CN110582574A - 合成启动子 - Google Patents
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Abstract
本公开内容的一些方面提供了在某些病变细胞(例如癌细胞)和正常细胞(例如非癌细胞)之间差异调节的合成启动子。这些合成启动子可用于例如病变细胞中治疗性分子的靶向表达。
Description
相关申请
本申请依据35U.S.C.§119(e)要求于2017年3月13日提交的美国临时申请号62/470,754的权益，其通过引用整体并入本文。
序列表
作为2017年2月8日创建、名为“M065670406WUS 00-SEQ-HJD.txt”的ASCII文本文件提交的并且大小为4.67MB的序列表通过引用并入本文。
背景技术
靶向治疗可用于治疗多种不同的疾病。基因表达的细胞类型特异性和/或细胞状态特异性控制使得例如能够将治疗性蛋白质靶向递送至病变细胞(例如癌细胞)而不会不利地影响健康的非病变细胞。
发明概述
本公开内容的一些方面提供了在不同细胞类型和/或不同细胞状态中具有差异活性的合成启动子。合成启动子可用于驱动特定细胞类型中或特定细胞状态期间目的基因的表达。在一些实施方案中，合成启动子用于诊断目的，以驱动特定细胞类型中或特定细胞状态下可检测分子(例如荧光蛋白，例如GFP)的表达。在一些实施方案中，合成启动子用于治疗目的，以驱动特定细胞类型(例如癌细胞)中或特定细胞状态期间治疗性分子(例如蛋白质，例如抗体，或核酸，例如siRNA)的表达。
因此，本文中提供了包含启动子的工程化核酸，所述启动子包含以下共有序列：TFBS-AGA-TFBS-TCG-TFBS-GAC-TFBS-CTA-TFBS-ACT-TFBS-TGC-TFBS-GTA-TFBS，其中TFBS是表5的转录因子结合位点序列。在一些实施方案中，相对于健康细胞，在病变细胞中启动子的活性提高。在一些实施方案中，相对于健康细胞，在病变细胞中启动子的活性降低。
在一些实施方案中，病变细胞选自乳腺癌细胞、结肠癌细胞和卵巢癌细胞。
在一些实施方案中，启动子与编码治疗性蛋白质的核苷酸序列可操作地连接。
在一些实施方案中，转录因子结合位点序列包含以下序列：CCACGTGC(SEQ ID NO：12265)。在一些实施方案中，启动子包含以下序列：
在一些实施方案中，转录因子结合位点序列包含以下序列：TGCTGAGTCAGCA(SEQID NO：12267)。在一些实施方案中，启动子包含以下序列：
本文中还提供了包含本文中所述的工程化核酸的细胞。
本文中还提供了包含本文中所述的工程化核酸的病毒，例如慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和/或溶瘤病毒。在一些实施方案中，溶瘤病毒是溶瘤单纯疱疹病毒。
本公开内容还提供了向细胞递送本文中所述的工程化核酸或溶瘤病毒的方法，所述细胞任选地在对象中。
在一些实施方案中，工程化核酸包含启动子，所述启动子包含由SEQ ID NO：1至12263中任一个所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，相对于健康细胞，在病变细胞(例如，卵巢癌细胞或乳腺癌细胞)中启动子的活性提高。在一些实施方案中，相对于健康细胞，在病变细胞中启动子的活性降低。SEQ ID NO：1至12263包含序列ATCATCTCACCTTGCCTCCTG(SEQ ID NO：12264)，用于直接从启动子文库扩增目的启动子。应理解，在一些实施方案中，“包含由SEQ ID NO：1至12263中任一个所示的核苷酸序列的启动子”不包含5’SEQ ID NO：12264。因此，SEQ ID NO：12264可从SEQ ID NO：1至12263中的任一个排除。
本文中还提供了包含工程化核酸的细胞，所述工程化核酸包含具有由SEQ ID NO：1至12263中任一个所示的核苷酸序列的合成启动子。
本公开内容还提供了向细胞递送或向对象递送(例如直接或通过细胞)工程化核酸，所述工程化核酸包含具有由SEQ ID NO：1至12263中任一个所示的核苷酸序列的合成启动子。
Nissim，L.等，Cell 2017；171：1138-1150的全部公开内容通过引用并入本文。
附图简述
附图并非旨在按比例绘制。为清楚起见，并非每个组件在每个附图中都会标记。
图1是示出了四种不同细胞系HCT、MDA-453、MCF-7和MCF-10A中合成启动子的活性的图。
图2是示出了八种不同细胞系OVCAR8、MDA-453、MDA-231、HCT、aHDF、CCD、12A和10A中合成启动子的活性的图。
图3是示出了四种细胞系OVCAR8、IOSE385、IOSE386和IOSE120中合成启动子的活性的图。
图4是示出了八种不同细胞系OVCAR8、IOSE385、IOSE386、IOSE120、aHDF、CCD、12A、10A、HEK和NB508中合成启动子的活性的图。
图5是示出了四种不同细胞系OVCAR8、HEK293T、NB508和4T1中合成启动子的活性的图。
图6是示出了八种不同细胞系OVCAR8、IOSE385、IOSE386、IOSE120、aHDF、CCD、MCF10A和MCF12A中合成启动子的活性的图。
图7是示出了四种不同细胞系OVCAR8、IOSE386、IOSE120、12A和10A中合成启动子的活性的图。
图8是示出了三种不同细胞系NB508、4T1和OVCAR8中合成启动子的活性的图。
图9是示出了两种不同细胞系10A和MDA中合成启动子的活性的图。
图10是示出了两种不同细胞系10A和MDA中合成启动子的活性的图。
发明详述
本文中提供了相对于健康(正常)、非病变细胞类型在多种病变细胞类型中差异调节的合成启动子。这些合成启动子可用于选择的细胞类型(例如癌细胞或另一些病变细胞)中目的分子/产物(例如治疗和/或诊断分子)的靶向表达。
合成启动子
“启动子”是指核酸序列的控制区域，核酸序列的其余部分的转录的起始和速率在此被控制。启动子调节(例如激活或抑制)其可操作连接的核酸序列的表达或转录。启动子还可包含在此调节蛋白和调节分子(例如RNA聚合酶和其他转录因子)可结合的子区域。启动子可以是组成型的、诱导型的、激活型的、阻遏型的、组织特异性的、细胞类型特异性的、细胞状态特异性的、或其任意组合。
本公开内容的启动子是合成启动子。合成启动子是非“天然存在的”启动子。本公开内容的合成启动子可以合成地产生(例如通过化学合成)、或使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR))产生(参见美国专利号4,683,202和美国专利号5,928,906)。
在一些实施方案中，合成启动子可以是10-300个核苷酸长。例如，合成启动子的长度可以是10-300、10-290、10-280、10-270、10-260、10-250、10-240、10-230、10-220、10-210、10-210、10-200、10-190、10-180、10-170、10-160、10-150、10-140、10-130、10-120、10-110、10-100、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、20-300、20-290、20-280、20-270、20-260、20-250、20-240、20-230、20-220、20-210、20-210、20-200、20-190、20-180、20-170、20-160、20-150、20-140、20-130、20-120、20-110、20-100、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、20-30、30-300、30-290、30-280、30-270、30-260、30-250、30-240、30-230、30-220、30-210、30-210、30-200、30-190、30-180、30-170、30-160、30-150、30-140、30-130、30-120、30-110、30-100、30-90、30-80、30-70、30-60、30-50、30-40、40-300、40-290、40-280、40-270、40-260、40-250、40-240、40-230、40-220、40-210、40-210、40-200、40-190、40-180、40-170、40-160、40-150、40-140、40-130、40-120、40-110、40-100、40-90、40-80、40-70、40-60、40-50、50-300、50-290、50-280、50-270、50-260、50-250、50-240、50-230、50-220、50-210、50-210、50-200、50-190、50-180、50-170、50-160、50-150、50-140、50-130、50-120、50-110、50-100、50-90、50-80、50-70、50-60、60-300、60-290、60-280、60-270、60-260、60-250、60-240、60-230、60-220、60-210、60-210、60-200