JP7399871B2 - T細胞に高い転写活性を有するキメラプロモーター - Google Patents
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- C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination
Description
ロモーター、GAPDHプロモーター、eIF4A1プロモーター、Egr1プロモーター、FerHプロモーター 、SM22αプロモーター、エンドセリン-1プロモーターなどを含む。
一つまたは複数の実施の形態において、上記プロモーターは、EF1αプロモーター、PGKプロモーター、β-actinプロモーター、hCMVプロモーター、EEF2プロモーター、CAGプロモーター、U6プロモーターとSV40プロモーターから選べられる。
一つまたは複数の実施の形態において、上記プロモーターは、EF1αプロモーター、hCMVプロモーターとβ-actinプロモーターであって、より好ましくは、EF1αプロモーターである。
一つまたは複数の実施の形態において、上記エンハンサーが、上記プロモーターの5’末端又は3’末端に位置し、好ましくは上記プロモーターの5’末端に位置する。
一つまたは複数の実施の形態において、上記増強されたプロモーター配列の核酸配列は、SEQ ID NO:1に示された核酸配列とSEQ ID NO:3に示された核酸配列からなる。
一つまたは複数の実施の形態において、上記核酸コンストラクトは、5’末端から3’末端まで、作動可能に連結される上記増強されたプロモーター配列、目的のタンパク質的コード配列及び転写ターミネーターを順に含有する発現カセットである。
一つまたは複数の実施の形態において、上記ベクターは、真核発現ベクターであり、一過性発現ベクター、ウイルス発現ベクター和転置可能なベクターから選べられるものである。
一つまたは複数の実施の形態において、上記ベクターは、目的の遺伝子の発現カセットを、ホスト細胞のゲノムに組み込むためのベクターであり、好ましくは、転置可能なベクターである。
一つまたは複数の実施の形態において、上記転置可能なベクターが、piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5又はTyから選べられる転置因子を含む。
一つまたは複数の実施の形態において、上記転置可能なベクターの5’LTRと3’LTRの間に、順に、作動可能に連結される上記増強されたプロモーター配列、一つ又は複数の制限エンドヌクレアーゼの制限サイト又は任意的な目的のコード配列、及び転写終了配列を含有する。
一つまたは複数の実施の形態において、3’LTRの3’末端には、さらに作動可能にトランスポゼースのコード配列及びそのプロモーター配列を連結している。
一つまたは複数の実施の形態において、上記ベクターは、さらに一つ又は複数の選択可能なマーカーを含有する。
一つまたは複数の実施の形態において、上記目的のコード配列は、抗体のコード配列である。
一つまたは複数の実施の形態において、上記抗体は、PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA4抗体、CD40抗体、CD40L抗体、CD47抗体、CD137抗体、CD28抗体、CD27抗体、OX40抗体、DNAM-1抗体、GITR抗体、ICSOS抗体、2B4抗体、CD160抗体、TIM3抗体、LAG3抗体、BTLA抗体とTIGIT抗体から選べられる;好ましくは、PD-1一本鎖抗体である。
一つまたは複数の実施の形態において、上記制限サイトは、AscI制限サイト、XbaI制限サイト、PvuI制限サイト、EcoRI制限サイトとSalI制限サイトから選べられる。
一つまたは複数の実施の形態において、上記ベクターの核酸配列は、SEQ ID NO:12に示された。
用語「コード配列」とは、核酸配列にそのタンパク質産物を直接に確定するアミノ酸配列部分を指す。コード配列の境界は、通常にmRNAの5 ’オープンリーディングフレームのすぐ上流のリボソーム結合部位(原核細胞の場合)と、mRNAの3’オープンリーディングフレームのすぐ下流の転写終結配列によって決定される。コード配列は、DNA、cDNAと組換え核酸配列を含んでも良いが、それらに限定されない。
NO:3に示されても良い;例示的なhCMVプロモーターのヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:4に示されても良い;例示的なβ-actinプロモーターのヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:5に示されても良い。
