CZ376898A3 - Konstrukt nukleové kyseliny pro expresi řízenou onkogenem nebo virem, způsob přípravy takového konstruktu a jeho použití pro přípravu léčiva - Google Patents

Description

(57) Anotace:

Konstrukt nukleové kyseliny pro expresi efektorového genu, přičemž tento konstrukt nukleové kyseliny obsahuje promotor I [složka a/], který řídí expresi genu transkripčního faktoru [složka b/] v tomto konstruktu obsaženém, a promotor II [složka c/], na který se specificky váže genový produkt genu transkripčního faktoru a který řídí expresi efektorového genu [složka d/[ v tomto konstruktu taktéž obsaženém, přičemž tento konstrukt je charakterizován tím, že aktivita genového produktu genu transkripčního faktoru je závislá na jednom nebo několika buněčných regulátorových proteinech, které se specificky váží na tento genový produkt a oblivňují jeho aktivitu. Izolovaná buňka obsahující tento konstrukt nukleové kyseliny, použití konstruktu pro přípravu léčiva k léčení nemocé, použití takové buňky k témuž konstruktu

176 568/ KB

Konstrukt nukleové kyseliny pro expresi řízenou onkogenem nebo virem, způsob přípravy takového konstruktu a jeho použití pro přípravu léčiva

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká konstruktu nukleové kyseliny pro expresi efektorového genu, a tento konstrukt nukleové kyseliny obsahuje promotor I (složka a)), který řídí expresi genu transkripčního faktoru (složka b)) v tomto konstruktu taktéž obsaženém, a promotor II (složka c) ) , na který se specificky váže genový produkt genu transkripčního faktoru a který řídí expresi efektorového genu (složka d) ) v tomto konstruktu taktéž obsaženém, přičemž konstrukt je charakterizován tím, že aktivita genového produktu genu transkripčního faktoru je závislá na jednom nebo několika buněčných regulačních proteinech, které se specificky váži na tento genový produkt a ovlivňují jeho aktivitu.

Dosavadní stav techniky

I. Úvod

Dosud zdaleka nevyřešeným problémem genové terapie je buněčně specifická kontrola exprese efektorového genu, zvláště v nemocných nebo jinak pozměněných buňkách. Předkládaný vynález popisuje nový způsob takové kontroly. Je založen na poznatku (Wernes et al. , Science 248, 76, 1990), že regulační proteiny vyskytující se v degenerované (nádorově zvrhlé) buňce, které jsou změněné nebo snížené takovým způsobem, že se již neváží na příslušné partnerské molekuly a nemohou s nimi reagovat, nebo naopak získají zcela nové vazebné vlastnosti vzhledem ke své partnerské molekule nebo k jiné partnerské molekule.

Způsob podle předkládaného vynálezu je dále založen na poznatku, že např. retinoblastomový protein se váže na aktivační doménu transkripčního faktoru E2F a tím může inhibovat jeho aktivitu (Flemington et al. , PNAS USA. 90, 6914, 1993) . Geny pro takové regulátorové proteiny již byly použity v expresních systémech pro vyhledávání inhibitorů nebo stimulátorů těchto regulátorových proteinů (viz např. WO 95/19367, WO 95/14777, WO 97/04092).

Dále byly již popsány vektorové systémy, ve kterých první vektor exprimuje supresorový nádorový protein, a druhý vektor exprimuje protein, který se váže na supresorový nádorový protein a tím ho inhibuje (WO 95/16771) . Oba vektory se pak zvedly do buňky. Vzhledem ke kombinaci obou vektorů mohou tyto vektory kódující supresorový nádorový protein být v buňce produkovány, aniž by proliferace buňky byla supresorovým nádorovým protein inhibována.

Kromě toho byly v patentové přihlášce WO 97/12970 zveřejněny vektorové systémy, ve kterých je exprese prvního genu kontrolována prvním promotorem, jehož funkce je v jiné než nádorové buňce (nenádorové buňce) potlačena, a exprese druhého genu, jehož expresní produkt inhibuje expresi prvního genu v nenádorových buňkách, je kontrolována druhým promotorem, který je vysoce regulován v nenádorové buňce.

Předmětem vynálezu je také nový jednoduchý expresní systém, který se může aktivovat jen v buňkách, v nichž se takové regulátorové proteiny vyskytují ve zmenšené nebo pozměněné formě. Tím se aktivuje transkripce efektorového genu, který je kódován expresním systémem. Expresní produkt efektorového genu, buďto sám nebo v kombinaci s další

9 9 farmaceutickou účinnou látkou, má profylaktický nebo léčivý účinek.

9 ·

' 9

999 9

Podstata vynálezu

II. Obecný popis vynálezu

Expresní systém podle předkládaného vynálezu představuje konstrukt nukleové kyseliny, jehož exprese je řízena onkogenem nebo virem, který způsobil změnu nebo ovlivnil regulátorový protein, a který v nejjednodušším případě obsahuje složky:

a) alespoň jednu aktivační sekvenci (promotorovou jednotku I)

b) alespoň jeden gen pro transkripční faktor, přičemž jeho transkripce je řízena složkou a)

c) alespoň jednu další aktivační sekvenci (promotorovou jednotku II) , která navázáním transkripčního faktoru kódovaného složkou b) řídí expresi složky d)

d) alespoň jeden efektorový gen.

Příklad uspořádání jednotlivých složek je uveden na obr. 1.

V předkládaném vynálezu se rozlišují dvě zvláštní formy provedení konstruktu nukleové kyseliny:

1) Forma provedení A)

Tato forma má následující vlastnosti:

Složka a)

- alespoň jedna aktivační sekvence (promotor č. I)

Složka b)

- alespoň jeden gen pro transkripční faktor tvořený fúzním proteinem, který obsahuje

• složku b_x) tj . alespoň jedna aktivační doména transkripčního faktoru • složku b₂) tj . alespoň jedna vazebná sekvence vazebného proteinu pro regulátorový protein • složku b₃) t j . alespoň jednu DNA-vazebnou doménu transkripčního faktoru

Složka c)

- alespoň jedna aktivační sekvence (promotor č.. II), která je aktivována navázáním transkripčního faktoru kódovaného složkou b)

Složka d)

- alespoň jeden efektorový gen

Příklad uspořádání jednotlivých složek je uveden na obr. 2. Předpokladem pro funkčnost expresního systému podle předkládaného vynálezu je to, že složka b₂) je na nebo mezi složky b_x) a b₃) vložena tak, že navázání regulátorového proteinu na složku b₂) inhibuje funkci aktivační domény (složka b_x)) a/nebo DNA-vazebné domény (složka b₃)) . Tato inhibice v normálních buňkách, tj . v buňkách s normálně fungujícím regulátorovým proteinem, vede k inhibici exprese efektorového genu. V degenerované (nádorově zvrhlé) nebo infikované buňce, ve které je regulátorový protein buďto pozměněn nebo vázán v komplexu tak, že nemůže nadále reagovat s příslušným vazebným proteinem nebo není nadále vůbec k dispozici nebo je k dispozici jen ve snížené míře, tato inhibice selhává, a tudíž transkripční faktor (složka b)) nerušeně aktivuje aktivační sekvenci (složka c) ) a tím může řídit zahájení transkripce efektorového genu.

Transkripce efektorového genu se zahájí aktivací aktivační sekvence (složka a)), kterou má následovat exprese • ·

Transkripční (složka c)) ,

- 5 genu pro transkripční faktor (složka b)) faktor se zase váže na aktivační sekvenci která indukuje expresi efektorového genu (složka d)).

Ve zvláštním provedení vynálezu je složka a) shodná se složkou c) . V takovém zvláštním provedení vynálezu vede i slabá aktivace aktivační sekvence (promotor I, složka a)) k expresi transkripčního faktoru (složka b)), který aktivuje jak první aktivační sekvenci (promotor I, složka a)) tak i druhou aktivační sekvenci (promotor II, složka c) ) , a tím indukuje jak expresi efektorového genu (složka d) ) tak také zesiluje expresi transkripčního faktoru (složka b)), čímž se opět zesiluje exprese efektorového genu (složka d)).

2) Forma provedení B)

Tato forma má následující vlastnosti složek:

Složka a') alespoň jedna aktivátorové sekvence (promotor I) , která obsahuje • složku a_x) tj . alespoň jednu DNA-vazebnou sekvenci pro regulátorový protein • složku a₂) tj . alespoň jeden bazální promotor, přičemž vazba regulátorového proteinu na složku a_x) aktivuje složku a₂)

Složka b')

-alespoň jeden gen pro transkripční faktor působící jako represor, přičemž jeho exprese je indukována složkou a⁷)

Složka c')

-alespoň jedna aktivátorové sekvence (promotor II), která obsahuje • složku c_x) tj . alespoň jednu aktivační sekvenci pro indukci transkripce složky d) a

··· ♦ • · ·· ·· • složku c₂) tj . alespoň jednu DNA-vazebnou sekvenci pro navázání represoru, přičemž tato vazba inhibuje aktivaci transkripce efektorového genu ležícího po směru transkripce (d))

Složka d)

-efektorový gen

Příklad uspořádání jednotlivých složek provedení ve formě B) je uveden na obr. 3.

Předpokladem pro fungování expresního systému podle provedení ve formě B) je, že v normální buňce vazba buněčného regulátorového proteinu na složku a') promotorové jednotky I indukuje transkripci represorového genu (složka b')) a že exprimovaný represor se váže na složku c₂) promotorové jednotky II, a tím inhibuje aktivaci transkripce strukturního genu (složka dj) promotorovou jednotkou II.

V degenerované (nádorově zvrhlé) nebo infikované buňce, ve které je regulátorový protein buďto pozměněn nebo vázán v komplexu tak, že se nemůže nadále vázat na DNA-vazebnou sekvenci složka a_x) promotorové jednotky II nebo není nadále vůbec k dispozici nebo je k dispozici jen ve snížené míře, nedochází k žádné expresi genu pro represor, a tím pádem k žádné inhibici exprese konstruktu nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu. V takových degenerovaných nebo infikovaných buňkách se v konstruktu nukleové kyseliny podle vynálezu ve formě B) transkripce efektorového genu (složka d) ) spouští aktivací aktivační sekvence (složka c_x) ) promotorové jednotky II).

9 9 9 · «

Tyto expresní systémy se mohou rozšířit ve formě A) i B)

- seřazením několika shodných nebo různých sekvencí pro efektorový gen (složky d) , d), ď')), které jsou navzájem spojeny shodnými nebo různými sekvencemi IRES nebo aktivačními sekvencemi (složky c^z) a c''))

V provedení formy A)

- seřazením několika shodných nebo různých genů pro transkripčni faktor (složka b)), které jsou navzájem spojeny shodnými nebo různými sekvencemi IRES nebo aktivačními sekvencemi (složky a) nebo c))

Při vzájemném seřazení genů pro různé faktory se aktivační sekvence vyberou tak, nukleotidové sekvence, na které se může vázat transkripčni faktor (složka b)).

Prostřednictvím konstruktu nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu se může efektorový gen (složka d) ) transkripčni že obsahuj i podle výběru aktivační exprimovat nespecificky, sekvence (složka a) nebo c_x) ) buněčně specificky a virově specificky, nebo se může exprimovat v závislosti na určitých metabolických podmínkách nebo buněčném cyklu. V případě efektorového genu se jedná o gen kódující farmakologicky účinnou látku nebo enzym, který štěpí neaktivní předstupeň léku (předlék) na aktivní lék. Efektorový gen může být např. vybrán tak, že exprimuje účinnou látku nebo enzym jako fúzní protein s ligandem a tento ligand se váže na povrch buňky, např. endotelové nebo nádorové buňky nebo leukocytu.

Konstrukty nukleové kyseliny podle vynálezu jsou výhodně z DNA. Pojmem „konstrukty nukleové kyseliny se rozumějí umělé výtvory z nukleové kyseliny, které mohou být v cílové buňce transkribovány. Výhodně jsou vloženy do ·· 99

9 9 • 9 9 9 9

9 9

99 vektoru, přičemž plazmidové nebo virové vektory jsou zvláště výhodné.

Konstrukt nukleové kyseliny, případně vložený do vektoru, se podává pacientovi k profylaxi nebo léčení onemocnění. Podání se může provést perorálně, lokálně, inj ekcí nebo infúzí.

Předmětem předkládaného vynálezu jsou také buňky savce, které obsahují konstrukt nukleové kyseliny podle vynálezu. Ve zvláště výhodném provedení vynálezu jsou konstrukty nukleové kyseliny vloženy do buněčné linie, která se po transfekci může použít jako nosič expresního systému pro expresi efektorového genu podle vynálezu. Takové buňky se mohou použít pro přípravu léčivého přípravku pro pacienty. Alternativně se mohou buňky nebo buněčné linie, jako jsou např. nádorové, imunitní nebo endotelové buňky, do kterých byl vložen konstrukt nukleové kyseliny předkládaného vynálezu, podat pacientovi lokálně nebo injikovat parentrerálně, např. intravenózně, intraarteriálně, do tělní dutiny, do orgánu nebo subkutánně.

