JP2021525243A - Nk細胞による標的細胞の殺傷を増進するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
本開示は、対象において免疫応答を増進するためおよび自己反応性B細胞により媒介されるがんまたは炎症状態を治療するための免疫療法組成物および方法を提供する。一部の態様では、少なくとも1つの腫瘍抗原またはB系列細胞抗原ならびにNKp30および/または別の活性化NK受容体を認識する多重特異性抗原結合性構築物が提供される。一部の態様では、少なくとも2つの腫瘍抗原またはB系列細胞により発現される2つの抗原、NKp30、および別の活性化NK受容体を認識する多重特異性抗原結合性構築物が提供される。本明細書に開示される多重特異性抗原結合性構築物および方法は、CD16欠損性微環境により特徴付けられる、および/または腫瘍抗原の発現の低いレベルを有する標的細胞(例えば、がん細胞)により特徴付けられるがんであったとしても、がんの治療のために使用することができる。
Description
本開示は、NK細胞による標的細胞の殺傷を増進するための組成物および方法に関する。
がんは主な死因の一つであり、米国癌学会(American Association for Cancer Research;AACR)の2017年版Cancer Progress Reportによれば、2015年に世界中でほぼ6分の1の死を占める。がんに関与する分子メカニズムは高度に複雑である。一部の状況では、T細胞、ナチュラルキラー細胞、およびマクロファージなどの免疫細胞は抗腫瘍活性を呈し、腫瘍の発生および/または進行を効果的に制御することができる。免疫細胞は腫瘍抗原(腫瘍特異的または腫瘍関連抗原)を認識し、抗原を発現する細胞を排除する。しかしながら、腫瘍はまた高度に抑制性の微環境を構成し、浸潤性免疫細胞の機能を下方調節することができる。例えば、腫瘍細胞は、腫瘍特異的または腫瘍関連抗原のレベルを下方調節し、浸潤性免疫細胞による細胞死を免れることができる。結果として、患者の免疫系はがん細胞を異物として認識しないことがあり、またはがん細胞を破壊するには十分に強くないことがある。
がんに対する多数の治療が現在利用可能であり、これには、手術、放射線、化学療法、ホルモン療法、免疫療法、標的化療法、幹細胞移植、およびプレシジョンメディシンが含まれる。具体的には、患者の内因性免疫系細胞(例えば、T細胞、ナチュラルキラー細胞、およびマクロファージ)を利用して腫瘍の形成および進行を阻害する免疫療法アプローチが近年開発されている。CD16は、ある特定の免疫療法にとっての標的である。例えば、マルゲツキシマブは、多数の腫瘍細胞上に発現されるヒト上皮増殖因子受容体2(HER2)を認識し、免疫エフェクター細胞(例えば、NK細胞)上のCD16aを標的化するFc最適化モノクローナル抗体である。追加的に、免疫療法薬物をB細胞リンパ腫に標的化するためにCD16およびCD19を認識する二重特異性抗体断片が開発されている。開発中の別の免疫療法は、NKG2D、腫瘍抗原、およびCD16に結合する多重特異性結合性タンパク質を伴う。しかしながら、ある特定の患者は、CD16のレベルが対照NK細胞と比較してNK細胞上で減少したレベルで存在するがんを有する。
既存の免疫腫瘍学の療法は、患者および腫瘍の大部分にとって依然としていくぶん効果的でない。例えば、腫瘍細胞が腫瘍抗原の発現を下方調節する場合、腫瘍抗原を標的とする免疫療法は効果的でないことがある。腫瘍関連抗原を標的化するモノクローナル抗体は、低抗原発現性腫瘍に対して有効性を示さなかった。したがって、低い抗原発現レベルを有する患者はある特定の利用可能な免疫療法に対して適格ではない。
追加的に、炎症状態(例えば、全体的または部分的に自己反応性B細胞により媒介される炎症状態)は一般的である。B細胞(形質細胞を含む)はそのような状態において複数の役割を有し、これには、自己抗体の分泌、自己抗原の提示、炎症性サイトカインの分泌、抗原プロセシングおよび提示のモジュレーション、ならびに異所性胚中心の生成が含まれる。B細胞の枯渇が提唱されているが、大域的なB細胞枯渇は保護的B細胞および病原性B細胞の両方を排除する。
本開示は、がん細胞に対する免疫応答を増進する(例えば、NK細胞の活性を増進する)ことができる多重特異性抗原結合性構築物の発見に少なくとも部分的に基づく。本開示はいかなる具体的な理論または作用機序によっても縛られないが、本明細書に記載の構築物は、がん細胞もしくはB系列細胞により発現される1つもしくは複数の腫瘍もしくはB系列細胞抗原、および/または1つもしくは複数の追加のNK細胞受容体に結合した場合に、隣接する免疫エフェクター細胞上のNKp30活性をアゴナイズし、それにより、構築物が結合した標的細胞に対する免疫応答を増進する(例えば、NKエフェクター機能、T細胞増殖、IFNγの産生および分泌、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)、ならびに/またはT細胞の細胞溶解活性を増加させる)ことができる。例えば、NKp30機能および/または1つもしくは複数の追加のNK細胞受容体をアゴナイズし、1つまたは複数の腫瘍抗原(例えば、B細胞成熟抗原(BCMA)またはHER2)を発現する腫瘍細胞に対する免疫応答を増進する多重特異性抗原結合性構築物が提供される。
本発明の多重特異性抗原結合性構築物は、1つまたは複数の例示的な特徴により目立つものである。本開示はいかなる具体的な理論または作用機序によっても縛られないが、第1に、1つまたは複数の腫瘍抗原またはB系列細胞抗原、例えば、BCMAに結合する抗原結合単位は、標的抗原とそのコグネイトリガンドまたは受容体との相互作用を阻害することができる。一部の実施形態では、腫瘍またはB系列細胞抗原を介するシグナル伝達は、該抗原を発現するがん細胞の増殖および/または生存能力を増進することができる。第2に、そのような活性は記載される構築物の機能のために必要とされないが、構築物はまた、可能とされたエフェクター機能であることができ(例えば、それらは、抗体のFc領域で可能とされたエフェクター機能を構成することができる)、これは抗体依存性細胞傷害性(ADCC)をサポートする。第3に、構築物は、標的細胞およびNK細胞に同時に結合できるように構造化されており、第4に、構築物は、例えば腫瘍微環境中で、NKp30のエンゲージメントを介してNK細胞活性化を誘発し、可溶性NKp30リガンドの効果を阻害し、NK細胞による炎症促進性サイトカインを増加させることができる他に、一部の実施形態では、1つまたは複数の追加のNK細胞受容体にエンゲージメントすることができる。
よって、一態様では、本開示は、少なくとも2つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性(例えば、二重特異性、三重特異性、四重特異性)抗原結合性構築物であって、第1の抗原結合単位が、腫瘍またはB系列細胞抗原に特異的に結合し、第2の抗原結合単位が、NKp30抗原に特異的に結合する、多重特異性抗原結合性構築物を提供する。
別の態様では、本開示は、少なくとも3つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、第1の抗原結合単位が、第1の腫瘍またはB系列細胞抗原に特異的に結合し、第2の抗原結合単位が、NKp30抗原に特異的に結合し、第3の抗原結合単位が、第2の腫瘍もしくはB系列細胞抗原またはNK受容体(活性化NK細胞受容体)に結合する、多重特異性抗原結合性構築物を特徴とする。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第3の抗原結合単位は第2の腫瘍またはB系列細胞抗原に結合する。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第3の抗原結合単位はNK受容体に結合する。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第3の抗原結合単位はNK受容体に結合する。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、NK受容体はNKp30であり、例えば、構築物はNKp30について二価である。本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、NK受容体はNKG2Dである。本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、NK受容体はNKp46またはNKp44である。本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、NK受容体は、本明細書に記載のまたは当該技術分野において公知の任意の他のNK細胞活性化受容体である。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は、第1の腫瘍またはB系列細胞抗原に結合する2つの抗原結合単位を含む。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第1の腫瘍またはB系列細胞抗原および第2の腫瘍またはB系列細胞抗原は同じ抗原である。例えば、本明細書に記載の構築物は、単一の標的抗原、例えば、BCMAについて少なくとも二価であることができる。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第1の腫瘍またはB系列細胞抗原および第2の腫瘍またはB系列細胞抗原は同じ抗原である。例えば、本明細書に記載の構築物は、単一の標的抗原、例えば、BCMAについて少なくとも二価であることができる。
さらに別の態様では、本開示は、少なくとも3つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、第1の抗原結合単位が、第1の腫瘍またはB系列細胞抗原に特異的に結合し、第2の抗原結合単位が、NKp30抗原に特異的に結合し、第3の抗原結合単位が、第2の腫瘍またはB系列細胞抗原に結合する、多重特異性抗原結合性構築物を特徴とする。
別の態様では、本開示は、少なくとも3つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、第1の抗原結合単位が、第1の腫瘍またはB系列細胞抗原に特異的に結合し、第2の抗原結合単位が、NKp30抗原に特異的に結合し、第3の抗原結合単位が、NK受容体に結合する、多重特異性抗原結合性構築物を特徴とする。
別の態様では、本開示は、少なくとも4つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、(i)第1の抗原結合単位が、第1の腫瘍またはB系列細胞抗原に特異的に結合し、第2の抗原結合単位が、第1のNK細胞活性化受容体に特異的に結合し、第3の抗原結合単位が、第2のNK細胞活性化受容体に結合し、第4の抗原結合単位が、第2の腫瘍またはB系列細胞抗原に結合し、(ii)第1のNK受容体がNKp30であり、第2のNK受容体がNKp30ではない、多重特異性抗原結合性構築物を提供する。例えば、第2のNK受容体は、NKG2D、2B4、NK−46、CD226、CD137、またはNKp44であることができる。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第1の腫瘍またはB系列細胞抗原および第2の腫瘍またはB系列細胞抗原は同じ抗原である。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第1の腫瘍抗原または第2の腫瘍抗原は、1GH−IGK、43−9F、5T4、791Tgp72、シクロフィリンC会合タンパク質(acyclophilin C−associated protein)、アルファ−フェトプロテイン(AFP)、α−アクチニン−4、A3、A33抗体に特異的な抗原、ART−4、B7、Ba 733、BAGE、BCMA、BCR−ABL、ベータカテニン、ベータ−HCG、BrE3抗原、BCA225、BTAA、CA125、CA 15−3\CA 27.29\BCAA、CA195、CA242、CA−50、CAM43、CAMEL、CAP−1、炭酸脱水酵素IX、c−Met、CA19−9、CA72−4、CAM 17.1、CASP−8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a−e、CD67、CD68、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD83、CD95、CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK4、CDK4m、CDKN2A、CO−029、CTLA4、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF−1a、結腸特異的抗原p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、c−Met、DAM、E2A−PRL、EGFR、EGFRvIII、EGP−1(TROP−2)、EGP−2、ELF2−M、Ep−CAM、線維芽細胞増殖因子(FGF)、FGF−5、Flt−1、Flt−3、葉酸受容体、G250抗原、Ga733VEpCAM、GAGE、gp100、GRO−β、H4−RET、HLA−DR、HM1.24、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)およびそのサブユニット、HER2/neu、HMGB−1、低酸素誘導因子(HIF−1)、HSP70−2M、HST−2、HTgp−175、Ia、IGF−1R、IFN−γ、IFN−α、IFN−β、IFN−λ、IL−4R、IL−6R、IL−13R、IL−15R、IL−17R、IL−18R、IL−2、IL−6、IL−8、IL−12、IL−15、IL−17、IL−18、IL−23、IL−25、インスリン様増殖因子−1(IGF−1)、KC4抗原、KSA、KS−1抗原、KS1−4、LAGE−1a、Le−Y、LDR/FUT、M344、MA−50、マクロファージ遊走阻害因子(MIF)、MAGE、MAGE−1、MAGE−3、MAGE−4、MAGE−5、MAGE−6、MART−1、MART−2、TRAG−3、mCRP、MCP−1、MIP−1A、MIP−1B、MIF、MG7−Ag、MOV18、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC13、MUC16、MUM−1/2、MUM−3、MYL−RAR、NB/70K、Nm23H1、NuMA、NCA66、NCA95、NCA90、NY−ESO−1、p15、p16、p185erbB2、p180erbB3、PAM4抗原、膵臓がんムチン(pancreatic cancer mucin)、PD1受容体(PD−1)、PD−1受容体リガンド1(PD−L1)、PD−1受容体リガンド2(PD−L2)、PI5、胎盤増殖因子、p53、PLAGL2、Pmel17前立腺酸ホスファターゼ、PSA、PRAME、PSMA、PlGF、ILGF、ILGF−1R、IL−6、IL−25、RCAS1、RS5、RAGE、RANTES、Ras、T101、SAGE、S100、サバイビン、サバイビン−2B、SDDCAG16、TA−90\Mac2結合タンパク質、TAAL6、TAC、TAG−72、TLP、テネイシン、TRAIL受容体、TRP−1、TRP−2、TSP−180、TNF−α、Tn抗原、トムセン−フリーデンライヒ抗原(Thomson−Friedenreich antigens)、腫瘍壊死抗原、チロシナーゼ、VEGFR、ED−Bフィブロネクチン、WT−1、17−1A抗原、補体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管新生マーカー、bc1−2、bc1−6、またはK−rasである。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第1の腫瘍抗原または第2の腫瘍抗原は、1GH−IGK、43−9F、5T4、791Tgp72、シクロフィリンC会合タンパク質(acyclophilin C−associated protein)、アルファ−フェトプロテイン(AFP)、α−アクチニン−4、A3、A33抗体に特異的な抗原、ART−4、B7、Ba 733、BAGE、BCMA、BCR−ABL、ベータカテニン、ベータ−HCG、BrE3抗原、BCA225、BTAA、CA125、CA 15−3\CA 27.29\BCAA、CA195、CA242、CA−50、CAM43、CAMEL、CAP−1、炭酸脱水酵素IX、c−Met、CA19−9、CA72−4、CAM 17.1、CASP−8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a−e、CD67、CD68、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD83、CD95、CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK4、CDK4m、CDKN2A、CO−029、CTLA4、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF−1a、結腸特異的抗原p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、c−Met、DAM、E2A−PRL、EGFR、EGFRvIII、EGP−1(TROP−2)、EGP−2、ELF2−M、Ep−CAM、線維芽細胞増殖因子(FGF)、FGF−5、Flt−1、Flt−3、葉酸受容体、G250抗原、Ga733VEpCAM、GAGE、gp100、GRO−β、H4−RET、HLA−DR、HM1.24、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)およびそのサブユニット、HER2/neu、HMGB−1、低酸素誘導因子(HIF−1)、HSP70−2M、HST−2、HTgp−175、Ia、IGF−1R、IFN−γ、IFN−α、IFN−β、IFN−λ、IL−4R、IL−6R、IL−13R、IL−15R、IL−17R、IL−18R、IL−2、IL−6、IL−8、IL−12、IL−15、IL−17、IL−18、IL−23、IL−25、インスリン様増殖因子−1(IGF−1)、KC4抗原、KSA、KS−1抗原、KS1−4、LAGE−1a、Le−Y、LDR/FUT、M344、MA−50、マクロファージ遊走阻害因子(MIF)、MAGE、MAGE−1、MAGE−3、MAGE−4、MAGE−5、MAGE−6、MART−1、MART−2、TRAG−3、mCRP、MCP−1、MIP−1A、MIP−1B、MIF、MG7−Ag、MOV18、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC13、MUC16、MUM−1/2、MUM−3、MYL−RAR、NB/70K、Nm23H1、NuMA、NCA66、NCA95、NCA90、NY−ESO−1、p15、p16、p185erbB2、p180erbB3、PAM4抗原、膵臓がんムチン(pancreatic cancer mucin)、PD1受容体(PD−1)、PD−1受容体リガンド1(PD−L1)、PD−1受容体リガンド2(PD−L2)、PI5、胎盤増殖因子、p53、PLAGL2、Pmel17前立腺酸ホスファターゼ、PSA、PRAME、PSMA、PlGF、ILGF、ILGF−1R、IL−6、IL−25、RCAS1、RS5、RAGE、RANTES、Ras、T101、SAGE、S100、サバイビン、サバイビン−2B、SDDCAG16、TA−90\Mac2結合タンパク質、TAAL6、TAC、TAG−72、TLP、テネイシン、TRAIL受容体、TRP−1、TRP−2、TSP−180、TNF−α、Tn抗原、トムセン−フリーデンライヒ抗原(Thomson−Friedenreich antigens)、腫瘍壊死抗原、チロシナーゼ、VEGFR、ED−Bフィブロネクチン、WT−1、17−1A抗原、補体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管新生マーカー、bc1−2、bc1−6、またはK−rasである。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、B系列細胞により発現される第1または第2の標的抗原は、BCMA、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD27、CD38、CD40、CD72、CD78、CD79a、CD79b、CD80、CD84、CD86、CD126、CD138、CD319、TACからなる群から選択される。本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第1の腫瘍またはB系列細胞抗原および第2の腫瘍またはB系列細胞抗原の一方または両方はB細胞成熟抗原(BCMA)である。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位の1つまたは複数は抗体またはその抗原結合性部分である。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位のそれぞれは抗体またはその抗原結合性部分である。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位のそれぞれは抗体またはその抗原結合性部分である。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第1の抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性部分はモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分である。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位のいずれか1つの抗体またはその抗原結合性部分は、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、またはいずれかの抗原結合性部分である。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位のいずれか1つの抗体またはその抗原結合性部分は、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、またはいずれかの抗原結合性部分である。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位のいずれか1つの抗体またはその抗原結合性部分はscFvまたはFab抗体断片である。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位の1つまたは複数は非抗体スキャフォールドタンパク質(non−antibody scaffold protein)である。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位の1つまたは複数は非抗体スキャフォールドタンパク質(non−antibody scaffold protein)である。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位の1つまたは複数は、ポリペプチド、小分子、またはアプタマーである。
一部の実施形態では、本明細書に記載の任意の構築物は、エフェクター免疫細胞により発現される分子に特異的に結合する追加の抗原結合単位をさらに含む。エフェクター免疫細胞により発現される分子は、例えば、CD16、CD16a、CD16b、CD32a、CD64、またはCD89であることができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の任意の構築物は、エフェクター免疫細胞により発現される分子に特異的に結合する追加の抗原結合単位をさらに含む。エフェクター免疫細胞により発現される分子は、例えば、CD16、CD16a、CD16b、CD32a、CD64、またはCD89であることができる。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、1つの抗原結合単位のその標的への結合は、別の抗原結合単位のその標的への結合を遮断しない。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第1の抗原結合単位および第2の抗原結合単位はそれらの各々の標的に結合し、両方の抗原結合単位は同時に結合したままとなる。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第1の抗原結合単位および第2の抗原結合単位はそれらの各々の標的に結合し、両方の抗原結合単位は同時に結合したままとなる。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、全ての抗原結合単位はそれらの各々の標的に結合し、同時に結合したままとなる。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第1の抗原結合単位および1つまたは複数の追加の抗原結合単位のそれらの各々の標的への結合は、第1の細胞および腫瘍細胞またはB系列細胞を一緒になるようにブリッジ形成させることができる。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第1の抗原結合単位および1つまたは複数の追加の抗原結合単位のそれらの各々の標的への結合は、第1の細胞および腫瘍細胞またはB系列細胞を一緒になるようにブリッジ形成させることができる。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第1の細胞および腫瘍細胞またはB系列細胞のブリッジ形成は、フローサイトメトリーおよび/または蛍光プレートリーダーにより決定される。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第1の抗原結合単位および第4の抗原結合単位の一方または両方は標的抗原機能を阻害する。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は多重特異性抗体である。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は多重特異性抗体である。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は共通の軽鎖を含む。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は四価である。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は少なくとも1つの腫瘍またはB系列細胞抗原について少なくとも二価である。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は四価である。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は少なくとも1つの腫瘍またはB系列細胞抗原について少なくとも二価である。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物はFcドメインを含まない。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、1つまたは複数の抗原結合単位は、Fcドメイン中の1つまたは複数の免疫グロブリンFc改変を含む重鎖を含む。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、1つまたは複数の抗原結合単位は、Fcドメイン中の1つまたは複数の免疫グロブリンFc改変を含む重鎖を含む。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、重鎖の免疫グロブリンFcドメインは、1つまたは複数の抗原結合単位のヘテロ二量体化を促進する1つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、突然変異は重鎖のCH3ドメイン中に存在する。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はクアドローマ細胞中で製造される。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はクアドローマ細胞中で製造される。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は1つまたは複数の免疫グロブリン定常領域改変を含む。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、抗体のヘテロ二量体化を促進する1つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、抗体のヘテロ二量体化を促進する1つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、1つまたは複数の突然変異は1つの抗原結合単位の軽鎖定常領域中に存在し、1つまたは複数の突然変異は別の抗原結合単位の重鎖定常領域中に存在する。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、Fcドメインは増加したエフェクター機能を有する。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、Fcドメインは減少したエフェクター機能を有する。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、Fcドメインは減少したエフェクター機能を有する。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、Fcドメインは構築物の半減期を増進する。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第1の腫瘍抗原および第2の腫瘍抗原の一方または両方は腫瘍特異抗原である。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第1の腫瘍抗原および第2の腫瘍抗原の一方または両方は腫瘍特異抗原である。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第1の抗原結合単位および第2の抗原結合単位は少なくとも1つのアミノリンカーアミノ酸配列により連結されている。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、リンカーアミノ酸配列はGGGGSx(配列番号22)(xは、1および6を含む1〜6の整数である)を含む。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、リンカーアミノ酸配列はGGGGSx(配列番号22)(xは、1および6を含む1〜6の整数である)を含む。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は、それぞれ配列番号11、12、および13において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は、配列番号10において示される重鎖可変領域配列を含む。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は、それぞれ配列番号15、16、および17において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は、それぞれ配列番号15、16、および17において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は、配列番号14、25、もしくは72において示される重鎖可変領域配列または配列番号14、25、もしくは72の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する重鎖可変配列を含む。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は、それぞれ配列番号19、20、および21において示される軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は、配列番号18において示される軽鎖可変領域配列または配列番号18の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する軽鎖可変配列を含む。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、構築物は、配列番号9または24において示される重鎖配列および配列番号8において示される軽鎖配列を含む。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、それぞれ配列番号38、39、および40、それぞれ配列番号11、12、および41、それぞれ配列番号44、45、および46、それぞれ配列番号47、48、および46、それぞれ配列番号11、45、および49、それぞれ配列番号11、50、および41、またはそれぞれ配列番号44、50、および41のいずれかにおいて示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む。任意選択で、構築物は、配列番号10、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、および配列番号57のいずれか1つの重鎖可変領域配列または配列番号10、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号56、および配列番号57のいずれか1つの配列に対して少なくとも90%の同一性を有する重鎖可変配列を含む。例として、構築物は、それぞれ、(a)配列番号15、16、および42において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、(b)配列番号69、70、および71において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、または(c)配列番号75、76、および77において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列を含むことができる。構築物は、それぞれ配列番号19、20、および43において示される軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列を含むことができる。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、それぞれ配列番号38、39、および40、それぞれ配列番号11、12、および41、それぞれ配列番号44、45、および46、それぞれ配列番号47、48、および46、それぞれ配列番号11、45、および49、それぞれ配列番号11、50、および41、またはそれぞれ配列番号44、50、および41のいずれかにおいて示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む。任意選択で、構築物は、配列番号10、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、および配列番号57のいずれか1つの重鎖可変領域配列または配列番号10、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号56、および配列番号57のいずれか1つの配列に対して少なくとも90%の同一性を有する重鎖可変配列を含む。例として、構築物は、それぞれ、(a)配列番号15、16、および42において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、(b)配列番号69、70、および71において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、または(c)配列番号75、76、および77において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列を含むことができる。構築物は、それぞれ配列番号19、20、および43において示される軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列を含むことができる。
配列番号9、配列番号24、配列番号26、配列番号27、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、および配列番号74のいずれか1つのアミノ酸配列を有する重鎖、ならびに配列番号8のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む構築物もまた本明細書において提供される。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、NKp30抗原に特異的に結合する第2の抗原結合単位は、任意選択で、配列番号7の残基I50、S82、またはL113の少なくとも1つを含むヒトNKp30上のエピトープに結合する。任意選択で、エピトープは配列番号7の残基I50を含む。任意選択で、エピトープは配列番号7の残基S82を含む。任意選択で、エピトープは配列番号7の残基L113を含む。例として、エピトープは、任意選択で、残基(i)配列番号7のI50およびS82、(ii)配列番号7のI50およびSL113、(iii)配列番号7のS82およびL113または(iv)配列番号7のI50、S82、およびL113を含む。第2の抗原結合単位または構築物は、任意選択で、約1×10−6またはそれ未満の親和性(KD)でNKp30に結合する。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第2の抗原結合単位または構築物は、任意選択で、ヒトNKp30のリガンド結合領域に結合する。一部の態様では、NKp30リガンドは、BAG6、B7−H6、またはGal−3である。任意選択で、配列番号7の残基I50、S82、またはL113、またはその任意の組合せのアラニンへの突然変異は、ヒトNKp30への結合の喪失を結果としてもたらす。エピトープは、任意選択で、非リニアエピトープである。
任意選択で、第2の抗原結合単位または構築物は、(a)それぞれ配列番号15、16、および42において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、ならびにそれぞれ配列番号19、20および43において示される軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、(b)それぞれ配列番号69、70および71において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、ならびにそれぞれ配列番号19、20および43において示される軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、ならびに(c)それぞれ配列番号75、76、および77において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、ならびに配列番号80の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列からなる群から選択される重鎖および軽鎖CDRを有する抗体またはその抗原結合性部分と、ヒトNKp30上のエピトープへの結合について競合する。任意選択で、第2の抗原結合単位または構築物は、配列番号14、配列番号25、もしくは配列番号72の重鎖可変領域アミノ酸配列、および配列番号18の軽鎖可変領域アミノ酸配列、または配列番号78の重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号80の軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する抗体またはその抗原結合性部分と、ヒトNKp30上のエピトープへの結合について競合する。任意選択で、第2の抗原結合単位または構築物は、(i)配列番号14、配列番号25、もしくは配列番号72のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号18のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、または(ii)配列番号78のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号80のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体またはその抗原結合性部分と、ヒトNKp30上のエピトープへの結合について競合する。
本明細書に記載の任意の構築物の一部の実施形態では、第2の抗原結合単位はヒトNKp30のエピトープに結合し、エピトープは配列番号7のアミノ酸50〜113内にありまたはそれとオーバーラップし、I50、S82、およびL113における置換の1つまたは複数は抗体または抗原結合性部分のヒトNKp30への結合を妨害する。任意選択で、エピトープはコンホメーショナルエピトープである。任意選択で、エピトープはリニアエピトープである。
配列番号38(YTFX1X2X3YX4Hであり、X1はTまたはSであり、X2はNまたはSであり、X3はYまたはHであり、X4はMまたはVである)のCDRH1、配列番号39(GX5IDPSX6GX7TX8YAであり、X5はVまたはIであり、X6はGまたはDであり、X7はG、YまたはSであり、X8はNまたはSである)のCDRH2、および配列番号40(ARGRYDYX9DYLGWFDX10であり、X9はGまたはSであり、X10はPまたはGである)のCDRH3を含む重鎖可変領域を含む、ヒトBCMAに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が本明細書において提供される。単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、任意選択で、それぞれ配列番号11、配列番号12、および配列番号41、それぞれ配列番号44、配列番号45、および配列番号46、それぞれ配列番号47、配列番号48、および配列番号46、それぞれ配列番号11、配列番号45、および配列番号49、それぞれ配列番号11、配列番号50、および配列番号41、それぞれ配列番号44、配列番号50、および配列番号41のいずれかにおいて示されるようなCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含む。任意選択で、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号19のCDRL1、配列番号20のCDRL2、および配列番号43のCDRL3をさらに含む。例として、記載されるような抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号10、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、または配列番号57のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一の重鎖可変配列を含むことができる。さらなる例として、抗体またはその抗原結合性断片は、任意選択で、配列番号18のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一の軽鎖可変配列を含む。そのため、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号10、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、および配列番号57のいずれか1つから選択される重鎖可変配列、ならびに配列番号18の軽鎖可変配列を含むことができる。
ヒトBCMAに結合した場合、配列番号10、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、および配列番号57のいずれか1つの重鎖可変領域配列、ならびに配列番号18の軽鎖可変配列を含む抗ヒトBCMA抗体により結合されるアミノ酸残基の少なくとも1つに結合する、ヒトBCMAに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片が本明細書において提供される。
(a)配列番号15のCDRH1、配列番号16のCDRH2、および配列番号42のCDRH3、(b)配列番号69のCDRH1、配列番号70のCDRH2、および配列番号71のCDRH3、または(c)配列番号75のCDRH1、配列番号76のCDRH2、および配列番号77のCDRH3を含む重鎖可変領域を含む、ヒトNKp30に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片もまた提供される。任意選択で、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号19のCDRL1、配列番号20のCDRL2、および配列番号43のCDRL3を含む軽鎖可変領域を含む。任意選択で、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号14、配列番号25、または配列番号72のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一の重鎖可変配列を含む。任意選択で、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号18のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一の軽鎖可変配列を含む。任意選択で、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号78のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一の重鎖可変配列を含む。任意選択で、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号80のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一の軽鎖可変配列を含む。そのため、(i)配列番号14、配列番号25、もしくは配列番号72の重鎖可変領域配列、および配列番号18の軽鎖可変領域配列、または(ii)配列番号78の重鎖可変領域配列および配列番号80の軽鎖可変領域配列を含む抗体またはその抗原結合性断片が本明細書において提供される。
ヒトNKp30に結合した場合、(i)配列番号14、配列番号25、もしくは配列番号72の重鎖可変領域配列、および配列番号18の軽鎖可変領域配列、または(ii)配列番号78の重鎖可変領域配列および配列番号80の軽鎖可変領域配列を含む抗ヒトNKp30抗体の結合を交差遮断する、ヒトNKp30に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片がさらに提供される。
本明細書に記載のこれらの態様および全てのそのような態様の一部の実施形態では、第1および/または第2の腫瘍抗原は、癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫、またはその組合せと関連付けられる。任意選択で、一部の実施形態では、第1および/または第2の腫瘍抗原は、上皮がん抗原、前立腺特異的がん抗原(PSA)もしくは前立腺特異的膜抗原(PSMA)、膀胱がん抗原、肺がん(例えば、小細胞肺)抗原、結腸がん抗原、卵巣がん抗原、脳がん抗原、胃がん抗原、腎細胞癌抗原、膵臓がん抗原、肝臓がん抗原、食道がん抗原、頭頸部がん抗原、結腸直腸がん抗原、リンパ腫(例えば、非ホジキンリンパ腫もしくはホジキンリンパ腫)抗原、B細胞リンパ腫がん抗原、白血病抗原、骨髄腫(例えば、多発性骨髄腫もしくは形質細胞骨髄腫)抗原、急性リンパ芽球性白血病抗原、慢性骨髄性白血病抗原、または急性骨髄性白血病抗原である。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原はBCMAである。
ある特定の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物の第1の抗原結合単位は、自己反応性B細胞または形質細胞などのB細胞により発現される第1の抗原に結合する。任意選択で、第1の抗原は、B細胞特異的、B細胞拘束、またはB細胞濃縮抗原である。任意選択で、第1の抗原は、CD19、CD20およびBCMAからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物の第3の抗原結合単位は、B細胞により発現される第2の抗原に結合する。任意選択で、第3の抗原結合単位はNK受容体(例えば、NKp30、NKG2D、NKp46、またはNKp44)に結合する。任意選択で、構築物は、B系列細胞により発現される第1の標的抗原に結合する2つの抗原結合単位を含む。任意選択で、B細胞により発現される第1の標的抗原およびB細胞により発現される第2の標的抗原は同じ抗原である。
少なくとも3つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、第1の抗原結合単位が、B系列細胞により発現される第1の標的抗原に特異的に結合し、第2の抗原結合単位がNKp30抗原に特異的に結合し、第3の抗原結合単位が、第2のB系列細胞抗原により発現される抗原またはNK受容体に結合する、多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。任意選択で、B系列細胞により発現される第1の標的抗原はB細胞成熟抗原(BCMA)である。任意選択で、B系列細胞により発現される第2の標的抗原は、BCMA、CD1c、CD5、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD27、CD34、CD38、CD40、CD72、CD78、CD79a、CD79b、CD80、CD84、CD86、CD126、CD138、CD319、TAC、GPRC5D(Gタンパク質共役型受容体クラスCグループ5メンバーD)、SLAMF7(CS1)、およびIL7/3Rからなる群から選択される。B系列細胞は、プロB細胞、プレB細胞、移行期B細胞、濾胞性B細胞、辺縁帯B細胞、胚中心B細胞、形質細胞、およびメモリーB細胞からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、第1の抗原結合単位は、B系列細胞により発現される第1の標的抗原の機能を阻害する。
一部の実施形態では、第1の抗原結合単位は非抗体スキャフォールドタンパク質である。ある特定の実施形態では、非抗体スキャフォールドタンパク質はアンチカリンである。他の実施形態では、第1の抗原結合単位は、ポリペプチド、小分子、またはアプタマーである。任意選択で、第1の抗原結合単位は抗体またはその抗原結合性断片である。第1の抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性部分は、任意選択で、モノクローナル抗体またはその抗原結合性部分である。第1の抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性部分は、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、またはいずれかの抗原結合性部分であることができる。第1の抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性部分は、任意選択で、scFvまたはFab抗体断片である。
一部の実施形態では、第2の抗原結合単位は非抗体スキャフォールドタンパク質である。ある特定の実施形態では、非抗体スキャフォールドタンパク質はアンチカリンである。他の実施形態では、第2の抗原結合単位は、ポリペプチド、小分子、またはアプタマーである。任意選択で、第2の抗原結合単位は抗体またはその抗原結合性断片である。第2の抗原結合単位は、任意選択で、モノクローナル抗体またはその抗原結合性部分である。第2の抗原結合単位は、ヒト化抗体または完全ヒト抗体、またはいずれかの抗原結合性部分であることができる。第2の抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性部分は、任意選択で、scFvまたはFab抗体断片である。
一部の実施形態では、第3の抗原結合単位は非抗体スキャフォールドタンパク質である。ある特定の実施形態では、非抗体スキャフォールドタンパク質はアンチカリンである。他の実施形態では、第3の抗原結合単位は、ポリペプチド、小分子、またはアプタマーである。任意選択で、第3の抗原結合単位は抗体またはその抗原結合性断片である。第3の抗原結合単位は、任意選択で、モノクローナル抗体またはその抗原結合性部分である。第3の抗原結合単位は、ヒト化抗体または完全ヒト抗体、またはいずれかの抗原結合性部分であることができる。第3の抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性部分は、任意選択で、scFvまたはFab抗体断片である。
一部の実施形態では、第4の抗原結合単位は非抗体スキャフォールドタンパク質である。ある特定の実施形態では、非抗体スキャフォールドタンパク質はアンチカリンである。他の実施形態では、第4の抗原結合単位は、ポリペプチド、小分子、またはアプタマーである。任意選択で、第4の抗原結合単位は抗体またはその抗原結合性断片である。第4の抗原結合単位は、任意選択で、モノクローナル抗体またはその抗原結合性部分である。第4の抗原結合単位は、ヒト化抗体または完全ヒト抗体、またはいずれかの抗原結合性部分であることができる。第4の抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性部分は、任意選択で、scFvまたはFab抗体断片である。抗原結合性構築物は、任意選択で、エフェクター免疫細胞により発現される分子に特異的に結合する追加の抗原結合単位をさらに含む。ある特定の実施形態では、エフェクター免疫細胞により発現される分子は、CD16、CD16a、CD16b、CD32a、CD64、またはCD89である。
一部の実施形態では、抗原結合性構築物は、第2の腫瘍またはB系列細胞抗原に特異的に結合する第3の抗原結合単位をさらに含む。
抗原結合性構築物は、第3の抗原結合単位、一部の実施形態では、NKp30に加えて、すなわち、NKp30上に見出される抗原ではない、別の活性化NK細胞受容体に特異的に結合する第3の抗原結合単位をさらに含む。そのような活性化NK細胞受容体の非限定的な例としては、NKp46、NKp44、2B4、CD226、NKG2D、CD137、CD16a、およびCD2が挙げられる。抗原結合性構築物は、一部の実施形態では、第2の腫瘍またはB系列細胞抗原に結合する第3の抗原結合単位、および、NKp30に加えて、すなわち、NKp30上に見出される抗原ではない、別の活性化NK細胞受容体に特異的に結合する第4の抗原結合単位をさらに含む。そのような活性化NK細胞受容体の非限定的な例としては、NKp46、NKp44、2B4、CD226、NKG2D、CD137、CD16a、およびCD2が挙げられる。
抗原結合性構築物は、第3の抗原結合単位、一部の実施形態では、NKp30に加えて、すなわち、NKp30上に見出される抗原ではない、別の活性化NK細胞受容体に特異的に結合する第3の抗原結合単位をさらに含む。そのような活性化NK細胞受容体の非限定的な例としては、NKp46、NKp44、2B4、CD226、NKG2D、CD137、CD16a、およびCD2が挙げられる。抗原結合性構築物は、一部の実施形態では、第2の腫瘍またはB系列細胞抗原に結合する第3の抗原結合単位、および、NKp30に加えて、すなわち、NKp30上に見出される抗原ではない、別の活性化NK細胞受容体に特異的に結合する第4の抗原結合単位をさらに含む。そのような活性化NK細胞受容体の非限定的な例としては、NKp46、NKp44、2B4、CD226、NKG2D、CD137、CD16a、およびCD2が挙げられる。
本明細書に開示される2つ以上の抗原結合単位は、同じ抗原結合性構築物内の同じまたは異なる構造であることができる。例えば、全ての抗原結合単位は抗体もしくはその抗原結合性部分であることができ、またはサブセットは抗体もしくはその抗原結合性部分であることができる。
一部の実施形態では、1つの抗原結合単位のその標的への結合は、他の抗原結合単位のその標的への結合を遮断しない。任意選択で、2つ以上の抗原結合単位はそれらの各々の標的に結合し、全ての抗原結合単位は同時に結合したままとなる。一部の実施形態では、それらの各々の標的への1つの抗原結合単位の結合および別の抗原結合単位の結合は、免疫細胞などの第1の細胞、および腫瘍細胞を一緒になるようにブリッジ形成させることができる。任意選択で、第1の細胞および腫瘍細胞のブリッジ形成は、フローサイトメトリーおよび/または蛍光プレートリーダーにより決定される。ある特定の実施形態では、第1の抗原結合単位は腫瘍抗原機能を阻害する。
本開示は、一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物が、二重特異性抗体、三重特異性抗体、または四重特異性抗体であることを提供する。任意選択で、構築物は共通の軽鎖を含む。ある特定の実施形態では、構築物は四価である。任意選択で、構築物は、腫瘍もしくはB系列細胞抗原について少なくとも二価であり、および/またはNKp30抗原について少なくとも二価である。一部の実施形態では、構築物はFcドメインを含まない。他の実施形態では、第1の抗原結合単位または第2の抗原結合単位、または両方は、1つまたは複数の免疫グロブリンFc改変を含む重鎖を含む。一部の実施形態では、重鎖の免疫グロブリンFcドメインは、第1および第2の抗原結合単位のヘテロ二量体化を促進する1つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。任意選択で、突然変異は重鎖のCH3ドメイン中に存在する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はクアドローマ細胞中で製造される。ある特定の実施形態では、構築物は1つまたは複数の免疫グロブリン定常領域改変を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、抗体のヘテロ二量体化を促進する1つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。任意選択で、1つまたは複数の突然変異は1つの抗原結合単位の軽鎖定常領域中に存在し、1つまたは複数の突然変異は別の抗原結合単位の重鎖定常領域中に存在する。一部の実施形態では、二重特異性抗体は、二重特異性IgG、二重特異性抗体断片、二重特異性融合タンパク質、付加型IgG(appended IgG)、および二重特異性抗体コンジュゲートからなる群から選択される。一部の実施形態では、Fc領域は、低減されたエフェクター機能を有し、または構築物の半減期を増進する。ある特定の実施形態では、第1の抗原結合単位および第2の抗原結合単位は少なくとも1つのアミノリンカーアミノ酸配列により連結されている。任意選択で、リンカーアミノ酸配列はGGGGSx(配列番号22)(xは、1および6を含む1〜6の整数である)を含む。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、それぞれ配列番号11、12、および13において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む。任意選択で、構築物は、配列番号10において示される重鎖可変領域配列を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、それぞれ配列番号15、16、および17において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む。任意選択で、構築物は、配列番号14または25において示される重鎖可変領域配列を含む。一部の実施形態では、構築物は、それぞれ配列番号19、20、および21において示される軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む。任意選択で、構築物は、配列番号18において示される軽鎖可変領域配列を含む。一部の実施形態では、構築物は、任意選択で、配列番号9または24において示される重鎖配列および配列番号8において示される軽鎖配列を含む。
本明細書に記載の任意の構築物の実施形態では、第2の抗原結合単位は、任意選択で、NKp30をアゴナイズすることができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、構築物が標的抗原を発現する細胞(例えば、がん細胞またはB系列細胞)に結合した場合に免疫エフェクター細胞により発現されるNKp30をアゴナイズすることができる。
本開示は、一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は多重特異性抗体であることを提供する。任意選択で、構築物は共通の軽鎖を含む。ある特定の実施形態では、構築物は四価である。一部の実施形態では、構築物は、NKp30抗原について二価であり、第1の腫瘍またはB系列細胞抗原について一価であり、第2の腫瘍またはB系列細胞抗原について一価である。一部の実施形態では、構築物は、NKp30抗原について二価であり、第2の活性化NK受容体について一価であり、腫瘍またはB系列細胞抗原について一価である。一部の実施形態では、構築物は、NKp30抗原について一価であり、第2の活性化NK受容体について一価であり、第1の腫瘍またはB系列細胞抗原について一価であり、第2の腫瘍またはB系列細胞抗原について一価である。一部の実施形態では、構築物はFcドメインを含まない。他の実施形態では、少なくとも1つの抗原結合単位は、1つまたは複数の免疫グロブリンFc改変を含む重鎖を含む。一部の実施形態では、重鎖の免疫グロブリンFcドメインは、抗原結合単位のヘテロ二量体化を促進する1つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。任意選択で、突然変異は重鎖のCH3ドメイン中に存在する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はクアドローマ細胞中で製造される。ある特定の実施形態では、構築物は1つまたは複数の免疫グロブリン定常領域改変を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、抗体のヘテロ二量体化を促進する1つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。任意選択で、1つまたは複数の突然変異は1つの抗原結合単位の軽鎖定常領域中に存在し、1つまたは複数の突然変異は別の抗原結合単位の重鎖定常領域中に存在する。一部の実施形態では、多重特異性抗体は、多重特異性IgG、多重特異性抗体断片、多重特異性融合タンパク質、付加型IgG、および多重特異性抗体コンジュゲートからなる群から選択される。一部の実施形態では、Fc領域は、低減されたエフェクター機能を有し、または構築物の半減期を増進する。ある特定の実施形態では、1つまたは複数の抗原結合単位は少なくとも1つのアミノリンカーアミノ酸配列により連結されている。任意選択で、リンカーアミノ酸配列はGGGGSx(配列番号22)(xは、1および6を含む1〜6の整数である)を含む。
本開示はまた、ヒトBCMAに結合した場合、配列番号10において表される重鎖可変領域配列および配列番号18において表される軽鎖可変領域配列を含む抗ヒトBCMA抗体により結合されるアミノ酸残基の少なくとも1つに結合する、ヒトBCMAに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片を提供する。別の態様では、本開示は、ヒトBCMAに結合した場合、配列番号10において表される重鎖可変領域配列および配列番号18において表される軽鎖可変領域配列を含む抗ヒトBCMA抗体の結合を交差遮断する、ヒトBCMAに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片を特徴とする。一部の実施形態では、それぞれ配列番号11、12、および13において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む、ヒトBCMAに特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合性断片が提供される。任意選択で、抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ配列番号19、20、および21において示される軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号10において示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号18において示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む。任意選択で、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号10において示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号18において示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
ヒトNKp30に結合した場合、配列番号14または25において示される重鎖可変領域配列および配列番号18において示される軽鎖可変領域配列を含む抗ヒトNKp30抗体により結合されるアミノ酸残基の少なくとも1つに結合する、ヒトNKp30に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片もまた提供される。本開示はまた、ヒトNKp30に結合した場合、配列番号14または25において示される重鎖可変領域配列および配列番号18において示される軽鎖可変領域配列を含む抗ヒトNKp30抗体の結合を交差遮断する、ヒトNKp30に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片を提供する。一部の実施形態では、それぞれ配列番号15、16、および17において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む単離された抗体、またはその抗原結合性断片が提供される。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、それぞれ配列番号19、20、および21において示される軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号14または25において示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号18において示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む。任意選択で、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号14または25において示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号18において示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
エピトープが配列番号7のアミノ酸50〜113内にありまたはそれとオーバーラップし、I50、S82、およびL113における置換の1つまたは複数が抗体または抗原結合性部分のヒトNKp30への結合を妨害する、ヒトNKp30のエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合性部分もまた本明細書において提供される。任意選択で、エピトープはコンホメーショナルエピトープである。任意選択で、エピトープはリニアエピトープである。
配列番号7の残基I50、S82、またはL113の少なくとも1つを含むヒトNKp30上のエピトープに結合する、ヒトNKp30に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分もまた本明細書において提供される。任意選択で、エピトープは配列番号7の残基I50を含む。任意選択で、エピトープは配列番号7の残基S82を含む。任意選択で、エピトープは配列番号7の残基L113を含む。さらなる例として、エピトープは、任意選択で、残基(i)配列番号7のI50およびS82、(ii)配列番号7のI50およびSL113、(iii)配列番号7のS82およびL113または(iv)配列番号7のI50、S82、およびL113を含む。任意選択で、抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号7のアミノ酸位置50〜113に対応する1つまたは複数のアミノ酸残基の配列を含むエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号7のアミノ酸位置50〜113に対応する3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のアミノ酸残基を含むエピトープに結合する。単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分は、任意選択で、約1×10−6またはそれ未満の親和性(KD)でNKp30に結合する。
抗体またはその抗原結合性部分は、任意選択で、ヒトNKp30のリガンド結合領域に結合する。一部の態様では、NKp30リガンドは、BAG6、B7−H6、またはGal−3である。任意選択で、配列番号7の残基I50、S82、またはL113、またはその任意の組合せのアラニンへの突然変異は、突然変異の非存在下での結合と比較して、ヒトNKp30への低減された結合を結果としてもたらす。そのような低減された結合は、検出可能な結合の完全な喪失であることができる。抗体またはその抗原結合性部分は、任意選択で、配列番号7のアミノ酸残基50〜113内に位置するエピトープに結合する。エピトープは、任意選択で、非リニアエピトープである。任意選択で、抗体またはその抗原結合性部分は、(a)それぞれ配列番号15、16、および42において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、ならびにそれぞれ配列番号19、20および43において示される軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、(b)それぞれ配列番号69、70および71において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、ならびにそれぞれ配列番号19、20および43において示される軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、ならびに(c)それぞれ配列番号75、76、および77において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、ならびに配列番号80の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列からなる群から選択される重鎖および軽鎖CDRを有する抗体またはその抗原結合性部分と、ヒトNKp30上のエピトープへの結合について競合する。任意選択で、抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号14、配列番号25、もしくは配列番号72の重鎖可変領域アミノ酸配列、および配列番号18の軽鎖可変領域アミノ酸配列、または配列番号78の重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号80の軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する抗体またはその抗原結合性部分と、ヒトNKp30上のエピトープへの結合について競合する。任意選択で、抗体またはその抗原結合性部分は、(i)配列番号14、配列番号25、もしくは配列番号72のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号18のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、または(ii)配列番号78のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号80のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合性部分と、ヒトNKp30上のエピトープへの結合について競合する。