含む。
選択可能な制限サイトが、AscI制限サイト、XbaI制限サイト、PvuI制限サイト、EcoRI制限サイトとSalI制限サイトを含むが、それらに限定されない。通常に、上記コード配列が、本発明的増強されたプロモーター配列と転写終了配列と、作動可能に連結されるように、ベクターには、一部の制限サイトが、本発明に記載された増強されたプロモーター配列と転写終了配列の間に位置し、当該位置でベクターを切断し、目的のタンパク質のコード配列を插入する。
beauty、frog prince、Tn5又はTyから選べられる転置因子を含む真核発現ベクターである。こんな転置可能なベクターが、対応するトランスポゾンの5’逆方向末端反復配列(5’LTR)と対応するトランスポゾンの3’逆方向末端反復配列(3’LTR)を含有する。トランスポゼースは、piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5又はTy転置システムから由来するトランスポゼースであっても良い。異なる転置システムから由来するトランスポゼースを使用する際に、上記ベクターにおける5’LTRと3’LTRの配列もそれに応じて、当該転置システムと適応する配列へ変化することは、当業者に容易的に確定されることである。
ンスポゾンの5’逆方向末端反復配列と3’逆方向末端反復配列である。ある実施の形態において、トランスポゾン5’逆方向末端反復配列は、CN 201510638974.7(その内容は引用の方式で本明細書に取り入られる)SEQ ID NO:1に示された。ある実施の形態において、トランスポゾン3’逆方向末端反復配列は、CN 201510638974.7 SEQ ID NO:4に示された。ある実施の形態において、piggybacトランスポゼースは、c-mycを含む核局在化シグナルコード配列のトランスポゼースである。ある実施の形態において、piggybacトランスポゼースのコード配列は、CN 201510638974.7 SEQ ID NO:5に示された。
トランスポゼースコード配列のプロモーターは、本分野に既知の、トランスポゼースコード配列の発現を制御するための各種プロモーターであっても良い。ある実施の形態において、CMVプロモーターで、トランスポゼースコード配列の発現を制御する。CMVプロモーターの配列は、CN 201510638974.7 SEQ ID NO:6に示された。
-L1抗体、CTLA4抗体、CD40抗体、CD40L抗体、CD47抗体、CD137抗体、CD28抗体、CD27抗体、OX40抗体、DNAM-1抗体、GITR抗体、ICSOS抗体、2B4抗体、CD160抗体、TIM3抗体、LAG3抗体、BTLA抗体とTIGIT抗体等を含むが、それらに限定されない。
1.増強された緑色蛍光タンパク質EGFP発現ベクターの構築
上海捷瑞生物会社に委託し、配列sDTS-LTR(SEQ ID NO:2)を合成し、AscI制限サイトを配列の上流に導入し、XbaI制限サイトをその下流に挿入し、それを、AscI + XbaIで二重制限したpNB328ベクター(pNB328ベクターの構造と配列については、CN 201510638974.7を参照し、その全内容は、引用の方式で本明細書に取り入られる;pNB328ベクターが、EF1αプロモーターを含む)にロードし、pNB338A-Eと呼ばれる組換えプラスミドを形成する。
上海捷瑞生物会社に委託し、pNL1.3.CMV[secNluc-CMV]プラスミドにおけるナノルシフェラーゼ(Nano luciferase、単にNlucいう)遺伝子のコード配列(その核酸配列は、SEQ ID NO:6に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO:7に示された)、EcoRI制限サイトを配列の上流に導入し、SalI制限サイトをその下流に挿入し、それを、EcoRI+SalIで二重制限したpNB328-EベクターとpNB338B-Eベクターにロードし、それぞれにpNB328-E-NlucとpNB338B-E-NLucと呼ばれる組換えプラスミドを形成する。
上海捷瑞生物会社に委託し、PD-1抗体ヌクレオチド配列(核酸配列は、SEQ ID NO:10に示され、アミノ酸配列は、SEQ ID NO:11に示された)を合成し、EcoRI制限サイトを配列の上流に導入し、SalI制限サイトをその下流に挿入し、それを、EcoRI+SalIで二重制限したpNB328-E-NLuc 、p
NB328-hC-NLuc、pNB328-β-NLuc、pNB338B-E-NLuc、pNB338B-hC-NlucとpNB338B-β-NLucベクターにロードし、それぞれにpNB328-E-m279V、pNB328-hC-m279V、pNB328-β-m279V、pNB338B-E-m279V、pNB338B-hC-m279VとpNB338B-m279Vと呼ばれる組換えプラスミドを形成する。
