JP2002538759A - 組換え転写因子に対する結合部位を有するキメラプロモーターからなる発現系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、次の構成成分：構成成分ａ）：少なくとも１つのプロモーター、ｂ）：少なくとも１つの組換えトランス活性化因子をコードするＤＮＡ、これによりその転写がａ）活性化される、構成成分ｂ１）：ＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ、構成成分ｂ２）：グルタミン、セリンおよびトレオニンに富むトランス作用ドメインをコードするＤＮＡ、構成成分ｃ）：構成成分ｂ）の発現産物が結合するための少なくとも１つのＤＮＡ配列、構成成分ｄ）：ＣＤＥ−ＣＨＲエレメントまたは Ｅ２Ｆ−ＢＳ−ＣＨＲエレメントを含有し、その５′−末端をもって構成成分ｃ）の３′−末端に結合する少なくとも１つの最小プロモーター、構成成分ｅ）：少なくとも１つのエフェクター遺伝子、これによりその転写が構成成分ｂ）の発現産物の構成成分ｃ）への結合により活性化される、を含有する核酸構築物に関する。本発明また、前記核酸構築物、核酸構築物を含むベクター、前記ベクターを含む細胞の産生および使用、並びに医薬の製造における核酸構築物の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 Ａ）序論 遺伝子の転写は、活性化配列（プロモーターおよびエンハンサー）により制御
されている。そのような活性化配列は、転写因子が結合し、その結果対応する遺
伝子の転写が取り決められるヌクレオチド配列を意味する。 プロモーターまたはエンハンサー配列として多数の活性化配列が知られている
。 その機能または起源に依存して、これらを一般的活性化配列、即ち全ての細胞
において効果的である活性化配列、ウィルス起源の活性化配列、および限定され
た作用を有する活性化配列に分類される。 限定は、例えば細胞特異的、代謝系（例えば低酸素状態）または細胞周期特異
的なものであり得る。 活性化配列の機能に関してこれらの限定は、構造遺伝子の発現の目的、例えば
遺伝子治療の目的のために利用される。故に、現在の技術は、細胞特異的プロモ
ーターの制御下における構造遺伝子の発現を与える（Sikora, Trends Biotech.
11, 197 (1993)）。

【０００２】 しかし、多くの場合において、一つには細胞特異的プロモーターの活性化が十
分に細胞特異的ではないという理由で、一つにはエフェクター遺伝子の発現が特
定の機能状態にある選択された細胞の型のその細胞においてのみ所望されるとい
う理由で、細胞特異的プロモーターによってエフェクター遺伝子の転写を制限す
るには十分ではない。そのような機能状態は、例えば細胞の細胞周期であり得る
。 故に、エフェクター遺伝子の発現をより広範囲に制御するため、構造遺伝子の
発現を制御するために異なる特異性を有する複数のプロモータを用いることが所
望される。

【０００３】 キメラプロモーター技術（特許出願、例えばPCT/GB95/02000, EP-A-0790313）
は、細胞周期特異的プロモーターとある特異性のプロモーターを組合わせるため
に開発された。この技術は、ある特異性の上流のプロモーターに下流にあるＣＤ
Ｅ−ＣＨＲエレメントまたはＥ２ＦＢＳ−ＣＨＲエレメントを連結することから
なる。 細胞分裂は、連続的なＧ０期、またはＧ１期、Ｓ期、Ｇ２期およびＭ期に分類
される。Ｓ期はＤＮＡ合成期であり、続いて移行期Ｇ２（Ｇ２期）、次に分裂期
（Ｍ期）が続き、母細胞が２つの嬢細胞に分裂する。Ｍ期とＳ期の間は、休止期
Ｇ０（Ｇ０期）または移行期Ｇ１（Ｇ１期）である。 細胞分裂は、一群のタンパク質キナーゼ、サイクリン／ｃｄｋ複合体によって
作動する。これらは、触媒サブユニット［サイクリン依存性キナーゼ（ｃｄｋ，
例えばｃｄｋ−１，−２，−３，−４，−５，−６，−７または−８）］および
制御サブユニット、サイクリン（例えばサイクリンＡ，−Ｂ１〜Ｂ３，−Ｄ１〜
Ｄ３，−Ｅ，−Ｈまたは−Ｃ）］から構成される。

【０００４】 個々のｃｄｋ複合体は、各細胞周期において特別に活性化される、従って、 Ｇ１中期では、 ｃｄｋ４／サイクリンＤ１〜３および ｃｄｋ６／サイクリンＤ１〜３ Ｇ１後期では、 ｃｄｋ２／サイクリンＥ Ｓ期では、 ｃｄｋ２／サイクリンＡ Ｇ２／Ｍ移行期では、 ｃｄｋ１／サイクリンＢ１〜３および ｃｄｋ１／サイクリンＡ サイクリン／ｃｄｋ複合体の活性はリン酸化であり、故にＤＮＡ合成および有
糸分裂の制御において直接的または間接的役割を果たすタンパク質の活性化また
は不活化である。

【０００５】 細胞周期におけるその機能に対応して、幾つかのサイクリンおよびｃｄｋの遺
伝子は、周期的に転写されるおよび／または、例えばサイクリンの制御された分
解により、阻害剤（例えばｐ１６ＩＮＫ４Ａ、ｐ１５ＩＮＫ４Ｂ、ｐ２１Ｃｉｐ
１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ｐ１８ＩＮＫ４Ｃ、ｐ１９ＩＮＫ４Ｄ、ｐ５７）の細胞周
期特異的結合により、または活性化酵素（例えばｃｄｃ２５Ａ、ｃｄｃ２５Ｂお
よびｃｄｃ２５Ｃまたはｃｄｋ７／サイクリンＨなどのｃｄｃ２５ホスファター
ゼ）もしくは阻害酵素（例えばＷｅｅｌキナーゼ）による修飾により、周期的に
活性化または阻害される（ZwickerとMueller, Progr. Cell Cycle Res. 91 (199
5); La Thangue, Curr Opin. Cell Biol. 443 (1994); MacLachlan等, Crit. Re
v. Eukaryotic Gene Expr. 127 (1995)の検討を参照）。

【０００６】 細胞周期のＧ２期におけるｃｄｃ２５Ｃの周期的発現は、ｃｄｃ２５Ｃの遺伝
子のプロモーター領域におけるエレメント（ＣＤＥ−ＣＨＲ）により本質的に支
配されている。このＣＤＥ−ＣＨＲエレメントは、Ｇ０／Ｇ１期では抑制タンパ
ク質により塞がれ、そしてＧ２期では遊離する。このプロモーターエレメントの
ヌクレオチド配列は特定され、サイクリンＡおよびｃｄｋ−１の遺伝子のプロモ
ーターにおいても同様に見出されたが、Ｂ−ｍｙｂのプロモーターにおいて見出
されたヌクレオチド配列は所々で異なっていた（Ｅ２ＦＢＳ−ＣＨＲ）。これら
のプロモーターエレメントの細胞周期依存性の機能の研究は、Ｇ０／Ｇ１期にお
けるその遮断には、問題の遺伝子の転写の上流調節が続くが、Ｂ−ｍｙｂ遺伝子
の場合にはごく初期（Ｇ１中期）にて、サイクリンＡの場合にはＧ１／Ｓ移行期
にて、ｃｄｋ−１遺伝子の場合にはＳ期にて、そしてｃｄｃ２５Ｃ遺伝子の場合
にはＳ期後期においてのみ開始されることを説明した。（ZwickerとMueller, Pr
ogr. Cell Cycle Res. 91 (1995); Lucibello等, EMBO J. 132 (1995); Liu等,
Nucl. Acids Res. 2905 (1995); Zwicker等, Nucl. Acids Res. 3822 (1995); E
MBO J. 4514 (1995)）。

【０００７】 驚くべきことに、ＣＤＥ−ＣＨＲエレメント（サイクリン２５Ｃ，サイクリン
Ａおよびｃｄｋ−１遺伝子のプロモーターのもの）およびＥ２ＦＢＳ−ＣＨＲエ
レメント（Ｂ−ｍｙｂ遺伝子のプロモーターのもの）が、Ｇ０／Ｇ１期における
相同性のある遺伝子の活性化および転写ばかりでなく、他の遺伝子の活性化およ
び転写もまた阻害しうることが見出された。本発明は、特許出願PCT/GB95/02000
，EP-A 0 777 739，EP-A 0 777 740，EP-A 0 804 601，EP-A 0 807 183，EP-A 0
790 313およびEP-A 0 860 445につながる。

【０００８】 これらの特許出願は、疾患の予防および／または治療のためのタンパク質をコ
ードするエフェクター遺伝子の転写活性化を制御するための細胞周期依存性プロ
モーターと、非特異的、細胞特異的、ウィルス特異的または代謝的に活性化しう
るプロモーターとの組合せを開示している。そのような疾患の例は、腫瘍疾患、
白血病、自己免疫疾患、種々の型の関節炎、アレルギー、炎症、移植器官の拒絶
、血液循環系の疾患、血液凝固系の疾患、感染または中枢神経系の損傷である。

【０００９】 いわゆるキメラプロモーターは、種々のプロモーターと細胞周期特異的エレメ
ントを組み合わせるための開発された。このキメラプロモーターにおいて、直ぐ
下流に位置するＣＤＥ−ＣＨＲまたはＥ２ＦＢＳ−ＣＨＲプロモーターエレメン
トによる非特異的、細胞特異的、ウィルス特異的または代謝的に活性化可能な活
性化配列（またはプロモーター配列）の活性は、細胞周期のＳ期およびＧ２期に
ついて大きく制限される。 特にＣＤＥ−ＣＨＲプロモーターエレメントの機能についてのより広範囲な研
究は、ＣＤＥ−ＣＨＲエレメントが細胞周期依存性にしている上流の活性化因子
配列の制御は、高グルタミン活性化ドメインを有する転写因子の活性化配列の活
性化に大きく依存していることを解明した（Zwicker等, Nucl. Acids. Res. 382
2 (1995)）。

【００１０】 そのような転写因子には、例えばＯｃｔ-２、Ｓｐ１およびＮＦ-Ｙが包含され
る。 結論として、これはキメラプロモーターへのＣＤＥ−ＣＨＲプロモーターエレ
メントの使用を制限するものである。Ｂ−ｍｙｂ遺伝子のＥ２Ｆ−ＢＳ−ＣＨＢ
プロモーターエレメントについても同様であると見なされうる（Zwicker等, Nuc
l. Acids Res. 23,3822(1995)）。 従って、任意のプロモーターを細胞周期特異的プロモーターと組み合わせるこ
とができる発現系が緊急に要求されている。

【００１１】 Ｂ）本発明の概要 本発明は、任意のプロモーターをＣＤＥ−ＣＨＲエレメントまたはＥ２ＦＢＳ
−ＣＨＲエレメントに連結して、機能的キメラプロモーターを与えることができ
、そして次の構成部分： −構成部分ａ） 少なくとも１つのプロモーター −構成部分ｂ） 少なくとも１つの組換えトランス作用因子をコードするＤＮＡであって、その
発現が構成部分ａ）により活性化され、そして次のもの： ｂ１）：ＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ ｂ２）：グルタミン、セリンおよびトレオニンに富むトランス作用因子ドメイ
ンをコードするＤＮＡ からなるもの −構成部分ｃ） 構成部分ｂ）の発現産物に結合する少なくとも１つのＤＮＡ配列 −構成部分ｄ） ＣＤＥ−ＣＨＲエレメントまたはＥ２ＦＢＳ−ＣＨＲエレメントを含み、その
５′−末端が構成部分ｃ）の３′−末端に結合される、少なくとも１つの最小プ
ロモーター −構成部分ｅ） その転写が構成部分ｃ）に結合する構成部分ｂ）の発現産物により活性化され
る、少なくとも１つのエフェクター遺伝子 からなる核酸構築物に関する。

【００１２】 それぞれの構成部分の配置は、一例として図１に示している。 構成部分ｄ）の最小プロモーターは少なくとも１つの転写活性化エレメントを
含む。 本発明による核酸構築物の機能は、細胞特異的、代謝的に活性化可能、ウィル
ス特異的、細胞周期特異的または普遍的に活性化可能なプロモーター［構成部分
ａ）］を組換え転写活性化因子のための遺伝子［構成部分ｂ）］の転写につなげ
、次にＤＮＡ結合配列［構成部分ｃ）］結合し、これにより最小ＣＤＥ−ＣＨＲ
含有プロモーター［構成部分ｄ）］を活性化して、その結果エフェクター遺伝子
［構成部分ｅ）］を転写させるというものである。

【００１３】 細胞周期のＧ０／Ｇ１期において、構成部分ｄ）のＣＤＥ−ＣＨＲエレメント
はいわゆるＣＤＦタンパク質の結合により妨害され、これにより構成部分ｅ）の
転写の活性化が阻害される。 本発明の核酸構築物は、種々の様式にて拡張することができる： −幾つかの同一または異なるエフェクター遺伝子［構成部分ｅ），ｅ′），ｅ″
）］を核酸構築物に導入して、これらのエフェクター遺伝子にＩＲＥＳ配列を介
して互いに連結させるか、または各エフェクター遺伝子の上流に加入した構成部
分ｃ）およびｄ）と連結させる。 −構成部分ｂ）により発現される組換えトランス作用因子が自己促進プロモータ
ーの意味で構成部分ａ）の活性化をも促進させるような方法で、構成部分ｃ）を
構成部分ａ）の上流に加入する。 そのようは発現系は例えば図２−Ｉに示されている。

【００１４】 そのような自己促進プロモーターは特許出願EP-A 0 848 061に既に詳細に記載
されている。 本発明の特別な態様において、自己促進プロモーター系は、例えば図２−IIに
示されるような本発明の発現系に加入してもよい。 −構成部分ｂ）は、カップリング物質［構成部分ｆ）］に結合するタンパク質Ａ
を発現する構成部分ｂ４）を導入し、そしてカップリング物質ｆ）に結合するタ
ンパク質Ｂを発現する構成部分ｂ４）を導入し、カップリング物質ｆ）により、
即ち薬理学的に制御することができる組換えトランス作用因子［構成部分ｂ′）
］を与えることにより拡張されうる。 そのような拡張は、例えば図３に示されている。

【００１５】 そのようなトランス作用因子の導入は、本発明の発現系を薬理学的に制御可能
にする。そのような発現系は、特許出願EP-A 0 848 061において既に詳細に記載
されている。 −さらに、プロゲステロン誘発性発現系は、構成部分ｂ）および／または構成部
分ｆ）とプロゲステロン受容体リガンド結合ドメインとの組合せに由来する。（
Wang等, Gene Therapy 4, 432 (1997)）。 −また、発現系は、構成部分ｂ１）およびｂ２）［構成部分ｂ１）、ｂ２）およ
びｂ５）から構成される構成部分ｂ″）］の間またはこれに対して、細胞性制御
タンパク質に対する結合タンパク質［構成部分ｂ５）］のための核酸配列を導入
することにより管理することができる。この補助的管理は、正常の細胞において
結合タンパク質と会合する調節タンパク質により引き起こされ、故に構成部分ｂ
″）により発現させられる組換えトランス作用因子の機能、つまりこのトランス
作用因子の構成部分ｃ）への結合が阻止される。細胞性制御タンパク質が突然変
異し、故に結合タンパク質と会合しない、あるいは制御タンパク質が減少、欠損
または構成部分ｂ５）と競合するような細胞性、ウィルス性、細菌性もしくは寄
生性の結合タンパク質と結合しているような細胞において、組換えトランス作用
因子［構成部分ｂ″）］は機能的であり、構成部分ｃ）と結合することが可能で
ある。

【００１６】 構成部分ｂ″）を一例として図４に示す。 核局在化シグナルを構成部分ｂ）、ｂ）′またはｂ″）に導入して、本発明の
発現系の作動性を増加させることが可能である。 −上述の拡張の２つ以上を組合わせる。 エフェクター遺伝子［構成部分ｄ）］は、サイトカイン、増殖因子、抗体もし
くは抗体断片、サイトカインもしくは増殖因子の受容体、抗増殖、アポト−シス
または細胞分裂抑制作用を有するタンパク質、血管形成阻害剤、血液凝固阻害剤
、血栓症誘発物質および凝固阻害剤、繊溶性活性物質、血漿タンパク質、補体活
性化タンパク質、ペプチドホルモン、ウィルス外殻タンパク質、細菌性抗原およ
び寄生性抗原、並びに血液循環に影響するタンパク質およびリボザイムからなる
群から選択される薬理学的活性成分をコードする。