本開示は、本明細書に開示される多重特異性抗原結合性構築物(例えば、二重特異性抗原結合性構築物、三重特異性抗原結合性構築物、もしくは四重特異性抗原結合性構築物)または単離された抗体もしくはその抗原結合性断片および薬学的に許容される担体を含む組成物をさらに提供する。抗原結合性構築物は、任意選択で、エフェクター免疫細胞により発現される分子に特異的に結合する第3の抗原結合単位をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に開示される1つより多くの多重特異性抗原結合性構築物を含むことができる。
本開示はまた、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物または単離された抗体もしくはその抗原結合性部分をコードする核酸を提供する。核酸を含むベクター(任意選択で発現制御配列を有する)およびベクターまたは核酸を含む細胞もまた提供される。そのような細胞を細胞によるベクターからの1つまたは複数のポリペプチドの発現のための条件下で培養することを含む、ポリペプチドを製造する方法が提供される。方法は、任意選択で、細胞または細胞が培養された培地から1つまたは複数のポリペプチドを単離することを含む。本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物または単離された抗体、もしくはその抗原結合性断片にコンジュゲート化した異種部分を含むタンパク質コンジュゲート分子もまた提供される。任意選択で、異種部分は、治療剤、毒素、薬物、または放射性部分である。本開示はまた、がんを有する対象に有効量の本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離された抗体、もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲート分子を投与することを含む、対象においてがんを治療する方法を提供する。
本開示はまた、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物はCD16エンゲージメント非依存的な方式でがんまたは腫瘍に対する免疫応答を増進することができるという発見に部分的に基づく。CD16(FCγRIII)は、IgG1アイソタイプ抗体のFc部分などのIgG抗体のFc部分に結合する。CD16Aは、NK細胞上のCD3ζおよびFc−εRI−γと共局在する膜貫通タンパク質である。そのようなFc領域のCD16Aへの結合は、NK細胞によるサイトカイン産生、およびがん細胞などの標的細胞に対するこれらの細胞の増加した細胞傷害性エフェクター活性(ADCC)を結果としてもたらす。多くの腫瘍指向性モノクローナル抗体療法は、その活性についてCD16Aエンゲージメントに依拠し、それががん患者におけるその使用にとって課題を提示し得る。例えば、ヒトにおいて、NK細胞は2つの別個の集団:CD56dim/CD16posおよびCD56bright/CD16negから構成される。健常個体において、CD16neg集団は総NK細胞集団の5〜15%を表す。しかしながら、一部のがん患者においてCD16neg NK細胞の割合は大きく増加している(例えば、最大50%)。
追加的に、腫瘍微環境は、細胞の表面からのCD16Aのシェディングを誘導すること(ADAM17酵素により媒介される活性)によりCD56dim/CD16pos NK細胞の表現型に影響することが示されており、またはTGFβはCD16AposからCD16neg NK細胞への変換を促進することができる。追加的に、CD16Aの多型に起因して、一部の個体は、モノクローナル抗体療法により媒介されるADCCを劇的に損なうCD16Aにおける突然変異を有する。そのため、CD16Aエンゲージメントの非存在下であっても抗腫瘍活性を維持することができる腫瘍指向性療法が強く所望され、必要とされている。CD16A欠損を克服することができる本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物は、その必要性を満たす。
本開示はまた、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物は、低いレベルの標的抗原(すなわち、多重特異性構築物が結合する腫瘍抗原)を発現する標的細胞に対する免疫応答(例えば、NK細胞媒介性応答)を増進することができるという発見に部分的に基づく。ハーセプチン(HERCEPTIN)(登録商標)(ジェネンテック(Genentech)[米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ(South San Francisco)所在])およびリツキサン(RITUXAN)(登録商標)(バイオジェン(Biogen)[米国マサチューセッツ州ケンブリッジ(Cambridge)所在])などの腫瘍抗原指向性モノクローナル抗体療法は、低いレベルの腫瘍抗原を発現する腫瘍に対して低減された有効性を呈している。実際、腫瘍抗原の低いレベルの発現を有する腫瘍を持つ患者は、抗原を標的化する抗体療法を用いる治療のために不適格なことがある。腫瘍は、とりわけ、抗体療法が結合する腫瘍抗原の発現を下方調節することによりそのような抗体療法を免れることができることも確立されている(例えば、スギモトら(Sugimoto et al.)(2009) Biochem. Biophys. Res. Commun. 390(1):48−53;ボドガイら(Bodogai et al.)(2013) Cancer Res. 73(7):1−12を参照)。本開示はいかなる具体的な理論または作用機序によっても縛られないが、本明細書に記載の多重特異性構築物は、NK細胞活性化の閾値を低下させ、高い、中間の、および低いレベルの腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞のNK細胞殺傷を強力に再方向付けすることにより抗体療法のこれらの制限を克服する。
そのため、本開示は、がんを有する対象に有効量の本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物もしくは抗体もしくはその抗原結合性部分、または本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物もしくは抗体もしくはその抗原結合性部分を含むタンパク質コンジュゲートもしくは組成物を投与する工程を含む、対象においてがんを治療する方法をさらに提供する。任意選択で、がんを治療する方法は、がんを有する対象に有効量の多重特異性抗原結合性構築物もしくは抗体もしくはその抗原結合性部分または多重特異性抗原結合性構築物もしくは抗体もしくは抗原結合性部分を含むタンパク質コンジュゲートもしくは組成物を投与することを含み、対象は、CD16欠損性(CD16 lowを含む)微環境を含むがん(例えば、対照NK細胞と比較して50%未満のCD16の発現を有する浸潤性NK細胞の集団を有するがんまたは浸潤性NK細胞の少なくとも10%が対照NK細胞と比較して低減されたCD16の発現を有する浸潤性NK細胞の集団を有するがん)を有する。一部の実施形態では、CD16欠損性微環境は、対象に対する造血幹細胞移植と関連付けられる。対象はヒトまたは他の哺乳動物であることができる。多重特異性抗原結合性構築物または抗体もしくはその抗原結合性部分は、NKp30機能をアゴナイズすることにより対象の免疫応答を増進することができる。例えば、多重特異性抗原結合性構築物または抗体もしくはその抗原結合性部分はNK細胞媒介性がん細胞溶解を増進することができる。方法は、微環境中のCD16を検出することを含むことができる。任意選択で、CD16欠損性微環境は、(例えば、組織の生検または試料中の)CD16aまたはCD16bのレベルを検出することにより検出される。本明細書に記載の任意の方法の一部の実施形態では、対象(例えば、ヒトがん患者)のCD16A遺伝子型は、多重特異性抗体を投与する前に決定することができる。例えば、CD16A 158多型に関して対象の遺伝子型を決定するための試験を実行することができる。例えば、シューら(Xu et al.)(2016) Med. Sci. Monitor. 22:2086−2096を参照。
任意選択で、がんを治療する方法は、がんを有する対象に有効量の多重特異性抗原結合性構築物または有効量の抗体もしくはその抗原結合性部分を投与することを含み、対象は、低いレベルの腫瘍抗原(例えば、がん細胞当たり約100,000コピー未満)を含むがんを有する。対象はヒトまたは他の哺乳動物であることができる。多重特異性抗原結合性構築物または抗体もしくはその抗原結合性部分は、NKp30機能をアゴナイズすることにより対象の免疫応答を増進することができる。多重特異性抗原結合性構築物または抗体もしくはその抗原結合性部分は、ナチュラルキラー(NK)細胞活性化の閾値を効果的に低下させ、いっそう低いレベルの腫瘍抗原を発現する標的細胞(例えば、腫瘍細胞)のNK細胞殺傷を再方向付けする。多重特異性抗原結合性構築物または抗体もしくはその抗原結合性部分は、低腫瘍抗原発現細胞であってもIFNγ産生およびADCC機能を保持する。
がんは、任意選択で、血液がん、神経学的がん(neurological cancer)、乳がん、前立腺がん、皮膚がん、肺がん、膀胱がん、腎臓がん、脳がん、頭頸部がん、胃腸がん、肝臓がん、膵臓がん、泌尿生殖器がん、骨がん、および血管がんからなる群から選択される。がんを治療する方法は、第2の抗がん療法を対象に投与する工程をさらに含むことができる。ある特定の実施形態では、抗がん療法は、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、サイトカイン療法、放射線療法、寒冷療法、または外科療法である。多重特異性抗原結合性構築物または組成物は、例えば、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口的、筋肉内、または頭蓋内に投与される。
本開示はまた、対象(例えば、ヒトまたは他の哺乳動物)に治療有効量の多重特異性抗原結合性構築物、有効量のもしくは本明細書に記載の抗体もしくはその抗原結合性部分、または開示される多重特異性抗原結合性構築物もしくは抗体もしくはその抗原結合性部分を含む有効量の組成物を投与することを含む、それを必要とする対象において免疫応答を増進する方法を提供する。増進した免疫応答は、増進したT細胞機能、増進したNK細胞機能、増進したマクロファージ機能、サイトカイン産生、および/またはADCC機能の1つまたは複数を含む。多重特異性抗原結合性構築物、抗体もしくは断片、または組成物は、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口的、筋肉内、または頭蓋内に投与される。
対照NK細胞によるCD16の発現と比較して低減されたCD16の発現を有するNK細胞を活性化させまたはその活性化を持続化させる方法もまた本明細書において提供される。方法は、NK細胞を有効量の本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物、抗体もしくはその抗原結合性部分、またはいずれかを含む組成物と接触させることを含む。NK細胞を多重特異性抗原結合性構築物または抗体もしくはその抗原結合性部分と接触させることはin vitroまたはin vivoで行うことができる。一部の実施形態では、方法は、がんを有する対象においてNK細胞を活性化させまたはその活性化を持続化させるために使用される。NK細胞の活性化または持続的な活性化はCD16欠損性微環境中で起こることができる。任意選択で、多重特異性抗原結合性構築物が特異的に結合する腫瘍抗原はBCMAまたはHER2である。接触させるNK細胞は腫瘍浸潤性NK細胞であることができる。任意選択で、NK細胞のCD16発現は対照NK細胞のCD16発現より低い(例えば、対照NK細胞と比較して50%未満のCD16の発現)。任意選択で、CD16欠損性微環境は、浸潤性NK細胞の少なくとも10%が対照NK細胞と比較して低減されたCD16の発現を有する腫瘍浸潤性NK細胞の集団を含む。NK細胞は150,000未満のCD16コピー数を有することができる。一部の実施形態では、NK細胞はCD16を発現しない。
NK細胞による標的細胞の殺傷を増進する方法もまた本明細書において提供される。方法は、NK細胞の存在下で標的細胞を有効量の本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物、抗体もしくはその抗原結合性部分、または組成物と接触させることを含む。任意選択で、標的細胞は低いレベルの腫瘍抗原を発現する(例えば、約100,000未満のコピー数)。より特には、標的細胞はがん細胞であることができ、抗原は腫瘍抗原である。任意選択で、がん細胞は対象中にあり、方法は、対象に有効量の多重特異性抗原結合性構築物、抗体もしくは断片、または組成物を投与してNK細胞によるがん細胞の殺傷を増進することを含む。
さらに別の態様では、本開示は、対象から標的細胞を枯渇させる方法であって、それを必要とする対象に標的抗原を発現する1つまたは複数の標的細胞を枯渇させるために十分な量の本明細書に記載されるような多重特異性抗原結合性構築物を投与することを含み、多重特異性結合性構築物が少なくとも2つの連結した抗原結合単位を含み、第1の抗原結合単位が、標的抗原に特異的に結合し、第2の抗原結合単位が、NKp30抗原に特異的に結合する、方法を特徴とする。一部の実施形態では、多重特異性結合性構築物は第3の抗原結合単位を含む。一部の実施形態では、多重特異性結合性構築物は第3の抗原結合単位および第4の抗原結合単位を含む。一部の実施形態では、標的抗原は、本明細書に記載のまたは当該技術分野において公知の任意の腫瘍抗原などの腫瘍抗原である。一部の実施形態では、標的細胞はB細胞、例えば、自己反応性B細胞である(そのような場合、標的抗原は、B細胞特異的、B細胞拘束、またはB細胞濃縮抗原、例えば、CD20またはBCMAである)。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象は自己免疫状態に罹患している。一部の実施形態では、自己免疫状態は、全体的または部分的に自己反応性B細胞により媒介される。一部の実施形態では、標的細胞を枯渇されている対象は赤芽球癆を有するまたはそのリスクがある。赤芽球癆は、例えば、同種幹細胞移植後のABO血液群不適合に起因することができる。一部のそのような実施形態では、対象は血液群Oを有し、同種幹細胞移植は血液群Aのドナーからのものであった。標的細胞を枯渇されている対象が赤芽球癆を有するまたはそのリスクがあるそれらの実施形態では、標的細胞は、例えば、標的血漿B細胞である。よって、一部の実施形態では、標的抗原は、例えば、血漿B細胞上に見出されるが他のB細胞上には見出されない抗原である。
別の態様では、本開示は、自己反応性B細胞性炎症状態を有する対象を治療する方法であって、対象に有効量の本明細書に開示される多重特異性抗原結合性構築物もしくは抗体もしくはその抗原結合性部分またはその医薬組成物を投与することを含む、方法を特徴とする。有効量の多重特異性抗原結合性構築物、抗体もしくはその断片、またはその医薬組成物は、任意選択で、IgG、IgM、またはIgAを発現する形質細胞の骨髄レベルを低減する。自己反応性B細胞性炎症状態としては、自己反応性B細胞により媒介される自己免疫疾患が挙げられる。自己反応性B細胞性炎症状態の例としては、重症筋無力症、軽鎖アミロイドーシス、尋常性天疱瘡、および免疫性血小板減少症が挙げられるがそれに限定されない。
全体的または部分的に自己反応性B細胞により媒介される炎症状態(例えば、自己免疫状態)を有する対象を治療する方法であって、対象に標的抗原を発現する1つまたは複数の自己反応性B細胞を枯渇させるために十分な量の本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物を投与することを含み、多重特異性結合性構築物が、標的抗原に特異的に結合する第1の抗原結合単位、NKp30抗原に特異的に結合する第2の抗原結合単位、および第3の抗原結合単位を含む、方法もまた本明細書において提供される。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は第4の抗原結合単位を含む。一部の実施形態では、標的抗原は、B細胞特異的、B細胞拘束、またはB細胞濃縮抗原、例えば、CD20、CD19、またはBCMAである。一部の実施形態では、全体的または部分的に自己反応性B細胞により媒介される自己免疫疾患は、全身性ループスエリテマトーデス(SLE)、シェーグレン症候群、1型糖尿病、アジソン病、悪性貧血、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、関節リウマチ、重症筋無力症、原発性胆汁胆管炎、グッドパスチャー病、原発性膜性腎症、卵巣不全、および自己免疫性睾丸炎からなる群から選択されるものであることができる。他のそのような自己免疫疾患は当該技術分野において公知であり、例えば、ルートヴィヒら(Ludwig et al.)(2017) Frontiers in Immunol 8:Article 603およびホフマンら(Hofmann et al.)(2018)Frontiers in Immunol 9:Article 835に記載されている。一部の実施形態では、そのような多重特異性構築物は、炎症性障害(例えば、自己免疫疾患)に対する他の療法、例えば、コルチコステロイド、DMARDs、または抗サイトカイン療法(例えば、抗TNFα抗体、TNFα受容体トラップ、抗IL17抗体、もしくは抗IL23抗体)と組み合わせることができる。
対象におけるがん細胞に対する免疫応答の増進において使用するための、本明細書に記載されるような多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートもまた本明細書において提供される。免疫応答は、任意選択で、NK細胞媒介性免疫応答である。がん細胞は、任意選択で、血液がん細胞、リンパ腫細胞、骨髄腫細胞、白血病細胞、神経学的がん細胞、乳がん細胞、前立腺がん細胞、皮膚がん細胞、肺がん細胞、膀胱がん細胞、腎臓がん細胞、頭頸部がん細胞、胃腸がん細胞、結腸直腸がん細胞、肝臓がん細胞、膵臓がん細胞、泌尿生殖器がん細胞、骨がん細胞、および血管がん細胞である。一部の態様では、がん細胞は第1の腫瘍抗原を発現する。一部の態様では、がん細胞は第1の腫瘍抗原および第2の腫瘍抗原を発現する。
本開示はまた、対象におけるB細胞に対する免疫応答の増進において使用するための、本明細書に記載されるような多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートを提供する。免疫応答は、任意選択で、NK細胞媒介性免疫応答である。B細胞は、任意選択で、自己反応性B細胞または形質細胞である。一部の態様では、B細胞は第1のB細胞抗原を発現する。一部の態様では、B細胞は第1のB細胞抗原および第2のB細胞抗原を発現する。
本開示は、対象におけるがんの治療において使用するための、本明細書に記載されるような多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートをさらに提供する。
本開示はまた、それを必要とする対象におけるがんの治療もしくはその進行の遅延または腫瘍成長の低減もしくは阻害において使用するための、本明細書に記載されるような多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートを提供する。
任意選択で、がんは、血液がん、リンパ腫、骨髄腫、白血病、神経学的がん、乳がん、前立腺がん、皮膚がん、肺がん、膀胱がん、腎臓がん、頭頸部がん、胃腸がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、泌尿生殖器がん、骨がん、または血管がんである。一部の態様では、がんは、第1の腫瘍抗原を発現するがん細胞を含む。一部の態様では、がんは、第1の腫瘍抗原および第2の腫瘍抗原を発現するがん細胞を含む。
本明細書に記載の任意の使用の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートは、NKp30機能をアゴナイズすることにより対象の免疫応答を増進する。
本明細書に記載の任意の使用の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートは、ナチュラルキラー(NK)細胞媒介性がん細胞溶解および/またはγδ T細胞機能を増進する。
本明細書に記載の任意の使用の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートは、γδ T細胞媒介性細胞傷害性またはサイトカイン産生を増進する。
本明細書に記載の任意の使用の実施形態では、使用は、抗がん療法を対象に投与することをさらに含む。任意選択で、抗がん療法は、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、細胞療法、サイトカイン療法、放射線療法、寒冷療法、または外科療法である。抗がん療法は、任意選択で、多重特異性抗原結合性構築物または単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片を用いる治療の前、同時、または後に投与される。抗がん療法は、任意選択で、免疫療法であり、対象におけるがんは、多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートを用いる治療の非存在下で免疫療法に対して難治性である。任意選択で、多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートは、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口的、筋肉内、または頭蓋内に投与される。
本明細書に記載の任意の使用の一部の実施形態では、がんはCD16欠損性腫瘍微環境を含み、または、がん細胞はCD16欠損性腫瘍微環境中に存在する。任意選択で、使用は、対象のがんにおけるCD16の発現レベルを検出することをさらに含む。CD16を検出することは、任意選択で、CD16aまたはCD16bのレベルを検出することを含む。一部の態様では、CD16欠損性微環境は、対象に対する造血幹細胞移植と関連付けられる。任意選択で、CD16欠損性微環境は浸潤性NK細胞の集団を含み、浸潤性NK細胞は対照NK細胞と比較して50%未満のCD16の発現を有する。一部の態様では、浸潤性NK細胞は、対照NK細胞と比較して30%未満、20%未満、または10%未満のCD16の発現を有する。任意選択で、CD16欠損性微環境は浸潤性NK細胞の集団を含み、浸潤性NK細胞の少なくとも10%は対照NK細胞と比較して低減されたCD16の発現を有する。一部の態様では、浸潤性NK細胞の少なくとも20%、少なくとも30%、または少なくとも40%は対照NK細胞と比較して低減されたCD16の発現を有する。
本明細書に記載の任意の使用の一部の実施形態では、がんは、低いレベルの腫瘍抗原を発現する細胞を含む。任意選択で、腫瘍抗原のレベルはがん細胞当たり100,000未満の腫瘍抗原コピーである。一部の態様では、腫瘍抗原のレベルは、がん細胞当たり90,000未満、75,000未満、50,000未満、または40,000未満の腫瘍抗原コピーである。使用は、任意選択で、対象の1つまたは複数のがん細胞の腫瘍抗原のレベルを検出することをさらに含む。
本開示は、自己免疫疾患を有する対象の治療において使用するための、本明細書に記載されるような多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートをさらに提供する。任意選択で、自己免疫疾患は、全体的または部分的に自己反応性B細胞により媒介される。対象は、任意選択で、標的細胞を枯渇されており、赤芽球癆を有するまたはそのリスクがある。一部の態様では、自己免疫疾患は、全身性ループスエリテマトーデス(SLE)、シェーグレン症候群、1型糖尿病、アジソン病、悪性貧血、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、関節リウマチ、重症筋無力症、原発性胆汁胆管炎、グッドパスチャー病、原発性膜性腎症、卵巣不全、および自己免疫性睾丸炎からなる群から選択される。
本明細書に記載の任意の使用の一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、NKp30機能をアゴナイズすることにより対象の免疫応答を増進する。
本明細書に記載の任意の使用の一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、B細胞のNK細胞媒介性溶解を増進する。
本明細書に記載の任意の使用の一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、B細胞のNK細胞媒介性溶解を増進する。
本明細書に記載の任意の使用の一部の実施形態では、使用は、剤を対象に投与することをさらに含み、剤は、コルチコステロイド、DMARD、および抗サイトカイン療法からなる群から選択される。任意選択で、抗サイトカイン療法は、抗TNFα抗体、TNFα受容体トラップ、抗IL17抗体、または抗IL23抗体である。
本明細書に記載の任意の使用の一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートは、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口的、筋肉内、または頭蓋内に投与される。
本開示は、対象におけるナチュラルキラー(NK)細胞の活性化またはその活性化の持続化において使用するための、本明細書に記載されるような多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートであって、NK細胞が対照NK細胞と比較して低減されたCD16の発現を有する、多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートをさらに提供する。任意選択で、対象はがんを有する。一部の態様では、がんは、構築物が特異的に結合する腫瘍抗原の一方または両方を発現する。接触させるNK細胞は、任意選択で、腫瘍浸潤性NK細胞である。任意選択で、NK細胞の活性化または持続的な活性化は腫瘍微環境中で起こる。NK細胞のCD16発現は、任意選択で、対照NK細胞のCD16発現の50%未満である。一部の態様では、NK細胞のCD16発現は、対照NK細胞のCD16発現の40%未満、30%未満、20%未満、10%未満、5%未満、または1%未満である。任意選択で、腫瘍微環境は浸潤性NK細胞の集団を含み、浸潤性NK細胞の少なくとも10%は対照NK細胞と比較して低減されたCD16の発現を有する。一部の態様では、浸潤性NK細胞の少なくとも20%、少なくとも30%、または少なくとも40%は対照NK細胞と比較して低減されたCD16の発現を有する。一部の態様では、NK細胞はCD16を発現しない。
本開示は、対象におけるNK細胞によるがん細胞の殺傷の増進において使用するための、本明細書に記載されるような多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートであって、がん細胞が、100,000未満の腫瘍抗原コピー数で、構築物または単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片が結合する腫瘍抗原を発現する、多重特異性抗原結合性構築物、抗体、もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートをさらに提供する。がん細胞は、任意選択で、がん細胞当たり90,000未満の腫瘍抗原コピーのコピー数で腫瘍抗原を発現する。一部の態様では、がん細胞は、がん細胞当たり75,000未満、50,000未満、または40,000未満の腫瘍抗原コピーのコピー数で腫瘍抗原を発現する。一部の態様では、使用は、対象の1つまたは複数のがん細胞による腫瘍抗原の発現を検出することをさらに含む。
本開示はまた、対象における自己反応性B細胞性炎症状態の治療において使用するための、本明細書に記載されるような多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートを提供する。任意選択で、有効量の多重特異性抗原結合性構築物または医薬組成物は、IgG、IgM、またはIgAを発現する形質細胞の骨髄レベルを低減する。自己反応性B細胞性炎症状態は、任意選択で、自己反応性B細胞により媒介される自己免疫疾患である。一部の態様では、自己反応性B細胞性炎症状態は、重症筋無力症、軽鎖アミロイドーシス、尋常性天疱瘡、および免疫性血小板減少症から選択される疾患である。一部の態様では、自己反応性B細胞により媒介される自己免疫疾患は、全身性ループスエリテマトーデス(SLE)、シェーグレン症候群、1型糖尿病、アジソン病、悪性貧血、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、関節リウマチ、重症筋無力症、原発性胆汁胆管炎、グッドパスチャー病、原発性膜性腎症、卵巣不全、および自己免疫性睾丸炎からなる群から選択される。例えば、自己反応性B細胞により媒介される自己免疫疾患は重症筋無力症である。
本明細書に記載の任意の使用の一部の実施形態では、使用は対象に抗炎症剤を投与することをさらに含む。任意選択で、抗炎症剤は、コルチコステロイド、DMARDs、または抗サイトカイン剤からなる群から選択される。任意選択で、対象はヒトである。
本出願は、以下の図を含む。これらの図は、本組成物および方法のある特定の実施形態および/または特徴を図示し、本組成物および方法の任意の記載を補足することが意図されている。これらの図は、書面による説明がそうであることを明示的に示さない限り、本組成物および方法の範囲を限定しない。
以下の記載は、開示される組成物および方法の様々な態様および実施形態を記述する。具体的な実施形態は、組成物および方法の範囲を定義することを意図するものではない。むしろ、実施形態は単に、開示される組成物および方法の範囲内に少なくとも含まれる非限定的な例を提供する。記載は当業者の観点から読まれるべきであり、したがって、当業者に周知の情報は必ずしも含まれない。本明細書において使用される場合、単数形a、およびtheは、文脈が他に明確に規定しなければ、複数の参照物を含むこともまた理解されるべきである。
多重特異性抗原結合性構築物
少なくとも2つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。第1の抗原結合単位は、腫瘍抗原に結合することにより腫瘍細胞を特異的に標的化するか、またはB系列細胞により発現される標的抗原に結合することによりB系列細胞を特異的に標的化する。第2の抗原結合単位はNKp30抗原に特異的に結合する。構築物は、がんまたは自己免疫疾患を有する対象における腫瘍細胞またはB細胞(形質細胞もしくは自己反応性B細胞などのB系列細胞を含む)の標的化および殺傷を含む様々な方法において有用である。
少なくとも2つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。第1の抗原結合単位は、腫瘍抗原に結合することにより腫瘍細胞を特異的に標的化するか、またはB系列細胞により発現される標的抗原に結合することによりB系列細胞を特異的に標的化する。第2の抗原結合単位はNKp30抗原に特異的に結合する。構築物は、がんまたは自己免疫疾患を有する対象における腫瘍細胞またはB細胞(形質細胞もしくは自己反応性B細胞などのB系列細胞を含む)の標的化および殺傷を含む様々な方法において有用である。
免疫系は、腫瘍細胞を認識および排除する能力を有するが、腫瘍細胞は、免疫系を逃れる複数の戦略を使用することができる。免疫チェックポイントの遮断は、治療的な抗腫瘍免疫を活性化または再活性化させるアプローチの1つである。がんの形成または進行を阻害する別のアプローチは、様々なエフェクター分子の機能および天然の免疫応答に関与する相互作用を増進することによる。本開示は、天然の免疫応答を増進する多重特異性抗原結合性構築物を提供する。免疫応答は、対象のNK細胞がCD16の低減されたレベルを呈し、および/または対象の腫瘍細胞が腫瘍抗原発現の低減されたレベルを呈する状態であっても構築物により増進される。本明細書において使用される場合、「免疫応答を増進する」は、多重特異性抗原結合性構築物の存在下で起こるがその非存在下では起こらない免疫応答の増加を指す。そのような増進は、本明細書の他の箇所において記載されるように、1つまたは複数のNKまたはT細胞機能(例えば、細胞傷害活性、サイトカイン産生)などの増加を指すことができる。
本開示は、一部の態様では、少なくとも2つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性(例えば、二重特異性、三重特異性、および四重特異性)抗原結合性構築物であって、第1の抗原結合単位が、腫瘍抗原またはB系列細胞により発現される抗原に特異的に結合し、第2の抗原結合単位が、NKp30抗原に特異的に結合する、多重特異性抗原結合性構築物およびその組成物を提供する。
本明細書に記載のこれらの態様および全てのそのような態様の一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は少なくとも3つの連結した抗原結合単位を含み、第1の抗原結合単位は第1の腫瘍抗原またはB系列細胞により発現される抗原に特異的に結合し、第2の抗原結合単位は第2の腫瘍抗原またはB系列細胞により発現される抗原に特異的に結合し、第3の抗原結合単位はNKp30抗原に特異的に結合する。
本明細書に記載のこれらの態様および全てのそのような態様の一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は少なくとも3つの連結した抗原結合単位を含み、第1の抗原結合単位は腫瘍抗原またはB系列細胞により発現される抗原に特異的に結合し、第2の抗原結合単位はNKp30抗原に特異的に結合し、第3の抗原結合単位はNK受容体に特異的に結合する。一部のそのような実施形態では、第3の抗原結合単位はNKp30にも結合する。一部のそのような実施形態では、第3の抗原結合単位は異なる活性化NK受容体に結合し、すなわち、NKp30に結合しない。
本明細書に記載のこれらの態様および全てのそのような態様の一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は少なくとも4つの連結した抗原結合単位を含み、第1の抗原結合単位は第1の腫瘍抗原またはB系列細胞により発現される抗原に特異的に結合し、第2の抗原結合単位は第2の腫瘍抗原またはB系列細胞により発現される抗原に特異的に結合し、第3の抗原結合単位はNKp30抗原に特異的に結合し、第4の抗原結合単位は活性化NK受容体に特異的に結合する。一部のそのような実施形態では、第4の抗原結合単位はNKp30にも結合する。一部のそのような実施形態では、第4の抗原結合単位は異なる活性化NK受容体に結合し、すなわち、NKp30に結合しない。第4の抗原結合単位が異なる活性化NK受容体に結合するそれらの実施形態では、受容体は、NKp46、NKp44、2B4、CD226、NKG2D、CD137、CD16a、およびCD2から選択される。これらのNK活性化受容体の例示的なヒトアミノ酸配列は配列番号28〜36として見出すことができる。
本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物は1つまたは複数の腫瘍抗原を標的化することができ、該腫瘍抗原としては、(i)腫瘍特異抗原、(ii)腫瘍関連抗原、(iii)腫瘍特異抗原を発現する細胞、(iv)腫瘍関連抗原を発現する細胞、(v)腫瘍上の胚性抗原、(vi)自己腫瘍細胞、(vii)腫瘍特異的膜抗原、(viii)腫瘍関連膜抗原、(ix)増殖因子受容体、(x)増殖因子リガンド、および(xi)がんと関連付けられる任意の他の種類の抗原または抗原提示細胞もしくは材料が挙げられる。
一部の実施形態では、第1および/または第2の腫瘍抗原は腫瘍特異抗原(TSA)である。本明細書において使用される場合、「TSA」は、腫瘍細胞に特有であり、身体中の他の細胞上に存在しない抗原である。一部の実施形態では、第1および/または第2の腫瘍抗原は腫瘍関連抗原(TAA)である。「TAA」は、本明細書において使用される場合、腫瘍細胞に特有ではなく、その代わりに抗原に対する免疫学的寛容の状態を誘導しない条件下で正常細胞上にも発現される。腫瘍上の抗原の発現は、免疫系が抗原に応答することを可能とする条件下で起こることができる。一部の実施形態では、TAAは、免疫系が未熟であり応答が不可能な胎生期発生の間に正常細胞上に発現され、または正常細胞上に極めて低いレベルで通常存在するが、腫瘍細胞上においてはるかにより高いレベルで発現される。
ある特定の実施形態では、TAAは、患者の腫瘍細胞をシークエンシングし、腫瘍中にのみ見出される突然変異したタンパク質を同定することにより決定される。これらの抗原は「ネオ抗原」と称される。ネオ抗原が同定されると、それに対する治療的抗体を製造し、本明細書に記載の方法において使用することができる。
一部の態様では、腫瘍抗原は、上皮がん抗原、前立腺特異的がん抗原(PSA)もしくは前立腺特異的膜抗原(PSMA)、膀胱がん抗原、肺がん抗原、結腸がん抗原、卵巣がん抗原、脳がん抗原、胃がん抗原、腎細胞癌抗原、膵臓がん抗原、肝臓がん抗原、食道がん抗原、頭頸部がん抗原、結腸直腸がん抗原、リンパ腫抗原、B細胞リンパ腫がん抗原、白血病抗原、骨髄腫抗原、急性リンパ芽球性白血病抗原、慢性骨髄性白血病抗原、または急性骨髄性白血病抗原である。
B細胞成熟抗原(BCMA)は、本明細書に記載の開示される多重特異性抗原結合性構築物により標的化することができる腫瘍抗原の例である。BCMAはTNF受容体スーパーファミリーの細胞表面受容体であり、成熟B細胞上に通常発現される。BCMAは天然に様々なアイソフォームにおいて存在する。例として、ヒトBCMAは配列番号6のアミノ酸配列を含む。BCMAはBCMおよび腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー17(TNFRSF17)としても公知である。BCMAはそのリガンドであるB細胞活性化因子(BAFF)に結合し、BAFFは、TNFファミリーのメンバーであり、B細胞共刺激の目的のためにT細胞および樹状細胞により発現される。BCMAは、ある特定のがん細胞、例えば、多発性骨髄腫細胞上に検出される。
ヒト上皮増殖因子2(HER2)は、本明細書に記載の開示される多重特異性抗原結合性構築物により標的化することができる腫瘍抗原の別の例である。HER2は、erbB2遺伝子によりコードされる膜結合型チロシンキナーゼ受容体である。HER2は、HER2/neu、EGFR2、CD340、およびERBB2としても公知である。HER2は、ある特定のがん細胞、例えば、乳がん細胞、卵巣がん細胞、胃がん細胞、肺がん細胞、および子宮がん細胞上に検出される。例として、ヒトHER2アイソフォームbは配列番号37のアミノ酸配列を含む。
開示される多重特異性抗原結合性構築物により標的化することができる追加の腫瘍抗原としては、1GH−IGK、43−9F、5T4、791Tgp72、9D7、シクロフィリンC会合タンパク質、アルファ−フェトプロテイン(AFP)、α−アクチニン−4、A3、A33抗体に特異的な抗原、ART−4、B7、Ba 733、BAGE、BCR−ABL、ベータカテニン、ベータ−HCG、BrE3抗原、BCA225、BING−4、BRCA1/2、BTAA、CA125、CA 15−3\CA 27.29\BCAA、CA195、CA242、CA−50、カルシウム活性化クロライドチャネル2、CAGE、CAM43、CAMEL、CAP−1、炭酸脱水酵素IX、c−Met、CA19−9、CA72−4、CAM 17.1、CASP−8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a−e、CD67、CD68、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD83、CD95、CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK4、CDK4m、CDKN2A、CML6/6、CO−029、CTLA4、CXCR4、CXCR7、CXCL12、サイクリンB、HIF−1a、結腸特異的抗原p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、c−Met、DAM、E2A−PRL、EGFR、EGFRvIII、EGP−1(TROP−2)、EGP−2、ELF2−M、Ep−CAM、EphA3、線維芽細胞増殖因子(FGF)、FGF−5、フィブロネクチン、Flt−1、Flt−3、葉酸受容体、G250抗原、Ga733VEpCAM、GAGE、gp100、GRO−β、H4−RET、HLA−DR、HM1.24、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)およびそのサブユニット、HMGB−1、低酸素誘導因子(HIF−1)、HSP70−2M、HST−2、HTgp−175、Ia、IGF−1R、IFN−γ、IFN−α、IFN−β、IFN−λ、IL−4R、IL−6R、IL−13R、IL−15R、IL−17R、IL−18R、IL−2、IL−6、IL−8、IL−12、IL−15、IL−17、IL−18、IL−23、IL−25、未熟ラミニン受容体、インスリン様増殖因子−1(IGF−1)、KC4抗原、KSA、KS−1抗原、KS1−4、LAGE−1a、Le−Y、LDR/FUT、M344、MA−50、マクロファージ遊走阻害因子(MIF)、MAGE、MAGE−1、MAGE−3、MAGE−4、MAGE−5、MAGE−6、MART−1、MART−2、TRAG−3、MC1R、mCRP、MCP−1、メソテリン、MIP−1A、MIP−1B、MIF、MG7−Ag、MOV18、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC13、MUC16、MUM−1/2、MUM−3、MYL−RAR、NB/70K、Nm23H1、NuMA、NCA66、NCA95、NCA90、NY−ESO−1、Pポリペプチド、p15、p16、p53、p185erbB2、p180erbB3、PAM4抗原、膵臓がんムチン、PD1受容体(PD−1)、PD−1受容体リガンド1(PD−L1)、PD−1受容体リガンド2(PD−L2)、PI5、胎盤増殖因子、p53、PLAGL2、Pmel17前立腺酸ホスファターゼ、PSA、PRAME、PSMA、PlGF、ILGF、ILGF−1R、IL−6、IL−25、RCAS1、RS5、RAGE、RANTES、Ras、T101、SAGE、SAP−1、S100、SSX−2、サバイビン、サバイビン−2B、SDDCAG16、TA−90\Mac2結合タンパク質、TAAL6、TAC、TAG−72、TGF−βRII、Ig TCR、TLP、テロメラーゼ、テネイシン、TRAIL受容体、TRP−1、TRP−2、TSP−180、TNF−α、Tn抗原、トムセン−フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、チロシナーゼ、VEGFR、ED−Bフィブロネクチン、WT−1、XAGE、17−1A抗原、補体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管新生マーカー、bc1−2、bc1−6、およびK−ras、がん遺伝子マーカーおよびがん遺伝子産物が挙げられるがそれに限定されない(例えば、センシら(Sensi et al.)(2006)Clin. Cancer Res. 12:5023−32;パルミアニら(Parmiani et al.)(2007)J. Immunol. 178:1975−79;ノヴェッリーノら(Novellino et al.)(2005)Cancer Immunol. Immunother. 54:187−207を参照)。
一部の実施形態では、腫瘍抗原は、ヒト慢性疾患またはがん(例えば、子宮頸がん)と関連付けられるウイルスに由来するウイルス抗原である。例えば、一部の実施形態では、ウイルス抗原は、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、HPV抗原E6および/もしくはE7、C型肝炎ウイルス(HCV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、またはサイトメガロウイルス(CMV)に由来する。
顕著なことに、腫瘍抗原発現は、NK細胞、具体的には腫瘍に浸潤するNK細胞による標的化を逃れるように腫瘍細胞により下方調節され得る。本発明の多重特異性抗原結合性構築物は、標的細胞が低い腫瘍抗原発現レベルを有する場合であってもNK細胞による標的細胞の殺傷を増進する能力を有する。追加的に、多重特異性抗原結合性構築物は、低腫瘍抗原発現性腫瘍細胞の存在下であってもIFNγ産生およびADCC機能を促進する能力を保持する。
NKp30などの、本明細書において「NK活性化受容体」と称されることもある天然細胞傷害性受容体(NCR)は、典型的には免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリーに属する活性化ナチュラルキラー(NK)細胞受容体である。そのようなNK受容体を通じたシグナル伝達は強いNK細胞活性化に繋がり、細胞内Ca++レベルの増加、細胞傷害性、およびサイトカインおよびリンホカイン放出の誘発、ならびに腫瘍細胞を含む多くの種類の標的細胞に対するNK細胞傷害性の活性化を結果としてもたらす。本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の実施形態において標的として使用するために想定される追加のNK活性化受容体の非限定的な例としては、NKp46、NKp44、2B4、CD226、NKG2D、CD137、CD16a、およびCD2が挙げられる。NKp30およびこれらの追加のNK活性化受容体の例示的なヒトアミノ酸配列は、配列番号7、および28〜36として見出すことができる。
NKp30(CD337としても公知)は、NK細胞、およびエフェクターγδ T細胞などのT細胞のサブセット上に発現される。NKp30は、BAG6、B7−H6(NCR3LG1)、およびガレクチン−3(Gal−3)を含む細胞外リガンドにより活性化され、そのようなリガンドを発現する隣接する細胞に対するNK細胞細胞傷害性を刺激する。そのため、NKp30は腫瘍細胞に対するNK細胞細胞傷害性を制御すると考えられている。ヒトNKp30のアミノ酸配列は、例えば、配列番号7を含むが、他の天然に存在する変種が存在する。
NKp46(CD335としても公知)は、休止NK細胞および活性化NK細胞の両方により選択的に発現される。活性化されると、NKp46は、そのリガンドを発現する隣接する細胞に対するNK細胞細胞傷害性を刺激する。ヒトNKp46のアミノ酸配列は、例えば、配列番号28を含むが、他の天然に存在する変種が存在する。
NKp44(CD336としても公知)は、活性化NK細胞およびin vitroで培養された(すなわち、活性化)TCRg/dリンパ球細胞により選択的に発現される。NKp44は、混合型白血病−5(mixed−lineage leukemia−5)タンパク質の新規のアイソフォームであるNKp44Lにより活性化される。ヒトNKp44のアミノ酸配列は、例えば、配列番号36を含むが、他の天然に存在する変種が存在する。
NKG2D(CD314としても公知)は、ナチュラルキラー(NK)細胞、CD8+アルファ−ベータおよびガンマ−デルタT細胞中、新鮮に単離されたPBMCからの本質的に全てのCD56+CD3− NK細胞上、ならびにインターフェロン産生キラー樹状細胞(IKDC)中に発現される。NKG2Dは、自己腫瘍細胞およびウイルス感染細胞の表面において提示される様々な細胞ストレス誘導性リガンドに結合することにより活性化され、レクチンなどのそのようなリガンドを発現する細胞に対するNK細胞細胞傷害性を刺激する。ヒトNKG2Dのアミノ酸配列は、例えば、配列番号32を含むが、他の天然に存在する変種が存在する。
2B4(CD244としても公知)は、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAM)ファミリーの異好性受容体であり、そのリガンドはCD48である。2B4は、NCR3およびNCR1などの他のNK受容体によるシグナルを増進することによりNK活性化における共刺激因子として作用する。ヒト2B44のアミノ酸配列は、例えば、配列番号29および30を含むが、他の天然に存在する変種が存在する。
CD137(41BBとしても公知)は、活性化T細胞の他に、樹状細胞、B細胞、濾胞性樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、顆粒球および炎症の部位における血管壁の細胞上に発現され、そのリガンドはTNFSF9/4−1BBLである。ヒトCD137のアミノ酸配列は、例えば、配列番号33を含むが、他の天然に存在する変種が存在する。
CD226(DNAM1としても公知)は、ナチュラルキラー(NK)およびT細胞のサブセット上に発現され、そのリガンドはCD155またはCD112である。ヒトCD226のアミノ酸配列は、例えば、配列番号31を含むが、他の天然に存在する変種が存在する。
CD16a(FcRIIIaとしても公知)は、ナチュラルキラー細胞、好中球多形核白血球、単球およびマクロファージ上に発現され、IgのFc領域の受容体であり、複合体化または凝集したIgGの他に、単量体IgGに結合する。ヒトCD16aのアミノ酸配列は、例えば、配列番号34を含むが、他の天然に存在する変種が存在する。
CD2(LFA2としても公知)は、ナチュラルキラー細胞およびT細胞上に発現され、LFA3/CD48およびCD48の受容体である。ヒトCD2のアミノ酸配列は、例えば、配列番号35を含むが、他の天然に存在する変種が存在する。
よって、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、少なくとも1つの抗原結合単位はNKp30に特異的に結合する。本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位はNKp46に特異的に結合する。本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位はNKp44に特異的に結合する。本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位はNKG2Dに特異的に結合する。本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位は2B4に特異的に結合する。本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位はCD226に特異的に結合する。本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位はCD137に特異的に結合する。本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位はCD16aに特異的に結合する。本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位はCD2に特異的に結合する。
本開示は、ある特定の免疫応答エフェクター分子および相互作用をアゴナイズすることにより免疫応答を増進するための組成物および方法を提供する。本発明の組成物および方法は、対象がCD16欠損性微環境を含むがんまたは状態を有する場合であっても、対象において免疫応答を増進するために使用することができる。CD16は、NK細胞、好中球多形核白血球、単球、およびマクロファージ上に存在するFc受容体であり、IgG抗体上のFc受容体に結合するのでFcγRIIIとしても公知である。CD16は、シグナル伝達に参加するCD16aおよびCD16b Fc受容体として同定されている。CD16aは、ある特定のNK細胞上に存在し、サイトカイン産生および抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を介する細胞傷害性エフェクター活性を誘導する。CD16aの下方調節がサイトカイン活性化および標的細胞刺激後に起こることが示されている。
CD16発現の非存在下で腫瘍細胞殺傷を媒介することは重要である。第1に、NK細胞は2つの別個の集団:CD56dim/CD16陽性およびCD56bright/CD16陰性から構成される。健常個体において、CD16陰性は総NK集団の5〜15%を表す。しかしながら、一部のがん患者においてCD16陰性NK細胞の割合は大きく増加している。それらの細胞集団はフローサイトメトリーにより同定することができる。追加的に、腫瘍微環境は、細胞の表面からのCD16aのシェディングを誘導すること(ADAM17酵素により媒介される活性)または細胞の表面上のその発現を下方調節すること(TGFβおよびその他により媒介される活性)によりCD56dim/CD16pos NK細胞の表現型に影響することが示されている。NK細胞上のCD16a発現のレベルは、フローサイトメトリーを使用して測定することができる。さらに、CD16aの多型に起因して、一部の個体は、モノクローナル抗体により媒介されるADCCを劇的に損なうCD16aにおける突然変異を有する。患者を遺伝子型判定することができる。追加的に、同種造血幹細胞移植(HCST)において、NK阻害受容体とHLAとの間のミスマッチの存在は、ドナーNK細胞がレシピエント免疫細胞を殺傷し、したがって残留悪性細胞を排除することを可能とする。最近、移植後に再構成される最初のNK細胞はNKp30+/CD16−表現型を示すことが示された。したがって、CD16発現の非存在下で腫瘍細胞殺傷を媒介することは大きな重要性を有する。
任意選択で、免疫応答を増進するための本発明の組成物および方法は、NK細胞が対照NK細胞と比較して50%未満のCD16の発現を有する対象を伴う。任意選択で、対象のCD16欠損性微環境は、浸潤性NK細胞の少なくとも10%が対照NK細胞と比較して低減されたCD16の発現を有する腫瘍浸潤性NK細胞の集団を含む。NK細胞は150,000未満のCD16コピー数を有することができる。一部の実施形態では、NK細胞はCD16を発現しない。
特定の標的抗原を認識する少なくとも2つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性抗原結合性構築物が提供される。そのため、「多重特異性抗原結合性構築物」という用語は、本明細書において使用される場合、二重特異性、三重特異性、四重特異性、および多重特異性抗原結合性構築物を含む。
多重特異性抗原結合性構築物は、単一の多機能性ポリペプチド、小分子、もしくはアプタマーであることができ、または共有結合的もしくは非共有結合的に互いに会合した2つ以上の分子のマルチマー複合体であることができる。多重特異性抗原結合性構築物としては、別の機能分子、例えば、別のペプチド、タンパク質、および/またはアプタマーに連結されることまたはそれと共発現されることができる抗体(またはその抗原結合性断片)が挙げられる。例えば、抗体またはその断片は、第2の結合特異性を有する多重特異性抗原結合性構築物を製造するために、タンパク質またはその断片などの1つまたは複数の他の分子実体に(例えば、化学カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合またはその他により)機能的に連結させることができる。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、多重特異性抗原結合性構築物を製造するために、異なる結合特異性を有する1つまたは複数の抗体またはその抗原結合性断片に機能的に連結させられる。構築物の各抗体またはその抗原結合性部分は1つまたは複数の抗原結合特異性を有することができる。
本明細書において使用される場合、抗原結合単位は、抗原に結合する構築物の区画を形成する多重特異性抗原結合性構築物のドメインまたは領域などを指す。第1の抗原結合単位は、構築物の第2の抗原結合単位とは別々の多重特異性抗原結合性構築物の結合区画を形成し、各単位は抗原結合の別々の領域を形成する。一般に、1つの単位(第1の単位)はその抗原結合において他の単位(第2の単位)とは別個である。例えば、構築物の1つの抗原結合単位は、腫瘍またはB系列細胞抗原(例えば、BCMA)について一価であってそれに結合する一方、構築物の他の抗原結合単位はNKp30について一価であってそれに結合する。さらに、例として、構築物の1つの抗原結合単位は腫瘍またはB系列細胞抗原に結合する一方、構築物の他のアームはNKp30または関連分子に結合する(例えば、構造の類似性に起因して、2つの抗原と交差反応する)。例えば、米国特許第9,845,356号明細書を参照。
任意選択で、および一部の実施形態では、多重特異性構築物は四価である。例えば、一部の実施形態では、1つの抗原結合単位は腫瘍またはB系列細胞抗原について二価であり、それぞれは腫瘍またはB系列細胞抗原上の同じエピトープに結合する一方、他の抗原結合単位はNKp30について二価であり、それぞれはNKp30上の同じエピトープに結合する。一部の実施形態では、多重特異性構築物は四価であり、1つの抗原結合単位は腫瘍またはB系列細胞抗原について二価であり、それぞれは腫瘍またはB系列細胞抗原上の2つの異なるエピトープに結合する。一部の実施形態では、多重特異性構築物は四価であり、1つの抗原結合単位はNKp30について二価であり、それぞれはNKp30上の2つの異なるエピトープに結合する。一部の実施形態では、多重特異性構築物は四価であり、1つの抗原結合単位は腫瘍またはB系列細胞抗原について二価であり、それぞれは腫瘍またはB系列細胞抗原上の2つの異なるがオーバーラップするエピトープに結合する。一部の実施形態では、多重特異性構築物は四価であり、1つの抗原結合単位はNKp30について二価であり、それぞれはNKp30の2つの異なるがオーバーラップするエピトープに結合する。一部の実施形態では、多重特異性構築物は四価であり、1つの抗原結合単位は第1の腫瘍抗原について一価であり、1つの抗原結合単位は第2の腫瘍またはB系列細胞抗原について一価であり、1つの抗原結合単位はNKp30について二価であり、それぞれはNKp30上の同じエピトープに結合する。一部の実施形態では、多重特異性構築物は四価であり、1つの抗原結合単位は腫瘍またはB系列細胞抗原について一価であり、1つの抗原結合単位はNKp30について二価であり、それぞれはNKp30上の同じエピトープに結合し、1つの抗原結合単位は第2のNK受容体について一価である。一部の実施形態では、多重特異性構築物は四価であり、1つの抗原結合単位は第1の腫瘍またはB系列細胞抗原について一価であり、1つの抗原結合単位は第2の腫瘍またはB系列細胞抗原について一価であり、1つの抗原結合単位はNKp30について一価であり、1つの抗原結合単位は第2のNK受容体について一価である。
価数という用語は、抗原結合性構築物またはタンパク質を記載するために使用される場合、異なる認識または結合部位が同じエピトープに結合するかどうかにかかわらず、抗原結合性構築物またはタンパク質中の認識(結合)部位の数を指す。各認識部位は、抗原上の1つのエピトープ(結合部位)を特異的に認識し、したがってそれに結合することができる。抗原結合性タンパク質が1つより多くの認識部位を含む場合(例えば、抗原結合性タンパク質が、その可変領域中に2つの認識部位を有するIgGである場合)、各認識部位は、同じ抗原上の同じエピトープ、または同じ抗原上もしくは異なる抗原上のいずれにあるにせよ異なるエピトープを特異的に認識することができる。多価性は、受容体結合単位または構築物と、関係する抗原または標的受容体との間のアビディティ、すなわち、結合の強度を増加させることができる。アビディティは、エピトープまたは抗原決定基と抗原結合単位上のその結合部位との間の親和性、および抗原結合単位上に存在する関係する結合部位の実際の数の両方に関する。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、腫瘍またはB系列細胞抗原に特異的に結合する第1の抗原結合単位、およびNKp30に特異的に結合する第2の抗原結合単位を含む。抗原結合単位の標的分子への結合に関して、特異的結合、特異的に結合する、特異的、選択的に結合する、および選択的などの用語は、具体的な標的抗原もしくは分子(例えば、ポリペプチド標的)または具体的な標的抗原もしくは分子上のエピトープに関する場合、非特異的または非選択的な相互作用とは測定できる程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、対照分子の結合と比較して標的分子の結合を決定することにより測定することができる。特異的結合はまた、過剰な非標識化標的などの、標的に類似した対照分子との競合により決定することができる。その場合、特異的結合は、標識化標的のプローブへの結合が過剰な非標識化標的により競合的に阻害される場合に指し示される。
エピトープという用語は、本明細書において使用される場合、抗原結合性構築物または単位への特異的結合が可能な抗原の成分を意味する。エピトープは、頻繁に、表面に接近可能なアミノ酸残基および/または糖側鎖からなり、特定の三次元構造的特徴の他に、特定の電荷的特徴を有することができ、連続または非連続であり得る。コンホメーショナルおよび非コンホメーショナルエピトープは、後者への結合はそうではないが、前者への結合は変性溶剤の存在下で失われるという点で区別される。エピトープは、結合に直接的に関与するアミノ酸残基、および結合に直接的に関与しない他のアミノ酸残基を含むことができる。抗原結合性タンパク質が結合するエピトープは、例えば、異なる点突然変異を有する抗原変種への抗原結合性タンパク質の結合についての試験、例えば、「エピトープマッピング」、および/またはX線結晶学技術の使用などのエピトープ決定のための公知の技術を使用して決定することができる。
一部の実施形態では、少なくとも1つの抗原結合単位は、少なくとも1×10−7M、少なくとも1×10−8M、少なくとも1×10−9M、少なくとも1×10−10M、少なくとも1×10−11M、少なくとも1×10−12M、または少なくとも1×10−13MのKDを有する。一部の実施形態では、構築物の抗原結合単位は同じまたは類似したKDを有する。
KD(M)という用語は、本明細書において使用される場合、具体的な抗原結合単位/抗原相互作用の解離平衡定数を指す。KD=kd/ka。kd(秒−1)という用語は、本明細書において使用される場合、具体的な抗原結合単位/抗原相互作用の解離速度定数を指す。この値はkoff値とも称される。ka(M−1×秒−1)という用語は、本明細書において使用される場合、具体的な抗原結合単位/抗原相互作用の会合速度定数を指す。この値はkon値とも称される。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物の1つの抗原結合単位(例えば、第1の抗原結合単位)のその標的への結合は、他の抗原結合単位(例えば、第2の抗原結合単位)のその標的への結合を遮断も立体的に邪魔もしない。例えば、第1の抗原結合単位の腫瘍またはB系列細胞抗原への結合時に、第2またはその後の抗原結合単位はNKp30抗原に自由に結合する。そのため、一部の実施形態では、第1の抗原結合単位および第2の抗原結合単位はそれらの各々の標的に同時に結合する。
一部の実施形態では、第1の抗原結合単位および第2の抗原結合単位のそれらの各々の標的への結合は免疫細胞および第2の細胞を一緒になるようにブリッジ形成させ、2つの細胞を近接させる。本明細書において使用される場合、ブリッジは、2つの細胞種(例えば、NKp30を発現する1つの免疫細胞および腫瘍もしくはB系列細胞抗原を発現する第2の細胞)を接合させることまたは2つの細胞を一緒になるように近接させることを指し、2つの細胞は物理的接触状態にある必要はない。そのため、多重特異性抗原結合性構築物は2つの細胞へのコネクター(例えば、ブリッジ)として作用し、各細胞は、NKp30および/もしくは第2のNK活性化受容体または1つもしくは複数の腫瘍もしくはB系列細胞抗原のいずれかを発現する。
2つの細胞が本開示の構築物によりブリッジ形成しているかどうかを決定する方法は当該技術分野において公知である。例えば、一部の実施形態では、免疫細胞および第2の細胞のブリッジ形成は、例えば、フローサイトメトリー、FRET、免疫沈降、顕微鏡法、または蛍光プレートリーダーにより決定される。
本明細書に記載されるように、本開示の構築物は、NKp30および/または第2のNK活性化受容体を発現する1つまたは複数の免疫細胞ならびに1つまたは複数の腫瘍またはB系列細胞抗原を発現する1つまたは複数の細胞に結合することができる。免疫細胞の種類は、治療される疾患の文脈、および免疫細胞の具体的な種類に依存し、考慮している障害に依存して当業者により決定され得る。一部の実施形態では、免疫細胞はT細胞であり、これには、エフェクターγδ T細胞を含むCD8+ T細胞およびCD4+細胞が含まれる。一部の実施形態では、免疫細胞はナチュラルキラー(NK)細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はB細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はマクロファージである。
一部の実施形態では、構築物は、1つまたは複数の腫瘍細胞(例えば、固形または非固形腫瘍細胞)に結合することができる。本明細書において使用される場合、腫瘍細胞はがん細胞と交換可能に使用されることがあるが、正常細胞と比較して増加した増殖を呈する非悪性(非がん性)細胞も包含する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、免疫細胞および腫瘍抗原を発現する細胞(例えば、BCMA発現性腫瘍細胞)をブリッジ形成させながら、NKp30機能を増進することにより治療することができるがん細胞である。
例として、腫瘍細胞は、血液がん、リンパ腫、骨髄腫、白血病、神経学的がん、皮膚がん、乳がん、前立腺がん、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がん、胃腸がん、肝臓がん、膵臓がん、泌尿生殖器がん、骨がん、腎臓がん、および血管がんからなる群から選択されるがんからのものである。任意選択で、腫瘍細胞(および排他的ではないがそのような腫瘍細胞と関連付けられる特定の腫瘍抗原)は、カポジ肉腫、白血病、急性リンパ性白血病(etv6、aml1、シクロフィリンb)、急性骨髄球性白血病、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性赤白血病(myeloblasts promyelocyte myelomonocytic monocytic erythroleukemia)、慢性白血病、慢性骨髄球性(顆粒球性)白血病、慢性リンパ性白血病(シクロフィリンb)、マントル細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、バーキットリンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫(Ig−イディオタイプ)、真性多血症リンパ(Polycythemia vera Lymphoma)、ホジキン病(Imp−1、EBNA−1)、非ホジキン病、骨髄腫(mycloma)(MUCファミリー、p21ras)、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、肉腫、癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫(chrondrosarcoma)、骨原性肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸肉腫、結腸癌(p21ras、HER2/neu、c−erbB−2、MUCファミリー)、膵臓がん、乳がん(MUCファミリー、HER2/neu、c−erbB−2)、卵巣がん、前立腺がん(前立腺特異的抗原(PSA)およびその抗原エピトープPSA−1、PSA−2、およびPSA−3、PSMA、HER2/neu、c−erbB−2、ga733糖タンパク質)、扁平細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌(HER2/neu、c−erbB−2)、ヘパトーマ、肝細胞がん(α−フェトプロテイン)、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、子宮がん、精巣腫瘍(NY−ESO−1)、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌(HER2/neu、c−erbB−2)、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫(E−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、γ−カテニン、p120ctn)、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫(menangioma)、黒色腫(p5タンパク質、gp75、がん胎児性抗原、GM2およびGD2ガングリオシド、Melan−A/MART−1、cdc27、MAGE−3、p21ras、gp100)、神経芽腫、網膜芽腫、鼻咽頭癌(Imp−1、EBNA−1)、食道癌、基底細胞癌、胆道がん(p21ras)、膀胱がん(p21ras)、骨がん、脳および中枢神経系(CNS)がん、子宮頸癌(p53、p21ras)、絨毛癌(CEA)、結腸直腸がん(結腸直腸関連抗原(CRC)−CO17−1A/GA733、APC)、結合組織がん、消化器系のがん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、頭頸部がん、胃がん(HER2/neu、c−erbB−2、ga733糖タンパク質)、上皮細胞がん(シクロフィリンb)、上皮内新生物、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん(小細胞、大細胞)(CEA、MAGE−3、NY−ESO−1)、口腔がん(例えば、口唇、舌、口、および咽頭がん)、卵巣がん(MUCファミリー、HER2/neu、c−erbB−2)、膵臓がん、直腸がん、呼吸器系のがん、皮膚がん、甲状腺がん、ならびに泌尿器系のがんからなる群から選択されるがんからのものである。
一部の構築物では、構築物は1つまたは複数のB系列細胞に結合することができる。本明細書において使用される場合、B系列細胞としては、プロB細胞、プレB細胞、移行期B細胞、濾胞性B細胞、辺縁帯B細胞、胚中心B細胞、形質細胞、およびメモリーB細胞が挙げられる。
少なくとも2つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、第1の抗原結合単位が、B系列細胞により発現される第1の標的抗原に特異的に結合し、第2の抗原結合単位が、NKp30抗原に特異的に結合する、多重特異性抗原結合性構築物が特に提供される。例えば、第1の標的抗原はB系列細胞成熟抗原(BCMA)であることができる。任意選択で、多重特異性抗原結合性構築物は、B系列細胞により発現される第2の標的抗原に結合する第3の抗原結合単位をさらに含む。
BCMAに加えて、B系列細胞により発現される標的抗原としては、例えば、CD1c、CD5、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD27、CD34、CD38、CD40、CD72、CD78、CD79a、CD79b、CD80、CD84、CD86、CD126、CD138、CD319、TAC、GPRC5D(Gタンパク質共役型受容体クラスCグループ5メンバーD)、SLAMF7(CS1)、およびIL7/3Rが挙げられる。
抗体およびその抗原結合性部分
本明細書に記載されるように、開示される多重特異性抗原結合性構築物は、二重特異性、三重特異性、四重特異性、または多重特異性の抗体またはその抗原結合性断片を含む。
本明細書に記載されるように、開示される多重特異性抗原結合性構築物は、二重特異性、三重特異性、四重特異性、または多重特異性の抗体またはその抗原結合性断片を含む。
本明細書に記載の構築物は、様々な態様および実施形態では、1つまたは複数の抗体および/またはその抗原結合性部分を含むことができる。例えば、抗原結合単位は、NKp30に対する所与の抗体のまたはBCMAもしくはHER2などの腫瘍抗原に対する所与の抗体の可変重鎖および/または可変軽鎖、またはその相補性決定領域を含むことができる。よって、本明細書に記載の任意の態様の一部の実施形態では、第1の抗原結合単位、第2の抗原結合単位、第3の抗原結合単位、またはその任意の組合せは、抗体またはその抗原結合性部分を含むことができる。本明細書に記載の任意の態様の一部の実施形態では、第1の抗原結合単位、第2の抗原結合単位、第3の抗原結合単位、またはその任意の組合せは抗体またはその抗原結合性部分である。