各発現ベクターの構造の模式図を図1に示す。
Filcoll分離法で、ドナー血液から末梢血単核細胞(PBMC)を分離した。PBMCを2-4時間付着培養し、その中に、付着していない懸濁した細胞は、最初のT細胞である;懸濁した細胞を15ml遠心チューブに集め、1200rpmで3分間遠心し、上清を捨て、生理食塩水を加え、1200rpmで3分間遠心し、生理食塩水を捨て、このステップを繰り返した。
1.5mlの遠心チューブ15本を取り、各チューブに5×106個の細胞を加え、1-15の番号を付け、1200rpmで3分間遠心し、上清を捨て、エレクトロポレーションキット(Lonza製)を用意し、各チューブに100ulの比率でエレクトロポレーション試薬を加え、6ugの上記プラスミドをチューブ1-15に加え、細胞を別々に再懸濁し混合した;混合溶液をエレクトロポレーションカップに移し、それをエレクトロポレーション機器に入れ、必要な手順を選択し、電気ショックを実行した;キットにおけるマイクロピペットを使用し、エレクトロポレーションされた細胞懸濁液を、培養液(2%FBSを含むAIM-V培養液)を含む6ウェルプレートに移し、均一まで混合して、37°C、5%CO2でインキュベートし、6時間後、刺激因子IL-2、CD3抗体およびCD28抗体を加え、37℃、5%CO2で3-4日間培養し、T細胞の成長状況を観察し、EGFP、NlucおよびPD-1抗体を発現するT細胞を取得した。
実施例2で得られたプラスミドpNB328-E-EGFP、pNB338A-E-EGFP、およびpNB338B-E-EGFPで修飾された活性化T細胞を、エレクトロポレーション後8日目および18日目にそれぞれ蛍光顕微鏡で観察し、5×105個の細胞ペレットを収集し、細胞ペレットをPBSで2回洗浄し、400ul PBSを加えて細胞をフローチューブに移し、機械でテストした。
実施例2に構築されたpNB328-E-Nluc、pNB338B-E-Nluc、pNB328-hC-Nluc、pNB338B-hC-Nluc、pNB328-β-Nluc、pNB338B-β-Nlucプラスミドで修飾された活性化T細胞を、7日目と17日目に、2×106細胞の数で細胞を回収し、2×106細胞/ウェルで3mlのAIM-V培地を入れた6ウェルプレートに播種し、37℃、5%CO2インキュベーターに入れ、24時間培養した後、細胞上清を回収し、後で使用するために-20℃で保存した。多機能マイクロプレートリーダーで、細胞上清へ分泌した新しいフルオレセインNlucの蛍光値を検出した。
実施例2に構築されたpNB328-E-m279V、pNB338B-E-m279V、pNB328-hC-m279V、pNB338B-hC-m279V、pNB328-β-m279V、pNB338B-β-m279Vプラスミドで修飾された活性化T細胞を、8日目と18日目に、2×106細胞の数で細胞を回収し、2×106細胞/ウェルで3mlのAIM-V培地を入れた6ウェルプレートに播種し、37℃、5%CO2インキュベーターに入れ、24時間培養した後、細胞上清を回収し、後で使用するために-20℃で保存した。二重抗体サンドイッチELISAより、ヒト化の組換えタンパク質でELISAプレートをコーティングし、HRP標識マウス抗ヒトIgG4 mAbの検出を行い、標準として市販の抗PD-1抗体を使用し、50倍希釈後にサンプルを定量的に検出した。
実施例1で構築されたpNB328-E-EGFPとpNB338B-E-EGFPを使用し、それぞれにCHO細胞をトランスフェクトした。具体的に、遠心チューブ2本を取り、各チューブに5×106個のCHO細胞を加え、1200rpmで3分間遠心し、上清を捨て、エレクトロポレーションキット(Lonza製)を用意し、各チューブに比率で合計で100ulのエレクトロポレーション試薬を加え、各チューブに6ugのpNB328-E-EGFPと6ugのpNB338B-E-EGFPを加え、細胞を別々に再懸濁し混合した;混合溶液をエレクトロポレーションカップに移し、それをエレクトロポレーション機器に入れ、必要な手順を選択し、電気ショックを実行した。エレクトロポレーション後、CHO細胞を10%FBS 1640 / DMEM(1:1混合)培地
で37℃、5%CO2インキュベーターで培養した。エレクトロポレーション後の8日目に、5×106の細胞ペレットを収集し、細胞ペレットをPBSで2回洗浄し、400ul PBSを加えて細胞をフローチューブに移し、機械でテストした。結果は、図5に示された。