【００１７】 エフェクター遺伝子が、細胞周期制御タンパク質、特にサイクリンＡ、サイク
リンＢ、サイクリンＤ１、サイクリンＥ、Ｅ２Ｆ１−５、ｃｄｃ２、ｃｄｃ２５
ＣもしくはＤＰ１、またはウィルス性タンパク質またはサイトカインもしくは増
殖因子またはその受容体からなる群から選択されるタンパク質をコードするｍＲ
ＮＡを不活化するリボザイムをコードするのが好ましい。 他の態様において、エフェクター遺伝子はプロドラグを医薬に開裂させる酵素
をコードするものである。

【００１８】 別の態様において、エフェクター遺伝子は、リガンド−エフェクター融合タン
パク質をコードしてもよく、リガンドとしては抗体、抗体断片、サイトカイン、
増殖因子、接着分子またはペプチドホルモンであり、エフェクターとしては上述
の薬理学的活性成分または酵素とすることができる。例えば、構造遺伝子は、酵
素がプロドラグを薬剤に開裂させ、リガンドが細胞表面、好ましくは内皮細胞ま
たは腫瘍細胞に結合する、リガンド−酵素融合タンパク質をコードしてもよい。

【００１９】 核酸構築物は、ＤＮＡで構成されるのが好ましい。用語「核酸構築物」は、標
的細胞において転写されうる人工の核酸構造物を意味すると理解されるべきであ
る。これらは、好ましくはベクター、特に好ましくはプラスミドベクターまたは
ウィルスベクター中に挿入される。好適な態様において、これらのベクターは、
患者に外部的または内部的、局所的に、体腔中に、器官中に、血液循環系に、呼
吸器系に、消化器系に、泌尿生殖器系にまたは筋肉内もしくは皮下に投与される
。

【００２０】 本発明の核酸構築物は、エフェクター遺伝子［構成部分ｅ）］を細胞特異的、
ウィルス特異的に、特定の代謝状態下においておよび／または細胞周期特異的に
発現させることが可能であり、エフェクター遺伝子が、薬理学的活性成分、ある
いはプロドラグを活性薬剤に開裂させる酵素をコードする遺伝子であるのが好ま
しい。薬理学的活性成分または酵素がリガンドとの融合タンパク質として発現し
、このリガンドが細胞の表面、例えば増殖する内皮または腫瘍細胞に結合すると
いう様式で、エフェクター遺伝子を選択することができる。

【００２１】 本発明の別の対象物は、本発明の核酸構築物を含む酵母または哺乳類の細胞で
ある。特に好ましい態様において、核酸構築物は、トランスフェクション後に、
トランス遺伝子を発現させるための使用することができる細胞系に導入される。
故に、これらの細胞は患者に対する医薬を供給するために使用することができる
。本発明の核酸構築物の好ましい使用は疾患の治療、核酸構築物を標的細胞に導
入すること、並びにそのウィルスまたは標的細胞特異的または代謝特異的または
非特異的および細胞周期特異的な発現を包含する医薬を提供する。

【００２２】 さらに本発明は、疾病を治療する医薬の製造のための本発明の核酸構築物を含
む哺乳類細胞の投与に関する。例えば、血液から得られる内皮細胞をインビトロ
にて本発明の核酸構築物でトランスフェクションして、例えば患者に静脈注射す
ることができる。 そのようなインビトロ−トランスフェクションした細胞もまた、本発明のベク
ターと組合わせて患者に投与することができる。この組合せは、細胞とベクター
をその都度、同時にまたは別の時点で、同じかまたは別の部位に投与または注射
することからなる。

【００２３】 本発明の核酸構築物は、この形態においては天然には生じない、即ち活性成分
、酵素またはリガンド−エフェクター融合タンパク質のエフェクター遺伝子は、
自然にはＣＤＥ−ＣＨＲエレメントまたはＥ２ＦＢＳ−ＣＨＲエレメントを組換
えトランス作用因子に対するＤＮＡ結合配列とともに含む本発明の最小プロモー
ターと組合わされることはない。 本発明の核酸構築物のプロモーターおよび活性成分（または酵素）のエフェク
ター遺伝子は、所望される目的に適合するように選択されたものである。

【００２４】 Ｃ）本発明の核酸構築物の構成部分の詳細な説明 Ｉ）プロモーター［構成部分ａ）］ 本発明の目的において使用されるべきプロモーター配列は、転写因子の結合後
にその３′−末端に隣接する構造遺伝子の転写を活性化するヌクレオチド配列で
ある。プロモーター配列［構成部分ｄ）］を包含するCDE-CHRまたはE2FBS-CHRと
組み合わされるべきプロモーター配列の選択は、治療すべき疾患および形質導入
すべき標的細胞次第である。故に、追加のプロモーター配列は、普遍的に、標的
細胞特異的に、特定の代謝条件下にて、細胞周期特異的にまたはウィルス特異的
に活性化することができる。選択すべきプロモーター配列には、例えば次のもの
が包含される： ａ）普遍的活性化プロモーターおよび活性化因子配列、例えば − ＲＮＡポリメラーゼIIIプロモーター − ＲＮＡポリメラーゼIIプロモーター − ＣＭＶプロモーターおよびエンハンサー − ＳＶ４０プロモーターおよびエンハンサー ｂ）ウィルス性プロモーターおよび活性化因子配列、例えば − ＨＢＶ − ＨＣＶ − ＨＳＶ − ＨＰＶ − ＥＢＶ − ＨＴＬＶ − ＨＩＶ ＨＩＶプロモーターを使用する場合、ＴＡＲ配列［＜−４５３位〜＞−８０位
，Rosen等, Cell 41, 813 (1985)］を包含するＬＴＲ配列の全ては、ウィルス特
異的プロモーターとして使用するべきである。

【００２５】 ｃ）代謝性活性化プロモーターおよびエンハンサー配列、例えば低酸素症誘発性
エンハンサー（Semenza等, PNAS 88, 5680 (1991); McBurney等, Nucl. Acids R
es. 19, 5755 (1991)）、または放射線誘発性プロモーター、例えばｅｇｒ−１
プロモーターの電離放射線誘発性エレメント（Hallahan等, Nature Med. 1, 786
, 1995））。 ｄ）細胞周期特異的活性化プロモーター。これらは例えばｃｄｃ２５Ｃ遺伝子、
サイクリンＡ遺伝子、ｃｄｃ２（ｃｄｋ−１）遺伝子、Ｂｍｙｂ遺伝子、ＤＨＦ
Ｒ遺伝子またはＥ２Ｆ-１遺伝子のプロモーター、あるいは細胞増殖中に起こる
かまたは活性化される転写因子の結合配列である。これらの結合配列には、Ｍｙ
ｃ Ｅボックスと称される、ヌクレオチド配列： ［5′-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3′; SEQ. ID NO: 1］のモノマーまたは多
重結合体（Blackwood und Eisenmann, Science 251, 1211 (1991)）が包含され
る。

【００２６】 ｅ）テトラサイクリン活性化プロモーター、例えば適当なリプレッサーと組合わ
されたテトラサイクリンオペレーターなど。 ｆ）細胞特異的活性化プロモーター これらには、選択された細胞にて優先的に生成されるタンパク質をコードする
遺伝子由来のプロモーターまたはエンハンサーのプロモーターまたは活性化因子
配列が包含されるのが好ましい。

【００２７】 例えば、本発明の目的において、次の細胞における下記のタンパク質に対する
プロモーターを使用することが好ましい： ｆ１）内皮細胞において活性化されるプロモーターおよび活性化因子配列 − 脳特異的，内皮性のグルコース−１−トランスポーター − エンドグリン − ＶＥＧＦ−受容体−１（ｆｌｔ−１） − ＶＥＧＦ−受容体−２（ｆｌｋ−１，ＫＤＲ） − ＶＥＧＦ−受容体−３（ｆｌｔ−４） − ｔｉｅ−１またはｔｉｅ−２ − Ｂ６１−受容体（Ｅｃｋ受容体） − Ｂ６１ − エンドセリン，特にエンドセリンＢまたはエンドセリン−１ − エンドセリン受容体，特にエンドセリンＢ受容体 − マンノース−６−ホスフェート受容体 − フォンビルブラント因子 − ＰＥＣＡＭ−１ − ＩＣＡＭ−３ − ＩＬ−１α，ＩＬ−１β − ＩＬ−１受容体 − 血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ−１） − 合成活性化因子配列 内皮細胞において優先的または選択的に活性化される転写因子に対するオリゴ
マー化した結合部位で構成される合成活性化因子配列もまた、天然の内皮細胞特
異的プロモーターの代わりに使用することができる。例は、その結合部位がエン
ドセリン−１遺伝子内の5′-TTATCT-3′である、転写因子GATA-2である［Lee等,
Biol. Chem. 266, 16188 (1991), Dormann等, J. Biol. Chem. 267, 1279 (199
2)および Wilson等, Mol. Cell Biol. 10,4854(1990)］。

【００２８】 ｆ２）活性化した内皮細胞の近傍の細胞にて活性化されるプロモーターまたは
活性化因子配列 −ＶＥＧＦ VEGF遺伝子の遺伝子制御配列は、５′−フランキング領域、３′−フランキン
グ領域、ｃ−Ｓｒｃ遺伝子またはｖ−Ｓｒｃ遺伝子である。 −ステロイドホルモン受容体およびそのプロモーターエレメント（TrussとBea
to, Endocr. Rev. 14, 459 (1993)）、特にマウス乳腺癌ウイルスのプロモータ
ー。

【００２９】 ｆ３）筋肉細胞、特に平滑筋細胞にて活性化されるプロモーターまたは活性化
因子配列 − トロポミオシン − α−アクチン − α−ミオシン − ＰＤＧＦ受容体 − ＦＧＦ受容体 − ＭＲＦ-４ − ホスホフルクトキナーゼＡ − ホスホグリセリン酸ムターゼ − トロポニンＣ − ミオゲニン − エンドセリンＡ受容体 − デスミン − ＶＥＧＦ ＶＥＧＦ遺伝子の遺伝子制御配列は、既にセクション「内皮細胞の近傍の細胞
にて活性化されるプロモーター」において示している（上記を参照）。

【００３０】 −人為的プロモーター ヘリックス−ループ−ヘリックス（ＨＬＨ）ファミリーの転写因子（ＭｙｏＤ
，Ｍｙｆ−５，マイオゲニン，ＭＲＦ４）は、筋肉特異的な転写因子として記載
されている。さらに筋肉特異的な転写因子には、ジンクフィンガータンパク質Ｇ
ＡＴＡ−４が包含される。 ＨＬＨタンパク質およびＧＡＴＡ−４は、筋肉特異的遺伝子のプロモーターば
かりでなく、異質な関係にある、つまり人為的プロモーターを用いても筋肉特異
的な転写を示す。そのような人工プロモーターは、例えば筋肉特異的ＨＬＨタン
パク質、例えばＥボックス（ＭｙｏＤ）に対する（ＤＮＡ）結合部位の多重コピ
ー（例えば４×AGCAGGTGTTGGGAGGC, SEQ ID NO:2）；またはα−ミオシン重鎖遺
伝子のＧＡＴＡ−４に対するＤＮＡ結合部位の多重コピー（例えば、5′-GGCCGA
TGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG3′, SEQ ID NO: 3）。

【００３１】 ｆ４）グリア細胞にて活性化されるプロモーターおよび活性化因子配列 特にこれらには、例えば次のタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子制御配列
またはエレメントが包含される： − シュワン細胞特異的タンパク質ペリアキシン − グルタミンシンセターゼ − グリア細胞特異的タンパク質(グリア繊維性酸性タンパク質＝ＧＦＡＰ) − グリア細胞タンパク質Ｓ１００ｂ − ＩＬ−６（ＣＮＴＦ） − ５−ＨＴ受容体 − ＴＮＦα − ＩＬ−１０ − インシュリン様増殖因子受容体ＩおよびII − ＶＥＧＦ ＶＥＧＦ遺伝子に対する遺伝子制御配列は既に上述している。

【００３２】 ｆ５）造血細胞にて活性化されるプロモーターおよび活性化因子配列 そのような遺伝子制御配列には、造血細胞またはその近傍の細胞、例えば間質
において発現されるサイトカインまたはその受容体の遺伝子に対するプロモータ
ー配列が包含される。 これらには、例えば次のサイトカインまたはその受容体に対するプロモーター
配列が包含される： − 幹細胞因子受容体 − 幹細胞因子 − ＩＬ−１α − ＩＬ−１受容体 − ＩＬ−３ − ＩＬ−３受容体（α−サブユニット） − ＩＬ−３受容体（β−サブユニット） − ＩＬ−６ − ＩＬ−６受容体 − ＧＭ−ＣＳＦ − ＧＭ−ＣＳＦ受容体（α−鎖） − インターフェロン制御因子１（ＩＲＦ−１） ＩＲＦ−１のプロモーターは、ＩＬ−６およびＩＦＮγまたはＩＦＮβによっ
て同様に活性化される。 − エリスロポイエチン − エリスロポイエチン受容体

【００３３】 ｆ６）リンパ球および／またはマクロファージにて活性化されるプロモーター
および活性化因子配列 これらには、例えばサイトカイン、サイトカイン受容体および接着分子並びに
抗体のＦｃ断片に対する受容体に対する遺伝子のプロモーターおよび活性化因子
配列が包含される。 これらには、例えば次のものが包含される： − ＩＬ−１受容体 − ＩＬ−１α − ＩＬ−１β − ＩＬ−２ − ＩＬ−２受容体 − ＩＬ−３ − ＩＬ−３受容体（α−サブユニット） − ＩＬ−３受容体（β−サブユニット） − ＩＬ−４ − ＩＬ−４受容体 − ＩＬ−５ − ＩＬ−６ − ＩＬ−６受容体 − インターフェロン制御因子１（ＩＲＦ−１） （ＩＲＦ−１のプロモーターは、ＩＬ−６およびＩＦＮγまたはＩＦＮβによ
って同様に活性化される。） − ＩＦＮγ反応性プロモーター − ＩＬ−７ − ＩＬ−８ − ＩＬ−１０ − ＩＬ−１１ − ＩＦＮγ − ＧＭ−ＣＳＦ − ＧＭ−ＣＳＦ受容体（α−鎖） − ＩＬ−１３ − ＬＩＦ − マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）受容体 − タイプＩおよびＩＩ マクロファージスカベンジャー受容体 − ＭＡＣ−１（白血球機能抗原） − ＬＦＡ−１α（白血球機能抗原） − ｐ１５０,９５（白血球機能抗原）

【００３４】 ｆ７）滑膜細胞にて活性化されるプロモーターおよび活性化因子配列 これらには、基質メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、例えば次のものに対する
プロモーター配列が包含される： − ＭＭＰ−１（間質コラゲナーゼ） − ＭＭＰ−３（ストロメライシン／トランシン[transin]） 従って、これらには、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）、例え
ば： ＴＩＭＰ−１ ＴＩＭＰ−２ ＴＩＭＰ−３ のプロモーター配列が包含される。

【００３５】 ８）白血病細胞にて活性化されるプロモーターおよび活性化因子配列 これらには、例えば： − ｃ−ｍｙｃ − ＨＳＰ−７０ − ｂｃｌ−１／サイクリンＤ−１ − ｂｃｌ−２ − ＩＬ−６ − ＩＬ−１０ − ＴＮＦα，ＴＮＦβ − ＨＯＸ−１１ − ＢＣＲ−ＡｂＩ − Ｅ２Ａ−ＰＢＸ−１ − ＰＭＬ−ＲＡＲＡ（前骨髄の白血病−レチノイン酸受容体） − ｃ−ｍｙｃ − ｃ−ｍｙｃタンパク質が結合して活性化する、ＭｙｃＥボックスと称され
るヌクレオチド配列（5-GGAAGCAGACCAGCTGGTCTGCTTCC-3′, SEQ ID NO: 1）の多
重結合体のプロモーターが包含される。