、60-190、60-180、60-170、60-160、60-150、60-140、60-130、60-120、60-110、60-100、60-90、60-80、60-70、70-300、70-290、70-280、70-270、70-260、70-250、70-240、70-230、70-220、70-210、70-210、70-200、70-190、70-180、70-170、70-160、70-150、70-140、70-130、70-120、70-110、70-100、70-90、70-80、80-300、80-290、80-280、80-270、80-260、80-250、80-240、80-230、80-220、80-210、80-210、80-200、80-190、80-180、80-170、80-160、80-150、80-140、80-130、80-120、80-110、80-100、80-90、90-300、90-290、90-280、90-270、90-260、90-250、90-240、90-230、90-220、90-210、90-210、90-200、90-190、90-180、90-170、90-160、90-150、90-140、90-130、90-120、90-110、90-100、100-300、100-290、100-280、100-270、100-260、100-250、100-240、100-230、100-220、100-210、100-210、100-200、100-190、100-180、100-170、100-160、100-150、100-140、100-130、100-120、100-110、110-300、110-290、110-280、110-270、110-260、110-250、110-240、110-230、110-220、110-210、110-210、110-200、110-190、110-180、110-170、110-160、110-150、110-140、110-130、110-120、120-300、120-290、120-280、120-270、120-260、120-250、120-240、120-230、120-220、120-210、120-210、120-200、120-190、120-180、120-170、120-160、120-150、120-140、120-130、130-300、130-290、130-280、130-270、130-260、130-250、130-240、130-230、130-220、130-210、130-210、130-200、130-190、130-180、130-170、130-160、130-150、130-140、140-300、140-290、140-280、140-270、140-260、140-250、140-240、140-230、140-220、140-210、140-210、140-200、140-190、140-180、140-170、140-160、140-150、150-300、150-290、150-280、150-270、150-260、150-250、150-240、150-230、150-220、150-210、150-210、150-200、150-190、150-180、150-170、150-160、160-300、160-290、160-280、160-270、160-260、160-250、160-240、160-230、160-220、160-210、160-210、160-200、160-190、160-180、160-170、170-300、170-290、170-280、170-270、170-260、170-250、170-240、170-230、170-220、170-210、170-210、170-200、170-190、170-180、180-300、180-290、180-280、180-270、180-260、180-250、180-240、180-230、180-220、180-210、180-210、180-200、180-190、190-300、190-290、190-280、190-270、190-260、190-250、190-240、190-230、190-220、190-210、190-210、190-200、200-300、200-290、200-280、200-270、200-260、200-250、200-240、200-230、200-220、200-210、200-210、210-300、210-290、210-280、210-270、210-260、210-250、210-240、210-230、210-220、220-300、220-290、220-280、220-270、220-260、220-250、220-240、220-230、230-300、230-290、230-280、230-270、230-260、230-250、230-240、240-300、240-290、240-280、240-270、240-260、240-250、250-300、250-290、250-280、250-270、250-260、260-300、260-290、260-280、260-270、270-300、270-290、270-280、280-300、280-290或290-300个核苷酸。在一些实施方案中，启动子可以长于300个核苷酸。在一些实施方案中，合成启动子可以长于300个核苷酸(例如300、350、400、450或500个核苷酸长或更长)。
在一些实施方案中，合成启动子的长度为200个核苷酸或更短。在一些实施方案中，合成启动子可以是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200个核苷酸长。
在一些实施方案中，合成启动子包含由SEQ ID NO：1至12263(具有或不具有由SEQID NO：12264所示的5’序列)中任一个所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，合成启动子包含与由SEQ ID NO：1至12263(具有或不具有由SEQ ID NO：12264所示的5’序列)中任一个所示的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列，并且能够调节其可操作地连接的序列的表达(例如激活或抑制)。例如，合成启动子可包含与由SEQ ID NO：1至12263(具有或不具有由SEQ ID NO：12264所示的5’序列)中任一个所示的核苷酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性的核苷酸序列，并且能够调节其可操作地连接的序列的表达(例如激活或抑制)。在一些实施方案中，合成启动子包含与由SEQ ID NO：1至12263(具有或不具有由SEQ ID NO：12264所示的5’序列)中任一个所示的核苷酸序列具有95-99％同一性的核苷酸序列，并且能够调节其可操作地连接的序列的表达(例如激活或抑制)。在一些实施方案中，合成启动子包含与由SEQ ID NO：1至12263(具有或不具有由SEQ ID NO：12264所示的5’序列)中任一个所示的核苷酸序列具有95％-99％、95％-98％、95％-97％、95％-96％、96％-99％、96％-98％、96％-97％、97％-99％、97％-98％或98％-99％同一性的核苷酸序列，并且能够调节其可操作地连接的序列的表达(例如激活或抑制)。在一些实施方案中，合成启动子可包含与由SEQ ID NO：1至12263(具有或不具有由SEQ ID NO：12264所示的5’序列)中任一个所示的核苷酸序列具有95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性的核苷酸序列，并且能够调节其可操作地连接的序列的表达(例如激活或抑制)。