Výhodné použití konstruktů nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu- spočívá buď v profylaxi nebo léčení nemoci, přičemž vynález zahrnuje in vitro zavedení konstruktu nukleové kyseliny do cílové buňky, nespecifickou, buněčně nebo virově specifickou expresi léčivého přípravku v cílové buňce nebo expresi léčivého přípravku specifickou metabolicky a/nebo v závislosti na buněčném cyklu, a lokální nebo parenterální podání cílové buňky pacientovi, anebo in vivo zavedení konstruktu nukleové kyseliny do cílové buňky lokálním nebo parenterálním podáním konstruktu nukleové kyseliny pacientovi.

Konstrukty nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu se v takové formě v přírodě nevyskytují, to

444 • 4 ···

44 » · · 4

I · 44 • 4 4 4 4

4 4

44 znamená, že efektorový gen pro účinnou látku nebo enzym nebo pro „ligand-účinná látka nebo pro fúzní protein „ligandúčinná látka není v přírodě kombinován se sekvencemi nukleové kyseliny, tak jak jsou obsaženy v konstruktu nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu.

Výhodné efektorové geny, které jsou vestavěny do expresního systému podle předkládaného vynálezu, kódují farmakologicky aktivní účinnou látku. Jsou to buď proteiny nebo glykoproteiny vybrané ze skupiny obsahující cytokiny, růstové faktory, receptory cytokinů nebo růstových faktorů, protilátky nebo fragmenty protilátek, antiproliferativně nebo cytostaticky působící proteiny, apopticky nebo antiapopticky působící proteiny, nádorové antigeny, inhibitory angiogeneze, proteiny indukované trombózou, inhibitory srážení, fybrinolyticky působící proteiny, proteiny krevní plazmy, proteiny aktivující komplement, obalové proteiny virů a bakterií, hormony, peptidy působící na oběhovou soustavu, neuropeptidy, enzymy, , mediátory, přirozeně se vyskytující nezměněné regulátorové proteiny a ribozymy nebo ribonukleotidy inhibičně působící na genovou expresi (antisense ribonukleotidy).

Výhodně se v případě transgenu jedná o efektorový gen, který kóduje ribozym, který inaktivuje mRNA, která kóduje protein vybraný ze skupiny obsahující proteiny kontrolující buněčný cyklus, zvláště cyklin A, cyklin B, cyklin Dl, cyklin E, E2F1-5, cdc2, cdc25C nebo DPI nebo virové proteiny nebo cytokiny nebo růstové faktory nebo jejich receptory.

V dalším provedení vynálezu může efektorový gen kódovat fúzní protein ligand-účinná látka, přičemž ligandem může být protilátka, fragment protilátky, cytokin, růstový faktor, adhezivní molekula nebo peptidový hormon a účinnou látkou může být výše popsaná farmakologicky aktivní účinná látka • ·· ·· · 4 • · · • ··· 4 • · ··· 4· • «4 ·· • β · 4 4 · • 4 · 44 • · ···4 4 • · · · ··· ·· ·4 nebo enzym. Efektorový gen může např. kódovat fúzní protein ligand-enzym, přičemž enzym štěpí předstupeň léku (předlék) na lék a ligand se váže na povrch buňky, např. endotelové nebo nádorové buňky.

III. Detailní popis zvláštností provedení ve formě A)

1) Složka b)

1.1) Vazebná sekvence pro regulátorový protein (složka b₂) )

Dosud byla popsána řada buněčných vazebných proteinů pro regulátorové proteiny (Zwicker a Múller, Progress in Cell Cycle Res. 1, 91, 1995, Boulikas et al., Int. J. Oncol. 6, 271, 1995, Pawson, Nátuře 373, 573, 1995, Cotter, Leuk.

Lymph. 18, 231, 1995, Hesketh, the Oncogene Facts Book Acad. Press, ISBN 0-12-344550-7, 1995, Miller a Sarver, Nátuře

Med. 3, 389,, 1997) .

Ve smyslu předkládaného vynálezu jsou výhodné vazebné proteiny nebo jejich vazebné sekvence pro takové regulátorové proteiny, které jsou v nemocné buňce exprimovány jen v malém množství, jsou inhibovány ve vazbě na vazebnou sekvenci, díky přebytku vazebných sekvencí nejsou k dispozici ve volné formě nebo jen v nepatrném množství, a nebo je jejich funkce jiným způsobem, např. prostřednictvím mutací, zkrácena nebo pozměněna.

K takovým regulátorovým proteinům patří např. proteiny exprimované nádorovými supresorovými geny.

Následující tabulky uvádí jako příklad výběr (aniž by jím byl vynález omezen) takových regulátorových proteinů, příslušných vazebných proteinů a jejich vazebných sekvencí.

ftft • · • ft ftftft • ft · ·· ·· • ft ftft ftftft· • · ftftft· • · · ftftft ft · • · ftftft ftftft ftftft ·· *·

Regulátorový protein

Složka b₂) (buněčný vazebný protein s vazebnou sekvencí pro regulační protein)

p53	MDM-2
pRb	transkripční faktor E2F,
	cyklin-Di, D2, -D3, nebo C
	transkripční faktor PU.l
	transkripční faktor Elf-1
pl30	transkripční faktor E2F-5
	cyklin A, E
Max	Myc
MAD	Myc
VHL	elongin C, -B
cdk4	pl4, pl5, pl6, pl8, p27, ;
MTS-1	(pl6) cdk4
WT-1	p53
SMAD2	(MADR2) DPC4
DPC-4	SMAD2
β-katenin LEF-1
LEF-1	β-katenin

Ve zvláštním provedení předkládaného vynálezu je složka b₂) vazebná sekvence pro regulátorový protein z proteinu, který není buňce vlastní. Taková nevlastní vazebná sekvence může být např. virového, bakteriálního nebo parazitárního původu.

Použití takové vazebné sekvence, která není vlastní buňce, umožňuje to, že v normální buňce je vazbou příslušného regulátorového proteinu na složku b₂) funkce složky b) inhibována. V infikované buňce je Však regulátorový protein dále vázán díky tomu, že infekční agens intracelulárně vytváří vazebný protein obsahující vazebnou • ·

- 12 sekvenci. Proto je v takové buňce složka b) volná a plně funkční.

V dalším zvláštním provedení předkládaného vynálezu je složka b₂) protilátka nebo část protilátky s vazebnou sekvencí (V_H a V_L) pro regulátorový protein.

Následující tabulky uvádějí příklady (neomezující vynález) vazebných sekvencí, které nejsou buňce vlastní.

Regulační Složka b₂) protein (virový vazebný protein s vazebnou sekvencí pro regulační protein) p53 IE 84 z CMV (Speir et al., Science 265, 391, 1994)

E1B (55kD) z AV (Sarnow et al., Cell 28, 387,1982, Liu et al. , Cold Spring Harbor Symp. On Quantitative

Biol. LIX, 215, 1995)

EBNA-5 z EBV (Szekely et al., PNAS USA 90, 5455, 1993)

BHFR1 z EBV (Theodorakis et al., Oncogene 12, 1707, 1996)

E6 z HPV-16 nebo -18 (Dyson et al., Science 243, 934, 1989, Howes et al., Genes Dev. 8, 1300, 1994) protein HBX z HBV (Wang et al., PNAS USA 91, 2230, 1994)

T-antigen z SV40 (Lané et al., Nátuře 278, 261, 1979, Linzer et al., Cell 17, 43, 1979)

Regulační protein pRb pl30

CBF-1 (RBP-JK)

NF-Kappa B

Lyn-tyrozinkináza bak bax

Složka b₂) (virový vazebný protein s vazebnou sekvencí pro regulační protein)

E1A z AV (Nevins Science 258, 424, 1991)

EBNA-2 z EBV

EBNA-1 nebo -5 z EBV

E7 z HPV

T-antigen z SV40

E1A z AV (Li et al., Genes Dev. 7, 2366, 1993)

EBNA-2 z EBV (Zimber-Strobl et al., EMBO J. 13, 4973, 1994)

Tax z HIV (Suzuki et al., Oncogene 9, 3099,1994)

LMP-1 z EBV

LMP-2A nebo LMP-2B z EBV

E1B (16	kD)	z AV
(Farrow	et	al., Nátuře	374,	731, 1995)
E1B (19	kD)	z AV
(Han et	al.	, Genes Dev.	, 10,	461, 1996)

- 14 Regulační Protilátky, případně fragmenty protilátek, protein s vazebnou sekvencí (V_H, V_L) pro regulační protein p53 monoklonální protilátky specifické pro němutovanou DNA vazebnou doménu

(Legros et al.,	Oncogene 9,	2071,	1994), 9,
3689, 1994, Hupp	et al. , Cell	71,	875,	1992,
Abarzna et al.,	Cancer Res.	55, 3490,	1995,
Bonsing et al.,	Cytometry	28,	11,	1997,
Thomas eťal., J	. Clin. Path.	50,	143,	1997,
Jannot et al., BBRC 230, 242,	1997)

pRb monoklonální protilátky specifické pro aktivní (nefosforylováný) pRb (Hu et al., Mol. Cell Biol. 11, 5792, 1991)

Při výběru protilátek jsou výhodně použity epitop vážící částí protilátek FVLFVH' jako složky b₂) , a to v humanizované formě v případě, že jsou myšího původu. Humanizace se provádí způsobem, který publikovali Winter et al. (Nátuře 349, 293, 1991) a Hoogenbooms et al. (Rev.

Transform. Transfus. Hemobiol. 36, 19, 1993). Fragmenty protilátky se připraví známým způsobem odpovídajícím stavu techniky, např. jak publikovali Winter et al. (Nátuře 349, 293, 1991). a Hoogenbooms et al. (Rev. Transform. Transfus.

Hemobiol. 36, 19, 1993), Girol, Mol. Immunol. 28, 1379, 1991 nebo Huston et al., Int. Rev. Immunol. 10, 195, 1993.

Detailní popis přípravy protilátek, protilátkových fragmentů a rekombinantních protilátkových fragmentů se provádí podle popisu v patentové přihlášce DE 19649645.4.

Rekombinantní protilátkové fragmenty se připravují přímo z již existujícíh hybridomů nebo se izolují pomocí techniky „phage display z knihovny myších popřípadě

• ·« · • · · · 9 9

9 · · • ··· 9 · • · · ··· ·· ···

- 15 lidských protilátkových fragmentů (Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12, 433, 1993). Tyto protilátkové fragmenty se na genetické úrovni použijí přímo pro spojení se složkami b₂) a b₃) .

Pro přípravu rekombinantních protilátkových fragmentů z hybridomů se využije genetická informace, kterou jsou kódovány vazebné domény protilátky pro antigen (V_H, V_L) , a to tak, že se izoluje mRNA, tato RNA se reverzně transkribuje do cDNA a nakonec se fragmenty získají pomocí amplifikace polymerázovou řetězovou reakcí s oligonukleotidy komplemetárními k 5'-konci popřípadě 3'-konci variabilních fragmentů. Takto získané fragmenty DNA kódující protilátkové fragmenty V_H a V_L se pak klonují do bakteriálních expresních vektorů, a tak se mohou exprimovat fragmenty Fv, jednořetězcové fragmenty Fv (scFV) nebo fragmenty Fab.

Nové protilátkové fragmenty se mohou získat technikou „phage display přímo z knihovny protilátek (tj . z tzv. imunoknihovny, nativní knihovny) myšího nebo humánního původu. Při technice „phage display se klonují geny pro antigen-vazebné domény jako fúzní geny s genem obalového proteinu g3P vláknitého fága buďto do genomu fága nebo do fagemidového vektoru v podobě fragmentů scFV nebo Fab. Fágy vázající antigen se selektují pomocí plastikových nádob potažených antigenem („rýžování), paramagnetických kuliček konjugovaných s antigenem nebo vazbou na buněčné povrchy.

Imunoknihovny se připraví pomocí amplifikace v polymerázové řetězové reakci (PCR) příslušného genu pro variabilní fragment protilátky z B-lymfocytů imunizovaného zvířete nebo člověka. K tomu se použije kombinace oligonukleotídů, které jsou specifické pro myší nebo lidský imunoglobulin popřípadě imunoglobulinovou genovou rodinu.

Využitím neimunizovaného dárce jako zdroje ··· · imunoglobulinu je možné připravit nativní knihovnu. Alternativně se může využít geny zárodečné imunoglobulinové dráhy pro přípravu semisyntetického repertoáru protilátek, přičemž komplementaritu určující úsek 3 variabilního fragmentu se doplní pomocí PCR s degenerovanými oligonukleotidovým primery. Tyto tzv. „single pot knihovny mají proti imunoknihovnám tu výhodu, že z jediné knihovny se mohou izolovat fragmenty protilátek proti několika antigenům.

