta。

8.权利要求1～7任一项所述的嵌合抗原受体NK细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：提取NK细胞；将编码CAR的核酸导入NK细胞获得CAR-NK细胞；对所述CAR-NK细胞基因表达进行调控。

9.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体NK细胞的制备方法，其特征在于，提取NK细胞包括：获取原代NK细胞或NK细胞系。

10.根据权利要求9所述的嵌合抗原受体NK细胞的制备方法，其特征在于，所述获取原代NK细胞包括：从外周血或脐带血中提取淋巴细胞，使用CD56磁珠分选出NK细胞，使用含白细胞介素2(IL2)的培养基扩增NK细胞；或者，所述获取NK细胞系包括：使用NK-92、NK-92MI等细胞系，使用相应培养基扩增。

11.根据权利要求9所述的嵌合抗原受体NK细胞的制备方法，其特征在于，所述编码CAR的核酸的导入包括：使用含CAR核酸序列的慢病毒或逆转录病毒转染所述NK细胞，以得到CAR-NK细胞。

12.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体NK细胞的制备方法，其特征在于，对所述CAR-NK细胞的基因表达进行调控包括：上调内源基因表达、加入自杀基因和下调内源基因表达。

13.根据权利要求12所述的嵌合抗原受体NK细胞的制备方法，其特征在于，所述上调内源基因表达和加入自杀基因步骤包括：在CAR核酸序列之后插入第一目的基因序列和自杀基因序列得到目标基因序列，再使用包含所述目标基因序列的慢病毒或逆转录病毒转染所述CAR-NK细胞。

14.根据权利要求13所述的嵌合抗原受体NK细胞的制备方法，其特征在于，所述下调内源基因表达包括：使用CRISPR/Cas 9技术敲除第二目的基因序列。

15.根据权利要求14所述的嵌合抗原受体NK细胞的制备方法，其特征在于，所述第一目的基因包括：IL15、IL7、CCR2、Bcl-2、MCL1、CD16；所述自杀基因包括：HSV-TK、iCasp-9、利妥昔单抗结合表位。

16.根据权利要求15所述的嵌合抗原受体NK细胞的制备方法，其特征在于，所述第二目的基因包括：EBAG9、RASA2。

17.权利要求1～16任一项所述的嵌合抗原受体NK细胞在制备减少纤维化或延缓衰老的药物中的用途。

18.根据权利要求17所述的用途，其特征在于，靶向FAP或CD248的CAR-NK细胞在制备减少纤维化的药物中的用途。

19.根据权利要求18所述的用途，其特征在于，用于减少纤维化的包含有所述CAR-NK细胞的药物治疗心力衰竭(包括HFpEF、HFmrEF、HFrEF)、特发性肺纤维化、肝硬化、和肾病。

20.根据权利要求17所述的用途，其特征在于，靶向uPAR的CAR-NK细胞在制备延缓机体衰老的药物中的用途。

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