JP2000201678A

JP2000201678A - 一本鎖多抗原結合分子並びにその製造方法および使用

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Publication number: JP2000201678A
Application number: JP11102595A
Authority: JP
Inventors: Roland Dr Kontermann; ローラント、コンターマン; Zetoratsuetsuku Hansuuhararuto; ハンス‐ハラルト、ゼトラツェック; Rolf Prof Dr Mueller; ロルフ、ミューラー
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 1998-04-09
Filing date: 1999-04-09
Publication date: 2000-07-25
Anticipated expiration: 2019-04-09
Also published as: CZ121599A3; EP2036926B1; AU767580C; DE59914902D1; HU9900956D0; CA2268258A1; US20090326206A1; PT952218E; EP2036926A2; ES2317680T3; CY1108728T1; HK1130498A1; CN1234406A; CA2268258C; US6759518B1; ATE414150T1; AU2004200632A1; EP0952218A3; US7838637B2; AU2365699A

Abstract

(57)【要約】【課題】多抗原結合分子の提供。【解決手段】ペプチドを介して順々に連結されている
VH-VL構築体の形態で連結された免疫グロブリンの重鎖
および軽鎖の種々の可変ドメインを有する一本鎖多価抗
原結合分子が開示される。一本鎖多価抗原結合分子の製
造方法および医薬または診断補助薬としての使用も開示
される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】発明の分野本発明は、ペプチドを介して順々にともに連結された、
VH-VL構築体の形態で連結された免疫グロブリンの重鎖
および軽鎖の種々の可変ドメインを有する一本鎖多抗原
結合分子、ならびにその製造方法および医薬または診断
補助薬としての使用に関する。

【０００２】背景技術２つの異なる抗原、例えば、腫瘍細胞表面抗原とエフェ
クター分子を認識する二重特異性抗体は、実験的免疫療
法において広く使用されている(Fanger et al., Crit.
Rev. Immunol. 12, 101-124 (1992); van de Winkel et
al., Immunol.Today 18, 562-564 (1997))。二重特異
性抗体により補充されるエフェクター機能体としては、
例えば、細胞障害性細胞や食細胞、補足成分、サイトカ
イン類や血栓溶解酵素および繊維素溶解酵素などの体内
で自然に生じるもの、ならびに例えば、毒素、前駆薬剤
変換酵素および放射性核種などの外生エフェクター分子
が挙げられる。このように、例えば、ホジキン腫瘍結合
抗原CD30および異種移植腫瘍におけるＴ細胞抗原CD3やC
D28に対する二重特異性抗体の注入は、細胞障害性Ｔ細
胞の取り込みと刺激をもたらし、次いで、殺腫瘍活性の
誘導をもたらす(Renner et al., Science 264, 833, 19
94)。もう１つの試みでは、CD30に対する二重特異性抗
体とアルカリ性ホスファターゼを用いて腫瘍部位に酵素
を補充し、かくして、無毒の薬剤前駆体を有毒薬剤へと
変換させた(Sahin et al., Cancer Res. 50, 6944-694
8, 1990)。

【０００３】精製二重特異性抗体の注入のための代替法
としては、in vitroまたはin vivoでトランスフェクト
された細胞による、これら二重特異性抗体の発現および
分泌が挙げられる。この戦略の利点は、形質導入細胞に
よる二重特異性抗体の産生をin vivoで行い、従って、
注入に先立ち、二重特異性抗体の精巧な製造および精製
の必要がないことである。さらに、適切な発現系を選択
することにより、局部的に器官または腫瘍で、または全
身的に、二重特異性抗体の発現を制御することができ
る。

【０００４】二重特異性抗体は、例えば、化学的架橋に
より製造できる(Nisonoff et al.,Nature 194, 355, 19
62)。動物器官のモノクローナルまたはポリクローナル
抗体分子の化学的架橋の場合、決して少なくない割合で
失活する可能性がある。さらに、ヘテロおよびホモ二量
体の双方が製造される。ホモ二量体は精巧な工程によ
り、必要とするヘテロ二量体から分離しなければならな
い。二重特性抗体を産生するハイブリドーマ細胞はハイ
ブリッド・ハイブリドーマと呼ばれ、そのためには２種
の異なるハイブリドーマをともに融合させる必要がある
ので、比較的精巧な方法でしか製造できない(Milstein
et al., Nature 305, 537, 1983)。この２つの抗体分子
の重鎖および軽鎖はどんな場合にでも互いに会合するこ
とができるので、機能的ヘテロ二量体の割合は相対的に
低く、理論的には10%でしかない。使用される出発物質
は主に、ヒトにもまた免疫原性のあるネズミ・モノクロ
ーナル抗体を含んでなる。

【０００５】また、種々の二価または二重特異性抗体分
子を組換えによって製造し、細菌または真核細胞で発現
させることもできる(WO 93/06217)。通常、あらゆる組
換え抗体分子のためには、ネズミおよびヒト出発分子の
双方を用いてそれらを製造することが可能である。二重
特異性組換え抗体分子をできる限り効率的に製造するこ
とを可能にする種々の方法が開発されている。これらの
方法を用いて、種々の分子群が製造可能である。

【０００６】ある分子群では、二量体形成を達成するた
めに、種々の抗体部分を不変免疫グロブリンドメイン(F
c、CH3、CL)と融合させる(Hu et al., Cancer Res. 56,
3055-3061 (1994); Hayden et al., ther. Immunol.
1, 3-15 (1994))。しかしながらこの場合には、ヘテロ
二量体分子に関する選択が行われず、その結果、このよ
うな場合には、主に二価ホモ二量体が産生される。さら
に、これらの分子の機能的形態での発現は真核細胞に制
限される。

【０００７】もう１つの分子群では、種々の抗体部分を
他のタンパク質に由来するペプチドまたはタンパク質ド
メインと融合させて、二価または二重特異性分子を形成
する(Pluckthun and Pack, Immunotechnol. 3, 83-105
(1997))。この場合もまた、ランダムに会合するため、
通常、ホモおよびヘテロ二量体が形成する。さらに、こ
れらの分子は、いくつかの場合では無視できないほどの
割合の外来配列を含み、この結果、著しい免疫原性が期
待される。

【０００８】第三の分子群では、組換えFv断片、概して
一本鎖Fv断片(scFv)をわずかに修飾して、二価または二
重特異性分子を形成する(Holliger and Winter, Curr.
Opin. Biotechnol. 4, 446-449 (1993))。これらには、
scFv鎖のC末端へのシステインの付加による二量体化が
含まれる(MacCartney et al., Protein Engin. 8, 301-
314 (1994))。しかしながらこの結果、ホモおよびヘテ
ロ二量体の双方が生じ、細菌細胞での発現において、機
能を持たない複合体が生じる。scFv(A)-リンカー-scFv
(B)構造(Mallender and Voss, J. Biol. Chem. 269, 19
9-206, 1994)のタンデム-scFv分子は、細菌および真核
細胞の双方で発現可能である。しかしながら、これらの
場合のいくつかでは、４つの可変ドメインの機能を持た
ない会合も生じうる。

【０００９】近年、組換え抗体技術は、新規二価または
二重特異性抗体の小断片の開発をもたらした。この種の
分子の例としては、「ジアボディー(diabodies)」があ
る(Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9
0, 6444-6448, 1993)。これらは、極めて短いリンカー
によってともに連結された免疫グロブリンの可変VHおよ
びVLドメインを含んでなる。このリンカーは、一本鎖Fv
断片を用いた場合に生じるような、鎖のVHとVLドメイン
の会合を引き起こすには短すぎる。このことは、２鎖の
VHドメインとVLドメインが会合して二量体を形成し、そ
の結果、２つの結合部位を有する分子が産生されること
を意味するものである(Perisic et al., Structure 2,
1217-1226, 1994)。二重特異性「ジアボディー」は、１
つの細胞のVH(A)-VL(B)およびVH(B)-VL(A)構造の２鎖の
発現により産生される。この場合、VLは、免疫グロブリ
ンの軽(L)鎖の可変(V)ドメインを意味し、VHは、重(H)
鎖の可変ドメイン(V)を意味し、これら可変ドメインが
抗原(A)または(B)に結合する。VH部分とVL部分の会合
が、機能的に有効な結合部位を有するヘテロ二量体断片
をもたらす。細菌で発現させた二重特異性「ジアボディ
ー」は、種々のエフェクター分子、免疫グロブリン、C1
qまたは酵素、もしくは例えば、細胞障害性Ｔリンパ球
などのエフェクター細胞を補充するためにすでに首尾よ
く使用されている(Kontermann et al., Nature Biotech
nol. 15, 629 (1997); Holliger et al.,Protein Engi
n. 9, 299 (1996); Nature Biotecnol. 15, 632 (199
7), Zhu et al., Bio Technol. 14, 192 (1996); FitzG
erald et al., Protein Engin. 10, 1221 (1997); Kreb
s et al., J. Biol. Chem. 273, 2858 (1998))。

【００１０】しかしながら、「ジアボディー」は以下の
不利な点を有する：２つのVH(A)-VL(B)およびVH(B)-VL
(A)鎖はもはや物理的には結合しないので、ホモおよび
ヘテロ二量体が同じ程度で生産される可能性があり、こ
れらがヘテロ二量体のために必要な極めて精巧な精製方
法をなす。さらに、scFV断片に関してすでに示されたよ
うに、この二量体の解離が起こる(Glockshuber et al.,
Biochem. 29, 1362-1367 (1990))。この問題を解決す
るために、ジスルフィドで安定化させた「ジアボディ
ー」(FitzGerald et al., Protein Engin. 10, 1221-12
25,1997)または「ノブ・イントゥー・ホール・ジアボデ
ィー(knob into hole diabodies)」(Zhu et al., Prote
in Sci. 6, 781-788, 1997)が開発された。しかしなが
ら、それらの製造はかなりの複雑さを伴う。さらに、二
重特異性「ジアボディー」の遺伝子工学的発現には、シ
グナル配列と各々の鎖についてリボソーム結合部位が必
要であり、これが極めて煩雑である。さらに、等モル量
でない可変ドメインが発現する可能性があり、このこと
が機能的でないホモ二量体の割合を増す。

【００１１】

【発明の概要】従って本発明の目的は、記載のいわゆる
「ジアボディー」の不利な点を持たず、しかも、ほぼ均
一な形態で、簡単な方法で製造可能な多抗原結合分子を
見出すことにあった。

【００１２】従って本発明の１つの態様は、以下の構成
要素： a)第１の特異性(A)を有する免疫グロブリンの重鎖の可
変ドメイン(VH)およびその機能的部分、 b)第２の特異性(B)を有する免疫グロブリンの軽鎖の可
変ドメイン(VL)およびその機能的部分、 c)特異性(B)を有する免疫グロブリンの重鎖の可変ドメ
イン(VH)およびその機能的部分、および d)特異性(A)を有する免疫グロブリンの軽鎖の可変ドメ
イン(VL)およびその機能的部分、（ここで、VHおよびVLドメインはVH-VL構築体またはVL-
VH構築体の形態で連結し、かつ、この２つのVH-VL構築
体はペプチド(P)を介して連結している）を含んでなる
一本鎖多抗原結合分子である。