【００３６】 ｆ９）腫瘍細胞にて活性化されるプロモーターまたは活性化因子配列 腫瘍細胞において形成されるかまたは活性のある転写因子と相互作用する遺伝
子制御ヌクレオチド配列は、プロモーターまたは活性化因子配列と考えられる。 本発明のこの目的のために好ましいプロモーターまたは活性化因子配列には、
特に癌細胞または肉腫細胞において形成されるタンパク質をコードする遺伝子の
遺伝子制御配列またはエレメントが包含される。故に、Ｎ−ＣＡＭタンパク質の
プロモーターは小細胞気管支癌の場合に使用されるのが好ましく、肝炎増殖因子
受容体またはＬ−プラスチンのプロモーターは卵巣癌の場合であり、Ｌ−プラス
チンまたは多型性上皮ムチン（ＰＥＭ）のプロモーターは膵臓癌の場合に用いる
のが好ましい。

【００３７】 II）組換えトランス作用因子［構成部分ｂ）］ 最も単純な場合、組換えトランス作用因子は、ＤＮＡ結合ドメイン［構成部分
ｂ１）］とグルタミン、Ｓｅｒおよび／またはＴｈｒに富むトランス活性化ドメ
イン［構成部分ｂ２）］からなる。 薬理学的に制御しうる組換え作用因子［構成部分ｂ′）］の場合にはカップリ
ング物質結合タンパク質に対する構成部分ｂ３）およびｂ４）を導入し、癌また
はウィルス制御組換えトランス作用因子［構成部分ｂ″）］の場合には制御タン
パク質の結合タンパク質に対する構成部分ｂ５）を導入する。

【００３８】 構成部分ｂ）、ｂ′）またはｂ″）の作動性は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）
を導入することにより高めることができる。使用しうるＮＬＳの例はＳＶ４０の
ＮＬＳ（Dingwall等, TIBS 16, 478 (1991)）である。 １）ＤＮＡ結合ドメイン［構成部分ｂ１）］ ＤＮＡ結合ドメインは、次の少なくとも１つの配列を表す： − Ｇａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１〜１４７；Chasma
n und Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990)）のｃＤＮＡ、 − ＬｅｘＡタンパク質（アミノ酸１〜８１；Kim等, Science 255, 203 (199
2)）もしくは完全なＬｅｘＡタンパク質（アミノ酸１〜２０２；Brent等. Cell
43, 729 (1985)）、 − ｌａｃリプレッサー（ｌａｃ Ｉ）タンパク質（Brown等, Cell 49, 603 (
1987)；Fuerst等, PNAS USA 86, 2549 (1989)）、 − テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔ−Ｒ）タンパク質（Gossen等, PN
AS USA 89, 5547 (1992)；Dingermann等, EMBO J. 11, 1487 (1992)）、または − ＺＦＨＤ１タンパク質（Pomerantz等, Science 267, 93 (1995)）

【００３９】 ２）トランス活性化ドメイン［構成部分ｂ２）］ 本発明の目的のために使用されるＤＮＡは、グルタミン、セリンのおよび／ま
たはトレオニンに富むトランス活性化ドメインのものである。 用語「富む」は、本発明の目的において、転写活性化ドメインが、総計： 少なくとも２０×グルタミン（＝少なくとも２０個のグルタミン基） 少なくとも１０×セリンおよび／または 少なくとも１０×トレオニン を含むことを意味する。

【００４０】 本発明の目的のためのトランス活性化ドメインには、例えば次のものが包含さ
れる： − Ｏｃｔ−２の活性化ドメイン（アミノ酸４３８〜４７９；Tanaka等, Mol.
Cell Biol. 14, 6064 (1994)もしくはアミノ酸３〜１５４；Das等, Nature 374
, 657 (1995)）、または − ＳＰ１の活性化ドメイン（アミノ酸３４０〜４８５；CoureyとTijan, Cel
l 55, 887 (1988)）、または − ＮＦＹ−１Ａの活性化ドメイン（アミノ酸１〜１３２もしくは１〜２３３
；Li等, J. Biol. Chem. 267, 8984 (1992); van Hujisduijnen等, EMBO J. 9,
3119 (1990)；Sinha等, J. Biol. Chem. 92, 1624 (1995)；Coustry等, J. Biol
. Chem. 270, 468 (1995)）。

【００４１】 ３）カップリング物質［構成部分ｆ）］−結合性タンパク質Ａ［構成部分ｂ３
）］およびＢ［構成部分ｂ４）］ カップリング物質並びに対応するタンパク質ＡおよびＢの例は既に特許出願EP
-A-0 848 061に詳細に記載されており、本明細書に引用することにより組み入れ
る。 これらタンパク質ＡおよびＢは、例えば − カップリング物質：ラパマイシンまたはラパマイシンアナログに対して ・ＦＫ５０６結合性タンパク質（ＦＫＢＰ） ・ラパマイシンＦＫＢＰ複合体に結合するＦＫＢＰ−ラパマイシン会合タンパ
ク質または、ラパマイシン−ＦＫＢＰ複合体（ＦＲＡＰ）に結合するそのサブ配
列 ・ＦＫＢＰおよびＦＲＡＰの遺伝子を使う代わりに、ラパマイシンに結合する
および／またはＦＫＢＰもしくはＦＲＡＰのラパマイシンへの結合を阻害するｒ
ｅｃ.Ｆｖの遺伝子を使うことが可能である − カップリング物質：ＦＫ５０６のダイマー（ＦＫ１０１２）に対して ・ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ） ・ＦＫ５０６複合体に結合するカルシンウリン[calcineurin]またはそのサブ
配列 ・カルシンウリンの遺伝子の代わりに、ＦＫ５０６のカルシンウリンへの結合
を阻害するｒｅｃ.Ｆｖの遺伝子を挿入することが可能である − カップリング物質：サイクロスポリンＡのダイマーに対して ・サイクロフィリン ・サイクロスポリンＡ／サイクロフィリン複合体に結合するカルシンウリンま
たはそのサブ配列 ・サイクロフィリンの遺伝子の代わりに、サイクロスポリンＡのサイクロフィ
リンへの結合を阻害するｒｅｃ.Ｆｖの遺伝子を導入することが可能である − カップリング物質：サイクロスポリンＡのモノマーと次の結合タンパク質
に対して ・サイクロフィリン ・サイクロフィリン／サイクロスポリンＡ複合体においてサイクロスポリンＡ
に結合するｒｅｃ.Ｆｖの遺伝子 ・サイクロフィリンの代わりとして、サイクロスポリンＡの別のエピトープに
結合する別のｒｅｃ.Ｆｖの遺伝子を使用することが可能である

【００４２】 − カップリング物質：メトトレキサートに対して ・メトトレキサートに対する抗体または抗体断片（ｒｅｃ.Ｆｖ） ・プテリジン基に対する抗体または抗体断片（ｒｅｃ.Ｆｖ） ・ベンゼン基に対する抗体または抗体断片（ｒｅｃ.Ｆｖ） ・ジヒドロホレートレダクターゼ − カップリング物質：ゲンタマイシンに対して ・ゲンタマイシンに対する抗体または抗体断片（ｒｅｃ.Ｆｖ） − カップリング物質に対して ・に対する抗体または抗体断片（ｒｅｃ.Ｆｖ） − カップリング物質：セファレキシンに対して ・セファンのＣ７位にあるアシル側鎖に対する抗体または抗体断片（ｒｅｃ.
Ｆｖ） − カップリング物質：葉酸に対して ・葉酸結合タンパク質 ・葉酸に対する抗体または抗体断片（ｒｅｃ.Ｆｖ）

【００４３】 − カップリング物質：レチノイン酸に対して ・細胞内レチノイン酸結合タンパク質のレチノイン酸結合ドメイン ・レチノイン酸に対する抗体または抗体断片（ｒｅｃ.Ｆｖ） − カップリング物質に対して ・アモキシシリンに対する抗体または抗体断片（ｒｅｃ.Ｆｖ） ・ベンジルペニシロイル基に対する抗体または抗体断片（ｒｅｃ.Ｆｖ） ・ペニシリンに対する抗体または抗体断片（ｒｅｃ.Ｆｖ） ・ペニシリン結合タンパク質 − カップリング物質：４−ヒドロキシ−タモキシフェンまたはタモキシフェ
ンに対して ・エストロゲン受容体タンパク質のエストロゲン結合ドメイン ・エストロゲンと、エストロゲン受容体または４−ヒドロキシ−タモキシフェ
ンとの複合体に対する抗体または抗体断片（ｒｅｃ.Ｆｖ） − カップリング物質：テトラサイクリンに対して ・テトラサイクリンリプレッサータンパク質 ・テトラサイクリンに対する抗体または抗体断片 − カップリング物質：テトラサイクリンとイソプロピル−β−Ｄ−チオガラ
クトシドとのコンジュゲートに対して ・テトラサイクリンリプレッサータンパク質 ・ｌａｃサイクリンリプレッサー（ｌａｃ Ｉ）タンパク質

【００４４】 ４）制御タンパク質に対する結合タンパク質［構成部分ｂ５）］ 制御タンパク質に対する多くの細胞性結合タンパク質が既に記載されている［
ZwickerとMueller, Progress in Cell Cycle Res. 1: 91 (1995); Boulikas等,
Int. J.Oncol. 6: 271 (1995); Pawson, Nature 373: 573 (1995); Cotter, Leu
k. Lymph. 18: 231 (1995); Hesketh, the Oncogene Facts Book Acad. Press,
ISBN 0-12-344550-7 (1995); MillerとSarver, Nature Med. 3: 389 (1997)］。

【００４５】 本発明の目的に適するものは、特に、疾病に冒された細胞においてのみ弱く発
現し、結合配列に対する結合が阻害され、過剰な結合配列のために遊離の形態で
は存在しないかもしくはごく少量しか存在しないか、またはその機能が例えば突
然変異により悪影響を受けるかもしくは変化しているような結合タンパク質また
はその制御タンパク質に対する結合配列である。 そのような制御タンパク質は、例えば腫瘍サプレッサー遺伝子により発現され
るタンパク質である。 そのような制御タンパク質、これに対応する結合タンパク質およびその結合配
列の選択を下記の例に示すが、これらは本発明を限定するものではない。

【００４６】

【表１】

【００４７】 本発明の特に好ましい態様において、構成部分ｂ５）は、制御タンパク質に対
する細胞外結合タンパク質の結合性である。そのような細胞外結合配列は、例え
ばウィルス性、細菌性または寄生性由来である。 そのような細胞外結合配列の使用は、対応する制御タンパク質が構成部分ｂ５
）に結合するため、正常細胞にて阻害されるよう構成部分ｂ）を機能させる。し
かし、感染細胞においては対応する制御タンパク質が、特定の病原体による結合
配列を含有する結合タンパク質の細胞内産生のためにその殆どが結合される。故
に、構成部分ｂ）はこれらの細胞中では遊離しており、作用可能である。 本発明の別の態様において、構成部分ｂ５）は、制御タンパク質に対する結合
配列（ＶＨおよびＶＬ）を有する抗体または抗体の部分である。 細胞外結合配列の選択は下記する例にて列記するが、これは本発明を制限する
ものではない：

【００４８】

【表２】

【００４９】

【表３】

【００５０】 抗体を選択した場合、構成部分ｂ５）として抗体ＦＶＬおよびＦＶＨのエピト
ープ結合部分を使用し、抗体がマウス起源である場合にはヒト型化の形態である
のが好ましい。ヒト型化は、Winter等（Nature 349, 293 (1991)およびHoogenbo
oms等（Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993)）により記載される方法
で達成される。抗体断片は、当該技術、例えばWinter等, Nature 349, 293 (199
1), Hoogenboom等, Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993), Girol, Mol
. Immunol. 28, 1379 (1991)またはHuston等, Int. Rev. Immunol. 10, 195 (19
93)に記載される方法にて作製される。

【００５１】 組換え抗体断片は、存在するハイブリドーマから直接作製されるか、またはフ
ァージディスプレー技術（Smith, Science 228, 1315, (1985)）によりマウスも
しくはヒト抗体断片のライブラリーから単離される（Winter等, Annu. Rev. Imm
unol. 12, 433 (1994)）。次いでこれらの抗体は、遺伝子レベルにおいて構成部
分ｂ１）およびｂ２）に直接使用される。

【００５２】 ハイブリドーマから組換え抗体断片を作製するためには、ｍＲＮＡを単離し、
前記ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、次いでその可変断片（Orlandi等, 1989）の
５′末端および３′末端にそれぞれ相補的なオリゴヌクレオチドを用いるポリメ
ラーゼ連鎖反応（Saiki等, Science 230, 1350 (1985)）によって増幅すること
により抗体の抗原結合ドメイン（ＶＨ，ＶＬ）をコードする遺伝情報を得る。次
にＶＨおよびＶＬ断片は、例えばＦｖ断片（SkerraとPluckthun, Science 240,
1038 (1988)）、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）（Bird等, Science 242, 423 (198
8); Huston等, PNAS USA 85, 5879 (1988)）の形態でまたはＦａｂ断片（Better
等, Science 240, 1041 (1988)）として細菌性発現ベクター中にクローン化され
る。

【００５３】 新たな抗体断片はまた、ファージディスプレー技術（McCafferty等, Nature 3
48, 552 (1990); Reitling等, Gene 104, 147 (1991); McCafferty等, Nature 3
48, 552 (1990); Hoogenboom等, Nucl. Acid Res. 19, 4133 (1991); Barbas等,
PNAS USA 88, 7978 (1991); Marks等, J. Mol. Biol. 222, 581 (1991); Hawki
ns等, J. Mol.'Biol. 226, 889 (1992); Marks等, Bio/Technol. 11, 1145 (199
3)）によりマウスまたはヒト起源の抗体のライブラリー（免疫ライブラリー、ナ
イーブ[naive]ライブラリー）から直接単離することができる。

【００５４】 免疫ライブラリーは、免疫感作動物（Sastry等, PNAS USA 86, 5728 (1989);
Ward等, Nature 341, 544 (1989); Clackson等, Nature 352, 624 (1991)）また
は患者（Mullinax等, PNAS USA 87, 8095 (1990); Barbas等, PNAS USA 88, 797
8 (1991)）のＢリンパ球由来の抗体断片のＰＣＲ増幅により作製される。

【００５５】 抗体断片の親和性は、ファージディスプレー技術、ランダム突然変異誘発（Ha
wkins等, J. Mol. Biol. 226, 889 (1992); Gram等, PNAS USA 89, 3576 (1992)
）、コドンベース突然変異誘発（Glaser等, J. Immunol. 149, 3903 (1992)）も
しくは特異的突然変異誘発（BalintとLarrick, Gene 137, 109 (1993)）により
調製される存在する抗体断片の新規ライブラリー、細菌性ミューテーター株（Lo
w等, J. Mol. Biol. 260, 359 (1996)）、ナイーブレパートリー（Marks等, Bio
/Technol. 10, 779 (1992)）からの断片または細菌性突然変異誘発株を用いて個
々のドメインの鎖をシャッフルすることにより向上させ、そして向上した特性を
有する抗体断片を、ストリンジェントな条件下で再度選択することにより単離す
ることができる（Hawkins等, J. Mol. Biol. 226, 889 (1992)）。