Afinita protilátkových fragmentů se může zvýšit prostřednictvím techniky „phage display, přičemž se připraví nová knihovna z již existujících protilátkových fragmentů náhodnou, na kodonech založenou nebo cílenou mutagenezí pomocí záměny jednotlivých domén fragmenty z naivního repertoáru nebo prostřednictvím mutátorových bakteriálních kmenů, a protilátkové fragmenty se zlepšenými vlastnostmi se izolují reselekcí za stringentních (přísných) podmínek. Navíc se mohou myší protilátkové fragmenty humanizovat postupnou výměnou variabilní domény za humánní repertoár a následnou selekcí pomocí původního antigenu (tzv. „guided selection). Alternativně se humanizace myších protilátek provádí cílenou výměnou hypervariabilního úseku humánní protilátky odpovídajícím úsekem původní myší protilátky.

1.2) Aktivační doména (složka b_x) ) a DNA-vazebná doména (složka b₃) )

Ve smyslu předkládaného vynálezu se jako složka b) mohou použít všechny vhodné geny aktivačních domén a DNAvazebných domén transkripčních faktorů. V následujícím ··· « • · ·· *

přehledu jsou uvedeny příklady omezovat).	(aniž by	měly	vynález
Aktivační domény (složka bx) )
alespoň jedna sekvence
• cDNA pro kyselou transaktivační	doménu	(TAD)
HSV1-VP16(aminokyseliny 406	až 488,	Triezenberg et

al. , Genes Developm. 2, 718, 1988, Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5, 190, 1995 nebo aminokyseliny 413 až 490, Regier et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90, 883, 1993) nebo • aktivační doména Oct-2 (aminokyseliny 438 až 479,

Tanaka et al. , Mol. Cell Biol. , 14, 6046, 1994, nebo aminokyseliny 3 až 154, Das et al., Nátuře, 374, 657,

1995) nebo • aktivační doména SPI· (aminokyseliny 340 až 485, Courey a Tijan, Cell 55, 887, 1988) nebo • aktivační doména NFY (aminokyseliny 1 až 233, Li et al., J. Biol. Chem. 267, 8984, 1992, van Hujisduijnen et al., EMBO J. 9, 3119, 1990, Sinha et al., J. Biol.

Chem. 92,	1624, 1995,	Coustry et al. ,	J.	Biol.	Chem.
270, 468,	1995) nebo
• aktivační	doména ITF2	(aminokyseliny 2	az	452,	Seipel
et al., EMBO J. 13, 4961, 1992) nebo
• aktivační	doména c-Myc (aminokyseliny	1 v 1 az	262,
Eilers et	al.) nebo
• aktivační	doména CTF	(aminokyseliny	399 až	499,
Mermod et	al., Cell 58	, 741, 1989, Das	a	Herr,	Nátuře
374, 657,	1995)

DNA-vazebné domény (složka b₃) ) alespoň jedna sekvence • cDNA pro DNA-vazebnou doménu proteinu Gal4 (aminokyseliny 1 až 147, Chasman a Kornberg, Mol. Cell Biol., 10, 2916, 1990) nebo • proteiny LexA (aminokyseliny 1 až 81, Kim et al. ,

Science 255, 203, 1992) nebo celý protein LexA (aminokyseliny 1 až 202, Brent et al. , Cell 43, 729,

1985) nebo • .proteiny represoru lac (lac I) (Brown et al. , Cell

49, 603, 1987, Fuerst et al. , PNAS USA 86, 2549, 1989) nebo • proteiny tetracyklinového represoru (tet R) (Gossen et al. , PNAS USA 89, 5547, 1992, Dingermann et al. ,

EMBO J. 11, 1487, 1992) nebo • proteiny ZFHD1 (Pomerantz et al., Science 267, 93,

1995).

Výhodné je podle předkládaného vynálezu vložit na 3'-konec DNA-vazebné domény jaderný lokalizační signál (NLS).

2) Aktivační sekvence promotorové jednotky II aktivovatelná složkou b) ( složka c))

Výběr této aktivační sekvence se řídí výběrem DNAvazebné domény (složka b₃) ) genu transkripčního faktoru (složka b) ) . Pro příklady uvedené v odstavci 1.2 existují, opět uvedené jako příklad, následující možnosti.

2.1) Možnost A) je vložena aktivační sekvence s alespoň jednou vazebnou sekvencí (nukleotidová sekvence: 5'-CGGACAACTGTTGACCG-3') (sekvence id. č. 1) pro protein Gal4 (Chasman a Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916, 1990) a (na svém 3' -konci) • bazální promotor SV40 (nukleotidy 48 až 5191, Tooze (ed.), DNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor, New York, New York, Cold Spring Harbor Laboratory) nebo • promotor c-fos (Das et al. , Nátuře 374, 657, 1995) nebo • promotor U2 snRNA nebo • promotor HSV TK (Papavassiliou et al., J. Biol. Chem.

265, 9402, 1990, Park et al. , Molec. Endocrinol. 7,

319, 1993) .

2.2) Možnost B)

- je vložena aktivační sekvence > · s alespoň jednou vazebnou sekvencí (nukleotidová sekvence 5'-TACTGTATGTACATACAGTA-3') (sekvence id. č.

2) pro protein	LexA	(operátor	LexA, Brent et al. ,
Nátuře 612, 312,	1984)	a (na svém 3' konci)
• bazální promotor	SV4 0
(nukleotidy 48 až	5191,	Tooze (ed.	), DNA Tumor
Viruses, Cold Spring Harbor, New	York, New York, Cold

Spring Harbor Laboratory) nebo jiný promotor (viz Možnost A).

·· ·· > · · <

> · ·· • · · · 1 ··· ··

- 20 2.3) Možnost C)

- je vložena aktivační sekvence • s alespoň jednou vazebnou sekvencí operátoru lac (nukleot idová sekvence: 5'-GAATTGTGAGCGCTCACAATTC-3') (sekvence id. č. 3) pro represorový protein lac I (Fuerst et al. , PNAS USA 86, 2549, 1989, Simons et al., PNAS USA 81, 1624, 1984) a (na jejím 3' konci) • bazální promotor SV40 (nukleotidy 48 až 5191, Tooze (ed.), DNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor, New York, N. Y., Cold Spring Harbor Laboratory), nebo jiný promotor (viz Možnost A).

2.4) Možnost D)

- je vložena aktivační sekvence • s alespoň jednou vazebnou sekvencí tetracyklinového operátoru (tet 0) (nukleotidová sekvence:

5' -TCGAGTTTACCAC-TCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3') (sekvence id. č. 4) pro tetracyklinový represorový protein (tet R) a (na jejím 3'-konci) • bazální promotor SV40 (nukleotidy 48 až 5191, Tooze (ed.), DNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor, New York, N. Y. , Cold Spring Harbor Laboratory) , nebo jiný promotor (viz Možnost A).

2.5) Možnost E)

- je vložena aktivační sekvence • s alespoň jednou vazebnou sekvencí (nukleotidová sekvence: 5'-TAATGATGGCG-3') (sekvence id. č. 5) pro protein ZFHD-1 (Pomerantz et al., Science 267, 93,

1995) a (na jejím 3' konci) • bazální promotor SV40 (nukleotidy 48 až 5191, Tooze (ed.), DNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor, New

York, New York, Cold Spring Harbor Laboratory), nebo jiný promotor (viz Možnost A).

IV) Detailní popis zvláštností provedení ve formě B) ř

1) Aktivační sekvence promotorové jednotky I (složka a'))

1.1) DNA-vazebná sekvence pro regulátorový protein (složka aj)

Sem patří DNA-vazebné sekvence transkripčních faktorů, které mají mutací zhoršenou DNA-vazebnou schopnost nebo jsou v buňce kvantitativně sníženy nebo zvýšeny, transkripční faktory a jejich změny přehledně publikovali např. Nichols et al. Blood 80, 2953, 1992, Crepieux et al. , Crit. Rev. Oncogen. 5, 615, 1994, LaThangue, TIBS 19, 108, 1994, Lipton, Nátuře Med. 3, 20, 1997).

Patří sem například alespoň jedna DNA-vazebná sekvence

- pro protein p53 (ATAATTGGGCAAGTCTAGGAA-3, (sekvence id. č. 6), Kern et al. , Science 252, 1708, 1991, Cho et al., Science 265, 346, 1994, nebo - (G/A) - (G/A) - (G/A)-C-(A/T)-T/A)-G, Cho et al. , Science 265, 346, 1994)

- pro protein Wt-1 (Wang et al., Oncogene 10, 415, 1995, Borel et al., Biochem. 35/37, 12070, 1996)

- pro protein NF-Kappa B (nukleotidová sekvence 5'-GGGACTTTCC-3' (sekvence id. č. 7), Urban et al. , Genes and Developm. 4, 1975, 1990, Roug et al. , Virol. 189, 750, 1992) nebo HIV-LTR (Gimble et al. , J.

Virol. 62, 41404, 1988)

- pro komplex E2F/DP-1 (alespoň jedna . nukleotidová sekvence 5'-TTTTCCCGCCAAAA (sekvence id. č. 8) nebo 5'-TTTTCCCGCCTTTTTT (sekvence id. č. 9) nebo 5'-TTTTCCCGCGCTTTTTT (sekvence id. č. 10) (Ouellete et al., Oncogene 7, 1075, 1992)

- pro protein Myc/Max (alespoň jedna nukleotidová sekvence 5'-CACGTG-3' (Walhout et al. , Nucl. Acids Res. 25, 1493, 1997, Nozaki et al . , J.

Biochem. 121, 550, 1997) nebo 5'-CATGTG-3' (Fisher et al. ,

EMBO J. 12, 5075, 1993)

1.2) bazální promotor (složka a₂) )

Sem patří například:

- bazální promotor SV40 (nukleotidy 48 až 5191, Tooze (ed.), DNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor, New York, New York, Cold Spring Harbor Laboratory) nebo

- promotor c-fos (Das et al., Nátuře 374, 657, 1995) nebo

- promotor U2 snRNA nebo

- promotor HSV TK(Papavassiliou et al. , J. Biol. Chem. 265, 9402, 1990, Park et al., Molec. Endocrin. 7, 319, 1993) .

2) repřesor (složka b') )

Sem patří například:

- represor lac (Brown et al. , Cell 49, 603, 1987, Fůrst et al., PNAS USA

86, 2549, 1989) nebo

- tetracyklinový represor (Gossen et al. , PNAS USA 89, 5549, 1992, Dingermann et al. ,

EMBO J. 11, 1487, 1992)

• ··· · · • · · • ·· ··

- 23 3) Aktivační sekvence (složka c_x)) ovlivňovaná složkou b')

Sem patří např. všechny aktivační sekvence uvedené v oddíle V)

4) DNA-vazebná sekvence pro represor (složka c₂) )

Sem patří například:

- alespoň jedna vazebná sekvence operátoru lac (nukleotidová sekvence: 5'-GAATTGTGAGCGCTCACAATTC-3') (sekvence id. č. 3) pro represorový protein lac I (Fůrst et al. , PNAS USA 86, 2549, 1989, Simons et al., PNAS USA 81, 1624, 1984) nebo

- alespoň jedna vazebná sekvence tetracyklinového operátoru (tet 0) (nukleotidová sekvence: 5'-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3') (sekvence id. č. 4) pro tetracyklinový represorový protein (tet R).

V) Aktivační sekvence I (složka a) ve formě provedení A) a složka c_x) ve formě B) )

Ve smyslu předkládaného vynálezu se jako aktivační sekvence použijí nukleotidová sekvence, které po navázání transkripčního faktoru aktivuji transkripci genu ležícího v sousedství 3'-konce. Výběr aktivační sekvence se řídí tím, jaká nemoc má být léčena a jaká cílová buňka má být transdukována. Takže aktivační sekvence (složka a)) může být neomezeně aktivovatelná nebo aktivovatelná specificky pro cílovou buňku, aktivovatelná za určitých metabolických podmínek, specificky pro buněčný cyklus nebo aktivovatelná virově specificky. Detailní popis takových promotorových sekvencí je v patentových přihláškách

EP95931933.6, EP95931204.2, EP95931205.9,

DE19639103.2 a DE19651443.6

EP95930524.4, EP97101507.8, K vybraným

EP97102547.3, p romo t o rovým sekvencím patří např. sekvence uvedené v následujícím přehledu;

• · ♦· ·· ·· ·· · · · · • · · · ·· • · · ··· · · * φ φ < φ φφφ ·♦· ♦· ··

1) Promotorové a aktivátorové sekvence, které mohou být aktivovány neomezeným způsobem, jako například

- promotor RNA polymerázy III

- promotor RNA polymerázy II

- promotor CMV a zesilovač CMV

- promotor SV4 0

2) Virové promotorové a aktivátorové sekvence, jako například

- HBV

- HCV

- HSV

- HPV

- EBV

- HTLV

- HIV

Když je použit promotor HIV, je použita celá sekvence

LTR včetně sekvence TAR (pozice -453 až -80, Rosen et al., Cell, 41, 813, 1985) jako virově specifický promotor.