免疫グロブリンまたは抗体という用語は、本明細書において使用される場合、ポリペプチド鎖の2つのペア:軽(L)鎖の1つのペアおよび重(H)鎖の1つのペアを一般に含む構造的に関するタンパク質のクラスを指す。インタクトな免疫グロブリンにおいて、これらの鎖の4つ全てはジスルフィド結合により相互接続されている。免疫グロブリンの構造はよく特徴付けられている。例えば、ポール(Paul)(2013) Fundamental Immunology 7th ed., Ch. 5, リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス(Lippincott Williams & Wilkins)[米国ペンシルベニア州フィラデルフィア(Philadelphia)所在]を参照。簡潔に述べれば、各重鎖は、典型的には、重鎖可変領域(VH)および重鎖定常領域(CH)を含む。重鎖定常領域は、典型的には、3つのドメイン、CH1、CH2、およびCH3を含む。各軽鎖は、典型的には、軽鎖可変領域(VL)および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、典型的には、CLと略記される1つのドメインを含む。
抗体は、本明細書において使用される場合、インタクトな抗体(例えば、インタクトな免疫グロブリン)を指すことができる。しかしながら、抗原結合性部分および抗原結合性断片という用語は、インタクトな抗体と交換可能に使用することができる。抗原結合性断片は少なくとも1つの抗原結合性ドメインを含む。抗原結合性ドメインの1つの例は、VH−VL二量体により形成される抗原結合性ドメインである。抗体および抗原結合性断片は、それらが特異的に結合する抗原により記載することができる。例えば、NKp30抗体、または抗NKp30抗体は、NKp30に特異的に結合する抗体である。
VHおよびVL領域は、より保存された領域が散在した超可変性の領域(相補性決定領域(CDR)とも呼ばれる超可変領域(HVR))にさらに分割することができる。より保存された領域はフレームワーク領域(FR)と呼ばれる。各VHおよびVLは、一般に、以下の順序(N末端からC末端へ):FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4で並べられた3つのCDRおよび4つのFRを含む。CDRは、抗原結合に関与し、抗体に対して抗原特異性および結合親和性を付与する。(カバットら(Kabat et al.)(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th ed.,米国国立衛生研究所公衆衛生局(Public Health Service, National Institutes of Health)[米国メリーランド州ベセスダ(Bethesda)所在]およびコチア、シーら(Chotia, C. et al.)(1987)J. Mol. Biol. 196:901−917を参照;全体を参照により本願明細書に援用する。)3つの重鎖CDRは、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3と称されることがあり、3つの軽鎖CDRは、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3と称されることがある。
「カバットに従って番号付けされた」、「カバット番号付け」、「カバットの定義」、および「カバットの標識化」とも称されるカバットにより記載されたシステムは、抗体の任意の可変ドメインに対して応用可能な明瞭な残基番号付けシステムを提供し、各鎖の3つのCDRを定義する精密な残基境界を提供する。(カバットら(Kabat et al.),Sequences of Proteins of Immunological Interest,米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)[米国メリーランド州ベセスダ(Bethesda)所在](1987)および(1991);その内容の全体を参照により援用する)。これらのCDRはカバットCDRと称され、おおよそ軽鎖可変ドメイン中の残基24〜34(CDR1)、50〜56(CDR2)および89〜97(CDR3)、ならびに重鎖可変ドメイン中の31〜35(CDR1)、50〜65(CDR2)および95〜102(CDR3)を含む。CDRがカバットに従って定義される場合、軽鎖FR残基はおおよそ残基1〜23(LCFR1)、35〜49(LCFR2)、57〜88(LCFR3)、および98〜107(LCFR4)に位置し、重鎖FR残基は、重鎖残基中のおおよそ残基1〜30(HCFR1)、36〜49(HCFR2)、66〜94(HCFR3)、および103〜113(HCFR4)に位置する。「カバットにおけるようなEUインデックス」はヒトIgG1 EU抗体の残基番号付けを指す。
他のCDR番号付けシステムもまた当該技術分野において使用される。コチア(Chothia)および共同研究者らは、カバットCDR内のある特定の下位部分は、アミノ酸配列のレベルにおいて大きな多様性を有するにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格コンホメーションをとることを見出した。(コチアら(Chothia et al.)(1987) J. Mol. Biol. 196:901−917;およびコチアら(Chothia et al.)(1989) Nature 342:877−883)。これらの下位部分は、L1、L2、およびL3またはH1、H2、およびH3として指定され、「L」および「H」はそれぞれ軽鎖および重鎖領域を指定する。これらのCDRは、「コチアCDR」、「コチア番号付け」、または「コチアに従って番号付けされた」と称されることがあり、おおよそ軽鎖可変ドメイン中の残基24〜34(CDR1)、52〜56(CDR2)および89〜97(CDR3)、ならびに重鎖可変ドメイン中の26〜32(CDR1)、50〜56または52〜56(CDR2)、および95〜102(CDR3)を含む。Mol. Biol. 196:901−917(1987)。
「マッカラムに従って番号付けされた」、または「マッカラム番号付け」とも称される、マッカラム(MacCallum)により記載されたシステムは、おおよそ軽鎖可変ドメイン中の残基30〜36(CDR1)、46〜55(CDR2)および89〜96(CDR3)、ならびに重鎖可変ドメイン中の30〜35(CDR1)、47〜58(CDR2)および93〜101(CDR3)を含む。マッカラムら(MacCallum et al.)((1996)J. Mol. Biol. 262(5):732−745)。
「AbMに従った番号付け」、または「AbM番号付け」とも称される、AbMにより記載されたシステムは、おおよそ軽鎖可変ドメイン中の残基24〜34(CDR1)、50〜56(CDR2)および89〜97(CDR3)、ならびに重鎖可変ドメイン中の26〜35(CDR1)、50〜58(CDR2)および95〜102(CDR3)を含む。
可変領域のIMGT(インターナショナル・イミュノジェネティクス・インフォメーション・システム(INTERNATIONAL IMMUNOGENETICS INFORMATION SYSTEM))番号付けもまた使用することができ、これは、ルフラン、エム、ピー(Lefranc, M.−P.)「免疫グロブリン、T細胞受容体およびIg様ドメインに対するIMGT特有の番号付け(The IMGT unique numbering for immunoglobulins, T cell Receptors and Ig−like domains)」,Immunologist,7,132−136(1999)(全体を参照により本願明細書に明示的に援用する)に記載されるようなIMGTの方法に従った免疫グロブリン可変重鎖または軽鎖中の残基の番号付けである。本明細書において使用される場合、「IMGT配列番号付け」または「IMTGに従って番号付けされた」は、IMGTに従った可変領域をコードする配列の番号付けを指す。重鎖可変ドメインについて、IMGTに従って番号付けされた場合、超可変領域は、CDR1についてアミノ酸位置27〜38、CDR2についてアミノ酸位置56〜65、およびCDR3についてアミノ酸位置105〜117に及ぶ。軽鎖可変ドメインについて、IMGTに従って番号付けされた場合、超可変領域は、CDR1についてアミノ酸位置27〜38、CDR2についてアミノ酸位置56〜65、およびCDR3についてアミノ酸位置105〜117に及ぶ。
本明細書に記載の構築物および抗原結合単位の一部の実施形態では、本明細書に記載のCDRは、コチア番号付けに従って番号付けされた場合、おおよそ軽鎖可変ドメイン中の残基24〜34(CDR1)、49〜56(CDR2)および89〜97(CDR3)、ならびに重鎖可変ドメイン中の27〜35(CDR1)、49〜60(CDR2)および93〜102(CDR3)を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメイン中のCDR2は、コチア番号付けに従って番号付けされた場合、アミノ酸49〜56を含むことができる。
所望の標的に対する抗体または抗体断片を生成およびスクリーニングする方法は当該技術分野において周知である。増進した特性(例えば、増進した親和性、キメラ化、ヒト化)のために抗体または抗体断片をさらに改変する他に、本明細書に記載されるような抗原結合性断片を生成する方法もまた当該技術分野において周知である。
キメラ抗体または抗体断片という用語は、重鎖および/または軽鎖の成分が具体的な供給源または種に由来し、重鎖および/または軽鎖の残余が異なる供給源または種に由来する、抗体または抗体断片を指す。
ヒト化形態の非ヒト抗体または抗体断片は、非ヒト抗体または抗体断片に由来する最小の配列を含有するキメラ抗体または抗体断片である。ヒト化抗体は、一般にヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)であって、1つまたは複数のCDRからの残基が非ヒト抗体(ドナー抗体)の1つまたは複数のCDRからの残基により置き換えられたものである。ドナー抗体は、所望の特異性、親和性、または生物学的効果を有するマウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、または非ヒト霊長動物抗体などの任意の好適な非ヒト抗体であることができる。一部の事例では、レシピエント抗体の選択されたフレームワーク領域残基は、ドナー抗体の対応するフレームワーク領域残基により置き換えられる。ヒト化抗体または抗体断片はまた、レシピエント抗体中にもドナー抗体中にも見出されない残基を含むことができる。そのような改変は、抗体機能をさらに精密化するために行うことができる。(ジョーンズら(Jones et al.)(1986) Nature 321:522−525;ライヒマンら(Riechmann et al.)(1988) Nature, 332:323−329;およびプレスタ(Presta)(1992) Curr. Op. Struct. Biol., 2:593−596を参照)。
ヒト抗体または抗体断片は、ヒトもしくはヒト細胞により産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する、またはヒト抗体レパートリーもしくはヒト抗体コーディング配列(例えば、ヒト供給源から得られるもしくはde novoで設計される)を利用する非ヒト供給源に由来するものである。ヒト抗体または抗体断片はヒト化抗体または抗体断片を特に除外する。
一部の実施形態では、抗体分子は、ダイアボディおよび一本鎖分子の他に、抗体の抗原結合性断片(例えば、Fab、F(ab’)2、およびFv)を含む。例えば、抗体分子は、重(H)鎖可変ドメイン配列(本明細書においてVHと略記される)、および軽(L)鎖可変ドメイン配列(本明細書においてVLと略記される)を含むことができる。一部の実施形態では、抗体分子は1つの重鎖および1つの軽鎖を含むまたはからなる(半抗体と称される)。別の例では、抗体分子は2つの重鎖可変ドメイン配列および2つの軽鎖可変ドメイン配列を含み、それにより、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc、Fd、Fd’、Fv、単鎖抗体(例えば、scFv)、単一可変ドメイン抗体、ダイアボディ(Dab)(二価および二重特異性)、ならびにキメラ(例えば、ヒト化)抗体などの2つの抗原結合部位を形成し、これは全体抗体の改変により製造することができ、または組換えDNA技術を使用してde novoで合成されたものであり得る。これらの機能性抗体断片は、それらの各々の抗原と選択的に結合する能力を保持する。抗体および抗体断片は、IgG、IgA、IgM、IgD、およびIgEが挙げられるがそれに限定されない抗体の任意のクラスから、ならびに抗体の任意のサブクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2)からのものであることができる。抗体分子の調製物はモノクローナルまたはポリクローナルであることができる。抗体分子はまた、ヒト、ヒト化、CDRグラフト、またはin vitro生成抗体であることができる。抗体は、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4から選ばれる重鎖定常領域を有することができる。抗体はまた、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖のいずれかから選ばれる軽鎖を有することができる。
抗体分子の抗原結合性断片または抗原結合性部分は当該技術分野において周知であり、例えば、(i)VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価断片であるFab断片;(ii)ヒンジ領域においてジスルフィドブリッジにより連結された2つのFab断片を含む二価断片であるF(ab’)2断片;(iii)VHおよびCH1ドメインからなるFd断片;(iv)抗体の単一のアームのVLおよびVHドメインからなるFv断片、(v)VHドメインからなるダイアボディ(dAb)断片;(vi)ラクダ科動物もしくはラクダ化可変ドメイン;(vii)単鎖Fv(scFv)(例えば、バードら(Bird et al.)(1988)Science 242:423−426;ヒューストンら(Huston et al.)(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879−5883を参照);または(viii)単一ドメイン抗体を含む。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技術を使用して得ることができ、断片は、インタクトな抗体と同じ方式で有用性についてスクリーニングすることができる。
抗体分子はまた、単一ドメイン抗体であることができる。単一ドメイン抗体は、その相補性決定領域(complementary determining regions)が単一ドメインポリペプチドの部分である抗体を含むことができる。例としては、重鎖抗体、軽鎖を天然に欠いた抗体、従来の4鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、操作された抗体および抗体に由来するもの以外の単一ドメインスキャフォールドが挙げられるがそれに限定されない。単一ドメイン抗体は、当該技術分野において公知の任意のものまたは任意の将来的な単一ドメイン抗体であることができる。単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、およびウシが挙げられるがそれに限定されない任意の種に由来することができる。単一ドメイン抗体は、例えば、国際公開第94/04678号に開示されている。明瞭性の理由から、天然に軽鎖を欠いた重鎖抗体に由来するこの可変ドメインは、4鎖免疫グロブリンの従来のVHからそれを区別するために本明細書においてVHHまたはナノボディとして知られる。そのようなVHH分子は、ラクダ科の種(例えば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、およびグアナコ)またはラクダ科以外の種において生じた抗体に由来することができる。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、少なくとも2つの抗原に対する特異性を有するが任意選択で2つより多くの結合部位を有する、二重特異性抗体を含む。二重特異性抗体分子は、第1の抗原(例えば、BCMAまたは他の腫瘍もしくはB系列細胞抗原)に対する結合特異性を有する第1の免疫グロブリン可変ドメイン配列および第2の抗原(例えば、NKp30)に対する結合特異性を有する第2の免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。一部の実施形態では、二重特異性抗体分子は、第1の抗原に対する結合特異性を有するscFvまたはその断片および第2の抗原に対する結合特異性を有するscFvまたはその断片を含む(例えば、コンターマン(Kontermann)およびブリンクマン(Brinkmann)(2015) Drug Discovery Today 20(7):838−47を参照)。
様々な二重特異性抗体フォーマットが当該技術分野において公知であり、これには、例えば、本明細書に記載される、二重特異性IgG、二重特異性抗体断片、二重特異性融合タンパク質、付加型IgG、および二重特異性抗体コンジュゲートが含まれる。本開示の文脈において使用することができる例示的な二重特異性フォーマットとしては、例えば、scFvベースまたはダイアボディ二重特異性フォーマット、IgG−scFv融合物、デュアル可変ドメイン(DVD)−lg、クアドローマ、ノブ−イントゥー−ホール(knobs−into−holes)、共通の軽鎖(例えば、ノブ−イントゥー−ホールを有する共通の軽鎖など)、CrossMab、CrossFab、(SEED)body、ロイシンジッパー、Duobody、lgG1/lgG2、二重作用性Fab(DAF)−lgG、およびMab2二重特異性フォーマットが挙げられるがそれに限定されない(例えば、以上のフォーマットの総説について、クラインら(Klein et al.)(2012)mAbs 4:6、1−11、およびそこで引用されている参考文献を参照;シュピースら(Spiess et al.)(2015)Mol. Immunol. 67:95−106も参照)。二重特異性抗体はまた、ペプチド/核酸コンジュゲーションを使用して構築することができ、例えば、直交化学反応性を有する非天然アミノ酸を使用して部位特異的抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを生成し、それを次に、定義される組成、価数、および幾何学形状を有するマルチマー複合体に自己アセンブルさせる。(例えば、カザンら(Kazane et al.)(2013) J. Am. Chem. Soc. 135(1):340−6を参照)。一部の実施形態では、本明細書に開示される多重特異性抗原結合性構築物は、共通の軽鎖を含む抗体を含む。本明細書に記載の構築物において使用される共通の軽鎖のアミノ酸配列の非限定的な例としては、配列番号8および配列番号81が挙げられる。
ある特定の実施形態では、抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、米国特許第7,517,966号明細書(その内容および配列の全体を参照により本願明細書に援用する)に記載の抗NKp30抗体といった、公知の抗体または公知のNKp30抗体のCDRを含む。任意選択で、NKp30抗体は、コレクシオン・ナショナル・ドゥ・キュルチュール・ドゥ・ミクロオルガニスム(Collection Nationale De Cultures De Micro−organismes)(CNCM)登録番号1−2576を有するハイブリドーマにより産生されるヒト化バージョンの抗体である。
ある特定の実施形態では、抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、国際公開第2018138032号、国際公開第2017114694号、国際公開第2016207278号、国際公開第2016207273号、国際公開第2015197593号、国際公開第2015197598号、国際公開第2015197582号、米国特許出願公開第20150376274号明細書、米国特許出願公開第20180207290号明細書、および国際公開第2018047154号(それぞれの内容および配列の全体を参照により本願明細書に援用する)のいずれかに記載の抗NKp46抗体といった、公知のNKp46抗体または公知のNKp46抗体のCDRを含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、国際公開第2018148447号、国際公開第2018035330号、国際公開第2010017103号、および米国特許第9,273,136号明細書(それぞれの内容および配列の全体を参照により本願明細書に援用する)のいずれかに記載の抗NKG2D抗体といった、公知の抗体または公知のNKG2D抗体のCDRを含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、国際公開第2017205745号、米国特許出願公開第20160244528号明細書、国際公開第2016134358号、米国特許出願公開第20170226215号明細書、および国際公開第2018191502号(それぞれの内容および配列の全体を参照により本願明細書に援用する)のいずれかに記載の抗CD137抗体といった、公知の抗体または公知のCD137抗体のCDRを含む。
ある特定の実施形態では、第1の抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、腫瘍抗原に対する公知の抗体または公知の抗体のCDRを含む。例として、米国食品医薬品局(U.S. Food and Drug Administration)および/または欧州医薬品庁(European Medicines Agency)によりがん療法における使用のために現在承認されている例示的な腫瘍抗原標的化抗体の商標名および一般名としては以下が挙げられるがそれに限定されない:レムトラーダ(LEMTRADA)(登録商標)(アレムツズマブ、サノフィジェンザイム(SanofiGenzyme);例えば、キーティングら(Keating et al.)(2002)Blood 99(10):3556−3561;ヒルメンら(Hillmen et al.)(2007)J. Clin. Oncol. 25(35):5616−5623)を参照;アバスチン(AVASTIN)(登録商標)(ベバシズマブ、ジェネンテック(Genentech);例えば、フェラーラ(Ferrara et al.)(2005)Biochem. Biophys. Res. Commun. 333(2):328−335)を参照;アドセトリス(ADCETRIS)(登録商標)(ブレンツキシマブベドチン、シアトル・ジェネティクス(Seattle Genetics);例えば、ユーネスら(Younes et al.)(2010)N. Engl. J. Med. 363(19):1812−1821;センターら(Senter et al.)(2012)Nat.Biotechnol. 30(7):631−637)を参照;レモバブ(REMOVAB)(登録商標)(カツマキソマブ、フレゼニウスバイオテック(Fresenius Biotech);例えば、サイメッツ(Seimetz)(2011)J. Cancer 2:309−316)を参照;アービタックス(ERBITUX)(登録商標)(セツキシマブ、エリリリー(Eli Lilly);例えば、ウォン(Wong)(2005)Clin. Ther.27(6):684−694)を参照;ゼヴァリン(ZEVALIN)(登録商標)(イブリツモマブチウキセタン、スペクトラムファーマシューティカルズ(Spectrum Pharmaceuticals);例えば、ヴィジッヒら(Witzig et al.)(2002)J. Clin. Oncol. 20(10):2453−2463;マーカス(Marcus)(2005)Semin. Oncol.32(1 Suppl 1:S36−43)を参照;ベクティビックス(VECTIBIX)(登録商標)(パニツムマブ、アムジェン(Amgen);例えば、チュー(Chu)(2006)Clin. Colorectal Cancer 6(1):13;ファン・クッツェムら(Van Cutsem et al.)(2007)J. Clin. Oncol. 25(13):1658−1664)を参照;パージェタ(PERJETA)(登録商標)(ペルツズマブ、ジェネンテック(Genentech);バセルガら(Baselga et al.)(2012)N. Engl. J. Med. 366(2):109−119;アグスら(Agus et al.)(2005)J. Clin. Oncol. 23(11):2534−2543)を参照;リツキサン(RITUXAN)(登録商標)(リツキシマブ、バイオジェン(Biogen);例えば、フジエール(Feugier)(2015)Future Oncol.11(9):1327−1342)を参照;アーゼラ(ARZERRA)(登録商標)(オファツムマブ、ノバルティス(Novartis);例えば、ティーリングら(Teeling et al.)(2006)J. Immunol. 177(1):362−371;ティーリングら(Teeling et al.)(2004)Blood 104(6):1793−1800)を参照;ガザイバ(GAZVYA)(登録商標)(オビヌツズマブ、ジェネンテック(Genentech);例えば、モスネルら(Mossner et al.)(2010)Blood 115(22):4393−4402;ゴレイら(Golay et al.)(2013)Blood 122(20):3482−3491;ゲーデら(Goede et al.)(2014)N. Engl. J. Med. 370(12):1101−1110;レディーら(Reddy et al.)(2017)Rheumatology(Oxford)56(7):1227−1237)を参照;オクレバス(OCREVUS)(登録商標)(オクレリズマブ、ジェネンテック(Genentech);例えば、ライヒェルト(Reichert)(2017)MAbs 9(2):167−181;モンタルバン(Montalban)(2016)N. Engl. J. Med. 376(3):209−220)を参照;ポルトラザ(PORTRAZZA)(登録商標)(ネシツムマブ、エリリリー(Eli Lilly);例えば、ディーンストマン(Dienstmann)およびタベルネロ(Tabernero)(2010)Curr. Opin. Investig. Drugs 11(12):1434−1441)を参照;ハーセプチン(HERCEPTIN)(登録商標)(トラスツズマブ、ジェネンテック(Genentech);例えば、スラモンら(Slamon et al.)(2001)N. Engl. J. Med. 344(11):783−792を参照;マキシミアノら(Maximiano et al.)(2016)BioDrugs 30(2):75−86)を参照;カドサイラ(KADCYLA)(登録商標)(アドトラスツズマブエムタンシン、ジェネンテック(Genentech);例えば、ヴェルマら(Verma et al.)(2012)N. Engl. J. Med. 367(19):1783−1791;クロップら(Krop et al.)(2014)15(7):689−699)を参照;ダラザレックス(DARZALEX)(登録商標)(ダラツムマブ、ヤンセン(Janssen);例えば、ド・ヴェーアら(de Weers et al.)(2011)J. Immunol. 186(3):1840−1848;ロニアルら(Lonial et al.)(2016)Lancet 387(10027):1551−1560)を参照;ユニツキシン(UNITUXIN)(登録商標)(ジヌツキシマブ、ユナイテッド・セラピューティクス(United Therapeutics);例えば、ディロン(Dhillon)(2015)Drugs 75(8):923−927)を参照;およびラルトルボ(LARTRUVO)(登録商標)(オララツマブ、エリリリー(Eli Lilly);例えば、タップら(Tap et al.)(2016)Lancet 388(10043):488−497;シャーリー(Shirley)(2017)Drugs 77(1):107−112)を参照。
追加の例示的な腫瘍抗原標的化抗体としては、I−131−BC8(代替的にIomab−Bとして公知、アクチニウム・ファーマティクス(Actinium Pharmaceuticals)、タラコツズマブ(代替的にJNJ−56022473として公知、ジャンセン(Janssen))、バダスツキシマブ・タリリン(vadastuximab talirine)(シアトル・ジェネティクス(Seattle Genetics))、ウブリツキシマブ(TGセラピューティクス(TG Therapeutics))、モキセツモマブ・パスドトクス(moxetumomab pasudotox)(アストラゼネカ(AstraZeneca)/メドイミュン(MedImmune))、XMAB−5574(代替的にMOR208として公知、キセンコル(Xencor))、オポルツズマブ・モナトクス(oportuzumab monatox)(ヴィヴェンティア・バイオ(Viventia Bio))、マルゲツキシマブ(マクロジェニックス(MacroGenics))、MM−302(メリマック・ファーマシューティカルズ(Merrimack Pharmaceuticals))、サシツズマブ・ゴビテカン(イミュノディクス、インク(Immunomedics, Inc.))、グレムバツムマブ・ベドチン(glembatumumab vedotin)(セルデックス・セラピューティクス(Celldex Therapeutics))、アンデカリキシマブ(ギリアード・サイエンシズ(Gilead Sciences))、デパツキシズマブ・マホドチン(アッヴィ(AbbVie))、トレメリムマブ(アストラゼネカ(AstraZeneca)/メドイミュン(MedImmune))、ラコツモマブ(レコンビオ・エスエル(Recombio SL))、アネツマブ・ラブタンシン(バイエル(Bayer))、ミルベツキシマブ・ソラブタンシン(mirvetuximab sorvtansine)(イミュノジェン(ImmunoGen))、およびカロツキシマブ(トラコン・ファーマ(TRACON Pharma))が挙げられるがそれに限定されず、これらの全てはライヒェルト(Reichert)(2017)MAbs 9(2):167−181(参照により全体を本願明細書に援用する)にさらに記載されている。
ある特定の実施形態では、第1の抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、任意選択で1つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有する、配列番号2のCDRH1、CDRH2、およびCDRH3を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号1のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む軽鎖可変領域を含む。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野において定義されており、これには、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。そのため、結合性ポリペプチド中の必須でないアミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えられる。ある特定の実施形態では、アミノ酸の連なりは、側鎖ファミリーメンバーの順序および/または組成において異なる構造的に類似した連なりで置き換えることができる。代替的に、ある特定の実施形態では、飽和突然変異誘発などにより、コーディング配列の全体または部分に沿って無作為に突然変異が導入されてもよく、結果として生じる突然変異体は、本明細書に記載されるような抗原結合単位に組み込み、所望の標的に結合する能力についてスクリーニングすることができる。
一部の態様では、第1の抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号2に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号1に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一部の態様では、多重特異性抗原結合性構築物は、配列番号2に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む少なくとも1つの重鎖を含む。ある特定の態様では、多重特異性抗原結合性構築物は、配列番号2のアミノ酸配列を含む少なくとも1つの重鎖を含む。一部の態様では、多重特異性抗原結合性構築物は、配列番号1に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む少なくとも1つの軽鎖を含む。任意選択で、多重特異性抗原結合性構築物は、配列番号1のアミノ酸配列を含む少なくとも1つの軽鎖を含む。配列に関する同一性または類似性は、配列をアライメントし、必要な場合にはギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後の、出発アミノ酸残基と同一(すなわち、同じ残基)の候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。本明細書において使用される場合、少なくとも90%の同一性は、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、および少なくとも99%同一、ならびに包括的に90%〜100%のあらゆるパーセンテージを含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、米国特許第7,517,966号明細書に記載のNKp30抗体のCDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む。一部の実施形態では、抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、米国特許第7,517,966号明細書に記載の抗体の重鎖に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む重鎖および米国特許第7,517,966号明細書に記載の抗体の軽鎖に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、国際公開第2018138032号、国際公開第2017114694号、国際公開第2016207278号、国際公開第2016207273号、国際公開第2015197593号、国際公開第2015197598号、国際公開第2015197582号、米国特許出願公開第20150376274号明細書、米国特許出願公開第20180207290号明細書、および国際公開第2018047154号のいずれかに記載のNKp46抗体のCDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む。一部の実施形態では、抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、国際公開第2018138032号、国際公開第2017114694号、国際公開第2016207278号、国際公開第2016207273号、国際公開第2015197593号、国際公開第2015197598号、国際公開第2015197582号、米国特許出願公開第20150376274号明細書、米国特許出願公開第20180207290号明細書、および国際公開第2018047154号のいずれかに記載の抗体の重鎖に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む重鎖ならびに国際公開第2018138032号、国際公開第2017114694号、国際公開第2016207278号、国際公開第2016207273号、国際公開第2015197593号、国際公開第2015197598号、国際公開第2015197582号、米国特許出願公開第20150376274号明細書、米国特許出願公開第20180207290号明細書、および国際公開第2018047154号のいずれかに記載の抗体の軽鎖に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、国際公開第2018148447号、国際公開第2018035330号、国際公開第2010017103号、および米国特許第9,273,136号明細書のいずれかに記載のNKG2D抗体のCDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む。一部の実施形態では、抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、国際公開第2018148447号、国際公開第2018035330号、国際公開第2010017103号、および米国特許第9,273,136号明細書のいずれかに記載の抗体の重鎖に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む重鎖ならびに国際公開第2018148447号、国際公開第2018035330号、国際公開第2010017103号、および米国特許第9,273,136号明細書のいずれかに記載の抗体の軽鎖に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、国際公開第2017205745号、米国特許出願公開第20160244528号明細書、国際公開第2016134358号、米国特許出願公開第20170226215号明細書、および国際公開第2018191502号のいずれかに記載のCD137抗体のCDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3を含む。一部の実施形態では、抗原結合単位の抗体またはその抗原結合性断片は、国際公開第2017205745号、米国特許出願公開第20160244528号明細書、国際公開第2016134358号、米国特許出願公開第20170226215号明細書、および国際公開第2018191502号のいずれかに記載の抗体の重鎖に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む重鎖ならびに国際公開第2017205745号、米国特許出願公開第20160244528号明細書、国際公開第2016134358号、米国特許出願公開第20170226215号明細書、および国際公開第2018191502号のいずれかに記載の抗体の軽鎖に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、BCMAまたはHER2などの腫瘍抗原のためのCDRH配列の他に、NKp30のためのCDRH配列の両方を含む重鎖の少なくとも1つのコピーを含む。
一部の態様では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物において使用することができる新規の抗体およびその抗原結合性断片もまた本明細書において提供される。換言すれば、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の1つまたは複数の抗原結合単位は、本明細書に記載の新規の抗体のいずれかに由来するまたはそれから選択される重鎖および/もしくは軽鎖CDR、重鎖および/もしくは軽鎖可変領域、ならびに/または全長重鎖および/もしくは軽鎖を含むことができる。
BCMA結合性抗体およびその抗原結合性部分
よって、(i)配列番号38(YTFX1X2X3YX4Hであり、X1はTまたはSであり、X2はNまたはSであり、X3はYまたはHであり、X4はMまたはVである)を含むCDRH1、(ii)配列番号39(GX5IDPSX6GX7TX8YAであり、X5はVまたはIであり、X6はGまたはDであり、X7はG、YまたはSであり、X8はNまたはSである)を含むCDRH2、および(iii)配列番号40(ARGRYDYX9DYLGWFDX10であり、X9はGまたはSであり、X10はPまたはGである)を含むCDRH3を含む重鎖可変領域を含む、ヒトBCMAに特異的に結合する新規の抗体またはその抗原結合性部分が本明細書において提供される。一部の実施形態では、ヒトBCMAに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、(i)配列番号19を含むCDRL1、(ii)配列番号20を含むCDRL2、および(iii)配列番号43を含むCDRL3を含む軽鎖可変領域をさらに含む。そのような重鎖および軽鎖CDRを有する抗体の代表的な例は、mAb1、mAb2、mAb3、mAb4、mAb5、mAb6、およびmAb7である。
よって、(i)配列番号38(YTFX1X2X3YX4Hであり、X1はTまたはSであり、X2はNまたはSであり、X3はYまたはHであり、X4はMまたはVである)を含むCDRH1、(ii)配列番号39(GX5IDPSX6GX7TX8YAであり、X5はVまたはIであり、X6はGまたはDであり、X7はG、YまたはSであり、X8はNまたはSである)を含むCDRH2、および(iii)配列番号40(ARGRYDYX9DYLGWFDX10であり、X9はGまたはSであり、X10はPまたはGである)を含むCDRH3を含む重鎖可変領域を含む、ヒトBCMAに特異的に結合する新規の抗体またはその抗原結合性部分が本明細書において提供される。一部の実施形態では、ヒトBCMAに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、(i)配列番号19を含むCDRL1、(ii)配列番号20を含むCDRL2、および(iii)配列番号43を含むCDRL3を含む軽鎖可変領域をさらに含む。そのような重鎖および軽鎖CDRを有する抗体の代表的な例は、mAb1、mAb2、mAb3、mAb4、mAb5、mAb6、およびmAb7である。
そのため、一部の態様では、配列番号11の重鎖CDR1、配列番号12の重鎖CDR2、および配列番号41の重鎖CDR3を含むヒトBCMAに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分が本明細書において提供される。一部の実施形態では、ヒトBCMAに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号19の軽鎖CDR1、配列番号20の軽鎖CDR2、および配列番号43の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域をさらに含む。そのようなCDRを有する代表的な抗体はmAb1である。
一部の態様では、配列番号44の重鎖CDR1、配列番号45の重鎖CDR2、および配列番号46の重鎖CDR3を含むヒトBCMAに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分が本明細書において提供される。一部の実施形態では、ヒトBCMAに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号19の軽鎖CDR1、配列番号20の軽鎖CDR2、および配列番号43の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域をさらに含む。そのようなCDRを有する代表的な抗体はmAb2である。
一部の態様では、配列番号47の重鎖CDR1、配列番号48の重鎖CDR2、および配列番号46の重鎖CDR3を含むヒトBCMAに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分が本明細書において提供される。一部の実施形態では、ヒトBCMAに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号19の軽鎖CDR1、配列番号20の軽鎖CDR2、および配列番号43の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域をさらに含む。そのようなCDRを有する代表的な抗体はmAb3である。
一部の態様では、配列番号11の重鎖CDR1、配列番号45の重鎖CDR2、および配列番号49の重鎖CDR3を含むヒトBCMAに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分が本明細書において提供される。一部の実施形態では、ヒトBCMAに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号19の軽鎖CDR1、配列番号20の軽鎖CDR2、および配列番号43の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域をさらに含む。そのようなCDRを有する代表的な抗体はmAb4である。
一部の態様では、配列番号11の重鎖CDR1、配列番号50の重鎖CDR2、および配列番号41の重鎖CDR3を含むヒトBCMAに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分が本明細書において提供される。一部の実施形態では、ヒトBCMAに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号19の軽鎖CDR1、配列番号20の軽鎖CDR2、および配列番号43の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域をさらに含む。そのようなCDRを有する代表的な抗体はmAb5である。
一部の態様では、配列番号44の重鎖CDR1、配列番号50の重鎖CDR2、および配列番号41の重鎖CDR3を含むヒトBCMAに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分が本明細書において提供される。一部の実施形態では、ヒトBCMAに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号19の軽鎖CDR1、配列番号20の軽鎖CDR2、および配列番号43の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域をさらに含む。そのようなCDRを有する代表的な抗体はmAb6およびmAb7である。
本明細書に記載の構築物、抗体、およびその抗原結合性部分の一部の態様および実施形態では、ヒトBCMAに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号10、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、および配列番号57のいずれか1つに対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、ヒトBCMAに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号18に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一部のそのような実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号10、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、および配列番号57のいずれか1つから15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部のそのような実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号18から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のヒトBCMAに特異的に結合する構築物、抗体、およびその抗原結合性部分のCDRは、コチア番号付けに従って番号付けされた場合、おおよそ軽鎖可変ドメイン中の残基24〜34(CDR1)、50〜56(CDR2)および89〜97(CDR3)、ならびに重鎖可変ドメイン中の27〜35(CDR1)、49〜60(CDR2)および93〜102(CDR3)を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメイン中のCDR2は、コチア番号付けに従って番号付けされた場合、アミノ酸49〜56を含むことができる。
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号10、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、および配列番号57のいずれか1つの重鎖可変領域の3つの重鎖CDR、ならびに配列番号18の軽鎖可変領域の3つの軽鎖CDRを含む、ヒトBCMAに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号10、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、および配列番号57のいずれか1つの重鎖可変領域の重鎖CDR、ならびに配列番号18の軽鎖可変領域の軽鎖CDRを含み、重鎖および軽鎖CDR残基がカバットに従って番号付けされたものである、ヒトBCMAに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号10、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、および配列番号57のいずれか1つの重鎖可変領域の重鎖CDR、ならびに配列番号18の軽鎖可変領域の軽鎖CDRを含み、重鎖および軽鎖CDR残基がコチアに従って番号付けされたものである、ヒトBCMAに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号10、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、および配列番号57のいずれか1つの重鎖可変領域の重鎖CDR、ならびに配列番号18の軽鎖可変領域の軽鎖CDRを含み、重鎖および軽鎖CDR残基がマッカラムに従って番号付けされたものである、ヒトBCMAに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号10、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、および配列番号57のいずれか1つの重鎖可変領域の重鎖CDR、ならびに配列番号18の軽鎖可変領域の軽鎖CDRを含み、重鎖および軽鎖CDR残基がAbMに従って番号付けされたものである、ヒトBCMAに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
開示はまた、一部の実施形態では、配列番号10、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、および配列番号57のいずれか1つの重鎖可変領域の重鎖CDR、ならびに配列番号18の軽鎖可変領域の軽鎖CDRを含み、重鎖および軽鎖CDR残基がIMGTに従って番号付けされたものである、ヒトBCMAに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本明細書に記載の構築物、抗体、およびその抗原結合性部分の一部の態様および実施形態では、ヒトBCMAに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号51、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、および配列番号102のいずれか1つに対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む重鎖領域を含む。一部の実施形態では、ヒトBCMAに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号8に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む。一部のそのような実施形態では、重鎖領域は、配列番号51、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、および配列番号102のいずれか1つから15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部のそのような実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号8から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
本開示はまた、ヒトBCMAに結合した場合、配列番号10、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、および配列番号57のいずれか1つにおいて表される重鎖可変領域配列、ならびに配列番号18において表される軽鎖可変領域配列を含む抗ヒトBCMA抗体により結合されるアミノ酸残基の少なくとも1つ(at last one)に結合する、ヒトBCMAに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片を提供する。別の態様では、本開示は、ヒトBCMAに結合した場合、配列番号10、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、および配列番号57のいずれか1つにおいて表される重鎖可変領域配列、ならびに配列番号18において表される軽鎖可変領域配列を含む抗ヒトBCMA抗体の結合を交差遮断する、ヒトBCMAに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片を特徴とする。
NKp30結合抗体およびその抗原結合性部分
一部の態様では、配列番号15の重鎖CDR1、配列番号16の重鎖CDR2、および配列番号42の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、ヒトNKp30に特異的に結合する新規の抗体またはその抗原結合性部分もまた本明細書において提供される。一部の実施形態では、ヒトNKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号19の軽鎖CDR1、配列番号20の軽鎖CDR2、および配列番号43の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域をさらに含む。そのようなCDRを有する代表的な抗体はmAb8およびmAb9である。
一部の態様では、配列番号15の重鎖CDR1、配列番号16の重鎖CDR2、および配列番号42の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、ヒトNKp30に特異的に結合する新規の抗体またはその抗原結合性部分もまた本明細書において提供される。一部の実施形態では、ヒトNKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号19の軽鎖CDR1、配列番号20の軽鎖CDR2、および配列番号43の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域をさらに含む。そのようなCDRを有する代表的な抗体はmAb8およびmAb9である。
本明細書に記載の構築物の一部の態様および実施形態では、ヒトNKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号14もしくは配列番号25に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ならびに/または配列番号18に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一部のそのような実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号14または配列番号25から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部のそのような実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号18から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のヒトNKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分のCDRは、コチア番号付けに従って番号付けされた場合、おおよそ軽鎖可変ドメイン中の残基24〜34(CDR1)、50〜56(CDR2)および89〜97(CDR3)、ならびに重鎖可変ドメイン中の27〜35(CDR1)、49〜60(CDR2)および93〜102(CDR3)を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメイン中のCDR2は、コチア番号付けに従って番号付けされた場合、アミノ酸49〜56を含むことができる。
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号14または25の重鎖可変領域の3つの重鎖CDR、および配列番号18の軽鎖可変領域の3つの軽鎖CDRを含む、NKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号14または25の重鎖可変領域の重鎖CDR、および配列番号18の軽鎖可変領域の軽鎖CDRを含み、重鎖および軽鎖CDR残基がカバットに従って番号付けされたものである、NKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号14または25の重鎖可変領域の重鎖CDR、および配列番号18の軽鎖可変領域の軽鎖CDRを含み、重鎖および軽鎖CDR残基がコチアに従って番号付けされたものである、NKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号14または25の重鎖可変領域の重鎖CDR、および配列番号18の軽鎖可変領域の軽鎖CDRを含み、重鎖および軽鎖CDR残基がマッカラムに従って番号付けされたものである、NKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号14または25の重鎖可変領域の重鎖CDR、および配列番号18の軽鎖可変領域の軽鎖CDRを含み、重鎖および軽鎖CDR残基がAbMに従って番号付けされたものである、NKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号14または25の重鎖可変領域の重鎖CDR、および配列番号18の軽鎖可変領域の軽鎖CDRを含み、重鎖および軽鎖CDR残基がIMGTに従って番号付けされたものである、NKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本明細書に記載の構築物、抗体、およびその抗原結合性部分の一部の態様および実施形態では、ヒトNKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号64または配列番号101に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む重鎖領域を含む。一部の実施形態では、ヒトNKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号8に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む。一部のそのような実施形態では、重鎖領域は、配列番号64または配列番号101から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部のそのような実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号8から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、配列番号69の重鎖CDR1、配列番号70の重鎖CDR2、および配列番号71の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、ヒトNKp30に特異的に結合する新規の抗体またはその抗原結合性部分が本明細書において提供される。一部の実施形態では、ヒトNKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号19の軽鎖CDR1、配列番号20の軽鎖CDR2、および配列番号43の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域をさらに含む。そのようなCDRを有する代表的な抗体はmAb10である。
本明細書に記載の構築物の一部の態様および実施形態では、ヒトNKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号72に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および/または配列番号18に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一部のそのような実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号72から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部のそのような実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号18から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のヒトNKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分のCDRは、コチア番号付けに従って番号付けされた場合、おおよそ軽鎖可変ドメイン中の残基24〜34(CDR1)、50〜56(CDR2)および89〜97(CDR3)、ならびに重鎖可変ドメイン中の27〜35(CDR1)、49〜60(CDR2)および93〜102(CDR3)を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメイン中のCDR2は、コチア番号付けに従って番号付けされた場合、アミノ酸49〜56を含むことができる。
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号72の重鎖可変領域の3つの重鎖CDR、および配列番号18の軽鎖可変領域の3つの軽鎖CDRを含む、NKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号72の重鎖可変領域の重鎖CDR、および配列番号18の軽鎖可変領域の軽鎖CDRを含み、重鎖および軽鎖CDR残基がカバットに従って番号付けされたものである、NKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号72の重鎖可変領域の重鎖CDR、および配列番号18の軽鎖可変領域の軽鎖CDRを含み、重鎖および軽鎖CDR残基がコチアに従って番号付けされたものである、NKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号72の重鎖可変領域の重鎖CDR、および配列番号18の軽鎖可変領域の軽鎖CDRを含み、重鎖および軽鎖CDR残基がマッカラムに従って番号付けされたものである、NKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号72の重鎖可変領域の重鎖CDR、および配列番号18の軽鎖可変領域の軽鎖CDRを含み、重鎖および軽鎖CDR残基がAbMに従って番号付けされたものである、NKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号72の重鎖可変領域の重鎖CDR、および配列番号18の軽鎖可変領域の軽鎖CDRを含み、重鎖および軽鎖CDR残基がIMGTに従って番号付けされたものである、NKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本明細書に記載の構築物、抗体、およびその抗原結合性部分の一部の態様および実施形態では、ヒトNKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号73に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む重鎖領域を含む。一部の実施形態では、ヒトNKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号8に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む。一部のそのような実施形態では、重鎖領域は、配列番号73から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部のそのような実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号8から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
ヒトNKp30に結合した場合、配列番号72において示される重鎖可変領域配列および配列番号18において示される軽鎖可変領域配列を含む抗ヒトNKp30抗体により結合されるアミノ酸残基の少なくとも1つに結合する、ヒトNKp30に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片もまた提供される。本開示はまた、ヒトNKp30に結合した場合、配列番号72において示される重鎖可変領域配列および配列番号18において示される軽鎖可変領域配列を含む抗ヒトNKp30抗体の結合を交差遮断する、ヒトNKp30に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片を提供する。
一部の態様では、配列番号75の重鎖CDR1、配列番号76の重鎖CDR2、および配列番号77の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、ヒトNKp30に特異的に結合する新規の抗体またはその抗原結合性部分が本明細書において提供される。一部の実施形態では、ヒトNKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号80の軽鎖CDR1、軽鎖CDR2、および軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域をさらに含む。そのようなCDRを有する代表的な抗体はmAb11である。
本明細書に記載の構築物の一部の態様および実施形態では、ヒトNKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号78に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および/または配列番号80に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一部のそのような実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号78から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部のそのような実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号80から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のヒトNKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分のCDRは、コチア番号付けに従って番号付けされた場合、おおよそ軽鎖可変ドメイン中の残基24〜34(CDR1)、50〜56(CDR2)および89〜97(CDR3)、ならびに重鎖可変ドメイン中の27〜35(CDR1)、49〜60(CDR2)および93〜102(CDR3)を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメイン中のCDR2は、コチア番号付けに従って番号付けされた場合、アミノ酸49〜56を含むことができる。
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号78の重鎖可変領域の3つの重鎖CDR、および配列番号80の軽鎖可変領域の3つの軽鎖CDRを含む、NKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号78の重鎖可変領域の重鎖CDR、および配列番号80の軽鎖可変領域の軽鎖CDRを含み、重鎖および軽鎖CDR残基がカバットに従って番号付けされたものである、NKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号78の重鎖可変領域の重鎖CDR、および配列番号80の軽鎖可変領域の軽鎖CDRを含み、重鎖および軽鎖CDR残基がコチアに従って番号付けされたものである、NKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号78の重鎖可変領域の重鎖CDR、および配列番号80の軽鎖可変領域の軽鎖CDRを含み、重鎖および軽鎖CDR残基がマッカラムに従って番号付けされたものである、NKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号78の重鎖可変領域の重鎖CDR、および配列番号80の軽鎖可変領域の軽鎖CDRを含み、重鎖および軽鎖CDR残基がAbMに従って番号付けされたものである、NKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本開示はまた、一部の実施形態では、配列番号78の重鎖可変領域の重鎖CDR、および配列番号80の軽鎖の軽鎖CDRを含み、重鎖および軽鎖CDR残基がIMGTに従って番号付けされたものである、NKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
本明細書に記載の構築物、抗体、およびその抗原結合性部分の一部の態様および実施形態では、ヒトNKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号79に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む重鎖領域を含む。一部の実施形態では、ヒトNKp30に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号81に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む。一部のそのような実施形態では、重鎖領域は、配列番号79から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部のそのような実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号81から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
ヒトNKp30に結合した場合、配列番号78において示される重鎖可変領域配列および配列番号80において示される軽鎖可変領域配列を含む抗ヒトNKp30抗体により結合されるアミノ酸残基の少なくとも1つに結合する、ヒトNKp30に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片が本明細書において提供される。本開示はまた、ヒトNKp30に結合した場合、配列番号78において示される重鎖可変領域配列および配列番号80において示される軽鎖可変領域配列を含む抗ヒトNKp30抗体の結合を交差遮断する、ヒトNKp30に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片を提供する。
NKp30エピトープ結合