【００１３】

【発明の具体的説明】もう１つの具体例では、本発明の
分子は、２つより多い該VH-VL構築体（例えば、ＶＨ
（Ｂ）‐ペプチド‐ＶＬ（Ｂ））含んでなる。これが、
いくつかの特異性(A)、(B)、(C)などを有してなる分子
を得ることを可能にする。

【００１４】好ましい具体例では、個々のVH-VL構築体
は、同じ特異性を有するそれらの可変ドメインを介して
結合している。本発明の分子の特に好ましい構造は図１
に示されている。

【００１５】もう１つの好ましい具体例では、個々の特
異性は本質的に同一である。「本質的に同一」とは、本
発明によれば、そのドメインが分子構造においては異な
るが、それらの特異性、すなわち、特異的抗原結合機能
は維持していることが申し分なく可能であることを意味
する。この結果、本発明の分子は、必ずしも完全な免疫
グロブリンの重鎖または軽鎖の可変ドメインを含んでな
らなくともよく、その機能的部分、すなわち、それらの
特異的抗原結合特性を維持している部分を含んでなれば
よいことになる。例えば、免疫グロブリンの可変ドメイ
ンの個々のCDR部分（「相補性決定領域」）からなる人
工構築体(Jones, P.T.et al. Nature, 321, 522, 1986;
Riechmann, L. et al., Nature 332, 323, 1988; Verh
oeyen, M. et al. Science, 239, 1534, 1988)も、本発
明の目的に含まれる。

【００１６】好ましい具体例では、VHおよびVLドメイン
は、VH-L-VL構築体またはVL-L-VH構築体の形態でペプチ
ドリンカー(L)を介して連結している。このリンカーは
この場合、通常、できる限り短くあるべきであり、好ま
しくは約1〜20のアミノ酸、特に好ましくは約1〜5のア
ミノ酸長である。配列GGGGS（配列番号８）を有するリ
ンカーが特に好ましい。

【００１７】リンカー(L)とは対照的に、連結ペプチド
(P)はいずれの適切な長さでもよい。しかしながら、ペ
プチド(P)は、好ましくは約12〜40個のアミノ酸、特に
は約12〜20個のアミノ酸、特定には約14個のアミノ酸を
有する。特に好ましいペプチド(P)は、アミノ酸配列GGG
GSGGRASGGGS（配列番号１）またはGGGGSGGRASGGGGS（配
列番号２）を含んでなり、特には、該アミノ酸配列から
なるペプチド(P)である。

【００１８】もう１つの好ましい具体例では、本発明の
分子はさらなる構成要素としてエフェクター(E)を含ん
でなる。このエフェクターは直接、あるいは適当であれ
ば、コネクター(B)を介して本発明の分子に連結させる
ことができる。コネクター(B)はプロテアーゼ切断配
列、好ましくはPSA（プロテアーゼ特異的抗原）カテプ
シン、プラスミノーゲンおよび／またはプラスミノーゲ
ンアクチベーター切断配列を含んでなることが特に好ま
しい。

【００１９】プロテアーゼ切断配列は、プロテアーゼの
使用により、本発明の分子からエフェクターを分離する
ことを可能にするので特に好ましい。エフェクターの活
性が直接、またはコネクターによって間接的に本発明の
分子に結合しているエフェクターのために阻害される場
合、この分離は特に有利である。

【００２０】プロテアーゼは特に炎症領域内、または腫
瘍内に存在するので、プロテアーゼ切断配列を介する本
発明の分子へのそれらの結合のために優先的に不活性化
されているエフェクターは、そこで大量の局所遊離を受
ける。さらに、例えば、腫瘍細胞上の抗原、腫瘍を伴う
内皮細胞上の抗原、または例えば、リンパ球またはマク
ロファージなどの炎症細胞上の抗原に対して特異性を有
する本発明の分子に適した標的構造を選択することによ
り、例えば炎症領域または腫瘍領域で、エフェクターと
ともに本発明の分子を集積することが達成できる。

【００２１】また、本発明によれば、いくつかのエフェ
クターを本発明の分子に直接または間接的に結合させる
ことができる。

【００２２】プロテアーゼまたは適切な切断配列につい
ては、例えばDE1970430.1に詳細に記載されている。

【００２３】分子にコネクターを介して結合するエフェ
クターを有する本発明の好ましい分子の一例は、図２に
図示されている。

【００２４】本発明の分子における個々の構成要素は、
通常、適用される範囲に従って選択される。

【００２５】そこで、例えばさらなる具体例において、
本発明の分子を診断目的として用いれば、第１の特異性
(A)は分析すべき分子に向けられ、第２の特異性(B)は直
接または間接的に分析物質に向けられる。分析物質は例
えば、放射性分子、蛍光分子、またはその酵素活性によ
って分析物質の前駆体を活性のある分析物質に変換する
酵素であり得る。

【００２６】もう１つの具体例では、第１の特異性(A)
は分析すべき分子に向けられ、第２の特異性(B)は分析
すべき別の分子に向けられ、また、エフェクター(E)は
分析物質、例えば、放射性分子、蛍光分子および／また
はずでに前記で詳細に説明したような酵素である。

【００２７】しかしながら、本発明の分子を、ウイルス
または非ウイルスベクターの標的細胞特異的結合のため
のリガンドとして用いることもできる。好ましい具体例
では、本発明の分子をいわゆる多機能性リガンドとして
用いることができる。ペプチド(P)およびエフェクター
(E)がフゾジェニックペプチドを含めば、この目的には
都合がよい。多機能性リガンドはヌクレオチド配列の標
的細胞特異的導入のために働き、これは一般に、標的細
胞特異的リガンド、遺伝子構築体特異的リガンドおよび
フゾジェニックペプチドを含んでなるタンパク質であ
る。この種の多機能性リガンドは、遺伝子構築体、すな
わち核酸構築体を標的細胞に特異的に結合させるために
用いることができ、フゾジェニックペプチドが、核酸構
築体を細胞膜を通じて細胞核へと透過させ、次いでエン
ドソームから遊離させることも可能にする。

【００２８】本発明の分子の、ベクターのリガンドとし
ての、または多機能性リガンドとしての使用において
は、第１の特異性(A)を標的細胞に向け、第２の特異性
(B)をベクターに向けることが有利である。このベクタ
ーは一般に、核酸、陽イオンペプチドまたはタンパク
質、陽イオン脂質、陽イオンペプチドまたは陽イオンポ
ルフィリンである。本発明の特に好ましい具体例では、
ベクターは、例えばアデノウイルス(AdV)、アデノ随伴
ウイルス(AAV)、ワクシニアウイルス、RSV、HSV、イン
フルエンザウイルスまたはレンチウイルスに由来するウ
イルスベクターである。

【００２９】免疫グロブリンに由来する、すなわち、VH
およびVLドメインを含んでなる標的細胞特異的リガン
ド、標的細胞の膜構造、標的細胞特異的リガンド、およ
び遺伝子構造特異的リガンド、ならびにフゾジェニック
特性を有するペプチドの例はDE19649645.4に詳細に記載
されている。

【００３０】また本発明の分子は、予防および／または
治療薬として適している。

【００３１】これらの目的のためには、例えば、第１の
特異性(A)は、例えば、リンパ球、マクロファージ、単
球、顆粒球、造血細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、横紋筋
細胞、上皮細胞、肝細胞、腎細胞、グリア細胞、組織を
支持する細胞、腫瘍細胞、または白血病細胞など細胞膜
に対して、もしくは細胞外マトリックス、補体系、凝固
系、キニン系、血漿系、支持組織系のタンパク質に対し
て、もしくはサイトカイン類またはケモキニン類に対し
て、もしくは内または外の毒素に対して、もしくは医
薬、例えばジギタリスに対して、および／または例え
ば、細菌、ウイルスおよび／または寄生性病原体などの
病原体に対して向けられる。

【００３２】例えば第２の特異性(B)は、例えば、リン
パ球、マクロファージ、単球、または顆粒球の細胞膜に
対して向けられ、その結果、その標的構造との架橋がそ
こで細胞障害過程、免疫調節過程または炎症過程を導く
ことができる。

【００３３】またそれを、サイトカイン類、ケモカイン
類または成長因子類に向けることも可能で、その結果、
その標的構造との架橋がそこで免疫調節過程または増殖
過程を誘導し得る。またそれを、その活性化を開始、促
進または阻害する補体系のタンパク質に対して向けても
よい。この種のタンパク質の標的構造との架橋は、タン
パク質の選択により、血栓症を誘導または回避し得る。
さらにそれを、標的構造の繊維素塊の溶解のもたらす繊
維素溶解タンパク質に、不活性な薬剤前駆体を標的構造
に対して活性のある、例えば毒性のある薬剤に変換する
ことが可能な酵素に、ペプチドホルモンまたはステロイ
ドホルモンに、免疫グロブリンの不変部分に、例えば、
ヒスタミン、セロトニン、ロイコトリエン、プロスタシ
クリンまたはキニンなどの伝達物質に、細菌、ウイルス
および／または病原寄生生物などの病原体に、もしくは
腫瘍細胞に向けてもよい。

【００３４】標的構造としてのサイトカイン類、もしく
は標的構造としての単球、マクロファージおよび／また
はリンパ球は、本発明の分子により感染性抗原または腫
瘍抗原と架橋し、それによりin vivoでその抗原に対す
る免疫応答をの増強を誘導することができる。この連結
においては、病原体の、または腫瘍の特定の抗原、およ
び適当であればサイトカインをも、本発明の分子に付加
し、さらに、この架橋複合体を局所投与または注射する
ことが有利である。

【００３５】また第２の特異性(B)を、標的細胞に対す
る毒素および食作用、またはその他の毒性反応の中和の
いずれかを引き起こし得るよう、内または外毒素に向け
ることもできる。さらに、その医薬の複合体化および排
出を引き起こすよう、例えばジギタリスなどの医薬に向
けてもよい。

【００３６】もう１つの具体例では、エフェクターを伴
う本発明の分子は、２つの同一のまたは異なる標的構造
と１以上のエフェクターとの架橋を可能にする。

【００３７】適切なエフェクターの例としては、受容体
のトランスメンブランドメイン、糖リン脂質アンカー、
リガンド結合部；受容体のリガンド、またはリガンドの
受容体結合部配列；ペプチドホルモン；サイトカイン；
成長因子；成長因子阻害剤；ケモカイン；インターフェ
ロン；伝達物質；循環に作用するペプチド；不活性な薬
剤前駆体を活性薬剤に変換する酵素；凝固を活性化また
は阻害するタンパク質；繊維素溶解を活性化または阻害
するタンパク質；補体系を活性化または阻害するタンパ
ク質；免疫グロブリンの１以上の不変ドメイン；細胞障
害性ペプチド、他の一本鎖の、一または多、特に二抗原
結合分子；腫瘍抗原、または例えば、細菌抗原またはウ
イルス抗原などの病原体の抗原；システインを含んでな
り、本発明の分子の二量体を形成するペプチド；および
／または二量体または多量体ペプチドがある(Pluckthun
and Pack, Immunotechnol. 3, 83-105 (1997))。