本公开内容的另一些方面提供了在不同细胞系或不同细胞状态中具有差异活性的合成启动子。“具有差异活性”意指合成启动子的活性在一种细胞类型中或细胞状态下比在不同的细胞类型中或不同的细胞状态下分别地更高或更低。在一些实施方案中，在一种细胞类型或细胞状态中合成启动子的活性至少10％(例如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、500倍或1000倍)的不同于(更高或更低)在另一细胞类型或另一细胞状态中合成启动子的活性。在一些实施方案中，在一种细胞类型或细胞状态中合成启动子的活性10％-100％的不同于(更高或更低)在另一细胞类型或另一细胞状态中合成启动子的活性。例如，在一种细胞类型或细胞状态中合成启动子的活性可10％-100％、10％-90％、10％-80％、10％-70％、10％-60％、10％-50％、10％-40％、10％-30％、10％-20％、20％-100％、20％-90％、20％-80％、20％-70％、20％-60％、20％-50％、20％-40％、20％-30％、30％-100％、30％-90％、30％-80％、30％-70％、30％-60％、30％-50％、30％-40％、40％-100％、40％-90％、40％-80％、40％-70％、40％-60％、40％-50％、50％-100％、50％-90％、50％-80％、50％-70％、50％-60％、60％-100％、60％-90％、60％-80％、60％-70％、70％-100％、70％-90％、70％-80％、80％-100％、80％-90％或90％-100％的不同于(更高或更低)在另一细胞类型或另一细胞状态中合成启动子的活性。在一些实施方案中，在一种细胞类型或细胞状态中合成启动子的活性1-1000倍的不同于(更高或更低)在另一细胞类型或另一细胞状态中合成启动子的活性。例如，在一种细胞类型或细胞状态中合成启动子的活性可1-1000、1-900、1-800、1-700、1-600、1-500、1-400、1-300、1-200、1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-40、1-30、1-20、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、5-1000、5-900、5-800、5-700、5-600、5-500、5-400、5-300、5-200、5-100、5-90、5-80、5-70、5-60、5-50、5-40、5-30、5-20、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、10-1000、10-900、10-800、10-700、10-600、10-500、10-400、10-300、10-200、10-100、10-90、10-80、10-70、10-60、10-50、10-40、10-30、10-20、20-1000、20-900、20-800、20-700、20-600、20-500、20-400、20-300、20-200、20-100、20-90、20-80、20-70、20-60、20-50、20-40、20-30、30-1000、30-900、30-800、30-700、30-600、30-500、30-400、30-300、30-200、30-100、30-90、30-80、30-70、30-60、30-50、30-40、40-1000、40-900、40-800、40-700、40-600、40-500、40-400、40-300、40-200、40-100、40-90、40-80、40-70、40-60、40-50、50-1000、50-900、50-800、50-700、50-600、50-500、50-400、50-300、50-200、50-100、50-90、50-80、50-70、50-60、60-1000、60-900、60-800、60-700、60-600、60-500、60-400、60-300、60-200、60-100、60-90、60-80、60-70、70-1000、70-900、70-800、70-700、70-600、70-500、70-400、70-300、70-200、70-100、70-90、70-80、80-1000、80-900、80-800、80-700、80-600、80-500、80-400、80-300、80-200、80-100、80-90、90-1000、90-900、90-800、90-700、90-600、90-500、90-400、90-300、90-200、90-100、100-1000、100-900、100-800、100-700、100-600、100-500、100-400、100-300、100-200、200-1000、200-900、200-800、200-700、200-600、200-500、200-400、200-300、300-1000、300-900、300-800、300-700、300-600、300-500、300-400、400-1000、400-900、400-800、400-700、400-600、400-500、500-1000、500-900、500-800、500-700、500-600、600-1000、600-900、600-800、600-700、700-1000、700-900、700-800、800-1000、800-900或900-1000倍的不同于(高于或低于)在另一细胞类型或另一细胞状态中合成启动子的活性。在一些实施方案中，在一种细胞类型或细胞状态中合成启动子的活性可10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、500倍或1000倍的不同于(高于或低于)在另一细胞类型或另一细胞状态中合成启动子的活性。在一些实施方案中，合成启动子可在一种细胞类型中是无活性的，而在另一细胞类型中是有活性的。在一些实施方案中，合成启动子可在一种细胞状态中是无活性的，而在另一细胞状态中是有活性的。测量启动子(例如合成启动子)的活性的方法是本领域技术人员已知的，例如，如Jeyaseelan等，Nucleic AcidsResearch.29(12)，2001；Allard等，Cell Notes(21)，2008和Zaslaver等，NatureMethods.3(8)：623-628，2006(其各自通过引用并入本文)中所述的。
在一些实施方案中，相对于健康细胞或另一类型的病变细胞，在一种类型的病变细胞中合成启动子具有不同的活性(更高或更低)。“病变细胞”是指与特定疾病或病症相关的异常细胞。病变细胞的一些非限制性实例包括：癌细胞、病变神经元、病变心肌细胞、病变皮肤细胞、病变肝细胞、病变免疫细胞、病变上皮细胞、病变眼细胞、病变星形胶质细胞、病变小胶质细胞和病变干细胞。本文中涵盖了其他病变细胞类型。本领域技术人员能够鉴定病变细胞。“健康”细胞，也称为“非病变细胞”，是指与任何疾病或病症无关的正常细胞。
在一些实施方案中，相对于另一细胞状态，在一种细胞状态下合成启动子具有不同的活性(例如更高或更低)。可在不同细胞状态之间转换的不同细胞类型的一些非限制性实例包括：胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞、神经元、心肌细胞、皮肤细胞、肝细胞、免疫细胞、上皮细胞、眼细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞。
在一些实施方案中，本文中提供的合成启动子仅在癌细胞中有活性或在癌细胞中具有更高的活性。例如，本文中提供的合成启动子可仅在乳腺癌细胞中有活性并且在非乳腺癌细胞中保持无活性，或者相比于在健康细胞或非乳腺癌细胞中，在乳腺癌细胞中具有更高的活性。作为另一实例，本文中提供的合成启动子可仅在肿瘤癌细胞中有活性并且在循环癌细胞中保持无活性，或者相比于循环癌细胞在肿瘤癌细胞中具有更高的活性。
在一些实施方案中，相对于健康细胞或相对于其他类型的癌细胞，在乳腺癌细胞中合成启动子具有更高的活性。
在一些实施方案中，相对于健康细胞或相对于其他类型的癌细胞，在卵巢癌细胞中合成启动子具有更高的活性。
在一些实施方案中，相对于健康细胞或相对于其他类型的癌细胞，在结直肠癌细胞中合成启动子具有更高的活性。
在一些实施方案中，合成启动子包含至少一个(一个或更多个)表5中所示的序列(特定转录因子结合位点序列)。在一些实施方案中，合成启动子包含表5中所示序列的至少一个(例如至少2个、至少3个、至少4个或至少5个)串联重复序列。在一些实施方案中，合成启动子包含表5中所示序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个串联重复序列。表5的重复序列可通过接头序列彼此分开。在一些实施方案中，接头序列包含三个(随机)核苷酸(例如AGA、TCG、GAC、CTA、ACT、TGC、GTA)或由其组成。在一些实施方案中，合成启动子包含以下共有基序：TFBS-AGA-TFBS-TCG-TFBS-GAC-TFBS-CTA-TFBS-ACT-TFBS-TGC-TFBS-GTA-TFBS，其中“TFBS”是表5的转录因子结合位点。
在一些实施方案中，合成启动子可包含USF1转录因子结合位点的串联重复序列CCACGTGC(SEQ ID NO：12265)。在一些实施方案中，合成启动子包含以下序列：CCACGTGCAGACCACGTGCTCGCCACGTGCGACCCACGTGCCTACCACGTGCACTCCACGTGCTGCCCACGTGCGTACCACGTGCG(SEQ ID NO：12266)。在一些实施方案中，合成启动子可包含MAFK转录因子结合位点的串联重复序列TGCTGAGTCAGCA(SEQ ID NO：12267)。在一些实施方案中，合成启动子包含以下序列：
工程化核酸和输出分子
本文中还提供了包含本文中所述的合成启动子的工程化核酸(例如构建体)。在一些实施方案中，合成启动子与编码分子(例如蛋白质或核酸)的核苷酸序列可操作地连接。当启动子相对于其调节的核酸序列处在正确的功能位置和方向以控制(“驱动”)该序列的转录起始和/或表达时，启动子被认为是“可操作地连接的”。