【００５６】 III）構成部分ｂ）［構成部分ｃ］］に対するＤＮＡ結合配列 ＤＮＡ結合配列の選択はＤＮＡ結合ドメインの選択次第である。例えば、II）
にて示したＤＮＡ結合ドメインの例については次の可能性が存在する。１）： − Ｇａｌ４タンパク質に対する少なくとも１つのＤＮＡ結合配列［ヌクレオ
チド配列：5′-CGGACAACTGTTGACCG-3′, SEQ ID NO: 4］；ChasmanとKomberg, M
ol. Cell Biol. 10, 2916 (1990)または［ヌクレオチド配列：5′-CGGAGGACTGTC
CTCCG 3′, SEQ ID NO: 5］［ヌクレオチド配列：5′-CGGAGTACTGTCCTCCG-3′,
SEQ ID NO: 6］；Giniger等, PNAS USA 85, 382 (1988)。 − ＬｅｘＡタンパク質［ＬｅｘＡオペレーター；Brent等, Nature 612, 312 (1984)］に対する少なくとも１つの結合配列［ヌクレオチド配列：5′-TACTGTA
TGTACATACAGTA-3′, SEQ ID NO: 7］ − ｌａｃ Ｉリプレッサータンパク質（Fuerst等, PNAS USA 86, 2549 (1989
); Simons等, ,PNAS USA 81, 1624 (1984)）に対する少なくとも１つのＬａｃオ
ペレーター結合配列［ヌクレオチド配列：5′-GAATTGTG AGGCTCACAATTC-3′, SE
Q ID NO: 8］ − テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔ Ｒ）タンパク質に対する少なく
とも１つのテトラサイクリンオペレーター（ｔｅｔ Ｏ）結合配列［ヌクレオチ
ド配列：5′-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3′, SEQ ID NO: 9
］ − ＺＦＨＤ−１タンパク質（Pomeranth等, Science 267, 93 (1995)）に対
する少なくとも１つの結合配列［ヌクレオチド配列：5′-TAATGATGGGCG-3′, SE
Q ID NO: 10］

【００５７】 IV）ＣＤＥ−ＣＨＲまたはＥ２ＦＢＳ−ＣＨＲ［構成部分ｄ］］を含む最小プロ
モーター 用いることができる断片の例は次のものである： − ｃｄｃ２５遺伝子の断片（核酸−２０〜＋１２１または核酸−２０〜＋５
０） − ｃｄｃ２（ｃｄｋ−１）遺伝子の断片（核酸−２６〜＋１２１；Liu等, N
ucl. Acids Res. 24, 2905 (1996)） − サイクリンＡ遺伝子の断片（核酸−４０〜＋９４；Liu等, Nucl. Acids R
es. 24, 2905 (1996)） − Ｂ−ｍｙｂ遺伝子の断片（核酸−５０〜＋５０；Liu等, Nucl. Acids Res
. 24, 2905 (1996)）

【００５８】 Ｖ）エフェクター遺伝子［構成部分ｅ］］ 本発明の目的のため、エフェクター遺伝子は、疾患の予防および／または治療
のための活性化合物をコードする。エフェクター遺伝子は、疾患の治療の性質に
ついて、そして遺伝子導入する標的細胞を考慮して選択されるべきである。 例えば、次の疾患の治療の場合にはプロモーター配列（例についてはセクショ
ンＣＩを参照）とエフェクター遺伝子の下記の組合せが選択される（詳細な記載
は特許出願EP-A 0 777 739, EP-A 0 777 740, EP-A 0 804 601, EP-A 0 807 183
, EP-A 0 790 313, EP-A 0 805 209およびEP-A 0 848 063に既に示されており、
ここで参照により組み入れる）。

【００５９】 ａ）腫瘍の治療 a.1）標的細胞： − 増殖内皮細胞または − 内皮細胞に隣接する間質細胞および筋肉細胞または − 腫瘍細胞もしくは骨髄腫細胞 a.2）プロモーター − 内皮細胞特異的および細胞周期特異的なもの、または − 細胞非特異的もしくは筋肉細胞特異的および細胞周期特異的なもの、また
は − 腫瘍細胞特異的（固体腫瘍、白血病）および細胞周期特異的なもの a.3）細胞増殖阻害剤のエフェクター遺伝子、例えば： − 網膜芽細胞腫に対するタンパク質（ｐＲｂ＝ｐ１１０）または関連するｐ
１０７およびｐ１３０タンパク質 網膜芽細胞腫のタンパク質（ｐＲｂ／ｐ１１０）並びに関連するｐ１０７およ
びｐ１３０タンパク質はリン酸化により活性化される。用いるのが好ましいこれ
らの細胞周期阻害剤の遺伝子は、発現されるタンパク質の不活化部位に対する突
然変異を示し、これにより悪影響を被り後者の機能を有さないものである。その
ような突然変異の例は、ｐ１１０について記載されている。ｐ１０７タンパク質
またはｐ１３０タンパク質に対するＤＮＡ配列は同様に変異される。

【００６０】 − ｐ５３タンパク質 ｐ５３タンパク質は、ＭＤＭ２などの特異的タンパク質への結合またはＣ−末
端のセリンの脱リン酸化を介するｐ５３のオリゴマー化のいずれかにより細胞中
で不活性化される。故に、ｐ５３タンパク質に対する好ましいＤＮＡ配列は、セ
リン３９２でＣ−末端がトランケートされたものである。 − ｐ２１（ＷＡＦ−１） − ｐ１６タンパク質 − 他のｃｄｋ阻害剤 − ＧＡＤＤ４５タンパク質 − ｂａｋタンパク質

【００６１】 a.4）血液凝固誘発因子および血管形成阻害剤に対するエフェクター遺伝子、
例えば： − プラスミノーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡ−１） − ＰＡＩ−２ − ＰＡＩ−３ − アンジオスタチンおよび／またはエンドスタチン − インターフェロン（ＩＦＮα，ＩＦＮβまたはＩＦＮγ） − 血小板因子４ − ＩＬ−１２ − ＴＩＭＰ−１ − ＴＩＭＰ−２ − ＴＩＭＰ−３ − 白血病阻害因子（ＬＩＦ） − 組織因子（ＴＦ）およびその凝固−活性断片

【００６２】 a.5）細胞増殖抑制性および細胞傷害性タンパク質に対するエフェクター遺伝
子、例えば： − パーフォリン − グランザイム − ＩＬ−２ − ＩＬ−４ − １１−１２ − 例えばＩＦＮ−α，ＩＦＮβまたはＩＦＮγなどのインターフェロン − ＴＮＦαまたはＴＮＦβなどのＴＮＦ − オンコスタチンＭ − スフィンゴミエリナーゼ − マゲイニンおよびマゲイニン誘導体

【００６３】 a.6）細胞増殖抑制性または細胞傷害性抗体および抗原結合性抗体断片と細胞
増殖抑制性、細胞傷害性または炎症性タンパク質もしくは酵素とで形成される融
合タンパク質に対するエフェクター遺伝子。 − 細胞増殖抑制性または細胞傷害性抗体には、例えばBurrows等（Pharmac.
Ther. 64, 155 (1994)）、Hughes等（Cancer Res. 49, 6214 (1989)）およびMar
uyama等（PNAS USA 87, 5744 (1990)）に記載されるような内皮細胞の細胞膜構
造物に対する抗体が包含される。特にこれらには、ＶＥＧＦ受容体に対する抗体
が包含される。

【００６４】 − さらに、これらには腫瘍細胞の細胞膜構造物に対する細胞増殖抑制性また
は細胞傷害性抗体が包含される。そのような抗体は、例えばSedlacek等, Contri
b. to Oncol. 32, Karger Veriag, Munich (1988)およびContrib. to Oncol. 43
, Karger Verlag, Munich (1992)により検討されている。他の例は、 Other exa
mples are antibodiesagainstシアリルルイスに対する抗体；Ｔリンパ球により
認識される腫瘍におけるタンパク質に対する抗体；癌遺伝子発現タンパク質に対
する抗体；GD3,GD2,GM2,9-0-aアセチルGD3,フコシルGM1などのに対する抗体；血
液型抗原およびその前駆体に対する抗体；多型性上皮ムチンの抗原に対する抗体
；熱ショックタンパク質の抗原における抗体である。

【００６５】 − さらにこれらには、白血病細胞の細胞膜構造物に対する抗体も包含される
。そのようなモノクローナル抗体の多くは、診断および治療法のために既に記載
されている（Kristensen, Danish Medical Bulletin 41, 52 (1994); Schranz,
Therapia Hungarica 38, 3 (1990); Drexler等, Leuk. Res. 10, 279 (1986); N
aeim, Dis. Markers 7, 1 (1989); Stickney等, Curr.. Opin. Oncol. 4, 847 (
1992); Drexler等, Blut 57, 327 (1988); Freedman等, Cancer Invest. 9, 69
(1991)におけるレビュー）。白血病の型に依存して、適するリガンドは、例えば
次の細胞膜抗原に対するモノクローナル抗体またはその抗原結合性抗体断片であ
る： 細 胞 細胞膜抗原 ＡＭＩ ＣＤ１３ ＣＤ１５ ＣＤ３３ ＣＡＭＡＬ シアロシル−Ｌｅ Ｂ−細胞 ＣＤ５ ＣＤ１ｃ ＣＤ２３ 細胞膜イムノグロブリンのイディオタイプおよびイソタイプ Ｔ−細胞 ＣＤ３３ Ｍ３８ ＩＬ−受容体 Ｔ−細胞受容体 ＡＬＬ ＣＡＬＬＡ ＣＤ１９ 非−ホジキンリンパ腫

【００６６】 − マウス抗体のヒト型化、Ｆａｂおよびｒｅｃ.Ｆａｂ断片の遺伝子の調製
および至適化は、当業者に知られた技術に従って実施される（Winter等, Nature
349, 293 (1991); Hoogenbooms等, Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36,19 (199
3); Girol,. Mol. Immunol. 28, 1379 (1991)またはHuston等, Intern. Rev. Im
munol. 10, 195 (1993)）。 ｒｅｃ.Ｆａｂ断片と、細胞増殖抑制性、細胞傷害性または炎症性タンパク質ま
たは酵素に対する遺伝子との融合はまた、当業者に知られた従来技術に従って実
施される。

【００６７】 a.7）標的細胞結合性リガンドと細胞増殖抑制性および細胞傷害性のタンパク
質とで形成される融合蛋白質に対するエフェクター遺伝子。リガンドには、内皮
細胞における細胞膜構造物または細胞膜受容体に結合するすべての物質が包含さ
れる。これらの例には次のものが包含される： − たとえばＩＬ−１などのサイトカイン、または内皮細胞により発現される
受容体に結合する増殖因子、その断片もしくはその部分、たとえばＰＤＧＦ，ｂ
ＦＧＦ，ＶＥＧＦ，ＴＧＦ。 − さらにこれらには、活性化および／または増殖内皮細胞結合する接着分子
が包含される。これらには例えばＳＬｅｘ，ＬＦＡ-１，ＭＡＣ-１，ＬＥＣＡＭ
-１，ＶＬＡ-４またはビトロネクチンが包含される。 − さらにこれらには、腫瘍または白血病細胞の細胞膜構造物または細胞膜受容
体に結合する物質が包含される。例えばこれらには、腫瘍または白血病細胞によ
り発現される受容体に結合する増殖因子、その断片または部分が包含される。

【００６８】 そのような増殖因子は既に開示されている（Cross等, Cell 64, 271 (1991),
Aulitzky等, Drugs 48, 667 (1994), Moore, Clin. Cancer Res. 1, 3 (1995),
Van Kooten等, Leuk. Lymph. 12, 27 (1993)にて検討されている）。 − 標的細胞に結合するこれらのリガンドと、細胞増殖抑制性、細胞傷害性ま
たは炎症性のタンパク質または酵素に対する遺伝子の融合は、当業者に知られた
方法を用いて従来技術に従って実施される。

【００６９】 a.8）炎症性に対するエフェクター遺伝子には、例えば次のものが包含される
： − ＩＬ−１ − ＩＬ−２ − ＲＡＮＴＥＳ （ＭＣＰ−２） − 単球走化性および活性化因子（ＭＣＡＦ） − ＩＬ−８ − マクロファージ炎症性タンパク質−１（ＭＩＰ−１α，−β） − 好中球活性化タンパク質−２（ＮＡＰ−２） − ＩＬ−３ − ＩＬ−５ − ヒト白血病阻害因子（ＬＩＦ） − ＩＬ−７ − ＩＬ−１１ − ＩＬ−１３ − ＧＭ−ＣＳＦ − Ｇ−ＣＳＦ − Ｍ−ＣＳＦ − ヒト補因子Ｃ３ｂに作用的に対応する、即ち補因子Ｂに結合し得て、そし
てＤ因子により開裂された後にＣ３コンベルターゼ[convertase]になる、コブラ
毒因子(CVF)またはＣＶＦの部分 − ヒト補因子Ｃ３またはその部分Ｃ３ｂ − 作用的に、構造的にＣＶＦと類似するヒト補因子Ｃ３の分解産物 − Salmonella typhi muriumのポーリン、Staphylococcus aureusのクランピ
ング因子、特にグラム陰性細菌由来のモジューリン[modulin]、レジオネラ、Ｂ
型インフルエンザウィルスもしくはクレブシエラの主要な外殻タンパク質、また
は連鎖球菌グループＧ由来のＭ分子などの補体を活性化するまたは炎症を引き起
こす細菌性タンパク質。

【００７０】 a.9）細胞増殖抑制剤の前駆体を活性化する酵素に対するエフェクター遺伝子
、例えば不活な前駆体（プロドラグ）を活性細胞増殖抑制剤（薬剤）に開裂させ
る酵素のエフェクター遺伝子 そのような物質および対応するプロドラグと薬剤は、既にDeonarain等（Br. J
. Cancer 70, 786 (1994), Mullen, Pharmac. Ther. 63, 199 (1994)）およびHa
rris等（Gene Ther. 1, 170 (1994)）により検討されている。例えば次の酵素の
１つのＤＮＡ配列が使用される： − 単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ − 水痘ウイルスのチミジンキナーゼ − 細菌性ニトロレダクターゼ − Secale cereale由来の植物β−グルクロニダーゼ − ヒトのβ−グルクロニダーゼ − ヒトのカルボキシペプチダーゼ（ＣＢ）、例えば肥満細胞のＣＢ−Ａ、膵
臓のＣＢ−Ｂまたは細菌性カルボキシペプチダーゼ − 細菌性β−ラクタマーゼ − 細菌性シトシンデアミナーゼ − ヒトのカタラーゼまたはペルオキシダーゼ − ホスファターゼ、特にヒトのアルカリ性ホスファターゼ、ヒトの酸性の前
立腺のホスファターゼまたはタイプ５酸性ホスファターゼ − オキシダーゼ、特にヒトのリシルオキシダーゼ、ヒトの好酸性ペルオキシ
ダーゼまたはヒトのＤ−アミノオキシダーゼ − ペルオキシダーゼ、特にヒトのグルタチオンペルオキシダーゼ、ヒトの好
酸性ペルオキシダーゼまたはヒトの甲状腺ペルオキシダーゼ − ガラクトシダーゼ

【００７１】 ｂ）自己免疫疾患および炎症の治療（詳細なことは既に特許出願EP-A 0 807 1
83に記載され、ここで参照により本明細書に組み入れる） b.1）標的細胞： − 増殖する内皮細胞 − マクロファージおよび／またはリンパ球、または − 滑膜細胞 b.2）プロモーター − 内皮細胞特異的および細胞周期特異的なプロモーター − マクロファージおよび／またはリンパ球特異的および／または細胞周期特
異的なプロモーター、または − 滑膜細胞特異的および／または細胞周期特異的なプロモーター

【００７２】 b.3）アレルギーの治療に対するエフェクター遺伝子、例えば： − ＩＦＮβ − ＩＦＮγ − ＩＬ−１０ − ＩＬ−４に対する抗体または抗体断片 − 可溶性ＩＬ−４受容体 − ＩＬ−１２ − ＴＧＦβ b.4）移植臓器拒絶を抑制するエフェクター遺伝子、例えば： − ＩＬ−１０ − ＴＧＦβ − 可溶性ＩＬ−１受容体 − 可溶性ＩＬ−２受容体 − ＩＬ−１受容体アンタゴニスト − 可溶性ＩＬ−６受容体 − 免疫抑制性抗体もしくはそのＶＨ−およびＶＬ含有断片、またはリンカー
を介して結合したそのＶＨおよびＶＬ断片 免疫抑制性抗体は、例えばＴ細胞受容体またはそのＣＤ複合体に特異的な抗体
、ＣＤ４またはＣＤ８に対する抗体、さらにはＬ−２受容体、ＩＬ−１受容体も
しくはＩＬ−４受容体に対する抗体、または接着分子ＣＤ２、ＬＡＦ−１、ＣＤ
２８、もしくはＣＤ４０に対する抗体である。