本開示はいかなる具体的な理論または作用機序によっても縛られないが、本明細書において実証されるように、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の優れた多面的な特性は、NKp30に結合してそれをアゴナイズする能力に部分的に由来すると考えられる。本明細書に記載の新規の多重特異性抗原結合性構築物は、NK細胞およびγδ T細胞などの免疫エフェクター細胞上のNKp30にエンゲージメントして、例えば、腫瘍微環境において、そのような免疫エフェクター細胞の活性化および結果的な炎症性サイトカインの産生、細胞傷害活性の増進、および免疫エフェクター細胞増殖を結果としてもたらす。本明細書において使用される場合、「腫瘍微環境」(代替的に「がん微環境」;「TME」と略記される)という用語は、腫瘍または新生物が存在する細胞環境または状況を指し、これには、周囲血管の他に、免疫細胞、線維芽細胞、骨髄由来炎症細胞、およびリンパ球が挙げられるがそれに限定されない非がん性細胞が含まれる。シグナル伝達分子および細胞外マトリックスもまたTMEを構成する。腫瘍および周囲微環境は密接に関連し、常に相互作用する。腫瘍は、細胞外シグナルを放出して腫瘍血管新生を促進し、末梢免疫寛容を誘導することにより微環境に影響を及ぼすことができ、微環境中の免疫細胞は腫瘍細胞の増殖および進化に影響することができる。
本開示はいかなる具体的な理論または作用機序によっても縛られないが、本明細書において実証されるように、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の優れた多面的な特性は、NKp30に結合してそれをアゴナイズする能力に部分的に由来すると考えられる。本明細書に記載の新規の多重特異性抗原結合性構築物は、NK細胞およびγδ T細胞などの免疫エフェクター細胞上のNKp30にエンゲージメントして、例えば、腫瘍微環境において、そのような免疫エフェクター細胞の活性化および結果的な炎症性サイトカインの産生、細胞傷害活性の増進、および免疫エフェクター細胞増殖を結果としてもたらす。本明細書において使用される場合、「腫瘍微環境」(代替的に「がん微環境」;「TME」と略記される)という用語は、腫瘍または新生物が存在する細胞環境または状況を指し、これには、周囲血管の他に、免疫細胞、線維芽細胞、骨髄由来炎症細胞、およびリンパ球が挙げられるがそれに限定されない非がん性細胞が含まれる。シグナル伝達分子および細胞外マトリックスもまたTMEを構成する。腫瘍および周囲微環境は密接に関連し、常に相互作用する。腫瘍は、細胞外シグナルを放出して腫瘍血管新生を促進し、末梢免疫寛容を誘導することにより微環境に影響を及ぼすことができ、微環境中の免疫細胞は腫瘍細胞の増殖および進化に影響することができる。
よって、エピトープマッピング解析を行って、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および抗体のNKp30への結合および機能的活性のために重要な残基を同定した。本明細書において使用される場合、「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、抗原結合性タンパク質(例えば、抗原結合単位、免疫グロブリン、抗体、またはその抗原結合性部分)が特異的に結合する抗原(例えば、NKp30)上の決定因子または部位を指す。タンパク質抗原のエピトープは「リニアエピトープ」および「コンホメーショナルエピトープ」に区分することができる。本明細書において使用される場合、「リニアエピトープ」という用語は、連結したアミノ酸の連続した直鎖状の配列から形成されるエピトープを指す。タンパク質抗原のリニアエピトープは、典型的には、化学変性剤(例えば、酸、塩基、溶媒、架橋試薬、カオトロピック剤、ジスルフィド結合還元剤)または物理変性剤(例えば、熱、放射能、もしくは機械的せん断もしくは応力)への曝露時に保持される。一部の実施形態では、エピトープは非直鎖状であり、断続的エピトープ(interrupted epitope)とも称される。本明細書において使用される場合、「コンホメーショナルエピトープ」または「非リニアエピトープ」という用語は、ポリペプチドの三次フォールディングにより並置された非連続のアミノ酸から形成されるエピトープを指す。コンホメーショナルエピトープは、典型的には、変性剤を用いた処理により喪失される。エピトープは、典型的には、特有の空間的コンホメーションにおいて少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、エピトープは、特有の空間的コンホメーションにおいて20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、または3個未満のアミノ酸を含む。一般に、具体的な標的分子に特異的な抗原結合単位、抗体、またはその抗原結合性部分は、タンパク質および/または高分子の複雑な混合物内の標的分子上の特定のエピトープを優先的に認識してそれに結合する。一部の実施形態では、エピトープは、ヒトNKp30の細胞外ドメインの全てのアミノ酸を含まない。
抗原結合性タンパク質、例えば、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、免疫グロブリン、抗体またはその抗原結合性部分と接触するまたはそれにより埋没する残基を含有するドメインまたは領域は、NKp30(例えば、配列番号7の野生型NKp30)中の特定の残基を突然変異させ、抗原結合性タンパク質が、突然変異したまたは変種NKp30タンパク質に結合できるかどうかを決定することにより同定することができる。多数の個々の突然変異を作製することにより、結合において直接的な役割を果たすまたは突然変異が抗原結合性タンパク質と抗原との結合に影響できるように抗原結合性タンパク質に十分に密接に近接している残基を同定することができる。これらのアミノ酸の知識から、抗原結合性タンパク質と接触するまたは抗体により覆われる残基を含有する抗原のドメインまたは領域を解明することができる。そのようなドメインは抗原結合性タンパク質の結合性エピトープを含むことができる。この一般のアプローチの1つの特定の例はアラニン/アルギニンスキャニングプロトコールを利用する(例えば、ナネヴィッツ、ティーら(Nanevicz, T. et al.),1995,J. Biol. Chem.,270:37,21619−21625およびズプニック、エーら(Zupnick, A. et al.),2006,J. Biol. Chem.,281:29,20464−20473を参照)。一般に、アルギニンは、荷電性でバルキーであり、そのため、突然変異が導入される抗原の領域において抗原結合性タンパク質と抗原との結合を妨害することがあるので、(典型的には個々に)野生型ポリペプチド中のアミノ酸の代替とされる。野生型抗原中に存在するアルギニンはアラニンで置き換えられる。様々なそのような個々の突然変異体が得られ、収集された結合結果が、いずれの残基が結合に影響するかを決定するために解析される。
そのため、本明細書に記載の具体的な抗体により認識されるエピトープの全体または部分(例えば、同じもしくはオーバーラップする領域または該領域の間もしくはそれにわたる領域)を含むNKp30上のエピトープに結合する抗原結合性タンパク質(例えば、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、免疫グロブリン、抗体またはその抗原結合性部分)もまた本明細書に記載の組成物および方法により包含される。そのような抗原結合性タンパク質抗体は、例えば、競合結合アッセイを含む、当該技術分野において公知の慣例的な技術を使用して同定することができる。
本明細書において実証されるように、NKp30に特異的に結合してNKp30の機能および活性をアゴナイズし、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物において使用することができる、複数の新規のNKp30抗体、すなわち、mAb8、mAb9、mAb10、およびmAb11が開発された。NKp30内のいずれのアミノ酸残基がmAb8、mAb10、およびmAb11のヒトNKp30への結合のために不可欠であるのかを決定するために、組み合わせたアラニンおよびアルギニンスキャニング突然変異誘発分析を行って、NKp30への抗体結合のために重要な残基を同定した。NKp30突然変異体は、NKp30の面上の表面露出したアミノ酸残基における単一点突然変異を用いて生成した。これらのHisタグ化NKp30突然変異体を次に、Octetにより測定した場合の、mAb8、mAb10、およびmAb11に結合する能力について試験した。
抗原結合性タンパク質と変種NKp30との結合における変更(例えば、低減または増加)は、本明細書において使用される場合、(例えば、実施例において以下に記載されるように、Biacore試験もしくはOctetなどの公知の方法により測定された場合の)結合親和性、EC50における変化、および/または抗原結合性タンパク質の総結合能力における変化(例えば、低減))があることを意味する。結合における有意な変更は、突然変異した残基が抗原結合性タンパク質への結合に直接的に関与することまたは結合性タンパク質が抗原に結合した場合に結合性タンパク質に密接に近接していることを指し示す。
一部の実施形態では、結合における有意な低減は、抗原結合性タンパク質と突然変異体NKp30抗原との間の結合親和性、EC50、および/または能力(capacity)が、抗原結合性タンパク質と野生型NKp30(例えば、配列番号7において示される)との間の結合と比べて10%より大きく、20%より大きく、40%より大きく、50%より大きく、55%より大きく、60%より大きく、65%より大きく、70%より大きく、75%より大きく、80%より大きく、85%より大きく、90%より大きくまたは95%より大きく低減されることを意味する。ある特定の実施形態では、結合は、検出可能な限界より低くまで低減される。一部の実施形態では、結合における有意な低減は、抗原結合性タンパク質の変種NKp30タンパク質への結合が、抗原結合性タンパク質と野生型NKp30タンパク質(例えば、配列番号7のタンパク質)との間で観察される結合の50%未満(例えば、40%、35%、30%、25%、20%、15%または10%未満)である場合に立証される。そのような結合の測定は、当該技術分野において公知の様々な結合アッセイを使用して行うことができる。1つのそのようなアッセイの特定の例は実施例37に記載されている。
mAb8について、I50、S82、およびL113は、これらの残基を突然変異させることはNKp30への結合の喪失を結果としてもたらしたので、NKp30への結合のために重要なアミノ酸残基として同定された。mAb10およびmAb11について、I50およびL113は、これらの残基を突然変異させることはNKp30への結合の喪失を結果としてもたらしたので、NKp30への結合のために重要なアミノ酸残基として同定された。図47Aは、NKp30の面上の表面露出したアミノ酸残基を含むNKp30の部分的なアミノ酸配列を含む表を示し、mAb8、mAb10、およびmAb11により結合されるエピトープを構成する残基は太字および下線文字で指し示される。図47Bは、残基I50、S82、およびL113を球として示したヒトNKp30のX線結晶学画像(左パネル)ならびに残基I50、S82、およびL113を球として示したB7−H6に結合したヒトNKp30のX線結晶学画像(右パネル)を表す。これらの図は、本明細書に記載のNKp30抗原結合性タンパク質は、NKp30のコンホメーショナルまたは非リニアエピトープに結合し、それにより、リガンド結合を遮断することを指し示す。
そのため、NKp30のNKp30リガンドへの結合を遮断する、配列番号7のアミノ酸残基I50、S82、およびL113の少なくとも1つに特異的に結合する多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分が本明細書において提供される。本明細書に記載のこれらの態様および全てのそのような態様の一部の実施形態では、NKp30リガンドは、BAG6、B7−H6、およびGal−3から選択される。本明細書に記載のこれらの態様および全てのそのような態様の一部の実施形態では、NKp30リガンドはB7−H6である。
本明細書に記載のこれらの態様および全てのそのような態様の一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号7の残基I50を含むヒトNKp30のエピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号7の残基S82を含むヒトNKp30のエピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号7の残基L113を含むヒトNKp30のエピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号7の残基I50およびL113を含むヒトNKp30のエピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号7の残基I50およびS82を含むヒトNKp30のエピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号7の残基S82およびL113を含むヒトNKp30のエピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号7の残基I50、S82、およびL113を含むヒトNKp30のエピトープに特異的に結合する。
本明細書に記載のこれらの態様および全てのそのような態様の一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分は、ヒトNKp30のエピトープに結合し、ヒトNKp30のエピトープへの結合についてmAb8と競合する。本明細書に記載のこれらの態様および全てのそのような態様の一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分は、ヒトNKp30のエピトープに結合し、ヒトNKp30のエピトープへの結合についてmAb10と競合する。本明細書に記載のこれらの態様および全てのそのような態様の一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分は、ヒトNKp30のエピトープに結合し、ヒトNKp30のエピトープへの結合についてmAb11と競合する。一部のそのような実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分は、NKp30に結合してそれをアゴナイズする。一部のそのような実施形態では、本開示により提供される多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分は、NKp30に結合してそれをアゴナイズし、NK細胞および/またはγδ T細胞などの免疫エフェクター細胞の活性化を共刺激する。
本開示は、本明細書に記載の1つまたは複数の具体的な参照抗体(例えば、mAb8、mAb10、またはmAb11)により認識されるエピトープの全体または部分を含むNKp30上のエピトープへの結合について競合する、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分を提供する。一部の実施形態では、提供する(provide)多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分は、ヒトNKp30のエピトープに結合し、ヒトNKp30のエピトープへの結合について参照抗体(例えば、mAb8、mAb10、またはmAb11)と競合し、1×10−6またはそれ未満の平衡解離定数KDでヒトNKp30に結合する。一部の実施形態では、エピトープに対する1つまたは複数の突然変異は、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分ならびに参照抗体(例えば、mAb8、mAb10、またはmAb11)の両方への結合を阻害、低減、または遮断する。一部の実施形態では、参照抗体は、本明細書に記載のmAb8抗体である。
一部の実施形態では、本開示により提供される多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分は、NKp30に結合した抗体、またはその断片もしくは部分を含む結晶構造のx線結晶学的解析を通じて評価することができる。一部の実施形態では、本開示により提供される抗体により結合されるエピトープは、抗体パラトープ残基、例えば、mAb8、mAb10、またはmAb11の4オングストローム(Å)以内に存在または位置するヒトNKp30抗原上の残基を決定することにより同定される。
一部の実施形態では、野生型NKp30タンパク質(例えば、配列番号7)中の残基がアルギニンまたはアラニンで置換されている変種NKp30タンパク質について有意により低い結合を呈する多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分が提供される。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質(例えば、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分)の結合は、野生型NKp30タンパク質(例えば、配列番号7)と比較して以下の突然変異:I50R、S82R、およびL113Rのいずれか1つまたは複数(例えば、1、2、3)を有する変種NKp30タンパク質について有意に低減している。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質の結合は、野生型NKp30タンパク質(例えば、配列番号7)と比較して、図47Aにおいて示されるように、以下の位置:50、82、および113において1つまたは複数(例えば、1、2、3)の置換を有する変種NKp30タンパク質について有意に低減している。一部の実施形態では、結合の低減は、EC50の変化として観察される。一部の実施形態では、EC50の変化はEC50の数値の増加(そのため結合の減少)である。一部の実施形態では、アミノ酸がNKp30エピトープの部分であるためには、結合は少なくとも10%低減しており、例えば、以下の量:少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%の少なくともいずれかの低減は、一部の実施形態では、残基がエピトープの部分であることを指し示すことができる。
一部の態様では、ヒトNKp30のエピトープが配列番号7のアミノ酸50〜113内にありまたはそれとオーバーラップし、アミノ酸残基I50、S82、およびL113における1つまたは複数の置換が抗体または抗原結合性部分のヒトNKp30への結合を妨害する、該エピトープに結合する多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、抗体またはその抗原結合性部分もまた本明細書において提供される。一部の実施形態では、エピトープはコンホメーショナルエピトープである。一部の実施形態では、エピトープはリニアエピトープである。
列記される変種形態は、配列番号7において示される野生型配列に関して参照されるが、NKp30のアレル変種において指し示される位置におけるアミノ酸は異なり得ることが理解されるであろう。NKp30のそのようなアレル形態について有意により低い結合を示す抗原結合性タンパク質もまた想定される。よって、一部の実施形態では、上記の任意の実施形態を、配列番号7の純粋に野生型の配列ではなくアレル配列と比較することができる。
上述のように、結合に直接的に関与するまたは抗原結合性タンパク質により覆われるアミノ酸残基は、スキャニングの結果から同定することができる。これらの残基は、そのため、抗原結合性タンパク質が結合する結合領域を含有する配列番号7のドメインまたは領域の表示を提供することができる。実施例37において要約される結果から見ることができるように、一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質は、配列番号7のアミノ酸:50、82、および113の少なくとも1つを含有するドメインに結合する。
一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質(例えば、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分)は、配列番号7のアミノ酸50、82、および113の少なくとも1つを含有する領域に結合する。一部の実施形態では、同定される残基の1つより多くは、抗原結合性タンパク質により結合される領域の部分である。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質はmAb8と競合する。
一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質(例えば、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分)は、配列番号7の少なくともI50を含有する領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質はmAb8、mb10、およびmAb11の1つまたは複数と競合する。
一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質(例えば、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分)は、配列番号7の少なくともS82を含有する領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質はmAb8と競合する。
一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質(例えば、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分)は、配列番号7の少なくともL113を含有する領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質はmAb8、mb10、およびmAb11の1つまたは複数と競合する。
一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質(例えば、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分)は、配列番号7の少なくともI50およびS82を含有する領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質はmAb8と競合する。
一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質(例えば、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分)は、配列番号7の少なくともI50およびL113を含有する領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質はmAb8、mb10、およびmAb11の1つまたは複数と競合する。
一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質(例えば、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分)は、配列番号7の少なくともS82およびL113を含有する領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質はmAb8と競合する。
一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質(例えば、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分)は、配列番号7の少なくともI50、S82、およびL113を含有する領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性タンパク質はmAb8と競合する。
別の態様では、NKp30への特異的結合について本明細書に記載のエピトープに対して例示される抗体またはその抗原結合性部分の1つと競合する抗原結合性タンパク質(例えば、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分)が提供される。そのような抗原結合性タンパク質はまた、本明細書に例示される抗原結合性タンパク質(例えば、多重特異性抗原結合性構築物、抗原結合単位、および単離された抗体またはその抗原結合性部分)の1つと同じエピトープ、またはオーバーラップするエピトープに結合することができる。例示される抗原結合性タンパク質(例えば、mAb8、mAb10、mAb11、または構築物1〜10のいずれか1つ)と競合しまたはそれと同じNKp30エピトープに結合する抗原結合性タンパク質は、類似した機能的特性を示すことが予期される。そのため、特定の例として、本明細書において提供される抗原結合性タンパク質としては、
(a)mAb8、mAb10、およびmAb11について本明細書に記載のCDRの6つ全て、
(b)mAb8、mAb10、mAb11、または構築物1〜10のいずれか1つについて本明細書に記載のVHおよびVL、
(c)mAb8、mAb10、mAb11、または構築物1〜10のいずれか1つについて指定されるような2つの軽鎖および2つの重鎖
を有する抗体または多重特異性抗原結合性構築物と競合するものが挙げられる。
(a)mAb8、mAb10、およびmAb11について本明細書に記載のCDRの6つ全て、
(b)mAb8、mAb10、mAb11、または構築物1〜10のいずれか1つについて本明細書に記載のVHおよびVL、
(c)mAb8、mAb10、mAb11、または構築物1〜10のいずれか1つについて指定されるような2つの軽鎖および2つの重鎖
を有する抗体または多重特異性抗原結合性構築物と競合するものが挙げられる。
多重特異性抗原結合性構築物
一部の態様では、本明細書に記載の組成物および方法において使用するための、NKp30およびBCMAに特異的に結合する多重特異性抗原結合性構築物もまた本明細書において提供される。例えば、構築物1は、ヒトBCMAおよびヒトNKp30に特異的に結合する多重特異性抗原結合性構築物である。構築物は、抗体の重鎖が、ポリ−GGGS(配列番号22)リンカーによって抗BCMA抗体のFc領域に接続された抗NKp30抗体(mAb8)の重鎖可変領域をそのC末端にさらに含む融合タンパク質である抗BCMA IgG1抗体(mAb1)を含有する。構築物の抗BCMA部分および抗NKp30部分の軽鎖は同一である。その構造が図1のイラストレーションにより表される構築物1は、配列番号9において表される重鎖配列および配列番号8において表される軽鎖配列を含む。
一部の態様では、本明細書に記載の組成物および方法において使用するための、NKp30およびBCMAに特異的に結合する多重特異性抗原結合性構築物もまた本明細書において提供される。例えば、構築物1は、ヒトBCMAおよびヒトNKp30に特異的に結合する多重特異性抗原結合性構築物である。構築物は、抗体の重鎖が、ポリ−GGGS(配列番号22)リンカーによって抗BCMA抗体のFc領域に接続された抗NKp30抗体(mAb8)の重鎖可変領域をそのC末端にさらに含む融合タンパク質である抗BCMA IgG1抗体(mAb1)を含有する。構築物の抗BCMA部分および抗NKp30部分の軽鎖は同一である。その構造が図1のイラストレーションにより表される構築物1は、配列番号9において表される重鎖配列および配列番号8において表される軽鎖配列を含む。
よって、一部の態様では、(i)配列番号9に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む重鎖領域および(ii)配列番号8に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む、BCMAおよびNKp30に特異的に結合する多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。一部の実施形態では、重鎖領域は、配列番号9から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖領域は、配列番号8から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
構築物2は、抗体の重鎖が、ポリ−GGGS(配列番号22)リンカーによって抗BCMA抗体のFc領域に接続された抗NKp30抗体(mAb9)の重鎖可変領域をそのC末端にさらに含む融合タンパク質である抗BCMA IgG1抗体を含む。構築物の抗BCMA部分および抗NKp30部分の軽鎖は同一である。その構造が図1のイラストレーションにより表される構築物2は、構築物1と同じ抗BCMA IgG1抗体部分、および構築物1と同じ軽鎖を含むが、構築物の抗NKp30抗体部分の可変領域配列(配列番号25)により異なる。
よって、一部の態様では、(i)配列番号24に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む重鎖領域および(ii)配列番号8に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む、BCMAおよびNKp30に特異的に結合する多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。一部の実施形態では、重鎖領域は、配列番号24から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖領域は、配列番号8から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
構築物3および4は、各構築物の重鎖のFc部分が(EU番号付けに従って番号付けされた)N297Aアミノ酸置換を含有する構築物1および2の非グリコシル化バージョン(「構築物1アグリコ」または「構築物2アグリコ」とも称される)である。例えば、構築物3は、配列番号26において表されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号8において表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。構築物4は、配列番号27において表されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号8において表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
よって、一部の態様では、(i)配列番号26または配列番号27に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む重鎖領域および(ii)配列番号8に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む、BCMAおよびNKp30に特異的に結合する多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。一部の実施形態では、重鎖領域は、配列番号26または配列番号27から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖領域は、配列番号8から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
構築物5は、抗体の重鎖が、ポリ−GGGS(配列番号22)リンカーによって抗BCMA抗体のFc領域に接続された抗NKp30抗体(mAb8)の重鎖可変領域をそのC末端にさらに含む融合タンパク質である親和性成熟した抗BCMA IgG1抗体(mAb3)を含む。構築物の抗BCMA部分および抗NKp30部分の軽鎖は同一である。構築物5は、配列番号65において表されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号8において表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
よって、一部の態様では、(i)配列番号65に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む重鎖領域および(ii)配列番号8に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む、BCMAおよびNKp30に特異的に結合する多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。一部の実施形態では、重鎖領域は、配列番号65から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖領域は、配列番号8から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
構築物6は、抗体の重鎖が、ポリ−GGGS(配列番号22)リンカーによって抗BCMA抗体のFc領域に接続された抗NKp30抗体(mAb8)の重鎖可変領域をそのC末端にさらに含む融合タンパク質である親和性成熟した抗BCMA IgG1抗体(mAb2)を含む。構築物の抗BCMA部分および抗NKp30部分の軽鎖は同一である。構築物6は、配列番号66において表されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号8において表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
よって、一部の態様では、(i)配列番号66に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む重鎖領域および(ii)配列番号8に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む、BCMAおよびNKp30に特異的に結合する多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。一部の実施形態では、重鎖領域は、配列番号66から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖領域は、配列番号8から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
構築物7は、抗体の重鎖が、伸長されたポリ−GGGS(配列番号22)リンカーによって抗BCMA抗体のFc領域に接続された抗NKp30抗体(mAb8)の重鎖可変領域をそのC末端にさらに含む融合タンパク質である抗BCMA IgG1抗体(mAb1)を含む非フコシル化構築物である。構築物の抗BCMA部分および抗NKp30部分の軽鎖は同一である。構築物7は、配列番号67において表されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号8において表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
よって、一部の態様では、(i)配列番号67に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む重鎖領域および(ii)配列番号8に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む、BCMAおよびNKp30に特異的に結合する多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。一部の実施形態では、重鎖領域は、配列番号67から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖領域は、配列番号8から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
構築物8は、抗体の重鎖が、ポリ−GGGS(配列番号22)リンカーによって抗BCMA抗体のFc領域に接続された抗NKp30抗体(mAb8)の重鎖可変領域をそのC末端にさらに含む融合タンパク質であり、重鎖のFc部分が(EU番号付けに従って番号付けされた)N297Aアミノ酸置換を含有する、親和性成熟した抗BCMA IgG1抗体(mAb3)を含む構築物5の非グリコシル化バージョンである。構築物の抗BCMA部分および抗NKp30部分の軽鎖は同一である。構築物8は、配列番号68において表されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号8において表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
よって、一部の態様では、(i)配列番号68に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む重鎖領域および(ii)配列番号8に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む、BCMAおよびNKp30に特異的に結合する多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。一部の実施形態では、重鎖領域は、配列番号68から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖領域は、配列番号8から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
構築物9(本明細書において構築物2Zと称されることもある)は、ヒトBCMAおよびヒトNKp30に特異的に結合する多重特異性抗原結合性構築物である。構築物は、抗体の重鎖が、ポリ−GGGS(配列番号22)リンカーによって抗BCMA抗体のFc領域に接続された抗NKp30抗体(mAb10)の重鎖可変領域をそのC末端にさらに含む融合タンパク質である抗BCMA IgG1抗体(mAb1)を含有する。構築物の抗BCMA部分および抗NKp30部分の軽鎖は同一である。構築物9は、配列番号74において表される重鎖配列および配列番号8において表される軽鎖配列を含む。
よって、一部の態様では、(i)配列番号74に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む重鎖領域および(ii)配列番号8に対して少なくとも90%同一(例えば、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一)のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む、BCMAおよびNKp30に特異的に結合する多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。一部の実施形態では、重鎖領域は、配列番号74から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖領域は、配列番号8から15アミノ酸もしくはそれ未満、14アミノ酸もしくはそれ未満、13アミノ酸もしくはそれ未満、12アミノ酸もしくはそれ未満、11アミノ酸もしくはそれ未満、10アミノ酸もしくはそれ未満、9アミノ酸もしくはそれ未満、8アミノ酸もしくはそれ未満、7アミノ酸もしくはそれ未満、6アミノ酸もしくはそれ未満、5アミノ酸もしくはそれ未満、4アミノ酸もしくはそれ未満、3アミノ酸もしくはそれ未満、2アミノ酸もしくはそれ未満、または1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を含む。
構築物10は、抗体の重鎖が、ポリ−GGGS(配列番号22)リンカーによって抗BCMA抗体のFc領域に接続された抗NKp30抗体(mAb8)の重鎖可変領域をそのC末端にさらに含む融合タンパク質である親和性成熟した抗BCMA IgG1抗体(mAb3)を含む非フコシル化構築物である。構築物の抗BCMA部分および抗NKp30部分の軽鎖は同一である。構築物10は、配列番号65において表されるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号8において表されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
非対称および対称の両方のアーキテクチャの多価および/または多重特異性抗体フォーマットなどの本明細書に記載の多価および/または多重特異性構築物を生成するために使用することができる様々なフォーマットおよび方法が当該技術分野において公知である。そのようなフォーマットの非限定的な例としては、以下が挙げられる:(i)Fcレス二重特異性抗体フォーマット、例えば、タンデム単鎖可変断片(scFv2、taFv)およびトリプルボディ、例えば、二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)および二重特異性キラー細胞エンゲージャー(BiKE)分子;単一ドメイン抗体を含む二重特異性単一ドメイン抗体融合タンパク質、例えば、VHまたはVLドメイン、VHH、VNARおよびナノボディ;ダイアボディおよびダイアボディ誘導体、例えば、タンデムダイアボディおよび二重親和性再標的化(dual−affinity retargeting)(DART)タンパク質;Fab融合タンパク質;および様々なタンパク質からのヘテロ二量体化ペプチドまたはミニ抗体、例えば、コイルドコイル構造を有するロイシンジッパーの使用を通じた他のFcレス融合タンパク質;(ii)非対称アーキテクチャを有する二重特異性IgG、例えば、2つの異なる抗体からの重鎖および軽鎖を有する非対称IgG;ノブ−イントゥー−ホールアプローチ、CH3ドメインのホモ二量体化を回避するための静電相互作用(ステアリング)、IgG1およびIgG2のヒンジ領域に電荷対を導入することによる優先的な重鎖ヘテロ二量体化、鎖交換操作ドメイン(strand−exchange engineered domain)(SEED)ヘテロ二量体、およびT細胞受容体に基づく抗体による二重特異性エンゲージメント(bispecific engagement by antibodies based on the T cell receptor)(BEAT)技術を使用した、非対称Fc領域を有する二重特異性IgG;非対称FcおよびCH3融合タンパク質;(iii)対称アーキテクチャを有する二重特異性抗体、例えば、scFvの融合による付加型IgG、ドメイン抗体およびスキャフォールドタンパク質の融合物、Fabアームの融合物、および追加の可変重鎖および軽鎖ドメインの融合物;改変されたIgG分子;対称FcおよびCH3ベース二重特異性抗体;および免疫グロブリン由来ホモ二量体化ドメインを使用した二重特異性抗体。例えば、「二重特異性抗体の製造(The making of bispecific antibodies)」、ブリンクマン(Brinkmann)およびコンターマン(Kontermann)、MABS 2017, Vol. 9:2, pp. 182−212(その内容の全体を参照により本願明細書に援用する)を参照。例えば、米国特許第5,731,168号明細書に記載の「ノブ・イン・ア・ホール」(knob in a hole)アプローチ;例えば、国際公開第09/089004号、国際公開第06/106905号および国際公開第2010/129304号に記載されるような静電ステアリングFcペアリング;例えば、国際公開第07/110205号に記載されるような鎖交換操作ドメイン(SEED)ヘテロ二量体形成;例えば、国際公開第08/119353号、国際公開第2011/131746号、および国際公開第2013/060867号に記載されるようなFabアーム交換;例えば、米国特許第4,433,059号明細書に記載されるような、例えば、アミン反応性基およびスルフヒドリル反応性基を有するヘテロ二官能性試薬を使用して二重特異性構造を生成するための抗体架橋による、二重抗体コンジュゲート;例えば、米国特許第4,444,878号明細書に記載されるような、2つの重鎖の間のジスルフィド結合の還元および酸化のサイクルを通じた異なる抗体からの半抗体(重鎖−軽鎖ペアまたはFab)の再結合により生成される二重特異性抗体決定因子;例えば、米国特許第5,273,743号明細書に記載されるような、三機能性抗体、例えば、スルフヒドリル(sulfhdryl)反応性基を通じて架橋された3つのFab’断片;例えば、米国特許第5,534,254号明細書に記載されるような、生合成結合性タンパク質、例えば、好ましくはジスルフィドまたはアミン反応性化学架橋を通じてC末端テイルを通じて架橋されたscFvのペア;例えば、米国特許第5,582,996号明細書に記載されるような、二機能性抗体、例えば、定常ドメインを置き換えたロイシンジッパー(例えば、c−fosおよびc−jun)を通じて二量体化した異なる結合特異性を有するFab断片;例えば、米国特許第5,591,828号明細書に記載されるような、二重特異性およびオリゴ特異性の一価およびオリゴ価受容体、例えば、1つの抗体のCH1領域と、典型的には会合した軽鎖を有する他の抗体のVH領域との間でポリペプチドスペーサーを通じて連結された2つの抗体(2つのFab断片)のVH−CH1領域;例えば、米国特許第5,635,602号明細書に記載されるような、二重特異性DNA−抗体コンジュゲート、例えば、DNAの二本鎖小片を通じた抗体またはFab断片の架橋;例えば、米国特許第5,637,481号明細書に記載されるような、二重特異性融合タンパク質、例えば、それらと全長定常領域との間に親水性ヘリカルペプチドリンカーを有する2つのscFvを含有する発現構築物;例えば、米国特許第5,837,242号明細書に記載されるような、多価および多重特異性結合性タンパク質、例えば、一般にダイアボディと称される、Ig重鎖可変領域の結合性領域を有する第1のドメイン、およびIg軽鎖可変領域の結合性領域を有する第2のドメインを有するポリペプチドの二量体(二重特異性、三重特異性、または四重特異性分子を作製するより高次構造もまた包含される);例えば、米国特許第5,837,821号明細書に記載されるような、二量体化して二重特異性/多価分子を形成することができる、ペプチドスペーサーを用いて抗体ヒンジ領域およびCH3領域にさらに接続された連結されたVLおよびVH鎖を有するミニボディ構築物;二量体を形成して二重特異性ダイアボディを形成することができる、短いペプチドリンカー(例えば、5もしくは10アミノ酸)を用いてまたはリンカーを全く用いずにいずれかの方向において連結されたVHおよびVLドメイン;例えば、米国特許第5,844,094号明細書に記載されるような、三量体および四量体;例えば、米国特許第5,864,019号明細書に記載されるような、一連のFV(またはscFv)を形成するためにVLドメインとさらに会合したC末端において架橋可能な基を用いたペプチド連結により接続されたVHドメイン(またはファミリーメンバー中のVLドメイン)の連なり;ならびに、例えば、米国特許第5,869,620号明細書に記載されるような、ペプチドリンカーを通じて連結されたVHドメインおよびVLドメインの両方を有する単鎖結合性ポリペプチドが非共有結合性または化学架橋を通じて多価構造に組み合わせられて、例えば、scFV型またはダイアボディ型の両方のフォーマットを使用してホモ二価、ヘテロ二価、三価、および四価構造を形成したものも参照。追加の例示的な多重特異性および二重特異性分子ならびにそれを作る方法は、例えば、米国特許第5,910,573号明細書、同第5,932,448号明細書、同第5,959,083号明細書、同第5,989,830号明細書、同第6,005,079号明細書、同第6,239,259号明細書、同第6,294,353号明細書、同第6,333,396号明細書、同第6,476,198号明細書、同第6,511,663号明細書、同第6,670,453号明細書、同第6,743,896号明細書、同第6,809,185号明細書、同第6,833,441号明細書、同第7,129,330号明細書、同第7,183,076号明細書、同第7,521,056号明細書、同第7,527,787号明細書、同第7,534,866号明細書、同第7,612,181号明細書、米国特許出願公開第US2002004587号明細書、米国特許出願公開第2002076406号明細書、米国特許出願公開第2002103345号明細書、米国特許出願公開第2003207346号明細書、米国特許出願公開第2003211078号明細書、米国特許出願公開第2004219643号明細書、米国特許出願公開第2004220388号明細書、米国特許出願公開第2004242847号明細書、米国特許出願公開第2005003403号明細書、米国特許出願公開第2005004352号明細書、米国特許出願公開第2005069552号明細書、米国特許出願公開第2005079170号明細書、米国特許出願公開第2005100543号明細書、米国特許出願公開第2005136049号明細書、米国特許出願公開第2005136051号明細書、米国特許出願公開第2005163782号明細書、米国特許出願公開第2005266425号明細書、米国特許出願公開第2006083747号明細書、米国特許出願公開第2006120960号明細書、米国特許出願公開第2006204493号明細書、米国特許出願公開第2006263367号明細書、米国特許出願公開第2007004909号明細書、米国特許出願公開第2007087381号明細書、米国特許出願公開第2007128150号明細書、米国特許出願公開第2007141049号明細書、米国特許出願公開第2007154901号明細書、米国特許出願公開第2007274985号明細書、米国特許出願公開第2008050370号明細書、米国特許出願公開第2008069820号明細書、米国特許出願公開第2008152645号明細書、米国特許出願公開第2008171855号明細書、米国特許出願公開第2008241884号明細書、米国特許出願公開第2008254512号明細書、米国特許出願公開第2008260738号明細書、米国特許出願公開第2009130106号明細書、米国特許出願公開第2009148905号明細書、米国特許出願公開第2009155275号明細書、米国特許出願公開第2009162359号明細書、米国特許出願公開第2009162360号明細書、米国特許出願公開第2009175851号明細書、米国特許出願公開第2009175867号明細書、米国特許出願公開第2009232811号明細書、米国特許出願公開第2009234105号明細書、米国特許出願公開第2009263392号明細書、米国特許出願公開第2009274649号明細書、欧州特許出願公開第346087号明細書、およびPCT国際公開0006605号、国際公開第02072635号、国際公開第04081051号、国際公開第06020258号、国際公開第2007044887号、国際公開第2007095338号、国際公開第2007137760号、国際公開第2008119353号、国際公開第2009021754号、国際公開第2009068630号、国際公開第9103493号、国際公開第9323537号、国際公開第9409131号、国際公開第9412625号、国際公開第9509917号、国際公開第9637621号、国際公開第9964460号に見出される。
一部の実施形態では、本開示の多重特異性抗原結合性構築物は腫瘍またはB系列細胞抗原(例えば、BCMA)およびNKp30に選択的に結合する。抗原結合単位は、本明細書に開示されるように、標準技術により生成することができる。一部の実施形態では、腫瘍もしくはB系列細胞抗原もしくはNKp30に対する任意の公知の抗体を使用して本開示に従った二重特異性抗体を生成することができ、または、多重特異性抗原結合性構築物は、当該技術分野において公知の抗体を使用して生成することができる。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物(例えば、三重特異性抗原結合性構築物)は、エフェクター免疫細胞により発現される分子に特異的に結合する第3の抗原結合単位をさらに含む。任意選択で、第3の抗原結合単位は免疫グロブリンFcドメインである。エフェクター免疫細胞により発現される分子は、例えば、CD16、CD32a、CD64、またはCD89であることができる。任意選択で、多重特異性抗原結合性構築物は免疫グロブリンFcドメインを含まない。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物(例えば、三重特異性抗原結合性構築物)は、第2の腫瘍またはB系列細胞抗原に特異的に結合する第3の抗原結合単位をさらに含む。そのような実施形態では、三重特異性抗原結合性構築物は、第1の腫瘍またはB系列細胞抗原について一価であり、第2の腫瘍またはB系列細胞抗原について一価であり、NKp30について二価である。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物(例えば、三重特異性抗原結合性構築物)は、第2のNK活性化受容体に特異的に結合する第3の抗原結合単位をさらに含む。一部のそのような実施形態では、三重特異性抗原結合性構築物は、腫瘍またはB系列細胞抗原について一価であり、NKp30について二価であり、第2のNK活性化受容体について一価である。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物(例えば、四重特異性抗原結合性構築物)は、第2のNK活性化受容体に特異的に結合する第3の抗原結合単位、および第2の腫瘍またはB系列細胞抗原に特異的に結合する第4の抗原結合単位をさらに含む。そのような実施形態では、四重特異性抗原結合性構築物は、腫瘍またはB系列細胞抗原について一価であり、第2の腫瘍またはB系列細胞抗原について一価であり、NKp30について一価であり、第2のNK活性化受容体について一価である。
本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の実施形態において標的として使用するために想定される追加のNK活性化受容体の非限定的な例としては、NKp46、2B4、CD226、NKG2D、CD137、CD16a、およびCD2が挙げられる。これらのNK活性化受容体の例示的なヒトアミノ酸配列は、配列番号27〜35として見出すことができる。
よって、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位はNKp46に特異的に結合する。
本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位は2B4に特異的に結合する。
本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位は2B4に特異的に結合する。
本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位はCD226に特異的に結合する。
本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位はNKG2Dに特異的に結合する。
本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位はNKG2Dに特異的に結合する。
本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位はCD137に特異的に結合する。
本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位はCD16aに特異的に結合する。
本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位はCD16aに特異的に結合する。
本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物の一部の実施形態では、抗原結合単位はCD2に特異的に結合する。
ある特定の実施形態では、第1の抗原結合単位および第2の抗原結合単位は少なくとも1つのアミノリンカーアミノ酸配列により連結されている。任意選択で、リンカーアミノ酸配列はGGGGSx(配列番号22)(xは、1および6を含む1〜6の整数である)を含む。
ある特定の実施形態では、第1の抗原結合単位および第2の抗原結合単位は少なくとも1つのアミノリンカーアミノ酸配列により連結されている。任意選択で、リンカーアミノ酸配列はGGGGSx(配列番号22)(xは、1および6を含む1〜6の整数である)を含む。
第1の抗原結合単位または第2の抗原結合単位、または両方は、1つまたは複数の免疫グロブリンFc改変を含む重鎖を含むことができる。同様に、第3またはその後の抗原結合単位、または両方もまた、1つまたは複数の免疫グロブリンFc改変を含む重鎖を含むことができる。一部の実施形態では、重鎖の免疫グロブリンFcドメインは、例えば、第1および第2の抗原結合単位のヘテロ二量体化を促進し、血清半減期を促進し、および/またはエフェクター機能を改変する、1つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。一部の実施形態では、突然変異は重鎖のCH3ドメイン中に存在する(例えば、シューら(Xu et al.)(2015)mAbs 7(1):231−42を参照)。
伝統的なFc融合タンパク質および抗体はガイドされない相互作用ペアの例であるが、例えば、第1の抗原結合単位および第2の抗原結合単位のヘテロ二量体化を促進するために、様々な操作されたFcドメインが非対称相互作用ペアとして設計されている(シュピースら(Spiess et al.)(2015)Molecular Immunology 67(2A):95−106)。許容される収率において好ましい非対称融合タンパク質を製造するために単一細胞株中でのFc含有ポリペプチド鎖の所望のペア形成を増加させる様々な方法が当該技術分野において公知である(例えば、クラインら(Klein et al.)(2012)mAbs 4:653−663;およびシュピースら(Spiess et al.)(2015)Molecular Immunology 67(2PartA):95−106を参照)。Fc含有ポリペプチドの所望のペア形成を得る方法としては、電荷ベースのペア形成(静電ステアリング)、「ノブ−イントゥー−ホール」立体ペア形成、SEEDボディペア形成、およびロイシンジッパーベースのペア形成が挙げられるがそれに限定されない(例えば、リッジウェイら(Ridgway et al.)(1996)Protein Eng. 9:617−621;マーチャントら(Merchant et al.)(1998)Nat. Biotech. 16:677−681;デイビスら(Davis et al.)(2010)Protein Eng. Des. Sel.23:195−202;グナセカランら(Gunasekaran et al.)(2010)J. Biol. Chem. 285:19637−19646;ラニクら(Wranik et al.)(2012)J. Biol. Chem. 287:43331−43339;米国特許第5,932,448号明細書;ならびにPCT国際公開第1993/011162号、国際公開第2009/089004号、および国際公開第2011/034605号を参照)。
例えば、特定のポリペプチドの間の相互作用を促進することができる1つの手段は、米国特許第7,183,076号明細書および同第5,731,168号明細書、ならびにPCT国際公開第2016/164089号などに記載されるようにプロチュベランス−イントゥー−キャビティ(protuberance−into−cavity)(ノブ−イントゥー−ホール)相補領域を操作することによる。「プロチュベランス」(隆起)は、第1のポリペプチドの境界面(例えば、第1の相互作用ペア)からの小さいアミノ酸側鎖をより大きい側鎖(例えば、チロシンまたはトリプトファン)で置き換えることにより構築される。プロチュベランスと同一または類似のサイズの相補的な「キャビティ」は、大きいアミノ酸側鎖をより小さいもの(例えば、アラニンまたはスレオニン)で置き換えることにより第2のポリペプチドの境界面(例えば、第2の相互作用ペア)上に任意選択で作製される。好適な位置および寸法のプロチュベランスまたはキャビティが第1または第2のいずれかのポリペプチドの境界面において存在する場合、隣接する境界面において対応するそれぞれキャビティまたはプロチュベランスを操作することのみが必要である。
中性pH(7.0)において、アスパラギン酸およびグルタミン酸は負に荷電し、リシン、アルギニン、およびヒスチジンは正に荷電する。これらの荷電性残基を使用して、ヘテロ二量体形成を促進し、それと同時にホモ二量体形成を邪魔することができる。反対の電荷の間で誘引性相互作用が起こり、同様の電荷の間で反発性相互作用が起こる。部分的に、本明細書に開示されるタンパク質複合体は、荷電性境界面残基の部位特異的突然変異誘発を実行することによりヘテロマルチマー形成(例えば、ヘテロ二量体形成)を促進するために誘引性相互作用を使用し、任意選択でホモ二量体形成(例えば、ホモ二量体形成)を邪魔するために反発性相互作用を使用する。
例えば、IgG1 CH3ドメイン境界面は、ドメイン−ドメイン相互作用に関与する4つの特有の電荷残基ペア:Asp356−Lys439’、Glu357−Lys370’、Lys392−Asp399’、およびAsp399−Lys409’[第2の鎖中の残基番号付けは(’)により指し示される]を含む。IgG1 CH3ドメイン中の残基を指定するためにここで使用される番号付けスキームは、カバットのEU番号付けスキームに従うことに留意すべきである。CH3−CH3ドメイン相互作用において存在する2回対称性に起因して、各特有の相互作用は構造中に2回現れる(例えば、Asp−399−Lys409’およびLys409−Asp399’)。野生型配列において、K409−D399’は、ヘテロ二量体およびホモ二量体の両方の形成を好む。第1の鎖において電荷極性を切り替える単一の突然変異(例えば、K409E;正電荷から負電荷へ)は、第1の鎖のホモ二量体の形成にとって不都合な相互作用に繋がる。不都合な相互作用は、同じ電荷(負−負;K409E−D399’およびD399−K409E’)の間で起こる反発性相互作用に起因して生じる。第2の鎖において電荷極性を切り替える類似した突然変異(D399K’;負から正へ)は、第2の鎖のホモ二量体形成にとって不都合な相互作用(K409’−D399K’およびD399K−K409’)に繋がる。しかし、同時に、これらの2つの突然変異(K409EおよびD399K’)はヘテロ二量体形成にとって好都合な相互作用(K409E−D399K’およびD399−K409’)に繋がる。ヘテロ二量体の形成およびホモ二量体の支障に対する静電ステアリング効果は、例えば、Arg355およびLys360を含む、第2の鎖中の反対に荷電した残基とペア形成していてもよいしそうでなくてもよい追加の電荷残基の突然変異によりさらに増進することができる(例えば、PCT国際公開第2016/164089号を参照)。
そのため、一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物は、例えば、免疫グロブリンのFc部分を含む、免疫グロブリンの定常ドメインを含むことができる。例えば、第1の抗原結合単位は、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、もしくはIgG4)、IgA(IgAlもしくはIgA2)、IgE、またはIgM免疫グロブリンのFcドメインに由来するアミノ酸配列を含むことができる。任意選択で、第2の抗原結合単位および/またはその後の抗原結合単位は、IgG(IgGl、lgG2、lgG3、もしくはIgG4)、IgA(IgAlもしくはIgA2)、IgE、またはIgMのFcドメインに由来するアミノ酸配列を含むことができる。そのような免疫グロブリンドメインは、ヘテロ二量体形成を促進する1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、欠失、付加、および/または置換)を含むことができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はIgG1アイソタイプである。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はIgG1アイソタイプであり、置換を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はIgG2アイソタイプである。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はIgG3アイソタイプである。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はIgG4アイソタイプである。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物はIgG4アイソタイプであり、置換を含む。一部の実施形態では、置換は、EU番号付けに従って番号付けされた場合にSer228におけるものである。一部の実施形態では、Ser228における置換はS228Pである。一部の実施形態では、第1の抗原結合単位および第2の抗原結合単位は、同じ免疫グロブリンクラスおよびサブタイプに由来するFcドメインを含む。一部の実施形態では、第1および第2の抗原結合単位は、異なる免疫グロブリンクラスまたはサブタイプに由来するFcドメインを含む。同様に、第1および/または第2の抗原結合単位(例えば、非対称ペアまたは非ガイド相互作用ペア)は、任意選択で、例えば、ヘテロ二量体形成を促進する1つまたは複数のアミノ酸改変(例えば、欠失、付加、および/または置換)を含む、改変された免疫グロブリンの定常ドメインを含む。1つまたは複数のその後の抗原結合単位は、任意選択で、同じクラスおよびサブタイプからのものであり、または第1および/もしくは第2の抗原結合単位とは異なる。所望のヘテロ二量体形成を有するFc改変を生成する方法は当該技術分野において公知である。
一部の実施形態では、Fcドメインは、本明細書に開示される多重特異性抗原結合性構築物の血清半減期を増進するように改変することができる。例えば、中性pHと比較して酸性pHにおいて、Fc受容体への抗体の結合を増進または減少させる1つまたは複数の突然変異を含むFcドメインは当該技術分野において公知である。例えば、本明細書に開示される構築物は、FcドメインのCH2またはCH3領域中に1つまたは複数の突然変異を含むことができ、突然変異は、酸性環境中(例えば、pHが約5.5〜約6.0に及ぶエンドソーム中)でFcRnに対するFcドメインの親和性を増加させる。そのような突然変異は、動物に投与された場合に構築物の血清半減期の増加を結果としてもたらすことができる。増進した血清半減期などの所望の特徴のためにFcドメインを改変する方法は当該技術分野において公知である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、その対応する変更されていない定常領域と比べて低減されたエフェクター機能を有する(またはエフェクター機能を有しない)変更された重鎖定常領域を含む。本明細書に記載の構築物の定常領域を伴うエフェクター機能は、定常またはFc領域の特性を変更することによりモジュレートすることができる。変更されたエフェクター機能としては、例えば、以下の活性:ADCC、補体依存性細胞傷害性(CDC)、アポトーシス、1つまたは複数のFc受容体への結合、および炎症促進性応答の1つまたは複数におけるモジュレーションが挙げられる。モジュレーションは、変更されていない形態の定常領域の活性と比較して変更された定常領域を含有する対象抗体またはその抗原結合性断片により呈されるエフェクター機能活性の増加、減少、または排除を指す。具体的な実施形態では、モジュレーションは、活性が消失しまたは完全に存在しない状況を含む。
変更されたFcR結合親和性および/またはADCC活性および/または変更されたCDC活性を有する変更された定常領域は、変更されていない形態の定常領域と比較して増進または減少したFcR結合活性および/またはADCC活性および/またはCDC活性のいずれかを有するポリペプチドである。FcRへの増加した結合を示す変更された定常領域は、変更されていないポリペプチドより高い親和性で少なくとも1つのFcRに結合する。FcRへの減少した結合を示す変更された定常領域は、変更されていない形態の定常領域より低い親和性で少なくとも1つのFcRに結合する。FcRへの減少した結合を示すそのような変種は、FcRへの認識できる結合をほとんどまたは全く有することができず、例えば、天然配列免疫グロブリン定常またはFc領域のFcRへの結合のレベルと比較して0〜50%(例えば、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1%未満)のFcRへの結合である。同様に、モジュレートされたADCCおよび/またはCDC活性を示す変更された定常領域は、変更されていない定常領域と比較して増加または低減されたADCCおよび/またはCDC活性のいずれかを呈することができる。例えば、一部の実施形態では、変更された定常領域を含む抗体またはその抗原結合性断片は、変更されていない形態の定常領域のADCCおよび/またはCDC活性の約0〜50%(例えば、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1%未満)を呈することができる。低減されたADCCおよび/またはCDCを示す変化した定常領域を含む本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物は、低減されたADCCおよび/もしくはCDC活性を呈し、またはADCCおよび/もしくはCDC活性を全く呈しないものであることができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物は、低減されたエフェクター機能を呈し、またはエフェクター機能を呈しない。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、G2/G4ハイブリッド定常領域などのハイブリッド定常領域、またはその部分を含む(例えば、バートンら(Burton et al.)(1992)Adv. Immun.51:1−18;キャンフィールドら(Canfield et al.)(1991)J. Exp. Med. 173:1483−1491;およびミュラーら(Mueller et al.)(1997)Mol. Immunol. 34(6):441−452を参照)。
一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物は、増加したエフェクター機能を呈する。免疫グロブリンFc領域中で行うことができる置換を含む、エフェクター機能を増進または増加させる方法は当該技術分野において公知である。そのような置換の例は、ワンら(Wang et al.)(2018)Protein Cell 9(1)63−73(例えば、Table 1を参照)(内容の全体を参照により本願明細書に援用する)において見出すことができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物のエフェクター機能をモジュレートすることは、グリコシル化における変化を含む。エフェクター機能の程度と共にヒトIgG上に見出されるオリゴ糖の重要性の要約は、ラジュ・ティー・エス(Raju T S.), BioProcess International April 2003. 44−53に記載されている。ライト(Wright)およびモリソン(Morrison)によれば、ヒトIgGオリゴ糖の微不均一性は、CDCおよびADCC、様々なFc受容体への結合、ならびにC1qタンパク質への結合などの生物学的機能に影響し得る。(ライト、エー(Wright A.)およびモリソン、エスエル(Morrison SL.) TIBTECH 1997, 15 26−32)。抗体のグリコシル化パターンは、産生細胞および細胞培養条件に依存して異なり得ることもまた報告されている(ラジュ・ティー・エス(Raju T S.), BioProcess International April 2003. 44−53)。そのような差異は、エフェクター機能および薬物動態の両方における変化に繋がり得る(イスラエルら(Israel et al.)Immunology 1996;89(4):573−578;ニューカークら(Newkirk et al.) P. Clin. Exp. 1996;106(2):259−64)。エフェクター機能における差異は、エフェクター細胞上のFcγ受容体(FcγR)に結合するIgGの能力に関する可能性がある。FcγRへの向上した結合を有するアミノ酸配列における変種を含むIgGは、ヒトエフェクター細胞を使用して100%までの増進したADCCを呈することができることもまた示されている(シールズら(Shields et al.) J Biol. Chem. 2001 276(9):6591−604)。これらの変種は、結合境界面において見出されないアミノ酸における変化を含むが、糖成分の性質およびその構造パターンの両方もまた、観察される差異に寄与する。追加的に、IgGのオリゴ糖成分中のフコースの存在または非存在は、結合およびADCCを向上させ得ることが示されている(シールズら(Shields et al.)J Biol. Chem. 2002;277(30):26733−40)。Asn297に連結したフコシル化炭水化物を欠いたIgGは、Fcγ受容体への正常な受容体結合を呈した。対照的に、FcγRIIA受容体への結合は、特により低い抗体濃度において、50%向上し、増進したADCCが付随した。よって、一部の実施形態では、エフェクター機能を増進または増加させる方法は、変更されたグリコシル化(glyosylation)またはフコシル化活性を有する遺伝子操作されたCHO細胞中で本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物を発現または産生させることを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物はフコシル化を欠いており、または非フコシル化されている。そのような遺伝子操作されたCHO細胞は、例えば、減少したα1,6−フコシルトランスフェラーゼ活性を有しまたはα1,6−フコシルトランスフェラーゼ活性を有しないものであることができ、それにより、結果として生じる多重特異性抗原結合性構築物は、糖鎖の還元末端のN−アセチルグルコサミンを通じてFc領域に結合した複合体N−グリコシド連結糖鎖が、N−アセチルグルコサミンに結合したフコースを有する糖鎖を何ら含有しない、または低減された量の該糖鎖を含有するような、Fc領域を含む。本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物と共に使用することができるそのような操作された細胞の非限定的な例としては、国際公開第00/61739号、米国特許第6,946,292号明細書、米国特許第7,214,775号明細書、米国特許第7,425,446号明細書、米国特許第7,708,992号明細書、および米国特許第7,737,325号明細書(それぞれの内容の全体を参照により本願明細書に援用する)に記載されるものが挙げられる。