3) Metabolicky aktivovatelné promotorové sekvence a sekvence zesilovače, jako například zesilovač indukovatelný hypoxií.

4) Promotory aktivovatelné specificky pro buněčný cyklus

Takové jsou například promotor genu cdc25C, genu cyklinu A, genu cdc2, genu B-myb, genu DHFR, genu E2F-1, genu cdc25B, nebo jiné vazebné sekvence pro transkripční faktory, které se objevují nebo jsou aktivovány během buněčné proliferace. K těmto vazebným sekvencím patří například vazebné sekvence pro proteiny c-myc. Tyto vazebné sekvence také zahrnují monomery nebo multimery nukleotidové ··· · · ···.

• ··* · · · · ···· · 4 4 4 4 4 4 4 ··· ·· ··· 444 ·· ·♦ sekvence, která se nazývá E-box genu myc (5'-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3' (sekvence id. č. 11) (Blackwood a Eismann, Science 251, 1211, 1991).

5) Promotory aktivovatelné tetracyklinem, jako například tetracyklinový operátor v kombinaci s odpovídajícím represorem.

6) Chimérické promotory

Chimérický promotor představuje kombinace aktivátorové sekvence ležící proti směru transkripce, která může být aktivována buněčně specifickým způsobem, metabolicky nebo způsobem virově specifickým, s promotorovým modulem ležícím po směru transkripce, který obsahuje nukleotidové sekvence CDE-CHR nebo E2FBS-CHR, na které se vážou supresivní proteiny, které prostřednictvím aktivace aktivátorové sekvence proti směru transkripce mohou zastavit buněčný cyklus ve fázích G_o a G_x (PCT/GB94/17366, Lucibello et al. , EMBO J. 14, 12, 1994).

7) Promotory aktivovatelné buněčně specificky

Sem výhodně patří promotorové nebo aktivátorové sekvence promotorů nebo zesilovačů takových genů, které kódují pokud možno proteiny ve zvolených buňkách.

Například ve smyslu vynálezu se výhodně používají promotory pro následující proteiny v následujících buňkách:

7.1. Promotorové a aktivátorové sekvence, které jsou aktivovány v endotelových buňkách

- pro mozek specifický endotelový přenašeč glukózy 1

- endoglin

- receptor VEGF 1 (flt-1) • 9 9 9

9 99

9- 999 9 9

9 9

- receptor VEGF 2 (flk-1, KDR)

- tie-1 nebo tie-2

- receptor B61 (receptor Eck)

- B61

- endotelin, zejména endotelin B nebo endotelin-1

- receptory endotelinu, zejména receptor endotelinu B

- receptory mannózo-6-fosfátu

- von Wilebrandtův faktor

- IL-la, IL-ΐβ

- receptor IL-1

- adhezivní molekula cévní buňky (VCAM-1)

- syntetické aktivátorové sekvence

Jako alternativa k přirozeným endotelové specifickým promotorům se mohou také použít syntetické aktivátorové sekvence, které obsahují oligomerizovaná vazebná místa pro transkripční faktory, které jsou přednostně nebo selektivně aktivní v endotelových buňkách. Takovým příkladem zde je transkripční faktor GATA-2, jehož vazebné místo v genu endotelinu-1 je 5'-TTATCT-3' (Lee et al. , Biol. Chem. 266, 16188, 1991, Dormann et al. , J. Biol. Chem. 267, 1279, 1992 a Wilson et al., Mol. Cell Biol. 10, 4854, 1990.

7.2. Promotorové nebo aktivátorové sekvence aktivované v buňkách v sousedství aktivovaných endotelových buněk

VEGF

Genově regulační sekvence pro gen VEGF jsou 5' hraniční oblast, 3' hraniční oblast, gen c-Src nebo gen v-Src - Receptory steroidních hormonů a jejich promotorové prvky (Truss a Beato, Endocr. Rev., 14, 459, 1993), zejména promotor viru myšího tumoru mléčné žlázy.

7.3. Promotorové nebo aktivátorové sekvence aktivované ve svalových buňkách, zejména v buňkách hladkého svalstva

- tropomyozin

- α-aktin .

- a-myozin

- receptor pro PDGF

- receptor pro FGF

- MRF-4

- fosfofruktokináza A

- fosfoglycerátmutáza

- troponin C

- myogenin

- receptory pro endotelin A

- desmin

- VEGF

Genové regulační sekvence pro gen VEGF již byly uvedeny v části nazvané „Promotory aktivované v buňkách v sousedství aktivovaných endotelových buněk (viz výše).

- „syntetické promotory

Faktory rodiny HLH (šroubovice-smyčka-šroubovice, „helix-loop-helix) (MyoD., Myf-5, myogeny a MRF4) jsou uváděny jako transkripční faktory svalově specifické. Dále ke svalově specifickým transkripčním faktorům patří protein „zinkového prstu GATA-4.

Proteiny HLH, a také GATA-4, projevují transkripci svalově specifickou nejenom s promotory genů svalově specifických, ale také v heterologním kontextu, tedy rovněž se syntetickými promotory. Takové syntetické promotory jsou například mnohonásobné kopie (DNA) vazebného místa pro svalově specifické proteiny HLH, jako je E-box (Myo D) (např. 4x AGCAGGTGTTGGGAGGC) nebo mnohonásobné kopie DNAvazebného místa pro GATA-4 geny těžkého řetězce a-myozinu (např. 5' -GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG-3') (sekvence id. č. 12).

7.4. Promotorové a aktivátorové sekvence aktivované v gliových buňkách.

Tyto sekvence zahrnují zejména genově regulační sekvence popřípadě prvky genů, které například kódují následující proteiny:

- protein periaxin specifický pro Schwannovy buňky

- glutaminsyntetázu

- protein specifický pro gliové buňky (glióvý vláknitý kyselý protein = GFAP)

- protein SIOOb gliové buňky

- IL-6 (CNTF)

- receptory 5-HT

- TNFa

- IL-10

- receptor růstového faktoru podobný inzulínu I a II

- VEGF

Genově regulační sekvence pro gen VEGF již byly uvedeny výše.

7.5. Promotorové a aktivátorové sekvence aktivované v hematopoetických buňkách

K těmto genovým regulačním sekvencím patří promotorové sekvence pro geny cytokinů nebo jejich receptorů, tyto geny jsou exprimovaný v hematopoetických buňkách nebo v sousedních buňkách, jako jsou buňky stromatu.

Tyto sekvence zahrnují promotorové sekvence například pro následující cytokiny a jejich receptory:

- receptor faktoru kmenové buňky

- faktor kmenové buňky

- IL-la

- receptor IL-1

- IL-3

- receptor IL-3 (podjednotka a)

- receptor IL-3 (podjednotka β)

- IL-6

- receptor IL-6

- GM-CSF

- receptor GM-CSF (řetězec a)

- interferonový regulační faktor 1 (IRF-1)

Promotor IRF-1 je aktivován do stejné míry prostřednictvím IL-6 jako prostřednictvím IFNy nebo IFNp.

- erytropoetin

- receptor erytropoetinu

7.6. Promotorové a aktivátorové sekvence aktivované v lymfocytech a/nebo makrofázích

Patří k nim například promotorové a aktivátorové sekvence genů cytokinů, cytokinových receptoru a adhezivních molekul a .receptorů pro fragment Fc protilátek.

Patří k nim například:

- receptor IL-1

- IL-la

- IL-ΐβ

- IL-2

- receptor IL-2

- IL-3

- receptor IL-3 (podjednotka a)

- receptor IL-3 (podjednotka β) i

• fc

- 30 - IL-4

- receptor IL-4

- IL-5

- IL-6

- receptor IL-6

- interferonový regulační faktor 1 (IRF-1) (Promotor IRF-1 je aktivován prostřednictvím IL-6 do stejné míry jako prostřednictvím IFNy nebo IFNP) .

- promotor responzivní na IFNy

- IL-7

- IL-8

- IL-10

- IL-11

- IFNy

- GM-CSF

- receptor GM-CSF (řetězec a)

- IL-13

- LIF

- receptor faktoru stimulujícího kolonii makrofágů (M-CSF)

- receptory makrofága typu I a II

- MAC-1 (leukocytární funkční antigen)

- LFA-Ια (leukocytární funkční antigen)

- pl50,95 (leukocytární funkční antigen)

7.7. Promotorové sekvence a aktivátorové sekvence aktivované v synoviálních buňkách

Patří k nim promotorové sekvence pro metaloproteinázy mezibuněčné hmoty (MMP), například pro

- MMP-1 (intersticiální kolagenáza)

- MMP-3 (stromelyzin/tranzin) • · · · ♦ · »·

Dále k nim patří promotorové sekvence pro tkáňové inhibitory metaloproteináz (TIMP), například

- TIMP-1

- TIMP-2

- TIMP-3

7.8. Promotory a aktivátorové sekvence aktivované v leukemických buňkách

Patří k nim například promotory pro

- c- myc

- HSP-70

- bcl-l/cyklin D-l

- bcl-2

- IL-6

- IL-10

- TNFa, TNFP

- HOX-11

- BCR-Abl

- E2A-PBX-1

- PML-RARA (promyelocytární leukemie - receptor kyseliny retinové)

- c-myc

Proteiny c-myc se váží na a aktivují multimery nukleotidové sekvence, která se nazývá Myc E-box (5'-GGAAGCAGACCAGCTGGTCTGCTTCC-3') (sekvence id. č. 11) .

7.9. Promotory nebo aktivátorové sekvence aktivované v nádorových buňkách

Za promotorové nebo aktivátorové sekvence se považují genové regulační sekvence, se kterými interagují transkripční faktory, které se tvoří nebo jsou aktivní v nádorových buňkách, · » 4

4 44

4 4 4 4

4 4 *'· 4· • 4 ··· 4

- 32 Ve smyslu tohoto vynálezu výhodné promotory nebo aktivátorové sekvence zahrnují genově regulační sekvence případně prvky z genů, které kódují proteiny, které jsou tvořeny zejména v rakovinných buňkách nebo buňkách sarkomů. Tedy v případě malobuněčných bronchiálních karcinomů je výhodné použití promotoru proteinu N-CAM, v případě ovariálních karcinomů použití promotoru receptoru růstového faktoru hepatitidy nebo L-plastinu, a v případě pankreatických karcinomů použití promotoru L-plastinu nebo polymorfního epitělového mucinu (PEM).

VI. Efektorové geny (složka d))

Ve smyslu vynálezu efektorové geny (složka d) ) kódují účinnou látku pro profylaxi a/nebo léčbu nemoci. Efektorové geny a promotorové sekvence jsou vybírány s ohledem na povahu léčby nemoci a berou se do úvahy cílové buňky, které mají být transdukovány.

Například následující kombinace promotorových sekvencí a efektorových genů' se vybírají ve spojení s následujícími nemocemi (detailní popis již byl uveden v patentových přihláškách EP95930524.4, EP95931933.6 , EP95931204.2, EP95931205.9, EP97101507.8 , DE19617851.7, DE19639103.2 a DE19651443.6, na které se tímto plně odkazuje):

1) Léčba nádorů

1.1) Cílové buňky:

- proliferující endotelové buňky nebo

- buňky stromatu a svalové buňky, které sousedí s endotelovými buňkami nebo

- nádorové nebo leukemické buňky

- 33 1.2) Promotory:

specifické pro endotelové buňky a specifické pro buněčný cyklus nebo buněčně nespecifické nebo specifické pro svalové buňky a specifické pro buněčný cyklus nebo specifické pro nádorové buňky , (solidní nádory a leukemie) a specifické pro buněčný cyklus

1.3) Efektorové geny inhibitorů buněčné proliferace například pro:

protein retinoblastomu (pRb=pllO) nebo příbuzné proteiny pl07 a pl30

Protein retinoblastomu (pRb/pllO) a příbuzné proteiny pl07 a pl30 jsou inaktivovány fosforylací. Výhodné je použití takových genů těchto inhibitorů buněčného cyklu, které projevují mutace pro inaktivační místa exprimovaných proteinů, aniž by se tím zhoršila funkce těchto proteinů. Příklady těchto mutací jsou popsány v případě pllO. Sekvence DNA proteinu pl07 nebo proteinu pl30 je mutována analogicky.

- protein p53

V buňce je protein p53 inaktivován buď vazbou na speciální proteiny, jako je MDM2, nebo oligomerizací p53 prostřednictvím defosforylovaného šeřinu na C-koncové části. Proto je výhodné použití sekvence DNA pro protein p53, který byl na C-koncové části zkrácen odstraněním šeřinu 392.

- p21 (WAF-1)

- protein pl6

- další inhibitory cdk

- protein GADD45

- protein bak

- vazebný protein pro regulační protein (viz II. 1.)