在一些实施方案中，合成启动子与编码输出分子的核苷酸序列可操作地连接，以使得合成启动子的激活导致输出分子的表达。可检测输出分子的信号，并且其强度是合成启动子的激活水平的指示。因此，通过比较来自输出分子的信号，可以比较不同细胞类型中合成启动子的活性。在一些实施方案中，与编码输出分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子可用于诊断目的。例如，当在病变细胞(例如癌细胞，例如乳腺癌细胞)中具有更高活性的合成启动子与编码输出分子的核苷酸序列可操作地连接时，相对于另一细胞，在一种细胞中由输出分子产生的更高信号表明所述细胞是病变细胞(例如癌细胞，例如乳腺癌细胞)。该示例并不意味着限制。本文中所述的合成启动子可用于任何疾病的诊断，只要相对于健康细胞或其他细胞类型，在病变细胞中该合成启动子具有不同的活性即可。
在一些实施方案中，输出分子是可检测蛋白质。在一些实施方案中，可检测蛋白质是荧光蛋白质。荧光蛋白质是当暴露于合适波长的光源(例如蓝色或紫外范围内的光)时发射荧光的蛋白质。可在本公开内容的传感器电路中用作可检测蛋白质的合适的荧光蛋白包括但不限于：eGFP、eYFP、eCFP、mKate2、mCherry、mPlum、mGrape2、mRaspberry、mGrape1、mStrawberry、mTangerine、mBanana和mHoneydew。在一些实施方案中，可检测蛋白质是水解底物以产生可检测信号(例如化学发光信号)的酶。这样的酶包括但不限于β-半乳糖苷酶(由LacZ编码)、辣根过氧化物酶或萤光素酶。在一些实施方案中，输出信号是荧光RNA。荧光RNA是RNA适配体，其在结合荧光发色团和暴露于合适波长的光源(例如蓝色或紫外范围内的光)时发射荧光。可在本公开内容的传感器电路中用作输出信号的合适的荧光RNA包括但不限于Spinach和Broccoli(例如，如Paige等，Science Vol.333，Issue 6042，pp.642-646，2011(通过引用并入本文)中所述)。
在一些实施方案中，合成启动子与编码治疗性分子的核苷酸序列可操作地连接。“治疗性分子”是对疾病或病症具有治疗效果的分子，并且可用于治疗疾病或病症。本公开内容的治疗性分子可以是基于核酸的或基于蛋白质或多肽的。在一些实施方案中，由于合成启动子的细胞特异性活性，合成启动子在期望的细胞类型(例如癌细胞)中但不在其他细胞类型中驱动治疗性分子的表达。因此，实现了疾病(例如癌症)的靶向治疗。
在一些实施方案中，基于核酸的治疗性分子可以是RNA干扰(RNAi)分子(例如微RNA、siRNA或shRNA)或核酸酶(例如核酶)。RNAi分子及在其在使基因表达沉默中的用途是本领域技术人员熟悉的。在一些实施方案中，RNAi分子靶向癌基因。
癌基因是在某些情况下可以使细胞转化成肿瘤细胞的基因。癌基因可以是编码以下的基因：生长因子或促分裂原(例如c-Sis)、受体酪氨酸激酶(例如EGFR、PDGFR、VEGFR或HER2/neu)、细胞质酪氨酸激酶(例如Src家族激酶、Syk-ZAP-70家族激酶或BTK家族激酶)、细胞质丝氨酸/苏氨酸激酶或其调节亚基(例如Raf激酶或细胞周期蛋白依赖性激酶)、调节性GTPase(例如Ras)或转录因子(例如Myc)。在一些实施方案中，寡核苷酸靶向脂质运载蛋白(Lcn2)(例如Lcn2 siRNA)。本领域技术人员熟悉可被靶向以用于治疗癌症的基因。
基于蛋白质或多肽的治疗性分子的一些非限制性实例包括酶、调节蛋白(例如免疫调节蛋白)、抗原、抗体或抗体片段和结构蛋白。在一些实施方案中，基于蛋白质或多肽的治疗性分子用于癌症治疗。
对于本公开内容的一些实施方案，合适的酶(用于与合成启动子可操作地连接)包括，例如，氧化还原酶、转移酶、聚合酶、水解酶、裂合酶、合酶、异构酶和连接酶、消化酶(例如蛋白酶、脂肪酶、糖酶和核酸酶)。在一些实施方案中，酶选自乳糖酶、β-半乳糖苷酶、胰酶、油降解酶、黏蛋白酶、纤维素酶、异麦芽糖酶、褐藻酸酶(alginase)、消化脂肪酶(例如舌脂肪酶、胰脂肪酶、磷脂酶)、淀粉酶、纤维素酶、溶菌酶，蛋白酶(例如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶、弹性蛋白酶)、酯酶(例如固醇酯酶(sterol esterase))、二糖酶(例如蔗糖酶、乳糖酶、β-半乳糖苷酶、麦芽糖酶、异麦芽糖酶)、DNase和RNase。
抗体及其片段的一些非限制性实例包括：贝伐单抗曲妥珠单抗阿仑单抗(适用于B细胞慢性淋巴细胞白血病)、吉姆单抗(hP67.6，抗CD33，适用于白血病，例如急性髓性白血病)、利妥昔单抗托西莫单抗(抗CD20，适用于B细胞恶性肿瘤)、MDX-210(双特异性抗体，其同时与HER-2/neu癌基因蛋白质产物和免疫球蛋白G(IgG)的I型Fc受体(FcγRI)结合)、奥戈伏单抗(oregovomab)(适用于卵巢癌)、依决洛单抗(edrecolomab)达克珠单抗帕利珠单抗(适用于呼吸系统病症，例如RSV感染)、替伊莫单抗(适用于非霍奇金淋巴瘤)、西妥昔单抗MDX-447、MDX-22、MDX-220(抗TAG-72)、IOR-C5、IOR-T6(抗CD1)、IOR EGF/R3、西洛果瓦(celogovab)(OV103)、依帕珠单抗pemtumomabGliomab-H(适用于脑癌、黑素瘤)。在一些实施方案中，抗体是抑制免疫检查点蛋白的抗体，例如抗PD-1抗体(例如派姆单抗(pembrolizumab)或纳武单抗)或抗-CTLA-4抗体(例如伊匹单抗(ipilimumab))。其他抗体和抗体片段可与如本文中提供的合成启动子可操作地连接。
在一些实施方案中，调节蛋白可以是转录因子或免疫调节蛋白。一些非限制性的示例性转录因子包括：NFkB家族的那些，例如Rel-A、c-Rel、Rel-B、p50和p52；AP-1家族的那些，例如Fos、FosB、Fra-1、Fra-2、Jun、JunB和JunD；ATF；CREB；STAT-1、-2、-3、-4、-5和-6；NFAT-1、-2和-4；MAF；甲状腺因子；IRF；Oct-1和-2；NF-Y；Egr-1；和USF-43、EGR1、Sp1和E2F1。其他转录因子可与如本文中提供的合成启动子可操作地连接。
如本文中所用，免疫调节蛋白是调节免疫应答的蛋白质。免疫调节蛋白的一些非限制性实例包括：抗原、佐剂(例如鞭毛蛋白、胞壁酰二肽)、细胞因子包括白细胞介素(例如IL-2、IL-7、IL-15或这些细胞因子的超激动剂/突变体形式)、IL-12、IFN-γ、IFN-α、GM-CSF、FLT3-配体)、和免疫刺激性抗体(例如抗-CTLA-4、抗-CD28、抗-CD3或这些分子的单链/抗体片段)。其他免疫调节蛋白可与如本文中提供的合成启动子可操作地连接。
如本文中所用，抗原是分子或分子的一部分，其通过抗体的抗原结合位点结合。在一些实施方案中，抗原是当施用于对象的细胞或在对象的细胞中表达时，激活或提高特异性结合抗原之抗体的产生的分子或部分。病原体的抗原是本领域技术人员公知的，并且包括但不限于细菌的部分(包衣、荚膜、细胞壁、鞭毛、菌毛和毒素)、病毒和其他微生物。可根据本公开内容使用的抗原的一些实例包括但不限于癌抗原、自身抗原、微生物抗原、变应原和环境抗原。其他抗原可与如本文中提供的合成启动子可操作地连接。
在一些实施方案中，本公开内容的抗原是癌抗原。癌抗原是优先地由癌细胞表达的抗原(即相比于非癌细胞，在癌细胞中其以更高的水平表达)，并且在一些情况下，其仅由癌细胞表达。癌抗原可在癌细胞内或在癌细胞的表面上表达。可根据本公开内容使用的癌抗原包括但不限于：MART-1/Melan-A、gp100、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、FAP、亲环蛋白b、结直肠相关抗原(CRC)--C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)、CAP-1、CAP-2、etv6、AML1、前列腺特异性抗原(PSA)、PSA-1、PSA-2、PSA-3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、T细胞受体/CD3-ζ链和CD20。癌抗原可选自MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4和MAGE-C5。癌抗原可选自GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8和GAGE-9。癌抗原可选自BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、甲胎蛋白、E-钙黏着蛋白、α-联蛋白、β-联蛋白、γ-联蛋白、p120ctn、gp100Pme1117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性结肠息肉病蛋白(adenomatous polyposis coli protein，APC)、胞衬蛋白、连接子蛋白37、Ig-独特型、p15、gp75、GM2神经节苷脂、GD2神经节苷脂、人乳头瘤病毒蛋白、Smad家族肿瘤抗原、lmp-1、P1A、EBV编码的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7、CD20以及c-erbB-2。其他癌抗原可与如本文中提供的合成启动子可操作地连接。