一部の実施形態では、エフェクター機能を増進しまたは増加させる方法は、ADCC活性に関係があるとされるオリゴ糖をバイセクト化させる変更されたグリコシルトランスフェラーゼ酵素(GnnU)活性を有する遺伝子操作または改変されたCHO細胞中で本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物を発現または産生させることを含む。
一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、増進または低減された補体依存性細胞傷害性(CDC)を呈する変更された定常領域を含有する。モジュレートされたCDC活性は、抗体のFc領域中に1つまたは複数のアミノ酸置換、挿入、または欠失を導入することにより達成することができる。例えば、米国特許第6,194,551号明細書を参照。
抗体またはその断片は、1つより多くの種に結合するためにさらに選択することができる。例えば、マウスおよびヒトの両方に結合する抗体または断片は、マウスおよびヒトの両方の標的細胞を用いるスクリーニングにより選択することができる。
本明細書に記載の構築物および抗原結合単位は、部分的に、スキャフォールドドメイン、タンパク質、または部分、例えば、標的受容体結合活性を提供しないが、空間的組織化、構造的サポート、複数の受容体結合単位の連結の手段、または他の所望の特徴、例えば、向上した半減期を提供する構築物の部分またはドメインを提供することができる分子を含むことができる。様々なスキャフォールド技術および組成物は当該技術分野において公知であり、本明細書に記載の抗原結合単位に容易に連結またはコンジュゲート化させることができる。スキャフォールドドメイン、タンパク質、または部分は、抗体に由来し、または抗体に由来しないものであり得る。そのようなスキャフォールドタンパク質、およびそのドメインは、一般に、既存の抗原結合性タンパク質のコンビナトリアル化学ベースの適合を通じて得られる。
非抗体タンパク質スキャフォールドは、2つの構造的カテゴリー、ドメインサイズの構築物(6〜20kDaの範囲内)、および制約されたペプチド(2〜4kDaの範囲内)に入ると考えることができる。ドメインサイズの非抗体スキャフォールドとしては、アフィボディ、アフィリン、アンチカリン、アトリマー、DARPin、FN3スキャフォールド(例えば、アドネクチンおよびセンチリン)、フィノマー、クニッツドメイン、プロネクチンならびにOBodyが挙げられるがそれに限定されない。ペプチドサイズの非抗体スキャフォールドとしては、例えば、アビマー、二環ペプチドおよびシステインノットが挙げられる。これらの非抗体スキャフォールドおよびそのベースまたは由来となる基礎タンパク質またはペプチドは、例えば、シメオン(Simeon)およびチェン(Chen), Protein Cell 9(1):3−14(2018);バスケス−ロンバルディら(Vazquez−Lombardi et al.), Drug Discovery Today 20:1271−1283(2015)、およびビンツら(Binz et al.), Nature Biotechnol. 23:1257−1268(2005)(それぞれの内容の全体を参照により本願明細書に援用する)により総説されている。非抗体スキャフォールドを使用する利点としては、増加した親和性、標的中和、および安定性が挙げられる。様々な非抗体スキャフォールドはまた、例えば、組織透過、より小さいサイズ、および熱安定性の点で、抗体スキャフォールドの制限の一部を克服することができる。一部の非抗体スキャフォールドはまた、例えば、二重特異性構築物が所望される場合の軽鎖会合の問題により邪魔されることなく、より容易な構築を許容することができる。非抗体スキャフォールド上に構築物を構築する方法は当業者に公知である。正式には抗体スキャフォールド上ではないが、そのような構築物は、多くの場合に、特異的な標的結合能力を提供する単一ドメイン抗体、scFvまたは他の抗体結合性ドメイン変種のいずれの形態にあるにせよ、抗体結合性ドメインを含む。
よって、本明細書に記載の任意の態様の一部の実施形態では、構築物は非抗体スキャフォールドタンパク質を含むことができる。本明細書に記載の任意の態様の一部の実施形態では、受容体結合単位の少なくとも1つは非抗体スキャフォールドタンパク質を含むことができる。非抗体スキャフォールドタンパク質のスキャフォールド部分は、一部の実施形態では、例えば、ヒト第10フィブロネクチンIII型ドメイン(10Fn3)に由来するアドネクチンスキャフォールドもしくは部分;ヒトリポカリンに由来するアンチカリンスキャフォールド(例えば、例えば国際公開第2015/104406号に記載されるものなど);低比重関連タンパク質(LRP)のAドメインおよび/もしくは超低比重リポタンパク質受容体(VLDLR)に由来するアビマースキャフォールドもしくはタンパク質断片;FYNチロシンキナーゼのSH3ドメインのフィノマースキャフォールドもしくは部分;ヒトトリプシン阻害剤、アプロチニン(ウシ膵臓トリプシン阻害剤)、アルツハイマーのアミロイド前駆体タンパク質、および組織因子経路阻害剤などのクニッツ型プロテアーゼ阻害剤のクニッツドメインスキャフォールドもしくは部分;E.エラテリウム(E. elaterium)からのトリプシン阻害剤に基づくものなどのノッチン(knottin)スキャフォールド(システインノットミニプロテイン);アフィボディスキャフォールドもしくはS.アウレウス(S. aureus)プロテインAのZドメインの全体もしくは部分;β−ヘアピン模倣体スキャフォールド;設計アンキリンリピートタンパク質(Designed ankyrin repeat protein)(DARPin)スキャフォールドもしくはアンキリンリピート(AR)タンパク質に基づく人工的なタンパク質スキャフォールド;またはヒトトランスフェリン、ヒトCTLA−4、ヒトクリスタリン、およびヒトユビキチンに由来しもしくはそれに基づく任意のスキャフォールドを含むことができることを当業者は理解する。例えば、ヒトトランスフェリン受容体用のヒトトランスフェリンの結合部位は、その一部が異なる抗原に対する親和性を獲得しているトランスフェリン変種の多様なライブラリーを作製するために多様化させることができる。例えば、アリら(Ali et al.)(1999)J. Biol. Chem. 274:24066−24073を参照。受容体との結合に関与しないヒトトランスフェリンの部分は、変化させないままであり、変種結合部位を提示するための、抗体のフレームワーク領域のようなスキャフォールドとして働く。ライブラリーは次に、抗体ライブラリーとして、および本明細書に記載の方法に従って、標的抗原について最適な選択性および親和性を有する変種を同定するために、目的の標的抗原に対してスクリーニングされる。例えば、ヘイら(Hey et al.)(2005)TRENDS Biotechnol. 23(10):514−522を参照。
本開示はまた、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物または単離された抗体、もしくはその抗原結合性部分をコードする核酸を提供する。本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物または単離された抗体、もしくはその抗原結合性部分をコードする核酸配列の非限定的な例としては、配列番号84〜100が挙げられる。核酸を含む(任意選択で発現制御配列を有する)本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物または単離された抗体、もしくはその抗原結合性断片のためのベクター、およびベクターまたは核酸を含む細胞もまた提供される。そのような細胞を細胞によるベクターからの1つまたは複数のポリペプチドの発現のための条件下で培養することを含む、ポリペプチドを製造する方法が提供される。方法は、任意選択で、細胞または細胞が培養された培地から1つまたは複数のポリペプチドを単離することを含む。本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物または単離された抗体、もしくはその抗原結合性断片にコンジュゲート化した異種部分を含むタンパク質コンジュゲート分子もまた提供される。任意選択で、異種部分は、治療剤、毒素、薬物、または放射性部分である。
多重特異性抗原結合性構築物を製造する方法
本明細書に記載の任意の多重特異性抗原結合性構築物を製造する方法が本明細書において提供される。開示される構築物を製造する方法は、抗体およびその抗原結合性断片を調製する方法を含む。そのような方法は当該技術分野において周知であり、例えば、適切な免疫原を用いて対象(例えば、非ヒト哺乳動物)を免疫化することを含む。腫瘍抗原、または、例えば、NKp30、NKp46、NKp44、もしくはNKG2Dなどの活性化NK受容体に結合する抗体を生成するために、当業者は、全長腫瘍抗原またはNK活性化受容体のポリペプチドもしくはその変種もしくは断片を用いて好適な対象(例えば、ラット、マウス、アレチネズミ、ハムスター、イヌ、ネコ、ブタ、ヤギ、ウマ、または非ヒト霊長動物などの非ヒト哺乳動物)を免疫化する。ポリペプチド(腫瘍抗原またはNK活性化受容体)の抗原性断片は、ポリペプチドの既知の構造的特徴に基づいて抗体を生成するために選択することができる。例えば、当該技術分野において利用可能な受容体/リガンド境界面の情報に基づいて腫瘍抗原またはNK活性化受容体内の領域を使用して、望ましい特性を有する抗体を生成するための好適な抗原性断片を設計することができる。結果として生じた抗体または抗原結合性構築物を次に所望の結合特性(例えば、腫瘍抗原およびNK活性化受容体に対する結合親和性ならびに腫瘍抗原およびNK活性化受容体が発現される細胞にブリッジ形成する能力)についてスクリーニングすることができる。
本明細書に記載の任意の多重特異性抗原結合性構築物を製造する方法が本明細書において提供される。開示される構築物を製造する方法は、抗体およびその抗原結合性断片を調製する方法を含む。そのような方法は当該技術分野において周知であり、例えば、適切な免疫原を用いて対象(例えば、非ヒト哺乳動物)を免疫化することを含む。腫瘍抗原、または、例えば、NKp30、NKp46、NKp44、もしくはNKG2Dなどの活性化NK受容体に結合する抗体を生成するために、当業者は、全長腫瘍抗原またはNK活性化受容体のポリペプチドもしくはその変種もしくは断片を用いて好適な対象(例えば、ラット、マウス、アレチネズミ、ハムスター、イヌ、ネコ、ブタ、ヤギ、ウマ、または非ヒト霊長動物などの非ヒト哺乳動物)を免疫化する。ポリペプチド(腫瘍抗原またはNK活性化受容体)の抗原性断片は、ポリペプチドの既知の構造的特徴に基づいて抗体を生成するために選択することができる。例えば、当該技術分野において利用可能な受容体/リガンド境界面の情報に基づいて腫瘍抗原またはNK活性化受容体内の領域を使用して、望ましい特性を有する抗体を生成するための好適な抗原性断片を設計することができる。結果として生じた抗体または抗原結合性構築物を次に所望の結合特性(例えば、腫瘍抗原およびNK活性化受容体に対する結合親和性ならびに腫瘍抗原およびNK活性化受容体が発現される細胞にブリッジ形成する能力)についてスクリーニングすることができる。
好適な対象(例えば、非ヒト哺乳動物)は、哺乳動物による抗体の産生を誘発するために十分な回数のその後のブースター免疫化と共に適切な抗原を用いて免疫化することができる。免疫原は、アジュバントと共に対象(例えば、非ヒト哺乳動物)に投与することができる。対象における抗体の産生において有用なアジュバントとしては、タンパク質アジュバント;細菌アジュバント、例えば、細菌全体(BCG、コリネバクテリウム・パルバム(Corynebacterium parvum)またはサルモネラ・ミネソタ(Salmonella minnesota))、および、細胞壁骨格、トレハロースジミコール酸、モノホスホリルリピドA、結核菌(tubercle bacillus)のメタノール抽出可能残留物(MER)、完全または不完全フロイントアジュバントを含む細菌成分;ウイルスアジュバント;ならびに化学的アジュバント、例えば、水酸化アルミニウム、およびヨード酢酸塩およびコレステリルヘミスクシネートが挙げられるがそれに限定されない。免疫応答を誘導する方法において使用することができる他のアジュバントとしては、例えば、コレラ毒素およびパラポックスウイルスタンパク質が挙げられる。(ビーグら(Bieg et al.)(1999)Autoimmunity 31(1):15−24も参照;例えば、ロドメルら(Lodmell et al.)(2000)Vaccine 18:1059−1066;ジョンソンら(Johnson et al.)(1999)J. Med. Chem. 42:4640−4649;バルドリッジら(Baldridge et al.)(1999)Methods 19:103−107;およびグプタら(Gupta et al.)(1995)Vaccine 13(14):1263−1276も参照)。
一部の実施形態では、方法は、免疫原に結合するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を調製することを含む。例えば、実験室マウスなどの好適な哺乳動物は、上記のようなポリペプチド(例えば、腫瘍抗原もしくはNK活性化受容体)または抗原性断片を用いて免疫化される。免疫化された哺乳動物の抗体産生細胞(例えば、脾臓のB細胞)は、免疫原の少なくとも1回のブースター免疫化の2〜4日後に単離することができ、次に好適な骨髄腫細胞株の細胞との融合前に培養で短期間生育することができる。細胞は、例えば、ワクシニアウイルスまたはポリエチレングリコールなどの融合促進剤の存在下で融合させることができる。融合において得られたハイブリッド細胞はクローニングされ、所望の抗体を分泌する細胞クローンが選択される。例えば、好適な免疫原を用いて免疫化されたBalb/cマウスの脾臓細胞は、骨髄腫細胞株PAIまたは骨髄腫細胞株Sp2/0−Ag14の細胞と融合させることができる。融合後、正常な骨髄腫細胞が所望のハイブリドーマ細胞より過成長することを防止するために定期的な間隔において選択培地、例えばHAT培地を添加した好適な培養培地中で細胞は拡大増殖される。得られたハイブリドーマ細胞は次に、所望の抗体、例えば、所望の抗原に結合する抗体の分泌についてスクリーニングされる。
一部の実施形態では、腫瘍抗原またはNK活性化受容体に特異的な抗体は、例えば、米国特許第6,300,064号明細書およびショーンブロートら(Schoonbroodt et al.)(2005) Nucleic Acids Res 33(9):e81に記載されるような非免疫バイアスライブラリーから選択される。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、例えば、ファージディスプレイ技術、細菌ディスプレイ、酵母表面ディスプレイ、真核ウイルスディスプレイ、哺乳動物細胞ディスプレイ、および無細胞(例えば、リボソームディスプレイ)抗体スクリーニング技術を伴い、またはそれと組み合わせて使用することができる(例えば、エッツら(Etz et al.)(2001)J. Bacteriol. 183:6924−6935;コーネリス(Cornelis)(2000)Curr. Opin. Biotechnol. 11:450−454;クレムら(Klemm et al.)(2000)Microbiology 146:3025−3032;キーケら(Kieke et al.)(1997)Protein Eng. 10:1303−1310;イェンら(Yeung et al.)(2002)Biotechnol. Prog. 18:212−220;ボーデルら(Boder et al.)(2000)Methods Enzymology 328:430−444;グラベールら(Grabherr et al.)(2001)Comb. Chem. High Throughput Screen 4:185−192;ミカエルら(Michael et al.)(1995)Gene Ther. 2:660−668;ペレボエフら(Pereboev et al.)(2001)J. Virol. 75:7107−7113;シャフィッツェルら(Schaffitzel et al.)(1999)J. Immunol. Methods 231:119−135;およびヘインズら(Hanes et al.)(2000)Nat. Biotechnol. 18:1287−1292を参照)。
様々なファージディスプレイ法を使用して抗体を同定する方法は当該技術分野において公知である。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインは、それをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面上に提示される。そのようなファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー(例えば、ヒトまたはマウス)から発現される、Fab、Fv、またはジスルフィド結合安定化Fv抗体断片などの抗体の抗原結合性ドメインを提示するために利用することができる。これらの方法において使用されるファージは、典型的には、fdおよびM13などの糸状ファージである。抗原結合性ドメインは、ファージコートタンパク質pIII、pVIII、またはpIXのいずれかに対する組換え融合タンパク質として発現される。(例えば、シら(Shi et al.)(2010)JMB 397:385−396を参照。)本明細書に記載の免疫グロブリン、またはその断片を作るために使用することができるファージディスプレイ法の例としては、ブリンクマンら(Brinkman et al.)(1995)J. Immunol. Methods 182:41−50;エイムスら(Ames et al.)(1995)J. Immunol. Methods 184:177−186;ケトルボローら(Kettleborough et al.)(1994)Eur. J. Immunol. 24:952−958;ペルシッチら(Persic et al.)(1997)Gene 187:9−18;バートンら(Burton et al.)(1994)Advances in Immunology 57:191−280;ならびにPCT国際公開第90/02809号、国際公開第91/10737号、国際公開第92/01047号、国際公開第92/18619号、国際公開第93/11236号、国際公開第95/15982号、および国際公開第95/20401号に開示されるものが挙げられる。好適な方法はまた、例えば、米国特許第5,698,426号明細書、同第5,223,409号明細書、同第5,403,484号明細書、同第5,580,717号明細書、同第5,427,908号明細書、同第5,750,753号明細書、同第5,821,047号明細書、同第5,571,698号明細書、同第5,427,908号明細書、同第5,516,637号明細書、同第5,780,225号明細書、同第5,658,727号明細書、同第5,733,743号明細書、および同第5,969,108号明細書に記載されている。
一部の実施形態では、ファージディスプレイ抗体ライブラリーは、免疫化された哺乳動物からのB細胞から収集されたmRNAを使用して生成することができる。例えば、B細胞を含む脾臓細胞試料を、上記のように腫瘍抗原またはNKp30ポリペプチドを用いて免疫化されたマウスから単離することができる。標準的な分子生物学技術を使用してmRNAを細胞から単離し、cDNAに変換することができる。(例えば、グリーン(Green)およびサムブルック(Sambrook)(2012)Molecular Cloning−−A Laboratory Manual, 4th Ed., コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)[ニューヨーク所在];ハーロウ(Harlow)およびレーン(Lane)(1988)Antibodies: a Laboratory Manual, コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)[ニューヨーク所在];ロー(Lo)(2004)Antibody Engineering: Methods and Protocols, スプリンガー・サイエンス・アンド・ビジネス・メディア(Springer Science & Business Media);ならびにボッレバエク(Borrebaeck)(1995)Antibody Engineering、オックスフォード・ユニバーシティ・プレス(Oxford University Press)を参照)。ファージディスプレイライブラリーを構築するために免疫グロブリンの重鎖および軽鎖ポリペプチドの可変領域をコードするcDNAが使用される。そのようなライブラリーを生成する方法は、例えば、メルツら(Merz et al.)(1995)J. Neurosci. Methods 62(1−2):213−9;ディ・ニロら(Di Niro et al.)(2005)Biochem. J. 388(Pt 3):889−894;およびイングバーグら(Engberg et al.)(1995)Methods Mol. Biol. 51:355−376に記載されている。
一部の実施形態では、例えば、ハイブリドーマ由来抗体の集団またはファージディスプレイ抗体ライブラリーから目的の抗体を同定するために選択およびスクリーニングの組合せを用いることができる。好適な方法は当該技術分野において公知であり、例えば、フーゲンブーム(Hoogenboom)(1997)Trends in Biotechnology 15:62−70;ブリンクマンら(Brinkman et al.)(1995)J. Immunol. Methods 182(1):41−50.;エイムスら(Ames et al.)(1995)J. Immunol. Methods 184(2):177−86.;ケトルボローら(Kettleborough et al.)(1994)Eur. J. Immunol. 24(4):952−8;およびペルシッチら(Persic et al.)(1997)Gene 187(1):9−18に記載されている。例えば、バクテリオファージコートタンパク質(例えば、M13ファージのpIII、pVIII、またはpIX)および異なる抗原組合せ領域の融合タンパク質をそれぞれコードする複数のファージミドベクターが標準的な分子生物学技術を使用して製造され、次に細菌(例えば、大腸菌(E.coli))の集団に導入される。細菌中でのバクテリオファージの発現は、一部の実施形態では、ヘルパーファージの使用を必要とし得る。一部の実施形態では、ヘルパーファージは必要とされない(例えば、チャスティーンら(Chasteen et al.)(2006)Nucleic Acids Res. 34(21):e145を参照)。細菌から産生されるファージを回収し、次にそれを、例えば、(固定化された)固体支持体に結合した標的抗原に接触させる。ファージはまた、溶液中の抗原に接触させることができ、複合体をその後に固体支持体に結合させる。
上記の方法を使用してスクリーニングされた抗体の亜集団は、当該技術分野において公知の任意の免疫学的または生化学ベースの方法を使用して具体的な抗原(例えば、ヒト腫瘍抗原またはNK活性化受容体)に対する特異性および結合親和性について特徴付けることができる。例えば、抗体の腫瘍抗原またはNK活性化受容体への特異的結合は、例えば、上記のようにELISAアッセイ、SPRアッセイ、免疫沈降アッセイ、アフィニティークロマトグラフィー、および平衡透析などであるがそれに限定されない免疫学的または生化学ベースの方法を使用して決定することができる。抗体の免疫特異的結合および交差反応性を解析するために使用することができるイムノアッセイとしては、ウエスタンブロット、RIA、ELISA(酵素連結免疫吸着アッセイ)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定化アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、およびプロテインAイムノアッセイなどの技術を使用する競合および非競合アッセイ系が挙げられるがそれに限定されない。上記の方法はまた、腫瘍抗原またはNK活性化受容体に対する抗体がヒト腫瘍抗原またはNK活性化受容体タンパク質に結合しないかどうかを決定するために使用することができる。
選択されたCDRアミノ酸配列が短鎖配列(例えば、10〜15未満のアミノ酸の長さ)である実施形態では、CDRをコードする核酸は、例えば、シライシら(Shiraishi et al.)(2007)Nucleic Acids Symposium Series 51(1):129−130および米国特許第6,995,259号明細書に記載されるように化学的に合成することができる。アクセプター抗体をコードする所与の核酸配列について、CDRをコードする核酸配列の領域は、標準的な分子生物学技術を使用して化学的に合成された核酸で置き換えることができる。化学的に合成された核酸の5’および3’末端は、ドナー抗体の可変領域をコードする核酸への核酸のクローニングにおいて使用するために付着末端制限酵素部位を含むように合成することができる。代替的に、一緒になって抗体をコードすることができる化学的に合成された核酸の断片は、当該技術分野において公知のDNAアセンブリー技術(例えば、ギブソンアセンブリー)を使用して接合させることができる。
選ばれた任意の抗体は、本明細書に記載されるような抗原結合性断片を生成するためにさらに改変し、および/または本明細書に記載されるような多重特異性抗原結合性構築物を生成するために当該技術分野において公知の技術を使用してマニピュレートすることができる。例えば、例えば米国特許第4,433,059号明細書に記載されるように、アミン反応性基およびスルフヒドリル反応性基を有するヘテロ二官能性試薬を使用して二重特異性構造を生成するために架橋方法を使用することができ;例えば、米国特許第4,444,878号明細書に記載されるように、2つの重鎖の間のジスルフィド結合の還元および酸化のサイクルを通じて異なる抗体から半抗体(重鎖−軽鎖ペアまたはFab)を再結合することにより二重特異性抗体決定因子を生成することができ;例えば、米国特許第5,273,743号明細書に記載されるように、スルフヒドリル(sulfhdryl)反応性基を通じて三機能性抗体、例えば、3つのFab’断片を架橋することができる。多重特異性構築物を生成する方法としては、例えば、共通の軽鎖を有する多重特異性構築物を生成する方法が挙げられる。
多重特異性抗原結合性構築物の発現および精製
本明細書に開示される多重特異性抗原結合性構築物は、分子生物学およびタンパク質化学の技術分野において公知の様々な技術を使用して製造することができる。例えば、多重特異性抗原結合性構築物をコードする核酸(単一の多機能性ポリペプチドとして、またはマルチマー複合体の別々の分子として、例えば、他の抗原結合単位から別々に1つの抗原結合単位として)は、転写および翻訳調節配列を含有する発現ベクターに挿入することができ、該配列としては、例えば、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および終止配列、翻訳開始および終止配列、転写ターミネーターシグナル、ポリアデニル化シグナル、ならびにエンハンサーまたは活性化因子配列が挙げられる。調節配列としては、プロモーターならびに転写開始および終止配列が挙げられる。追加的に、発現ベクターは、2つの異なる生物中、例えば、発現のために哺乳動物または昆虫細胞中ならびにクローニングおよび増幅のために原核性宿主中で維持することができるように、1つより多くの複製システムを含むことができる。
本明細書に開示される多重特異性抗原結合性構築物は、分子生物学およびタンパク質化学の技術分野において公知の様々な技術を使用して製造することができる。例えば、多重特異性抗原結合性構築物をコードする核酸(単一の多機能性ポリペプチドとして、またはマルチマー複合体の別々の分子として、例えば、他の抗原結合単位から別々に1つの抗原結合単位として)は、転写および翻訳調節配列を含有する発現ベクターに挿入することができ、該配列としては、例えば、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および終止配列、翻訳開始および終止配列、転写ターミネーターシグナル、ポリアデニル化シグナル、ならびにエンハンサーまたは活性化因子配列が挙げられる。調節配列としては、プロモーターならびに転写開始および終止配列が挙げられる。追加的に、発現ベクターは、2つの異なる生物中、例えば、発現のために哺乳動物または昆虫細胞中ならびにクローニングおよび増幅のために原核性宿主中で維持することができるように、1つより多くの複製システムを含むことができる。
哺乳動物細胞中での核酸からのクローニングされた重鎖および軽鎖ポリペプチドの発現のために幾つかの可能なベクターシステムが利用可能である。ベクターの1つのクラスは、所望の遺伝子配列の宿主細胞ゲノムへの組込みに依拠する。安定的に組み込まれたDNAを有する細胞は、大腸菌(E.coli)gpt(ムリガン(Mulligan)およびバーグ(Berg)(1981)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072)またはTn5 neo(サザン(Southern)およびバーグ(Berg)(1982)Mol. Appl. Genet. 1:327)などの薬物抵抗性遺伝子を同時に導入することにより選択することができる。選択マーカー遺伝子は、発現されるべきDNA遺伝子配列に連結させるか、または共トランスフェクションにより同じ細胞に導入するかのいずれかとすることができる(ウィグラーら(Wigler et al.)(1979)Cell 16:77)。ベクターの第2のクラスは、染色体外プラスミドに自律複製能力を付与するDNAエレメントを利用する。これらのベクターは、ウシパピローマウイルス(サーバーら(Sarver et al.)(1982)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:7147)、サイトメガロウイルス、ポリオーマウイルス(ディーンズら(Deans et al.)(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1292)、またはSV40ウイルス(ルスキー(Lusky)およびボッチャン(Botchan)(1981)Nature 293:79)などの動物ウイルスに由来することができる。
発現ベクターは、核酸のその後の発現のために好適な方式で細胞に導入することができる。導入の方法は、概ね、以下に議論される標的化される細胞種により定められる。例示的な方法としては、CaPO4沈殿、リポソーム融合、陽イオン性リポソーム、エレクトロポレーション、ウイルス感染、デキストラン媒介性トランスフェクション、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、および直接微量注射が挙げられる。
抗体またはその抗原結合性断片の発現用の適切な宿主細胞としては、酵母、細菌、昆虫、植物、および哺乳動物細胞が挙げられる。具体的に関心が持たれるものとしては、大腸菌(E.coli)などの細菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)などの真菌、SF9などの昆虫細胞、哺乳動物細胞株(例えば、ヒト細胞株)の他に、初代細胞株である。
一部の実施形態では、抗体またはその断片は、トランスジェニック動物(例えば、トランスジェニック哺乳動物)中で発現させ、そこから精製することができる。例えば、抗体は、例えば、ホーデビン(Houdebine)(2002)Curr. Opin. Biotechnol. 13(6):625−629;ファン・クイク−ロメイジュンら(van Kuik−Romeijn et al.)(2000)Transgenic Res. 9(2):155−159;およびポロックら(Pollock et al.)(1999)J. Immunol. Methods 231(1−2):147−157に記載されるように、トランスジェニック非ヒト哺乳動物(例えば、齧歯動物)中で産生され、ミルクから単離することができる。
抗体およびその断片は、タンパク質の発現を可能とするために十分な条件下、および期間、抗体または断片をコードする核酸を含有する発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞を培養することにより細胞から産生させることができる。タンパク質発現のためのそのような条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択と共に変動し、慣例的な実験を通じて当業者により容易に確認される。例えば、大腸菌(E.coli)中で発現された抗体は、封入体から再フォールディングさせることができる(例えば、ホウら(Hou et al.)(1998)Cytokine 10:319−30を参照)。細菌発現システムおよびその使用方法は当該技術分野において公知である(オーズベルら(Ausubel et al.)(1988)Current Protocols in Molecular Biology、ウィリー・アンド・サンズ(Wiley & Sons);ならびにグリーン(Green)およびサムブルック(Sambrook)(2012)Molecular Cloning−−A Laboratory Manual, 4th Ed., コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)[ニューヨーク所在](2001)を参照)。コドン、好適な発現ベクターおよび好適な宿主細胞の選択は多数の要因に依存して変動し、必要に応じて容易に最適化することができる。本明細書に記載の抗体(またはその断片)は、哺乳動物細胞中または酵母、バキュロウイルス、およびin vitro発現システムが挙げられるがそれに限定されない他の発現システム中で発現させることができる(例えば、カスズブスカら(Kaszubska et al.)(2000) Protein Expression and Purification 18:213−220を参照)。
発現後に、抗体およびその断片を単離することができる。抗体またはその断片は、どんな他の成分が試料中に存在するのかに依存して当該技術分野において公知の様々なやり方において単離または精製することができる。標準的な精製方法としては、電気泳動、分子、免疫学的、およびクロマトグラフィー技術が挙げられ、クロマトグラフィー技術としては、イオン交換、疎水性、アフィニティー、および逆相HPLCクロマトグラフィーが挙げられる。例えば、抗体は、標準的な抗抗体カラム(例えば、プロテインAまたはプロテインGカラム)を使用して精製することができる。タンパク質濃縮と組み合わせて限外濾過およびダイアフィルトレーション技術もまた有用である。例えば、スコープス(Scopes)(1994)Protein Purification, 3rd edition, シュプリンガー・フェアラーク(Springer−Verlag)[米国ニューヨーク州ニューヨーク市(New York City)所在]を参照。必要な精製の程度は所望の使用に依存して変動する。一部の事例では、発現された抗体またはその断片の精製は必要でない。
精製された抗体またはその断片の収率または純度を決定する方法は当該技術分野において公知であり、例えば、ブラッドフォードアッセイ、UV分光法、ビウレットタンパク質アッセイ、ローリータンパク質アッセイ、アミドブラックタンパク質アッセイ、高圧力液体クロマトグラフィー(HPLC)、質量分析(MS)、およびゲル電気泳動方法(例えば、クマシーブルーまたはコロイド銀染色剤などのタンパク質染色剤を使用する)が挙げられる。
多重特異性抗原結合性構築物の修飾
多重特異性抗原結合性構築物は、単一の多機能性ポリペプチドとしてまたはマルチマー複合体の別々の分子として、例えば、他の抗原結合単位から別々に1つの抗原結合単位として、修飾することができる。修飾は、共有結合または非共有結合修飾であることができる。そのような修飾は、例えば、ポリペプチドの標的化されたアミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることにより抗体または抗原結合性断片に導入することができる。修飾のために好適な部位は、例えば、抗体または断片の構造解析またはアミノ酸配列解析を含む様々な基準のいずれかを使用して選ぶことができる。
多重特異性抗原結合性構築物は、単一の多機能性ポリペプチドとしてまたはマルチマー複合体の別々の分子として、例えば、他の抗原結合単位から別々に1つの抗原結合単位として、修飾することができる。修飾は、共有結合または非共有結合修飾であることができる。そのような修飾は、例えば、ポリペプチドの標的化されたアミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることにより抗体または抗原結合性断片に導入することができる。修飾のために好適な部位は、例えば、抗体または断片の構造解析またはアミノ酸配列解析を含む様々な基準のいずれかを使用して選ぶことができる。
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、異種部分にコンジュゲート化させることができる。異種部分は、例えば、異種ポリペプチド、治療剤(例えば、毒素もしくは薬物)、または検出可能な標識であることができ、検出可能な標識は、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、重金属標識、発光標識、またはビオチンもしくはストレプトアビジンなどのアフィニティータグなどであるがそれに限定されない。好適な異種ポリペプチドとしては、例えば、抗体または断片の精製において使用するための抗原性タグ(例えば、FLAG(DYKDDDDK)(配列番号3)、ポリヒスチジン(6−His;HHHHHH)(配列番号4)、ヘマグルチニン(HA;YPYDVPDYA)(配列番号5)、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、またはマルトース結合タンパク質(MBP))が挙げられる。異種ポリペプチドとしてはまた、診断用のまたは検出可能なマーカーとして有用なポリペプチド(例えば、酵素)、例えば、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質(例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP))、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)が挙げられる。好適な放射性標識としては、例えば、32P、33P、14C、125I、131I、35S、および3Hが挙げられる。好適な蛍光標識としては、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、DYLIGHT(商標) 488、フィコエリトリン(PE)、ヨウ化プロピジウム(PI)、PerCP、PE−ALEXA FLUOR(登録商標) 700、Cy5、アロフィコシアニン、およびCy7が挙げられるがそれに限定されない。発光標識としては、例えば、様々な発光性ランタニド(例えば、ユウロピウムまたはテルビウム)キレートのいずれかが挙げられる。例えば、好適なユウロピウムキレートとしては、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)またはテトラアザシクロドデカン−1,4,7,10−四酢酸(DOTA)のユウロピウムキレートが挙げられる。酵素標識としては、例えば、アルカリホスファターゼ、CAT、ルシフェラーゼ、および西洋ワサビペルオキシダーゼが挙げられる。
2つのタンパク質(例えば、抗体および異種部分)は、多数の公知の化学架橋剤のいずれかを使用して架橋することができる。そのような架橋剤の例は、「ヒンダード」(hindered)ジスルフィド結合を含む連結を介して2つのアミノ酸残基を連結するものである。これらの連結において、架橋単位内のジスルフィド結合は、例えば、還元されたグルタチオンまたは酵素ジスルフィドレダクターゼの作用により、還元から保護される(ジスルフィド結合のいずれかの側の基を邪魔することによる)。1つの好適な試薬、4−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α(2−ピリジルジチオ)トルエン(SMPT)は、タンパク質の1つにおける末端リシンおよび他方における末端システインを利用して2つのタンパク質間にそのような連結を形成する。各タンパク質上の異なるカップリング部分により架橋するヘテロ二官能性試薬もまた使用することができる。他の有用なクロスリンカーとしては、2つのアミノ基(例えば、N−5−アジド−2−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド)、2つのスルフヒドリル基(例えば、1,4−ビス−マレイミドブタン)、アミノ基およびスルフヒドリル基(例えば、m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル)、アミノ基およびカルボキシル基(例えば、4−[p−アジドサリチルアミド]ブチルアミン)、ならびにアミノ基およびアルギニンの側鎖中に存在するグアニジニウム基(例えば、p−アジドフェニルグリオキサール一水和物)を連結する試薬が挙げられるがそれに限定されない。
一部の実施形態では、放射性標識は、抗体のアミノ酸骨格に直接的にコンジュゲート化させることができる。代替的に、放射性標識は、タンパク質骨格に結合しているより大きい分子(例えば、関係のあるタンパク質のメタ−ヨードフェニル(mIP)誘導体を形成するために遊離アミノ基に結合するメタ−[125I]ヨードフェニル−N−ヒドロキシスクシンイミド([125I]mIPNHS中の125I(例えば、ロジャーズら(Rogers et al.)(1997)J. Nucl. Med. 38:1221−1229を参照)またはキレート(例えば、DOTAもしくはDTPA)の部分として含めることができる。放射性標識またはそれを含有するより大きい分子/キレートを本明細書に記載の抗体または抗原結合性断片にコンジュゲート化する方法は当該技術分野において公知である。そのような方法は、放射性標識またはキレートのタンパク質への結合を促す条件(例えば、pH、塩濃度、および/または温度)下でタンパク質を放射性標識とインキュベートすることを伴う(例えば、米国特許第6,001,329号明細書を参照)。
蛍光標識(フルオロフォアと称されることがある)をタンパク質(例えば、抗体)にコンジュゲート化する方法はタンパク質化学の技術分野において公知である。例えば、フルオロフォアは、フルオロフォアに取り付けられたスクシンイミジル(NHS)エステルまたはテトラフルオロフェニル(TFP)エステル部分を使用してタンパク質の(例えば、リシンの)遊離アミノ基または(例えば、システインの)スルフヒドリル基にコンジュゲート化することができる。一部の実施形態では、フルオロフォアは、スルホ−SMCCなどのヘテロ二官能性クロスリンカー部分にコンジュゲート化することができる。好適なコンジュゲーション方法は、フルオロフォアのタンパク質への結合を促す条件下で抗体タンパク質またはその断片をフルオロフォアとインキュベートすることを伴う。例えば、ウェルチ(Welch)およびレドバンリー(Redvanly)(2003)Handbook of Radiopharmaceuticals:Radiochemistry and Applications, ジョン・ウィリー・アンド・サンズ(John Wiley and Sons)を参照。
一部の実施形態では、抗体または断片は、例えば、循環中、例えば、血液、血清、または他の組織中の抗体の安定化および/または保持を向上させる部分を用いて修飾することができる。例えば、抗体または断片は、例えば、リーら(Lee et al.)(1999)Bioconjug. Chem. 10(6):973−8;キンストラーら(Kinstler et al.)(2002)Advanced Drug Deliveries Reviews 54:477−485;およびロバーツら(Roberts et al.)(2002)Advanced Drug Deliveries Reviews 54:459−476に記載されるようにPEG化、またはHES化(フレゼニウス・カビ(Fresenius Kabi)、ドイツ)(例えば、パヴィシッチら(Pavisic et al.)(2010)Int. J. Pharm. 387(1−2):110−119を参照)することができる。安定化部分は、少なくとも、例えば、1.5(または少なくとも2、5、10、15、20、25、30、40、または50またはより大きい)倍数だけ抗体(または断片)の安定性、または保持を向上させることができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合性断片は、グリコシル化されることができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合性断片は、抗体または断片が低減されたグリコシル化を有するまたはグリコシル化を有しないように、酵素もしくは化学処理に供し、または細胞から製造することができる。低減されたグリコシル化を有する抗体を製造する方法は当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第6,933,368号明細書;ライトら(Wright et al.)(1991)EMBO J. 10(10):2717−2723;およびコら(Co et al.)(1993)Mol. Immunol. 30:1361に記載されている。
医薬組成物および製剤
本開示の多重特異性抗原結合性構築物または単離されたモノクローナル抗体、もしくはその抗原結合性部分もしくは断片および薬学的に許容される担体を含む組成物もまた提供される。組成物は、本明細書に開示される方法と共に使用される希釈剤、可溶化剤、乳化剤、防腐剤、および/またはアジュバントをさらに含むことができる。そのような組成物は、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物から利益を得るであろう、がんまたは自己免疫障害などの他の状態を有する対象において使用することができる。
本開示の多重特異性抗原結合性構築物または単離されたモノクローナル抗体、もしくはその抗原結合性部分もしくは断片および薬学的に許容される担体を含む組成物もまた提供される。組成物は、本明細書に開示される方法と共に使用される希釈剤、可溶化剤、乳化剤、防腐剤、および/またはアジュバントをさらに含むことができる。そのような組成物は、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物から利益を得るであろう、がんまたは自己免疫障害などの他の状態を有する対象において使用することができる。
ある特定の実施形態では、許容される製剤材料は、好ましくは、用いられる投与量および濃度においてレシピエントに対して非毒性である。ある特定の実施形態では、製剤材料はs.c.および/またはI.V.投与用である。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、組成物の例えば、pH、重量オスモル濃度、粘度、透明性、色、等張性、匂い、無菌状態、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着または透過を改変、維持または保存するための製剤材料を含有することができる。ある特定の実施形態では、好適な製剤材料としては、アミノ酸(例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシン);抗菌物質;抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムもしくは亜硫酸水素ナトリウム);緩衝剤(例えば、ボレート、ビカルボネート、Tris−HCl、シトレート、ホスフェートもしくは他の有機酸);充填剤(例えば、マンニトールもしくはグリシン);キレート剤(例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA));錯化剤(例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリンもしくはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン);充填剤;単糖、二糖、および他の炭水化物(例えば、グルコース、マンノースもしくはデキストリン);タンパク質(例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン);着色、香味および希釈剤;乳化剤;親水性ポリマー(例えば、ポリビニルピロリドン);低分子量ポリペプチド;塩形成対イオン(例えば、ナトリウム);防腐剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸もしくは過酸化水素);溶剤(例えば、グリセリン、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール);糖アルコール(例えば、マンニトールもしくはソルビトール);懸濁化剤;界面活性剤もしくは湿潤剤(例えば、プルロニック(登録商標)、PEG、ソルビタンエステル、ポリソルベート20、ポリソルベート80などのポリソルベート、triton、トロメタミン、レシチン、コレステロール、tyloxapal);安定性増進剤(例えば、スクロースもしくはソルビトール);張度増進剤(例えば、ハロゲン化アルカリ金属、好ましくは、塩化ナトリウムもしくはカリウム、マンニトール、ソルビトール);送達溶媒;希釈剤;賦形剤ならびに/または薬学的アジュバントが挙げられるがそれに限定されない。(アレン(Allen)(2012)Remington −The Science and Practice of Pharmacy, 22d Edition, ロイド、ブイ、アレン(Lloyd V、Allen)編, ザ・ファーマシューティカル・プレス(The Pharmaceutical Press))。ある特定の実施形態では、製剤は、PBS;20mMのNaOAC、pH5.2、50mMのNaCl;および/または10mMのNaOAC、pH5.2、9%のスクロースを含む。ある特定の実施形態では、最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達フォーマットおよび所望の投与量に依存して当業者により決定される。例えば、アレン(Allen)(2012)Remington − The Science and Practice of Pharmacy, 22d Edition, ロイド、ブイ、アレン(Lloyd V、Allen)編, ザ・ファーマシューティカル・プレス(The Pharmaceutical Press)を参照。ある特定の実施形態では、そのような組成物は、多重特異性抗原結合性構築物の物理的状態、安定性、in vivo放出の速度および/またはin vivoクリアランスの速度に影響を及ぼすことができる。
ある特定の実施形態では、医薬組成物中の主要な溶媒または担体は、水性または非水性のいずれかの性質であることができる。例えば、ある特定の実施形態では、好適な溶媒または担体は、場合により非経口投与用の組成物において一般的な他の材料を添加した、注射用の水、生理食塩水溶液または人工脳脊髄液であることができる。ある特定の実施形態では、生理食塩水は等張リン酸緩衝生理食塩水を含む。ある特定の実施形態では、血清アルブミンと混合された中性の緩衝生理食塩水または生理食塩水はさらなる例示的な溶媒である。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、約pH7.0〜8.5のTris緩衝液、または約pH4.0〜5.5の酢酸緩衝液を含み、これらはソルビトールまたはしたがって(therefore)好適な代替物をさらに含むことができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される多重特異性抗原結合性構築物を含む組成物は、凍結乾燥ケーキまたは水性溶液の形態において所望の純度を有する選択された組成物を任意選択の製剤物質と混合することにより貯蔵用に調製することができる(アレン(Allen)(2012)Remington − The Science and Practice of Pharmacy, 22d Edition, ロイド、ブイ、アレン(Lloyd V、Allen)編, ザ・ファーマシューティカル・プレス(The Pharmaceutical Press))。さらに、ある特定の実施形態では、本明細書に開示される多重特異性抗原結合性構築物を含む組成物は、スクロースなどの適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として製剤化することができる。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、非経口送達用に選択することができる。ある特定の実施形態では、組成物は、吸入用または経口的などの消化管を通じた送達用に選択することができる。そのような薬学的に許容される組成物の調製は当業者の能力の範囲内である。
ある特定の実施形態では、製剤成分は、投与の部位にとって許容される濃度において存在する。ある特定の実施形態では、生理的pHまたはわずかにより低いpH、典型的には、約5〜約8のpH範囲内に組成物を維持するために緩衝剤が使用される。
非経口投与が想定される場合のある特定の実施形態では、治療用組成物は、薬学的に許容される溶媒中に多重特異性抗原結合性構築物を含む、発熱物質非含有の非経口的に許容される水性溶液の形態であることができる。ある特定の実施形態では、非経口注射用の溶媒は、多重特異性抗原結合性構築物がその中に無菌の等張溶液として製剤化され、適切に保存される無菌の蒸留水である。ある特定の実施形態では、調製物は、次にデポー注射を介して送達することができる製造物の制御または持続放出を提供することができる、注射可能なマイクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー化合物(例えば、ポリ乳酸もしくはポリグリコール酸)、ビーズまたはリポソームなどの剤を含む所望の分子の製剤を伴うことができる。ある特定の実施形態では、ヒアルロン酸もまた使用することができ、これは、循環中の持続期間を促進する効果を有することができる。ある特定の実施形態では、所望の分子を導入するために、埋込み可能な薬物送達デバイスを使用することができる。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は吸入用に製剤化することができる。ある特定の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は、吸入用の乾燥粉末として製剤化することができる。ある特定の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物を含む吸入溶液は、エアロゾル送達用の噴射剤を用いて製剤化することができる。ある特定の実施形態では、溶液を噴霧することができる。肺投与は、化学的に修飾されたタンパク質の肺送達を記載するPCT出願第PCT/US94/001875号にさらに記載されている。
ある特定の実施形態では、製剤は経口的に投与できることが想定される。ある特定の実施形態では、この様式において投与される多重特異性抗原結合性構築物は、錠剤およびカプセルなどの固体投与形態の配合において慣習的に使用される担体を用いてまたは用いずに製剤化することができる。ある特定の実施形態では、バイオアベイラビリティが最大化され、前全身性分解が最小化される胃腸管中の点において製剤の活性部分を放出するようにカプセルを設計することができる。ある特定の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物の吸収を促すために少なくとも1つの追加の剤を含めることができる。ある特定の実施形態では、希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、および結合剤もまた用いることができる。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、錠剤の生産のために好適な非毒性の賦形剤との混合状態の有効量の多重特異性抗原結合性構築物を伴うことができる。ある特定の実施形態では、無菌水または他の適切な溶媒中に錠剤を溶解することにより、溶液を単位用量形態において調製することができる。ある特定の実施形態では、好適な賦形剤としては、炭酸カルシウム、炭酸もしくは重炭酸ナトリウム、ラクトース、もしくはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤;またはデンプン、ゼラチン、もしくはアカシアなどの結合剤;またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、もしくはタルクなどの潤滑剤が挙げられるがそれに限定されない。
追加の医薬組成物が当業者により選択されることができ、これには、持続または制御送達製剤中の多重特異性抗原結合性構築物を伴う製剤が含まれる。ある特定の実施形態では、リポソーム担体、生体内分解性マイクロ粒子または多孔性ビーズおよびデポー注射などの、様々な他の持続または制御送達手段を製剤化するための技術もまた当業者に公知である。例えば、医薬組成物の送達用の多孔性ポリマーマイクロ粒子の制御放出を記載するPCT出願第PCT/US93/00829号を参照。ある特定の実施形態では、持続放出調製物は、成形物品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリックスを含むことができる。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ハイドロゲル、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号明細書および欧州特許出願公開第058,481号明細書)、L−グルタミン酸およびガンマエチル−L−グルタメートのコポリマー(シドマンら(Sidman et al.)(1993)Biopolymers 22:547−556)、ポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリレート)(ランガーら(Langer et al.)(1981)J Biomed Mater. Res. 15:167−277;およびランガー(Langer)(1982)Chem. Tech. 12:98−105)、エチレン酢酸ビニル(ランガーら(Langer et al.))またはポリ−D(−)−3−ヒドロキシ酪酸(欧州特許第133,988号明細書)を含むことができる。ある特定の実施形態では、持続放出組成物はまた、当該技術分野において公知の幾つかの方法のいずれかにより調製できるリポソームを含むことができる(例えば、エプスタインら(Eppstein et al.)(1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688−3692;欧州特許第036,676号明細書;欧州特許第088,046号明細書;および欧州特許第143,949号明細書を参照)。
in vivo投与のために使用される医薬組成物は典型的には無菌である。ある特定の実施形態では、滅菌は、無菌濾過膜を通じた濾過により達成される。ある特定の実施形態では、組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後のいずれかにおいて実行することができる。ある特定の実施形態では、非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態でまたは溶液中に貯蔵することができる。ある特定の実施形態では、非経口組成物は、一般に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針により貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルに入れられる。
ある特定の実施形態では、医薬組成物が製剤化されたら、それを溶液、懸濁液、ゲル、エマルション、固体としてまたは脱水もしくは凍結乾燥粉末として無菌バイアル中に貯蔵することができる。ある特定の実施形態では、そのような製剤は、使用準備済みの形態または投与前に再構成される(例えば、凍結乾燥された)形態のいずれかにおいて貯蔵することができる。
ある特定の実施形態では、単回用量投与単位を製造するためのキットが提供される。ある特定の実施形態では、キットは、乾燥タンパク質を有する第1の容器および水性製剤を有する第2の容器の両方を含有することができる。ある特定の実施形態では、シングルおよびマルチチャンバー事前充填シリンジを含有するキットが含まれる。
ある特定の実施形態では、治療的に用いられる多重特異性抗原結合性構築物を含む医薬組成物の有効量は、例えば、治療的な文脈および目的に依存する。ある特定の実施形態による治療用の適切な投与量レベルは、部分的には、送達される分子、多重特異性抗原結合性構築物が使用されている適応症、投与の経路、ならびに患者のサイズ(体重、身体表面もしくは臓器サイズ)および/または状態(年齢および全般的健康)に依存して変動することを当業者は理解する。臨床医は、最適な治療効果を得るために投与量を滴定し、投与の経路を改変することができる。
臨床医はまた、使用される製剤中の多重特異性抗原結合性構築物の薬物動態パラメーターを考慮に入れて、投薬の頻度を選択する。ある特定の実施形態では、臨床医は、所望の効果を達成する投与量に達するまで組成物を投与する。ある特定の実施形態では、組成物は、したがって、単回用量としてもしくは経時的な2つもしくはより多くの用量(同じ量の所望の分子を含有してもよく、もしくはそうでなくてもよい)として、または、例えば埋込みデバイスもしくはカテーテルを介して、連続注入として、投与することができる。適切な投与量のさらなる精密化は当業者により慣例的に為され、当業者により慣例的に行われるタスクの範囲内である。ある特定の実施形態では、適切な投与量は、適切な用量応答データの使用を通じて確認することができる。
ある特定の実施形態では、医薬組成物の投与の経路は、公知の方法、例えば、経口的なもの、静脈内、腹腔内、脳内(実質内)、脳内、脳室内、筋肉内、皮下、眼内、動脈内、門脈内、もしくは病巣内経路による注射を通じたもの、持続放出システムによるものまたは埋込みデバイスによるものに従って為される。ある特定の実施形態では、組成物は、ボーラス注射によりまたは注入により連続的に、または埋込みデバイスにより投与することができる。ある特定の実施形態では、併用療法の個々の要素は、異なる経路により投与することができる。
ある特定の実施形態では、組成物は、例えば、手術の間にまたは外用で、局所的に投与することができる。任意選択で、局所投与は、所望の分子が吸収または被包された膜、スポンジ、または別の適切な材料の埋込みを介して為される。ある特定の実施形態では、埋込みデバイスが使用される場合、デバイスは、任意の好適な組織または臓器に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、徐放性ボーラス、または連続的な投与を介して為され得る。
ある特定の実施形態では、ex vivoの方式において多重特異性抗原結合性構築物を含む医薬組成物を使用することが望ましいことがある。そのような事例では、患者から除去された細胞、組織(例えば、血液を含む)および/または臓器は、多重特異性抗原結合性構築物を含む医薬組成物に曝露され、その後に細胞、組織および/または臓器は再び患者に埋め込まれる。
ある特定の実施形態では、抗原結合性構築物は、ポリペプチドを発現および分泌するように本明細書に記載の方法などの方法を使用して遺伝子操作されたある特定の細胞を埋め込むことにより送達することができる。ある特定の実施形態では、そのような細胞は動物またはヒト細胞であることができ、自己、異種由来の、または異種間のものであることができる。ある特定の実施形態では、細胞を不死化させることができる。ある特定の実施形態では、免疫学的応答の可能性を減少させるために、細胞を被包して周囲組織の浸潤を回避することができる。ある特定の実施形態では、被包材料は、典型的には、タンパク質生成物の放出を可能とするが、患者の免疫系によるまたは周囲組織からの他の有害な因子による細胞の破壊を防止する生体適合性の半透性ポリマーエンクロージャまたは膜である。
多重特異性抗原結合性構築物の使用方法
本明細書に記載されるように、本開示は、それを必要とする対象において増殖性障害を治療する方法であって、対象に治療有効量の本開示の多重特異性抗原結合性構築物(例えば、二重特異性抗原結合性構築物)を投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象において免疫応答を増進する(例えば、増進したNKおよび/またはT細胞機能;増進したNKおよび/またはT細胞媒介性応答;T細胞からの増加したサイトカイン、例えば、IFNγの分泌および/または産生;細胞溶解活性を含む、増進したNK細胞および/またはT細胞機能;増進したマクロファージ機能;増進したADCC機能)方法であって、対象に治療有効量の本開示の多重特異性抗原結合性構築物または構築物を含む組成物を投与することを含む、方法を提供する。本明細書において例示されるように、免疫応答の増進は、単一の標的を有する剤と比較して多重特異性抗原結合性構築物の投与でより大きい。一部の実施形態では、免疫応答の増進は、腫瘍もしくはB細胞抗原単独またはNKp30もしくは他のNK活性化受容体単独に結合する剤と比較して少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、またはより大きく高い。これらの効果は、腫瘍抗原発現のレベルにかかわらず(すなわち、腫瘍抗原の高いレベルを有する標的細胞中の他に、腫瘍抗原の低いレベルを有する標的細胞中で)起こる。
本明細書に記載されるように、本開示は、それを必要とする対象において増殖性障害を治療する方法であって、対象に治療有効量の本開示の多重特異性抗原結合性構築物(例えば、二重特異性抗原結合性構築物)を投与することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象において免疫応答を増進する(例えば、増進したNKおよび/またはT細胞機能;増進したNKおよび/またはT細胞媒介性応答;T細胞からの増加したサイトカイン、例えば、IFNγの分泌および/または産生;細胞溶解活性を含む、増進したNK細胞および/またはT細胞機能;増進したマクロファージ機能;増進したADCC機能)方法であって、対象に治療有効量の本開示の多重特異性抗原結合性構築物または構築物を含む組成物を投与することを含む、方法を提供する。本明細書において例示されるように、免疫応答の増進は、単一の標的を有する剤と比較して多重特異性抗原結合性構築物の投与でより大きい。一部の実施形態では、免疫応答の増進は、腫瘍もしくはB細胞抗原単独またはNKp30もしくは他のNK活性化受容体単独に結合する剤と比較して少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、またはより大きく高い。これらの効果は、腫瘍抗原発現のレベルにかかわらず(すなわち、腫瘍抗原の高いレベルを有する標的細胞中の他に、腫瘍抗原の低いレベルを有する標的細胞中で)起こる。
本明細書に記載の組成物は、とりわけ、対象において様々ながんまたは状態を治療し、その進行を遅延させ、または予防する方法において有用である。がんまたは状態はCD16欠損性微環境を含むことができる。任意選択で、CD16微環境は、対象に対する造血幹細胞移植と関連付けられる。CD16欠損性微環境は、対照NK細胞(例えば、休止NK細胞、対象からの健常NK細胞、健常個体からのNK細胞)と比較して50%未満のCD16の発現を有する浸潤性NK細胞の集団を含むことができる。任意選択で、浸潤性NK細胞は、対照NK細胞と比較して45%未満、40%未満、35%未満、30%未満、25%未満、20%未満、15%未満、10%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、または1%未満のCD16の発現を有する。一部の対象中の浸潤性NK細胞はCD16を発現しない。他の実施形態では、CD16欠損性微環境は、浸潤性NK細胞の少なくとも10%が対照NK細胞と比較して低減されたCD16の発現を有する浸潤性NK細胞の集団を含む。任意選択で、CD16欠損性微環境は、浸潤性NK細胞の少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、または少なくとも50%が対照NK細胞と比較して低減されたCD16の発現を有する浸潤性NK細胞の集団を含む。他の実施形態では、NK細胞は150,000未満のCD16コピー数を有する。任意選択で、NK細胞は、140,000未満、130,000未満、120,000未満、110,000未満、100,000未満、75,000未満、50,000未満、または25,000未満のCD16コピー数を有する。
本明細書に記載の方法および使用を使用して治療されるがんまたは増殖性障害もしくは腫瘍としては、血液がん、リンパ腫、骨髄腫、白血病、神経学的がん、皮膚がん、乳がん、前立腺がん、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がん、胃腸がん、肝臓がん、膵臓がん、泌尿生殖器がん、骨がん、腎臓がん、および血管がんが挙げられるがそれに限定されない。任意選択で、がんは、カポジ肉腫、白血病、急性リンパ性白血病(etv6、aml1、シクロフィリンb)、急性骨髄球性白血病、骨髄芽球性前骨髄球性骨髄単球性単球性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄球性(顆粒球性)白血病、慢性リンパ性白血病(シクロフィリンb)、マントル細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、バーキットリンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫(Ig−イディオタイプ)、真性多血症リンパ、ホジキン病(Imp−1、EBNA−1)、非ホジキン病、骨髄腫(MUCファミリー、p21ras)、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、肉腫、癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸肉腫、結腸癌(p21ras、HER2/neu、c−erbB−2、MUCファミリー)、膵臓がん、乳がん(MUCファミリー、HER2/neu、c−erbB−2)、卵巣がん、前立腺がん(前立腺特異的抗原(PSA)およびその抗原エピトープPSA−1、PSA−2、およびPSA−3、PSMA、HER2/neu、c−erbB−2、ga733糖タンパク質)、扁平細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌(HER2/neu、c−erbB−2)、ヘパトーマ、肝細胞がん(α−フェトプロテイン)、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、子宮がん、精巣腫瘍(NY−ESO−1)、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌(HER2/neu、c−erbB−2)、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫(E−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、γ−カテニン、p120ctn)、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫(p5タンパク質、gp75、がん胎児性抗原、GM2およびGD2ガングリオシド、Melan−A/MART−1、cdc27、MAGE−3、p21ras、gp100)、神経芽腫、網膜芽腫、鼻咽頭癌(Imp−1、EBNA−1)、食道癌、基底細胞癌、胆道がん(p21ras)、膀胱がん(p21ras)、骨がん、脳および中枢神経系(CNS)がん、子宮頸癌(p53、p21ras)、絨毛癌(CEA)、結腸直腸がん(結腸直腸関連抗原(CRC)−CO17−1A/GA733、APC)、結合組織がん、消化器系のがん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、頭頸部がん、胃がん(HER2/neu、c−erbB−2、ga733糖タンパク質)、上皮細胞がん(シクロフィリンb)、上皮内新生物、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん(小細胞、大細胞)(CEA、MAGE−3、NY−ESO−1)、口腔がん(例えば、口唇、舌、口、および咽頭がん)、卵巣がん(MUCファミリー、HER2/neu、c−erbB−2)、膵臓がん、直腸がん、呼吸器系のがん、皮膚がん、甲状腺がん、および泌尿器系のがんからなる群から選択される。