【００３８】本発明のもう１つの態様は、本発明の分子
をコードする核酸である。核酸は一般に、ＤＮＡまたは
ＲＮＡ、好ましくは二重らせんＤＮＡである。

【００３９】適当であれば必要とされる、本発明の発現
産物の分泌のためには、本発明の核酸は5'末端にシグナ
ルまたはトランスメンブラン配列をコードするヌクレオ
チド配列を含んでなる（例えば、DE19639103.2またはDE
19651443.6を参照）。適切なシグナルまたはトランスメ
ンブラン配列の一例には、免疫グロブリンのシグナル配
列（ＤＮＡ位63〜107）、CEAのシグナル配列（ＤＮＡ位
33〜134）、またはヒト気道融合ウイルス糖タンパク質
（アミノ酸配列38〜50または48〜65のｃＤＮＡ）があ
る。

【００４０】もう１つの具体例では、本発明の核酸は5'
末端にプロモーターおよび／またはアクチベーターを含
んでなる。このアクチベーターは、細胞特異的に、細胞
周期特異的に、代謝特異的に、および／または薬剤によ
り活性化、もしくは抑制され得ることが好ましい。この
種のアクチベーターは、その組み合わせも含め、EP9710
1507.8、DE19617851.7、DE19639103.2、DE19651443.6、
DE19704301.1、EP97102547.3およびDE19710643.9に記載
されている。本発明の特に好ましい核酸構築体は、図３
および４に図式で示されている。

【００４１】好ましい具体例では、本発明の核酸は、開
始コドンの5'末端に配列GCCACCまたはGCCGCCを含んでな
り、これが転写の増強をもたらし得る。

【００４２】本発明のもう１つの具体例は、本発明の核
酸を含んでなるベクターに関する。ベクターはこの場
合、ウイルスまたは非ウイルスベクターであってよく、
特に陽イオン脂質、陽イオンポリマー、陽イオンペプチ
ド、または陽イオンポルフィリンから選択される非ウイ
ルスであることが好ましい。

【００４３】本発明の分子を製造するためには、記載の
核酸を発現ベクター、例えば、適切なプラスミド中にク
ローン化し、次いで適切な細胞、例えば、細菌、酵母、
昆虫または哺乳類細胞に導入し、このようにして形質転
換またはトランスフェクトされた細胞を培養し、適当で
あればその発現産物を単離する。この方法は一般に当業
者に公知であり、例えば、Sambrook J. et al. Molecul
ar Cloning, A Laboratory Handbook 2nd ed., Cold Sp
ring Harbor Laboratory Press, 1989に詳細に記載され
ている。

【００４４】本発明の特に好ましい具体例では、これら
の細胞はエフェクターを有する本発明の分子を発現し、
このエフェクターは好ましくはトランスメンブランドメ
インである。

【００４５】このように、例えば、ヒトマクロファージ
コロニー刺激因子のトランスメンブラン配列をコードす
るＤＮＡ配列（ＤＮＡ位1485〜1554）、またはヒト気道
融合ウイルス(RSV)糖タンパク質Gのシグナルおよびトラ
ンスメンブラン領域をコードするＤＮＡ配列（アミノ酸
1〜63、またはその部分配列アミノ酸38〜63）、または
インフルエンザウイルス・ノイラミニダーゼのシグナル
およびトランスメンブランをコードするＤＮＡ配列（ア
ミノ酸7〜35またはその部分配列アミノ酸7〜27）を、遺
伝子の3'において本発明の分子のプロモーター配列とＤ
ＮＡ配列その他の間に挿入することができる。

【００４６】しかしながら、本発明の分子を発現する細
胞の細胞膜に薬剤をつなぎ留めるために、核酸構築体へ
糖リン脂質アンカーをコードするヌクレオチド配列を挿
入することもできる。

【００４７】糖リン脂質アンカーの挿入は通常、本発明
の分子をコードするヌクレオチド配列の3'末端で起こ
り、さらにシグナル配列の挿入も起こり得る。

【００４８】糖リン脂質アンカーは、例えば、CEAに関
して、N-CAMに関して、また例えばThy-1などの膜タンパ
ク質に関して記載されている。

【００４９】このトランスメンブラン領域のために、特
定の細胞がその細胞膜上で本発明の分子を発現し、かく
して、本発明の分子の抗原結合部分により認識される標
的またはエフェクター構造に特異的な「受容体」をつな
ぎ留める。

【００５０】もう１つの好ましい受容体は、受容体、例
えばＴ細胞受容体またはM-CSF受容体のトランスメンブ
ラン形質導入ドメインまたはシグナル形質導入ドメイン
である。これによりその細胞膜上で本発明の分子を発現
する細胞を、標的構造の特異的官能基への結合により活
性化させることができる。この種の特異的作用は、例え
ば、Ｔリンパ球の細胞障害性反応、マクロファージおよ
び顆粒球の食作用反応、ならびに顆粒球、単球およびマ
クロファージのエキソサイトーシスであり得る。

【００５１】従って、本発明のもう１つの態様は、本発
明の核酸、または本発明のベクター、特に細菌、昆虫、
酵母または哺乳類細胞を含んでなる細胞である。適切な
哺乳類細胞としては、例えば、CHOまたはBHK細胞など、
核酸を発現するものとして一般に知られている細胞の
他、リンパ球、マクロファージ、グリア細胞、上皮細
胞、肝細胞、腎細胞、骨髄細胞、内皮細胞、平滑または
横紋筋細胞、または繊維素がある。

【００５２】直前に記載した細胞は、遺伝子治療への適
用に特に適している。なぜなら、本発明核酸構築体を含
んでなるこれらの細胞は、疾患の予防または治療のた
め、患者へ局所的または非経口的、例えば、静脈内、動
脈内、体腔内、器官内または皮下注射可能であるからで
ある。

【００５３】しかしながら、遺伝子治療による疾患の治
療については、本発明の核酸構築体を患者に局所、体腔
内、器官内、循環系内、皮下または筋肉内投与すること
も可能である。

【００５４】従って、本発明のもう１つの態様はまた、
本発明の分子、本発明の核酸、本発明のベクター、また
は本発明の細胞を含んでなる医薬、ならびにすでに詳細
に前記したような分析物質にもまた向けられる、本発明
の分子を含んでなる診断補助剤である。

【００５５】従って、本発明の分子、本発明の核酸、本
発明のベクター、または本発明の細胞は、例えば、腫瘍
症、自己免疫疾患、炎症性疾患、特に血液凝固および／
または循環系の血液疾患、神経系疾患、および／または
感染症の治療、予防または診断に適している。

【００５６】この連結における個々の構成要素の選択
は、一般に、本発明の部材の使用に依存する。以下、例
を挙げて個々の構成要素およびそれら使用を詳しく説明
する。

【００５７】本発明の部材を製造するためには、すでに
図３および４において例示により示したように、本発明
の核酸構築体を5'末端で、シグナル配列をコードする核
酸の3'末端に連結し、次いで、後者をその5'末端でプロ
モーター配列の3'末端に連結することができる。

【００５８】選択されるプロモーター配列としては、例
えば、ＲＮＡポリメラーゼIIIのプロモーター、ＲＮＡ
ポリメラーゼIIのプロモーター、CMVプロモーターおよ
び／またはエンハンサーであるSV40プロモーターなど、
非限定的な活性化が可能なプロモーターおよびアクチベ
ーター配列；または、例えば、HBV、HCV、HSV、HPV、EB
V、HTLV、HIVなどのウイルスプロモーターおよびアクチ
ベーター配列が挙げられる。

【００５９】HIVプロモーターの使用の際には、TAR配列
[≦-453 bis≧-80位, Rosen et al., Cell 41, 813 (19
85)を含む全LTR配列をウイルス特異的プロモーターとし
て使用することが好ましい。

【００６０】選択される他のプロモーター配列として
は、例えば、低酸素症により誘導可能なエンハンサーな
どの代謝的に活性化され得るプロモーターおよびエンハ
ンサー配列、例えば、cdc25C遺伝子の、cdc25B遺伝子
の、サイクリンA遺伝子の、cdc2遺伝子の、B-myb遺伝子
の、DHFR遺伝子の、またはE2F-1遺伝子のプロモーター
などの細胞周期特異的に活性化され得るプロモーター、
もしくは細胞周期特異的に生じるか、または活性化され
る転写因子の結合配列がある。これらの結合配列には、
例えば、c-mycタンパク質の結合配列がある。Myc E-ボ
ックス[5'-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3']（配列番号
３）として好ましい核酸配列の単量体または多量体が、
これらの結合配列に含まれる。

【００６１】さらに、選択されるプロモーター配列とし
ては、例えば、対応するリプレッサーと組み合わせたテ
トラサイクリンオペレーターなどの、テトラサイクリン
により活性化され得るプロモーター、またはキメラプロ
モーターがある。キメラプロモーターとは、細胞特異的
に、代謝またはウイルス特異的に活性化が可能で、上流
に置かれたアクチベーター配列と、下流に置かれプロモ
ーターモジュールとの組み合わせであり、これは、サプ
レッサータンパク質が結合し、それにより細胞周期のG0
およびG1期において、上流に置かれたアクチベーター配
列の活性化を阻害することができるCDE-CHRまたはE2FBS
-CHR核酸配列を含んでなる(WO96/06943;Lucibello et a
l., EMBO J. 14, 132(1995))。

【００６２】選択される他のプロモーター配列には、例
えば、好ましくは選択された細胞で産生されることが好
ましいタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターま
たはエンハンサー由来のプロモーターまたはアクチベー
ター配列などの、細胞特異的に活性化され得るプロモー
ターがある。

【００６３】例えば、好ましくは、以下の細胞におい
て、以下のタンパク質のプロモーターを、本発明の目的
のために使用する：内皮細胞で活性化されるプロモータ
ーおよびアクチベーター配列としては、例えば、下記タ
ンパク質：脳特異的内皮グルコース1輸送体、エンドグ
リン、VEFG受容体1(flt-1)、VEGF受容体2(flk-1, KD
R)、til-1、またはtil-2、B61受容体(Eck受容体)、B1
6、エンドセリン、特にはエンドセリンBまたはエンドセ
リン1、エンドセリン受容体、特にはエンドセリンB受容
体、マンノース6-リン酸受容体、フォンビルブラント因
子（von Willebrand factor）、IL-α、IL-1β、IL-1受
容体、血管細胞接着分子(VCAM-1)をコードする遺伝子由
来の遺伝子調節配列、あるいは内皮細胞で優先的にまた
は選択的に活性を有する転写因子の結合部位がオリゴマ
ー化したものからなる合成アクチベーター配列がある。
それらの一例は、その結合部位がエンドセリン1遺伝子
の5'-TTATCT-3'である、転写因子GATA-2である。