【００７３】 b.5）抗体媒介自己免疫疾患の治療のためのエフェクター遺伝子、例えば： − ＴＧＦβ − ＩＦＮα − ＩＦＮβ − ＩＦＮγ − ＩＬ−１２ − 可溶性ＩＬ−４受容体 − 可溶性ＩＬ−６受容体 − 免疫抑制性抗体またはそのＶＨ−およびＶＬ−含有断片

【００７４】 b.6）細胞媒介自己免疫疾患の治療のためのエフェクター遺伝子： − ＩＬ−６ − ＩＬ−９ − ＩＬ−１０ − ＩＬ−１３ − ＴＮＦαまたはＴＮＦβ − ＩＬ−１３ − 免疫抑制性抗体またはそのＶＨ−およびＶＬ−含有断片 b.7）細胞増殖の阻害剤、細胞増殖抑制性薬剤の前駆体を活性化するための細
胞増殖抑制性または細胞傷害性タンパク質および酵素に対するエフェクター遺伝
子 そのようなタンパク質をコードする遺伝子の例は、セクション「腫瘍の治療の
ためのエフェクター遺伝子」にて既に言及している。

【００７５】 既に上述した同じ形態において、抗体、その抗体のＦａｂもしくはｒｅｃ.Ｆ
ｖ断片、または標的細胞に特異的な他のリガンドと、上述のサイトカイン、増殖
因子、受容体、細胞増殖抑制性もしくは細胞傷害性タンパク質および酵素から形
成される融合タンパク質をコードする構造遺伝子を本発明の目的に使用すること
ができる。

【００７６】 b.8）関節炎の治療のためのエフェクター遺伝子 本発明の目的のために、構造遺伝子は、その発現したタンパク質が直接的また
は間接的に、例えば関節における炎症を阻害するおよび／または関節における細
胞外基質（関節，結合組織）の再構成を促進するものから選択される。 これらには例えば次のものが包含される： −ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１−ＲＡ）； ＩＬ−１−ＲＡは、ＩＬ−１α，βの形成を阻害する − 可溶性ＩＬ−１受容体； 可溶性ＩＬ−１受容体はＩＬ−１に結合し、これを活性化する − ＩＬ−６ ＩＬ−６はＴＩＭＰおよびスーパーオキシドの分泌を増加させ、骨膜細胞およ
び軟骨細胞によるＩＬ−１およびＴＮＦαの分泌を減少させる − 可溶性ＴＮＦ受容体 可溶性ＴＮＦ受容体はＴＮＦに結合し、これを不活化する − ＩＬ−４ ＩＬ−４はＩＬ−１、ＴＮＦαおよびＭＭＰの生成とその分泌を阻害する − ＩＬ−１０ ＩＬ−１０は、ＩＬ−１、ＴＮＦαおよびＭＭＰの生成とその分泌を阻害し、
そしてＴＩＭＰの分泌を増加させる − インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１） ＩＧＦ−１は細胞外基質の合成を刺激する − ＴＧＦβ，特にＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２ ＴＧＦβは細胞外基質の合成を刺激する − スーパーオキシドジスムターゼ − ＴＩＭＰ、特にＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２またはＴＩＭＰ−３

【００７７】 ｃ）血液細胞の形成不全の治療 （詳細なことは既に特許出願EP-A 0 807 183に記載されており、参照することに
より組み入れる） c.1）標的細胞： − 造血系の増殖する未熟な細胞、または − その造血細胞の近傍の間質細胞 c.2）プロモーター： − 造血細胞に特異的なおよび／または細胞周期特異的なプロモーター − 細胞非特異的および細胞周期特異的なプロモーター c.3）貧血症の治療のためのエフェクター遺伝子、例えば： − エリスロポイエチン c.4）白血病の治療のためのエフェクター遺伝子 − Ｇ−ＣＳＦ − ＧＭ−ＣＳＦ − Ｍ−ＣＳＦ c.5）血小板減少症の治療のためのエフェクター遺伝子、例えば： − ＩＬ−３ − 白血病阻害因子（ＬＩＦ） − ＩＬ−１１ − トロンボポイエチン

【００７８】 ｄ）神経系の損傷の治療 （詳細なことは特許出願EP-A 0 777 740に既に記載されており、本明細書に参照
により組み入れる。） d.1）標的細胞： − グリア細胞または − 増殖する内皮細胞 d.2）プロモーター： − グリア細胞特異的および細胞周期特異的なプロモーター − 内皮細胞特異的および細胞周期特異的なプロモーターまたは − 非特異的および細胞周期特異的なプロモーター d.3）ニューロン増殖因子のエフェクター遺伝子、例えば： − ＦＧＦ − 神経増殖因子（ＮＧＦ） 脳由来のニュートロフィック因子（ＢＤＮＦ） − ニュートロフィン−３（ＮＴ−３） − ニュートロフィン−４（ＮＴ−４） − 毛様体ニュートロフィック因子（ＣＮＴＦ） d.4）酵素に対するエフェクター遺伝子、例えば： − チロシンヒドロキシラーゼ − dopadeカルボキシラーゼ d.5）サイトカインおよびＴＮＦαの神経毒作用を阻害または中和するその阻
害剤に対するエフェクター遺伝子、例えば − ＴＧＦβ − 可溶性ＴＮＦ受容体 − ＴＮＦ受容体はＴＮＦαを中和する − ＩＬ−１０ ＩＬ−１０はIFNγ、TNFα、ＩＬ−２およびＩＬ−４の生成を阻害する − 可溶性ＩＬ−１０受容体 − ＩＬ−１受容体Ｉ − ＩＬ−１受容体II − 可溶性ＩＬ−１受容体はＩＬ−１の活性を中和する − ＩＬ−１受容体アンタゴニスト − 可溶性ＩＬ−６受容体

【００７９】 e）血液凝固系異常および血液循環系異常の治療 （詳細なことは既に特許出願EP-A 0 777 739、EP-A 0 790 313、EP-A 0 805 209
およびEP-A 0 848 063に既に記載されており、本明細書に参照により組み入れる
。） e.1）標的細胞： − 内皮細胞 − 増殖中の内皮細胞 − 内皮細胞の近傍の体細胞および平滑筋細胞または − マクロファージ e.2）プロモーター： − 細胞非特異的および細胞周期特異的なプロモーター − 内皮細胞、平滑筋細胞またはマクロファージに特異的であり、細胞周期特
異的なプロモーター e.3）凝固を阻害するまたは繊維素溶解を促進するためのエフェクタイー遺伝
子、例えば − 組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ） − ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ） − ｔＰＡとｕＰＡの混合物 − プロテインＣ − ヒルジン − セリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）、例えばＣ−１Ｓ阻害剤、α１−
アンチトリプシンおよびアンチトロンビンIIIなど − 組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）

【００８０】 e.4）凝固を促進するためのエフェクター遺伝子、例えば： − ＦVIII − ＦIX − フォンビルブラント因子 − ＦXIII − ＰＡＩ-１ − ＰＡＩ-２ − 組織因子およびその断片 e.5）血管形成に対するエフェクター遺伝子、例えば： − ＶＥＧＦ − ＦＧＦ e.6）血圧低下に対するエフェクター遺伝子、例えば： − カリクレイン − 内皮細胞窒素酸化物シンセターゼ

【００８１】 e.7）内皮層の損傷後の平滑筋細胞の増殖を阻害するエフェクター遺伝子、例
えば： − 抗増殖性、細胞増殖抑制性または細胞傷害性タンパク質 − 既に上述した（腫瘍について）細胞増殖抑制性薬剤の前駆体を細胞増殖抑
制性薬剤に開裂させるためのエフェクター遺伝子または − 活性化合物とリガンド、例えば筋肉細胞に特異的な抗体もしくは抗体断片
との融合タンパク質 e.8）他の血漿タンパク質に対するエフェクター遺伝子、例えば： − アルブミン − Ｃ１不活化因子 − セリンコリンエステラーゼ − トランスフェリン − １−アンチトリプシン

【００８２】 ｆ）接種 （詳細な記載は既に特許出願EP-A 0 807 183、EP-A 0-790 313、EP-A 0 860 445
に開示されており、参照により組み入れる） f.1）標的細胞： − 筋肉細胞 − マクロファージおよび／またはリンパ球 f.2）プロモーター： − 非特異的および細胞周期特異的なプロモーターまたは − 標的細胞特異的および細胞周期特異的なプロモーター f.3）感染症を予防するためのエフェクター遺伝子 慣用される手段による効果的なワクチンの調製の可能性は制限される。

【００８３】 故に、ＤＮＡワクチンの技術が開発された。しかし、これらのＤＮＡワクチン
は、その効率について疑問が生じている（Fynan等, Int. J. Immunopharm. 17,
79 (1995); Donnelly等, Immunol. 2, 20 (1994)）。 ＤＮＡワクチンのよりよい効率が本発明により期待される。 選択されるべき活性物質は、病原体により生成される、即ち免疫反応の誘因、
抗体の結合および／または細胞傷害性Ｔリンパ球により病原体の中和および／ま
たは破壊を導くタンパク質のＤＮＡである。いわゆる中和抗原は既にワクチン抗
原として応用されている（Ellis, Adv. Exp. Med.Biol. 327, 263 (1992)におけ
るレビューを参照）。

【００８４】 本発明の目的に好ましいものは、次の病原体の中和抗原をコードするＤＮＡで
ある： − Ａ型インフルエンザウィルス − ＨＩＶ − 狂犬病ウィルス − ＨＳＶ（単純疱疹ウイルス） − ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウィルス） − パラインフルエンザウイルス − ロタウィルス − ＶＺＶ（水痘ウイルス） − ＣＭＶ（サイトメガロウィルス） − 麻疹ウイルス − ＨＰＶ（ヒト乳頭腫ウィルス） − ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウィルス） − ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウィルス） − ＨＤＶ（Ｄ型肝炎ウィルス） − ＨＥＶ（Ｅ型肝炎ウィルス） − ＨＡＶ（Ａ型肝炎ウィルス） − ビブリオコレラ抗原 − ボレリア・ブルグドフェリ[Borrelia burgdorferi] − ヘリコバクター・ピロリ[Helicobacter pylori] − マラリア抗原 − しかしながら、本発明の目的に対してそのような活性物質にはまた、抗イ
デオタイプ抗体またはその抗原結合断片のＤＮＡが包含され、その抗原結合構造
（相補性決定領域）は病原体の中和抗原のタンパク質または炭水化物構造のコピ
ーを構成する。

【００８５】 そのような抗イデオタイプ抗体は、特に細菌性病原体における炭水化物抗原を
置換する。 そのような抗イデオタイプ抗体またはその開裂産物は、Hawkins等（J. Immuno
ther. 14, 273 (1993)）およびWesterinkとApicella （Springer Seminars in I
mmunopathol. 15, 227(1993)）により検討されている。

【００８６】 f.4）“腫瘍ワクチン”に対するエフェクター遺伝子 − これらには腫瘍細胞における抗原が包含される。そのような抗原は、例え
ばSedlacek等, Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, Munich (1988)およびC
ontrib. to Oncol 43, Karger Verlag, Munich (1992)により検討されている。 他の例は、次の抗原または次の抗原に対応する抗イデオタイプ抗体の遺伝子で
ある： − シアリルルイス − Ｔリンパ球により認識される腫瘍におけるペプチド − 癌遺伝子により発現されるタンパク質 − 血液型抗原およびその前駆体 − 多型性上皮ムチンにおける抗原 − 熱ショックタンパク質における抗原

【００８７】 ｇ）慢性感染症の治療 （詳細な記載は、特許出願EP-A 0 807 183およびEP-A 0 860 445に既に開示され
ており、参照により組み入れる） g.1）標的細胞： − 肝臓細胞 − リンパ球および／またはマクロファージ − 上皮細胞 − 内皮細胞 g.2）プロモーター： − ウィルス特異的または細胞特異的および細胞周期特異的なプロモーター g.3）エフェクター遺伝子、例えば： − 細胞増殖抑制性、アポトーシスまたは細胞傷害作用を示すタンパク質。 − 抗ウィルス性または細胞傷害性物質の前駆体を活性物質に開裂する酵素。

【００８８】 g.4）抗ウィルス性タンパク質に対するエフェクター遺伝子 − 抗ウィルス作用を有するサイトカインおよび増殖因子。これらには例えば
、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＴＮＦＢβ、ＴＮＦα、ＩＬ−１またはＴＧ
Ｆβが包含される。 − 当該ウィルスを不活化する特異性の抗体、またはリンカーを介して結合さ
れ、既に記載したように調製されるＶＨおよびＶＬ含有断片。

【００８９】 ウィルス抗原に対する抗体の例は次のものである： 抗−ＨＢＶ 抗−ＨＣＶ 抗−ＨＳＶ 抗−ＨＰＶ 抗−ＨＩＶ 抗−ＥＢＶ 抗−ＨＴＬＶ 抗−コクサッキーウィルス 抗−ハンターン[Hantaan]ウィルス − Ｒｅｖ結合タンパク質。これらのタンパク質はＲｅｖ ＲＮＡに結合して
、レトロウィルス遺伝子発現においてＲｅｖ依存性転写後段階を阻害する。Ｒｅ
ｖ結合タンパク質の例は次のものである： ＲＢＰ９−２７ ＲＢＰ１−８Ｕ ＲＢＰ１−８Ｄ ＲＢＰ１−８の偽遺伝子 − 細胞周期制御タンパク質の遺伝子のｍＲＮＡまたはウィルスのｍＲＮＡを
消化するリボザイム。ＨＩＶに対して分解作用を示すリボザイムは、例えばChri
stoffersen等, J. Med. Chem. 38, 2033 (1995)により検討されている。

【００９０】 g.5）抗菌タンパク質に対するエフェクター遺伝子 抗菌タンパク質には、例えば細菌毒素を中和するまたは細菌をオプソニン化す
る抗体が包含される。これらの抗体には次にものに対する抗体が包含される： 髄膜炎菌[meningococci]ＣまたはＢ Ｅ.ｃｏｌｉ ボレリア[Borrelia] シュードモナス[Pseudomonas] ヘリコバクター・ピロリ スタフィロコッカス・アウレウス[Staphylococcus aureus]

【００９１】 VI）同じまたは異なるエフェクター遺伝子の組合せ （詳細な記載は、EP-A 0 777 739およびEP-A0 860 445に開示されており、参照
により組み入れる。） ２つ異常のエフェクター遺伝子［例えば構成部分ｅ、ｅ′、ｅ″］、別の構成
部分ｃ）および構成部分ｄ）を発現させるために、内部リソームエントリー部位
（ＩＲＥＳ）のｃＤＮＡを制御エレメントとして当該エフェクター遺伝子の各々
の間に挿入するのが好ましい。 ＩＲＥＳは、ＩＲＥＳを介して互いに連結された２つのＤＮＡ配列の発現を可
能にする。

【００９２】 そのようなＩＲＥＳは、例えばMontfordとSmith (TIG 11, 179 (1995); Kaufm
an等, Nucl. Acids Res. 19, 4485 (1991); Morgan等, Nucl. Acids Res. 20, 1
293 (1992); Dirks等, Gene 128, 247 (1993); PelletierとSonenberg, Nature
334, 320 (1988)およびSugitomo等, BioTechn. 12, 694 (1994))により記載され
ている。 例えば、ポリオウィルスＩＲＥＳ配列（５′−ＵＴＲの＜１４０〜６３０＞位
）の対応するＤＮＡ配列を用いることができる。

【００９３】 本発明の目的のために、別の構成部分ｃ）およびｄ）またはＩＲＥＳ配列を介
して付加的作用を有するエフェクター遺伝子を連結するのが好ましい。 本発明の目的のために、例えば次のエフェクター遺伝子を組み合わせるのが好
ましい： ａ）腫瘍の治療 − 同じまたは異なる、細胞増殖抑制、アポトーシス性、細胞傷害性および／
または炎症性タンパク質、または − 同じまたは異なる、細胞増殖抑制剤の前駆体を開裂する酵素 ｂ）自己免疫疾患の治療 − 細胞性および／またはヒト免疫反応の阻害について相乗効果を有するなる
異サイトカインまたは受容体、または − 同じまたは異なるＴＩＭＰ ｃ）血液細胞の形成欠損の治療 − 異なる、階層的な一連のサイトカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ
−６もしくはＧＭ−ＣＳＦおよびエリスロポイエチン、Ｇ−ＣＳＦもしくはトロ
ンボポイエチン