実施例1の方法でpNB338h-β-m279V、pNB338h-hC-m279V、pNB338h-β-m279V、pNB338e-β-m279V、pNB338e-hC-m279VとpNB338e-β-m279V組換えプラスミドを構築した;pNB338B-E-m279V、pNB338B-hC-m279VとpNB338B-β-m279Vとが異なり、pNB338h-β-m279V、pNB338h-hC-m279VとpNB338h-β-m279Vには、sDTS配列の代わりにhCMVエンハンサー配列を使用し、pNB338e-β-m279V、pNB338e-hC-m279VとpNB338e-β-m279Vには、sDTS配列の代わりにCD3eエンハンサーを使用した。
Claims (18)
- SEQ ID NO:1に示されるヌクレオチド配列を有するエンハンサーsDTSと、当該エンハンサーに作動可能に連結され、SEQ ID NO:3に示されるヌクレオチド配列を有するEF1αプロモーターからなり;上記エンハンサーsDTSが、上記EF1αプロモーターの5’末端に位置することを特徴とする増強されたプロモーター。
- 請求項1に記載の増強されたプロモーターを含有する核酸コンストラクト。
- 上記核酸コンストラクトは、5’末端から3’末端まで、作動可能に連結される上記増強されたプロモーター、目的のタンパク質のコード配列及び転写ターミネーターを順に含有する発現カセットである請求項2に記載の核酸コンストラクト。
- 請求項1に記載の増強されたプロモーターを含有するベクター。
- 上記ベクターは一過性発現ベクター、ウイルス発現ベクター又は転置可能なベクターから選ばれる真核発現ベクターであるか、あるいは、
上記ベクターは、目的の遺伝子の発現カセットをホスト細胞のゲノムへ組み込むためのベクターである、請求項4に記載のベクター。 - 上記ベクターは転置可能なベクターであり、上記転置可能なベクターは、piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5又はTyから選ばれる転置因子を含有する請求項5に記載のベクター。
- 上記転置可能なベクターの5’LTRと3’LTRの間に、順に、作動可能に連結される上記増強されたプロモーター、一つ又は複数の制限エンドヌクレアーゼの制限サイト又は任意的な目的のコード配列、及び転写終了配列を含有することを特徴とする請求項5に記載のベクター。
- 上記3’LTRの3’末端に作動可能にトランスポゼースのコード配列及びそのプロモーター配列が連結される請求項7に記載のベクター。
- 上記ベクターの核酸配列は、SEQ ID NO:12に示される請求項4に記載のベクター。
- 上記転写終了配列は、SV40 polyA転写終了配列である請求項7に記載のベクター。
- 上記目的の遺伝子は、PD-1一本鎖抗体のコード配列である請求項5に記載のベクター。
- 上記制限サイトは、AscI制限サイト、XbaI制限サイト、PvuI制限サイト、EcoRI制限サイト及びSalI制限サイトから選ばれることを特徴とする請求項7に記載のベクター。
- 請求項1に記載の増強されたプロモーターの、外来遺伝子のT細胞内の発現を促進することにおける使用。
- 請求項1に記載の増強されたプロモーター又は請求項2又は請求項3に記載の核酸コンストラクト又は請求項4乃至請求項12のいずれか一項に記載のベクターを含有するT細胞。
- 上記T細胞のゲノムに、請求項1に記載の増強されたプロモーターをプロモーターとすることで目的の外来遺伝子の発現を駆動させる発現カセットが組み込まれている請求項14に記載のT細胞。
- T細胞のゲノムに、請求項1に記載の増強されたプロモーター及び当該プロモーターと作動可能に連結される抗体のコード配列を含有する発現カセットを組み込んでいる、安定的に抗体を発現するT細胞。
- 上記抗体は、PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA4抗体、CD40抗体、CD40L抗体、CD47抗体、CD137抗体、CD28抗体、CD27抗体、OX40抗体、DNAM-1抗体、GITR抗体、ICSOS抗体、2B4抗体、CD160抗体、TIM3抗体、LAG3抗体、BTLA抗体及びTIGIT抗体から選ばれるいずれか一種の抗体である請求項16に記載のT細胞。
- 上記PD-1抗体のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:10に示され、又は、上記PD-1抗体のコード配列は、SEQ ID NO:11に示された請求項17に記載のT細胞。
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