【００６４】活性化された内皮細胞に隣接した細胞で活
性化されるプロモーターまたはアクチベーター配列とし
ては、例えば、下記タンパク質：VEGF（この場合、この
VEGF遺伝子の遺伝子調節配列は、5'フランキング領域、
3'フランキング領域、c-Src遺伝子またはv-Src遺伝子で
ある）をコードする遺伝子由来の遺伝子調節配列、もし
くはステロイドホルモン受容体およびそれらのプロモー
ターエレメント、特にはマウス乳癌ウイルスプロモータ
ーがある。

【００６５】筋細胞、特に平滑筋細胞で活性化されるプ
ロモーターまたはアクチベーター配列としては、例え
ば、下記タンパク質：トロポミオシン、α-アクチン、
α-ミオシン、PDGFの受容体、FGFの受容体、MRF-4、ホ
スホフルクトキナーゼA、ホスホグリセレートムター
ゼ、トロポニンC、ミオゲン、エンドセリンAの受容体、
デスミン、VEGF（前記参照）をコードする遺伝子由来の
遺伝子調節配列、「人工」プロモーター、またはヘリッ
クス・ループ・ヘリックス(HLH)ファミリー(MyoD、Myf-
5、ミオゲン、MRF4)またはジンクフィンガータンパク質
GATA-4の因子などの筋肉特異的転写因子のプロモーター
がある。

【００６６】HLHタンパク質およびGATA-4は、筋肉特異
的遺伝子のプロモーターを伴って筋肉特異的転写を示す
ばかりでなく、異種の場合でも、さらには人工プロモー
ターを伴っても筋肉特異的転写を示す。この種の人工プ
ロモーターの例としては、Eボックス(Myo D)などの筋肉
特異的HLHタンパク質の（ＤＮＡ）結合部位の多重コピ
ー（例えば、4x AGCAGGTGTTGGGAGGC）（配列番号４）、
またはα-ミオシン重鎖遺伝子GATA-4のＤＮＡ結合部位
の多重コピー（例えば、5'-GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCC
GATGGGCAGATAGAGG3'）（配列番号５）がある。

【００６７】グリア細胞で活性化されるプロモーターお
よびアクチベーター配列には、例えば、下記タンパク
質：シュワン細胞特異的タンパク質ペリアキシン、グル
タミンシンテターゼ、グリア細胞特異的タンパク質（グ
リア繊維酸性タンパク質=GFAP）、グリア細胞タンパク
質S100b、IL-6、CNTF、5-HT受容体、TNFα、IL-10、イ
ンスリン様成長因子受容体IおよびII、またはVEGF（前
記参照）をコードする遺伝子由来の遺伝子調節配列があ
る。

【００６８】造血細胞で活性化されるプロモーターおよ
びアクチベーター配列としては、例えば、造血細胞、ま
たは例えばストロマなどの近傍細胞で発現するサイトカ
インまたはその受容体の遺伝子のプロモーター配列があ
る。

【００６９】これらは、例えば、下記サイトカイン類お
よびそれらの受容体：幹細胞因子受容体、幹細胞因子、
IL-1α、IL-1受容体、IL-3、IL-3受容体、（αサブユニ
ット）、IL-3受容体（βサブユニット）、IL-6、IL-6受
容体、GM-CSF、GM-CSF受容体、（α鎖）、IL-6によりIF
NγまたはIFNβによるのと同程度まで活性化されるIRF-
1のプロモーターを伴うインターフェロン調節因子1(IRF
-1)、エリトロポエチンまたはエリトロポエチン受容体
をコードする遺伝子由来のプロモーター配列を含む。

【００７０】リンパ球および／またはマクロファージで
活性化されるプロモーターおよびアクチベーター配列と
しては、例えば、サイトカイン類、サイトカイン受容
体、および接着分子、ならびに例えば、IL-1受容体、IL
-1α、IL-1β、IL-2、IL-2受容体、IL-3、IL-3受容体
（αサブユニット）、IL-3受容体（βサブユニット）、
IL-4、IL-4受容体、IL-5、IL-6、IL-6受容体、インター
フェロン調節因子1(IRF-1)、IL-6によりIFNγまたはINF
βによるのと同程度まで活性化されるIRF-1のプロモー
ター、IFNγ応答プロモーター、IL-7、IL-8、IL-10、IL
-11、IFNγ、GM-CSF、GM-CSF受容体（α鎖）、IL-3、LI
F、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)受容体、I
型およびII型マクロファージスカベンジャー受容体、MA
C-1（白血球機能に関連する抗原）、LFA-1α（白血球機
能に関連する抗原）またはp150,95（白血球機能に関連
する抗原）をコードする遺伝子のプロモーターおよびア
クチベーター配列がある。

【００７１】骨膜細胞で活性化されるプロモーターおよ
びアクチベーター配列としては、例えば、MMP-1（間質
性コラゲナーゼ）、MMP-3（ストロメライシン／トラン
シン）などのマトリックスメタロプロテナーゼ(MMP)、
またはTIMP-1、TIMP-2、TIMP-3などのメタロプロテナー
ゼ(TIMP)の組織阻害剤をコードする遺伝子のプロモータ
ー配列がある。

【００７２】白血病細胞で活性化されるプロモーターお
よびアクチベーター配列としては、例えば、下記タンパ
ク質：HSP-70、bcl-1/サイクリンD-1、bcl-2、IL-6、IL
-10、TNFα、TNFβ、HOX-11、BCR-Abl、E2A-PBX-1、PML
-RAR（前骨髄性白血病レチノイン酸受容体）、またはc-
myc（ここで、c-mycタンパク質は、MycEボックス(5'-GG
AAGCAGACCAGCTGGTCTGCTTCC-3')（配列番号６）と呼ばれ
る多量体核酸配列に結合して、これを活性化する）をコ
ードする遺伝子のプロモーターがある。

【００７３】腫瘍細胞で活性化されるプロモーターおよ
びアクチベーター配列としては、例えば、腫瘍細胞で形
成されるか、または活性を有する転写因子が相互作用す
る遺伝子調節核酸配列がある。

【００７４】本発明の目的のために好ましいプロモータ
ーまたはアクチベーター配列としては、特に腫瘍細胞ま
たは肉腫細胞で産生されるタンパク質をコードする遺伝
子調節配列または遺伝子エレメントがある。このよう
に、好ましくは、小細胞気管支癌にはN-CAMタンパク質
のプロモーターが用いられ、子宮癌には肝炎増殖因子ま
たはL-プラスチンのプロモーターが、そして、膵臓癌に
はL-プラスチンまたは多型性上皮ムチン(PEM)のプロモ
ーターが用いられる。

【００７５】本発明の顕著な利点は、個々の成分の結合
がヘテロ二量体の会合に有利であり、その結果一本鎖多
抗原結合分子が優先的に形成されることにある。scFv断
片に関して示したように、二量体の解離もまた低下する
（例えば、Glockshuber et al., Biochem. 29, 1362-13
67, 1990参照）。このように、本発明の分子は、いわゆ
る「ジアボディー」よりも、たとえそれがジスルフィド
で安定化されていたり、または「ノブ・イントゥー・ホ
ールジアボディー」の形態であったとしても、比較的煩
雑でなく、かつ、均一な形態で製造することができる。

【００７６】さらに、本発明の分子を製造するために
は、１つのシグナル配列と１つのリボソーム結合部位(R
BS)しか必要としない。これに対し、本発明の「ジアボ
ディー」の場合には、各鎖に、シグナル配列とRBSが必
要とされる。本発明のもう１つの利点は、「ジアボディ
ー」の２鎖の発現の際には、等モル量でない可変ドメイ
ンが発現し、かくして、機能のないホモ二量体の産生が
増加する本発明の分子を用いると等モル量の可変ドメイ
ンが発現することである。

【００７７】本発明の分子のもう１つの利点は、簡単、
かつ、細菌と酵母、バキュロウイルスと真核細胞の双方
の機能的形態で発現し得ることである。さらには、本発
明の分子の分泌の他にも、細胞内の、または膜と結合し
ているそれらを発現させることができる可能性がある
（例えば、Biocca & Cattaneo, Trends Cell Biol. 5,2
48-252(1995)を参照）。

【００７８】本発明の分子のもう１つの利点は、二重特
異性抗体と同様、診断目的として、また疾患の予防およ
び／治療薬として使用することができることである。

【００７９】エフェクターおよびプロモーター配列の遺
伝子は、所望される使用のために、また、形質導入され
る標的細胞を考慮して選択すべきである。例えば、下記
の疾患のために選択されるプロモーター配列およびエフ
ェクター遺伝子は以下の通りである。

【００８０】腫瘍治療腫瘍治療のための標的細胞は、例えば、増殖内皮細胞ま
たは内皮細胞近傍のストロマ細胞および筋細胞、あるい
は腫瘍細胞または白血病細胞であり、用いられるプロモ
ーターは、例えば、内皮細胞特異的かつ細胞周期特異
的、または細胞非特異的または筋細胞特異的かつ細胞周
期特異的、または腫瘍細胞特異的（固形腫瘍、白血病）
かつ細胞周期特異的プロモーターであり、用いられるエ
フェクターは、例えば、下記遺伝子である：細胞増殖阻
害剤の遺伝子は、例えば、網膜芽細胞腫タンパク質(pRb
＝p110)または関連のp107およびp130タンパク質の遺伝
子である。網膜芽細胞腫タンパク質(pRb/p110)および関
連のp107およびp130タンパク質はリン酸化により不活性
化させる。好ましく用いられると考えられる細胞周期阻
害剤の遺伝子は、発現タンパク質の不活性化部位に対し
て突然変異を有し、その機能がそれによって損なわれる
ことのないものである。これらの突然変異の例が、p110
について記載されている。p107タンパク質またはp130タ
ンパク質のＤＮＡ配列も、同様の方法で変異する。P53
タンパク質の遺伝子もまた適している。p53タンパク質
は、例えばMDM2のような特異的なタンパク質と結合する
ことによるか、または脱リン酸化されたC末端セリンを
介してp53がオリゴマー化するかのいずれかにより、細
胞内で不活性化される。このように、C末端でセリン392
によりトランケートされたp53タンパク質のＤＮＡ配列
を使用することが好ましい。さらに適した遺伝子として
は、p21(WAF-1)の、p16タンパク質の、他のcdk阻害剤
の、GADD45タンパク質またはbakタンパク質の遺伝子が
ある。

【００８１】凝固誘導因子および血管形成阻害剤の遺伝
子としては、例えば、プラスミノーゲンアクチベーター
阻害剤1(PAI-1)、PAI-2、PAI-3、アンギオスタチン、イ
ンターフェロン(IFNα、IFNβまたはIFNγ)、血小板因
子4、IL-12、TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、白血病阻害因子
(LIF)、または組織因子(TF)およびその凝固促進断片の
遺伝子がある。

【００８２】細胞増殖抑制タンパク質および細胞障害タ
ンパク質の遺伝子としては、例えば、パーフォリン、グ
ランザイム、IL-2、IL-4、IL-12、例えば、そしてIFN-
α、IFNβ、またはIFNγなどのインターフェロン、TNF
αまたはTNFβなどのTNF、オンコスタチンM、スフィン
ゴミエリナーゼ、またはマガイニンおよびマガイニン誘
導体の遺伝子がある。