在一些实施方案中，基于蛋白质或多肽的治疗性分子是融合蛋白。融合蛋白是包含两种通过肽键直接或间接(例如通过接头)彼此共价结合的异源蛋白质、蛋白质结构域或蛋白质片段的蛋白质。在一些实施方案中，融合蛋白由核酸编码，所述核酸包含与另外的蛋白质的编码区域一起在框内的蛋白质的编码区域，而没有介于中间的终止密码子，从而导致所述蛋白质在其中融合在一起的单个蛋白质的翻译。
“核酸”是共价连接在一起的至少两个核苷酸，并且在一些情况下，可包含磷酸二酯键(例如磷酸二酯“骨架”)。“工程化核酸”(也称为“构建体”)是非天然存在的核酸。然而，应理解，虽然工程化核酸作为整体是非天然存在的，但它可包含天然存在的核苷酸序列。在一些实施方案中，工程化核酸包含来自不同生物体(例如来自不同物种)的核苷酸序列。例如，在一些实施方案中，工程化核酸包含鼠核苷酸序列、细菌核苷酸序列、人核苷酸序列和/或病毒核苷酸序列。工程化核酸包括重组核酸和合成核酸。“重组核酸”是通过连接核酸(例如分离的核酸、合成核酸、或其组合)构建并且在一些实施方案中可在活细胞中复制的分子。“合成核酸”是扩增或化学地或通过其他方法合成的分子。合成核酸包括经化学修饰或以其他方式修饰但可与天然存在的核酸分子碱基配对的那些。重组核酸和合成核酸还包括由前述之一的复制而产生的那些分子。
在一些实施方案中，本公开内容的核酸被认为是核酸类似物，其可至少部分地包含其他骨架，所述骨架包含例如磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-甲基亚磷酰胺(O-methylphophoroamidite)连接和/或肽核酸。如所指出的，核酸可以是单链(ss)或双链(ds)的，或者可包含单链和双链序列二者的部分。在一些实施方案中，核酸可包含三链序列的部分。核酸可以是DNA、基因组和/或cDNA二者、RNA或杂合体，其中核酸包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸(例如人工或天然)的任何组合，以及碱基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤)的任何组合。
本公开内容的核酸可包含一种或更多种遗传元件。“遗传元件”是指在核酸表达中起作用的特定核苷酸序列(例如启动子、增强子、终止子)或编码工程化核酸的离散产物的特定核苷酸序列(例如编码指导RNA、蛋白质和/或RNA干扰分子(例如siRNA或miRNA)的核苷酸序列)。
可使用标准分子生物学方法产生本公开内容的核酸(参见，例如，Green andSambrook，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2012，Cold Spring HarborPress)。
在一些实施方案中，使用GIBSON克隆生产核酸(参见，例如，Gibson，D.G.等.Nature Methods，343-45，2009；和Gibson，D.G等.Nature Methods，901-903，2010，其各自其中通过引用并入本文)。GIBSON 通常在单管反应中使用三种酶活性：5’外切核酸酶、DNA聚合酶的3’延伸活性和DNA连接酶活性。5’外切核酸酶活性回切(chew back)5’端序列并暴露互补序列用于退火。然后聚合酶活性填充退火区域上的间隙。然后DNA连接酶密封切口并且将DNA片段共价地连接在一起。相邻片段的重叠序列比Golden Gate Assembly中使用的那些长得多，并因此导致更高百分比的正确组装。
在一些实施方案中，工程化核酸在载体上递送至细胞。“载体”是指用作人工携带遗传物质(例如工程化核酸)进入例如其可在其中复制和/或表达的细胞之载剂的核酸(例如DNA)。在一些实施方案中，载体是附加体型载体(episomal vector)(参见，例如，VanCraenenbroeck K.等，Eur.J.Biochem.267，5665，2000，通过引用并入本文)。载体的一个非限制性实例是质粒(例如图3)。质粒是能够在宿主细胞中自动复制的双链、通常为环状的DNA序列。质粒载体通常包含允许质粒在宿主中半独立复制的复制起点以及转基因插入物。质粒可具有更多特征，包括例如“多克隆位点”(其包含用于插入核酸插入物的核苷酸突出端)，以及插入物任一侧的多个限制性酶共有位点。载体的另一个非限制性实例是病毒载体，例如溶瘤单纯疱疹病毒。因此，本公开内容提供了包含工程化核酸的溶瘤单纯疱疹病毒载体，所述工程化核酸包含启动子，所述启动子包含由SEQ ID NO：1至12263中任一个所示的核苷酸序列，或与由SEQ ID NO：1至12263中任一个所示的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列。
细胞
还提供了包含本公开内容的工程化核酸的细胞。在一些实施方案中，包含本文中所述的合成启动子的工程化核酸全身递送或递送至特定细胞类型，例如癌细胞、良性肿瘤细胞或其他疾病细胞。在一些实施方案中，将工程化核酸递送至具有肿瘤细胞或癌细胞的对象，并且合成启动子驱动其可操作地连接的核苷酸序列在肿瘤细胞或癌细胞中的特异性表达。
癌细胞可以是任何类型的癌细胞，包括但不限于恶变前肿瘤(premalignantneoplasm)、恶性肿瘤、转移癌、或以不受控的细胞生长为特征使得其被认为是癌性或癌前的任何疾病或病症。癌症可以是原发性癌症或转移性癌症。癌症包括但不限于：眼癌，胆道癌，膀胱癌，胸膜癌，胃癌，卵巢癌，脑脊膜癌，肾癌，脑癌包括胶质母细胞瘤和髓母细胞瘤，乳腺癌，宫颈癌，绒毛膜癌，结肠癌，子宫内膜癌，食管癌，胃癌，血液系统肿瘤(hematological neoplasm)包括急性淋巴细胞和髓性白血病，多发性骨髓瘤，AIDS相关白血病和成体T细胞白血病淋巴瘤，上皮内肿瘤包括鲍恩病(Bowen’s disease)和佩吉特病(Paget’s disease)，肝癌，肺癌，淋巴瘤包括霍奇金病(Hodgkin’s disease)和淋巴细胞性淋巴瘤，神经母细胞瘤，口腔癌包括鳞状细胞癌，卵巢癌包括由上皮细胞、基质细胞、生殖细胞和间充质细胞产生的那些，胰腺癌，前列腺癌，直肠癌，肉瘤包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和骨肉瘤，皮肤癌包括黑素瘤、卡波西肉瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌，睾丸癌包括生殖肿瘤(germinal tumor)例如精原细胞瘤、非精原细胞瘤、畸胎瘤、绒毛膜癌，间质瘤和生殖细胞肿瘤，甲状腺癌包括甲状腺腺癌和髓样癌，以及肾癌包括腺癌和肾母细胞瘤(Wilm’s tumor)。常见的癌症包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌和脑癌。在一些实施方案中，肿瘤是黑素瘤、癌、肉瘤或淋巴瘤。
本公开内容的工程化核酸可在广泛的宿主细胞类型中使用。在一些实施方案中，工程化核酸在哺乳动物细胞(例如人细胞)、细菌细胞(大肠杆菌(Escherichia coli)细胞)、酵母细胞、昆虫细胞或其他类型的细胞中使用。本公开内容的工程化核酸可体内使用，例如在对象中例如人对象中使用。
在一些实施方案中，包含合成启动子的工程化核酸在哺乳动物细胞中使用，例如用于研究或治疗应用。例如，在一些实施方案中，工程化核酸在人细胞、灵长类细胞(例如vero细胞)、大鼠细胞(例如GH3细胞、OC23细胞)或小鼠细胞(例如MC3T3细胞)中使用。存在多种人细胞系，包括但不限于人胚肾(human embryonic kidney，HEK)细胞、HeLa细胞、来自国家癌症研究所的60种癌细胞系(NCI60)的癌细胞、DU145(前列腺癌)细胞、Lncap(前列腺癌)细胞、MCF-7(乳腺癌)细胞、MDA-MB-438(乳腺癌)细胞、PC3(前列腺癌)细胞、T47D(乳腺癌)细胞、THP-1(急性髓性白血病)细胞、U87(胶质母细胞瘤)细胞、SHSY5Y人神经母细胞瘤细胞(克隆自骨髓瘤)和Saos-2(骨癌)细胞。在一些实施方案中，工程化核酸在人胚肾(HEK)细胞(例如HEK293或HEK293T细胞)中表达。在一些实施方案中，工程化核酸在干细胞(例如人干细胞)中表达，例如在多能干细胞(例如人多能干细胞，包括人诱导多能干细胞(humaninduced pluripotent stem cell，hiPSC))中表达。“干细胞”是指具有在培养基中无限期分裂并产生特化细胞的能力的细胞。“多能干细胞”是指一种类型的干细胞，其能够分化成生物体的所有组织，但单独不能够维持完整的生物体发育。“人诱导多能干细胞”是指通过被迫表达对维持胚胎干细胞的指定特性重要的基因和因子而被重编程为胚胎干细胞样状态的体(例如成熟或成体)细胞(参见，例如，Takahashi和Yamanaka，Cell 126(4)：663-76，2006，通过引用并入本文)。人诱导多能干细胞表达干细胞标志物并且能够产生所有三个胚层(外胚层、内胚层、中胚层)的细胞特性。