組成物は、部分的には投与の経路に依存する様々な方法を使用して対象、例えば、ヒト対象に投与することができる。経路は、例えば、静脈注射もしくは注入(IV)、皮下注射(SC)、腹腔内(IP)注射、筋肉内注射(IM)、皮内注射(ID)、経口、頭蓋内注射、または髄腔内注射(IT)であることができる。注射は、ボーラスまたは連続注入において行うことができる。
本明細書に記載されるように、BCMAおよびNKp30の両方を標的化する多重特異性抗原結合性構築物は、骨髄中の形質細胞を特異的に枯渇させることができる。これは、そのような構築物は、B細胞などの標的細胞集団の枯渇が必要とされる障害、例えば、全体的または部分的に自己反応性B細胞または抗体により媒介される障害の治療のために有用であることを指し示す。よって、さらに別の態様では、本開示は、対象から標的細胞(例えば、腫瘍細胞またはB系列細胞)を枯渇させる方法であって、それを必要とする対象に標的抗原を発現する1つまたは複数の標的細胞を枯渇させるために十分な量の本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物を投与することを含み、多重特異性結合構築物が少なくとも2つの連結した抗原結合単位を含み、第1の抗原結合単位が、標的抗原に特異的に結合し、第2の抗原結合単位が、NKp30抗原に特異的に結合する、方法を特徴とする。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は第3の抗原結合単位を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は第3の抗原結合単位および第4の抗原結合単位を含む。一部の実施形態では、標的抗原は、本明細書に記載のまたは当該技術分野において公知の任意の腫瘍抗原などの腫瘍抗原である。一部の実施形態では、標的細胞は、自己反応性B細胞などのB細胞であり、そのような場合、標的抗原は、B細胞特異的、B細胞拘束、またはB細胞濃縮抗原、例えば、CD20またはBCMAである。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象は自己免疫状態に罹患している。一部の実施形態では、自己免疫状態は、全体的または部分的に自己反応性B細胞により媒介される。一部の実施形態では、標的細胞が枯渇されている対象は赤芽球癆を有するまたはそのリスクがある。赤芽球癆は、例えば、同種幹細胞移植後のABO血液群不適合に起因することができる。一部のそのような実施形態では、対象は血液群Oを有し、同種幹細胞移植は血液群Aのドナーからのものであった。標的細胞を枯渇されている対象が赤芽球癆を有するまたはそのリスクがあるそれらの実施形態では、標的細胞は、例えば、標的血漿B細胞である。よって、一部の実施形態では、標的抗原は、例えば、血漿B細胞上に見出されるが他のB細胞上には見出されない抗原である。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、本明細書において提供される多重特異性構築物を用いて治療されている対象は、例えば、ギラン・バレー症候群(GBS)、重症筋無力症、SLE、ANCA関連血管炎、炎症性ミオパチー、びまん性強皮症、自己免疫性髄膜脳炎、関節リウマチ、クリオグロブリン血症、および原発性APSなどにおける、治療的血漿交換が一次標準治療またはファーストライン補助療法(first−line adjunct)である疾患または障害を有する。ザ・アメリカン・ソサイエティ・フォー・アフェレーシス(The American Society for Apheresis)(ASFA)ガイドライン2016年版は、プラスマフェレーシスという用語を「血液の他の成分から血漿を分離する医療用デバイスに患者またはドナーの血液を通過させ、コロイド置換液を使用することなく血漿を除去する(すなわち、総血漿体積の15%未満)手順」と定義し、TPE(治療的血漿交換)を「血液の他の成分から血漿を分離する医療用デバイスに患者の血液を通過させる治療的手順。血漿は除去され、コロイド溶液(例えば、アルブミンおよび/もしくは血漿)またはクリスタロイド/コロイド溶液の組合せなどの置換液で置き換えられる。」と定義している。そのため、本明細書において使用される場合、TPEは、病原性自己抗体、免疫複合体、クリオグロブリン、骨髄腫軽鎖(myeloma light chains)、エンドトキシン、およびコレステロールを含有するリポタンパク質などの高分子量物質(>15,000Da)の除去のための体外血液精製技術である。よって、一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物は、例えば、「併発性全身性ループスエリテマトーデスおよび他の自己免疫疾患の管理としての治療的血漿交換(Therapeutic Plasma Exchange as Management of Complicated Systemic Lupus Erythematosus and Other Autoimmune Diseases)」、ディー・アギーレ−バレンシアら(D. Aguirre−Valencia et al.), Autoimmune Diseases (2019) Article ID 5350960(内容の全体を参照により本願明細書に援用する)の表1に列記される任意の自己免疫疾患などの、血漿からの成分を枯渇させるためにTPEが使用される適応症において使用することができる。
別の態様では、本開示は、全体的または部分的に自己反応性B細胞により媒介される炎症状態(例えば、自己免疫状態)を有する対象を治療する方法であって、対象に標的抗原を発現する1つまたは複数の自己反応性B細胞を枯渇させるために十分な量の本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物を投与することを含む、方法を特徴とする。対象に有効量の本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物を投与することにより自己反応性B細胞性炎症状態を有する対象を治療する方法もまた提供される。任意選択で、有効量の多重特異性抗原結合性構築物またはその医薬組成物は、IgG、IgM、またはIgAを発現する形質細胞の骨髄レベルを低減する。本明細書において使用される場合、自己反応性B細胞性炎症状態は、自己反応性B細胞により媒介される自己免疫疾患であり、例としては、自己反応性B細胞により媒介される自己免疫疾患が挙げられる。本明細書に記載の方法は、対象に抗炎症剤、例えば、炎症または自己免疫疾患もしくは状態を治療するために使用される抗炎症剤(コルチコステロイド、DMARDs、もしくは抗サイトカイン剤)または他の剤を投与することを含むことができる。任意選択で、標的抗原は、B細胞特異的、B細胞拘束、またはB細胞濃縮抗原、例えば、CD20、CD19、またはBCMAである。一部の実施形態では、全体的または部分的に自己反応性B細胞により媒介される自己免疫疾患は、全身性ループスエリテマトーデス(SLE)、シェーグレン症候群、1型糖尿病、アジソン病、悪性貧血、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、関節リウマチ、重症筋無力症、原発性胆汁胆管炎、グッドパスチャー病、原発性膜性腎症、卵巣不全、尋常性天疱瘡、および自己免疫性睾丸炎からなる群から選択されるものであることができる。他のそのような自己免疫疾患は当該技術分野において公知であり、例えば、ルートヴィヒら(Ludwig et al.)(2017)Frontiers in Immunol 8:Article 603およびホフマンら(Hofmann et al.)(2018)Frontiers in Immunol 9:Article 835に記載されている。本明細書に記載の構築物および方法を使用して治療することができる異常なB細胞を伴う他の適応症としては、軽鎖アミロイドーシス、尋常性天疱瘡、および免疫性血小板減少症が挙げられる。
例えば、重症筋無力症は、腕および脚を含む骨格筋において虚弱を引き起こす慢性の自己免疫性神経筋疾患である。重症筋無力症において、抗体(免疫タンパク質)は、筋肉の収縮を防止する神経筋接合部におけるアセチルコリンの受容体を遮断、変更、または妨害する。この疾患の有病率は100,000人当たり約20症例であり、重症筋無力症を有するほとんどの個体において、疾患は、アセチルコリン受容体自体に対する抗体により引き起こされる。しかしながら、MuSK(筋肉特異的キナーゼ)タンパク質などの他のタンパク質に対する抗体もまた、神経筋接合部における伝達の障害に繋がることがある。重症筋無力症を治療するために典型的に使用されるコルチコステロイドおよび免疫抑制剤は、多数の重大な副作用と関連付けられる。例えば、ソリリス(Soliris)のみの使用は、ACh受容体を標的とする病原性IgGによりリクルートされた補体の活性を遮断する。それは、病原性IgGによるAch受容体の遮断にも、これらのIgGによる受容体の架橋および内部移行にも対処しない。
軽鎖アミロイドーシスまたはALアミロイドーシスは、形質細胞の群が多過ぎる軽鎖を作り、それがミスフォールディングおよび凝集してアミロイド原線維を形成する障害である。原線維は次に臓器中に沈着する。影響される最も一般的な臓器は心臓および腎臓である。軽鎖アミロイドーシスはまた、胃、大腸、肝臓、神経および皮膚に影響することがある。軽鎖アミロイドーシスの有病率は1,000,000人当たり約40症例である。最大80%の患者が自己幹細胞移植(ASCT)に不適格であり、形質細胞指向性化学療法は、アミロイド沈着により引き起こされる臓器機能障害の対処に不十分であることが示されている。
100,000人当たり約1〜10患者の有病率を有する尋常性天疱瘡は、見かけ上は健常な皮膚および粘膜における上皮内の水疱および大規模なびらんにより特徴付けられる珍しい潜在的に致死性の自己免疫障害である。尋常性天疱瘡は、カルシウム依存性カドヘリンデスモグレイン1およびデスモグレイン3を標的とするIgG自己抗体により特徴付けられる。これらの膜貫通糖タンパク質は、上皮細胞間の細胞−細胞接着およびシグナル伝達に影響する。棘融解(結果的な上皮水疱形成を伴う細胞間接着の喪失)は、自己抗体結合によるデスモグレイン機能の直接的な阻害または細胞−細胞接着の下方調節を結果としてもたらす自己抗体誘導性細胞シグナル伝達のいずれかの結果としてもたらされる。自己抗体は、活動性疾患の間に血清および皮膚の両方に存在する。粘膜表面を含む、層状扁平上皮の任意の区画が影響され得る。コルチコステロイドおよび免疫抑制剤に応答しない患者は、IV Igまたはリツキサンを用いて治療される。IV Igおよびリツキサンを用いた場合でも、完全寛解には数か月要することがあり、一部の患者は応答しない。
100,000人当たり約9.5症例の有病率を有する免疫性血小板減少症(ITP)は、自己抗体が正常な血小板に対して産生される場合に起こる。血小板は破壊され、身体から排除されて、影響された個体におけるこれらの細胞の不足が結果としてもたらされる。これらの抗体の一部はまた、血小板を産生する骨髄中の細胞(巨核球)に影響し、それが血小板産生の減少に繋がって、血液中の血小板の数をさらに低減する。ITPの治療は、典型的には、血小板の自己免疫破壊の低減、または特定の増殖因子を用いる血小板産生の直接的な刺激のいずれかに集中する。IV Igおよびプラスマフェレーシスの使用は深刻な合併症に繋がることがあり、トロンボポエチン受容体アゴニストは血液血小板数の増加に繋がるが、血小板の基礎となる破壊に対処しない。
よって、本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性構築物を用いて治療されている対象は、重症筋無力症、軽鎖アミロイドーシス、尋常性天疱瘡、および免疫性血小板減少症から選択される疾患を有する。
一部の実施形態では、そのような多重特異性構築物は、コルチコステロイド、DMARDs、または抗サイトカイン療法などの炎症性障害(例えば、自己免疫疾患)に対する他の療法と組み合わせることができる。
そのため、自己反応性B細胞性炎症状態を有する対象を治療する方法であって、対象に有効量の少なくとも2つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、第1の抗原結合単位が、B系列細胞により発現される第1の標的抗原に特異的に結合し、第2の抗原結合単位が、NKp30抗原に特異的に結合する、多重特異性抗原結合性構築物または構築物を含む医薬組成物を投与することによるものである、方法が本明細書において提供される。自己反応性B細胞性炎症状態という用語は、部分的または全体的に自己反応性B細胞または形質細胞により駆動される状態を含む。より特には、自己反応性B細胞媒介性炎症状態としては、本明細書に記載されるような多数の自己免疫状態が挙げられる。
有効量の多重特異性抗原結合性構築物または医薬組成物は、例えば、IgG、IgM、またはIgAを発現する形質細胞の骨髄レベルを低減する。方法は、任意選択で、対象に炎症性および自己免疫状態の治療において使用される抗炎症剤(例えば、コルチコステロイド、DMARDs、もしくは抗サイトカイン剤)または他の剤を投与することをさらに含む。
本明細書において使用される場合、対象という用語は哺乳動物対象を意味する。例示的な対象としては、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ラクダ、ヤギおよびヒツジが挙げられるがそれに限定されない。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象は、本明細書において提供される多重特異性抗原結合性構築物を用いて治療することができる疾患または状態を有するまたは有することが疑われる。一部の実施形態では、疾患または状態はがんである。一部の実施形態では、対象は、本明細書において提供される多重特異性抗原結合性構築物を用いて治療することができるがんを有するヒトである。一部の実施形態では、対象は、本明細書において提供される多重特異性抗原結合性構築物を用いて治療することができるがんを有することが疑われるヒトである。
任意の疾患または障害を治療することまたはその治療は、対象において存在する疾患または障害を寛解させることを指す。寛解という用語は、疾患状態、例えば、がんの治療における任意の治療的に有益な結果、重篤度もしくは進行の軽減、軽快もしくは軽快の継続期間の促進、またはその治癒を指す。そのため、治療することまたは治療としては、少なくとも1つの身体的パラメーターまたは症状を寛解させることが挙げられる。治療することまたは治療としては、身体的(例えば、認識可能な症状の安定化)または生理学的(例えば、身体的パラメーターの安定化)のいずれかまたは両方で、疾患または障害をモジュレートすることが挙げられる。治療することまたは治療としては、転移または進行を遅延させまたは予防することが挙げられる。
本明細書において使用される場合、投与することまたは投与は、粘膜、皮内、静脈内、筋肉内、皮下送達および/または本明細書に記載のもしくは当該技術分野において公知の任意の他の物理的送達方法などにより、身体の外側に存在する物質(例えば、本明細書において提供される多重特異性抗原結合性構築物)を患者の中に注射しまたは他に物理的に送達する行為を指す。疾患、またはその症状が治療されている場合、物質の投与は、典型的には、疾患またはその症状の開始後に行われる。疾患、またはその症状が予防されている場合、物質の投与は、典型的には、疾患またはその症状の開始前に行われる。
投与は、例えば、外用投与、局所注入、注射、またはインプラントの手段により達成することができる。インプラントは、シラスティック(sialastic)膜などの膜、または繊維を含む、多孔性、非多孔性、またはゼラチン状材料のものであることができる。インプラントは、対象への組成物の持続的または定期的な放出のために構成することができる。例えば、米国特許出願公開第20080241223号明細書;米国特許第5,501,856号明細書;同第4,863,457号明細書;および同第3,710,795号明細書;ならびに欧州特許第488401号明細書および欧州特許第430539号明細書を参照。組成物は、例えば、拡散性、浸食性、または対流性システムに基づく埋込み可能なデバイス、例えば、浸透ポンプ、生分解性インプラント、電気拡散システム、電気浸透システム、蒸気圧ポンプ、電気分解ポンプ、起泡性ポンプ、圧電ポンプ、浸食ベースのシステム、または電気機械システムによって対象に送達することができる。一部の実施形態では、本開示の多重特異性抗原結合性構築物は、局所投与によって対象に治療的に送達される。
本明細書において使用される場合、増進したT細胞機能またはT細胞の活性化という用語は、表面上に抗原特異的T細胞受容体を発現する成熟T細胞がそのコグネイト抗原を認識して、細胞周期に入ること、サイトカインまたは溶菌酵素を分泌すること、および細胞ベースのエフェクター機能を行うことを開始させるまたはそのためにコンピテントとなることにより応答する細胞プロセスを指す。T細胞活性化は、典型的には、完全に活性化されるために少なくとも2つのシグナルを必要とする。1つ目は抗原−主要組織適合複合体(MHC)によるT細胞抗原特異的受容体(TCR)のエンゲージメント後に起こり、2つ目は共刺激分子(例えば、CD28)のその後のエンゲージメントにより起こる。これらのシグナルは核に伝達され、T細胞のクローン性拡大増殖、細胞表面上の活性化マーカーの上方調節、エフェクター細胞への分化、細胞傷害性もしくはサイトカイン分泌の誘導、アポトーシスの誘導、またはその組合せを結果としてもたらす。一部の実施形態では、増進したT細胞機能はまた、T細胞の増進した生存および/または増進した増殖を包含する。そのような活性を測定する方法は当該技術分野において慣例的で公知であり、例示的な方法は実施例などにおいて本明細書に記載されている。
本明細書において使用される場合、T細胞媒介性応答という用語は、T細胞により媒介される任意の応答を指し、T細胞としては、エフェクターT細胞(例えば、CD8+細胞、エフェクターγδ T細胞)ならびにヘルパーT細胞(例えば、TH1、TH2、TH3、TH17、TH9、およびTFH細胞などのそのサブセットを含む、CD4+細胞)が挙げられるがそれに限定されない。T細胞媒介性応答としては、例えば、T細胞の細胞傷害性、T細胞のサイトカイン分泌、および増殖が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物により増進されるT細胞媒介性応答としては、パーフォリン−グランザイム経路および/またはTRAIL/FAS−L経路を通じた細胞溶解活性などの、エフェクターγδ T細胞により媒介される応答;ADCC媒介性細胞溶解またはサイトカイン分泌;ならびにTCR刺激、NKG2D刺激、および/またはIL−12もしくはIL−18誘導を通じたIFN−γおよびTNF−αのサイトカイン分泌が挙げられる。シー、ゾウら(C. Zou et al.), Oncotarget. (2017)8(5):8900−8909(内容の全体を参照により本願明細書に援用する)を参照。
対象においてがんを治療しもしくはその進行を遅延させまたは腫瘍成長を低減もしくは阻害する方法であって、対象に有効量の本明細書に記載されるような多重特異性抗原結合性構築物、抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートを投与することによる、方法もまた本明細書において提供される。任意選択で、投与はγδ T細胞媒介性細胞傷害性またはサイトカイン産生を増進する。
本明細書において使用される場合、治療有効量または有効量という用語は、対象に投与された場合に、疾患もしくは障害を治療するためまたは別の所望の効果を達成するために効果的(例えば、NK細胞またはエフェクターγδ T細胞などの他のNKp30発現エフェクター細胞による標的細胞(例えば、がん細胞またはB系列細胞)の殺傷を増進するために効果的)な多重特異性抗原結合性構築物の量を指す。対象におけるがんを治療もしくは予防することができるまたはin vitroもしくはin vivoでNK細胞による標的細胞の殺傷を増進することができる、本明細書に記載の抗体またはその断片の好適な用量は様々な要因に依存することができ、該要因としては、使用される具体的な構築物およびそれが他の治療剤と付随して使用されるかどうかが挙げられる。例えば、同じ対象を治療するために必要とされる多重特異性抗原結合性構築物の断片(例えば、単一の抗原結合単位)の用量と比較して異なる用量の多重特異性抗原結合性構築物全体ががんを有する対象を治療するために必要とされることがある。対象に投与される用量に影響する他の要因としては、例えば、がんまたは自己反応性B細胞媒介性状態の種類または重篤度が挙げられる。例えば、転移性黒色腫を有する対象は、膠芽腫を有する対象とは異なる多重特異性抗原結合性構築物の投与量の投与を必要とすることがある。同様に、重症筋無力症を有する対象は、全身性ループスエリテマトーデスを有する対象とは異なる投与量を必要とすることがある。他の要因としては、例えば、対象に同時にまたは以前に影響した他の医学的障害、対象の全般的健康、対象の遺伝学的傾向、食事、投与の時間、排出の速度、薬物の組合せ、および対象に投与される任意の他の追加の治療法を挙げることができる。任意の具体的な対象のための特定の投与量および治療レジメンは、治療施術者(例えば、医師または看護師)の判断にも依存することも理解されるべきである。治療有効量はまた、組成物の任意の毒性または有害効果を治療的に有益な効果が凌ぐものである。
医薬組成物は、治療有効量の本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物を含むことができる。そのような有効量は、上記のように当業者により容易に決定され得る。考慮としては、投与される多重特異性抗原結合性構築物の効果、または、1つより多くの剤が医薬組成物中でもしくはそれと共に使用される場合には、1つもしくは複数の追加の活性剤との多重特異性抗原結合性構築物の組合せの効果が挙げられる。
本明細書に記載の任意の多重特異性抗原結合性構築物の好適なヒト用量は、例えば、第I相用量漸増研究においてさらに評価することができる。例えば、ファン・グルプら(van Gurp et al.)(2008)Am. J. Transplantation 8(8):1711−1718;ハノウスカら(Hanouska et al.)(2007)Clin. Cancer Res. 13(2, part 1):523−531;およびヘザリントンら(Hetherington et al.)(2006)Antimicrobial Agents and Chemotherapy 50(10):3499−3500を参照。
そのような多重特異性抗原結合性構築物の毒性および治療効果は、細胞培養物または実験動物(例えば、本明細書に記載の任意のがんの動物モデル)において公知の薬学的手順により決定することができる。これらの手順は、例えば、LD50(集団の50%に対して致死的な用量)およびED50(集団の50%において治療的に効果的な用量)を決定するために使用することができる。毒性効果と治療効果との用量比は治療指数であり、それは比LD50/ED50として表すことができる。高い治療指数を呈する多重特異性抗原結合性構築物が好ましい。毒性の副作用を呈する構築物が使用されてもよいが、影響された組織の部位にそのような構築物を標的化する送達システムを設計すること、および、正常細胞への潜在的な損傷を最小化し、それにより副作用を低減することに注意するべきである。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおいて使用するための投与量の範囲の定式化において使用することができる。本明細書に記載の抗原結合性構築物の投与量は、一般に、ほとんどまたは全く毒性を有しないED50を含む多重特異性抗原結合性構築物の循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる投与形態および利用される投与の経路に依存してこの範囲内で変動することができる。本明細書に記載の抗原結合性構築物について、治療的に効果的な用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養において決定されるようなEC50(すなわち、症状の半数最大阻害を達成する構築物、例えば、抗体の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成するために動物モデルにおいて定式化することができる。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。一部の実施形態では、例えば、(例えば、目または関節への)局所投与が所望される場合、局所的な部位内で治療的に効果的な濃度を達成するために必要とされる用量を決定するために細胞培養または動物モデルを使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物は、単剤療法として対象に投与することができる。代替的に、抗原結合性構築物は、がんに対する他の療法と組み合わせて投与することができる。例えば、組成物は、放射線、手術、標的化もしくは細胞傷害性化学療法、化学放射線療法、ホルモン療法、免疫療法、遺伝子療法、細胞移植療法、プレシジョンメディシン、ゲノム編集療法、炎症性もしくは自己免疫疾患療法(例えば、抗炎症剤もしくは抗サイトカイン剤)または他の薬物療法と同時、その前、または後に対象に投与することができる。
本開示の組成物との併用投与のために好適な化学療法剤としては、例えば、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、ミトマイシン、エトポシド、テノポシド(tenoposide)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン(colchicin)、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン(dihydroxyanthrancindione)、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンならびにこれらのアナログまたはホモログが挙げられる。さらなる剤としては、例えば、代謝拮抗物質(例えば、メトトレキサート、6−メルカプトプリン、6−チオグアニン、シタラビン、5−フルオロウラシルデカルバジン(5−fluorouracil decarbazine)、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BSNU)、ロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ミトマイシンC、シス−ジクロルジアミン白金(II)(cys−dichlordiamine platinum (II))(DDP)、プロカルバジン、アルトレタミン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、サトラプラチン、または四硝酸トリプラチン)、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(旧ダウノマイシン)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノムシン(dactinomcin)(旧アクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン(AMC))、ならびに抗有糸分裂剤(例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン)およびテモゾロミドが挙げられる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物および1つまたは複数の追加の活性剤は同時に投与される。任意選択で、多重特異性抗原結合性構築物は時間的に一番目に投与され、1つまたは複数の追加の活性剤は時間的に二番目に投与される。一部の実施形態では、1つまたは複数の追加の活性剤は時間的に一番目に投与され、多重特異性抗原結合性構築物は時間的に二番目に投与される。任意選択で、多重特異性抗原結合性構築物および1つまたは複数の追加の剤は同じまたは異なる経路において同時に投与される。例えば、抗原結合性構築物を含む組成物は、任意選択で、1つまたは複数の追加の剤を含有する。
本明細書に記載の多重特異性抗原結合性は、以前にまたは現在投与されている療法を置き換えまたは増強することができる。例えば、多重特異性抗原結合性構築物を用いて治療する場合、1つまたは複数の追加の活性剤の投与は、中止または縮小することができ、例えば、より低いレベルまたは投与量において投与することができる。一部の実施形態では、以前の療法の投与を維持することができる。一部の実施形態では、以前の療法は、多重特異性抗原結合性構築物のレベルが治療効果を提供するために十分なレベルに達するまで維持される。
本明細書において定義されるようながんまたは自己反応性B細胞媒介性炎症状態の改善について対象(例えば、ヒト患者)をモニターすることは、疾患パラメーターにおける変化、例えば、腫瘍成長またはサイズの低減について対象を評価することを意味する。一部の実施形態では、評価は、投与の少なくとも1時間後、例えば、少なくとも2、4、6、8、12、24、もしくは48時間、または少なくとも1日、2日、4日、10日、13日、20日もしくはより多くの日数、または少なくとも1週、2週、4週、10週、13週、20週、もしくはより多くの週の後に行われる。対象は、以下の期間:治療の開始前、治療中、または治療の1つもしくは複数の要素が投与された後の1つまたは複数において評価することができる。評価は、さらなる治療の必要性を評価すること、例えば、投与量、投与の頻度、または治療の継続期間を変更するべきかどうかを評価することを含むことができる。それはまた、選択された治療モダリティーを追加または削減する必要性、例えば、本明細書に記載のがんに対する任意の治療を追加または削減することを評価することを含むことができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の治療有効量の多重特異性抗原結合性構築物、または構築物を含む組成物は、それを必要とする対象において免疫応答をモジュレートまたは増進するために対象に投与される。一部の実施形態では、増進した免疫応答は、増進したT細胞機能、増進したNK細胞機能、または増進したマクロファージ機能の1つまたは複数を含む。ある特定の態様では、多重特異性抗原結合性構築物は、NKp30を発現する免疫細胞を腫瘍またはB系列細胞抗原を発現する第2の細胞(例えば、腫瘍細胞またはB系列細胞)とブリッジ形成させることによりNKp30機能をアゴナイズすることにより対象の免疫応答を増進する。
対照NK細胞によるCD16の発現と比較して低減されたCD16の発現を有するNK細胞を活性化させまたはその活性化を持続化させる方法もまた本明細書において提供される。方法は、NK細胞を有効量の本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物と接触させることを含む。多重特異性結合構築物は、例えば、少なくとも2つの連結した抗原結合単位を含み、第1の抗原結合単位は腫瘍抗原(例えば、BCMAまたはHER2/neu)に特異的に結合し、第2の抗原結合単位はNKp30抗原に特異的に結合する。NK細胞の多重特異性抗原結合性構築物との接触は、in vitroまたはin vivoで行うことができる。
一部の実施形態では、方法は、がんを有する対象においてNK細胞を活性化させまたはその活性化を持続化させるために使用される。がん細胞は、多重特異性抗原結合性構築物が特異的に結合する標的抗原を発現してもよい。任意選択で、多重特異性抗原結合性構築物が特異的に結合する腫瘍抗原はBCMAまたはHER2である。接触させるNK細胞は腫瘍浸潤性NK細胞であることができる。
NK細胞の活性化または持続的な活性化は、NK細胞がCD16欠損性微環境にあるかどうかにかかわらず起こる。CD16欠損性微環境は、対照NK細胞(例えば、休止NK細胞、対象からの健常NK細胞、健常個体からのNK細胞)と比較して50%未満のCD16の発現を有する浸潤性NK細胞の集団を含んでもよい。任意選択で、浸潤性NK細胞は、対照NK細胞と比較して45%未満、40%未満、35%未満、30%未満、25%未満、20%未満、15%未満、10%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、または1%未満のCD16の発現を有する。一部の対象中の浸潤性NK細胞はCD16を発現しない。他の態様では、CD16欠損性微環境は、浸潤性NK細胞の少なくとも10%が対照NK細胞と比較して低減されたCD16の発現を有する浸潤性NK細胞の集団を含む。任意選択で、CD16欠損性微環境は、浸潤性NK細胞の少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、または少なくとも50%が対照NK細胞と比較して低減されたCD16の発現を有する浸潤性NK細胞の集団を含む。他の態様では、NK細胞は150,000未満のCD16コピー数を有する。任意選択で、NK細胞は、140,000未満、130,000未満、120,000未満、110,000未満、100,000未満、75,000未満、50,000未満、または25,000未満のCD16コピー数を有する。
本明細書において使用される場合、増進したNK細胞機能またはNK細胞の活性化という用語は、細胞周期に入ること(すなわち、増殖すること)、1つまたは複数の活性化マーカーの細胞表面発現を増加させること、サイトカインまたはケモカイン(IFN−γ、TNF−α、IL−17A、およびIL−22を含む)または溶菌酵素(例えば、パーフォリンおよびグランザイム)を分泌することまたはその分泌を増加させること、および細胞ベースのエフェクター機能を行うことを開始させるまたはそのためにコンピテントとなることによりNK細胞がコグネイトリガンドまたは本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物に応答する細胞プロセスを指す。そのような活性を測定する方法は当該技術分野において慣例的で公知であり、例示的な方法は実施例などにおいて本明細書に記載されている。例えば、増進したNK細胞機能がNK細胞による増加または増進したサイトカイン産生である実施形態では、ELISAまたはサイトカインビーズアレイアッセイなどのサイトカインアッセイを使用して増加を決定することができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物の存在下でのサイトカイン産生の増加は、対照または参照抗体と比較して少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、またはより高い。増進したNK細胞機能が1つまたは複数の活性化マーカーの増加または増進した発現である実施形態では、アッセイは、例えばフローサイトメトリーを使用して、NK細胞上の少なくとも1つの活性化マーカーの表面発現の増加を検出することを含む。一部の実施形態では、「表面発現の増加」は、対照抗体または参照抗体の存在下での表面発現と比べて表面発現の少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または100%の増加を指す。
本明細書に開示される多重特異性抗原結合性構築物は、がんの治療のための本明細書における任意の方法において、および、任意選択で、抗がん療法を対象に投与することをさらに含む方法において記載されるように使用することができる。本明細書に記載されるようなそのような抗がん療法(例えば、免疫療法、化学療法など)は、多重特異性抗原結合性構築物を用いる治療の前、同時、または後に投与することができる。例として、抗がん療法は、多重特異性抗原結合性構築物の投与の1もしくはより多くの分、時間、日、または週だけ前に投与することができる。そのような場合、抗がん療法は、腫瘍細胞が腫瘍抗原発現を下方調節するまで単独で投与することができ、そのような時点において、多重特異性抗原結合性構築物の投与は、抗がん療法と共にまたはその代わりに開始することができる。方法のある特定の実施形態では、抗がん療法および多重特異性抗原結合性構築物は、完全または部分的にオーバーラップする期間において投与される。そのため、両方は、同じ期間の分、時間、日、週、または月の間に投与することができる。そのようなオーバーラップする時間的期間の間に、抗がん療法および多重特異性抗原結合性構築物は、(例えば、同じ組成物中でもしくは同じ投与手段により)同時にもしくはおおよそ同じ時点において投与することができ、または一方を他方の(分、時間、日などだけ)前もしくは後に投与することができる。任意選択で、抗がん療法は免疫療法であり、対象におけるがんは、少なくとも多重特異性抗原結合性構築物を用いる治療の非存在下で、免疫療法に対して難治性である。
対象においてがんを治療する方法であって、がんが低いレベルの腫瘍抗原を含む、方法もまた本明細書において提供される。方法は、対象に有効量の本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物を投与することを含む。多重特異性結合構築物は、例えば、少なくとも2つの連結した抗原結合単位を含み、第1の抗原結合単位は腫瘍抗原(例えば、BCMAまたはHER2/neu)に特異的に結合し、第2の抗原結合単位はNKp30抗原に特異的に結合し、本明細書に記載の任意の多重特異性抗原結合性構築物であり得る。治療されるがんは低いレベルの腫瘍抗原を含む。本明細書において使用される場合、腫瘍抗原の低いレベルは、当業者により高いと考えられない任意のレベルである。例として、腫瘍細胞当たり約130,000〜150,000より多いBCMAのコピーのBCMA発現レベルは高いと考えられる一方、約130,000〜150,000未満のBCMA発現レベルは中間または低いと考えられる。そのため、BCMAの低いレベルは、本明細書において使用される場合、腫瘍細胞当たり約100,000未満、約90,000未満、約75,000未満、および50,000未満のBCMAのコピーを含む。そのため、がんが低いレベルの腫瘍抗原を含む対象においてがんを治療する方法は、がん細胞当たり約100,000未満の腫瘍抗原コピー、細胞当たり130未満の腫瘍抗原コピー、がん細胞当たり約75,000未満の腫瘍抗原コピー、がん細胞当たり約60,000未満の腫瘍抗原コピー、がん細胞当たり50,000未満の腫瘍抗原コピー、がん細胞当たり40,000未満の腫瘍抗原コピー、細胞当たり35,000未満の腫瘍抗原コピー、または細胞当たりより少ない任意の数のコピーのレベルの腫瘍抗原を含む。低いレベルの腫瘍抗原発現は、経時的に下方調節されてもよく(例えば、腫瘍細胞は、NK細胞などの浸潤性免疫細胞による細胞死を免れる)、具体的な腫瘍細胞に特徴的であってもよく、または両方であってもよい。
第1の抗原結合単位が特異的に結合する腫瘍抗原の低いレベルにもかかわらず、多重特異性抗原結合性構築物は、NKp30機能をアゴナイズすることにより対象の免疫応答を増進することができ、NK細胞媒介性がん細胞溶解を増進すること、サイトカイン(例えば、IFNγ)の産生を促進すること、およびADCC機能を増進することができる。そのため、多重特異性抗原結合性構築物は、様々ながん種の治療のための本明細書における任意の方法において、および、任意選択で、抗がん療法を対象に投与することをさらに含む方法において記載されるように使用することができる。本明細書に記載されるようなそのような抗がん療法(例えば、免疫療法)は、多重特異性抗原結合性構築物を用いる治療の前、同時、または後に投与することができる。例として、抗がん療法は、多重特異性抗原結合性構築物の投与の1もしくはより多くの分、時間、日、または週だけ前に投与することができる。そのような場合、抗がん療法は、腫瘍細胞が腫瘍抗原発現を下方調節するまで単独で投与することができ、そのような時点において、多重特異性抗原結合性構築物の投与は、抗がん療法と共にまたはその代わりに開始することができる。本明細書に記載の方法のある特定の実施形態では、抗がん療法および多重特異性抗原結合性構築物は、完全または部分的にオーバーラップする期間において投与される。そのため、両方は、同じ期間の分、時間、日、週、または月の間に投与することができる。そのようなオーバーラップする時間的期間の間に、抗がん療法および多重特異性抗原結合性構築物は、(例えば、同じ組成物中でもしくは同じ投与手段により)同時にもしくはおおよそ同じ時点において投与することができ、または一方を他方の(分、時間、日などだけ)前もしくは後に投与することができる。任意選択で、抗がん療法は免疫療法であり、対象におけるがんは、少なくとも多重特異性抗原結合性構築物を用いる治療の非存在下で、免疫療法に対して難治性である。
ナチュラルキラー(NK)細胞による標的細胞の殺傷を増進する方法もまた本明細書において提供される。方法は、NK細胞の存在下で標的細胞を有効量の(すなわち、標的細胞の殺傷を増進するために十分な)多重特異性抗原結合性構築物と接触させることを含み、標的細胞は約100,000未満のコピー数で腫瘍抗原を発現し、多重特異性結合構築物は少なくとも2つの連結した抗原結合単位を含み、第1の抗原結合単位は腫瘍抗原に特異的に結合し、第2の抗原結合単位はNKp30抗原に特異的に結合する。接触工程はin vivoまたはin vitroで行うことができる。接触工程がin vitroで行われる場合、残留する生存細胞は、任意選択で、細胞が由来する対象と同じまたは異なる対象に移植される。例えば、残留生存細胞は、幹細胞、または造血細胞などであり得る。
対象においてNK細胞によるがんまたはB系列細胞の殺傷を増進する方法もまた提供される。方法は、対象に有効量(すなわち、NK細胞によるがんまたはB細胞の殺傷を増進するために十分な量の多重特異性抗原結合性構築物を投与することを含む。任意選択で、がん細胞は約100,000未満のコピー数で腫瘍抗原を発現し、多重特異性結合構築物は少なくとも2つの連結した抗原結合単位を含み、第1の抗原結合単位は腫瘍抗原に特異的に結合し、第2の抗原結合単位はNKp30抗原に特異的に結合する。
本明細書において使用される場合、増進したNK細胞機能またはNK細胞の活性化という用語は、細胞周期に入ること(すなわち、増殖すること)、1つまたは複数の活性化マーカーの細胞表面発現を増加させること、サイトカインまたはケモカイン(IFN−γ、TNF−α、IL−17A、およびIL−22を含む)または溶菌酵素(例えば、パーフォリンおよびグランザイム)を分泌することまたはその分泌を増加させること、および細胞ベースのエフェクター機能を行うことを開始させるまたはそのためにコンピテントとなることによりNK細胞がコグネイトリガンドまたは本明細書に記載の多重特異性抗原結合性構築物に応答する細胞プロセスを指す。そのような活性を測定する方法は当該技術分野において慣例的で公知であり、例示的な方法は実施例などにおいて本明細書に記載されている。例えば、増進したNK細胞機能がNK細胞による増加または増進したサイトカイン産生である実施形態では、ELISAまたはサイトカインビーズアレイアッセイなどのサイトカインアッセイを使用して増加を決定することができる。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物の存在下でのサイトカイン産生の増加は、対照または参照抗体と比較して少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、またはより高い。増進したNK細胞機能が1つまたは複数の活性化マーカーの増加または増進した発現である実施形態では、アッセイは、例えばフローサイトメトリーを使用して、NK細胞上の少なくとも1つの活性化マーカーの表面発現の増加を検出することを含む。一部の実施形態では、「表面発現の増加」は、対照抗体または参照抗体の存在下での表面発現と比べて表面発現の少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または100%の増加を指す。
一部の態様では、それを必要とする対象からの標的細胞(例えば、腫瘍細胞またはB系列細胞)の枯渇において使用するための多重特異性抗原結合性構築物であって、少なくとも2つの連結した抗原結合単位を含み、第1の抗原結合単位が、標的抗原に特異的に結合し、第2の抗原結合単位が、NKp30抗原に特異的に結合する、多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は第3の抗原結合単位を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗原結合性構築物は第3の抗原結合単位および第4の抗原結合単位を含む。一部の実施形態では、標的抗原は、本明細書に記載のまたは当該技術分野において公知の任意の腫瘍抗原などの腫瘍抗原である。一部の実施形態では、標的細胞は、自己反応性B細胞などのB細胞であり、そのような場合、標的抗原は、B細胞特異的、B細胞拘束、またはB細胞濃縮抗原、例えば、CD20またはBCMAである。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象は自己免疫状態に罹患している。一部の実施形態では、自己免疫状態は、全体的または部分的に自己反応性B細胞により媒介される。一部の実施形態では、標的細胞を枯渇されている対象は赤芽球癆を有するまたはそのリスクがある。一部のそのような実施形態では、対象は血液群Oを有し、同種幹細胞移植は血液群Aのドナーからのものであった。標的細胞を枯渇されている対象が赤芽球癆を有するまたはそのリスクがあるそれらの実施形態では、標的細胞は、例えば、標的血漿B細胞である。よって、一部の実施形態では、標的抗原は、例えば、血漿B細胞上に見出されるが他のB細胞上には見出されない抗原である。
一部の態様では、それを必要とする対象における全体的または部分的に自己反応性B細胞により媒介される炎症状態(例えば、自己免疫状態または自己反応性B細胞性炎症状態)の治療において使用するための多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。一部の実施形態では、対象は、重症筋無力症、軽鎖アミロイドーシス、尋常性天疱瘡、および免疫性血小板減少症から選択される疾患を有する。一部の実施形態では、そのような多重特異性構築物は、コルチコステロイド、DMARDs、または抗サイトカイン療法などの炎症性障害(例えば、自己免疫疾患)に対する他の療法と組み合わせることができる。
一部の態様では、それを必要とする対象におけるがん免疫応答などの免疫応答のモジュレートまたは増進において使用するための多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。一部の実施形態では、増進した免疫応答は、増進したT細胞機能、増進したNK細胞機能、または増進したマクロファージ機能の1つまたは複数を含む。ある特定の態様では、多重特異性抗原結合性構築物は、NKp30を発現する免疫細胞を腫瘍またはB系列細胞抗原を発現する第2の細胞(例えば、腫瘍細胞またはB系列細胞)とブリッジ形成させることによりNKp30機能をアゴナイズすることにより対象の免疫応答を増進する。
一部の態様では、対照NK細胞によるCD16の発現と比較して低減されたCD16の発現を有するNK細胞の活性化またはその活性化の持続化において使用するための多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。一部の態様では、それを必要とする対象における低いレベルの腫瘍抗原を有するがんの治療またはその進行の遅延において使用するための多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。一部の態様では、それを必要とする対象におけるナチュラルキラー(NK)細胞による標的細胞の殺傷の増加または増進において使用するための多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。一部の態様では、対象におけるNK細胞によるがんまたはB系列細胞の殺傷の増進において使用するための多重特異性抗原結合性構築物が本明細書において提供される。
開示される実施形態のために使用できる、それと組み合わせて使用できる、またはその準備において使用できる材料、組成物、および成分が開示される。これらおよび他の材料が本明細書に開示され、これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、群などが開示される場合、これらの組成物の各様々な個々的および集合的組合せおよび並べ替えの特定の言及が明示的に開示されないことがあるが、それぞれは本明細書において特に想定され記載されていることが理解される。例えば、方法が開示および議論され、方法に含まれる多数の分子に対して為され得る多数の改変が議論されている場合、そうでないことが特に指し示されなければ、方法のそれぞれのおよびあらゆる組合せおよび並べ替え、ならびに可能な改変が特に想定される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組合せもまた特に想定され、開示される。この概念は、開示される組成物を使用する方法における工程が挙げられるがそれに限定されない本開示の全ての態様に適用される。そのため、行うことができる様々な追加の工程がある場合、これらの追加の工程のそれぞれは、開示される方法の任意の特定の方法工程または方法工程の組合せと共に行うことができること、ならびに各そのような組合せまたは組合せのサブセットが特に想定され、開示されていると考えられるべきであることが理解される。
本明細書において参照される刊行物およびそのためにそれらが参照される材料は、本願明細書により特に全体を参照により援用する。以下の記載は、開示される組成物および方法のさらなる非限定的な例を提供する。
(実施例1)
BCMAおよびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物はNKエフェクター機能を増進させる
BCMAおよびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物がNK細胞に及ぼす効果を分析するため、初代ヒトNK細胞を、10ng/mLのIL−15で予備刺激し、多発性骨髄腫細胞株H929のBCMA発現標的細胞、および各アームがBCMAに結合し、各重鎖のC末端がヒトNKp30と特異的に結合するscFvである抗体(IgG1)全体を含むフォーマットを有する本明細書に記載されている10nMの多重特異性抗原結合構築物と共に一晩インキュベートする(10IU/mLのIL−2の存在下で)。第1の抗原結合ドメインは、米国特許第9,273,141号明細書に記載されている例示的なCA8抗体の重鎖可変領域(配列番号2)および軽鎖可変領域(配列番号1)を含む。scFvは、ハイブリドーマI−2576により産生される抗体(米国特許第7,517,966号明細書に詳細に記載されており、この抗体およびその配列に関連するその開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される)またはそのヒト化バージョンの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。BCMAおよびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、対照BCMA抗体単独と比較して、NKエフェクター機能を増進させる。
BCMAおよびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物はNKエフェクター機能を増進させる
BCMAおよびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物がNK細胞に及ぼす効果を分析するため、初代ヒトNK細胞を、10ng/mLのIL−15で予備刺激し、多発性骨髄腫細胞株H929のBCMA発現標的細胞、および各アームがBCMAに結合し、各重鎖のC末端がヒトNKp30と特異的に結合するscFvである抗体(IgG1)全体を含むフォーマットを有する本明細書に記載されている10nMの多重特異性抗原結合構築物と共に一晩インキュベートする(10IU/mLのIL−2の存在下で)。第1の抗原結合ドメインは、米国特許第9,273,141号明細書に記載されている例示的なCA8抗体の重鎖可変領域(配列番号2)および軽鎖可変領域(配列番号1)を含む。scFvは、ハイブリドーマI−2576により産生される抗体(米国特許第7,517,966号明細書に詳細に記載されており、この抗体およびその配列に関連するその開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される)またはそのヒト化バージョンの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。BCMAおよびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、対照BCMA抗体単独と比較して、NKエフェクター機能を増進させる。
追加の構築物
標準的な分子生物学技法を使用して、ヒトBCMAおよびヒトNKp30と特異的に結合する多重特異性抗原結合構築物である構築物1を生成した。この構築物は、抗BCMA IgG1抗体(mAb1)を含み、この抗体の重鎖は、ポリGGGS(配列番号22)リンカーを介して抗BCMA抗体のFc領域に接続されている抗NKp30抗体(mAb8)の重鎖可変領域をそのC末端にさらに含む融合タンパク質である。この構築物の抗BCMA部分および抗NKp30部分の軽鎖は同一である。その構造が図1の図解により表される構築物1は、配列番号9に示されている重鎖配列および配列番号8に示されている軽鎖配列を含む。
標準的な分子生物学技法を使用して、ヒトBCMAおよびヒトNKp30と特異的に結合する多重特異性抗原結合構築物である構築物1を生成した。この構築物は、抗BCMA IgG1抗体(mAb1)を含み、この抗体の重鎖は、ポリGGGS(配列番号22)リンカーを介して抗BCMA抗体のFc領域に接続されている抗NKp30抗体(mAb8)の重鎖可変領域をそのC末端にさらに含む融合タンパク質である。この構築物の抗BCMA部分および抗NKp30部分の軽鎖は同一である。その構造が図1の図解により表される構築物1は、配列番号9に示されている重鎖配列および配列番号8に示されている軽鎖配列を含む。
標準的な分子生物学技法を使用して、これもヒトBCMAおよびヒトNKp30と特異的に結合する多重特異性抗原結合構築物である構築物2を生成した。この構築物は、抗BCMA IgG1抗体(mAb1)を含み、この抗体の重鎖は、ポリGGGS(配列番号22)リンカーを介して抗BCMA抗体のFc領域に接続されている抗NKp30抗体の重鎖可変領域をそのC末端にさらに含む融合タンパク質である。この構築物の抗BCMA部分および抗NKp30部分の軽鎖は同一である。その構造が図1の図解により表される構成物2は、構築物1と同じ抗BCMA IgG1抗体部分および構築物1と同じ軽鎖を含むが、この構築物の抗NKp30抗体部分(mAb9)の可変領域配列が異なる。構築物2は、配列番号24に示されている重鎖配列および配列番号8に示されている軽鎖配列を含む。
また、構築物1および2の非グリコシル化バージョン(「構築物1脱グリコ」/構築物3または「構築物2脱グリコ」/構築物4)を作出した。各構築物の重鎖のFc部分は、N297Aアミノ酸置換(EU式付番による付番)を含んでいた。例えば、構築物3は、配列番号26に示されているアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号8に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。構築物4は、配列番号27に示されているアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号8に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
構築物5は、親和性成熟抗BCMA IgG1抗体(mAb3)を含み、この抗体の重鎖は、ポリGGGS(配列番号22)リンカーを介して抗BCMA抗体のFc領域に接続されている抗NKp30抗体(mAb8)の重鎖可変領域をそのC末端にさらに含む融合タンパク質である。この構築物の抗BCMA部分および抗NKp30部分の軽鎖は同一である。構築物5は、配列番号65に示されているアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号8に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
構築物6は、親和性成熟抗BCMA IgG1抗体(mAb2)を含み、この抗体の重鎖は、ポリGGGS(配列番号22)リンカーを介して抗BCMA抗体のFc領域に接続されている抗NKp30抗体(mAb8)の重鎖可変領域をそのC末端にさらに含む融合タンパク質である。この構築物の抗BCMA部分および抗NKp30部分の軽鎖は同一である。構築物6は、配列番号66に示されているアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号8に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
構築物7は、抗BCMA IgG1抗体(mAb1)を含む非フコシル化構築物であり、この抗体の重鎖は、伸長されたポリGGGS(配列番号22)リンカーを介して抗BCMA抗体のFc領域に接続されている抗NKp30抗体(mAb8)の重鎖可変領域をそのC末端にさらに含む融合タンパク質である。この構築物の抗BCMA部分および抗NKp30部分の軽鎖は同一である。構築物66は、配列番号67に示されているアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号8に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
構築物8は、抗BCMA IgG1抗体(mAb3)を含む構築物5の非グリコシル化バージョンであり、この抗体の重鎖は、伸長されたポリGGGS(配列番号22)リンカーを介して抗BCMA抗体のFc領域に接続されている抗NKp30抗体(mAb8)の重鎖可変領域をそのC末端にさらに含む融合タンパク質である。この構築物の抗BCMA部分および抗NKp30部分の軽鎖は同一である。構築物8は、配列番号68に示されているアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号8に示されているアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
(実施例2)
BCMAおよびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、NK細胞によるCD16発現の非存在下でNKエフェクター機能を増進させる
CD16発現の非存在下において、NK細胞上のBCMAおよびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物の効果を分析するために、CD16に結合することができない抗体を研究した(図2Aおよび図2B)。BCMAおよびNKp30を標的とするグリコシル化多重特異性抗原結合構築物は、CD16に結合する能力を保持するが、非グリコシル化抗体は、CD16に結合する能力を欠如する。
BCMAおよびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、NK細胞によるCD16発現の非存在下でNKエフェクター機能を増進させる
CD16発現の非存在下において、NK細胞上のBCMAおよびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物の効果を分析するために、CD16に結合することができない抗体を研究した(図2Aおよび図2B)。BCMAおよびNKp30を標的とするグリコシル化多重特異性抗原結合構築物は、CD16に結合する能力を保持するが、非グリコシル化抗体は、CD16に結合する能力を欠如する。
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞(PBMC)をヒト末梢血バフィコートから単離した。NK細胞(CD3−CD56+)を、磁気ビーズによるネガティブ選択を使用してPBMCから単離した。単離NK細胞の純度は、典型的には90%よりも高かった。単離NK細胞を、細胞傷害性アッセイまたはIFNγ放出アッセイで使用する前に、IL−2およびIL−15で補完された培地で一晩培養した。翌日、NK細胞を、標的細胞ならびに種々の濃度の構築物1および2または抗BCMA抗体および対照抗体と混合した。
図2Aに示されているように、グリコシル化二重特異性抗体である構築物1および2は、親抗BCMAモノクローナル抗体単独の活性と比較して、H929腫瘍細胞に対して末梢血NK細胞による優れたADCC活性を呈する。さらに、構築物1および2は、CD16A受容体に結合しない構築物の非グリコシル化バージョンを使用して図2Bで実証されているように、NK細胞上のCD16A受容体に対する結合が無効になった場合でも、依然として強力なADCCを媒介することができる。こうした結果は、本多重特異性抗原結合構築物が、末梢血(pb)NK細胞によるADCCを増進し、CD16Aに対する結合の非存在下でもこの活性を保持したことを示す。
図3Aおよび図3Bは、構築物1が、CD16A発現の存在下でADCCを増進したことを示す。図3Aは、腫瘍抗原BCMAを中レベルで発現するMM.1S腫瘍細胞を使用した結果を示し、図3Bは、BCMAを低レベルで発現するRPMI−8226腫瘍細胞を使用した結果を示す。CD16A発現NK細胞株の細胞をエフェクター細胞として使用した場合、構築物1は、BCMAモノクローナル抗体または陰性対照と比較して、ADCCを増加させたことが実証された。
最後に、CD16を発現しないNK細胞株をエフェクター細胞として使用した。図4Aおよび図4Bは、BCMAおよびNKp30を標的とする本多重特異性抗原結合構築物が、CD16A発現の非存在下でADCCを誘導したことを示す。図4Aおよび図4Cは、腫瘍抗原BCMAを高レベルで発現するH929腫瘍細胞を使用した結果を示し、図4Bは、BCMAを低レベルで発現するRPMI−8226腫瘍細胞を使用した結果を示す。CD16A陰性NK細胞株(図4Aおよび図4CのKHYG−1、図4BのNK細胞株)をエフェクター細胞として使用した場合、BCMAおよびNKp30を標的とする多重特異性構築物は、BCMAモノクローナル抗体(図4Bおよび図4C)、IgG1アイソタイプ対照(図4B)、またはCD16A−BCMA二重特異性構築物(図4C)と比較して、CD16陰性NK細胞による腫瘍細胞殺傷を誘導した。
(実施例3)
BCMAおよびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、優れた活性を呈する
NKp30およびCD16を両方とも標的とする、BCMAおよびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物の効果を分析するため、種々の構成物を研究した(図5A、図5B、および図5C)。NKp30およびCD16を両方とも標的とする、BCMAおよびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、産生されたIFNγの量または特異的溶解のパーセンテージにより測定して、優れた活性を呈することが示された。
BCMAおよびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、優れた活性を呈する
NKp30およびCD16を両方とも標的とする、BCMAおよびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物の効果を分析するため、種々の構成物を研究した(図5A、図5B、および図5C)。NKp30およびCD16を両方とも標的とする、BCMAおよびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、産生されたIFNγの量または特異的溶解のパーセンテージにより測定して、優れた活性を呈することが示された。
図5Aは、H929腫瘍細胞を使用した結果を示し、図5Bおよび図5Cは、BCMAを低レベルで発現するMM.1S腫瘍細胞を使用した結果を示す。BCMAおよびNKp30を標的とする多重特異性構築物は、NKp30−BCMA Fc−ヌル構築物(図4A)、BCMAモノクローナル抗体(図5A、図5B、および図5C)、Her2 IgG1アイソタイプ対照(図4A)、CD16−BCMA二重特異性構築物(図5Bおよび図5C)、およびNKp30ヌル−BCMA Fcヌル構築物(図5C)よりも優れた活性を呈した。
(実施例4)
BCMAおよびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、高、中、または低BCMA発現腫瘍細胞の存在下でIFNγ産生およびADCC機能を保持する
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞(PBMC)をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、NK細胞(CD3−CD56+)をPBMCから単離した。この方法で典型的に達成された単離NK細胞の純度は、90%よりも高かった。単離NK細胞を、細胞傷害性アッセイまたはIFNγ放出アッセイで使用する前に、IL−2およびIL−15で補完された培地で一晩培養した。翌日、NK細胞を、1細胞あたり約130,000〜150,000コピーのBCMAを発現することがフローサイトメトリーにより決定された標的細胞H929(図6Aおよび図6B);1細胞当たり約90,000〜100,000,000コピーのBCMAを発現することがフローサイトメトリーにより決定されたMM.1S(図7Aおよび図7B);または1細胞当たり約30,000〜40,000コピーのBCMAを発現することがフローサイトメトリーにより決定されたRPMI8226(図8Aおよび図8B)と混合した。NK細胞および標的細胞を、5:1のエフェクター:標的(E:T)比で使用し、抗体希釈範囲は、10nMから開始して1/5希釈した(n=8濃度)。細胞傷害性アッセイは、96U底ウェルプレートにて4時間37℃で実施し、IFNγアッセイは、96U底ウェルプレートにて18時間37℃で実施した。
BCMAおよびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、高、中、または低BCMA発現腫瘍細胞の存在下でIFNγ産生およびADCC機能を保持する
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞(PBMC)をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、NK細胞(CD3−CD56+)をPBMCから単離した。この方法で典型的に達成された単離NK細胞の純度は、90%よりも高かった。単離NK細胞を、細胞傷害性アッセイまたはIFNγ放出アッセイで使用する前に、IL−2およびIL−15で補完された培地で一晩培養した。翌日、NK細胞を、1細胞あたり約130,000〜150,000コピーのBCMAを発現することがフローサイトメトリーにより決定された標的細胞H929(図6Aおよび図6B);1細胞当たり約90,000〜100,000,000コピーのBCMAを発現することがフローサイトメトリーにより決定されたMM.1S(図7Aおよび図7B);または1細胞当たり約30,000〜40,000コピーのBCMAを発現することがフローサイトメトリーにより決定されたRPMI8226(図8Aおよび図8B)と混合した。NK細胞および標的細胞を、5:1のエフェクター:標的(E:T)比で使用し、抗体希釈範囲は、10nMから開始して1/5希釈した(n=8濃度)。細胞傷害性アッセイは、96U底ウェルプレートにて4時間37℃で実施し、IFNγアッセイは、96U底ウェルプレートにて18時間37℃で実施した。
インキュベーション後、標的細胞の殺傷を、PIERCE(商標)LDH細胞傷害性アッセイキット(サーモフィッシャーサイエンティフィック社(ThermoFisher Scientific)、米国マサチューセッツ州ウォルサム(Waltham)所在)を製造業者の使用説明書に従って使用して、損傷細胞から培地への乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の放出を細胞傷害性および細胞溶解のバイオマーカーとして用いることにより測定した。全ての実験条件を三重重複で分析し、特異的溶解のパーセンテージを以下の通りに決定した:100×(実験値−エフェクター細胞自発的対照−標的細胞自発的対照)/標的細胞最大対照−標的細胞自発的対照)。NK細胞により培地に放出されたIFNγをElisaで測定した。
結果は、NKp30に結合するドメインおよびBCMAに結合するドメインを有する多重特異性結合構築物の存在下では、NK細胞は、BCMAモノクローナル抗体の存在下またはhIgG1アイソタイプ対照抗体の存在下でのNK細胞と比較して、ほとんどの濃度において、細胞溶解を引き起こし、サイトカインIFNγの放出を促進する優れた能力を有することを示す。この効果は、3つのタイプの細胞:H929(図6Aおよび図6B)、MM.1S(図7Aおよび図7B)、およびRPMI−8226(図8Aおよび図8B)において示された。これらの細胞は、それぞれ、1標的細胞あたり約130,000〜150,000コピーのBCMA、1標的細胞あたり約90,000〜100,000コピーのBCMA、および1標的細胞あたり約30,000〜40,000コピーのBCMAを発現することがフローサイトメトリーを使用して決定されていた。まとめると、こうしたデータは、多重特異性結合構築物が、標的細胞上のBCMAが低レベルである場合でさえ効果的であることを示す。
(実施例5)
多重特異性抗原結合構築物は、腫瘍細胞の非存在下ではNK細胞を活性化しない
IL−2およびIL−15サイトカインで活性化されたNK細胞(図9)または休止NK細胞(図10および図11)を、幾つかの多重特異性抗原結合構築物(構築物1など)または10nM濃度の抗BCMA IgG1モノクローナル抗体対照(図9)または種々の濃度の抗体(図10および図11)の存在下で、H929がん細胞(エフェクター:標的比1:1)と共にまたは無しで一晩インキュベートした。インキュベーション後、上清を収集し、IFNγを、Elisa(バイオレジェンド社(Biolegend))で測定した(図9)。NK細胞によるCD69(図10)およびCD137(図11)の発現を、フローサイトメトリーで評価した。がん細胞の非存在下では、多重特異性抗体結合構築物は、IFNγ放出、CD69およびCD137発現により測定したところ、NK細胞を活性化することができなかった。
多重特異性抗原結合構築物は、腫瘍細胞の非存在下ではNK細胞を活性化しない
IL−2およびIL−15サイトカインで活性化されたNK細胞(図9)または休止NK細胞(図10および図11)を、幾つかの多重特異性抗原結合構築物(構築物1など)または10nM濃度の抗BCMA IgG1モノクローナル抗体対照(図9)または種々の濃度の抗体(図10および図11)の存在下で、H929がん細胞(エフェクター:標的比1:1)と共にまたは無しで一晩インキュベートした。インキュベーション後、上清を収集し、IFNγを、Elisa(バイオレジェンド社(Biolegend))で測定した(図9)。NK細胞によるCD69(図10)およびCD137(図11)の発現を、フローサイトメトリーで評価した。がん細胞の非存在下では、多重特異性抗体結合構築物は、IFNγ放出、CD69およびCD137発現により測定したところ、NK細胞を活性化することができなかった。