【００９４】 ｄ）神経細胞傷害の治療 − 神経増殖因子およびサイトカインまたはサイトカインの阻害剤 ｅ）血液凝固系および血液循環系の傷害の治療 − アンチトロンビン剤および繊維素溶解剤（例えばｔＰＡまたはｕＰＡ） − 細胞増殖抑制性、アポトーシス性もしくは細胞傷害性タンパク質およびア
ンチトロンビン剤もしくは繊溶剤 − 幾つかの異なる相乗的に作用する血液凝固因子、例えばF VIIIとvWFもし
くはF VIIIとF IX ｆ）ワクチン接種 − 抗原および免疫刺激性サイトカイン、例えばＩＬ−１α、ＩＬ−１β、Ｉ
Ｌ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３もしくはＩＬ−４受容体 − １つの病原体もしくは別の病原体の異なる抗原、または − １つの腫瘍タイプもしくは別の腫瘍タイプの異なる抗原

【００９５】 ｇ）ウィルス感染症の治療 − 抗ウィルス性タンパク質および細胞増殖抑制性、アポトーシス性もしくは
細胞傷害性タンパク質 − １つのウィルスもしくは幾つかのウィルスの異なる表面抗原に対する抗体
。 ｈ）細菌感染症の治療 微生物の異なる表面抗原および／または毒素に対する抗体

【００９６】 VII）シグナル配列および膜貫通ドメインの導入 ａ）翻訳を促進するために、核酸配列GCCACCまたはGCCGCCをプロモーター配列
の３′−末端におよび直接開始シグナル（ATG）のシグナルもしくは膜貫通配列
（Kozak, J. Cell Biol. 108, 299 (1989)）の５′−末端に挿入することができ
る。 ｂ）エフェクター遺伝子の発現産物の分泌を促進するために、エフェクター遺
伝子のＤＮＡ配列中に包含されうる相同的なシグナル配列を、細胞外分泌を向上
させる異質シグナル配列と置換することができる。 故に、例えばイムノグロブリンに対するシグナル配列（ＤＮＡ＜６３〜１０７
位＞；Riechmann等, Nature 332, 323 (1988)）またはＣＥＡに対するシグナル
配列（ＤＮＡ＜３３〜１３４位＞； Schrewe等, Mol. Cell Biol. 10, 2738 (19
90)；Berling等, Cancer Res. 50, 6534 (1990)）またはヒト呼吸器合胞体[resp
iratory syncytial]ウイルスのシグナル配列（ＤＮＡ＜３８〜５０位または４８
〜６５位＞；Lichtenstein等, J. Gen. Virol. 77, 109 (1996)）を挿入するこ
とができる。 ｃ）活性物質を生成する、遺伝子導入した細胞表面に活性物質を固着させるた
めに、膜貫通ドメインに対する配列をシグナル配列の代わりにまたはこれに追加
して導入することができる。 故に、例えばヒトのマクロファージコロニー刺激因子の膜貫通配列（ＤＮＡ＜
１４８５〜１５５４＞；Cosman等, Behring Inst. Mitt. 83, 15 (1988)）また
はヒト呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）糖タンパク質Ｇのシグナルおよび膜貫通
領域に対するＤＮＡ配列（アミノ酸１〜６３位またはその部分配列、アミノ酸３
８〜６３位；Vijaya等, Mol. Cell Biol. 8, 1709 (1988); Lichtenstein等, J.
Gen. Virol. 77, 109 (1996)）またはインフルエンザウィルスのノイラミニダ
ーゼのシグナルおよび膜貫通領域に対するＤＮＡ配列（アミノ酸７〜３５位また
はアミノ酸７〜２７位のその部分配列；Brown等, J .Virol. 62, 3824 (1988)）
を、プロモーター配列とエフェクター遺伝子の間に挿入することができる。

【００９７】 ｄ）しかし、活性物質を生成する遺伝子導入細胞の細胞膜に活性物質を固着さ
せるために、糖リン脂質アンカーに対するヌクレオチド配列を挿入することが可
能である。 糖リン脂質アンカーは構造遺伝子のヌクレオチド配列の３′末端に挿入され、
これはシグナル配列の挿入に加えて行うことができる。 糖リン脂質アンカーは、例えばＣＥＡ、Ｎ−ＣＡＭおよび他の膜タンパク質、
例えばＴｈｙ−１などについて記載されている（Ferguson等, Ann. Rev. Bioche
m. 57, 285(1988)のレビューを参照）。

【００９８】 ｅ）本発明に従う細胞膜への活性物質の固着の別の可能性は、リガンド／活性
物質融合タンパク質に対するＤＮＡ配列の使用である。この融合タンパク質のリ
ガンドの特異性は、選択される標的細胞の細胞膜における膜構造に対するもので
ある。 e.1）細胞の表面に結合するリガンドには、例えば次の細胞の表面における構
造物に対する抗体または抗体断片である： − 内皮細胞の膜構造物。これらには特にＶＥＧＦ受容体またはキニン受容体
に対する抗体が包含される。 − または、筋肉細胞の膜構造物、例えばアクチンに対する抗体もしくはアン
ジオテンシンII受容体に対する抗体、または増殖因子の受容体、例えばＥＧＦ受
容体、ＰＤＧＦ受容体もしくはＦＧＦ受容体などに対する抗体、またはエンドセ
リンＡ受容体に対する抗体である。 − リガンドにはまた、腫瘍細胞膜における腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗
原に対する抗体またはその断片が包含される。そのような抗体は既に開示されて
いる。 マウスモノクローナル抗体はヒト型化形態で用いるのが好ましい。既に上述し
たように、Ｆａｂ、ｒｅｃ.Ｆｖ断片およびそれらの融合産物は当業者に知られ
た技術を用いて作製される。

【００９９】 e.2）さらにリガンドには、例えばサイトカインまたは接着分子、増殖因子、
その断片もしくはその部分、または当該選択された細胞における膜構造物または
膜受容体に結合するメディエイターもしくはペプチドホルモンなどの全ての活性
物質が包含される。これらには、例えば次のものが包含される： − ＩＬ−１、ＰＤＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＧβ（Pusztain等, J. P
athol. 169, 191 (1993)）またはキニンおよびその誘導体もしくはキニンのアナ
ログなどの内皮細胞に対するリガンド。 − さらにこれらには、接着分子が包含される。そのような接着分子例えばＳ
Ｌｅｘ、ＬＦＡ−１、ＭＡＣ−１、ＬｅＣＡＭ−１、ＶＬＡ−４またはビトロネ
クチンおよびその誘導体もしくはビトロネクチンのアナログなどが内皮細胞に対
して記載されている（Augustin-Voss等, J. Cell Biol. 119, 483 (1992); Paul
i等, Cancer Metast. Rev. 9, 175 (1990); Honn等, Cancer Metast. Rev. 11,
353 (1992); Varner等., Cell Adh. Commun. 3, 367 (1995)におけるレビュー）
。

【０１００】 本発明を下記の実施例を参照して詳細に説明するが、これらは本発明を限定す
るものではない。 Ｄ）本発明の思想を説明するための実施例 実施例１：内皮細胞における、組換え転写因子と共にキメラプロモーター系を含
む発現系の作製と検定 ｂ）使用したプラスミドのクローニング 本発明の発現系は以下に示した構築物から構成されている: RTA (組換え転写
トランスアクチベーター)構築物と、その下流につながる各々異なるヌクレオチ
ド配列をもつレポーター構築物１および２。 ＲＴＡ構築物（図５ａ） − ＳＶ４０プロモーターとエンハンサー（ジーンバンク ＳＶ４０環状ゲノ
ム，NID g965480：ヌクレオチド５１７２〜２９４位) − ウサギβ−グロビン イントロンII (ジーンバンク β−グロビン遺伝子
，accession No.V00882: ヌクレオチド７００〜１３０５位, van Ooyen等, Scie
nce 206, 337 (1979)) − Ｇａｌ４タンパク質[アミノ酸１〜１４７位；Chasman と Kornberg, Mol.
Cell Biol. 2916 (1990)]のＤＮＡ結合ドメインのｃＤＮＡ − リンカー: ATA GGC CGG GCC (SEQ ID NO: 11) − ＮＦ−ＹＡ［アミノ酸１〜２６１＋終止コドン（ＴＡＧ）；Li 等, J. Bi
ol. Chem. 267, 8984 (1992); van Hujisduijnen等, EMBOJ. 9, 3119(1990); Si
nka等, J. Biol. Chem. 92, 1624 (1995)]の転写促進ドメインのｃＤＮＡ − ＳＶ４０ポリ−Ａシグナル（ベクター pGL3, Promega） (特に言及しない限り、この転写終止シグナルは以下に記したすべての構築物の
３′末端に付加されている)

【０１０１】 レポーター構築物１（図５ｂ） − ５×Ｇａｌ４タンパク質(Webster等, Cell 52, 169 (1988))の結合配列 [
ヌクレオチド配列: 5×5′-CGGAGTACTGTCCTCCG-3′, SEQ ID NO: 6] − ｃｄｃ２５Ｃの基本プロモーター[ヌクレオチド配列−２０〜＋１２１；L
ucibello等, EMBO J. 14, 132 (1995)] − ルシフェラーゼのｃＤＮＡ；すべてのルシフェラーゼ構築物は転写終止の
ためのＳＶ４０のポリ−Ａシグナルを含むベクターｐＧＬ３(Promega)にクロー
ン化されている。

【０１０２】 レポーター構築物２（図５ｃ） − ３×Ｇａｌ４タンパク質(Webster等, Cell 52, 169 (1988))の結合配列[
ヌクレオチド配列: 5×5′-CGGAGTACTGTCCTCCG-3′, SEQ ID NO: 6] − サイクリンＡの基本プロモーター (ヌクレオチド配列−４０〜＋９４；He
nglein等, Proc. Nati Acad. Sci. USA 91, 5490-5494 (1994)) − ルシフェラーゼのｃＤＮＡ(pGL3, Promega) 以下の構築物を対照として用いた。

【０１０３】 レポーター構築物３（図５ｄ） この構築物はレポーター構築物1に相当するが、 ｃｄｃ２５Ｃの基本プロモータ
ー[ヌクレオチド配列−２０〜＋１２１；Lucibello等, EMBO J. 14, 132 (1995)
]の中のＣＤＥエレメントTGGCGGAがTGGCtGAに変異されている。 対照構築物１（図６ａ） Promega製“ｐＧＬ３プロモーター”： 以下の塩基配列をもつ発現系 − ＳＶ４０プロモーター − ルシフェラーゼｃＤＮＡ 対照構築物２（図６ｂ） 以下の塩基配列をもつ発現系 − サイクリンＡプロモーター（−２１４〜＋１００, Henglein等, Proc. Na
tl Acad. Sci. USA 91, 5490-5494 (1994)) − ルシフェラーゼｃＤＮＡ

【０１０４】 対照構築物３（図６ｃ） 以下の塩基配列をもつ発現産物 − ｃｄｃ２５Ｃプロモーター（−２９０〜＋１２１, Lucibello等, EMBO J. 14, 132-142(1995)) − ルシフェラーゼｃＤＮＡ すべてのレポーター構築物と対照構築物をクローン化するために、ｐＧＬ３(P
romega, ルシフェラーゼｃＤＮＡレポーター)をベクターとして用いた。このベ
クターにクローン化されたレポーターエレメントは、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣ
Ｒの手法により増幅した。この目的のために用いたオリゴヌクレオチドは、それ
ぞれの場合で、４ヌクレオチドの突出部(5′-GATC-3′)とそれに続く制限酵素に
よる切断に必要な部位を含む６ヌクレオチド (対照プラスミド１および２とレポ
ータープラスミド１および３については、５′プライマー: BamHI (GGATCC)／３
′プライマー: Hindlll (AAGCTT)、レポータープラスミド２については、５′プ
ライマー Bgl II(AGATCT)／３′プライマー: Hindlll)と、続いて、増幅される
べきプロモーター（括弧の中に示した転写開始に関係する位置で始まっている）
に相補的な２０〜２５ヌクレオチドを含んでいる。括弧の中に示した位置は、引
用文献中で記された配列を参照している。

【０１０５】 ＰＣＲ産物は、ＱｌＡｑｕｉｃｋ^TMスピンカラム(Qiagen)を製造者の取扱説明
書に従って用いて精製し、適切な制限酵素（これらの酵素は市販されている）で
消化し、アガロースゲル電気泳動によって分離した後、再びＱｌＡｑｕｉｃｋ^TM スピンカラムを用いて精製した。 Ｇａｌ４結合部位は、適切な制限酵素切断部位(5′: BamHI/3′: Bgl II)の為
に必要な突出部をもったオリゴヌクレオチドとして合成し、セファデックスＧ２
５(Pharmacia)を用いて精製し、ハイブリダイズさせた。

【０１０６】 続いて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ (Promega)を用いて、消化したＰＣＲ産物とハイ
ブリダイズしたオリゴヌクレオチドを、適当な方法で切断して精製したベクター
につないだ。 ＰＣＲとオリゴヌクレオチドを用いた手法により得られたすべての構築物は、
変異がないことを確かめるために配列決定を行った。

【０１０７】 ｂ）レポーターアッセイ: 一過的トランスフェクション、同調化およびルシフ
ェラーゼアッセイ ａ）にて述べた構築物のプロモーター活性は、内皮細胞に一過的なトランスフ
ェクションまたはコトランスフェクションし、次にルシフェラーゼ活性を測る手
法により決定した。ＢＡＥＣｓ（子牛血管内皮細胞）にＤＥＡＥ／デキストラン
法［Sompayrac等, PNAS 78, 7575 (1981)の変法］により一過的にトランスフェ
クションした。ルシフェラーゼアッセイはLucibello等(EMBO J. 14, 132 (1995)
)により記述された方法に従って行った。

【０１０８】 ３.５cmの培養皿あたり８mgのプラスミドをトランスフェクションした。コト
ランスフェクションの場合には、４＋４μgのプラスミドをトランスフェクショ
ンし、対照の場合には、プラスミドｐＵＣ１９を総量を埋め合わせるために用い
た。細胞周期依存的なプロモーターの活性を測るためには、増殖中の細胞（完全
培地）を４８時間メチオニンを枯渇させることによって細胞周期のＧ１期に休止
させた細胞と比較した。細胞周期によって制御されない（かつ、ＳＶ４０プロモ
ーターを含んでいる）対照構築物１を標準化のために用いた（その活性を１とし
た）。

【０１０９】 ｃ）結果 以下のような結果が得られた（括弧の中に示された測定値は、増殖中の細胞に
おけるルシフェラーゼの比活性（ＳＶ４０プロモーター＝対照構築物１で標準化
された）／Ｇ１の細胞のルシフェラーゼの比活性を示している）。 対照構築物２）および３を）トランスフェクションした内皮細胞中に合成され
るルシフェラーゼの量は、細胞が細胞周期のＧ１期に休止した場合（ＤＮＡ＝２
Ｓ）に比べて、増殖中の場合（ＤＮＡ＞２Ｓ）の方が、著しく多い（対照構築物
３：＞４０×；対照構築物２：＞１５０×）。これらの構築物を本発明の発現系
の対照として使用した。

【０１１０】 レポーター構築物１）および２）をＲＴＡ構築物と共にコトランスフェクショ
ンした場合にも、また、Ｇ１−休止中の内皮細胞に比べて増殖中の細胞において
より高いルシフェラーゼ活性が示された。（レポーター構築物１：５.５×；レ
ポーター構築物２：８.３×）。対照構築物３）とＲＴＡ構築物をコトランスフ
ェクションした場合には、違いが見られなかった（１.０×）。それぞれの場合
において、当該のレポーター構築物のみをトランスフェクションした場合よりも
、ルシフェラーゼ活性は著しく高かった。 このように、内皮細胞における本発明の発現系の明白な細胞周期による制御が
示された。