可根据本公开内容使用的细胞系的另外的非限制性实例包括：293-T、293-T、3T3、4T1、721、9L、A-549、A172、A20、A253、A2780、A2780ADR、A2780cis、A431、ALC、B16、B35、BCP-1、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BR 293、BxPC3、C2C12、C3H-10T1/2、C6、C6/36、Cal-27、CGR8、CHO、CML T1、CMT、COR-L23、COR-L23/5010、COR-L23/CPR、COR-L23/R23、COS-7、COV-434、CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、E14Tg2a、EL4、EM2、EM3、EMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、H1299、H69、HB54、HB55、HCA2、Hepa1c1c7、High Five细胞、HL-60、HMEC、HT-29、HUVEC、J558L细胞、Jurkat、JY细胞、K562细胞、KCL22、KG1、Ku812、KYO1、LNCap、Ma-Mel 1，2，3....48、MC-38、MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-468、MDCK II、MG63、MONO-MAC6、MOR/0.2R、MRC5、MTD-1A、MyEnd、NALM-1、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、NCI-H69/LX4、NIH-3T3、NW-145、OPCN/OPCT Peer、PNT-1A/PNT 2、PTK2、Raji、RBL细胞、RenCa、RIN-5F、RMA/RMAS、S2、Saos-2细胞、Sf21、Sf9、SiHa、SKBR3、SKOV-3、T-47D、T2、T84、THP1、U373、U87、U937、VCaP、WM39、WT-49、X63、YAC-1和YAR细胞。
在一些实施方案中，修饰本公开内容的细胞。经修饰的细胞是包含外源核酸或天然不存在的核酸的细胞。在一些实施方案中，经修饰的细胞包含基因组核酸中的突变。在一些实施方案中，经修饰的细胞包含外源独立复制核酸(例如附加体型载体上存在的工程化核酸)。在一些实施方案中，通过将外来或外源核酸引入细胞中来产生经修饰的细胞。可通过常规方法将核酸引入细胞中，例如电穿孔(参见，例如，Heiser W.C.TranscriptionFactor Protocols：Methods in Molecular BiologyTM 2000；130：117-134)，化学(例如磷酸钙或脂质)转染(参见，例如，Lewis W.H.，等，Somatic Cell Genet.1980年5月；6(3)：333-47；Chen C.，等，Mol Cell Biol.1987年8月；7(8)：2745-2752)，与包含重组质粒的细菌原生质体融合(参见，例如，Schaffner W.Proc Natl Acad Sci USA.1980年4月；77(4)：2163-7)，纯化的DNA直接转导、缀合或微注射到细胞核中(参见，例如，CapecchiM.R.Cell.1980年11月；22(2Pt 2)：479-88)。
在一些实施方案中，修饰细胞以表达报道分子。在一些实施方案中，修饰细胞以表达与报道分子(例如荧光蛋白例如绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)，或其他报道分子)可操作地连接的诱导型启动子。
在一些实施方案中，修饰细胞以过表达内源目的蛋白质(例如，通过引入或修饰编码目的蛋白质的内源基因附近的启动子或其他调节元件以提高目的蛋白质的表达水平)。在一些实施方案中，通过诱变修饰细胞。在一些实施方案中，通过将工程化核酸引入细胞中来修饰细胞，以产生目的遗传变化(例如，通过插入或同源重组)。
在一些实施方案中，工程化核酸可以是密码子优化的，例如，用于在哺乳动物细胞(例如人细胞)或其他类型的细胞中表达。密码子优化是通过将一个物种的核苷酸的DNA序列转化为另一物种的核苷酸的DNA序列来提高目的基因的翻译效率，从而使活的生物体中蛋白质表达最大化的技术。密码子优化的方法是公知的。
在一些方面，本文中还提供了包括将(例如至少一个、至少两个、至少三个或更多个)工程化核酸或附加体型载体(例如包含工程化核酸)引入细胞中的方法。可通过常规方法将工程化核酸引入细胞中，例如电穿孔，化学(例如磷酸钙或脂质)转染，与包含重组质粒的细菌原生质体融合，纯化的DNA直接转导、缀合或微注射到细胞核中。
可通过本领域中已知的任何体内递送方法将本公开内容的工程化核酸递送至对象(例如哺乳动物对象，例如人对象)。例如，工程化核酸可静脉内递送。在一些实施方案中，工程化核酸在递送载剂(例如非脂质体纳米颗粒或脂质体)中递送。在一些实施方案中，工程化核酸全身递送至患有癌症或其他疾病的对象，并在对象的癌细胞或病变细胞中特异性地激活(激活转录)。
如上所述，可使用病毒递送系统(例如逆转录病毒、腺病毒、腺相关、辅助依赖性腺病毒系统、杂合腺病毒系统、单纯疱疹、痘病毒、慢病毒、Epstein-Barr病毒)或非病毒递送系统(例如，物理：裸DNA、DNA轰击、电穿孔、流体动力学、超声波或磁转染；或化学：阳离子脂质、不同阳离子聚合物或脂质聚合物)向对象的细胞(例如癌细胞)递送工程化核酸(Nayerossadat N等，Adv Biomed Res.2012；1：27，通过引用并入本文)。在一些实施方案中，基于非病毒的递送系统是基于水凝胶的递送系统(参见，例如，Brandl F，等，Journalof Controlled Release，2010，142(2)：221-228，通过引用并入本文)。
另外的实施方案
本公开内容还提供以下编号段落中所述的另外的实施方案：
1.包含启动子的工程化核酸，所述启动子包含由SEQ ID NO：1至12263中任一个所示的核苷酸序列，或与由SEQ ID NO：1至12263中任一个所示的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列。
2.段落1所述的工程化核酸，其中相对于健康细胞，在病变细胞中所述启动子的活性提高。
3.段落1所述的工程化核酸，其中相对于健康细胞，在病变细胞中所述启动子的活性降低。
4.段落2或3所述的工程化核酸，其中所述病变细胞选自乳腺癌细胞、结肠癌细胞和卵巢癌细胞。
5.段落1至4中任一段所述的工程化核酸，其中所述启动子与编码治疗性蛋白质的核苷酸序列可操作地连接。
6.包含段落1至5中任一段所述的工程化核酸的细胞。
7.向细胞递送段落1至5中任一段所述的工程化核酸的方法。
8.向对象递送段落1至5中任一段所述的工程化核酸的方法。
9.向对象递送段落6所述的细胞的方法。
10.段落1至5中任一段所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：1至40中任一个或与由SEQ ID NO：1至40中任一个所示的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列所示。
11.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：1所示。
12.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：2所示。
13.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：3所示。
14.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：4所示。
15.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：5所示。
16.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：6所示。
17.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：7所示。
18.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：8所示。
19.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：9所示。
20.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：10所示。
21.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：11所示。
22.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：12所示。
23.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：13所示。
24.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：14所示。