【００８３】炎症誘導物質の遺伝子としては、例えば、
IL-1、IL-2、RANTES(MCP-2)単球走化性および活性化因
子(MCAF)、IL-8、マクロファージ炎症性タンパク質1(MI
P-1α、-β)、好中球活性化タンパク質-2(NAP-2)、IL-
3、IL-5、ヒト白血病阻害因子(LIF)、IL-7、IL-11、IL-
13、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、コブラ毒因子(CVF)または
ヒト補体因子C3bに機能的に相当する、すなわち補体因
子Bと結合することができ、因子Dによる切断の後には、
C3変換酵素に相当するCVFの部分配列、ヒト補体因子C3
またはその部分配列C3bの遺伝子、機能的および構造的
にCVFに似たヒト補体因子C3の切断生成物の遺伝子、ま
たは例えば、サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonell
a typhimurium)のポーリン、スタフィロコッカス・アウ
レウス(Staphylococcus aureus)の凝固因子、特にグラ
ム陰性菌のモジュリン、レジオネラ属(legionellae)ま
たはヘモフィラス・インフルエンザB型(Haemophilus in
fluenzatype B)またはクレブシエラ属(klebsiellae)の
主要外膜タンパク質またはG群ストレプトコッカス(stre
ptococci)のM分子のような、補体を活性化するか、また
は炎症を誘導する細菌性タンパク質の遺伝子がある。

【００８４】細胞増殖抑制物質の前駆体を活性化する酵
素の遺伝子としては、例えば、不活性な前駆体（前駆薬
剤）を切断して活性のある細胞増殖抑制物質（薬剤）に
する酵素の遺伝子がある。この種の物質および前駆薬
剤、ならびにそれら各々に関する薬剤はすでにDeonarai
n et al.(Br. J. Cancer 70, 786 (1994))、Mullen(Pha
rmac. Ther. 63, 199(1994))およびHarris et al.(Gen
e. Ther. 1, 170(1994))により概説されている。例え
ば、下記の酵素の１つのＤＮＡ配列を用いることができ
る：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、水痘帯状
ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、細菌ニトロレダク
ターゼ、細菌β-グルクロニダーゼ、セカレ・セレアル
(Secale cereale)由来の植物β-グルクロニダーゼ、ヒ
トβ-グルクロニダーゼ、例えば、マスト細胞CB-A、膵
臓細胞CB-Bなどのヒト・カルボキシペプチダーゼ(CB)、
または細菌カルボキシペプチダーゼ、細菌β-ラクタマ
ーゼ、細菌シトシンデアミナーゼ、ヒト・カタラーゼま
たはペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、特にヒト・ア
ルカリ性ホスファターゼ、ヒト・プロスタチン酸ホスフ
ァターゼまたは5型酸性ホスファターゼ、オキシダー
ゼ、特にヒト・リシルオキシダーゼまたはヒトD−アミ
ノ酸オキシダーゼ、特にヒト・グルタチオンペルオキシ
ダーゼ、ヒト好酸球ペルオキシダーゼまたはヒト甲状腺
ペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼまたはα-ガラ
クトシダーゼ。特に好ましいものは、前駆薬剤であるダ
ウノマイシンβ-D-ガラクトピラノシドを細胞増殖抑制
性ダウノマイシンに変換するためのβ-ガラクトシダー
ゼである。

【００８５】自己免疫疾患および炎症の治療自己免疫疾患および炎症の治療のための標的細胞として
は、例えば、増殖性内皮細胞またはマクロファージおよ
び／またはリンパ球、あるいは骨膜細胞があり、用いら
れるプロモーターは、例えば、内皮細胞特異的かつ細胞
周期特異的、またはマクロファージおよび／またはリン
パ球特異的および／または細胞周期特異的、または骨膜
細胞特異的および／または細胞周期特異的プロモーター
であり、用いられるエフェクターには、例えば、下記遺
伝子がある：アレルギー治療のための遺伝子としては、
例えば、IFNβ、IFNγ、IL-10、IL-4に対する抗体また
は抗体断片、可溶性IL-4受容体、IL-12またはTGFβの遺
伝子がある。

【００８６】移植器官の拒絶反応防止のための遺伝子と
しては、例えば、IL-10、TGFβ、可溶性IL-1受容体、可
溶性IL-2受容体、IL-1受容体アンタゴニストまたは可溶
性IL-6受容体の遺伝子がある。

【００８７】抗体介在性の自己免疫疾患の治療のための
遺伝子としては、例えば、TGFβ、IFNα、IFNβ、IFN
γ、IL-12、可溶性IL-4受容体、可溶性IL-6受容体、免
疫抑制抗体またはそのV_HおよびV_L含有断片の遺伝子があ
る。

【００８８】細胞介在性の自己免疫疾患の治療のための
遺伝子としては、例えば、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、
TNFαまたはTNFβ、IL-13、免疫抑制抗体またはそのV_H
およびV_L含有断片の遺伝子がある。

【００８９】細胞増殖、細胞増殖抑制または細胞障害タ
ンパク質、および細胞増殖抑制物質の前駆体を活性化す
る酵素の阻害剤の遺伝子は、すでに前記にて詳細に記載
されている。

【００９０】関節炎の治療のための遺伝子としては、例
えば、その発現タンパク質が、例えば間接部において直
接または間接的に炎症を抑制し、かつ／または関節部に
おいて細胞外マトリックス（軟骨部組織、結合組織）の
再構成を促進する構造遺伝子がある。

【００９１】これらには、例えば、IL-1-RAがIL-1α、
βの生成を阻害するがゆえに、IL-1受容体アンタゴニス
ト(IL-1-RA)；可溶性IL-1受容体がIL-1と結合して不活
性化するがゆえに、可溶性IL-1受容体；IL-6がTIMPおよ
びスーパーオキシドの分泌を増加させ、かつ、骨膜細胞
および軟骨細胞によるIL-1およびTNFαの分泌を減少さ
せるがゆえに、IL-6；可溶性TNF受容体がTNFと結合して
不活性化するがゆえに、可溶性TNF受容体；IL-4がIL-
1、TNFαおよびMMPの生成および分泌を阻害するがゆえ
に、IL-4；IL-10がIL-1、TNFαおよびMMPの生成および
分泌を阻害し、かつ、TIMPの分泌を増加させるがゆえ
に、IL-10；IGF-1が細胞外マトリックスの合成を刺激す
るがゆえに、インスリン様成長因子(IGF-1)；TGFβが細
胞外マトリックスの合成を刺激するがゆえに、TGFβ、
特にTGFβ1および TGFβ2；スーパーオキシドジスムタ
ーゼまたはTIMP、特にTIMP-1、TIMP-2またはTIMP-3が含
まれる。

【００９２】造血系の治療血球細胞の欠陥形成の治療のための標的細胞としては、
例えば、造血系の増殖性未熟細胞または造血細胞近傍の
ストロマ細胞があり；用いられるプロモーターは、例え
ば、造血細胞に特異的であり、かつ／または細胞周期特
異的、または細胞非特異的かつ細胞周期特異的なプロモ
ーターであり、用いられるエフェクターは、例えば、下
記遺伝子である：貧血症治療のための遺伝子としては、
例えば、エリトロポエチンの遺伝子がある。

【００９３】白血球減少症治療のための遺伝子として
は、例えば、G-CSF、GM-CSFまたはM-CSFの遺伝子があ
る。

【００９４】血小板減少症治療のための遺伝子として
は、例えば、IL-3、白血病阻害因子(LIF)、IL-11または
トロンボポエチンの遺伝子がある。

【００９５】神経系の治療神経系損傷の治療のための標的細胞としては、例えば、
グリア細胞または増殖性内皮細胞があり、用いられるプ
ロモーターは、例えば、グリア細胞特異的かつ細胞周期
特異的、または内皮細胞特異的かつ細胞周期特異的、ま
たは非特異的かつ細胞周期特異的プロモーターであり、
用いられるエフェクターは、例えば、下記遺伝子であ
る：ニューロン成長因子遺伝子としては、例えば、FG
F、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニ
ューロトロフィン-3(NT-3)、ニューロトロフィン-4(NT-
4)または繊毛神経栄養因子(CNTF)の遺伝子がある。

【００９６】酵素遺伝子としては、例えば、チロシンヒ
ドロキシラーゼまたはドーパデカルボキシラーゼの遺伝
子がある。

【００９７】サイトカイン類およびTNFαの神経障害作
用を阻害または中和するそれらの阻害剤の遺伝子として
は、例えば、TGFβの遺伝子；TNF受容体がTNFαを中和
するがゆえに、可溶性TNF受容体の遺伝子；IL-10がIFN
γ、TNFα、IL-2およびIL-4の生成を阻害するがゆえ
に、IL-10の遺伝子；可溶性IL-1受容体がIL-1の活性を
中和するがゆえに、IL-1受容体IまたはIL-1受容体IIな
どの可溶性IL-1受容体の遺伝子；IL-1受容体アンタゴニ
ストまたは可溶性IL-6受容体の遺伝子がある。

【００９８】血液凝固および循環系の治療血液凝固および循環系障害の治療のための標的細胞とし
ては、例えば、内皮細胞、増殖性内皮細胞、内皮細胞の
近傍にある体細胞および平滑筋細胞またはマクロファー
ジがあり、用いられるプロモーターは、例えば、細胞非
特異的かつ細胞周期特異的プロモーター、または内皮細
胞、平滑筋細胞またはマクロファージ特異的かつ細胞周
期特異的プロモーターであり、用いられるエフェクター
は、例えば、下記遺伝子である：凝固を阻害または繊維
素を溶解する遺伝子としては、例えば、組織プラスミノ
ーゲンアクチベーター(tPA)、ウロキナーゼ型プラスミ
ノーゲンアクチベーター(uPA)の遺伝子、tPAとuPAのハ
イブリッドの遺伝子、タンパク質C、ヒルジンの遺伝
子、例えば、C-1S阻害剤のようなセリンプロテナーゼ阻
害剤（セルピン）、α1-抗トリプシンまたは抗トロンビ
ンIIIの遺伝子、または組織因子経路阻害剤(TFPI)の遺
伝子がある。

【００９９】凝固を促進する遺伝子としては、例えば、
FVIII、FIX、フォンビルブラント因子、FXIII、PAI-1、
PAI-2または組織因子およびその断片の遺伝子がある。

【０１００】血管形成因子の遺伝子としては、例えば、
VEGFまたはFGFの遺伝子がある。

【０１０１】血圧を低下させる遺伝子としては、例え
ば、カリクレインまたは内皮細胞「酸化窒素シンター
ゼ」の遺伝子がある。

【０１０２】内皮層の損傷後の平滑筋細胞の増殖を阻害
する遺伝子としては、例えば、抗増殖タンパク質、細胞
増殖抑制タンパク質または細胞障害タンパク質の遺伝
子、またはすでに前記したような細胞増殖抑制物質の前
駆体を細胞増殖抑制物質へと分割する酵素の遺伝子、ま
たは例えば、筋細胞に特異的な抗体または抗体断片など
の、リガンドを有するこれらの薬剤の１つの融合タンパ
ク質の遺伝子がある。