1.4) Efektorové geny pro faktory vyvolávající koagulaci a inhibitory angiogeneze, například:

- inhibitor aktivátoru plazminogenu 1 (PAI-1)

- PAI-2

- PAI-3

- angiostatin

- interferony (IFNa, IFNp nebo IFNy)

- destičkový faktor 4

- TIMP-1

- TIPM-2

- TIMP-3

- leukemický inhibiční faktor (LIF)

- tkáňový faktor (TF) a jeho koagulačně aktivní fragmenty

1.5) Efektorové geny pro cytostatické a cytotoxické proteiny, například pro:

- perforin

- granzym

- IL-2

- IL- 4

- IL-12

- interferony, jako například IFN-α, IFNP nebo IFNy

- TNF, jako TNFa nebo TNFP

- onkostatin M

- sfingomyelináza

- magainin a deriváty magaininu ·· ··· ' · ·

1.6 Efektorové geny pro cytostatické nebo cytotoxické protilátky a pro fúzní proteiny mezi protilátkovými fragmenty vázajícími antigen a cytostatickými, cytotoxickými nebo zánět vyvolávajícími proteiny nebo enzymy.

- K cytostatickým nebo cytotoxickým protilátkám patří ty, které jsou namířené proti membránovým strukturám endotelových buněk, jak byly popsány například autory: Burrows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155, 1994), Hughes et al. (Cancer Res. 49> 6214, 1989) a Maruyama et al. (PNAS USA 87, 5744, 1990). Tyto protilátky zahrnují zejména protilátky proti receptorům VEGF.

Patří k nim dále cytostatické nebo cytotoxické protilátky, které jsou namířené proti membránovým strukturám na nádorových buňkách. Protilátky této povahy byly uvedeny v přehledech autory: Sedlaček et al. (Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, Můnchen, 1988, a Contrib. to Oncol. 43, Karger Verlag, Můnchen, 1992). Dalšími příklady jsou protilátky proti sialyl Lewis, proti peptidům na nádorech, které jsou rozeznávány T buňkami, proti proteinům, které jsou exprimovány onkogeny, proti gangliosidům, jako GD3, GD2, GM2, 9-O-acetyl GD3, fukosyl GM1, proti antigenům krevních skupin a jejich prekurzorům, proti antigenům na polymorfním epitelovém mucinu, proti antigenům na proteinech tepelného šoku.

- Dále k nim patří protilátky, které jsou namířeny proti membránovým strukturám leukemických buněk. Velké množství monoklonálních protilátek této povahy již bylo popsáno v diagnostických a léčebných způsobech (přehledy: Kristensen, Danish Medical Bulletin 41, 52, 1994, Schranz, Therapia Hungarica 38, 3, 1990, Drexler et al. , Leuk. Res. 10, 279, 1986, Naeim, Dis. Markers 7, 1, 1989, Stickney et al. , Curr. Opin. Oncol. 4, 847, 1992, Drexler et al. , Blut ··· • ·0

57, 327, 1988, Freedman et al., Cancer Invest. 9, 69, 1991). V závislosti na typu leukemie jsou jako ligandy vhodné například monoklonální protilátky nebo jejich protilátkové fragmenty vázající antigen namířeny proti následujícím membránovým antigenům:

Buňky

Membránový antigen

AML

B-CLL

T-CLL

ALL

CD13

CD15

CD33

CAMAL

Sialosyl-Le

CD5

CDlc

CD23

Idiotypy a izotypy membránových imunoglobulinů CD33

M38 receptory IL-2 receptory T buněk

CALLA

CD19

Nehodgkinský lymfom

- Humanizace myších protilátek, příprava a optimalizace genů pro Fab a rekombinantní fragmenty Fv se prováděj í podle odborníkům známé techniky. Fúze rekombinantních fragmentů Fv s geny pro cytostatické, cytotoxické nebo zánět vyvolávající proteiny nebo enzymy se provádějí v souladu s odborníkům známým stavem techniky.

• · ♦ ♦ · · · ·

9 9 9 999 9 ·

··· ·· ·

- 37 1.7) Efektorové geny pro fúzní proteiny ligandů vázajících se na cílovou buňku s cytostatickými a cytotoxickými proteiny. K ligandům patří všechny látky, které se váží na membránové struktury nebo membránové receptory na endotelových buňkách. Například sem patří

- Cytokiny, jako například IL-1 nebo růstové faktory nebo jejich fragmenty či částečné sekvence, které se váží na receptory, které jsou exprimovány endotelovými buňkami, jako například PDGF, bFGF, VEGF a TGF.

- Dále k nim patří adhezivní molekuly, které se váží na aktivované a/nebo proliferující endotelové buňky. Patří k nim například Slex, LFA-1, MAC-1, LECAM-1, VLA-4 nebo vitronektin.

- Patří k nim další látky, které se váží na membránové struktury nebo membránové receptory nádorových nebo leukemických buněk. Například sem patří hormony nebo růstové faktory nebo jejich fragmenty či částečné sekvence, které se váží na receptory, které jsou exprimovány leukemickými nebo nádorovými buňkami.

Takové růstové faktory již byly popsány (přehledy autorů: Cross et al. , Cell 64, 271, 1991, Aulitzky et al. , Drugs . 48, 667, 1994, Moore, Clin. Cancer Res. 1, 3, 1995, Van Kooten et al., Leuk. Lymph. 12, 27, 1993.

- Fúze genů ligandů, které se váží na cílovou buňku, s geny pro cytostatické, cytotoxické nebo zánět vyvolávající proteiny nebo enzymy, se provádí v souladu se stavem techniky za použití metod, které jsou odborníkovi známy.

• ·· ·· «· * · · ♦ ♦ · · ·♦ • · ··« · · • · · · • ··· ·· · *

1.8.) Efektorové geny pro induktory zánětů jsou např. následující geny pro:

- IL-1

- IL-2

- RANTES (MCP-2)

- monocytární chemotaktický a aktivační faktor (MCAF)

- IL-8

- makrofágový zánětlivý protein 1 (ΜΙΡ-Ια, -β)

- neutrófilový aktivační protein 2 (NAP-2)

- IL-3

- IL-5

- lidský leukemický inhibiční faktor (LIF)

- IL-7

- IL-11

- IL-13

- GM-CSF

- G-CSF

- M-CSF

- faktor kobřího jedu (CVF) nebo částečné sekvence CVF, které funkčně odpovídají lidskému komplementpvému faktoru C3b, tj., které jsou schopny se vázat ke komplementovému faktoru B a které tvoří konvertázu C3 po štěpení faktorem D lidský komplementový faktor C3 nebo jeho částečná sekvence C3b

- štěpné produkty lidského komplementového faktoru C3, které jsou funkčně a strukturálně podobné CVF

- bakteriální proteiny, které aktivují komplement nebo vyvolávají záněty, jako jsou například poriny ze Salmonella typhimurium, „srážlivé faktory ze Staphylococcus aureus, moduliny, zejména z gramnegativních bakterií, „hlavní vnější membránový • · ··· • · · * • · ·· φφ« φ · φ φ · « · · · protein legionel nebo z Haemophilus influenzae typu B nebo z klebsiel, nebo M molekuly streptokoků skupiny G.

1.9) Efektorové geny pro enzymy pro aktivaci prekurzorů cytostatik, například pro enzymy, které štěpí inaktivní prekurzorové látky (předléky) na aktivní cytostatika (léky).

Takovéto látky, předléky a léky, již byly uvedeny v přehledech autorů: Deonarain et al. (Br. J. Cancer 70, 786, 1994), Mullen (Pharmac. Ther. 63, 199, 1994) a Harris et al. (Gene Ther. 1, 170, 1994). Lze použít například sekvence DNA pro jakýkoliv enzym z následujících:

- thymidinkináza viru Herpes simplex

- thymidinkináza viru Varicella zoster

- bakteriální nitroreduktáza

- bakteriální β-glukuronidáza

- rostlinná β-glukuronidáza ze Secale cereale

- lidská β-glukuronidáza

- lidská karboxypeptidáza (CB), například CB-A mastocytů, pankreatická CB-B nebo bakteriální karboxypeptidáza

- bakteriální β-laktamáza

- bakteriální cytosindeamináza

- lidská kataláza popř. peroxidáza

- fosfatáza, zejména lidská alkalická fosfatáza, lidská kyselá fosfatáza z prostaty a nebo kyselá fosfatáza typu 5 oxidáza, zejména lidská lysyloxidáza nebo lidská kyselá D-aminooxidáza peroxidáza, zejména lidská glutathionperoxidáza, lidská eosinofilní peroxidáza nebo lidská thyroidní peroxidáza

-galaktosidáza

2) Léčba autoimunitních nemocí a zánětů

2.1) Cílové buňky:

- proliferující endotelové buňky nebo

- makrofágy a/nebo lymfocyty nebo

- synoviální buňky

2.2) Promotory:

specifické pro endotelové buňky a specifické pro buněčný cyklus nebo specifické pro makrofágy a/nebo specifické pro lymfocyty a/nebo specifické pro buněčný cyklus

- specifické pro synoviální buňky a/nebo specifické pro buněčný cyklus

2.3) Efektorové geny pro léčbu alergií', například:

- IFNp

- IFNy

- IL-10

- protilátky nebo protilátkové fragmenty proti IL-4

- rozpustné receptory IL-4

- IL-12

- TGFp

2.4) Efektorové geny pro zabránění rejekci transplantovaných orgánů jsou například:

- IL-10

- TGFp

- rozpustné receptory IL-1

- rozpustné receptory IL-2

- antagonisté receptoru IL-1

- rozpustné receptory IL-6 ·· · · ··

9 9 9

999 9 9

9^9

999 99 999 ·« ·

- 41 imunosupresivní protilátky nebo jejich fragmenty obsahující V_H a V_L nebo jejich fragmenty V_H a V_L, které jsou spojeny prostřednictvím spojky. Imunosupresivní protilátky jsou například protilátky specifické pro T buněčný receptor nebo jeho komplex CD3, proti CD4 nebo CD8, dále proti receptorů IL-2, receptorů IL-1 nebo receptorů IL-4 nebo proti adhezivním molekulám CD2, LFA-1, CD2 8 nebo CD40.

2.5) Efektorové geny pro léčbu autoimunitních nemocí zprostředkovaných protilátkami, například pro:

- TFGp

- IFNa

- IFNP

- IFNy

- IL-12

- rozpustné receptory IL-4

- rozpustné receptory IL-6 imunosupresivní protilátky nebo jejich fragmenty obsahující V_H a V_L

2.6) Efektorové geny pro léčbu autoimunitních nemocí zprostředkovaných buňkami, například:

- IL-6

- IL-9

- IL-10

- IL-13

- TNFa nebo TNFp

- imunosupresivní protilátky nebo jejich fragmenty obsahující V_H a V_L

2.7) Efektorové geny pro inhibitory buněčné proliferace, cytostatické nebo cytotoxické proteiny a enzymy pro aktivaci prekurzorů cytostatik.

Příklady genů kódujicích·proteiny této povahy již byly uvedeny v části nazvané „Efektorové geny pro léčbu nádorů.

Ve smyslu vynálezu mohou být použity, ve stejné formě jak již bylo v příslušném bodě popsáno, efektorové geny, které kódují fúzní proteiny, které obsahují protilátky nebo fragmenty Fab nebo rekombinantní fragmenty Fv těchto protilátek nebo jiných ligandů, které jsou specifické pro cílové buňky, a výše zmíněné cytokiny, růstové faktory, receptory, cytostatické nebo cytotoxické proteiny a enzymy.

2.8) Efektorové geny pro léčbu artritidy

Ve smyslu vynálezu jsou vybrány efektorové geny, jejichž exprimovaný protein přímo nebo nepřímo inhibuje zánět, například v kloubu, a/nebo podporuje rekonstituci mezibuněčné hmoty (chrupavky a vazivové tkáně) v kloubu.