25.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：15所示。
26.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：16所示。
27.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：17所示。
28.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：18所示。
29.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：19所示。
30.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：20所示。
31.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：21所示。
32.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：22所示。
33.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：23所示。
34.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：24所示。
35.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：25所示。
36.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：26所示。
37.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：27所示。
38.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：28所示。
39.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：29所示。
40.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：30所示。
41.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：31所示。
42.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：32所示。
43.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：33所示。
44.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：34所示。
45.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：35所示。
46.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：36所示。
47.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：37所示。
48.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：38所示。
49.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：39所示。
50.段落10所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：40所示。
51.段落1至5中任一段所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：41至49中任一个或与由SEQ ID NO：41至49中任一个所示的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列所示。
52.段落51所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：41所示。
53.段落51所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：42所示。
54.段落51所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：43所示。
55.段落51所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：44所示。
56.段落51所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：45所示。
57.段落51所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：46所示。
58.段落51所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：47所示。
59.段落51所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：48所示。
60.段落51所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：49所示。
61.包含段落1至5或10至60中任一段所述的工程化核酸的溶瘤病毒。
62.段落61所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒是溶瘤单纯疱疹病毒。
实施例
实施例1.合成启动子活性和特异性-合成启动子1至40
通过将ECFP或mKate2的编码序列置于合成启动子下来构建报道构建体。将报道构建体转染到表1中列出的不同细胞系中。ECFP或mKate2的表达指示每种细胞系中合成启动子的活性。在不同细胞系中测试一组合成启动子(表2)的活性。结果提供在图1至7中。
表1.用于测试启动子活性的不同细胞系
| # | 系 | 类型 | 组织 | 生物体 |
| 1 | OVCAR8 | 癌症 | 卵巢 | 人 |
| 2 | IOSE386 | 正常的 | 卵巢 | 人 |
| 3 | IOSE385 | 正常的 | 卵巢 | 人 |
| 4 | IOSE120 | 正常的 | 卵巢 | 人 |
| 5 | HCT116 | 癌症 | 结直肠 | 人 |
| 6 | CCD-841-Con | 正常的 | 结肠 | 人 |
| 7 | SKBR3 | 癌症 | 乳腺 | 人 |
| 8 | MDA-MB-453 | 癌症 | 乳腺 | 人 |
| 9 | MDA-MB-231 | 癌症 | 乳腺 | 人 |
| 10 | MCF-7 | 癌症 | 乳腺 | 人 |
| 11 | MCF-10A | 正常的 | 乳腺 | 人 |
| 12 | MCF-12A | 正常的 | 乳腺 | 人 |
| 13 | aHDF | 正常的 | 成体真皮成纤维细胞 | 人 |
| 14 | NB508 | 癌症 | 胰腺 | 小鼠 |
| 15 | 4T1 | 癌症 | 乳腺 | 小鼠 |
用于调节ECFP表达的合成启动子的一些实例：
表2.合成启动子1至40
实施例2.合成启动子活性和特异性-合成启动子41至49
通过将mKate2的编码序列置于来自文库的所选择的启动子(合成启动子41至49)的控制下来产生报道构建体。将报道构建体转染到表3中列出的不同细胞系中。P119是阴性对照细胞，并且p153是在强hUbC启动子下表达mKate2的mKate2阳性细胞。
mKate2的表达指示每种细胞系中合成启动子的活性。结果提供在图8和表2中。发现合成启动子41和44在肿瘤细胞系中比受试的其他合成启动子更有活性。有趣的是，合成启动子41和44二者都具有肿瘤特异性TF的结合基序，包括CREB、EGR1、SP1和E2F1。如表3中所示，在不同细胞系中测试另一组合成启动子的活性。
表3.不同细胞系中合成启动子活性
表4.合成启动子41至49
实施例3.MDA-MB-453特异性启动子表哒
两种合成启动子S(USF1)p和S(MAFK)p被设计成特异性地靶向MDA-MB-453乳腺癌细胞系，但不靶向MCF-10A非致瘤性乳腺上皮细胞系。在这两种细胞系中将各个启动子单独产生的mKate2输出与对照(G8-Pe)进行比较。S(USF1)p和S(MAFK)p仅在MDA-MB-453细胞中产生高输出(图9)(还参见Nissim，L.等，Cell 2017；171：1138-1150，通过引用并入本文)。
S(USF1)p
S(MAFK)p
实施例4.合成启动子活性和特异性
通过将mKate2的编码序列置于来自文库的所选择的启动子的控制下来产生报道构建体(参见图10)。将报道构建体转染到不同的细胞系中：10A(正常乳腺组织细胞)或MDA(癌性乳腺组织细胞)。
mKate2的表达指示每种细胞系中合成启动子的活性。结果提供在图10中。发现合成启动子的亚组在肿瘤细胞系中比受试的其他合成启动子更有活性。
实施例5.