【０１０３】他の血漿タンパク質遺伝子としては、例え
ば、アルブミン、C1インアクチベーター、血清コリンエ
ステラーゼ、トランスフェリンまたは1-アンチトリプシ
ンの遺伝子がある。

【０１０４】感染症の予防および／または治療接種用標的細胞としては、例えば、筋細胞またはマクロ
ファージおよび／またはリンパ球があり、用いられるプ
ロモーターは、例えば、非特異的かつ細胞周期特異的、
または標的細胞特異的かつ細胞周期特異的プロモーター
であり、用いられるエフェクターは、例えば、感染症の
予防のための遺伝子がある。

【０１０５】一般に選択される活性物質は、病原体によ
り産生され、かつ、免疫応答を導入することにより、す
なわち抗体結合および／または細胞障害性Ｔリンパ球に
よって、病原体の中和および／または死滅に導くタンパ
ク質のＤＮＡである。いわゆるこの種の抗原の中和はす
でにワクチン抗原として使用されている（例えば、Elli
s, Adv. Exp. Med. Bio.327, 263 (1992)を参照）。

【０１０６】本発明の目的のためには下記病原体の抗原
を中和する核酸コーディングが好ましい：インフルエン
ザAウイルス、HIV、狂犬病ウイルス、HSV（単純ヘルペ
スウイルス）、RSV（気道融合ウイルス）、パラインフ
ルエンザウイルス、ロタウイルス、VZV（水痘・帯状ヘ
ルペスウイルス）、CMV（サイトメガロウイルス）、は
しかウイルス、HPV（ヒトパピローマウイルス）、HBV
（B型肝炎ウイルス）、HCV（C型肝炎ウイルス）、HDV
（D型肝炎ウイルス）、HEV（E型肝炎ウイルス）、HAV
（A型肝炎ウイルス）、ビブリオ・コレラ(Vibrio chole
rae)抗原、ボレリア・バーグドルフェリ(Borrelia burg
dorferi)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylo
ri)またはマラリア抗原。

【０１０７】本発明の目的のためのこの種の活性物質も
また、抗イディオタイプ抗体のＤＮＡ、またはその抗原
結合断片のＤＮＡを包み、この抗体の抗原結合構造（相
補性決定領域）は病原体の抗原を中和するタンパク質ま
たは炭水化物構造の複写に相当する（前記参照）。

【０１０８】この種の抗イディオタイプ抗体およびそれ
らの切断生成物は、特に病原菌の炭水化物抗原を置換す
ることができ、例えばHawkins et al.(J. Immunother.
14,273 (1993))およびWesterink and Apicella(Springe
r Seminars in Immunopathol. 15, 227 (1993))により
概説されている。

【０１０９】他のエフェクターの例としては、「腫瘍ワ
クチン」遺伝子がある。これらには、例えば、Sedlacek
et al., Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, Mun
ich(1988)およびContrib. to Oncol. 43, Karger Verla
g, Munich (1992)によい概説されているように、腫瘍細
胞の抗原が含まれる。

【０１１０】他の例としては、下記抗原または下記抗イ
ディオタイプ抗体の遺伝子がある：シアリル−ルイス；
T細胞により認識される腫瘍のペプチド；癌遺伝子によ
り発現されるタンパク質；血液型抗原およびそれらの前
駆体；多型性上皮ムチンの抗原；または熱ショックタン
パク質の抗原。

【０１１１】慢性感染症の治療のための標的細胞として
は、例えば、肝細胞、リンパ球および／またはマクロフ
ァージ、上皮細胞または内皮細胞であり、用いられるプ
ロモーターは、例えば、ウイルス特異的または細胞特異
的かつ細胞周期特異的プロモーターであり、用いられる
エフェクターは、例えば、下記遺伝子である：細胞増殖
抑制作用、アポトーシス作用または細胞障害作用を有す
るタンパク質をコードする遺伝子、または抗ウイルスま
たは細胞障害性物質の前駆体を、活性物質へと切断する
酵素をコードする遺伝子。

【０１１２】抗ウイルス活性を有するサイトカイン類の
ような抗ウイルスタンパク質、および、例えば、IFN
α、IFNβ、IFNγ、TNFβ、TNFα、IL-1またはTGFβな
どの成長因子、または特定のウイルスを不活性化する特
異性を有する抗体、またはそのV_HおよびV_L含有断片、ま
たはすでに記載されているように、リンカーを介して連
結されたそのV_HおよびV_L断片をコードする遺伝子。ウイ
ルス抗原に対する抗体の例としては、抗HBV、抗HCV、抗
HSV、抗HPV、抗HIV、抗EBV、抗HTLV、抗コクサッキーウ
イルスまたは抗ハンタンウイルスがある。

【０１１３】もう１つの抗ウイルス活性を有するタンパ
ク質としては、rev結合タンパク質がある。これらのタ
ンパク質はrevＲＮＡと結合し、レトロウイルス遺伝子
発現のrev依存性転写後段階を阻害する。rev結合タンパ
ク質の例としては、RBP9-27、RBP1-8U、RBP1-8DまたはR
BP1-8の偽遺伝子がある。

【０１１４】例えば、細菌毒素を中和する、または細菌
にオプソニンを作用させる抗体のような抗菌タンパク質
をコードする遺伝子。これらの例としては、メニンゴコ
ッキ(meningococci)CまたはB、大腸菌、ボレリア、シュ
ードモナス(Pseudomonas)、ヘリコバクター・ピロリま
たはスタフィロコッカス・アウレウスに対する抗体があ
る。

【０１１５】以下、図面および実施例により本発明を詳
しく説明するが、それらに限定するものではない。

【０１１６】

【実施例】実施例1 ：一本鎖二価抗原結合タンパク質の
製造および細菌による発現癌胎児性抗原(CEA)および大腸菌β-ガラクトシダーゼな
どの抗原を認識するタンパク質の例を用いる一本鎖二価
抗原結合タンパク質の製造方法を記載する。

【０１１７】下記ＤＮＡ配列は、以下のように5'から3'
方向に共に連結した： LacZプロモーター細菌リボソーム結合構造体(AAGGAG) 細菌シグナル配列pelB(Power et al., Gene 113, 95-99
(1992)) VH抗CEA(Kontermann et al., Immunotechnol. 3, 137(1
997)) リンカーGGGS（配列番号８）(Kontermann et al., (199
7)) VL抗β-ガラクトシダーゼ(Kontermann et al., (1997)) 結合ペプチドGGGGSGGRASGGGGS（配列番号２） VH抗β-ガラクトシダーゼ(Kontermann et al., (1997)) リンカーGGGGS VL抗CEA(Kontermann et al., (1997)) 抗体9E10 EQKLISEEDLN（配列番号９）のMycエピトープ
(Munro & Pelham, Cell46, 291-300(1986)) -IMACによるポリヒスチジンHHHHHH（配列番号１０）精
製物(Kontermann et al.,(1997)) この構築体の結合は、種々のＤＮＡ配列の末端における
PCR増幅により包含された適切な制限部位により可能と
なる(Kontermann et al., Immunotechnol. 3,137(199
7))。

【０１１８】この結合は、当業者に公知の制限部位に特
異的な酵素およびＤＮＡリガーゼを用いて行った。これ
らの酵素は商業的に入手可能である。この構築体を、細
菌発現ベクターpAB1中にクローン化した(Kontermann et
al., (1997))。

【０１１９】クローニングは、オリゴヌクレオチドプラ
イマーLMB2およびLMB3(Kontermann,R.E. (1997), 同上)
および VK-NotFor：5'-TTG TTC TGC GGC CGC CCG TTT CAG CTC
CAG CTT GGT GCC AGC ACC-3'（配列番号１１）、 scDb-AscBack：5'-TGC ATG CTA GGG CGC GCC TCG GGC G
GA GGT GGC TCA CAG GTGCAG CTG GTG CAA TCT GG-3'
（配列番号１２）、 scDb-AscForK：GCT CGG TAA GGC GCG CCC ACC GCT GCC
ACC GCC TCC ACC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC-3'（配
列番号１３）および pelB-Metminus：5'-TTA CTC GCG GCC CAG CCG GCC ACG
GCC CAG GT-3'（配列番号１４）を用いて行った。

【０１２０】この目的のために、ジアボディーCEAGal(K
ontermann, R.E. (1997))由来の断片VHB-VLA(断片1)お
よびVHA-VLB(断片2)を、プライマーLMB2およびLMB3を用
いて増幅し、ゲル精製した。次いで、Ascl部位およびリ
ンカーの7個のアミノ酸を導入するために、断片1をプラ
イマーVK-NotForおよびscDb-AscBackを用いて増幅し
た。Ascl部位およびリンカーの8個のアミノ酸を導入す
るためには、断片2をプライマーLMB3およびscDb-AscFor
λを用いて増幅した。これらの断片をAsclおよびNotl
(断片1)、およびSfilおよびAscl(断片2)とともに加水分
解して、細菌発現ベクターpAB1中にクローン化した(Kon
termann, R.E. (1997))。得られた挿入配列は、VHA-VLB
が15個のアミノ酸長の配列GGGGSGGRASGGGGS（配列番号
２）を有するリンカーを介してVHB-VLAと結合している
一本鎖ポリペプチドをコードする。

【０１２１】次いで、このプラスミドをTG1細菌に挿入
し、当業者に公知の方法によりこれらを培養した(Konte
rmann, R.E. (1997))。

【０１２２】この細菌を破砕し、固定化金属アフィニテ
ィークロマトグラフィー(IMAC)(Hochuli et al., Bio/T
echn. 6, 1321-1325(1988))により、一本鎖二価抗原結
合タンパク質を細胞周辺調製物から精製した。この方法
の詳細については、Kontermann et al., (1997)に記載
されている。

【０１２３】精製タンパク質の分子量は60kDaであるこ
とがSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲル濾
過により示されている。細菌培養液1リットルにつき、
この分子を約200ないし300μg精製することが可能であ
る。細菌により発現された一本鎖二価抗原結合タンパク
質は、ELISAにおいてCEAおよびβ-ガラクトシダーゼと
反応し、o-ニトロフェニルβ-D-ガラクトピラノシドの
変換により示されたように、プラスチック結合CEAに酵
素を補充することができる（図6）。さらに、この一本
鎖二価抗原結合タンパク質は、β-ガラクトシダーゼの
補充および基質5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-D-
ガラクトピラノシド(X-Gal)の変換により生存および固
定CEA発現LoVo細胞を染色することができた。このため
に、LoVo細胞を、10μg/mlの適切な抗原結合タンパク質
と10μg/mlβ-ガラクトシダーゼおよびX-Gal(PBS中0.8m
g/ml、3mMシアン化カリウム鉄(III)、3mMシアン化カリ
ウム鉄(II)とともにインキュベートした。種々の対照細
胞(A549、HEK293)で、または鶏卵ライソザイムおよびβ
-ガラクトシダーゼに対するジアボディー(HEL Gal；Kon
termann et al.,(1997))では染色は認められなかった。