Patří k nim například:

- antagonista receptoru IL-1 (IL-l-RA)

IL-l-RA inhibuje vazbu IL-Ια, β

- rozpustný receptor IL-1 rozpustný receptor IL-1 váže a inaktivuje IL-1

- IL-6

IL-6 zvyšuje sekreci TIMP a superoxidů a snižuje sekreci IL-1 a TNFa synoviálními buňkami a chondrocyty

- rozpustný receptor TNF rozpustný receptor TNF váže a inaktivuje TNF

- IL-4

IL-4 inhibuje tvorbu a sekreci IL-1, TNFa a MMP

IL-10 ,,, · · · · · · * ··· · · · · ··· · · * · · · · · · «·· ·· ··· ··· ·· ··

IL-10 inhibuje tvorbu a sekreci IL-1, TNFa a MMP a zvyšuje sekreci TIMP

- růstový faktor podobný inzulínu (IGF-1)

IGF-1 stimuluje syntézu mezibuněčné hmoty

- TGFP, zejména TGFpi a TGFP2

TGFp stimuluje syntézu mezibuněčné hmoty

- superoxiddismutáza

- TIMP, zejména TIMP-1, TIMP-2 nebo TIMP-3

3) Léčba nedostatečné hematopoézy

3.1) Cílové buňky:

- proliferující nezralé buňky hematopoetického systému nebo

- buňky stromatu v sousedství hematopoetických buněk

3.2) Promotory:

- specifické pro hematopoetické buňky a/nebo specifické pro buněčný cyklus

- buněčně nespecifické a specifické pro buněčný cyklus

3.3) Efektorové geny pro léčbu anémie, například gen pro:

- erytropoetin

3.4) Efektorové geny pro léčbu leukopenie, například pro:

- G-CSF

- GM-CSF

- M-CSF

3.5) Efektorové geny pro léčbu trombocytopenie, například pro:

- IL-3

- leukemický inhibiční faktor (LIF) ·· ·· • · · * • · ·· • ··· · · • · · ·· ·· ··· • ·

- 44 - IL-11

- trombopoetin

4) Léčba poškození nervového systému:

4.1) Cílové buňky:

- gliové buňky nebo

- proliferující endotelové buňky

4.2) Promotory:

- specifické pro gliové buňky a specifické pro buněčný cyklus nebo specifické pro endotelové buňky a specifické pro buněčný cyklus nebo

- nespecifické a specifické pro buněčný cyklus

4.3) Efektorové geny pro neuronové růstové faktory, například:

- FGF

- nervový růstový faktor (NGF)

- neurotrofický faktor pocházející z mozku (BDBF)

- neurotrofin-3 (NT-3)

- neurotrofin-4 (NT-4)

- ciliární neurotrofický faktor (CNTF)

4.4) Efektorové geny pro enzymy, například pro:

- tyrosinhydroxylázu

- dopadekarboxylázu

4.5) Efektorové geny pro cytokiny a jejich inhibitory, které inhibují nebo neutralizují neurotoxický účinek TNFa, například pro:

- TGFp

0

000

000

- 45 - rozpustné receptory TNF receptory TNF neutralizují TNFa

- IL-10

IL-10 inhibuje tvorbu IFNy, TNFa, IL-2 a IL-4

- rozpustné receptory IL-1

- IL-1 receptor I

- IL-1 receptor II rozpustné receptory IL-1 neutralizují aktivitu IL-1

- antagonista receptoru IL-1

- rozpustné receptory IL-6

5) Léčba poruch krevního koagulačního systému a krevního oběhu

5.1) Cílové buňky:

- endotelové buňky nebo

- proliferující endotelové buňky nebo somatické buňky v sousedství endotelových buněk a buněk hladkého svalstva nebo

- makrofágy

5.2) Promotory:

- buněčně nespecifické a specifické pro buněčný cyklus nebo specifické pro endotelové buňky, buňky hladkého svalstva nebo makrofágy a specifické pro buněčný cyklus

5.3) Strukturní geny pro inhibici koagulace nebo pro podporu fibrinolýzy, například pro:

- aktivátor tkáňového plazminogenu (tPA)

- aktivátor plazminogenu urokinázového typu (uPA)

- hybridy tPA a uPA

- protein C • · · · · · · • ··· · · · · ··· · • · · · · · ··· ·· ····*· ··

- hirudin

- inhibitory serinové proteázy (serpiny), jako například inhibitor C-1S, αΐ-antitrypsin nebo antitrombin III

- inhibitor dráhy tkáňového faktoru (TFPI)

5.4) Efektorové geny pro podporu koagulace, například pro:

- F VIII

- F IX

- von Willebrandtův faktor

- F XIII

- PAI-1

- PAI-2

- tkáňový faktor a jeho fragmenty

5.5) Efektorové geny pro angiogenní faktory, například pro:

- VEGF

- FGF

5.6) Efektorové geny pro snížení krevního tlaku, například pro:

- kalikrein

- syntázu oxidu dusnatého endotelových buněk

5.7) Efektorové geny pro inhibici proliferace buněk hladkého svalstva po poranění endotelové vrstvy, například pro:

- antiproliferační, cytostatický nebo cytotoxický protein nebo

- enzym pro štěpení prekurzorů cytostatik na cytostatika, jak již bylo uvedeno výše (v části týkající se nádorů) nebo • ftft · · • ft ft · ftft ftft ftftft ft ft ft ftftft · · · · • · ftft ftftft ftft ftftft ftftft v v · « » ftft I

I · ·· ftft·· 4 • ft I • · ··

- fúzní protein jedné z těchto aktivních látek s ligandem, například protilátkami nebo fragmenty protilátek specifickými pro svalové buňky

5.8) Efektorové geny pro další proteiny krevní plazmy, například pro:

- albumin

- inaktivátor Cl

- sérovou cholinesterázu

- transferin

- 1-antitrypsin

6) Vakcinace

6.1) Cílové buňky:

- svalové buňky

- makrofágy a/nebo lymfocyty

- endotelové buňky

6.2) Promotory:

- nespecifické a specifické pro buněčný cyklus nebo

- specifické pro cílovou buňku a specifické pro buněčný cyklus

6.3) Efektorové geny pro profylaxi infekčních nemocí:

Možnosti přípravy účinných vakcín obvyklým způsobem jsou omezeny.

Proto byla vyvinuta technologie DNA vakcín. Avšak tyto DNA vakcíny vyvolávají otázky s ohledem na sílu jejich účinnosti.

Podle předkládaného vynálezu je třeba počítat s větší účinností těchto DNA-vakcín.

• ♦· · · 44 44 • 4 ' 4 ·· ·· · · « · • · · 4 · 4 4 4· • ··· · · 9 9 444 4 *

4 4 4 4 9 4

999 99 444 444 44 44

Jako aktivní látka se vybere DNA pro protein, který je tvořen infekčním agens a který prostřednictvím vyvolání imunitní reakce, tj . pomocí vazby protilátky a/nebo prostřednictvím cytotoxických lymfocytů T, vede k neutralizaci a/nebo destrukci agens. Takzvané neutralizační antigeny této povahy jsou již používány jako vakcinační antigeny (viz přehled v Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 263, 1992) .

Výhodně jsou ve smyslu vynálezu DNA kódující neutralizační antigeny následujících agens:

- virus chřipky A

- HIV

- virus rabies

- virus HSV (herpes simplex virus)

- RSV (respirační syncyciální virus)

- virus parainfluenzy

- rotavirus

- VZV (varicella zoster virus)

- CMV (cytomegalovirus)

- virus spalniček

- HPV (lidský papilomavirus)

- HBV (virus hepatitidy B)

- HCV (virus hepatitidy C)

- HDV (virus hepatitidy D)

- HEV (virus hepatitidy E)

- HAV (virus hepatitidy A)

- antigen vibria cholery

- Borrelia burgdorferi

- Helicobacter pylori

- antigen malárie

Avšak ve smyslu vynálezu k aktivním látkám této povahy patří také DNA pro anti-idiotypovou protilátku nebo její ·· · fragmenty vázající antigen, jejichž struktury vázající antigen (komplementaritu určující oblasti) představují kopie proteinové nebo sacharidové struktury neutralizačního antigenu infekčního agens.

Takové anti-idiotypové protilátky mohou nahradit zejména sacharidové antigeny v případě bakteriálních infekčních agens.

Anti-idiotypové protilátky této povahy a jejich štěpné produkty byly uvedeny v přehledech autorů: Hawkins et al. , (J. Immunother. 14, 273, 1993) a Westerink a Apicella (Springer Seminars in Immunopathol. 15, 227, 1993).

6.4) Efektorové geny pro „nádorové vakcíny

- Patří sem	antigeny	na	nádorových buňkách.	Antigeny
této povahy byly	uvedeny	například v	přehledech	autorů:
Sedlaček et al.,	Contrib.	to	Oncol.	32, Karger	Verlag,
Můnchen, 1988, a	Contrib.	to	Oncol.	43, Karger	Verlag,
Můnchen, 1992.

Další příklady představují geny pro následující proteinové antigeny, popřípadě variabilní oblast (V_L, V_H) anti-idiotypových protilátek, odpovídající následujícím neproteinovým antigenům:

- gangliosidy

- sialyl Lewis

- peptidy na nádorech, které jsou rozpoznávány

T-buňkami

- proteiny exprimované onkogeny

- antigeny krevních skupin a jejich prekurzory

- antigeny na mucinu spojeném s nádory

- antigeny na proteinech tepelného šoku

7) Léčba chronických infekčních nemocí

7.1) Cílová buňka:

- jaterní buňka

- lymfocyt a/nebo makrofág

- epitelová buňka

- endotelová buňka

7.2) Promotory:

virově specifické nebo buněčně specifické a specifické pro buněčný cyklus

7.3) Efektorové geny například pro:

- protein, který projevuje cytostatické, apoptotické nebo cytotoxické účinky.

enzym, který štěpí prekurzor antivirové nebo cytotoxické látky na aktivní látku.

7.4) Efektorové geny pro antivirové proteiny

- antivirově účinné cytokiny a růstové faktory. Patří k nim například IFNa, ΙΡΝβ, IFNy, TNFp, TNFa, IL-1 nebo TGFp.

protilátka mající specificitu, která inaktivuje příslušný virus, nebo její fragmenty obsahující V_H a V_L, nebo její fragmenty V_H a V_L, které jsou spojeny prostřednictvím spojky, připraveny, jak již bylo popsáno.

Protilátky proti virovým antigenům jsou například:

- ant i	HBV
- ant i	HCV
- ant i	HSV
- ant i	HPV
- ant i	HIV

4 4

4 9

4 • 4 ♦ »

444 4 44

4 4 4 • 4444 4

4 4

444 44 444

- 51 - anti EBV

- anti HTLV

- anti Coxsackie virus

- anti Hantaan virus

- Protein vázající rev. Tyto proteiny se váží k rev-RNA a inhibují kroky následující po transkripci závislé na rev v expresi retrovirálních genů. Příklady proteinů vázajících rev jsou:

- RBP9-27

- RBP1-8U

- RBP1-8D

- pseudogeny RBP1-8

- Pro ribozymy, které štěpí mRNA genů pro proteiny, které řídí buněčný cyklus, nebo mRNA virů. Ribozymy, které jsou katalytické pro HIV, byly přehledně popsány například v Christoffersen et al. , J. Med. Chem. 38, 2033, 1995.

7.5) Efektorové geny pro antibakteriální proteiny

K antibakteriálním proteinům patří například protilátky, které neutralizují bakteriální toxiny nebo které opsonizují baktérie. Patří k nim například protilátky proti

- meningokokům C nebo B

- E. coli

- Borreliím

- Pseudomonas

- Helicobacter pylori

- Staphylococcus aureus

VII) Kombinace totožných nebo odlišných efektorových genů

Předmětem vynálezu je dále samozesilující, farmakologicky regulovatelný expresní systém, ve kterém jsou kombinovány sekvence DNA dvou totožných nebo dvou odlišných efektorových genů (složky c) a c')) . Pro expresi obou sekvencí DNA je jako regulační prvek mezi oba efektorové geny vložena další promotorova sekvence nebo výhodně cDNA vnitřního ribozomálního vstupního místa (IRES).

IRES umožňuje expresi dvou sekvencí DNA, které jsou spojeny k sobě navzájem prostřednictvím IRES.

IRES této povahy byly popsány například v článcích autorů: Montford a Smith (TIG 11, 179, 1995), Kaufman et al. (Nucl. Acids Res. 19, 4485, 1991), Morgan et al. (Nucl. Acids Res. 20, 1293, 1992), Dirks et al. (Gene, 128, 247,

1993), Pelletier a Sonenberg (Nátuře 334, 320, 1988) a Sugitomo et al. (BioTechn. 12, 694, 1994).

Tak například může být použita cDNA sekvence IRES polioviru (pozice < 140 až > 630 z 5' UTR.

Ve smyslu vynálezu jsou výhodně spojovány přes další promotorové sekvence nebo sekvence IRES efektorové geny, které projevují aditivní účinek.