(実施例6)
本明細書に記載されている多重特異性抗原結合構築物は、サイトカインによる以前の刺激がなくともNK細胞を活性化する
休止NK細胞を、幾つかの多重特異性抗原結合構築物(構築物1など)の1つ、または種々の濃度の抗BCMA IgG1モノクローナル抗体対照の存在下で、エフェクター:標的(E:T)比1:1のBCMA陽性標的細胞H929と共に37℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、上清を収集し、IFNγを、Elisa(バイオレジェンド社(Biolegend))で測定した(図12)。NK細胞によるCD69およびCD137の発現(それぞれ、図13および図14)を、フローサイトメトリーで評価した。これらのデータは、BCMA−NKp30抗原結合構築物が、サイトカインによる以前の刺激がなくともNK細胞を活性化することを示す。
本明細書に記載されている多重特異性抗原結合構築物は、サイトカインによる以前の刺激がなくともNK細胞を活性化する
休止NK細胞を、幾つかの多重特異性抗原結合構築物(構築物1など)の1つ、または種々の濃度の抗BCMA IgG1モノクローナル抗体対照の存在下で、エフェクター:標的(E:T)比1:1のBCMA陽性標的細胞H929と共に37℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、上清を収集し、IFNγを、Elisa(バイオレジェンド社(Biolegend))で測定した(図12)。NK細胞によるCD69およびCD137の発現(それぞれ、図13および図14)を、フローサイトメトリーで評価した。これらのデータは、BCMA−NKp30抗原結合構築物が、サイトカインによる以前の刺激がなくともNK細胞を活性化することを示す。
(実施例7)
本明細書に記載されている多重特異性抗原結合構築物は、標的細胞溶解を強力に誘導する
NKp30−BCMA多重特異性抗原結合構築物の効果をさらに分析するために、構築物を、現在臨床試験中のある特定の従来型抗体と比較して使用した(図15A、図15B、および図15C)。図15Aは、MM.1S腫瘍細胞上での、腫瘍抗原BCMA、CD38、およびCS1の表面発現を反映する。多重特異性構築物は、抗BCMA IgG1抗体、CD38を標的とするダラツムマブ、およびCSIを標的とするエロツズマブと比べて試験した場合、腫瘍細胞に対してIFNγ産生増加(図15B)および優れたADCC活性(図15C)を呈した。これらのデータは、本明細書に記載されているNKp30−BCMA多重特異性抗原結合構築物が従来型抗体よりも優れた効力を有することを実証する。
本明細書に記載されている多重特異性抗原結合構築物は、標的細胞溶解を強力に誘導する
NKp30−BCMA多重特異性抗原結合構築物の効果をさらに分析するために、構築物を、現在臨床試験中のある特定の従来型抗体と比較して使用した(図15A、図15B、および図15C)。図15Aは、MM.1S腫瘍細胞上での、腫瘍抗原BCMA、CD38、およびCS1の表面発現を反映する。多重特異性構築物は、抗BCMA IgG1抗体、CD38を標的とするダラツムマブ、およびCSIを標的とするエロツズマブと比べて試験した場合、腫瘍細胞に対してIFNγ産生増加(図15B)および優れたADCC活性(図15C)を呈した。これらのデータは、本明細書に記載されているNKp30−BCMA多重特異性抗原結合構築物が従来型抗体よりも優れた効力を有することを実証する。
(実施例8)
免疫不全異種移植マウスモデルにおけるBCMA−NKp30二重特異性抗体の効果
NSG(商標)マウス(ジャクソンラボ社(Jackson Labs)、米国メイン州バーハーバー(Bar Harbor)所在)に、8×106個のBCMA発現標的細胞(例えば、H929、MM.iS、RPMI−8226)を接種する。接種後4〜5日毎に、CD16を発現するように遺伝子改変された放射線照射NK細胞をマウスに投与する。BCMA結合ドメインおよびNKp30結合ドメインを有する多重特異性結合構築物および単一特異性結合構築物の投与後に、動物の生存、体重、および血漿をモニターする。
免疫不全異種移植マウスモデルにおけるBCMA−NKp30二重特異性抗体の効果
NSG(商標)マウス(ジャクソンラボ社(Jackson Labs)、米国メイン州バーハーバー(Bar Harbor)所在)に、8×106個のBCMA発現標的細胞(例えば、H929、MM.iS、RPMI−8226)を接種する。接種後4〜5日毎に、CD16を発現するように遺伝子改変された放射線照射NK細胞をマウスに投与する。BCMA結合ドメインおよびNKp30結合ドメインを有する多重特異性結合構築物および単一特異性結合構築物の投与後に、動物の生存、体重、および血漿をモニターする。
(実施例9)
非ヒト霊長類におけるBCMA−NKp30二重特異性抗体の効果
カニクイザルでは、BCMAは、B細胞マーカーであり、BCMAが形質細胞には存在するが末梢B細胞には存在しないヒトとは異なり、形質細胞および大部分の末梢血B細胞に存在する。したがって、BCMA結合構築物の効力は、末梢血中のB細胞および骨髄中の形質細胞の枯渇を検出することにより評価することができる。効力、PK、PD、および非GLP毒性を評価するため、カニクイザルに、BCMA結合ドメインおよびNKp30結合ドメインを有する多重特異性結合構築物またはBCMAに結合する対応する単一特異性結合構築物を50mg/Kg〜0.1mg/Kgで投与する。B細胞枯渇を、B細胞数および血清IgGレベルをモニターすることにより処置の24時間〜72時間後に評価する。
非ヒト霊長類におけるBCMA−NKp30二重特異性抗体の効果
カニクイザルでは、BCMAは、B細胞マーカーであり、BCMAが形質細胞には存在するが末梢B細胞には存在しないヒトとは異なり、形質細胞および大部分の末梢血B細胞に存在する。したがって、BCMA結合構築物の効力は、末梢血中のB細胞および骨髄中の形質細胞の枯渇を検出することにより評価することができる。効力、PK、PD、および非GLP毒性を評価するため、カニクイザルに、BCMA結合ドメインおよびNKp30結合ドメインを有する多重特異性結合構築物またはBCMAに結合する対応する単一特異性結合構築物を50mg/Kg〜0.1mg/Kgで投与する。B細胞枯渇を、B細胞数および血清IgGレベルをモニターすることにより処置の24時間〜72時間後に評価する。
(実施例10)
Her2およびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、優れた活性を呈する
Her2およびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物の効果を分析するため、種々の構成物を研究した(図17A、図17B、および図17C)。標準的な分子生物学技法を使用して、各々が、ヒトHer2およびヒトNKp30と特異的に結合する多重特異性抗原結合構築物である構築物AおよびBを生成した。構築物は、抗Her2 IgG1抗体を含み、この抗体の重鎖は、ポリGGGS(配列番号22)リンカーを介して抗Her2抗体のFc領域に接続されている抗NKp30抗体の重鎖可変領域をそのC末端にさらに含む融合タンパク質である。構築物の抗Her2部分および抗NKp30部分の軽鎖は同一である。その構造が図1の図解により表される構築物Aは、構築物1および2の抗NKp30抗体部分と同じ重鎖領域および軽鎖領域を含む。
Her2およびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、優れた活性を呈する
Her2およびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物の効果を分析するため、種々の構成物を研究した(図17A、図17B、および図17C)。標準的な分子生物学技法を使用して、各々が、ヒトHer2およびヒトNKp30と特異的に結合する多重特異性抗原結合構築物である構築物AおよびBを生成した。構築物は、抗Her2 IgG1抗体を含み、この抗体の重鎖は、ポリGGGS(配列番号22)リンカーを介して抗Her2抗体のFc領域に接続されている抗NKp30抗体の重鎖可変領域をそのC末端にさらに含む融合タンパク質である。構築物の抗Her2部分および抗NKp30部分の軽鎖は同一である。その構造が図1の図解により表される構築物Aは、構築物1および2の抗NKp30抗体部分と同じ重鎖領域および軽鎖領域を含む。
Her2およびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、特異的溶解のパーセンテージにより測定したところ、優れた活性を呈することが示された。
図17Aは、SKBR3腫瘍細胞を使用した結果を示す。Her2およびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物(構築物Aおよび構築物B)は、抗Her2モノクローナル抗体(トラスツズマブ、図17A)および抗Her2モノクローナル抗体の非グリコシル化バージョン(図17A)よりも優れた活性を呈した。
図17Aは、SKBR3腫瘍細胞を使用した結果を示す。Her2およびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物(構築物Aおよび構築物B)は、抗Her2モノクローナル抗体(トラスツズマブ、図17A)および抗Her2モノクローナル抗体の非グリコシル化バージョン(図17A)よりも優れた活性を呈した。
(実施例11)
Her2およびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、高、中、または低Her2発現腫瘍細胞の存在下でIFNγ産生活性を保持する
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞(PBMC)をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、NK細胞(CD3−CD56+)をPBMCから単離した。この方法で典型的に達成された単離NK細胞の純度は、90%よりも高かった。単離NK細胞を、細胞傷害性アッセイまたはIFNγ放出アッセイで使用する前に、IL−2およびIL−15で補完された培地で一晩培養した。翌日、NK細胞を、標的細胞SKBR3(Her2を高発現する)、SW40(Her2の発現レベルが低い)、またはT47D(Her2の発現レベルが中程度〜低い)と混合した。それらのHer2発現レベルをフローサイトメトリーで測定した(図18を参照)。NK細胞および標的細胞を、5:1のエフェクター:標的(E:T)比で使用した。抗体希釈範囲は、10nMから開始して1/10または1/5希釈した(n=8濃度)。インキュベーション後、NK細胞により培地に放出されたIFNγをELISAで測定した。
Her2およびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、高、中、または低Her2発現腫瘍細胞の存在下でIFNγ産生活性を保持する
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞(PBMC)をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、NK細胞(CD3−CD56+)をPBMCから単離した。この方法で典型的に達成された単離NK細胞の純度は、90%よりも高かった。単離NK細胞を、細胞傷害性アッセイまたはIFNγ放出アッセイで使用する前に、IL−2およびIL−15で補完された培地で一晩培養した。翌日、NK細胞を、標的細胞SKBR3(Her2を高発現する)、SW40(Her2の発現レベルが低い)、またはT47D(Her2の発現レベルが中程度〜低い)と混合した。それらのHer2発現レベルをフローサイトメトリーで測定した(図18を参照)。NK細胞および標的細胞を、5:1のエフェクター:標的(E:T)比で使用した。抗体希釈範囲は、10nMから開始して1/10または1/5希釈した(n=8濃度)。インキュベーション後、NK細胞により培地に放出されたIFNγをELISAで測定した。
結果は、NKp30に結合するドメインおよびHer2に結合するドメインを有する多重特異性結合構築物の存在下では、NK細胞は、Her2モノクローナル抗体の存在下または幾つかの抗Her2 IgG1モノクローナル抗体のいずれか1つの存在下でのNK細胞と比較して、ほとんどの濃度において、サイトカインIFNγの放出を促進する優れた能力を有することを示す(図17Bおよび17C)。この効果は、上記の3つの細胞タイプ全てにおいて示される。まとめると、こうしたデータは、多重特異性結合構成物が、標的細胞上のHer2が低レベルである場合でさえ効果的であることを示す。
(実施例12)
NKp30およびBCMAを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物1は、カニクイザルマカクの骨髄中の形質細胞を枯渇させる
構築物1を、30.25mg/kgで成体カニクイザル(n=2)に単回静脈内注射した。処置したサルの骨髄中の免疫グロブリン分泌細胞の数を、IgM、IgG、およびIgAに特異的なELISPOTアッセイを使用して経時的に測定した。骨髄中の形質細胞数の推定として、骨髄中の免疫グロブリン分泌細胞の大部分は、形質細胞であると仮定した。図19に示されているように、処置動物では両方とも、処置2週間後に骨髄形質細胞の強力な減少(>80%)が、続いて3週間後にリバウンドが観察された。
NKp30およびBCMAを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物1は、カニクイザルマカクの骨髄中の形質細胞を枯渇させる
構築物1を、30.25mg/kgで成体カニクイザル(n=2)に単回静脈内注射した。処置したサルの骨髄中の免疫グロブリン分泌細胞の数を、IgM、IgG、およびIgAに特異的なELISPOTアッセイを使用して経時的に測定した。骨髄中の形質細胞数の推定として、骨髄中の免疫グロブリン分泌細胞の大部分は、形質細胞であると仮定した。図19に示されているように、処置動物では両方とも、処置2週間後に骨髄形質細胞の強力な減少(>80%)が、続いて3週間後にリバウンドが観察された。
(実施例13)
NKp30およびBCMAを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物1は、カニクイザルマカクの血漿中の血清IgMを減少させる
単回用量の構築物1を、30.25mg/kgでカニクイザルマカクに静脈内投与した。ELISAを使用して、処置したカニクイザルマカクの末梢血中の血漿IgMのレベルを経時的に測定した。このアッセイは、カニクイザルIgMに特異的であり、標準カニクイザルIgMを使用して、処置したサルの血中IgM濃度を算出した。処置の5週間後に、血漿IgMの強力な減少の開始が観察された。データは3つの独立実験の代表的なものである。図20に示されているように、NKp30およびBCMAを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物1は、処置したカニクイザルマカクの血漿中の血清IgMの減少を誘導する。
NKp30およびBCMAを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物1は、カニクイザルマカクの血漿中の血清IgMを減少させる
単回用量の構築物1を、30.25mg/kgでカニクイザルマカクに静脈内投与した。ELISAを使用して、処置したカニクイザルマカクの末梢血中の血漿IgMのレベルを経時的に測定した。このアッセイは、カニクイザルIgMに特異的であり、標準カニクイザルIgMを使用して、処置したサルの血中IgM濃度を算出した。処置の5週間後に、血漿IgMの強力な減少の開始が観察された。データは3つの独立実験の代表的なものである。図20に示されているように、NKp30およびBCMAを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物1は、処置したカニクイザルマカクの血漿中の血清IgMの減少を誘導する。
(実施例14)
NKp30およびBCMAを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物1は、処置したサルのin vivo NK細胞拡大増殖を誘導する
フローサイトメトリーを使用して、構築物1を0日目に30.25mg/kgで静脈内投与したカニクイザルにおける絶対数計算のための細胞血球数を含む、処置したサルの末梢血中のNK細胞の絶対数を経時的に測定した。カニクイザルNK細胞は、死細胞を除いて、CD45+/CD3−/CD14−/CD20−細胞集団をゲート制御した。フローサイトメトリーを使用して、同じ処置サルの骨髄における白血球集団中のNK細胞のパーセンテージを経時的に測定した。
NKp30およびBCMAを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物1は、処置したサルのin vivo NK細胞拡大増殖を誘導する
フローサイトメトリーを使用して、構築物1を0日目に30.25mg/kgで静脈内投与したカニクイザルにおける絶対数計算のための細胞血球数を含む、処置したサルの末梢血中のNK細胞の絶対数を経時的に測定した。カニクイザルNK細胞は、死細胞を除いて、CD45+/CD3−/CD14−/CD20−細胞集団をゲート制御した。フローサイトメトリーを使用して、同じ処置サルの骨髄における白血球集団中のNK細胞のパーセンテージを経時的に測定した。
図21Aに示されているように、NK細胞は、処置したサルの血液中で拡大増殖し、処置の約14日後に最大ピークを示した。NK細胞は、処置したサルの骨髄でも拡大増殖したが(図21B)、この拡大増殖は、サルB6016の方がAK749Jよりも少なかった。
(実施例15)
NKp30およびBCMAを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物1は、サルAK749JにおいてNK細胞活性化を誘導する
フローサイトメトリーを使用して、構築物1を0日目に30.25mg/kgで静脈内投与したカニクイザルの末梢血または骨髄中のNK細胞上でのCD69発現レベルを経時的に測定した。カニクイザルNK細胞は、死細胞を除いて、CD45+/CD3−/CD14−/CD20−細胞集団をゲート制御した。CD69発現により示されるように、NK細胞は、サルAK749Jの血液(図22A)および骨髄(図22B)で活性化された。サルB6016は、処置前に高いCD69発現(>70%)を示し、処置の経過中に高いCD69発現を維持したことに留意されたい。
NKp30およびBCMAを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物1は、サルAK749JにおいてNK細胞活性化を誘導する
フローサイトメトリーを使用して、構築物1を0日目に30.25mg/kgで静脈内投与したカニクイザルの末梢血または骨髄中のNK細胞上でのCD69発現レベルを経時的に測定した。カニクイザルNK細胞は、死細胞を除いて、CD45+/CD3−/CD14−/CD20−細胞集団をゲート制御した。CD69発現により示されるように、NK細胞は、サルAK749Jの血液(図22A)および骨髄(図22B)で活性化された。サルB6016は、処置前に高いCD69発現(>70%)を示し、処置の経過中に高いCD69発現を維持したことに留意されたい。
(実施例16)
NKp30およびBCMAを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物1は、典型的なIgG1様薬物動態プロファイルを表示する
構築物1の単回IV注射後に血漿を収集し、抗原特異的ELISAを使用して、処置したサルの血液中の構築物1のレベルを測定した。二相減衰モデルを使用して、図23に示されているように、両サルでのβ相半減期が約16日間であると推定した。
NKp30およびBCMAを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物1は、典型的なIgG1様薬物動態プロファイルを表示する
構築物1の単回IV注射後に血漿を収集し、抗原特異的ELISAを使用して、処置したサルの血液中の構築物1のレベルを測定した。二相減衰モデルを使用して、図23に示されているように、両サルでのβ相半減期が約16日間であると推定した。
(実施例17)
NKp30およびBCMAを標的とする多重特異性抗原結合構築物は、腫瘍細胞の存在下でのみ、NK細胞によるIFNγ、TNFα、およびランテスのより高い産生を促進する
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞(PBMC)をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、NK細胞(CD3−CD56+)をPBMCから単離した。この方法で典型的に達成された単離NK細胞の純度は、90%よりも高かった。新たに単離したNK細胞を、1:1のエフェクター:標的(E:T)比で標的細胞H929と混合した。抗体希釈範囲は、10nMから開始して1/5希釈した(n=7濃度)。翌日、培養物から上清を収集し、IFNγ、TNFα、およびランテス濃度をELISAで測定した。本明細書では図24に実証されているように、構築物1は、BCMA−IgG1モノクローナルと比較して、新鮮な休止NK細胞によるサイトカインのより高い産生を促進し、腫瘍細胞の非存在下ではNK細胞によるサイトカインの産生を誘導しない。
NKp30およびBCMAを標的とする多重特異性抗原結合構築物は、腫瘍細胞の存在下でのみ、NK細胞によるIFNγ、TNFα、およびランテスのより高い産生を促進する
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞(PBMC)をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、NK細胞(CD3−CD56+)をPBMCから単離した。この方法で典型的に達成された単離NK細胞の純度は、90%よりも高かった。新たに単離したNK細胞を、1:1のエフェクター:標的(E:T)比で標的細胞H929と混合した。抗体希釈範囲は、10nMから開始して1/5希釈した(n=7濃度)。翌日、培養物から上清を収集し、IFNγ、TNFα、およびランテス濃度をELISAで測定した。本明細書では図24に実証されているように、構築物1は、BCMA−IgG1モノクローナルと比較して、新鮮な休止NK細胞によるサイトカインのより高い産生を促進し、腫瘍細胞の非存在下ではNK細胞によるサイトカインの産生を誘導しない。
(実施例18)
NKp30およびBCMAを標的とする多重特異性抗原結合構築物1は、骨髄腫患者に由来する末梢NK細胞による、MM腫瘍細胞に対する活性化および細胞傷害性を誘導する
NKp30陽性(pos)またはCD16posNK細胞の頻度を、健常者(n=5)または疾患状態が異なる多発性骨髄腫患者(n=5)から単離されたPBMCを使用してフローサイトメトリーで評価した(図25A)。図25Aで使用したものと同じMM患者に由来するPBMCを、モネンシンおよびブレフェルジンAの存在下において、10nMの構築物1、またはトラスツズマブ(アイソタイプ対照として使用)、または無抗体の存在下で、MM.1S腫瘍細胞に対して試験した。NK細胞脱顆粒およびIFNγ産生を、NK(CD56pos、CD3陰性(neg))CD107pos細胞およびNK(CD56pos、CD3neg)IFNγ陽性細胞をゲート制御することによりフローサイトメトリーを使用して測定した。図25Aおよび図25Bに示されているように、MM患者に由来するPBMC上でのNKp30およびCd16Aの発現は、健常個体と同等であり、MM患者に由来するNK細胞は、構築物1に応答して高い機能性を表示する。
NKp30およびBCMAを標的とする多重特異性抗原結合構築物1は、骨髄腫患者に由来する末梢NK細胞による、MM腫瘍細胞に対する活性化および細胞傷害性を誘導する
NKp30陽性(pos)またはCD16posNK細胞の頻度を、健常者(n=5)または疾患状態が異なる多発性骨髄腫患者(n=5)から単離されたPBMCを使用してフローサイトメトリーで評価した(図25A)。図25Aで使用したものと同じMM患者に由来するPBMCを、モネンシンおよびブレフェルジンAの存在下において、10nMの構築物1、またはトラスツズマブ(アイソタイプ対照として使用)、または無抗体の存在下で、MM.1S腫瘍細胞に対して試験した。NK細胞脱顆粒およびIFNγ産生を、NK(CD56pos、CD3陰性(neg))CD107pos細胞およびNK(CD56pos、CD3neg)IFNγ陽性細胞をゲート制御することによりフローサイトメトリーを使用して測定した。図25Aおよび図25Bに示されているように、MM患者に由来するPBMC上でのNKp30およびCd16Aの発現は、健常個体と同等であり、MM患者に由来するNK細胞は、構築物1に応答して高い機能性を表示する。
(実施例19)
NKp30およびBCMAを標的とする多重特異性抗原結合構築物1は、多発性骨髄腫患者の骨髄に由来する自家骨髄腫細胞のNK細胞殺傷を誘導する
骨髄細胞を一団の抗体で染色して、多発性骨髄腫であると新たに診断された患者に由来する骨髄形質細胞(CD138pos)上でのBCMA、CS1、およびCD38の発現を測定した。この患者のBMにおけるNK細胞の頻度、ならびにNK細胞上でのNKp30、CD16A、NKG2D、およびNKp46の発現を、図26Aに示されているように、リンパ球およびCD56pos、CD3neg細胞をゲート制御することによりフローサイトメトリーで評価した。図26Bは、CD138pos多発性骨髄腫細胞の頻度の減少としてフローサイトメトリーで測定したところ、構築物1、構築物1の非グリコシル化(Fcヌル)バージョンである構築物3、およびBCMA−IgG1 mAbの存在下で、自家骨髄形質細胞の死を示す。データは、抗体を含まない対照ウェルに対して正規化した。構築物1、または構築物3、またはBCMA−IgG1 mAbの存在下で骨髄細胞を試験した場合、構築物1およびその非グリコシル化バージョンである構築物3では、BCMA−IgG1モノクローナル対照と比較してより高い程度の悪性骨髄細胞の死が、無抗体対照に対して観察された。
NKp30およびBCMAを標的とする多重特異性抗原結合構築物1は、多発性骨髄腫患者の骨髄に由来する自家骨髄腫細胞のNK細胞殺傷を誘導する
骨髄細胞を一団の抗体で染色して、多発性骨髄腫であると新たに診断された患者に由来する骨髄形質細胞(CD138pos)上でのBCMA、CS1、およびCD38の発現を測定した。この患者のBMにおけるNK細胞の頻度、ならびにNK細胞上でのNKp30、CD16A、NKG2D、およびNKp46の発現を、図26Aに示されているように、リンパ球およびCD56pos、CD3neg細胞をゲート制御することによりフローサイトメトリーで評価した。図26Bは、CD138pos多発性骨髄腫細胞の頻度の減少としてフローサイトメトリーで測定したところ、構築物1、構築物1の非グリコシル化(Fcヌル)バージョンである構築物3、およびBCMA−IgG1 mAbの存在下で、自家骨髄形質細胞の死を示す。データは、抗体を含まない対照ウェルに対して正規化した。構築物1、または構築物3、またはBCMA−IgG1 mAbの存在下で骨髄細胞を試験した場合、構築物1およびその非グリコシル化バージョンである構築物3では、BCMA−IgG1モノクローナル対照と比較してより高い程度の悪性骨髄細胞の死が、無抗体対照に対して観察された。
(実施例20)
NKp30およびBCMAを標的とする親和性成熟多重特異性抗原結合構築物は、可溶性BCMAリガンドであるAPRILの存在下で結合を向上させた
抗BCMA−IgG1、構築物5(親和性成熟BCMAアームを有する多重特異性抗原結合構築物1の変異体)、および構築物1を、100ng/mlの組換えヒトAPRILと混合し、H929(BCMApos)がん細胞と共に45分間インキュベートした。細胞を洗浄し、抗ヒトIgG F(ab)2で15分間染色した。結合データを、フローサイトメトリーで評価した。図27に示されているように、親和性成熟BCMAアームを有する多重特異性抗原結合構築物1の変異体である多重特異性抗原結合構築物5は、可溶性APRILの存在下でさえ、BCMA陽性腫瘍細胞に結合することができる。
NKp30およびBCMAを標的とする親和性成熟多重特異性抗原結合構築物は、可溶性BCMAリガンドであるAPRILの存在下で結合を向上させた
抗BCMA−IgG1、構築物5(親和性成熟BCMAアームを有する多重特異性抗原結合構築物1の変異体)、および構築物1を、100ng/mlの組換えヒトAPRILと混合し、H929(BCMApos)がん細胞と共に45分間インキュベートした。細胞を洗浄し、抗ヒトIgG F(ab)2で15分間染色した。結合データを、フローサイトメトリーで評価した。図27に示されているように、親和性成熟BCMAアームを有する多重特異性抗原結合構築物1の変異体である多重特異性抗原結合構築物5は、可溶性APRILの存在下でさえ、BCMA陽性腫瘍細胞に結合することができる。
(実施例21)
NKp30およびBCMAを標的とする親和性成熟多重特異性抗原結合構築物の活性は、可溶性BCMAリガンドであるAPRILおよびBAFFの存在による影響を受けない
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞(PBMC)をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、NK細胞(CD3−CD56+)をPBMCから単離した。この方法で典型的に達成された単離NK細胞の純度は、90%よりも高かった。単離NK細胞を、サイトカイン放出アッセイで使用する前に、IL−2およびIL−15で補完された培地で一晩培養した。翌日、NK細胞を、標的細胞U266−B1およびMM1Rと混合した。NK細胞および標的細胞は、2:1のエフェクター:標的(E:T)比で使用した。抗体希釈範囲は、25nMから開始して1/10希釈した(n=3濃度)。IFNγのELISAアッセイは、48時間後に37℃にて96U底ウェルプレートで実施した。本明細書では図28に実証されているように、構築物5(親和性成熟BCMAアームを有する多重特異性抗原結合構築物1の変異体)の活性は、両方とも多発性骨髄腫患者の血清に見出される可溶性AprilおよびBAFF(BCMAリガンド)の存在による影響を受けない。
NKp30およびBCMAを標的とする親和性成熟多重特異性抗原結合構築物の活性は、可溶性BCMAリガンドであるAPRILおよびBAFFの存在による影響を受けない
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞(PBMC)をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、NK細胞(CD3−CD56+)をPBMCから単離した。この方法で典型的に達成された単離NK細胞の純度は、90%よりも高かった。単離NK細胞を、サイトカイン放出アッセイで使用する前に、IL−2およびIL−15で補完された培地で一晩培養した。翌日、NK細胞を、標的細胞U266−B1およびMM1Rと混合した。NK細胞および標的細胞は、2:1のエフェクター:標的(E:T)比で使用した。抗体希釈範囲は、25nMから開始して1/10希釈した(n=3濃度)。IFNγのELISAアッセイは、48時間後に37℃にて96U底ウェルプレートで実施した。本明細書では図28に実証されているように、構築物5(親和性成熟BCMAアームを有する多重特異性抗原結合構築物1の変異体)の活性は、両方とも多発性骨髄腫患者の血清に見出される可溶性AprilおよびBAFF(BCMAリガンド)の存在による影響を受けない。
(実施例22)
NKp30およびBCMAを標的とする親和性成熟多重特異性抗原結合構築物の活性は、可溶性BCMAの存在による影響を受けない
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞(PBMC)をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、NK細胞(CD3−CD56+)をPBMCから単離した。この方法で典型的に達成された単離NK細胞の純度は、90%よりも高かった。単離NK細胞を、サイトカイン放出アッセイで使用する前に、IL−2およびIL−15で補完された培地で一晩培養した。翌日、NK細胞を、1:1のエフェクター:標的(E:T)比で標的H929細胞と混合した。抗体希釈範囲は、25nMから開始して1/10希釈し(n=8濃度)、50ng/mlの可溶性BCMAを有するかまたは有していなかった。IFNγのELISAアッセイは、48時間後に37℃にて96U底ウェルプレートで実施した。図29に示されているように、親和性成熟BCMAアームを有する構築物5は、高レベルの可溶性BCMAの存在下で活性を示す。
NKp30およびBCMAを標的とする親和性成熟多重特異性抗原結合構築物の活性は、可溶性BCMAの存在による影響を受けない
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞(PBMC)をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、NK細胞(CD3−CD56+)をPBMCから単離した。この方法で典型的に達成された単離NK細胞の純度は、90%よりも高かった。単離NK細胞を、サイトカイン放出アッセイで使用する前に、IL−2およびIL−15で補完された培地で一晩培養した。翌日、NK細胞を、1:1のエフェクター:標的(E:T)比で標的H929細胞と混合した。抗体希釈範囲は、25nMから開始して1/10希釈し(n=8濃度)、50ng/mlの可溶性BCMAを有するかまたは有していなかった。IFNγのELISAアッセイは、48時間後に37℃にて96U底ウェルプレートで実施した。図29に示されているように、親和性成熟BCMAアームを有する構築物5は、高レベルの可溶性BCMAの存在下で活性を示す。
(実施例23)
BCMAlow標的細胞に対する、NKp30およびBCMAを標的とする親和性成熟多重特異性抗原結合構築物の活性は保持される
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞(PBMC)をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、NK細胞(CD3−CD56+)をPBMCから単離した。この方法で典型的に達成された単離NK細胞の純度は、90%よりも高かった。単離NK細胞を、サイトカイン放出アッセイで使用する前に、IL−2およびIL−15で補完された培地で一晩培養した。翌日、NK細胞を、様々なレベルのBCMAコピー/細胞を発現する標的腫瘍細胞と2:1のエフェクター:標的(E:T)比で混合した。IFNγのELISAアッセイは、48時間後に37℃にて96U底ウェルプレートで実施した。データは、構築物5が、BCMA高(high)発現腫瘍細胞に対して選択性を示し、BCMA低(low)発現腫瘍細胞に対して活性を保持したが、2,000BCMAコピー/細胞未満を発現する腫瘍細胞(例えば、Raji)に対しては活性を示さなかったことを示す。図30に示されているように、構築物5は、BCMAhigh発現腫瘍細胞に対して選択性を示し、BCMAlow発現腫瘍細胞に対して活性を保持したが、2,000BCMAコピー/細胞未満を発現する腫瘍細胞(例えば、Raji)に対しては活性を示さなかった。
BCMAlow標的細胞に対する、NKp30およびBCMAを標的とする親和性成熟多重特異性抗原結合構築物の活性は保持される
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞(PBMC)をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、NK細胞(CD3−CD56+)をPBMCから単離した。この方法で典型的に達成された単離NK細胞の純度は、90%よりも高かった。単離NK細胞を、サイトカイン放出アッセイで使用する前に、IL−2およびIL−15で補完された培地で一晩培養した。翌日、NK細胞を、様々なレベルのBCMAコピー/細胞を発現する標的腫瘍細胞と2:1のエフェクター:標的(E:T)比で混合した。IFNγのELISAアッセイは、48時間後に37℃にて96U底ウェルプレートで実施した。データは、構築物5が、BCMA高(high)発現腫瘍細胞に対して選択性を示し、BCMA低(low)発現腫瘍細胞に対して活性を保持したが、2,000BCMAコピー/細胞未満を発現する腫瘍細胞(例えば、Raji)に対しては活性を示さなかったことを示す。図30に示されているように、構築物5は、BCMAhigh発現腫瘍細胞に対して選択性を示し、BCMAlow発現腫瘍細胞に対して活性を保持したが、2,000BCMAコピー/細胞未満を発現する腫瘍細胞(例えば、Raji)に対しては活性を示さなかった。
(実施例24)
NKp30およびBCMAを標的とする親和性成熟多重特異性抗原結合構築物は、より高発現BCMA腫瘍細胞に対して選択性を示し、低BCMA発現細胞で活性を保持する
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞(PBMC)をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、NK細胞(CD3−CD56+)をPBMCから単離した。この方法で典型的に達成された単離NK細胞の純度は、90%よりも高かった。単離NK細胞を、サイトカイン放出アッセイで使用する前に、IL−2およびIL−15で補完された培地で一晩培養した。翌日、NK細胞を、様々なレベルのBCMAコピー/細胞を発現する様々な標的腫瘍細胞と、2:1のエフェクター:標的(E:T)比で混合した。構築物5の抗体希釈範囲は、25nMから開始して1/10希釈した(n=3濃度)。IFNγのELISAアッセイは、48時間後に37℃にて96U底ウェルプレートで実施した。図31に示されているように、構築物5は、ピコモル濃度でさえ、BCMA発現レベルが様々である一連の細胞株と共に共培養したNK細胞によるIFNγ産生を誘導する活性を示した。
NKp30およびBCMAを標的とする親和性成熟多重特異性抗原結合構築物は、より高発現BCMA腫瘍細胞に対して選択性を示し、低BCMA発現細胞で活性を保持する
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞(PBMC)をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、NK細胞(CD3−CD56+)をPBMCから単離した。この方法で典型的に達成された単離NK細胞の純度は、90%よりも高かった。単離NK細胞を、サイトカイン放出アッセイで使用する前に、IL−2およびIL−15で補完された培地で一晩培養した。翌日、NK細胞を、様々なレベルのBCMAコピー/細胞を発現する様々な標的腫瘍細胞と、2:1のエフェクター:標的(E:T)比で混合した。構築物5の抗体希釈範囲は、25nMから開始して1/10希釈した(n=3濃度)。IFNγのELISAアッセイは、48時間後に37℃にて96U底ウェルプレートで実施した。図31に示されているように、構築物5は、ピコモル濃度でさえ、BCMA発現レベルが様々である一連の細胞株と共に共培養したNK細胞によるIFNγ産生を誘導する活性を示した。
(実施例25)
NKp30およびBCMAを標的とする親和性成熟多重特異性抗原結合構築物は、低コピー/細胞のBCMAを発現するリンパ腫細胞の存在下でNK細胞を活性化する
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞(PBMC)をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、NK細胞(CD3−CD56+)をPBMCから単離した。この方法で典型的に達成された単離NK細胞の純度は、90%よりも高かった。単離NK細胞を、サイトカイン放出アッセイで使用する前に、IL−2およびIL−15で補完された培地で一晩培養した。翌日、NK細胞を、約5000BCMAコピー/細胞を発現するJeKo−1標的リンパ腫細胞と2:1のエフェクター:標的(E:T)比で混合した。構築物Xの抗体希釈範囲は、25nMから開始して1/10希釈した(n=6濃度)。IFNγのELISAアッセイは、48時間後に37℃にて96U底ウェルプレートで実施した。図32に示されているように、構築物5は、低コピー/細胞のBCMAを発現するリンパ腫細胞の存在下でNK細胞を活性化するが、BCMA−IgG1モノクローナルは、いかなる活性も示さない。
NKp30およびBCMAを標的とする親和性成熟多重特異性抗原結合構築物は、低コピー/細胞のBCMAを発現するリンパ腫細胞の存在下でNK細胞を活性化する
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞(PBMC)をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、NK細胞(CD3−CD56+)をPBMCから単離した。この方法で典型的に達成された単離NK細胞の純度は、90%よりも高かった。単離NK細胞を、サイトカイン放出アッセイで使用する前に、IL−2およびIL−15で補完された培地で一晩培養した。翌日、NK細胞を、約5000BCMAコピー/細胞を発現するJeKo−1標的リンパ腫細胞と2:1のエフェクター:標的(E:T)比で混合した。構築物Xの抗体希釈範囲は、25nMから開始して1/10希釈した(n=6濃度)。IFNγのELISAアッセイは、48時間後に37℃にて96U底ウェルプレートで実施した。図32に示されているように、構築物5は、低コピー/細胞のBCMAを発現するリンパ腫細胞の存在下でNK細胞を活性化するが、BCMA−IgG1モノクローナルは、いかなる活性も示さない。
(実施例26)
NKp30およびBCMAを標的とする親和性成熟多重特異性抗原結合構築物により誘導される増殖シグナルは、主にNKp30係合に依存する
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞(PBMC)をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、NK細胞(CD3−CD56+)をPBMCから単離した。この方法で典型的に達成された単離NK細胞の純度は、90%よりも高かった。単離NK細胞を、サイトカイン放出アッセイで使用する前に、IL−2およびIL−15で補完された培地で一晩培養した。初代NK細胞を、CELLTRACE(商標)Violet(CTV)で標識し、IL−2、および構築物5、BCMA、CD16(Fcを介して)に結合するが、NKp30には結合しない二重特異性物質[NKp30ヌル×BCMA IgG1]、またはBCMAに結合するが、CD16またはNKp30には結合しない二重特異性物質[NKp30ヌル×BCMA Fcヌル]の存在下で、H929がん細胞と共にインキュベートした。5日後に、フローサイトメトリーによりNK細胞増殖を測定し、CTV希釈物を評価した。図33に示されているように、構築物5は、CD16Aに結合するがNKp30には結合しない二重特異性物質[NKp30ヌル×BCMA(IgG1)]またはCD16AおよびNKp30に結合しない二重特異性物質[NKp30ヌル×BCMA Fcヌル]よりも高い程度にNK細胞増殖を誘導し、構築物5の増殖シグナルが、主にNKp30係合に依存することを示す。
NKp30およびBCMAを標的とする親和性成熟多重特異性抗原結合構築物により誘導される増殖シグナルは、主にNKp30係合に依存する
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞(PBMC)をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、NK細胞(CD3−CD56+)をPBMCから単離した。この方法で典型的に達成された単離NK細胞の純度は、90%よりも高かった。単離NK細胞を、サイトカイン放出アッセイで使用する前に、IL−2およびIL−15で補完された培地で一晩培養した。初代NK細胞を、CELLTRACE(商標)Violet(CTV)で標識し、IL−2、および構築物5、BCMA、CD16(Fcを介して)に結合するが、NKp30には結合しない二重特異性物質[NKp30ヌル×BCMA IgG1]、またはBCMAに結合するが、CD16またはNKp30には結合しない二重特異性物質[NKp30ヌル×BCMA Fcヌル]の存在下で、H929がん細胞と共にインキュベートした。5日後に、フローサイトメトリーによりNK細胞増殖を測定し、CTV希釈物を評価した。図33に示されているように、構築物5は、CD16Aに結合するがNKp30には結合しない二重特異性物質[NKp30ヌル×BCMA(IgG1)]またはCD16AおよびNKp30に結合しない二重特異性物質[NKp30ヌル×BCMA Fcヌル]よりも高い程度にNK細胞増殖を誘導し、構築物5の増殖シグナルが、主にNKp30係合に依存することを示す。
(実施例27)
Fcの非フコシル化は、NKp30およびBCMAを標的とする多重特異性抗原結合構築物の活性を向上させる
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞(PBMC)をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、NK細胞(CD3−CD56+)をPBMCから単離した。この方法で典型的に達成された単離NK細胞の純度は、90%よりも高かった。単離NK細胞を、脱顆粒アッセイで使用する前に、IL−2およびIL−15で補完された培地で一晩培養した。翌日、NK細胞を、標的H929細胞と1:1のエフェクター:標的(E:T)比で混合した。抗体希釈範囲は、25nMから開始して1/10希釈した(n=6濃度)。NK細胞上のCD107発現ならびに細胞内IFNγを、フローサイトメトリーで測定し、CD107および細胞内IFNγを発現するNK細胞のパーセンテージを決定した。図34に示されているように、多重特異性抗原結合構築物1に非フコシル化Fcを有する構築物7を使用すると、活性が向上する。
Fcの非フコシル化は、NKp30およびBCMAを標的とする多重特異性抗原結合構築物の活性を向上させる
密度勾配遠心分離を使用して、末梢血単核細胞(PBMC)をヒト末梢血バフィコートから単離した。磁気ビーズによるネガティブ選択を使用して、NK細胞(CD3−CD56+)をPBMCから単離した。この方法で典型的に達成された単離NK細胞の純度は、90%よりも高かった。単離NK細胞を、脱顆粒アッセイで使用する前に、IL−2およびIL−15で補完された培地で一晩培養した。翌日、NK細胞を、標的H929細胞と1:1のエフェクター:標的(E:T)比で混合した。抗体希釈範囲は、25nMから開始して1/10希釈した(n=6濃度)。NK細胞上のCD107発現ならびに細胞内IFNγを、フローサイトメトリーで測定し、CD107および細胞内IFNγを発現するNK細胞のパーセンテージを決定した。図34に示されているように、多重特異性抗原結合構築物1に非フコシル化Fcを有する構築物7を使用すると、活性が向上する。
(実施例28)
NKp30は、多発性骨髄腫患者の骨髄中のγδT細胞上に発現される
骨髄細胞を一団の抗体で染色し、4人の多発性骨髄腫患者のBMにおけるγδT細胞の頻度ならびにγδT細胞によるNKp30の発現を、図35Aに示されているように、リンパ球、CD3pos、TCRγδpos細胞をゲート制御することによりフローサイトメトリーで評価した。図35Bは、各患者の骨髄穿刺液中のTCR γδT細胞の頻度を示す。これらのデータは、多発性骨髄腫患者のNKp30発現γδT細胞も、本明細書に記載されているNKp30およびBCMAを標的とする多重特異性抗原結合構築物を使用して活性化することができることを示す。
NKp30は、多発性骨髄腫患者の骨髄中のγδT細胞上に発現される
骨髄細胞を一団の抗体で染色し、4人の多発性骨髄腫患者のBMにおけるγδT細胞の頻度ならびにγδT細胞によるNKp30の発現を、図35Aに示されているように、リンパ球、CD3pos、TCRγδpos細胞をゲート制御することによりフローサイトメトリーで評価した。図35Bは、各患者の骨髄穿刺液中のTCR γδT細胞の頻度を示す。これらのデータは、多発性骨髄腫患者のNKp30発現γδT細胞も、本明細書に記載されているNKp30およびBCMAを標的とする多重特異性抗原結合構築物を使用して活性化することができることを示す。
(実施例29)
多重特異性抗原結合構築物5は、BCMA陽性腫瘍細胞の増殖を阻止する
構築物5を、NK細胞の非存在下で、100ng/mlのAPRILおよび10ng/mlのBAFFを有するかまたは有しない、BCMA陽性腫瘍細胞であるMM.1Rを有する培養に10pMの濃度で添加した。腫瘍細胞増殖を、INCUCYTE(登録商標)生細胞分析システムを使用して蛍光イメージング法により100時間の期間にわたってモニターした。図36に示されているように、親和性成熟BCMAアームを有する多重特異性抗原結合構築物1の変異体である多重特異性抗原結合構築物5は、100ng/mlのAPRILおよび1ng/mlのBAFFの存在下ならびにNK細胞の非存在下でさえ、BCMA陽性腫瘍細胞であるMM.1Rの増殖を阻止した。
多重特異性抗原結合構築物5は、BCMA陽性腫瘍細胞の増殖を阻止する
構築物5を、NK細胞の非存在下で、100ng/mlのAPRILおよび10ng/mlのBAFFを有するかまたは有しない、BCMA陽性腫瘍細胞であるMM.1Rを有する培養に10pMの濃度で添加した。腫瘍細胞増殖を、INCUCYTE(登録商標)生細胞分析システムを使用して蛍光イメージング法により100時間の期間にわたってモニターした。図36に示されているように、親和性成熟BCMAアームを有する多重特異性抗原結合構築物1の変異体である多重特異性抗原結合構築物5は、100ng/mlのAPRILおよび1ng/mlのBAFFの存在下ならびにNK細胞の非存在下でさえ、BCMA陽性腫瘍細胞であるMM.1Rの増殖を阻止した。
(実施例30)
多重特異性抗原結合構築物5は、NK細胞のより大きな増殖および細胞分裂を両方とも誘導する
NK細胞を、IL−2、および構築物5(1nM)、BCMA−IgG1抗体(1nM)、IgG1対照抗体(トラスツズマブ)(1nM)、または無抗体の存在下にて、CELLTRACE(商標)Violet(CTV)で標識されたH929と共に5日間培養した。増殖を、CELLTRACE(商標)Violetの希釈により測定し、NK細胞が起こした細胞分裂の数を、FLOWJOソフトウェア(フロージョーLLC社(FlowJo,LLC);米国オレゴン州アッシュランド(Ashland)所在)を使用して算出した。図37に示されているように、親和性成熟BCMAアームを有する多重特異性抗原結合構築物1の変異体である多重特異性抗原結合構築物5は、CELLTRACE(商標)Violetの希釈により測定したところ、モノクローナルBCMA−IgG1抗体よりも高い程度にNK細胞の増殖および細胞分裂を誘導した。
多重特異性抗原結合構築物5は、NK細胞のより大きな増殖および細胞分裂を両方とも誘導する
NK細胞を、IL−2、および構築物5(1nM)、BCMA−IgG1抗体(1nM)、IgG1対照抗体(トラスツズマブ)(1nM)、または無抗体の存在下にて、CELLTRACE(商標)Violet(CTV)で標識されたH929と共に5日間培養した。増殖を、CELLTRACE(商標)Violetの希釈により測定し、NK細胞が起こした細胞分裂の数を、FLOWJOソフトウェア(フロージョーLLC社(FlowJo,LLC);米国オレゴン州アッシュランド(Ashland)所在)を使用して算出した。図37に示されているように、親和性成熟BCMAアームを有する多重特異性抗原結合構築物1の変異体である多重特異性抗原結合構築物5は、CELLTRACE(商標)Violetの希釈により測定したところ、モノクローナルBCMA−IgG1抗体よりも高い程度にNK細胞の増殖および細胞分裂を誘導した。
(実施例31)
多重特異性抗原結合構築物5は、BCMAリガンドであるAPRILおよびBAFFの存在下でさえ、MM.1R腫瘍細胞の強力なNK細胞殺傷を誘導する
初代NK細胞を、構築物5[100pM]、BCMA−IgG1 mAb[100pM]、または無抗体の存在下または非存在下にて、2:1のエフェクター:標的比で、レンチウイルスNucLight greenを形質導入したBCMA陽性腫瘍細胞MM.1Rと共に共培養した。NK細胞による腫瘍細胞殺傷は、INCUCYTE(登録商標)生細胞分析システムを使用して蛍光イメージング法により4時間の期間にわたってモニターした。殺傷パーセントを、標的細胞のみの対照群の数に対して正規化することにより算出した。図38に示されているように、親和性成熟BCMAアームを有する多重特異性抗原結合構築物1の変異体である多重特異性抗原結合構築物5は、100ng/mlのAPRILおよび1ng/mlのBAFFの存在下で、NK細胞によるBCMA陽性腫瘍細胞MM.1Rの強力な殺傷を誘導した。
多重特異性抗原結合構築物5は、BCMAリガンドであるAPRILおよびBAFFの存在下でさえ、MM.1R腫瘍細胞の強力なNK細胞殺傷を誘導する
初代NK細胞を、構築物5[100pM]、BCMA−IgG1 mAb[100pM]、または無抗体の存在下または非存在下にて、2:1のエフェクター:標的比で、レンチウイルスNucLight greenを形質導入したBCMA陽性腫瘍細胞MM.1Rと共に共培養した。NK細胞による腫瘍細胞殺傷は、INCUCYTE(登録商標)生細胞分析システムを使用して蛍光イメージング法により4時間の期間にわたってモニターした。殺傷パーセントを、標的細胞のみの対照群の数に対して正規化することにより算出した。図38に示されているように、親和性成熟BCMAアームを有する多重特異性抗原結合構築物1の変異体である多重特異性抗原結合構築物5は、100ng/mlのAPRILおよび1ng/mlのBAFFの存在下で、NK細胞によるBCMA陽性腫瘍細胞MM.1Rの強力な殺傷を誘導した。
(実施例32)
多重特異性抗原結合構築物1は、広範囲の抗原発現を発現するBCMA腫瘍細胞の強力な殺傷を誘導する
異なるドナーに由来する初代NK細胞を、系列希釈した構築物1またはBCMA−IgG1モノクローナル抗体の存在下で、様々なレベルのBCMAを発現する多発性骨髄腫腫瘍細胞株と共に4時間共培養した。腫瘍細胞の殺傷を、5:1のエフェクター:標的比を使用して実施した4時間のLDH(乳酸デヒドロゲナーゼ)放出アッセイにより評価した。異なるドナーに由来するエフェクターNK細胞を用いた、標的H929、MM.1S、およびRPMI8226腫瘍細胞の構築物1またはBCMA−IgG1モノクローナル抗体誘導性溶解のEC50値が示されている。データは、構築物1が、モノクローナルBCMA−IgG1抗体よりもはるかにより強力であったことを示す。RPMI8226で試験したBCMA−IgG1のEC50値は、BCMA−IgG1がBCMAに対してNK細胞を活性化しなかったため、該当なし(n/a)として示されている。図39に示されているように、NKp30およびBCMAを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物1は、モノクローナルBCMA−IgG1抗体と比較して、広範囲の抗原発現を発現するBCMA腫瘍細胞の強力な殺傷を誘導する。
多重特異性抗原結合構築物1は、広範囲の抗原発現を発現するBCMA腫瘍細胞の強力な殺傷を誘導する
異なるドナーに由来する初代NK細胞を、系列希釈した構築物1またはBCMA−IgG1モノクローナル抗体の存在下で、様々なレベルのBCMAを発現する多発性骨髄腫腫瘍細胞株と共に4時間共培養した。腫瘍細胞の殺傷を、5:1のエフェクター:標的比を使用して実施した4時間のLDH(乳酸デヒドロゲナーゼ)放出アッセイにより評価した。異なるドナーに由来するエフェクターNK細胞を用いた、標的H929、MM.1S、およびRPMI8226腫瘍細胞の構築物1またはBCMA−IgG1モノクローナル抗体誘導性溶解のEC50値が示されている。データは、構築物1が、モノクローナルBCMA−IgG1抗体よりもはるかにより強力であったことを示す。RPMI8226で試験したBCMA−IgG1のEC50値は、BCMA−IgG1がBCMAに対してNK細胞を活性化しなかったため、該当なし(n/a)として示されている。図39に示されているように、NKp30およびBCMAを両方とも標的とする多重特異性抗原結合構築物1は、モノクローナルBCMA−IgG1抗体と比較して、広範囲の抗原発現を発現するBCMA腫瘍細胞の強力な殺傷を誘導する。
(実施例33)
多重特異性抗原結合構築物8は、CD16A係合の非存在下で活性を示す
初代NK細胞を使用した4時間のLDH(乳酸デヒドロゲナーゼ)殺傷アッセイを実施した。様々な用量の抗体の存在下におけるH929腫瘍細胞の殺傷は、構築物8[構築物5のFcヌルバージョン]またはBCMA−IgG1 mAbにより誘導される、H929腫瘍細胞の最大溶解のパーセンテージとして示されている。図40に示されているように、多重特異性抗原結合構築物5の非グリコシル化(Fcヌル)変異体である多重特異性抗原結合構築物8は、CD16A係合の非存在下でさえ活性を示す。
多重特異性抗原結合構築物8は、CD16A係合の非存在下で活性を示す
初代NK細胞を使用した4時間のLDH(乳酸デヒドロゲナーゼ)殺傷アッセイを実施した。様々な用量の抗体の存在下におけるH929腫瘍細胞の殺傷は、構築物8[構築物5のFcヌルバージョン]またはBCMA−IgG1 mAbにより誘導される、H929腫瘍細胞の最大溶解のパーセンテージとして示されている。図40に示されているように、多重特異性抗原結合構築物5の非グリコシル化(Fcヌル)変異体である多重特異性抗原結合構築物8は、CD16A係合の非存在下でさえ活性を示す。
(実施例34)
多重特異性抗原結合構築物5は、低BCMA JeKo−1腫瘍細胞のNK細胞殺傷を誘導するが、BCMA陰性HL−60腫瘍細胞のNK細胞殺傷は誘導しない
初代NK細胞を、系列希釈(5倍)された構築物5の存在下で、低BCMA(陽性)JeKo−1腫瘍細胞またはBCMA陰性HL−60腫瘍細胞と共に4時間共培養した。図41に示されているように、構築物5の存在下では、JeKo−1腫瘍細胞の殺傷が用量依存的に観察されたが、BCMA陰性HL−60腫瘍細胞の殺傷は検出されなかった。
多重特異性抗原結合構築物5は、低BCMA JeKo−1腫瘍細胞のNK細胞殺傷を誘導するが、BCMA陰性HL−60腫瘍細胞のNK細胞殺傷は誘導しない
初代NK細胞を、系列希釈(5倍)された構築物5の存在下で、低BCMA(陽性)JeKo−1腫瘍細胞またはBCMA陰性HL−60腫瘍細胞と共に4時間共培養した。図41に示されているように、構築物5の存在下では、JeKo−1腫瘍細胞の殺傷が用量依存的に観察されたが、BCMA陰性HL−60腫瘍細胞の殺傷は検出されなかった。
(実施例35)
Her2およびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、優れた細胞傷害活性を呈する
Her2およびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物の効果を分析するため、種々の構築物を研究した(図42)。標準的な分子生物学技法を使用して、各々が、ヒトHer2およびヒトNKp30に特異的に結合する多重特異性抗原結合構築物である構築物CおよびDを生成した。例えば、構築物Dは、抗Her2 IgG1抗体を含み、この抗体の重鎖は、ポリGGGS(配列番号22)リンカーを介して抗Her2抗体のFc領域に接続されている抗NKp30抗体の重鎖可変領域をそのC末端にさらに含む融合タンパク質である。手短に言えば、Her2陽性SK−BR3細胞株を、エフェクターKHYG−1NK細胞株と共に使用した。標的細胞およびNK細胞を、1nMの構築物C、構築物D、またはトラスツズマブと混合し、5%CO2インキュベーターで4時間37℃にてインキュベートした。標的SK−BR3細胞からのLDH(乳酸デヒドロゲナーゼ)放出を、読出しとして測定した。Her2およびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、特異的溶解のパーセンテージにより測定したところ、抗Her2モノクローナル抗体単独、トラスツズマブ単独と比較して優れた活性を呈することが示された。
Her2およびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、優れた細胞傷害活性を呈する
Her2およびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物の効果を分析するため、種々の構築物を研究した(図42)。標準的な分子生物学技法を使用して、各々が、ヒトHer2およびヒトNKp30に特異的に結合する多重特異性抗原結合構築物である構築物CおよびDを生成した。例えば、構築物Dは、抗Her2 IgG1抗体を含み、この抗体の重鎖は、ポリGGGS(配列番号22)リンカーを介して抗Her2抗体のFc領域に接続されている抗NKp30抗体の重鎖可変領域をそのC末端にさらに含む融合タンパク質である。手短に言えば、Her2陽性SK−BR3細胞株を、エフェクターKHYG−1NK細胞株と共に使用した。標的細胞およびNK細胞を、1nMの構築物C、構築物D、またはトラスツズマブと混合し、5%CO2インキュベーターで4時間37℃にてインキュベートした。標的SK−BR3細胞からのLDH(乳酸デヒドロゲナーゼ)放出を、読出しとして測定した。Her2およびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、特異的溶解のパーセンテージにより測定したところ、抗Her2モノクローナル抗体単独、トラスツズマブ単独と比較して優れた活性を呈することが示された。
(実施例36)
BCMAおよびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、γδT細胞による標的細胞殺傷を促進する
ガンマデルタ(γδ)T細胞を、新鮮なバフィコートから単離されたヒト末梢血単核細胞(PBMC)からのCD3およびγδTCRの陽性発現に従って、FACsARIAを使用して選別し、合計で約2.5×104個の濃縮γδT細胞を得た。γδT細胞を、1μg/mLの抗CD3、0.5μg/mLの抗CD28、100IUのIL−2、および1μg/mLのPHAと共に1×106個/mLで約12日間培養した。γδT細胞の最終収量は、約6×106個だった。
BCMAおよびNKp30を標的とする多重特異性抗原結合構築物は、γδT細胞による標的細胞殺傷を促進する
ガンマデルタ(γδ)T細胞を、新鮮なバフィコートから単離されたヒト末梢血単核細胞(PBMC)からのCD3およびγδTCRの陽性発現に従って、FACsARIAを使用して選別し、合計で約2.5×104個の濃縮γδT細胞を得た。γδT細胞を、1μg/mLの抗CD3、0.5μg/mLの抗CD28、100IUのIL−2、および1μg/mLのPHAと共に1×106個/mLで約12日間培養した。γδT細胞の最終収量は、約6×106個だった。
拡大増殖したγδT細胞の表現型および機能評価は、図43に示されている。図示されているように、拡大増殖したγδT細胞のおよそ40%は、NKp30発現に対して陽性である。
拡大増殖したγδT細胞のさらなる表現型および機能評価を実施した。γδT細胞を計数し、10nM濃度のCFSE Far Redで染色し、1ウェル当たり100,000細胞でRP10+10IUのIL−2に播種した。U266標的細胞をcell trace CFSEで染色し、1ウェル当たり50,000標的細胞でRP10に播種し、最終2:1エフェクター:標的比をもたらした。構築物5の系列希釈物を、RP10培地で10nMから開始して10倍系列希釈して調製し、合計7つのデータ点を作成した。プレートをIncucyte Zoomでインキュベートし、緑色および赤色チャネルの画像を2時間毎に撮影した。図44に示されているように、標的U266細胞のT細胞特異的細胞傷害性は、構築物5の存在下では用量依存的効果を示す。さらに、図45に実証されているように、構成物5の存在下でのみ、30分後に標的U266細胞の殺傷が観察された。左パネルおよび右パネルでは両方とも、標的U266細胞は、Invitrogen Cell Trace CFSEで緑色に標識されている。30分後、10pMの構築物5の存在下でのみ、標的U266細胞が顕著に減少し(右パネル)、構築物5によるγδT細胞上のNKp30の係合が、標的細胞殺傷を促進することを実証する。標的U266細胞の減少に加えて、図46に示されているように、γδT細胞が48時間後に増加する。上部パネルおよび下部パネルでは両方とも、γδT細胞は、CFSE Far Redで標識されているが、10pMの構築物5の存在下でのみ(底部パネル)γδT細胞の数の増加が見られ、構成物5によるγδT細胞上のNKp30の係合が、γδT細胞増殖を増加させることが実証されている。
(実施例37)
NKp30に対する不可欠な結合残基の識別
NKp30突然変異体の抗体結合を、Forte Bio Octet Red384システム(ポールフォーテバイオコーポレーション社(Pall Forte Bio Corporation)、米国カリフォルニア州メンローパーク(Menlo Park)所在)で実施した。Hisタグ付きNKp30突然変異体を、順化培地からHIS1K Octetセンサーで直接的に捕捉した。次いで、センサーを100nM試験抗体に曝露した。ForteBioのデータ分析ソフトウェア7.0を使用してデータを処理し、結合応答を表にして報告した。
NKp30に対する不可欠な結合残基の識別
NKp30突然変異体の抗体結合を、Forte Bio Octet Red384システム(ポールフォーテバイオコーポレーション社(Pall Forte Bio Corporation)、米国カリフォルニア州メンローパーク(Menlo Park)所在)で実施した。Hisタグ付きNKp30突然変異体を、順化培地からHIS1K Octetセンサーで直接的に捕捉した。次いで、センサーを100nM試験抗体に曝露した。ForteBioのデータ分析ソフトウェア7.0を使用してデータを処理し、結合応答を表にして報告した。
NKp30内のどのアミノ酸残基が、ヒトNKp30に対するmAb8、mAb10、およびmAb11の結合に不可欠であるかを決定するため、複合アラニンおよびアルギニンスキャニング突然変異誘発分析(combined alanine and arginine scanning mutagenesis analysis)を実施して、NKp30に対する抗体結合に重要な残基を識別した。NKp30に対するNKp30リガンドB7−H6の結合に重要であることが知られている選択されたアミノ酸残基位置に単一の点突然変異を有するNKp30突然変異体を生成した。その後、これらのHisタグ付きNKp30突然変異体を、mAb8、mAb10、およびmAb11に結合するそれらの能力について試験した。
mAb8の場合、I50、S82、およびL113が、NKp30に対する結合に重要なアミノ酸残基であると識別された。それは、これらの残基を突然変異させると、NKp30に対する結合の喪失がもたらされたからである。mAb10およびmAb11の場合、I50およびL113が、NKp30に対する結合に重要なアミノ酸残基であると識別された。それは、これらの残基を突然変異させると、NKp30に対する結合の喪失がもたらされたからである。図47Aは、NKp30の部分的アミノ酸配列を有する表を示す。この表では、mAb8、mAb10、およびmAb11が結合するエピトープを構成する残基は、太字で示されている。また、図47Bには、残基I50、S82、およびL113が球体として示されているヒトNKp30のX線結晶解析画像(左パネル)、ならびに残基I50、S82、およびL113が球体として示されている、B7−H6に結合しているヒトNKp30のX線結晶解析画像(右パネル)が描かれている。これらの図は、本明細書に記載されているNKp30抗原結合性タンパク質が、NKp30の立体構造エピトープまたは非リニアエピトープに結合し、それによりリガンド結合を阻止することを示す。
Claims (283)
- 少なくとも2つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、第1の抗原結合単位が、第1の腫瘍抗原に結合することにより腫瘍細胞を特異的に標的化するか、またはB細胞により発現される第1の標的抗原に結合することによりB細胞を特異的に標的化し、第2の抗原結合単位が、NKp30抗原に特異的に結合する、多重特異性抗原結合性構築物。