【０１２４】実施例2 ：一本鎖二価抗原結合タンパク質
の真核細胞による発現真核細胞における発現のためには、一本鎖二価抗原結合
タンパク質のコーディング領域を真核細胞発現ベクター
(pSecTagA，Invitrogen)中にクローン化し、細菌シグナ
ル配列は、すでにベクター中に存在するIg-κシグナル
配列と置換しておいた。

【０１２５】このためには、一本鎖構築体をプライマー
LMB2およびpelB-Metminusを用いて増幅し、それによりp
elBリーダー(21位)におけるメチオニンをトレオニンに
置換した。次いで、これをSfilおよびEcoRIで加水分解
し、ベクターpSecTagA中にクローン化した。成熟一本鎖
抗原結合タンパク質は、VHAドメインのN末端に7個のア
ミノ酸付加(AAQPATA)（配列番号１５）を含む。

【０１２６】このプラスミドを、一時的にリポフェクタ
ミン(Gibco)を用いて真核HEK293細胞にトランスフェク
トした。安定した細胞をゼオシンの存在下で選択した。
これらの細胞を用いる免疫蛍光実験において、小胞体ER
およびゴルジ体の染色を検出することが可能であった。
さらに、³⁵S-Met-標識細胞の上清に由来する60kDaタン
パク質の免疫沈降および固定化金属アフィニティークロ
マトグラフィー(IMAC)による精製による、一本鎖二価抗
原結合タンパク質の分泌を検出することも可能であっ
た。精製タンパク質は、β-ガラクトシダーゼとCEA被覆
マイクロタイタープレートとの結合、およびβ-ガラク
トシダーゼのプラスチック結合CEAへの補充において機
能的に活性を有する（図7）。

【０１２７】実施例3 ：一本鎖二価抗原結合タンパク質
を分泌する細胞との共存培養によるinvitroにおける酵
素の補充 in vitroにおいて一本鎖二価抗原結合タンパク質を産生
するHEK293細胞およびCEA陽性LoVo細胞を共存培養する
ことにより、補充を検討した。このために、まず、本発
明のタンパク質を産生する細胞をLoVo細胞とともにトラ
ンスウェル細胞培養ディッシュ(Costar)中で培養し、膜
により2つの細胞ラインを分離した。2日後にβ-ガラク
トシダーゼ(10μg/ml)を加え、基質X-Galを加えること
によりその補充を検出した。一本鎖二価抗原結合タンパ
ク質を産生する細胞との共存培養時には特異的染色が認
められたが、非トランスフェクトHEK293細胞を用いる対
照実験においては染色は認められなかった。

【０１２８】LoVo細胞がA549細胞(CEA陰性)により置換
される実験、および一本鎖二価抗原結合タンパク質を産
生する細胞が酵素および基質とともにインキュベートさ
れる実験でもまた同様に陰性であった。後者は、一本鎖
二価抗原結合タンパク質を産生する細胞がそれ自身、酵
素に結合できないことを示している。

【０１２９】もう１つの実験においては、一本鎖二価抗
原結合タンパク質を分泌するHEK293細胞、およびLoVo細
胞を、播種比率1:4〜1:24で直に共存培養した。LoVo細
胞からHEK293細胞を区別するために、LoVo細胞を加える
前に前者をCM-Dil(MolecularProbes)(赤色蛍光)で染色
した。2日後に、β-ガラクトシダーゼを加え、X-Gal(10
μg/ml)の添加および抗β-ガラクトシダーゼ抗体(Biotr
end)による直接免疫蛍光により、細胞への結合を検出し
た。これらの実験もまた、この酵素のLoVo細胞への特異
的補充を示したが、HEK293細胞は染色されなかった。非
トランスフェクトHEK293細胞を用いる対照実験は陰性で
あった。これらの実験は、一本鎖二価抗原結合タンパク
質が特異的かつ選択的に腫瘍細胞を認識することを証明
するものである。

【０１３０】さらなる実験では、無毒なダウノマイシン
β-D-ガラクトピラノシドの細胞傷害性ダウノマイシン
への変換を検討した。LoVo細胞を精製一本鎖二価抗原結
合タンパク質(10μg/ml)とともに1時間インキュベート
し、次いでβ-ガラクトシダーゼ(1μg/ml)およびダウノ
マイシンβ-D-ガラクトピラノシド(2μM)とともに37℃
で1時間インキュベートすることにより、得られるダウ
ノマイシンの核内における特異的局在を、ダウノマイシ
ンとの直接的インキュベーションによる染色に匹敵す
る、基質の自己蛍光により検出することが可能であっ
た。一本鎖二価抗原結合タンパク質またはβ-ガラクト
シダーゼの不在下、および対照細胞(HEK293；一本鎖二
価抗原結合タンパク質産生HEK)において核染色は検出さ
れなかった。これらの実験は一本鎖二価抗原結合タンパ
ク質が腫瘍細胞に酵素を補充することができ、またこの
酵素は無毒の前駆体を毒性物質に変換するのに使用でき
ることを証明している。

【０１３１】この作用をさらなる実験で利用して、腫瘍
細胞を特異的に殺傷することが可能である。

【０１３２】この目的で、LoVo細胞を96ウェルプレート
中で一本鎖二価抗原結合タンパク質と(10μg/ml)、次い
でダウノマイシンβ-D-ガラクトピラノシド(5μM)とと
もに37℃にて1時間インキュベートした。2日後に、WST
試験(Boehringer Mannheim)を用いて細胞の死滅を分析
した（図8）。この場合、前駆薬剤の薬剤への変換の際
の細胞の死滅は、薬剤の存在下とほぼ同様に良好であっ
た（図8A）。ある成分の不在下、またはCEA陰性A549細
胞を用いた場合には、実質的作用は認められなかった。
（図8B）。

【０１３３】実施例4 ：一本鎖二価抗原結合タンパク質
の細胞内発現のための構築体の製造一本鎖二価抗原結合タンパク質の細胞内発現のために、
一本鎖二価抗原結合タンパク質遺伝子のＤＮＡを種々の
プライマーを用いて増幅する。

【０１３４】トランスメンブラン一本鎖二価抗原結合タ
ンパク質(TM-scDAP)。このためには、遺伝子の3'末端に
おいてトランスメンブランドメインPDGFRを挿入するプ
ライマーが使用される。

【０１３５】(LPFKVVVISAIIALVVLTIISLIILIMLWQKKPRYE
S)（配列番号１６）小胞体に局在する一本鎖二価抗原結合タンパク質(ER-sc
DAP)。このためには、遺伝子の3'末端にER保持シグナル
(SEKDEL)を挿入するプライマーが使用される。

【０１３６】細胞質に局在する一本鎖二価抗原結合タン
パク質(cyto-scDAP)。このためには、遺伝子の5'末端の
シグナル配列をメチオニンおよび最適な翻訳開始のため
のKozak配列に置換するプライマーが使用される。

【０１３７】核に局在する一本鎖二価抗原結合タンパク
質(nuc-scDb)。このためには、遺伝子の5'末端のシグナ
ル配列をメチオニンおよび最適な翻訳開始のためのKoza
k配列に置換するプライマー、および遺伝子の3'末端に
核局在配列(PKKKRKVGGGT（配列番号１７）；核局在配列
は下線)を挿入するプライマーが使用される。

【０１３８】これらの断片を適切な真核細胞発現ベクタ
ー中にクローン化する(pSecTagAおよびpcDNA3；Invitro
gen)。次いで、得られた構築体（TM-scDAP、ER-scDAP、
cyto-scDAP、nuc-scDAPおよびsec-scDAP(=分泌タンパク
質；実施例2を参照)）を一時的に真核細胞(3T3)中にト
ランスフェクトし、発現タンパク質の局在を抗Mycエピ
トープ抗体を用いる免疫蛍光法により調べる。分泌経路
に典型的な染色は、構築体sec-scDAP、ER-scDAPおよびT
M-scDAPに関して検出可能であるが、cyto-scDAPは細胞
質に拡散して局在しており、nuc-scDAPは核中に局在し
ている。

【０１３９】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH <120> Single-chain multiple antigen-binding molecule, its preparation and use <130> 119449 <140> <141> <150> GB19816141.7 <151> 1998-04-09 <150> GB19827239.1 <151> 1998-06-18 <160> 17 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:connecting peptide (P) <400> 1 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Arg Ala Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:connecting peptide (P) <400> 2 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Arg Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Myc E-BOX <400> 3 ggaagcagac cacgtggtct gcttcc 26 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:E-BOX (Myo-D) <400> 4 agcaggtgtt gggaggc 17 <210> 5 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:binding site for GATA-4 of the α-myosin heavy chain gene <400> 5 ggccgatggg cagatagagg gggccgatgg gcagatagag g 41 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Myc E-BOX <400> 6 ggaagcagac cagctggtct gcttcc 26 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:connecting peptide (P) <400> 7 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Arg Ala Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 8 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:linker (L) <400> 8 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Myc epitope <400> 9 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn 1 5 10 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:polyhistidine <400> 10 His His His His His His 1 5 <210> 11 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer <400> 11 ttgttctgcg gccgcccgtt tcagctccag cttggtgcca gcacc 45 <210> 12 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer <400> 12 tgcatgctag ggcgcgcctc gggcggaggt ggctcacagg tgcagctggt gcaatctgg 59 <210> 13 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer <400> 13 gctcggtaag gcgcgcccac cgctgccacc gcctccacct aggacggtca gcttggtccc 60 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer <400> 14 ttactcgcgg cccagccggc cacggcccag gt 32 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:additional amino acids <400> 15 Ala Ala Gln Pro Ala Thr Ala 1 5 <210> 16 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:TM-scDAP <400> 16 Leu Pro Phe Lys Val Val Val Ile Ser Ala Ile Ile Ala Leu Val Val 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ile Ser Leu Ile Ile Leu Ile Met Leu Trp Gln Lys Lys 20 25 30 Pro Arg Tyr Glu Ser 35 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:nuclear localization sequence <400> 17 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Gly Gly Thr 1 5 10

【図面の簡単な説明】

【図１】一本鎖二抗原結合分子の構造を図示したもので
ある。

【図２】エフェクターを有する一本鎖二抗原結合分子の
構造を図示したものである。

【図３】一本鎖二抗原結合分子をコードする核酸構築体
を図示したものである。

【図４】エフェクターを有する一本鎖二抗原結合分子を
コードする核酸構築体を図示したものである。

【図５】一本鎖二抗原結合分子をコードする核酸構築体
を図示したものである。

【図６】本発明の一本鎖二抗原結合タンパク質によるプ
ラスチック結合CEAに対するβ-ガラクトシダーゼの補充
(scDb-CEAGal)を、CEAおよび大腸菌β-ガラクトシダー
ゼ(CEAGal)に対するジアボディーとの比較において示
す。負の対照としては、マイクロタイタープレートをBS
Aで被覆した。