Ve smyslu vynálezu jsou výhodné kombinace efektorových genů například pro

1) Léčbu nádorů totožné nebo odlišné cytostatické, apoptotické, cytotoxické nebo zánět vyvolávající proteiny nebo - totožné nebo odlišné enzymy pro štěpení prekurzorů cytostatik «· • · • 9 99 • 9999 1 • · ( ·· 99

- 53 2) Léčbu autoimunitních nemocí odlišné cytokiny nebo receptory se synergickým účinkem na inhibici buněčné a/nebo humorální imunitní reakce nebo

- odlišné nebo totožné TIMP

3) Léčbu nedostatečné hematopoezy odlišné, hierarchicky následující cytokiny, jako například IL-1, IL-3, IL-6 nebo GM-CSF a erytropoetin,

G-CSF nebo trombopoetin

4) Léčbu poškození nervové buňky

- neuronový růstový faktor a cytokin nebo inhibitor cytokinů

5) Léčbu poruch' krevního koagulačního systému a krevního oběhu

- antitrombotický přípravek a fibrinolytický přípravek (např. tPA nebo uPA) nebo cytostatický, apoptotický nebo cytotoxický protein a antitrombotický přípravek nebo fibrinolytický přípravek

-několik odlišných, synergisticky působících koagulačních faktorů, například F VIII a vWF nebo F VIII a F IX

6) Vakciny

- antigen a cytokin stimulující imunitu, jako například IL-la, IL-Ιβ, IL-2, GM-CSF, IL-3 nebo receptor . IL-4 různé antigeny jednoho infekčního agens nebo odlišných infekčních agens nebo

- různé antigeny jednoho nádorového typu nebo odlišných nádorových typů

7) Léčbu virových infekčních nemocí

- antivirový protein a cytostatický, apoptotický nebo cytotoxický protein protilátka proti odlišným povrchovým antigenům jednoho viru nebo několika virů

8) Léčbu bakteriálních infekčních nemocí

- protilátky proti odlišným povrchovým antigenům a/nebo toxinům škodlivého organismu

VIII. Vložení signálních sekvencí a transmembránových domén

1) Zesílení translace

Aby se zesílila translace, nukleotidová sekvence GCCACC nebo 3'-konec promotorové sekvence a startovacího signálu (ATG) signální sekvence muže

GCCGCC přímo být vložena například na na 5' konec popřípadě 108, 299, transmembránové sekvence (Kozák, J. Cell Biol 1989) .

2) Usnadnění sekrece

Aby se usnadnila sekrece expresního produktu efektorového genu, může být nahrazena homologní signální sekvence, která je přítomná v sekvenci DNA efektorového genu, heterologní signální sekvencí, která zlepšuje extracelulární sekreci.

Tedy například může být vložena signální sekvence pro imunoglobulin (pozice DNA < 63 až > 107, Riechman et al. , Nátuře 332, 323, 1988) nebo signální sekvence pro CEA (pozice DNA < 33 až > 134, Schrewe et al. , Mol. Cell Biol.

··· · • · ·· • ···· · * · ·

- 55 10, 2738, 1990, Berling et al. , Cancer Res. 50, 6534, 1990) nebo signální sekvence glykoproteinu lidského respiračního syncyciálního viru (cDNA pro aminokyseliny < 38 až > 50 nebo 48 až 65, Lichtenstein et al. , J. Gen. Virol. 77, 109, 1996).

3) Ukotvení účinné látky

3.1) Aby se ukotvila aktivní sloučenina v buněčné membráně transdukované buňky, která tvoří aktivní látku, může být alternativně nebo navíc vložena signální sekvence pro transmembránovou doménu

Tak například mezi promotorovou sekvenci a sekvenci ^fektorového genu může být vložena transmembránová sekvence lidského faktoru stimulujícího kolonie makrofágů (pozice DNA < 1485 až > 1554, Cosman et al., Behring Inst. Mitt. 83, 15, 1988) nebo sekvence DNA pro signální a transmembránové oblasti glykoproteinu G lidského respiračního syncyciálního viru (RSV) (aminokyseliny 1 až 63 nebo jejich částečná sekvence, aminokyseliny 38 až 63, Vijaya et al. , Mol. Cell Biol. 8, 1709, 1988, Lichtenstein et al., J. Gen. Virol. 77, 109, 1996) nebo sekvence DNA pro signální a transmembránové oblasti neuraminidázy viru chřipky (aminokyseliny 7 až 35 nebo částečná sekvence aminokyseliny 7 až 27, Brown et al. , J. Virol., 62, 3824, 1988).

3.2) Aby se ukotvila aktivní sloučenina v buněčné membráně transdukované buňky, která tvoří aktivní sloučeninu, může být také vložena nukleotidová sekvence pro glykofosfolipidovou kotvu.

Glykofosfolipidová kotva je vložena na 3'-konec nukleotidové sekvence pro efektorový gen, přičemž toto • · φ · • ··· · ·

- 56 vložení může být provedeno navíc kromě vložení signální sekvence.

Glykofosfolipidové kotvy byly popsány například pro CEA, pro N-CAM a pro další membránové proteiny, jako například Thy-1 (viz přehled Ferguson et al. , Ann. Rev. Biochem. 57, 285, 1988).

3.3) Další možností pro ukotvení aktivní látky v buněčné membráně v souladu s předkládaným vynálezem je použití sekvence DNA pro fúzní protein „ligand-aktivní látka. Specificita ligandu tohoto fúzního proteinu je namířena proti membránové struktuře na buněčné membráně vybrané cílové buňky.

K ligandům, které se váží na povrch buněk, patří například protilátky nebo protilátkové fragmenty namířené proti povrchovým strukturám, například:

endotelových buněk, zejména sem patří protilátky proti receptořům VEGF nebo kininovým receptořům - nebo svalových buněk, jako protilátky proti aktinu nebo protilátky proti receptorům angiotenzinu II nebo protilátky proti receptorům pro růstové faktory, jako například proti receptorům EGF nebo proti receptorům PDGF nebo proti receptorům FGF nebo protilátky proti receptorům endotelinu A

K ligandům také patří protilátky nebo jejich fragmenty, které jsou namířeny proti nádorově specifickým nebo s nádorem spojeným antigenům na buněčné membráně nádorových buněk. Protilátky této povahy již byly popsány.

Myší monoklonální protilátky se výhodně používají v humanizované formě. Fragmenty Fab a rekombinantní •4 4 4 4 4 44

4444 4 4 4 4444 4

4 4 4 4 4 fragmenty Fv a jejich fúzní produkty, jak byly již popsány, se připravují technologií odborníkovi známou.

K ligandům dále patří všechny aktivní látky, jako například cytokiny nebo adhezivní molekuly, růstové faktory nebo jejich fragmenty či částečné sekvence, mediátory nebo peptidové hormony, které se vážou na membránové struktury nebo membránové receptory na vybraných konkrétních buňkách. Například sem patří

- ligandy pro endotelové buňky, jako IL-1, PDGF, bFGF,

VEGF, TGGp nebo kinin a deriváty nebo analogy kininu.

- K dalším patří adhezivní molekuly. Adhezivní molekuly této povahy, jako například Slex, LFA-1, MAC-1, LeCAM1, VLA-4 nebo vitronektin a deriváty nebo analogy vitronektinU, již byly popsány pro endotelové buňky (přehledy Augustin-Voss et al. , J. Cell Biol. 119, 483, 1992, Pauli et al. , Cancer Metast. Rev. 9, 175, 1990,

Honn et al. , Cancer Metast. Rev. 11, 353, 1992, Varner et al., Cell Adh. Commun. 3, 367, 1995).

Vynález je blíže popsán v následujících příkladech.

0 0 0 0	0 00	0 0
0 0 0	0		0 0	0 0
0 00« 0	0	0	0 00 0	0	0
• 0 0 0 0 0 0	0 00 0	0 0 0 0	0 0 0	0 0 0	0

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava expresního systému řízeného onkogenem

Expresní systém řízený onkogenem podle předkládaného vynálezu obsahuje následující odlišné, po směru transkripce za sebou uspořádané nukieotidové sekvence:

Složka a) • promotor genu cdc25C (nukleové kyseliny -290 až +121,

Zwicker et al. , EMBO J. , 14, 4514, 1995, Zwicker et al., Nucl. Acids Res., 23, 3822, 1995)

Složka b) • jaderný lokalizační signál (NLS) SV40 (SV4.0 velké T, aminokyseliny 12 6 až 132, PKKKRKV (sekvence id. č. 13), Dingwall et al., TIBS 16, 478, 1991) • kyselá transaktivační doména (TAD) HSV-1 VP16 (aminokyseliny 406 až 488, Triezenberg et al. , Genes Developm. 2, 718, 1988, Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5, 190, 1995) • vazebná sekvence RB proteinu E2F-1 (aminokyseliny 409 až 426 (LDYHFGLEEGEGIRDLFD) (sekvence id. č. 14), Flemington et al. , PNAS USA 90, 6914, 1993, Helin et al., Cell 70, 337, 1992)

•	cDNA pro DNA-vazebnou (aminokyseliny 1 až 147,	doménu proteinu Chasman a Kornberg,	Gal4 Mol.
Cell Biol., 10, 2916,	1990)
Složka	c)
•	lOx vazebná sekvence	pro	DNA-vazebnou sekvenci	Gal4

s nukleotidovou sekvencí 5'-CGGACAACTGTTGACCG-3'

Β ΒΒ · · Β· ΒΒ

ΒΒΒΒ ΒΒ ·· ΒΒΒΒ

ΒΒΒ Β Β ΒΒΒΒ

Β ΒΒΒΒ Β Β · ΒΒΒ Β Β

Β Β Β Β ΒΒΒ • ΒΒ ΒΒ ΒΒΒ ΒΒΒ ΒΒ ΒΒ (sekvence id. č. 1) (Chasman a Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916, 1990) • bazální promotor SV40 (nukleové kyseliny 48 až 5191, Tooze (ed.), DNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor, New York, New York, Cold Spring Harbor Laboratory)

Složka d) • sekvence GCCACC (Kodak, J. Cell Biol. 108, 229, 1989) • cDNA pro signální peptid imunoglobulinu (nukleotidová sekvence 63 až 107, Riechmann et al. , Nátuře 332, 323, 1988) • cDNA β-glukuronidázy (nukleotidová sekvence 93 až 1982, Oshima et al., PNAS USA 84, 685, 1987)

Spojení jednotlivých složek konstruktu bylo provedeno prostřednictvím vhodných restrikčních míst, která byla vložena na konce různých prvků pomocí PCR amplifikace. Vlastní spojení se pak provedlo odborníkovi známými metodami pomocí enzymů specifických pro restrikční místa a DNA-ligáz. Tyto enzymy j sou komerčně dostupné.

Takto připravený nukleotidový konstrukt byl klonován do plazmidového vektoru pXP2 (Nordeen, Biotechniques 454, 1988) , který byl pak použit buď přímo nebo v koloidním disperzním systému pro in vivo aplikaci.

Popsaným plazmidem byly transfekovány kultury fibroblastů 3T3 (RB pozitivní) a buňky osteosarkomu (SAOS-2, RB negativní) způsobem odborníkovi známým (Lucibello et al. , EMBO J. 132, 1995) a pomocí 4-metylumbelliferylβ-glukuronidu jako substrátu bylo měřeno množství β-glukuronidázy, které fibroblasty popřípadě osteosarkomové buňky produkovaly.

• ·· · · ·· ·· ·· · · ·· ·· ···· «·· · · · · ·· • ·*· · · * · ···· · • · · « · · · ··· ·· ··· «·· ·· ··

K ověření specificity pro buněčný cyklus byly osteosarkomové buňky synchronizovány ve fázi Gq/Gí odejmutím methioninu na 48 hodin. Obsah DNA buněk byl stanoven po obarvení buněk barvou Hoechst 33258 pomocí sorteru fluorescenčně označených buněk (Lucibello et al., EMBO J. 132, 1995).

Byly získány následující výsledky:

V transfekovaných fibroblastech (RB pozitivní) nebyl pozorován žádný přírůstek β-glukuronidázy ve srovnání s netransfekovanými fibroblasty.

Transfekované osteosarkomové buňky (RB negativní) exprimovaly výrazně více β-glukuronidázy než netransfekované buňky.

Proliferující osteosarkomové buňky (DNA > 2S, S = jedna sada chromozomů) secernovaly zřetelně více β-glukuronidázy než osteosarkomové buňky synchronizované ve fázi G₀/G_x (DNA = 2S) .

Takže popsaný expresní systém vede k expresi strukturního genu β-glukuronidázy závislé na RB, která podle výběru promotorové sekvence může být regulována v závislosti na buněčném cyklu.

·· • · · • · ♦ ·· · • ·

»·

• · »· ··

- 61 Příklad 2

Příprava expresního systému řízeného virem

Expresní systém podle předkládaného vynálezu řízený virem se skládá z následujících odlišných, po směru transkripce vzájemně navazujících nukleotidových sekvencí:

Složka a) • promotor genu cdc25C (nukleové kyseliny -290 až +121,

Zwicker et al. , EMBO J., 14, 4514, 1995, Zwicker et al., Nucl. Acids Res., 23, 3822, 1995)

Složka b) • jaderný lokalizační signál (NLS) SV40 (SV40 velké T, aminokyseliny 126 až 132, PKKKRKV (sekvence id. č. 13), Dingwall et al., TIBS 16, 478, 1991) • kyselá transaktivační doména (TAD) HSV-1 VP16 (aminokyseliny 406 až 488, Triezenberg et al. , Genes Developm. 2, 718, 1988, Triezenberg, Curr. Opin. Gen.