【０１１１】 実施例２：メラノーマ細胞における、組換え転写因子と共にキメラプロモーター
系を含む発現系の作製と検定 ａ）使用したプラスミドのクローニング 本発明の発現系は以下の構築物にそれぞれ異なるヌクレオチド配列を下流につ
ないだものからなる： ＲＴＡ構築物 ＲＴＡ（組換え転写活性化因子）プラスミドはＧａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン
と転写因子ＮＦ−ＹＡの高−セリン、−スレオニンおよび−グルタミン転写活性
化因子ドメインから構成される融合タンパク質をコードする。 − ＣＭＶ−ＧＮ Ｇａｌ４（Ａｓ １〜１４７），リンカー: ATA GGC CGG GC
C (SEQ ID.NO: 11) ＣＭＶプローモーターおよびエンハンサー（ｐｃＤＮＡ３由来のｎｔｓ２３２
〜８６３、Invitrogen)の支配下にあるｍＮＦ−ＹＡ（Ａｓ １〜２６１＋終止コ
ドン（ＴＡＧ））、ＳＶ４０−ポリＡ（図７ａ） (Li 等、 J. Biol. Chem. 267, 8984-8990 (1992)) − Ｔｙｒ−ＧＮ Ｇａｌ４（Ａｓ １〜１４７）、リンカー：ATA GGC CGG
GCC (SEQ ID NO:11)、チロシナーゼプロモーター(構築物Ｔｙｒ参照)の支配下に
あるｍＮＦ−ＹＡ（Ａｓ １〜２６１＋終止コドン（ＴＡＧ））、ＳＶ４０−ポ
リＡ（図７ｂ）（Li 等、 J. Biol. Chem. 267, 8984-8990 (1992)) − Ｔｙｒ−Ｇ チロシナーゼプロモーターの支配下にあるＧａｌ４−ストッ
プ（Ａｓ １〜１４７＋終止コドン（ＴＡＧ）)、ＳＶ４０−ポリＡ（図７ｃ）

【０１１２】 レポーター構築物 − ５Ｇ２５Ｃ Ｉ）のレポーター構築物１）と同一 − ５Ｇ２５ＣＲＴ７ Ｉ）のレポーター構築物２）と同一 − ８ＧＣｙｃＡ ８×Ｇａｌ４結合部位＋サイクリンＡプロモータ
ー（−４０／＋９４；Henglein 等、 Proc. Nati Acad. Sci. USA 91, 5490-549
4 (1994)）（図８ａ） − ８ＧＣｙｃＡＲＴ７ ８ＧｃｙｃＡと類似，ＣＤＥ（TCGCGGG→TCGCtGG
, Zwicker等、EMBO J. 14: 4514, 1995）を変異している(図８ｂ) Ｇａｌ４ＤＮＡ結合部位：5′-CGGAGTACTGTCCTCCG-3′, SEQ ID NO: 6

【０１１３】 対照構築物 − 基準ｂａｓｉｃ＝“ｐＧＬ３基本配列”（Promega, プロモーターもエン
ハンサーも含まない）(図９ａ) − ＳＶ４０ｐ＝Ｉ）の対照構築物１）と同一の“ｐＧＬ３プロモーター”（
Promega，シミアン・ウィルス４０基本プロモーターを含む）（図６ａ） − Ｔｙｒ チロシナーゼプロモーター：２×遠位エレメント（ＴＤＥ，−２
０１４／−１８１１）および１×近位エレメント（ＴＰＥ，−２０９／＋５１）
（Shibata 等、J. Biol. Chem. 267, 20584 (1992)）、ルシフェラーゼのｃＤＮ
Ａ（ｐＧＬ３，Promega）（図９ｂ） − ｃｄｃ２５Ｃ ｃｄｃ２５Ｃプロモーター（−２９０／＋１２１）（Luci
bello 等、 EMBO J. 14, 132-142 (1995）），ルシフェラーゼのｃＤＮＡ（ｐＧ
Ｌ３，Promega）；Ｉの対照構築物３と同一（図６ｃ） − ｃｙｃＡ サイクリンＡプロモーター（−２１４／＋１００）（Henglein
等、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5490-5494 (1994))、ルシフェラーゼの
ｃＤＮＡ（ｐＧＬ３，Promega）；Ｉの対照構築物２と同一（図６ｂ）

【０１１４】 ｐＧＬ３（Promega，ルシフェラーゼｃＤＮＡレポーター）を、すべてのレポ
ーター構築物および対照構築物のベクターとして用いた。ベクターにクローン化
したプロモーターエレメントはヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ法により増幅した。
この目的のために使用したオリゴヌクレオチドは、それぞれの場合で、４ヌクレ
オチドの突出部（ＧＡＴＣ）とそれに続く制限酵素による切断に必要な部位を含
む６ヌクレオチド（対照プラスミドｃｄｃ２５ＣとｃｙｃＡ、レポータープラス
ミド５Ｇ２５Ｃおよび５Ｇ２５ＣＲＴ７についてはＢａｍＨＩ（GGATCC）／Ｈｉ
ｎｄｌｌｌ（AAGCTT）；ＴＤＥについてはＫｐｎｌ（GGTACC）／Ｎｈｅｌ（GCTA
GC）およびＮｈｅｌ／Ｘｈｏｌ（CTCGAG）、ＴＰＥについてはＸｈｏｌ／Ｂｇｌ
ｌｌ（AGATCT）；レポータープラスミド８ＧｃｙｃＡおよび８ＧＣｙｃＡＲＴ７
についてはＢｇｌ II／ＨｉｎｄIII）と、続いて、増幅されるべきプロモーター
（括弧の中に示した転写開始に関係する位置で始まっている）に相補的な２０〜
２５ヌクレオチドを含んでいる。括弧の中に示した位置は、引用文献中に記され
た配列を参照している。

【０１１５】 ＰＣＲ産物は、QlAquickTM スピンカラム(Qiagen)を製造者の取扱指示書に従
って用いて精製し、適切な制限酵素（これらの酵素は市販されている）で消化し
、アガロースゲル電気泳動によって分離した後、再びQlAquickTMスピンカラムを
用いて精製した。 Ｇａｌ４結合部位は、適切な制限酵素切断部位（Ｋｐｎｌ（上端：５′；下端
：３′）／Ｘｈｏｌ（上端：５′；下端：３′）またはＢａｍＨＩ（上端：５′
；下端：３′）／ＢｇｌII（上端：５′；下端：３′））の為に必要な突出部を
有するオリゴヌクレオチドとして合成し、セファデックスＧ２５（Pharmacia）
を用いて精製し、ハイブリダイズさせた。

【０１１６】 次に、消化したＰＣＲ産物とハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは、適当
な方法で切断し、生成したベクターにＴ４ＤＮＡリガーゼ(Promega)を用いて連
結した。 ＰＣＲおよびオリゴヌクレオチドの使用により得られたすべての構築物は、変
異がないことを確かめるために配列決定を行った。

【０１１７】 ｂ）レポーターアッセイ：一過的トランスフェクション、同調化およびルシフェ
ラーゼアッセイ ａ）にて述べた構築物のプロモーター活性はメラノサイト（ＭｅＷｏ，ヒト）
、繊維芽細胞（３Ｔ３，マウス）および前立腺腫瘍細胞（ＰＣ−３，ヒト）に一
過的にコトランスフェクションし、次にルシフェラーゼ活性を測定する手法によ
って決定した。細胞は、ＤＯＴＡＰ(Boehringer, Mannheim)を製造者の取扱指示
書に従って用いて一過的にトランスフェクションを行った。

【０１１８】 ルシフェラーゼアッセイはLucibello等(EMBOJ., 14, 132(1995))に記載の方法
に従って行った。３.５cmの培養皿あたり１mgのレポーター＋２mgのＲＴＡプラ
スミドを６mlのＤＯＴＡＰと共にトランスフェクションし、対照の場合はＲＴＡ
プラスミドのかわりにｐＵＣ１９プラスミドを用いた。 細胞周期依存的なプロモーター活性を測定するためには、増殖中の細胞（完全
培地）を細胞周期のＧ１期に休止させた細胞と比較した。細胞周期による制御を
受けない構築物ＳＶ４０ｐを標準化のために用いた（その活性を１とした）。
細胞は、メチオニンを６０時間涸渇させることによりトランスフェクションの後
にＧ１期に同調化させた。 細胞タイプ特異的なプロモーター活性を測るためには、様々な細胞タイプのル
シフェラーゼ活性を、普遍的なＳＶ４０プロモーターの測定値（その場合は、Ｓ
Ｖ４０ｐ＝１）を用いて標準化して比較した。

【０１１９】 ｃ）結果 表１に、この系の明白な細胞タイプ特異性を示す：（１）ＳＧＣｙｃＡ構築物
は基本ベクター“ｂａｓｉｃ”の活性の範囲以内の低い活性しか示さない、（２
）ＣＭＶ−ＧＮ構築物のコトランスフェクションは、３細胞株すべてにおいて著
しい活性化を生じる、（３）Ｔｙｒ−ＧＮ構築物のコトランスフェクションは、
Ｇａｌ−ＮＦ−Ｙ融合タンパク質の選択的な発現によって対象の細胞、すなわち
メラノーマ細胞においてのみ、特異的な活性化を引き起こした。（４）Ｔｙｒ−
Ｇ構築物のコトランスフェクションは、非常に弱い活性化しか引き起こさなかっ
た。

【０１２０】 すなわち、（３）での活性化は、ＮＦ−ＹＡトランスアクチベーションドメイ
ンの結果であると考えられる。 ＳＧＣｙｃＡ＋Ｔｙｒ−ＧＮの系の特異性は５８（ＭｅＷｏ：ＰＣ−３の比）
または７３（ＭｅＷｏ：３Ｔ３の比）であり、対象以外の細胞では非常に活性が
低い。 表２の値は、本系の活性が細胞周期により制御されることを確かに示している
： サイクリンＡプロモーターは細胞周期による制御を示し、係数２６（増殖中の
ＭｅＷｏの活性：陽性対照であるＧ１期のＭｅＷｏの活性）で増加している。 ８ＧＣｙｃＡ＋Ｔｙｒ−ＧＮの系は細胞周期による制御を示し、係数２２.５
で増加している（また、従って、サイクリンＡの野生型のプロモーターとほぼ同
程度に高い制御を受けており、増殖中の細胞における活性はほぼ同じである）。

【０１２１】 また、ＣＤＥエレメント（ＲＴ７）の変異はＧ１細胞における著しい活性の増
加を引き起こし、その結果、細胞周期による制御に対しては係数が５に減少して
いる。従って、細胞周期による制御は、Ｇ１における主にＣＤＥ／ＣＨＲ−を介
した抑制（Ｇ１細胞において、ＮＦ−ＹＡによるトランスアクチベーションを抑
制するＣＤＥ／ＣＨＲ−結合リプレッサーによって引き起こされる）に帰因する
と考えられる。ＲＴ７変異体に残っている細胞周期による制御は、同様に低い（
係数４.２）チロシナーゼプロモーターそのものの細胞周期による制御に帰因す
ると考えられる。

【０１２２】 表３および４では、ｃｄｃ２５Ｃ−ＣＤＥ／ＣＨＲエレメントを用いた場合に
、本系が明白な細胞タイプ特異性（係数３.９）だけでなく、細胞周期による制
御（係数８.４）をも示すことを表している。 このように、一例として、ＣＤＥ／ＣＨＲエレメントの上流のＧａｌ４ ＤＮ
Ａ結合部位を介して組織特異的および増殖依存的な両方の様式で組織特異的遺伝
子発現を制御しているＧａｌ−ＮＦ−Ｙ融合タンパク質の組織特異的な発現を示
すことが可能であった。メラノサイト特異的チロシナーゼプロモーターとサイク
リンＡ−ＣＤＥ／ＣＨＲエレメントからなるものを使用した場合には、細胞周期
による制御は係数で＞２０に増加した一方で、細胞タイプ特異性は係数で＞５０
に増加した。増殖中の標的細胞では、この系の活性は野生型サイクリンＡプロモ
ーターの活性におおむね近く、また、増殖中でない対象細胞や対象でない細胞で
は、基本ベクターであるｐＧＬ３ｂａｓｉｃの活性とほとんど等しい。

【０１２３】 実施例３：生体内の実験 本発明のプロモーター系によって得られる転写のレベルが生物学的な効果を得
るのに十分であるかどうかを調べるために、試験管内でのＴＮＦ−α細胞融解ア
ッセイを行った。このアッセイは、ＴＮＦ−α感受性細胞株Ｌ９２９での細胞障
害性効果を測定するもので、媒体として、アクチベーター（Ｔｙｒ−ＧＮ）とエ
フェクター（ＧａｌＣｙｃＡＴＮＦ）構築物をコトランスフェクションしたＭｅ
Ｗｏ細胞を用いて行った。ＧａｌＣｙｃＡＴＮＦを作製するためには、Ｇａｌ・
ＣｙｃＡのルシフェラーゼｃＤＮＡをｐＡＳ３プラスミド(M. Clauss, Max Plan
ck Institut, Bad Nauheim, Germanyより入手した）由来のＴＮＦ−αｃＤＮＡ
に置き換えた。ｐＡＳ３は、pBluescriptII ＳＫベクターのＰｓｔｌ／ＥｃｏＲ
Ｉ制限酵素部位にクローン化したマウスのＴＮＦ−αｃＤＮＡを含んでいる。

【０１２４】 ＴＮＦαの生物学的検定法において実現しうる最も高いトランスフェクション
率を得るために、ＭｅＷｏ細胞は、リポフェクチン（Life Technologies）を製
造者の取扱指示書に従って加えて用いた。１ｇのＧａｌＣｙｃＡＴＮＦと１ｇの
ｐＵＣ１９またはＴｙｒ−ＧＮを１０μlのリポフェクチンと共にＯｐｔｉＭＥ
Ｍ中で混合し、その中で細胞を６時間培養した。

【０１２５】 ＭｅＷｏ細胞は、３つの平行したバッチでＧａｌＣｙｃＡＴＮＦ／ｐＵＣ１９
またはＧａｌＣｙｃＡＴＮＦ／Ｔｙｒ−ＧＮと共にコトランスフェクションした
。トランスフェクション２４時間後、培地を交換し、さらに２４時間後、培地を
回収した。培養上清はＴＮＦαの生物学的検定法で検定し、形質転換マウス繊維
芽細胞株Ｌ９２９でのその細胞傷害性を決定した。そのようなＬ９２９細胞は、
ウェルあたり４×１０４細胞個の密度でマイクロタイタープレートに播種した。
１６時間後、トランスフェクションしていないＭｅＷｏ細胞のならし培地および
トランスフェクションした細胞の上清のマウスＴＮＦαの希釈系列と、各々にア
クチノマイシンＤを最終濃度１μg／mlとなるように添加した。２４時間後、生
存するＬ９２９細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色し、付着した色素
をＥＬＩＳＡリーダーを用いて波長λ＝４５０nmで定量化した。

【０１２６】 トランスフェクション４８時間後、細胞融解は、およそ６０％であった（上清
の〜１.０ng／ml ＴＮＦαに相当する）。対照的に、ＧａｌＣｙｃＡＴＮＦエフ
ェクター構築物のみを用いてトランスフェクションした細胞の上清では死細胞は
ごくわずかな比率（＜２％）であることが示された。これらの結果は、本発明の
プロモーター系により達成される転写率が顕著な生物学的効果を達成するのに適
することを示している。