【図７】CEAを被覆したマイクロタイタープレートに使
用されている種々の量のscDb-CEAGalおよびβ-ガラクト
シダーゼを用いて、哺乳類細胞により分泌されたscDb-C
EAGalによるβ−ガラクトシダーゼの補充を示す。使用
した基質はo-ニトロフェニルβ-D-ガラクトピラノシド
であった。負の対照としては、マイクロタイタープレー
トをBSAで被覆した。

【図８】Ａは、本発明の一本鎖二抗原結合タンパク質(s
cDb)、β-ガラクトシダーゼ（β-Gal）、ダウノマイシ
ンβ-D-ガラクトピラノシド（前駆薬剤）および／また
はダウノマイシン（薬剤）の存在下でのLoVo細胞の死滅
を示す。Ｂは、CEA陰性細胞ライン(A549)を用いた対照
実験を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 37/00 Ａ６１Ｋ 31/00 ６３７Ａ６１Ｋ 35/74 35/74 Ｚ 35/76 35/76 38/00 Ｃ０７Ｋ 16/46 Ｃ０７Ｋ 16/46 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 Ａ６１Ｋ 37/02 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者ハンス‐ハラルト、ゼトラツェックドイツ連邦共和国マールブルク、ゾネンハンク、３ (72)発明者ロルフ、ミューラードイツ連邦共和国マールブルク、ポイチールスシュトラーセ、８

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記構成要素： (a)第１の特異性(A)を有する免疫グロブリンの重鎖の可
変ドメイン(VH)およびその機能的部分、(b)第２の特異
性(B)を有する免疫グロブリンの軽鎖の可変ドメイン(V
L)およびその機能的部分、(c)特異性(B)を有する免疫グ
ロブリンの重鎖の可変ドメイン(VH)およびその機能的部
分、および(d)特異性(A)を有する免疫グロブリンの軽鎖
の可変ドメイン(VL)およびその機能的部分、（ここで、
VHおよびVLドメインはVH-VL構築体またはVL-VH構築体の
形態で連結し、かつ、この２つのVH-VL構築体はペプチ
ド(P)を介して連結している）を含んでなる一本鎖多抗
原結合分子。
【請求項２】２以上のVH-VL構築体を含んでなる、請求
項１記載の一本鎖多抗原結合分子。
【請求項３】VH-VL構築体が同一の特異性を有するドメ
インを介して連結されている、請求項１または２記載の
一本鎖多抗原結合分子。
【請求項４】特異性(A)および(B)が実質的に同一であ
る、請求項１〜３のいずれか１項に記載の一本鎖多抗原
結合分子。
【請求項５】VHおよびVLドメインが、VH-L-VL構築体ま
たはVL-L-VH構築体の形態でペプチドリンカー(L)を介し
て連結されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載
の一本鎖多抗原結合分子。
【請求項６】リンカー(L)が約1〜20個のアミノ酸、好ま
しくは約1〜5個のアミノ酸長である、請求項５記載の一
本鎖多抗原結合分子。
【請求項７】リンカー(L)がアミノ酸配列GGGGSを含んで
なる、請求項５記載の一本鎖多抗原結合分子。
【請求項８】ペプチド(P)が約12〜40個のアミノ酸、好
ましくは約12〜20個のアミノ酸、特には約14個のアミノ
酸長である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の一本
鎖多抗原結合分子。
【請求項９】ペプチド(P)がアミノ酸配列GGGGSGGRASGGG
SまたはGGGGSGGRASGGGGSを含んでなる、請求項８記載の
一本鎖多抗原結合分子。
【請求項１０】該分子がさらなる構成要素として１以上
のエフェクター(E)を含んでなる、請求項１〜９のいず
れか１項に記載の一本鎖多抗原結合分子。
【請求項１１】エフェクター(E)がコネクター(B)を介し
て該分子に連結されている、請求項１０記載の一本鎖多
抗原結合分子。
【請求項１２】コネクター(B)がプロテアーゼ切断配
列、好ましくはPSA、カテプシン、プラスミノーゲン、
および／またはプラスミノーゲンアクチベーター切断配
列を含んでなる、請求項１１記載の一本鎖多抗原結合分
子。
【請求項１３】第１の特異性(A)が分析すべき分子に向
けられ、かつ、第２の特異性(B)が分析物質（analyte）
に向けられる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の
一本鎖多抗原結合分子。
【請求項１４】分析物質が放射性分子、蛍光分子および
／または酵素である、請求項１３記載の一本鎖多抗原結
合分子。
【請求項１５】第１の特異性(A)が分析すべき分子に向
けられ、第２の特異性(B)が別の分析すべき分子に向け
られ、かつ、エフェクター(E)が分析物質である、請求
項１０〜１２のいずれか１項に記載の一本鎖多抗原結合
分子。
【請求項１６】分析物質が放射性分子、蛍光分子および
／または酵素である、請求項１５記載の一本鎖多抗原結
合分子。
【請求項１７】ペプチド(P)および／またはエフェクタ
ー(E)がフゾジェニックペプチド（fusogenic peptide）
を含んでなる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の
一本鎖多抗原結合分子。
【請求項１８】第１の特異性(A)が標的細胞に向けら
れ、かつ、第２の特異性(B)がベクターに向けられてい
る、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の一本鎖多抗
原結合分子。
【請求項１９】ベクターが核酸、陽イオンペプチドまた
はタンパク質、陽イオン脂質、陽イオンポリマー、陽イ
オンポルフィリン、またはAdV、AAV、ワクシニア、RS
V、HSV、インフルエンザまたはレンチウイルスベクター
からなる群より選択されるウイルスベクターである、請
求項１８記載の一本鎖多抗原結合分子。
【請求項２０】第１の特異性(A)が、細胞膜に、特にリ
ンパ球、マクロファージ、単球、顆粒球、造血細胞、内
皮細胞、平滑筋細胞、横紋筋細胞、上皮細胞、肝細胞、
腎細胞、グリア細胞、支持組織の細胞、腫瘍細胞または
白血病細胞に、あるいは細胞外マトリックスの、補体系
の、凝固系の、キニン系の、血漿の、支持組織のタンパ
ク質に、あるいはサイトカイン類またはケモキニン類
に、あるいは内または外毒素に、あるいは医薬、特にジ
ギタリスに、および／または、特に細菌、ウイルスおよ
び／または病原寄生生物などの病原体に向けられる、請
求項１〜１２のいずれか１項に記載の一本鎖多抗原結合
分子。
【請求項２１】第２の特異性(B)が、細胞膜に、特にリ
ンパ球、マクロファージ、単球または顆粒球に、サイト
カイン類、ケモカイン類または成長因子に、補体系のタ
ンパク質に、凝固系のタンパク質に、繊維素溶解タンパ
ク質に、不活性な薬剤前駆体を標的構造に対して活性の
ある、特に細胞障害性である、薬剤へと変換することが
できる酵素に、ペプチドホルモンまたはステロイドホル
モンに、免疫グロブリンの不変部分に、特にヒスタミ
ン、セロトニン、ロイコトリエン、プロスタシクリンま
たはキニンなどの伝達物質に、病原体に、腫瘍細胞に、
内または外毒素に、医薬、特にジギタリスに向けられ
る、請求項１〜１２および２０のいずれか１項に記載の
一本鎖多抗原結合分子。
【請求項２２】エフェクター(E)が、トランスメンブラ
ンドメイン、糖リン脂質アンカー、受容体のリガンド結
合部分、受容体のリガンドまたはリガンドの受容体結合
部分、ペプチドホルモン、サイトカイン、成長因子、成
長因子阻害剤、ケモカイン、インターフェロン、伝達物
質、循環に作用するペプチド、不活性な薬剤前駆体を活
性のある薬剤へと変換する酵素；凝固を活性化または阻
害するタンパク質；繊維素溶解を活性化または阻害する
タンパク質；補体系を活性化または阻害するタンパク
質；免疫グロブリンの１以上の不変ドメイン；細胞障害
ペプチド；別の一本鎖、一価または多価、特に二抗原結
合分子；腫瘍抗原または、例えば、細菌抗原またはウイ
ルス抗原などの病原体の抗原；システインおよび／また
はジ-または多量体形成ペプチドを含んでなるペプチド
から選択される、請求項１〜１２、２０および２１のい
ずれか１項に記載の一本鎖多抗原結合分子。
【請求項２３】請求項１〜２２のいずれか１項に記載の
一本鎖多抗原結合分子をコードする核酸。
【請求項２４】該核酸が、その5'末端にシグナルまたは
トランスメンブラン配列をコードする核酸配列を含んで
なる、請求項２３に記載の核酸。
【請求項２５】該核酸が、その5'末端にプロモーターお
よび／またはアクチベーターを含んでなる、請求項２３
または２４記載の核酸。
【請求項２６】アクチベーターが細胞特異的に、細胞周
期特異的に、代謝特異的におよび／または薬剤により活
性化、または抑制され得る、請求項２５記載の核酸。
【請求項２７】該核酸が、その開始コドンの5'末端に、
配列GCCACCまたはGCCGCCを含んでなる、請求項２３〜２
６のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項２８】請求項２３〜２７のいずれか１項に記載
の核酸を含んでなるベクター。
【請求項２９】ウイルスベクターまたは非ウイルスベク
ターである、請求項２８記載のベクター。
【請求項３０】非ウイルスベクターが陽イオン脂質、陽
イオンポリマー、陽イオンペプチドまたは陽イオンポル
フィリンから選択される、請求項２９記載のベクター。
【請求項３１】請求項２３〜２７のいずれか１項に記載
の核酸、もしくは請求項２８または２９記載のベクター
を含んでなる細胞。
【請求項３２】細菌、酵母、昆虫または哺乳類細胞であ
る、請求項３１記載の細胞。
【請求項３３】哺乳類細胞がリンパ球、単球、グリア細
胞、上皮細胞、肝細胞、腎細胞、骨髄細胞、内皮細胞、
平滑または横紋筋細胞または繊維素である、請求項３２
記載の細胞。
【請求項３４】請求項３１または３２記載の細胞を培養
した後、必要であれば、発現産物を単離する、一本鎖多
抗原結合分子の製造方法。
【請求項３５】請求項１〜１２および１７〜２２のいず
れか１項に記載の一本鎖多抗原結合分子、請求項２３〜
２７のいずれか１項に記載の核酸、請求項２８〜３０の
いずれか１項に記載のベクター、または請求項３１〜３
３のいずれか１項に記載の細胞を含んでなる医薬。
【請求項３６】請求項１３〜１６のいずれか１項に記載
の一本鎖多抗原結合分子を含んでなる診断補助剤。
【請求項３７】腫瘍、自己免疫疾患、炎症性疾患、血液
の、特に血液凝固および／または循環系の疾患、神経系
疾患および／または感染症の治療、予防または診断のた
めの、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の一本鎖多
抗原結合分子の、請求項２３〜２７のいずれか１項に記
載の核酸の、請求項２８〜３０のいずれか１項にベクタ
ーの、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の細胞の
使用。