- 第2の腫瘍抗原、B細胞により発現される第2の標的抗原、またはNK受容体に結合する第3の抗原結合単位をさらに含む、請求項1に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記第1の抗原結合単位が、第1の腫瘍抗原に結合することにより腫瘍細胞を特異的に標的化する、請求項1または2に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記第3の抗原結合単位が第2の腫瘍抗原に結合する、請求項3に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記第3の抗原結合単位がNK受容体に結合する、請求項3に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記NK受容体がNKp30である、請求項5に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記NK受容体がNKG2Dである、請求項5に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記NK受容体がNKp46またはNKp44である、請求項5に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記第1の腫瘍抗原に結合する2つの抗原結合単位を含む、請求項1乃至8のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記第1の腫瘍抗原および前記第2の腫瘍抗原が同じ腫瘍抗原である、請求項2乃至9のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記第1の抗原結合単位が、B細胞により発現される第1の標的抗原に結合することによりB細胞を特異的に標的化する、請求項1または2に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記B細胞により発現される前記第1の標的抗原が、自己反応性B細胞または形質細胞である、請求項1、2、または11に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記B細胞により発現される前記第1の標的抗原が、B細胞特異的、B細胞拘束、またはB細胞濃縮抗原である、請求項1、2、11、および12のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記B細胞により発現される前記第1の標的抗原が、CD19、CD20、およびBCMAからなる群から選択される、請求項1、2、および11乃至13のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記第3の抗原結合単位が、B細胞により発現される第2の標的抗原に結合する、請求項2または11に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- B細胞により発現される前記第1の標的抗原に結合する2つの抗原結合単位を含む、請求項2および11乃至15のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- B細胞により発現される前記第1の標的抗原およびB細胞により発現される前記第2の標的抗原が同じ抗原である、請求項16に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 少なくとも4つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、(i)第1の抗原結合単位が、第1の腫瘍抗原に結合することにより腫瘍細胞を特異的に標的化するか、またはB細胞により発現される第1の標的抗原に結合することによりB細胞を標的化し、第2の抗原結合単位が、第1のNK細胞活性化受容体に特異的に結合し、第3の抗原結合単位が、第2のNK細胞活性化受容体に結合し、第4の抗原結合単位が、第2の腫瘍抗原またはB細胞により発現される第2の標的抗原に結合し、(ii)前記第1のNK受容体がNKp30であり、前記第2のNK受容体がNKp30ではない、多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記第1の腫瘍抗原および前記第2の腫瘍抗原が同じ腫瘍抗原である、請求項18に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記第1の腫瘍抗原または前記第2の腫瘍抗原が、1GH−IGK、43−9F、5T4、791Tgp72、シクロフィリンC会合タンパク質、アルファ−フェトプロテイン(AFP)、α−アクチニン−4、A3、A33抗体に特異的な抗原、ART−4、B7、Ba 733、BAGE、BCMA、BCR−ABL、ベータカテニン、ベータ−HCG、BrE3抗原、BCA225、BTAA、CA125、CA 15−3\CA 27.29\BCAA、CA195、CA242、CA−50、CAM43、CAMEL、CAP−1、炭酸脱水酵素IX、c−Met、CA19−9、CA72−4、CAM 17.1、CASP−8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a−e、CD67、CD68、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD83、CD95、CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK4、CDK4m、CDKN2A、CO−029、CTLA4、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF−1a、結腸特異的抗原p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、c−Met、DAM、E2A−PRL、EGFR、EGFRvIII、EGP−1(TROP−2)、EGP−2、ELF2−M、Ep−CAM、線維芽細胞増殖因子(FGF)、FGF−5、Flt−1、Flt−3、葉酸受容体、G250抗原、Ga733VEpCAM、GAGE、gp100、GRO−β、H4−RET、HLA−DR、HM1.24、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)およびそのサブユニット、HER2/neu、HMGB−1、低酸素誘導因子(HIF−1)、HSP70−2M、HST−2、HTgp−175、Ia、IGF−1R、IFN−γ、IFN−α、IFN−β、IFN−λ、IL−4R、IL−6R、IL−13R、IL−15R、IL−17R、IL−18R、IL−2、IL−6、IL−8、IL−12、IL−15、IL−17、IL−18、IL−23、IL−25、インスリン様増殖因子−1(IGF−1)、KC4抗原、KSA、KS−1抗原、KS1−4、LAGE−1a、Le−Y、LDR/FUT、M344、MA−50、マクロファージ遊走阻害因子(MIF)、MAGE、MAGE−1、MAGE−3、MAGE−4、MAGE−5、MAGE−6、MART−1、MART−2、TRAG−3、mCRP、MCP−1、MIP−1A、MIP−1B、MIF、MG7−Ag、MOV18、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC13、MUC16、MUM−1/2、MUM−3、MYL−RAR、NB/70K、Nm23H1、NuMA、NCA66、NCA95、NCA90、NY−ESO−1、p15、p16、p185erbB2、p180erbB3、PAM4抗原、膵臓がんムチン、PD1受容体(PD−1)、PD−1受容体リガンド1(PD−L1)、PD−1受容体リガンド2(PD−L2)、PI5、胎盤増殖因子、p53、PLAGL2、Pmel17前立腺酸ホスファターゼ、PSA、PRAME、PSMA、PlGF、ILGF、ILGF−1R、IL−6、IL−25、RCAS1、RS5、RAGE、RANTES、Ras、T101、SAGE、S100、サバイビン、サバイビン−2B、SDDCAG16、TA−90\Mac2結合タンパク質、TAAL6、TAC、TAG−72、TLP、テネイシン、TRAIL受容体、TRP−1、TRP−2、TSP−180、TNF−α、Tn抗原、トムセン−フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、チロシナーゼ、VEGFR、ED−Bフィブロネクチン、WT−1、17−1A抗原、補体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管新生マーカー、bc1−2、bc1−6、またはK−rasである、請求項1乃至10、18、および19のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記第1の腫瘍抗原および前記第2の腫瘍抗原の一方または両方がB細胞成熟抗原(BCMA)またはHER2である、請求項1乃至10、18、および19のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- B細胞により発現される前記第1の抗原およびB細胞により発現される前記第2の抗原が同じ抗原である、請求項18に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- B細胞により発現される前記第1の抗原またはB細胞により発現される前記第2の抗原がB細胞成熟抗原(BCMA)である、請求項1、2、5乃至8、11乃至18、21、22のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記抗原結合単位の1つまたは複数が抗体またはその抗原結合性部分である、請求項1乃至23のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記抗原結合単位のそれぞれが抗体またはその抗原結合性部分である、請求項1乃至23のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記第1の抗原結合単位の前記抗体またはその抗原結合性部分がモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分である、請求項24または25に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記抗原結合単位のいずれか1つの前記抗体またはその抗原結合性部分が、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、またはいずれかの抗原結合性部分である、請求項24乃至26のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記抗原結合単位のいずれか1つの前記抗体またはその抗原結合性部分がscFvまたはFab抗体断片である、請求項24乃至26のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記抗原結合単位の1つまたは複数が非抗体スキャフォールドタンパク質である、請求項1乃至24および26乃至28のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記非抗体スキャフォールドタンパク質がアンチカリンである、請求項29に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記抗原結合単位の1つまたは複数が、ポリペプチド、小分子、またはアプタマーである、請求項1乃至24および26乃至30のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 少なくとも1つの抗原結合単位が、エフェクター免疫細胞により発現される分子に特異的に結合する、請求項1乃至31のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記エフェクター免疫細胞により発現される前記分子が、CD16、CD16a、CD16b、CD32a、CD64、またはCD89である、請求項32に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 1つの抗原結合単位のその標的への結合が、別の抗原結合単位のその標的への結合を遮断しない、請求項1乃至33のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記第1の抗原結合単位および前記第2の抗原結合単位がそれらの各々の標的に結合し、両方の抗原結合単位が同時に結合したままとなる、請求項1乃至34のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 全ての抗原結合単位がそれらの各々の標的に結合し、同時に結合したままとなる、請求項1乃至35のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 第1の抗原結合単位および1つまたは複数の追加の抗原結合単位のそれらの各々の標的への結合が、第1の細胞および腫瘍またはB細胞を一緒になるようにブリッジ形成させることができる、請求項1乃至36のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記第1の細胞および前記腫瘍またはB細胞の前記ブリッジ形成が、フローサイトメトリーおよび/または蛍光プレートリーダーにより決定される、請求項37に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記抗原結合単位の1つまたは複数が標的抗原機能を阻害する、請求項1乃至38のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 二重特異性抗体である、請求項1乃至39のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 三重特異性または四重特異性抗体である、請求項1乃至39のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 共通の軽鎖を含む、請求項1乃至41のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 四価である、請求項1乃至42のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 少なくとも1つの腫瘍またはB細胞抗原について少なくとも二価である、請求項1乃至43のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- NKp30抗原について少なくとも二価である、請求項1乃至43のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- Fcドメインを含まない、請求項1乃至45のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 1つまたは複数の抗原結合単位が、Fcドメイン中の1つまたは複数の免疫グロブリンFc改変を含む重鎖を含む、請求項1乃至45のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記重鎖の前記免疫グロブリンFcドメインが、前記1つまたは複数の抗原結合単位のヘテロ二量体化を促進する1つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む、請求項47に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記突然変異が前記重鎖のCH3ドメイン中に存在する、請求項48に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- クアドローマ細胞中で製造される、請求項1乃至49のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 1つまたは複数の免疫グロブリン定常領域改変を含む、請求項1乃至50のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記免疫グロブリン定常領域が、抗体のヘテロ二量体化を促進する1つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む、請求項51に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 1つまたは複数の突然変異が1つの抗原結合単位の軽鎖定常領域中に存在し、1つまたは複数の突然変異が別の抗原結合単位の重鎖定常領域中に存在する、請求項51または52に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記Fcドメインが増加したエフェクター機能を有する、請求項47乃至53のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記Fcドメインが減少したエフェクター機能を有する、請求項47乃至53のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記Fcドメインが前記構築物の半減期を増進する、請求項47乃至55のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記多重特異性抗体が、多重特異性IgG、多重特異性抗体断片、多重特異性融合タンパク質、付加型IgG、および多重特異性抗体コンジュゲートからなる群から選択される、請求項47乃至56のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記第1の腫瘍抗原および第2の腫瘍抗原の一方または両方が腫瘍特異抗原である、請求項1乃至10、18乃至21、24乃至54、および56のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記抗原結合単位の1つまたは複数が、B細胞により発現される標的抗原に特異的に結合する、請求項1乃至2、5乃至8、11乃至18、22乃至53、55乃至57のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 少なくとも3つの連結した抗原結合単位を含む多重特異性抗原結合性構築物であって、第1の抗原結合単位が、B系列細胞により発現される第1の標的抗原に特異的に結合し、第2の抗原結合単位がNKp30抗原に特異的に結合し、第3の抗原結合単位が、第2のB系列細胞により発現される第2の標的抗原またはNK受容体に結合する、多重特異性抗原結合性構築物。
- B系列細胞により発現される前記第1の標的抗原がB細胞成熟抗原(BCMA)である、請求項60に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- B系列細胞により発現される前記第2の標的抗原が、BCMA、CD1c、CD5、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD27、CD34、CD38、CD40、CD72、CD78、CD79a、CD79b、CD80、CD84、CD86、CD126、CD138、CD319、TAC、GPRC5D(Gタンパク質共役型受容体クラスCグループ5メンバーD)、SLAMF7(CS1)、およびIL7/3Rからなる群から選択される、請求項60または61に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記B系列細胞が、プロB細胞、プレB細胞、移行期B細胞、濾胞性B細胞、辺縁帯B細胞、胚中心B細胞、形質細胞、およびメモリーB細胞からなる群から選択される、請求項60乃至62のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記第1の抗原結合単位が、前記B系列細胞により発現される前記第1の標的抗原の機能を阻害する、請求項60乃至63のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記第1の抗原結合単位および前記第2の抗原結合単位が少なくとも1つのアミノリンカーアミノ酸配列により連結されている、請求項1乃至64のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記リンカーアミノ酸配列がGGGGSx(配列番号22)(xは、1および6を含む1〜6の整数である)を含む、請求項65に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- (a)それぞれ配列番号38、39、および40において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、
(b)それぞれ配列番号11、12、および41において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、
(c)それぞれ配列番号44、45、および46において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、
(d)それぞれ配列番号47、48、および46において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、
(e)それぞれ配列番号11、45、および49において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、
(f)それぞれ配列番号11、50、および41において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、または
(g)それぞれ配列番号44、50、および41において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列
を含む、請求項1乃至66のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。 - 配列番号10、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、および配列番号57のいずれか1つの重鎖可変領域配列または配列番号10、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号56、および配列番号57のいずれか1つの配列に対して少なくとも90%の同一性を有する重鎖可変配列を含む、請求項1乃至67のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- (a)それぞれ配列番号15、16、および42において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、または(b)それぞれ配列番号69、70、および71において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む、請求項1乃至68のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 配列番号14、25、もしくは72において示される重鎖可変領域配列または配列番号14、25、もしくは72において示される配列に対して少なくとも90%の同一性を有する重鎖可変配列を含む、請求項69に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- それぞれ配列番号19、20、および43において示される軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む、請求項1乃至70のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 配列番号18において示される軽鎖可変領域配列または配列番号18において示される配列に対して少なくとも90%の同一性を有する軽鎖可変配列を含む、請求項71に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 配列番号9、配列番号24、配列番号26、配列番号27、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、および配列番号74のいずれか1つにおいて示される重鎖配列ならびに配列番号8において示される軽鎖配列を含む、請求項1乃至72のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- (a)配列番号38(YTFX1X2X3YX4Hであり、X1はTまたはSであり、X2はNまたはSであり、X3はYまたはHであり、X4はMまたはVである)のCDRH1、
(b)配列番号39(GX5IDPSX6GX7X8TYAであり、X5はVまたはIであり、X6はGまたはDであり、X7はG、YまたはSであり、X8はNまたはSである)のCDRH2、および
(c)配列番号40(ARGRYDYX9DYLGWFDX10であり、X9はGまたはSであり、X10はPまたはGである)のCDRH3
を含む重鎖可変領域を含む、ヒトBCMAに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。 - CDRH1が配列番号11であり、CDRH2が配列番号12であり、CDRH3が配列番号41である、請求項74に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
- CDRH1が配列番号44であり、CDRH2が配列番号45であり、CDRH3が配列番号46である、請求項74に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
- CDRH1が配列番号47であり、CDRH2が配列番号48であり、CDRH3が配列番号46である、請求項74に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
- CDRH1が配列番号11であり、CDRH2が配列番号45であり、CDRH3が配列番号49である、請求項74に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
- CDRH1が配列番号11であり、CDRH2が配列番号50であり、CDRH3が配列番号41である、請求項74に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
- CDRH1が配列番号44であり、CDRH2が配列番号50であり、CDRH3が配列番号41である、請求項74に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
- 配列番号19のCDRL1、配列番号20のCDRL2、および配列番号43のCDRL3をさらに含む、請求項74乃至80のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
- 配列番号10のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一の重鎖可変配列を含む、請求項74乃至81のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
- 配列番号52のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一の重鎖可変配列を含む、請求項74乃至81のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
- 配列番号53のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一の重鎖可変配列を含む、請求項74乃至81のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
- 配列番号54のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一の重鎖可変配列を含む、請求項74乃至81のいずれか1項の請求項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
- 配列番号55のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一の重鎖可変配列を含む、請求項74乃至81のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
- 配列番号56のアミノ酸配列または配列番号57のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一の重鎖可変配列を含む、請求項74乃至81のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
- 配列番号18のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一の軽鎖可変配列を含む、請求項74乃至87のいずれか1項の請求項のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
- 配列番号10、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、および配列番号57のいずれか1つから選択される重鎖可変配列ならびに配列番号18の軽鎖可変配列を含む、請求項74に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
- ヒトBCMAに結合した場合、配列番号10、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、および配列番号57のいずれか1つの重鎖可変領域配列ならびに配列番号18の軽鎖可変配列を含む抗ヒトBCMA抗体により結合されるアミノ酸残基の少なくとも1つに結合する、ヒトBCMAに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
- (a)配列番号15のCDRH1、配列番号16のCDRH2、および配列番号42のCDRH3または(b)配列番号69のCDRH1、配列番号70のCDRH2、および配列番号71のCDRH3を含む重鎖可変領域を含む、ヒトNKp30に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
- 配列番号19のCDRL1、配列番号20のCDRL2、および配列番号43のCDRL3を含む軽鎖可変領域を含む、請求項91に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
- 配列番号14、配列番号25、または配列番号72のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一の重鎖可変配列を含む、請求項91または92に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
- 配列番号18のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一の軽鎖可変配列を含む、請求項91乃至93のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
- 配列番号14、配列番号25、または配列番号72の重鎖可変配列および配列番号18の軽鎖可変配列を含む、請求項91乃至94のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
- ヒトNKp30に結合した場合、(a)配列番号14、配列番号25、もしくは配列番号72の重鎖可変領域配列および配列番号18の軽鎖可変領域配列、または(b)配列番号78の重鎖可変領域配列および配列番号80の軽鎖可変領域配列を含む抗ヒトNKp30抗体の結合を交差遮断する、ヒトNKp30に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
- 配列番号7の残基I50、S82、またはL113の少なくとも1つを含むヒトNKp30上のエピトープに結合する、ヒトNKp30に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分。
- 前記エピトープが配列番号7の残基I50を含む、請求項97に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分。
- 前記エピトープが配列番号7の残基S82を含む、請求項97に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分。
- 前記エピトープが配列番号7の残基L113を含む、請求項97に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分。
- 前記エピトープが、残基(a)配列番号7のI50およびS82、(b)配列番号7のI50およびSL113、(c)配列番号7のS82およびL113、または(d)配列番号7のI50、S82、およびL113を含む、請求項97に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分。
- 約1×10−6またはそれ未満の親和性(KD)でNKp30に結合する、請求項97乃至101のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分。
- 前記ヒトNKp30のリガンド結合領域に結合する、請求項97乃至102のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分。
- 前記NKp30リガンドが、BAG6、B7−H6、またはGal−3である、請求項103に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分。
- 配列番号7の残基I50、S82、またはL113、またはその任意の組合せのアラニンへの突然変異が、ヒトNKp30への結合の喪失を結果としてもたらす、請求項97乃至104のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分。
- 配列番号7のアミノ酸残基50〜113内に位置するエピトープに結合する、請求項97乃至105のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分。
- 前記エピトープが非リニアエピトープである、請求項97乃至106のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分。
- (a)それぞれ配列番号15、16、および42において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、ならびにそれぞれ配列番号19、20および43において示される軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、
(b)それぞれ配列番号69、70および71において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、ならびにそれぞれ配列番号19、20および43において示される軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、ならびに
(c)それぞれ配列番号75、76、および77において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、ならびに配列番号80の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列
からなる群から選択される重鎖および軽鎖CDRを有する抗体またはその抗原結合性部分と、ヒトNKp30上の前記エピトープへの結合について競合する、請求項97乃至107のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分。 - 配列番号14、配列番号25、もしくは配列番号72の重鎖可変領域アミノ酸配列、および配列番号18の軽鎖可変領域アミノ酸配列、または配列番号78の重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号80の軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する抗体またはその抗原結合性部分と、ヒトNKp30上の前記エピトープへの結合について競合する、請求項97乃至108のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分。
- (a)配列番号14、配列番号25、または配列番号72のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号18のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域または(b)配列番号78のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号80のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合性部分と、ヒトNKp30上の前記エピトープへの結合について競合する、請求項97乃至109のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分。
- ヒトNKp30のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、前記エピトープが配列番号7のアミノ酸50〜113内にありまたはそれとオーバーラップし、I50、S82、およびL113における置換の1つまたは複数が前記抗体または抗原結合性部分のヒトNKp30への結合を妨害する、抗体またはその抗原結合性部分。
- 前記エピトープがコンホメーショナルエピトープである、請求項111に記載の抗体またはその抗原結合性部分。
- 前記エピトープがリニアエピトープである、請求項111に記載の抗体またはその抗原結合性部分。
- NKp30抗原に特異的に結合する前記第2の抗原結合単位が配列番号7の残基I50、S82、またはL113の少なくとも1つを含むヒトNKp30上のエピトープに結合する、請求項1乃至73のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記エピトープが配列番号7の残基I50を含む、請求項114に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記エピトープが配列番号7の残基S82を含む、請求項114に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記エピトープが配列番号7の残基L113を含む、請求項114に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記エピトープが、残基(i)配列番号7のI50およびS82、(ii)配列番号7のI50およびSL113、(iii)配列番号7のS82およびL113または(iv)配列番号7のI50、S82、およびL113を含む、請求項114に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記第2の抗原結合単位または構築物が約1×10−6またはそれ未満の親和性(KD)でNKp30に結合する、請求項114乃至118のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記第2の抗原結合単位またはその構築物がヒトNKp30のリガンド結合領域に結合する、請求項114乃至119のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記NKp30リガンドが、BAG6、B7−H6、またはGal−3である、請求項120に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 配列番号7の残基I50、S82、またはL113、またはその任意の組合せのアラニンへの突然変異が、ヒトNKp30への結合の喪失を結果としてもたらす、請求項114乃至121のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記エピトープが非リニアエピトープである、請求項114乃至122のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記第2の抗原結合単位または構築物が、
(a)それぞれ配列番号15、16、および42において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、ならびにそれぞれ配列番号19、20および43において示される軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、
(b)それぞれ配列番号69、70および71において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、ならびにそれぞれ配列番号19、20および43において示される軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、ならびに
(c)それぞれ配列番号75、76、および77において示される重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、ならびに配列番号80の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列
からなる群から選択される重鎖および軽鎖CDRを有する抗体またはその抗原結合性部分と、ヒトNKp30上の前記エピトープへの結合について競合する、請求項114乃至123のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。 - 前記第2の抗原結合単位または構築物が、配列番号14、配列番号25、もしくは配列番号72の重鎖可変領域アミノ酸配列、および配列番号18の軽鎖可変領域アミノ酸配列、または配列番号78の重鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号80の軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する抗体またはその抗原結合性部分と、ヒトNKp30上の前記エピトープへの結合について競合する、請求項114乃至124のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記第2の抗原結合単位または構築物が、(i)配列番号14、配列番号25、もしくは配列番号72のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号18のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、または(ii)配列番号78のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号80のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体またはその抗原結合性部分と、ヒトNKp30上の前記エピトープへの結合について競合する、請求項114乃至125のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記第2の抗原結合単位がヒトNKp30のエピトープに結合し、前記エピトープが配列番号7のアミノ酸50〜113内にありまたはそれとオーバーラップし、I50、S82、およびL113における置換の1つまたは複数が前記抗体または抗原結合性部分のヒトNKp30への結合を妨害する、請求項1乃至73のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物。
- 前記エピトープがコンホメーショナルエピトープである、請求項127に記載の抗体またはその抗原結合性部分。
- 前記エピトープがリニアエピトープである、請求項127に記載の抗体またはその抗原結合性部分。
- 請求項1乃至129のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物または単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片をコードする核酸。
- 請求項130に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 1つまたは複数の発現制御配列をさらに含む、請求項131に記載の発現ベクター。
- 請求項131または132に記載の発現ベクターを含む細胞。
- 哺乳動物細胞である、請求項133に記載の細胞。
- 前記哺乳動物細胞が齧歯動物細胞である、請求項134に記載の細胞。
- 前記齧歯動物細胞がCHO細胞である、請求項135に記載の細胞。
- 多重特異性抗原結合性構築物または単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片を製造する方法であって、請求項133乃至136のいずれか1項に記載の細胞を前記細胞による前記発現ベクターからの前記多重特異性抗原結合性構築物または単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片の発現のために好適な条件下で培養することを含む、方法。
- 前記細胞または前記細胞が培養された培地から前記構築物または単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片を単離することをさらに含む、請求項137に記載の方法。
- 請求項1乃至126のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物または単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- (a)請求項1乃至129のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物または単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片および
(b)(a)の多重特異性抗原結合性構築物または単離された抗体もしくはその抗原結合性断片にコンジュゲート化した異種部分
を含む、タンパク質コンジュゲート分子。 - 前記異種部分が、治療剤、毒素、薬物、または放射性部分である、請求項140に記載のタンパク質コンジュゲート分子。
- 対象においてがん細胞に対する免疫応答を増進する方法であって、前記対象に有効量の請求項1乃至10、18乃至21、24乃至54、56乃至58、65乃至129、および139乃至141のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートを投与し、それにより、前記対象においてがん細胞に対する免疫応答を増進することを含む、方法。
- 前記免疫応答がNK細胞媒介性免疫応答である、請求項142に記載の方法。
- 前記がん細胞が、血液がん細胞、リンパ腫細胞、骨髄腫細胞、白血病細胞、神経学的がん細胞、乳がん細胞、前立腺がん細胞、皮膚がん細胞、肺がん細胞、膀胱がん細胞、腎臓がん細胞、頭頸部がん細胞、胃腸がん細胞、結腸直腸がん細胞、肝臓がん細胞、膵臓がん細胞、泌尿生殖器がん細胞、骨がん細胞、および血管がん細胞である、請求項142または143に記載の方法。
- 前記がん細胞が前記第1の腫瘍抗原を発現する、請求項142乃至144のいずれか1項に記載の方法。
- 前記がん細胞が前記第1の腫瘍抗原および前記第2の腫瘍抗原を発現する、請求項142乃至145のいずれか1項に記載の方法。
- 対象においてB細胞に対する免疫応答を増進する方法であって、前記対象に有効量の請求項1乃至2、5乃至8、11乃至18、22乃至53、55乃至57、59乃至129、および139乃至141のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートを投与し、それにより、前記対象においてB細胞に対する免疫応答を増進することを含む、方法。
- 前記免疫応答がNK細胞媒介性免疫応答である、請求項147に記載の方法。
- 前記B細胞が自己反応性B細胞または形質細胞である、請求項147または148に記載の方法。
- 前記B細胞が前記第1のB細胞抗原を発現する、請求項147乃至149のいずれか1項に記載の方法。
- 前記B細胞が前記第1のB細胞抗原および前記第2のB細胞抗原を発現する、請求項147乃至150のいずれか1項に記載の方法。
- 対象においてがんを治療する方法であって、前記対象に有効量の請求項1乃至10、18乃至21、24乃至54、56乃至58、65乃至129、および139乃至141のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートを投与することを含む、方法。
- それを必要とする対象においてがんを治療しもしくはその進行を遅延させまたは腫瘍成長を低減もしくは阻害する方法であって、前記対象に有効量の請求項1乃至10、18乃至21、24乃至54、56乃至58、65乃至129、および139乃至141のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートを投与することを含む、方法。
- 前記がんが、血液がん、リンパ腫、骨髄腫、白血病、神経学的がん、乳がん、前立腺がん、皮膚がん、肺がん、膀胱がん、腎臓がん、頭頸部がん、胃腸がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、泌尿生殖器がん、骨がん、または血管がんである、請求項152または153に記載の方法。
- 前記がんが、前記第1の腫瘍抗原を発現するがん細胞を含む、請求項152乃至154のいずれか1項に記載の方法。
- 前記がんが、前記第1の腫瘍抗原および前記第2の腫瘍抗原を発現するがん細胞を含む、請求項152乃至155のいずれか1項の請求項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、前記医薬組成物、または前記タンパク質コンジュゲートが、NKp30機能をアゴナイズすることにより前記対象の免疫応答を増進する、請求項152乃至156のいずれか1項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、前記医薬組成物、または前記タンパク質コンジュゲートがナチュラルキラー(NK)細胞媒介性がん細胞溶解および/またはγδ T細胞機能を増進する、請求項152乃至157のいずれか1項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、前記医薬組成物、または前記タンパク質コンジュゲートがγδ T細胞媒介性細胞傷害性またはサイトカイン産生を増進する、請求項158に記載の方法。
- 抗がん療法を前記対象に投与することをさらに含む、請求項152乃至159のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗がん療法が、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、細胞療法、サイトカイン療法、放射線療法、寒冷療法、または外科療法である、請求項160に記載の方法。
- 前記抗がん療法が、前記多重特異性抗原結合性構築物または単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片を用いる治療の前、同時、または後に投与される、請求項160または161に記載の方法。
- 前記抗がん療法が免疫療法であり、前記対象における前記がんが、前記多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、前記医薬組成物、または前記タンパク質コンジュゲートを用いる治療の非存在下で前記免疫療法に対して難治性である、請求項160乃至162のいずれか1項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、前記医薬組成物、または前記タンパク質コンジュゲートが、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口的、筋肉内、または頭蓋内に投与される、請求項152乃至163のいずれか1項に記載の方法。
- 前記がんがCD16欠損性腫瘍微環境を含み、または、前記がん細胞がCD16欠損性腫瘍微環境中に存在する、請求項152乃至164のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象の前記がんにおけるCD16の発現レベルを検出することをさらに含む、請求項152乃至165のいずれか1項に記載の方法。
- 前記CD16を検出することがCD16aまたはCD16bのレベルを検出することを含む、請求項166に記載の方法。
- 前記CD16欠損性微環境が、前記対象に対する造血幹細胞移植と関連付けられる、請求項165乃至167のいずれか1項に記載の方法。
- 前記CD16欠損性微環境が浸潤性NK細胞の集団を含み、前記浸潤性NK細胞が対照NK細胞と比較して50%未満のCD16の発現を有する、請求項165乃至168のいずれか1項に記載の方法。
- 前記浸潤性NK細胞が、対照NK細胞と比較して30%未満、20%未満、または10%未満のCD16の発現を有する、請求項169に記載の方法。
- 前記CD16欠損性微環境が浸潤性NK細胞の集団を含み、前記浸潤性NK細胞の少なくとも10%が対照NK細胞と比較して低減されたCD16の発現を有する、請求項165乃至169のいずれか1項に記載の方法。
- 前記浸潤性NK細胞の少なくとも20%、少なくとも30%、または少なくとも40%が対照NK細胞と比較して低減されたCD16の発現を有する、請求項171に記載の方法。
- 前記がんが、低いレベルの腫瘍抗原を発現する細胞を含む、請求項152乃至172のいずれか1項に記載の方法。
- 前記腫瘍抗原のレベルががん細胞当たり100,000未満の腫瘍抗原コピーである、請求項173に記載の方法。
- 前記腫瘍抗原のレベルが、がん細胞当たり90,000未満、75,000未満、50,000未満、または40,000未満の腫瘍抗原コピーである、請求項174に記載の方法。
- 前記対象の1つまたは複数のがん細胞の腫瘍抗原のレベルを検出することをさらに含む、請求項152乃至175のいずれか1項に記載の方法。
- 自己免疫疾患を有する対象を治療する方法であって、前記対象に請求項1乃至2、5乃至8、11乃至18、22乃至53、55乃至57、59乃至129、および139乃至141のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートを投与することを含む、方法。
- 前記自己免疫疾患が、全体的または部分的に自己反応性B細胞により媒介される、請求項177に記載の方法。
- 前記対象が、標的細胞を枯渇されており、赤芽球癆を有するまたはそのリスクがある、請求項177または178に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が、全身性ループスエリテマトーデス(SLE)、シェーグレン症候群、1型糖尿病、アジソン病、悪性貧血、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、関節リウマチ、重症筋無力症、原発性胆汁胆管炎、グッドパスチャー病、原発性膜性腎症、卵巣不全、および自己免疫性睾丸炎からなる群から選択される、請求項177乃至179のいずれか1項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗原結合性構築物が、NKp30機能をアゴナイズすることにより前記対象の免疫応答を増進する、請求項177乃至180のいずれか1項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗原結合性構築物が、B細胞のNK細胞媒介性溶解を増進する、請求項177乃至181のいずれか1項に記載の方法。
- 剤を前記対象に投与することをさらに含み、前記剤が、コルチコステロイド、DMARD、および抗サイトカイン療法からなる群から選択される、請求項177乃至182のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗サイトカイン療法が、抗TNFα抗体、TNFα受容体トラップ、抗IL17抗体、または抗IL23抗体である、請求項183に記載の方法。
- 前記多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、前記医薬組成物、または前記タンパク質コンジュゲートが、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口的、筋肉内、または頭蓋内に投与される、請求項177乃至184のいずれか1項に記載の方法。
- ナチュラルキラー(NK)細胞を活性化させまたはその活性化を持続化させる方法であって、前記NK細胞を有効量の請求項1乃至129および139乃至141のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートと接触させることを含む、方法。
- 前記接触させることがin vitroで行われる、請求項186に記載の方法。
- 前記接触させることがin vivoで行われる、請求項186に記載の方法。
- 対象においてナチュラルキラー(NK)細胞を活性化させまたはその活性化を持続化させる方法であって、前記NK細胞を有効量の請求項1乃至129および139乃至141のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートと接触させることを含み、前記NK細胞が対照NK細胞と比較して低減されたCD16の発現を有する、方法。
- 前記対象ががんを有する、請求項189に記載の方法。
- 前記がんが、前記構築物が特異的に結合する前記腫瘍抗原の一方または両方を発現する、請求項190に記載の方法。
- 前記接触させるNK細胞が腫瘍浸潤性NK細胞である、請求項189乃至191のいずれか1項に記載の方法。
- 前記NK細胞の前記活性化または持続的な活性化が腫瘍微環境中で起こる、請求項189乃至192のいずれか1項に記載の方法。
- 前記NK細胞のCD16発現が前記対照NK細胞のCD16発現の50%未満である、請求項189乃至193のいずれか1項に記載の方法。
- 前記NK細胞のCD16発現が、前記対照NK細胞のCD16発現の40%未満、30%未満、20%未満、10%未満、5%未満、または1%未満である、請求項194に記載の方法。
- 前記腫瘍微環境が浸潤性NK細胞の集団を含み、前記浸潤性NK細胞の少なくとも10%が対照NK細胞と比較して低減されたCD16の発現を有する、請求項193に記載の方法。
- 前記浸潤性NK細胞の少なくとも20%、少なくとも30%、または少なくとも40%が対照NK細胞と比較して低減されたCD16の発現を有する、請求項196に記載の方法。
- 前記NK細胞がCD16を発現しない、請求項189乃至197のいずれか1項に記載の方法。
- ナチュラルキラー(NK)細胞による標的細胞の殺傷を増進する方法であって、前記NK細胞の存在下で前記標的細胞を請求項1乃至129および139乃至141のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートと接触させることを含む、方法。
- 前記接触工程がin vivoで行われる、請求項199に記載の方法。
- 前記接触工程がin vitroで行われる、請求項199に記載の方法。
- 前記標的細胞ががん細胞である、請求項199乃至201のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的細胞がB細胞である、請求項199乃至201のいずれか1項に記載の方法。
- 対象においてNK細胞によるがん細胞の殺傷を増進する方法であって、前記対象に有効量の請求項1乃至129および139乃至141のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートを投与することを含み、前記がん細胞が、前記構築物または単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片が結合する腫瘍抗原を100,000未満のコピー数で発現する、方法。
- 前記がん細胞が、がん細胞当たり90,000未満の腫瘍抗原コピーのコピー数で前記腫瘍抗原を発現する、請求項204に記載の方法。
- 前記がん細胞が、がん細胞当たり75,000未満、50,000未満、または40,000未満の腫瘍抗原コピーのコピー数で前記腫瘍抗原を発現する、請求項205に記載の方法。
- 前記対象の1つまたは複数のがん細胞による前記腫瘍抗原の発現を検出することをさらに含む、請求項204乃至206のいずれか1項に記載の方法。
- 自己反応性B細胞性炎症状態を有する対象を治療する方法であって、前記対象に有効量の請求項1乃至2、5乃至8、11乃至18、22乃至53、55乃至57、59乃至129、および139乃至141のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートを投与することを含む、方法。
- 前記有効量の多重特異性抗原結合性構築物または医薬組成物が、IgG、IgM、またはIgAを発現する形質細胞の骨髄レベルを低減する、請求項208に記載の方法。
- 前記自己反応性B細胞性炎症状態が、自己反応性B細胞により媒介される自己免疫疾患である、請求項208または209に記載の方法。
- 前記自己反応性B細胞性炎症状態が、重症筋無力症、軽鎖アミロイドーシス、尋常性天疱瘡、および免疫性血小板減少症から選択される疾患である、請求項210に記載の方法。
- 自己反応性B細胞により媒介される前記自己免疫疾患が、全身性ループスエリテマトーデス(SLE)、シェーグレン症候群、1型糖尿病、アジソン病、悪性貧血、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、関節リウマチ、重症筋無力症、原発性胆汁胆管炎、グッドパスチャー病、原発性膜性腎症、卵巣不全、および自己免疫性睾丸炎からなる群から選択される、請求項210に記載の方法。
- 自己反応性B細胞により媒介される前記自己免疫疾患が重症筋無力症である、請求項210に記載の方法。
- 前記対象に抗炎症剤を投与することをさらに含む、請求項208乃至213のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗炎症剤が、コルチコステロイド、DMARDs、または抗サイトカイン剤からなる群から選択される、請求項214に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項142乃至185、189乃至198、および204乃至215のいずれか1項に記載の方法。
- 対象におけるがん細胞に対する免疫応答の増進において使用するための、請求項1乃至10、18乃至21、24乃至54、56乃至58、65乃至129、および139乃至141のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲート。
- 前記免疫応答がNK細胞媒介性免疫応答である、請求項217に記載の使用。
- 前記がん細胞が、血液がん細胞、リンパ腫細胞、骨髄腫細胞、白血病細胞、神経学的がん細胞、乳がん細胞、前立腺がん細胞、皮膚がん細胞、肺がん細胞、膀胱がん細胞、腎臓がん細胞、頭頸部がん細胞、胃腸がん細胞、結腸直腸がん細胞、肝臓がん細胞、膵臓がん細胞、泌尿生殖器がん細胞、骨がん細胞、および血管がん細胞である、請求項217または218に記載の使用。
- 前記がん細胞が前記第1の腫瘍抗原を発現する、請求項217乃至219のいずれか1項に記載の使用。
- 前記がん細胞が前記第1の腫瘍抗原および前記第2の腫瘍抗原を発現する、請求項217乃至220のいずれか1項に記載の使用。
- 対象におけるB細胞に対する免疫応答の増進において使用するための、請求項1乃至2、5乃至8、11乃至18、22乃至53、55乃至57、59乃至129、および139乃至141のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲート。
- 前記免疫応答がNK細胞媒介性免疫応答である、請求項222に記載の使用。
- 前記B細胞が自己反応性B細胞または形質細胞である、請求項222または223に記載の使用。
- 前記B細胞が前記第1のB細胞抗原を発現する、請求項222乃至224のいずれか1項に記載の使用。
- 前記B細胞が前記第1のB細胞抗原および前記第2のB細胞抗原を発現する、請求項222乃至225のいずれか1項に記載の使用。
- 対象におけるがんの治療において使用するための、請求項1乃至10、18乃至21、24乃至54、56乃至58、65乃至129、および139乃至141のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲート。
- それを必要とする対象におけるがんの治療もしくはその進行の遅延または腫瘍成長の低減もしくは阻害において使用するための、請求項1乃至10、18乃至21、24乃至54、56乃至58、65乃至129、および139乃至141のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲート。
- 前記がんが、血液がん、リンパ腫、骨髄腫、白血病、神経学的がん、乳がん、前立腺がん、皮膚がん、肺がん、膀胱がん、腎臓がん、頭頸部がん、胃腸がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、泌尿生殖器がん、骨がん、または血管がんである、請求項227または228に記載の使用。
- 前記がんが、前記第1の腫瘍抗原を発現するがん細胞を含む、請求項227乃至229のいずれか1項に記載の使用。
- 前記がんが、前記第1の腫瘍抗原および前記第2の腫瘍抗原を発現するがん細胞を含む、請求項227乃至230のいずれか1項に記載の方法。
- 前記多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、前記医薬組成物、または前記タンパク質コンジュゲートが、NKp30機能をアゴナイズすることにより前記対象の免疫応答を増進する、請求項227乃至231のいずれか1項に記載の使用。
- 前記多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、前記医薬組成物、または前記タンパク質コンジュゲートがナチュラルキラー(NK)細胞媒介性がん細胞溶解および/またはγδ T細胞機能を増進する、請求項227乃至232のいずれか1項に記載の使用。
- 前記多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、前記医薬組成物、または前記タンパク質コンジュゲートがγδ T細胞媒介性細胞傷害性またはサイトカイン産生を増進する、請求項233に記載の使用。
- 抗がん療法を前記対象に投与することをさらに含む、請求項227乃至234のいずれか1項に記載の使用。
- 前記抗がん療法が、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、細胞療法、サイトカイン療法、放射線療法、寒冷療法、または外科療法である、請求項235に記載の使用。
- 前記抗がん療法が、前記多重特異性抗原結合性構築物または単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片を用いる治療の前、同時、または後に投与される、請求項235または236に記載の使用。
- 前記抗がん療法が免疫療法であり、前記対象における前記がんが、前記多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、前記医薬組成物、または前記タンパク質コンジュゲートを用いる治療の非存在下で前記免疫療法に対して難治性である、請求項235乃至237のいずれか1項に記載の使用。
- 前記多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、前記医薬組成物、または前記タンパク質コンジュゲートが、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口的、筋肉内、または頭蓋内に投与される、請求項227乃至238のいずれか1項に記載の使用。
- 前記がんがCD16欠損性腫瘍微環境を含み、または、前記がん細胞がCD16欠損性腫瘍微環境中に存在する、請求項227乃至239のいずれか1項に記載の使用。
- 前記対象の前記がんにおけるCD16の発現レベルを検出することをさらに含む、請求項227乃至240のいずれか1項に記載の使用。
- 前記CD16を検出することがCD16aまたはCD16bのレベルを検出することを含む、請求項241に記載の使用。
- 前記CD16欠損性微環境が、前記対象に対する造血幹細胞移植と関連付けられる、請求項240乃至242のいずれか1項に記載の使用。
- 前記CD16欠損性微環境が浸潤性NK細胞の集団を含み、前記浸潤性NK細胞が対照NK細胞と比較して50%未満のCD16の発現を有する、請求項240乃至243のいずれか1項に記載の使用。
- 前記浸潤性NK細胞が、対照NK細胞と比較して30%未満、20%未満、または10%未満のCD16の発現を有する、請求項244に記載の使用。
- 前記CD16欠損性微環境が浸潤性NK細胞の集団を含み、前記浸潤性NK細胞の少なくとも10%が対照NK細胞と比較して低減されたCD16の発現を有する、請求項240乃至244のいずれか1項に記載の使用。
- 前記浸潤性NK細胞の少なくとも20%、少なくとも30%、または少なくとも40%が対照NK細胞と比較して低減されたCD16の発現を有する、請求項246に記載の使用。
- 前記がんが、低いレベルの腫瘍抗原を発現する細胞を含む、請求項227乃至247のいずれか1項に記載の使用。
- 前記腫瘍抗原のレベルががん細胞当たり100,000未満の腫瘍抗原コピーである、請求項248に記載の使用。
- 前記腫瘍抗原のレベルが、がん細胞当たり90,000未満、75,000未満、50,000未満、または40,000未満の腫瘍抗原コピーである、請求項249に記載の使用。
- 前記対象の1つまたは複数のがん細胞の腫瘍抗原のレベルを検出することをさらに含む、請求項227乃至250のいずれか1項に記載の使用。
- 自己免疫疾患を有する対象の治療において使用するための、請求項1乃至2、5乃至8、11乃至18、22乃至53、55乃至57、59乃至129、および139乃至141のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲート。
- 前記自己免疫疾患が、全体的または部分的に自己反応性B細胞により媒介される、請求項252に記載の使用。
- 前記対象が、標的細胞を枯渇されており、赤芽球癆を有するまたはそのリスクがある、請求項252または253に記載の使用。
- 前記自己免疫疾患が、全身性ループスエリテマトーデス(SLE)、シェーグレン症候群、1型糖尿病、アジソン病、悪性貧血、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、関節リウマチ、重症筋無力症、原発性胆汁胆管炎、グッドパスチャー病、原発性膜性腎症、卵巣不全、および自己免疫性睾丸炎からなる群から選択される、請求項252乃至254のいずれか1項に記載の使用。
- 前記多重特異性抗原結合性構築物が、NKp30機能をアゴナイズすることにより前記対象の免疫応答を増進する、請求項252乃至255のいずれか1項に記載の使用。
- 前記多重特異性抗原結合性構築物が、B細胞のNK細胞媒介性溶解を増進する、請求項252乃至256のいずれか1項に記載の方法。
- 剤を前記対象に投与することをさらに含み、前記剤が、コルチコステロイド、DMARD、および抗サイトカイン療法からなる群から選択される、請求項252乃至257のいずれか1項に記載の使用。
- 前記抗サイトカイン療法が、抗TNFα抗体、TNFα受容体トラップ、抗IL17抗体、または抗IL23抗体である、請求項258に記載の使用。
- 前記多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、前記医薬組成物、または前記タンパク質コンジュゲートが、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口的、筋肉内、または頭蓋内に投与される、請求項252乃至259のいずれか1項に記載の使用。
- 対象におけるナチュラルキラー(NK)細胞の活性化またはその活性化の持続化において使用するための、請求項1乃至129および139乃至141のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートであって、前記NK細胞が対照NK細胞と比較して低減されたCD16の発現を有する、多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲート。
- 前記対象ががんを有する、請求項261に記載の使用。
- 前記がんが、前記構築物が特異的に結合する前記腫瘍抗原の一方または両方を発現する、請求項262に記載の使用。
- 前記接触させるNK細胞が腫瘍浸潤性NK細胞である、請求項261乃至263のいずれか1項に記載の使用。
- 前記NK細胞の前記活性化または持続的な活性化が腫瘍微環境中で起こる、請求項261乃至264のいずれか1項に記載の使用。
- 前記NK細胞のCD16発現が前記対照NK細胞のCD16発現の50%未満である、請求項261乃至265のいずれか1項に記載の使用。
- 前記NK細胞のCD16発現が、前記対照NK細胞のCD16発現の40%未満、30%未満、20%未満、10%未満、5%未満、または1%未満である、請求項266に記載の使用。
- 前記腫瘍微環境が浸潤性NK細胞の集団を含み、前記浸潤性NK細胞の少なくとも10%が対照NK細胞と比較して低減されたCD16の発現を有する、請求項265に記載の使用。
- 前記浸潤性NK細胞の少なくとも20%、少なくとも30%、または少なくとも40%が対照NK細胞と比較して低減されたCD16の発現を有する、請求項268に記載の使用。
- 前記NK細胞がCD16を発現しない、請求項261乃至269のいずれか1項に記載の使用。
- 対象におけるNK細胞によるがん細胞の殺傷の増進において使用するための、請求項1乃至129および139乃至141のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲートであって、前記がん細胞が、前記構築物または単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片が結合する腫瘍抗原を100,000未満のコピー数で発現する、多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲート。
- 前記がん細胞が、がん細胞当たり90,000未満の腫瘍抗原コピーのコピー数で前記腫瘍抗原を発現する、請求項271に記載の使用。
- 前記がん細胞が、がん細胞当たり75,000未満、50,000未満、または40,000未満の腫瘍抗原コピーのコピー数で前記腫瘍抗原を発現する、請求項272に記載の使用。
- 前記対象の1つまたは複数のがん細胞による前記腫瘍抗原の発現を検出することをさらに含む、請求項271乃至273のいずれか1項に記載の使用。
- 対象における自己反応性B細胞性炎症状態の治療において使用するための、請求項1乃至2、5乃至8、11乃至18、22乃至53、55乃至57、59乃至129、および139乃至141のいずれか1項に記載の多重特異性抗原結合性構築物、単離されたモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、医薬組成物、またはタンパク質コンジュゲート。
- 前記有効量の多重特異性抗原結合性構築物または医薬組成物が、IgG、IgM、またはIgAを発現する形質細胞の骨髄レベルを低減する、請求項275に記載の使用。
- 前記自己反応性B細胞性炎症状態が、自己反応性B細胞により媒介される自己免疫疾患である、請求項275または276に記載の使用。
- 前記自己反応性B細胞性炎症状態が、重症筋無力症、軽鎖アミロイドーシス、尋常性天疱瘡、および免疫性血小板減少症から選択される疾患である、請求項277に記載の使用。
- 自己反応性B細胞により媒介される前記自己免疫疾患が、全身性ループスエリテマトーデス(SLE)、シェーグレン症候群、1型糖尿病、アジソン病、悪性貧血、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、関節リウマチ、重症筋無力症、原発性胆汁胆管炎、グッドパスチャー病、原発性膜性腎症、卵巣不全、および自己免疫性睾丸炎からなる群から選択される、請求項277に記載の使用。
- 自己反応性B細胞により媒介される前記自己免疫疾患が重症筋無力症である、請求項277に記載の使用。
- 前記対象に抗炎症剤を投与することをさらに含む、請求項275乃至280のいずれか1項に記載の使用。
- 前記抗炎症剤が、コルチコステロイド、DMARDs、または抗サイトカイン剤からなる群から選択される、請求項281に記載の使用。
- 前記対象がヒトである、請求項217乃至282のいずれか1項に記載の使用。
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