【０１２７】

【表４】

【０１２８】

【表５】

【０１２９】

【表６】

【０１３０】

【表７】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の核酸構築物である。

【図２−Ｉ】 本発明の核酸構築物である。

【図２−II】 本発明の核酸構築物である。

【図３】 本発明の核酸構築物である。

【図４】 本発明の核酸構築物である。

【図５ａ】 ＩにおけるＲＴＡ構築物の概略図である。

【図５ｂ】 Ｉにおけるレポーター構築物の概略図である。

【図５ｃ】 Ｉにおけるレポーター構築物の概略図である。

【図５ｄ】 Ｉにおけるレポーター構築物の概略図である。

【図６ａ】 Ｉにおける対照の構築物の概略図である。

【図６ｂ】 Ｉにおける対照の構築物の概略図である。

【図６ｃ】 Ｉにおける対照の構築物の概略図である。

【図７ａ】 IIにおけるＲＴＡ構築物であり、ベクターの骨格はｐＧＬ３（Promega）に由
来する。

【図７ｂ】 IIにおけるＲＴＡ構築物であり、ベクターの骨格はｐＧＬ３（Promega）に由
来する。

【図７ｃ】 IIにおけるＲＴＡ構築物であり、ベクターの骨格はｐＧＬ３（Promega）に由
来する。

【図８ａ】 IIにおけるＲＴＡレポーター構築物の概略図である。

【図８ｂ】 IIにおけるＲＴＡレポーター構築物の概略図である。

【図９ａ】 IIにおける対照の構築物の概略図である。

【図９ｂ】 IIにおける対照の構築物の概略図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 ハンス−ハーラルト・ゼドラツェク ドイツ連邦共和国デー−35041マールブル ク．ゾネンハング３ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA02 DA02 EA04 FA01 FA02 FA06 GA11 HA17 4B063 QA01 QA05 QQ08 QQ13 QQ22 QR33 QR55 QR77 QR80 QS24 QS25 QS34 QS36 QS38 QX01 QX02

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の構成部分： −構成部分ａ）：少なくとも１つのプロモーター −構成部分ｂ）：少なくとも１つの組換えトランス活性化因子をコードするＤ
   ＮＡであって、その発現が構成部分ａ）により活性化され、そして次のもの： ・構成部分ｂ１）：ＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ ・構成部分ｂ２）：グルタミン、セリンおよびトレオニンに富むトランス活性
   化ドメインをコードするＤＮＡ からなるもの −構成部分ｃ）：構成部分ｂ）の発現産物に結合する少なくとも１つのＤＮＡ
   配列 −構成部分ｄ）：ＣＤＥ−ＣＨＲエレメントまたはＥ２ＦＢＳ−ＣＨＲエレメ
   ントを含み、その５′−末端が構成部分ｃ）の３′−末端に結合される、少なく
   とも１つの最小プロモーター −構成部分ｅ）：少なくとも１つのエフェクター遺伝子であって、その転写が
   構成部分ｃ）に結合する構成部分ｂ）の発現産物により活性化されるもの からなる核酸構築物。
2. 【請求項２】 少なくとも１つの構成部分ｃ）が、構成部分ａ）の５′−末
   端に結合され、その発現系が自己増幅性である請求項１に記載の核酸構築物。
3. 【請求項３】 核酸構築物が −構成部分ｂ１）が、カップリング物質ｆ）に結合するタンパク質Ａをコード
   する構成部分ｂ３）に連結され、 −構成部分ｂ２）が、カップリング物質ｆ）に結合するタンパク質Ｂをコード
   する構成部分ｂ４）に連結され、 −カップリング物質ｆ）が、構成部分ｂ１）、ｂ３）、ｂ４）およびｂ２）の
   発現産物と関連し、作動的組換えトランス活性化因子を与える 構成部分ｂ′）を含む請求項１または２に記載の核酸構築物。
4. 【請求項４】 構成部分ｂ１）およびｂ２）が細胞性制御タンパク質に結合
   する少なくとも１つの結合タンパク質をコードする構成部分ｂ５）に連結され、
   細胞性制御タンパク質の対応する結合タンパク質への結合が、構成部分ｂ″）に
   より発現されるトランス活性化因子の機能を阻害するものである、構成部分ｂ″
   ）を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸構築物。
5. 【請求項５】 複数の同じかまたは異なるエフェクター遺伝子［構成部分ｅ
   ）、ｅ′）、ｅ″）］が、互いにＩＲＥＳ配列または構成部分ｃ）およびｄ）で
   構成される活性化配列により連結されている、請求項１〜４のいずれか１項に記
   載の核酸構築物。
6. 【請求項６】 核局在化シグナルが構成部分ｂ）、ｂ′）またはｂ″）に結
   合されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸構築物。
7. 【請求項７】 構成部分ａ）に存在するプロモーターが、 −ＲＮＡポリメラーゼIIIのプロモーターまたはＲＮＡポリメラーゼIIのプロ
   モーター、ＣＭＶプロモーターおよびエンハンサー、ＳＶ４０プロモーターから
   なる群から選択される非特異的プロモーター配列、 −ＨＢＶ，ＨＣＶ，ＨＳＶ，ＨＰＶ，ＥＢＶ，ＨＴＬＶ，ＨＩＶの配列からな
   る群から選択されるウィルスプロモーターおよびアクチベーター配列、 −ｃｄｃ２５Ｃ、サイクリンＡ、ｃｄｃ２（ｃｄｋ−１）、Ｂｍｙｂ、ＤＨＦ
   Ｒ、Ｅ２Ｆ−１遺伝子の配列、またはＭｙｃ Ｅボックスの単結合体もしくは
   多重結合体などの細胞増殖依存的様式で生じるかまたは活性化されるその転写因
   子の結合配列からなる群から選択される細胞周期特異的活性化プロモーター配列
   、 −内皮細胞、結合組織細胞、筋肉細胞、グリア細胞、造血細胞、リンパ球、マ
   クロファージ、滑膜細胞、白血病細胞または腫瘍細胞、消化管粘膜の細胞、腎臓
   の細胞、呼吸器の細胞、生殖器の細胞および尿路下部の細胞において細胞特異的
   に活性化されうるプロモーターからなる群から選択される細胞特異的活性化プロ
   モーター、 −低酸素症誘導エンハンサー配列からなる群から選択される代謝性活性化プロ
   モーター、 からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸構築物。
8. 【請求項８】 構成部分ｂ１）が、Ｇａｌ４タンパク質、ＬｅｘＡタンパク
   質、ｌａｃリプレッサータンパク質、テトラサイクリンリプレッサータンパク質
   またはＺＦＨＤ１タンパク質に由来するＤＮＡ結合ドメインからなる群から選択
   される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸構築物。
9. 【請求項９】 構成部分ｂ２）が、全体で少なくとも２０×グルタミン、１
   ０×セリンおよび１０×トレオニンを含むトランス活性化ドメインの中から選択
   される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸構築物。
10. 【請求項１０】 構成部分ｂ２）がＯｃｔ−２、ＳＰ１およびＮＦＹ−１の
    トランス活性化ドメインからなる群から選択される請求項９に記載の核酸構築物
    。
11. 【請求項１１】 構成部分ｂ３）またはｂ４）において、カップリング構造
    ｆ）と結合するタンパク質ＡおよびＢの少なくとも１つが組換え抗体または組換
    え抗体断片である、請求項３〜１０のいずれか１項に記載の核酸構築物。
12. 【請求項１２】 カップリング物質ｆ）と結合するタンパク質ＡおよびＢの
    少なくとも１つが、短いペプチド配列により共有結合した可変鎖と軽鎖を含む一
    本鎖Ｆｖ断片である、請求項１１に記載の核酸構築物。
13. 【請求項１３】 カップリング物質ｆ）と結合するタンパク質ＡおよびＢの
    少なくとも１つが、当該構成部分ｆ）に対する天然に生じた結合タンパク質の結
    合ドメインを構成する、請求項３〜１２のいずれか１項に記載の核酸構築物。
14. 【請求項１４】 カップリング物質ｆ）が薬剤である請求項３〜１３のいず
    れか１項に記載の核酸構築物。
15. 【請求項１５】 カップリング物質ｆ）が細胞膜を通じて細胞に浸透可能な
    物質である、請求項３〜１３のいずれか１項に記載の核酸構築物。
16. 【請求項１６】 カップリング物質ｆ）が、ラパマイシン、ＦＫ５０６、サ
    イクロスポリンＡ、メトトレキサート、葉酸、レチノイン酸、ペニシリン、４−
    ヒドロキシ−タモキシフェン、タモキシフェン、テトラサイクリンまたはテトラ
    サイクリン／イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドコンジュゲートからなる
    群から選択される請求項１４または１５に記載の核酸構築物。
17. 【請求項１７】 細胞性制御タンパク質に対する結合配列［構成部分ｂ５）
    ］が細胞性結合タンパク質またはこの結合タンパク質の部分である、請求項４〜
    １６のいずれか１項に記載の核酸構築物。
18. 【請求項１８】 細胞性結合タンパク質または前記結合タンパク質の部分が
    、ｐ５３、ｐＲｂ、ｐ１３０、Ｍａｘ、ＭＡＤ、ＶＨＬ、ｃｄｋ−４、ＭＴＳ−
    １（ｐ１６）、ＷＴ−１、ＳＭＡＤ−２、ＤＰＣ−４からなる群から選択される
    細胞性制御タンパク質に結合する、請求項１７に記載の核酸構築物。
19. 【請求項１９】 構成部分ｂ５）が、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ３、Ｅ２
    Ｆ４、Ｅ２Ｆ５、サイクリンＤ１、サイクリンＤ２、サイクリンＤ３またはサイ
    クリンＣ、サイクリンＡ、サイクリンＥ、Ｍｙｃ、転写因子ＰＵ.１またはＥｌ
    ｆ−１、エロジンＢ、エロジンＣ、ｐ１４、ｐ１５、ｐ１６、ｐ１８、ｐ２１、
    ｐ２７、ｐ５３、Ｍｙｃ、ｃｄｋ−４、ＤＰＣ−４およびＳＭＡＤ−２からなる
    細胞性結合タンパク質の群から選択される、請求項１７に記載の核酸構築物。
20. 【請求項２０】 細胞性制御タンパク質に対する結合配列［構成部分ｂ５）
    ］がウィルス性結合タンパク質または前記結合タンパク質の部分である、請求項
    １７に記載の核酸構築物。
21. 【請求項２１】 ウィルス性結合タンパク質または前記結合タンパク質の部
    分が、ｐ５３、ｐＲｂ（ｐ１１０）、ＮＦＫＢ、ｐ１３０、ＣＢＦ−１、ｌｙｎ
    チロシンキナーゼ、ｂａｋおよびｂａｘからなる群から選択される細胞性制御タ
    ンパク質に結合する、請求項２０に記載の核酸構築物。
22. 【請求項２２】 構成部分ｂ５）は、ＣＭＶのＩＥ８４、ＡＶのＥ１Ｂ（５
    ５ｋＤ）、ＥＢＶのＥＢＮＡ−５、ＥＢＶのＢＨＦＲ、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ
    １８のＥ６、ＨＢＶのｘタンパク質、ＳＶ４０のＴ抗原、ＡＶのＥ１Ａ、ＥＢＶ
    のＥＢＮＡ−２、ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＨＰＶのＥ７、ＨＩＶのＴａｘ、ＥＢ
    ＶのＬＭＰ−１、ＥＢＶのＬＭＰ−２ＡまたはＬＭＰ−２Ｂ、ＡＶのＥ１Ｂ（１
    ６ｋＤ）、ＡＶのＥ１Ｂ（１０ｋＤ）からなるウィルス性結合タンパク質の群か
    ら選択される、請求項２０に記載の核酸構築物。
23. 【請求項２３】 細胞性制御タンパク質に対する結合配列［構成部分ｂ５）
    ］が抗体または前記抗体の部分である、請求項４に記載の核酸構築物。
24. 【請求項２４】 結合性の構成部分ｂ）、ｂ′）またはｂ″）に対するＤＮ
    Ａ配列［構成部分ｃ）］が、Ｇａｌ４タンパク質に対する結合性配列、ＬｅｘＡ
    タンパク質に対する結合配列、ＬａｃＩリプレッサータンパク質に対する結合配
    列、テトラサイクリンのオペレーターに対する結合配列およびＺＦＨＤ−１タン
    パク質に対する結合配列からなる群から選択される、請求項１〜２３のいずれか
    １項に記載の核酸構築物。
25. 【請求項２５】 ＣＤＥ−ＣＨＲを含む最小プロモーター［構成部分ｄ）］
    が、ｃｄｃ２５Ｃ遺伝子、ｃｄｃ２（ｃｄｋ−１）遺伝子およびサイクリンＡ遺
    伝子からなる群から選択される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の核酸構
    築物。
26. 【請求項２６】 Ｅ２ＦＢＳ−ＣＨＲを含む最小プロモーター［構成部分ｄ
    ）］がＢｍｙｂ遺伝子から得られる、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の核
    酸構築物。
27. 【請求項２７】 エフェクター遺伝子（構成部分ｃ）が、サイトカイン、ケ
    モカインまたは増殖因子、抗増殖作用、細胞増殖抑制作用もしくはアポトーシス
    作用を有するタンパク質、炎症性または免疫抑制性タンパク質、抗体、抗体断片
    、血管形成阻害剤、ペプチドホルモン、血液凝固因子、血液凝固阻害剤、繊溶性
    タンパク質、血液循環において有効なペプチドもしくはタンパク質、血漿タンパ
    ク質、病原体、細胞もしくは腫瘍の抗原、免疫応答を引き起こす選択された抗原
    からなる群から選択される活性物質をコードする遺伝子である、請求項１〜２０
    のいずれか１項に記載の核酸構築物。
28. 【請求項２８】 エフェクター遺伝子が、プロドラッグをドラッグに開裂さ
    せる酵素をコードする遺伝子である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の核
    酸構築物。
29. 【請求項２９】 エフェクター遺伝子が、リガンド／活性物質融合タンパク
    質、またはリガンド／酵素融合タンパク質をコードする遺伝子であり、リガンド
    がサイトカイン、増殖因子、抗体、抗体断片、ペプチドホルモン、仲介体［medi
    ator］および細胞接着分子からなる群から選択される、請求項１〜２６のいずれ
    か１項に記載の核酸構築物。
30. 【請求項３０】 核酸がＤＮＡである、請求項１〜２９のいずれか１項に記
    載の核酸構築物。
31. 【請求項３１】 核酸構築物がベクター中に挿入される、請求項１〜３０の
    いずれか１項に記載の核酸構築物。
32. 【請求項３２】 プラスミドベクターである、請求項３０に記載の核酸構築
    物。
33. 【請求項３３】 ウィルス性ベクターである、請求項３２に記載の核酸構築
    物。
34. 【請求項３４】 疾患を予防または治療するために外用に、経口的に、静脈
    注射で、経鼻的に、気管支内にもしくは消化管内に投与されるか、または器官、
    体腔、筋肉系、皮下もしくは血液循環系に注射される、請求項１〜３３のいずれ
    か１項に記載の核酸構築物。
35. 【請求項３５】 請求項１〜３３のいずれか１項に記載の核酸構築物を含む
    単離細胞。
36. 【請求項３６】 細胞が、内皮細胞、リンパ球、マクロファージ、造血細胞
    、繊維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞、腎細胞、消化管、呼吸器系、下部尿管、生殖
    器官、皮膚の上皮細胞、グリア細胞、神経系の細胞、腫瘍細胞および白血病細胞
    からなる群から選択される、請求項３５に記載の単離細胞。
37. 【請求項３７】 感染、腫瘍、白血病、自己免疫疾患、アレルギー、種々の
    関節炎、炎症、組織拒絶、移植片対宿主反応、血液凝固疾患、循環器系疾患、貧
    血、ホルモン疾患およびＣＮＳ対する損傷からなる群から選択される疾患の治療
    薬の製造のための請求項１〜３４のいずれか１項に記載の核酸構築物または請求
    項３３に記載の細胞の使用。
38. 【請求項３８】 個々の構成部分を段階的に連結させる、請求項１〜３７の
    いずれか１項に記載の核酸構築物の製造方法。
39. 【請求項３９】 疾患を予防または治療するために少なくとも１つの細胞を
    外用に、静脈注射で、経鼻的に、気管支内に、経口的に、もしくは消化管内に投
    与するか、または器官、体腔、筋肉系、皮下もしくは血液循環系に注射する、請
    求項３２に記載の疾患の治療用の医薬の製造のための請求項３５または３６に記
    載の細胞の使用。