Developm. 5, 190, 1995) • protein Ξ6 viru HPV-18 (nukleotidové sekvence 100 až 578, Roggenbuck et al., J. Virol. 65, 5068, 1991) • cDNA pro DNA-vazebnou doménu proteinu Gal4 (aminokyseliny 1 až 147, Chasman a Kornberg, Mol. Cell Biol., 10, 2916, 1990)

Složka c) • lOx vazebná sekvence pro DNA-vazebnou sekvenci Gal4 s nukleotidovou sekvencí 5'-CGGACAACTGTTGACCG-3' (sekvence id. č. 1) (Chasman a Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916, 1990) bazální promotor SV40 (nukleové kyseliny 48 až 5191, Tooze (ed.), DNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor, New York, New York, Cold Spring Harbor Laboratory) ·· • · · • · ··· · • ·· · ·· · · · 0 • · · ·· • · 000 · · • · · 0 • 000 ·· 00

Složka d) • sekvence GCCACC (Kodak, J. Cell Biol. 108, 229, 1989) • cDNA pro signální peptid imunoglobulinu (nukleotidová sekvence 63 až 107, Riechmann et al. , Nátuře 332, 323, 1988) • cDNA β-glukuronidázy (nukleotidová sekvence 93 až 1982, Oshima et al., PNAS USA 84, 685, 1987)

Spojení jednotlivých složek konstrukktu bylo provedeno prostřednictvím vhodných restrikčních míst, která byla vložena na konce různých prvků pomocí PCR amplifikace. Vlastní spojení se pak provedlo odborníkovi známými metodami pomocí enzymů specifických pro restrikční místa a DNA-ligáz. Tyto enzymy jsou komerčně dostupné.

Takto připravený nukleotidový konstrukt byl klonován do plazmidového vektoru pUC18/l9, který byl pak použit bud' přímo nebo v koloidním disperzním systému pro in vivo aplikaci.

Popsaným plazmidem byly transfekovány kultury lidských fibroblastů (Wi-38, E6/E7 negativní) a buňky cervikálního karcinomu (HeLa, HPV-18-E6/E7 pozitivní) způsobem odborníkovi známým (Lucibello et al., EMBO J. 132, 1995) a pomocí 4-metylumbelliferyl^-glukuronidu jako substrátu bylo měřeno množtví β-glukuronidázy, které tyto buňky produkovaly.

K ověření specificity pro buněčný cyklus byly buňky HeLa synchronizovány ve fázi Gq/G! odejmutím methioninu na 48 hodin. Obsah DNA buněk byl stanoven po obarvení buněk barvou Hoechst 33258 pomocí sorteru fluorescenčně označených buněk (Lucibello et al., EMBO J. 132, 1995).

• · ·

- 63 Byly získány následující výsledky:

V transfekovaných fibroblastech nebyl pozorován žádný přírůstek β-glukuronidázy ve srovnání s netransfekovanými fibroblasty.

Transfekované HeLa buňky exprimovaly výrazně více β-glukuronidázy než netransfekované HeLa buňky.

Proliferuj ící HeLa buňky (DNA > 2S, S = jedna sada chromozomů) secernovaly zřetelně více β-glukuronidázy než osteosarkomové buňky synchronizované ve fázi G₀/G_x (DNA = 2S) .

Takže popsaný expresní systém vede k virově specifické (HPV18) expresi strukturního genu β-glukuronidázy, která podle výběru promotorové sekvence může být regulována v závislosti na buněčném cyklu.

Účinná látka podle příkladu 1 nebo 2 umožňuje, aby po lokálním podání, např. do místa nádoru nebo po intrakraniálním popřípadě subarachnoidálním podání nebo po systémovém, výhodně intravenózním nebo intraarteriálním podání, výrazně převládaly, pokud ne zcela výlučně, jen buňky vylučující β-glukuronidázu, které mají mutovaný onkogen nebo jsou infikovány virem, tato β-glukuronidáza štěpí nyní injikovaný dobře snášený doxorubicin-B-glukuronid (Jacquesy et al. , EP 0511917 Al) na cytostaticky účinný doxorubicin. Ten inhibuje proliferaci endotelových buněk a působí cytostaticky na tyto buňky stejně jako na sousední nádorové buňky. Tím dojde k inhibici nádorového růstu.

·· · · • ·

- 64 Popis obrázků

Obr. 1. Uspořádání jednotlivých obecných složek v konstruktu nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu.

Obr. 2. Schematické znázornění uspořádání obecných složek kontruktu nukleové kyseliny podle provedení vynálezu ve formě A.

Obr. 3. Schematické znázornění uspořádání obecných složek konstruktu nukleové kyseliny podle provedení vynálezu ve formě B.

• φ · ·

- 65 φ φφφ φ φ φφ

SEZNAM SEKVENCI (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...17 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č.

CGGACAACTG TTGACCG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...20 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č.

TACTGTATGT ACATACAGTA

ČÍSLEM 1:

:

ČÍSLEM 2:

:

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů baží

ČÍSLEM 3:

- 66 (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...22 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 3:

GAATTGTGAG CGCTCACAAT TC 22 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4: .

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 42 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...42 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 4:

TCGAGTTTAC CACTCCCTAT CAGTGATAGA GAAAAGTGAA AG 42 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 11 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon

-iafcfeí·.-

	• · · · Φ · · · · ·	• · • · • • · ·
• · · ··	• · ·
- 67 - (B) POZICE: 1...11
(χί) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S TAATGATGGC G	ID. Č.	5 :	11
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY: (A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...21	ČÍSLEM 6
(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ATAATTGGGC AAGTCTAGGA A	ID. Č.	6 :	21

(2) INFORMACE	PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 10 párů baží
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	TYP VLÁKNA: jednoduché
(D)	TOPOLOGIE:- lineární
(ii) TYP	MOLEKULY: DNA (genomová)
(ix) ZNAKY:
(A)	JMÉNO/OZNAČENÍ: exon
(B)	POZICE: 1... 10
(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 7:

GGGACTTTCC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 14 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...14 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 8:

TTTTCCCGCC AAAA 14 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 16 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...16 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 9:

TTTTCCCGCC TTTTTT 16 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...17 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 10:

TTTTCCCGCG CTTTTTT 17 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...26 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 11:

GGAAGCAGAC CACGTGGTCT GCTTCC 26 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 41 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...41 ··· · · · » · · • ···· · · · ·· ·· · • · · · · · · ··· ·· «·· ·«· ·· ·· (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 12:

GGCCGATGGG CAGATAGAGG GGGCCGATGG GCAGATAGAG G 41 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 7 aminokyselin (B) TYP: peptid (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1...7 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 13:

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 aminokyselin (B) TYP: peptid (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1...18 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 14:

Leu Asp Tyr His Phe Gly Leu Glu Glu Gly Glu Gly Ile Arg Asp Leu

5 10 15

Phe Asp • · ·

• 9

99 9

9 9 9

9 99

9 9 ·

9 9 99 99

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (16)

1. Konstrukt nukleové kyseliny pro expresi efektorového genu obsahující promotor I [složka a)], který řídí expresi

b) ] v konstruktu a dále obsahující genu transkripčního faktoru [složka nukleové kyseliny taktéž obsaženého, promotor II [složka c)], na který se specificky váže genový produkt genu transkripčního faktoru, řídící expresi efektorového genu [složka d)] v konstruktu nukleové kyseliny taktéž obsaženého, přičemž aktivita genového produktu genu transkripčního faktoru je závislá ne jednom nebo několika buněčných regulátorových proteinech, které se na tento genový produkt specificky váží a ovlivňují jeho aktivitu.

2. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 1, kde

-složka a) je aktivační sekvence pro transkripci složky b), -složka b) je transkripční faktor obsahující b_x) aktivační doménu b₂) vazebnou sekvenci pro buněčný regulátorový protein b₃) DNA-vazebnou doménu,

-složka c) je aktivační sekvence, které se aktivuje navázáním produktu exprese složky b) a která aktivuje transkripci složky d), a

-složka d) je efektorový gen.

3. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 1, kde složky a), b) a c) jsou provedeny ve formě složek a'), b') a c') : -složka a'): je aktivační sekvence pro transkripci složky b) obsahující :

a!) DNA-vazebnou sekvenci pro buněčný regulátorový protein •44 · * 4444

444 4 44 94 4 44 4

444 4 4 4 444

4 444 4 · 4444444

4 4 4 4 4 4 4

444 44 444 444 44 44

- 72 a₂) bazální promotor,

-složka b') je transkripční faktor, který představuje represorový protein a inhibuje složku c'),

-složka c'): je aktivační sekvence obsahující c_x) aktivační sekvenci pro transkripční faktor složky d) c₂) sekvenci DNA, která váže represorový protein [tj.

složka b')] a tím inhibuje aktivaci transkripce složky d) a

-složka d) je efektorový gen.

4. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 2, kde složka a) je shodná se složkou o).

5. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 2 nebo 3, kde složka a) , popřípadě složka c_x) , představuje promotorovou sekvenci aktivovatelnou nespecificky, buněčně specificky, metabolicky specificky, virově specificky a/nebo specificky v závislosti na buněčném cyklu.

6. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 5, kde složka a) nebo složka c_x) je vybrána ze skupiny obsahující:

-promotory aktivované v endotelových buňkách, v buňkách peritonea, v buňkách pleury, v epitelových buňkách kůže, plic, gastrointestinálního traktu, ledviny a močových cest, ve svalových buňkách, v buňkách pojivové tkáně, v buňkách krevní řady, v makrofágách, lymfocytech, v leukemických buňkách, nádorových buňkách nebo gliových buňkách, -promotorové sekvence virů jako jsou např. HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV, CMV nebo HIV, promotorové nebo enhancerové (zesilovací) aktivované hypoxií nebo sekvence

444 4 4

4 4 4

44 44 • 4« 4

-aktivační sekvence specifické pro buněčný cyklus z genů pro cdc25C, cyklin A, cdc2, E2F-1, B-myb- a DHFR,

-vazebné sekvence transkripčních faktorů vyskytujících se nebo aktivujících se v závislosti na buněčné proliferaci jako jsou monomery nebo multimery E-boxu genu myc.

7. Konstrukt nukleové kyseliny podle jednoho nebo několika nároků z nároků 2 až 6, kde aktivační doména [složka b_x)] složky b) je vybrána ze skupiny obsahující aktivační domény transkripčních faktorů Oct-2, Spi, NFY, ITF-2, VP-16, c-myc a CTF.

8. Konstrukty nukleové kyseliny podle jednoho nebo několika nároků z nároků 2 až 7, kde vazebná sekvence [složka b₂)] složky b) pro buněčný regulátorový protein je buněčný vazebný protein nebo část tohoto vazebného proteinu.

9. Konstrukty nukleové kyseliny podle nároku 8, kde buněčný regulátorový protein, na který se váže buněčný vazebný protein nebo část tohoto vazebného proteinu, je vybraný ze skupiny obsahující p53, pRb, pl30, max, MAD, VHL, cdk-4, MTS-1 (pl6), WT-1, SMAD-2, DPC-4.

10. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 9, kde složka b') je vybrána ze skupiny obsahující buněčné vazebné proteiny:

E2F-1, -2, -3, -3, -4, -5, cyklin-Dl, -D2, -D3 nebo -C, cyklin A, -E, myc, transkripční faktor PU.l nebo Elf-1, elongin-B nebo -C, pl4, pl5, pl6, pl8, p21, p27, P53, myc, cdk-4, DPC-4 a SMAD-2.

♦ 444 • 94 9

- 74

11. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 7, kde vazebná sekvence [složka b₂) ] složky b) pro buněčný regulátorový protein je virový vazebný protein nebo část tohoto vazebného proteinu.

12. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 11, kde buněčný regulátorový protein, na který se váže virový vazebný protein nebo část tohoto vazebného proteinu, je vybrán ze skupiny obsahující p53, pRb (pllO), NFKB, pl30, CBF-1, Lyntyrosinkinázu, bak a bax.

13. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 12, kde složka b₂) je vybrána ze skupiny obsahující virové vazebné proteiny: IE84 z CMV, E1B (55kD) z AV, EBNA-5 z EBV, BHFR z EBV, E6 z HPV-16 nebo -18, protein x z HBV, T-antigen z SV40, EIA z AV, EBNA-2 z EBV, EBNA-1 z EBV, E7 z HPV, tax z HIV, LMP-1 z EBV, LMP-2A nebo LMP-2B z EBV, E1B (16kD) z AV, E.1B (10kD) z AV.

14. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 7, kde vazebná sekvence [složka b₂) ] složky b) pro buněčný regulátorový protein je protilátka nebo část této protilátky.

15. Konstrukt nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde složka c) obsahuje nejméně jednu sekvenci DNA pro vazbu složky b) a touto vazbou je aktivována exprese složky d).

16. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 15, kde sekvence DNA je vybrána ze skupiny obsahující:

vazebnou sekvenci (5-CGGACAACTGTTGACCCG-3, sekvence id. č. 1) pro protein Gal4,