合成启动子文库在人诱导多能干细胞系(GATA6-hiPSC)中测试，所述人诱导多能干细胞系(GATA6-hiPSC)在多西环素诱导的GATA6表达之后形成肝芽样类器官(Guye，P.等，Nature Communications，2016，通过引用并入本文)。通过在平底、基质胶涂覆的组织培养板中接种25,000个GATA6-hiPSC/cm2来制备2D类器官。分化遵循先前描述的方案(Guye，P.等，Nature Communications，2016)，并通过添加1000ng/mL多西环素(dox)5天来开始。在第5天，用合成启动子文库和转导对照的等摩尔混合物转导类器官。定性调整病毒滴度，以使得＜15％的群体表达转导标志物。分化持续总共16天，之后用PBS洗涤类器官并用Accutase将其解离成单细胞混悬液。将细胞离心(300×g下3分钟)并重悬于APEL 2培养基(StemCellTechnologies)中。通过FACS(BD FACS Aria，BD Biosciences)将重悬的细胞分选到具有手动限定的设门的mKate阳性和阴性群体中。与所有其他样品一样，进行基因组DNA(gDNA)的提取。
使用来自mKate阳性群体的gDNA，如对于其他样品所描述的那样，通过PCR扩增合成启动子，不同之处在于需要50个循环。用AscI和SbfI消化扩增的启动子文库和pLN490并进行凝胶纯化。将消化和纯化的启动子和pLN490骨架连接并转化到大肠杆菌(E.coli)中并通过氨苄青霉素进行选择。挑选菌落并进行Sanger测序以鉴定导致类器官中mKate表达的合成启动子。由Sanger测序鉴定的候选启动子一式三份进行验证。通过用表达mKate2上游的特定启动子的慢病毒转导未分化的GATA6-hiPSC来进行验证。用2μg/mL聚凝胺进行转导并定性评价以引起超过90％的GATA6-hiPSC中的mKate2表达。如上所述使类器官分化并使用Leica TCS SP5 II共聚焦显微镜每天成像持续20天。每种启动子也在通过在不添加dox的情况下在mTeSR1中培养细胞而保持不分化>5天的GATA6-hiPSC中表达。
通过在hiPSC中的GATA6表达得到的肝芽样类器官中合成启动子文库的表达导致来自1396种mKate阳性细胞的库中37种不同候选启动子的鉴定。通过用特定启动子转导GATA6-hiPSC并重复分化至肝芽样类器官来单独验证每种启动子。我们一式三份地验证了这些启动子中的18种，并且发现其中7种在所有样品中都是mKate2阳性的。一式两份地，2种启动子仅是mKate2阳性的。在具有mKate2活性的这9种启动子中，8种还在未分化的GATA6-hiPSC中具有可检测的活性(对于4种启动子可一式三份验证活性，对于1种启动子为一式两份，并且对于3种启动子为仅单个样品)。然而，它们在GATA6-hiPSC中的活性通常限于具有很少细胞的簇，表明这些未分化的干细胞的转录因子谱可存在细微差异。
具有RELA、STAT_disc5、HIF1A和TP53结合位点的合成启动子在所有一式三份中示出了一致的表现。这些启动子的活性和模式在几天之间变化，暗示细胞类型特异性启动子活性。此外，启动子在其中是有活性的细胞的模式、强度和数目也各不相同。例如，HIF1A启动子在类似于先前鉴定的外胚层来源细胞的大球状体中显示为有活性(P.Guye，2016)。此外，信号示出了这些球状体结构内的模式，表明进一步的细胞类型特异性。mKate2表达在类器官发育中晚期突然地出现(≈第15天)，并逐渐消失。当信号从推定的外胚层区域逐渐消失时，它将开始在偏爱扁平结构的类器官的附近区域中出现。
TP53和STAT_disc5在类器官发育期间早期都具有活性，并且对形态学上不同的细胞没有明显的偏好。TP53在hiPSC和早期(第2天)类器官中广泛有活性。随着时间的推移，mKate2阳性细胞的频率逐渐消退，尽管在剩余的少数阳性细胞中信号仍然保持强烈。STAT_disc5在hiPSC中没有活性，但在第3天左右开始，在第4/5天达到峰值。然后随着类器官成熟逐渐停止，并在第12天实际上消失。
RELA强烈地开始，首先是在第4天左右在少数细胞中，但在实验期间不断扩散至更大比例的细胞群体。启动子表现出偏爱某些具有扁平形态学的区域。此外，数个细胞-基于它们的mKate2荧光-示出了长而薄的形状，其在形态学上不同于从其他启动子观察到的模式。
总之，来自候选启动子的mKate2表达的验证还揭示了通常需要筛选每个类器官的多个区域以鉴定mKate阳性区域的启动子的异质表达。这意味着形态学上相似的区域可仍然示出影响合成启动子转录的TF谱的细微差异。总而言之，复制的时间、空间和形态学上的观察表明了在肝芽样类器官的发育期间出现和成熟的某些细胞类型的非随机偏好。
先前描述的将hiPSC分化成肝芽样类器官的方法导致类器官内的异质和多样化的细胞组成，其中细胞谱系由所有三种不同的胚层产生。这种细胞类型的异质性使得类器官作为测试合成启动子文库的细胞类型偏好的平台是理想的。
特定细胞的TF谱的变化是细胞分化和成熟的关键，并且预期合成启动子利用这种变化，从而为细胞类型特异性基因调节提供平台。实际上，我们发现少数候选启动子示出了对类器官内某些形态学上不同的区域的时间特异性。然而，启动子活性通常在形态学上相似的区域之间不同，意味着启动子可对细胞类型之间TF活性的变化非常敏感。通过对于特定细胞群体的更有针对性的搜索和彻底筛选，合成启动子是用于调节异质细胞群体的亚群中基因网络的有力工具。
表5.合成启动子的转录因子结合位点
本文中公开的所有参考文献、专利和专利申请均关于其被引用的各自主题通过引用并入，其在一些情况下可涵盖文件的整个内容。
除非明确指出相反，否则本文中在说明书和权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词应理解为意指“至少一个/种”。
还应理解，除非明确指出相反，否则在本文中要求保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，方法的步骤或动作的顺序不必限于叙述该方法的步骤或动作的顺序。
在权利要求书中以及在以上说明书中，所有过渡短语例如“包含”、“包括”、“带有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由...构成”等都应理解为开放式的，即，意指包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节中所述，仅过渡短语“由......组成”和“基本上由.....组成”应分别是封闭或半封闭的过渡短语。
Claims (15)
1.包含启动子的工程化核酸，所述启动子包含以下共有序列：TFBS-AGA-TFBS-TCG-TFBS-GAC-TFBS-CTA-TFBS-ACT-TFBS-TGC-TFBS-GTA-TFBS，其中TFBS是表5的转录因子结合位点序列。
2.权利要求1所述的工程化核酸，其中相对于健康细胞，在病变细胞中所述启动子的活性提高。
3.权利要求1所述的工程化核酸，其中相对于健康细胞，在病变细胞中所述启动子的活性降低。
4.权利要求2或3所述的工程化核酸，其中所述病变细胞选自乳腺癌细胞、结肠癌细胞和卵巢癌细胞。
5.权利要求1至4中任一项所述的工程化核酸，其中所述启动子与编码治疗性蛋白质的核苷酸序列可操作地连接。
6.权利要求1、2、4或5中任一项所述的工程化核酸，其中所述转录因子结合位点序列包含以下序列：CCACGTGC(SEQ ID NO：12265)。
7.权利要求6所述的工程化核酸，其中所述启动子包含以下序列：CCACGTGCAGACCACGTGCTCGCCACGTGCGACCCACGTGCCTACCACGTGCACTCCACGTGCTGCCCACGTGCGTACCACGTGCG(SEQ IDNO：12266)。
8.权利要求1、2、4或5中任一项所述的工程化核酸，其中所述转录因子结合位点序列包含以下序列：TGCTGAGTCAGCA(SEQ ID NO：12267)。
9.权利要求8所述的工程化核酸，其中所述启动子包含以下序列：TGCTGAGTCAGCAAGATGCTGAGTCAGCATCGTGCTGAGTCAGCAGACTGCTGAGTCAGCACTATGCTGAGTCAGCAACTTGCTGAGTCAGCATGCTGCTGAGTCAGCAGTATGCTGAGTCAGCAG(SEQ ID NO：12268)。
10.包含权利要求1至9中任一项所述的工程化核酸的细胞。
11.包含权利要求1至9中任一项所述的工程化核酸的溶瘤病毒。
12.权利要求11所述的溶瘤病毒，其中所述溶瘤病毒是溶瘤单纯疱疹病毒。
13.向细胞递送权利要求1至9中任一项所述的工程化核酸或者权利要求11或12所述的溶瘤病毒的方法，所述细胞任选地在对象中。
14.包含启动子的工程化核酸，所述启动子包含由SEQ ID NO：1至12263中任一个所示的核苷酸序列，或与由SEQ ID NO：1至12263中任一个所示的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列。
15.权利要求14所述的工程化核酸，其中所述核苷酸序列由SEQ ID NO：1至49中任一个或与SEQ ID NO：1至49中任一个具有至少95％同一性的核苷酸序列所示。
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