EP1097232A1 - Expressionssysteme enthaltend chimäre promotoren mit bindungsstellen für rekombinante transkriptionsfaktoren - Google Patents

Expressionssysteme enthaltend chimäre promotoren mit bindungsstellen für rekombinante transkriptionsfaktoren

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EP1097232A1
EP1097232A1 EP99936465A EP99936465A EP1097232A1 EP 1097232 A1 EP1097232 A1 EP 1097232A1 EP 99936465 A EP99936465 A EP 99936465A EP 99936465 A EP99936465 A EP 99936465A EP 1097232 A1 EP1097232 A1 EP 1097232A1
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EP
European Patent Office
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component
nucleic acid
acid construct
protein
binding
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP99936465A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Rolf Müller
Dirk Nettelbeck
Hans-Harald Sedlacek
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Original Assignee
Aventis Pharma Deutschland GmbH
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Definitions

  • Activation sequences represent nucleotide sequences to which transcription factors bind, which thereby initiate the transcription of the associated gene.
  • activation sequences are now known as promoters or enhancer sequences.
  • the limitation can e.g. be cell-specific, metabolic (e.g. under hypoxic conditions) or cell cycle-specific.
  • the activation of the transcription of an effector gene which is restricted by a cell-specific promoter, is not sufficient in many cases, partly because the activation of the cell-specific promoter is not sufficiently cell-specific is partly because the expression of the effector gene is desired only in those cells of the selected cell type that have a certain functional state.
  • a functional state can be, for example, the cell cycle phase of the cell.
  • the chimeric promoter technology was developed for the combination of a promoter of any specificity with a cell cycle-specific promoter (patent applications e.g. PCT / GB95 / 02000, EP-A 0 790 313). It consists in linking an upstream promoter of any specificity with the downstream CDE-CHR element or the E2FBS-CHR element.
  • the cell division is divided into the successive phases G0 or G1, S, G2 and M.
  • the S phase is the DNA synthesis phase, followed by the transition phase G2 (G2 phase), to which the mitosis phase (M- Phase), in which a mother cell divides into two daughter cells.
  • the resting phase G0 (GO phase) or the transition phase G1 (G1 phase) lies between the M phase and the S phase.
  • cyclin / cdk complexes consist of a catalytic subunit [cyclin dependent kinase (cdk, for example cdk-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7 or -8) and a regulatory subunit, the cyclin (for example Cyclin A, -B1-B3, -D1-D3, -E, -H or -C].
  • cyclin dependent kinase for example cdk-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7 or -8
  • regulatory subunit for example Cyclin A, -B1-B3, -D1-D3, -E, -H or -C.
  • the activity of the cyclin / cdk complexes consists in phosphorylation and thus activation or inactivation of proteins which are directly or indirectly involved in the control of DNA synthesis and mitosis.
  • the genes for some cyclins and cdk's are periodically transcribed and / or periodically activated or inhibited, for example by the regulated breakdown of cyclins, by cell cycle phase-specific binding of inhibitors (eg p16INK4A, p15INK4B, p21 Cip1, p27Kip1, ⁇ 18INK4 p19INK4D, p57) or by modification by activating (e.g. by cdc25-phosphatases, such as cdc25A, cdc25B and cdc25C or cdk7 / Cyclin H) or inhibiting (e.g.
  • inhibitors eg p16INK4A, p15INK4B, p21 Cip1, p27Kip1, ⁇ 18INK4 p19INK4D, p57
  • activating e.g. by cdc25-phosphatases, such as cdc25A, cd
  • weel kinase enzymes (overview by Zwicker and Müller, Progr. Cell Cycle Res. 91 (1995); La Thangue, Curr Opin. Cell Biol. 443 (1994); MacLachlan et al., Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expr. 127 (1995)).
  • CDE-CHR an element in the promoter region of the gene for cdc25C.
  • This CDE-CHR element is occupied by a repressing protein in the G0 / G1 phase and is free in the G2 phase.
  • the nucleotide sequence of this promoter element could be identified and likewise found in the promoters of the genes for cyclin A and cdk-1, while a partially different nucleotide sequence (E2FBS-CHR) was detected in the promoter for B-myb.
  • a cell cycle-dependent promoter with an unspecific, cell-specific, virus-specific or metabolically activable promoter for the regulated activation of the transcription of an effector gene which codes for a protein for the prophylaxis and / or therapy of a disease.
  • diseases can be, for example, tumor diseases, leukaemias, autoimmune diseases, arthritis, allergies, inflammation, rejection of transplanted organs, diseases of the blood circulation system, the blood coagulation system, infections or damage to the central nervous system.
  • the so-called chimeric promoter was developed for the combination of different promoters with a cell cycle-specific promoter element.
  • the activity of an unspecific, cell-specific, virus-specific or metabolically activatable activation sequence is largely restricted to the S and G2 phase of the cell cycle by the promoter element CDE-CHR or E2FBS-CHR immediately downstream.
  • Such transcription factors include, for example, Oct-2, Sp1 and NF-Y.
  • the invention now relates to a nucleic acid construct in which any promoter can be linked to the CDE-CHR element or the E2FBS-CHR element to form a functional chimeric promoter and which contains the following components:
  • Expression is activated by component a) and contains b1) DNA coding for a DNA binding domain b2) DNA coding for a transactivation domain which is rich in glutamine, serine and threonine.
  • Component c) at least one DNA sequence for binding the expression product of component b)
  • E2F-BS-CHR element contains and is bound with its 5 'end to the 3' end of component c)
  • Component e at least one effector gene, the transcription of which by binding the
  • Expression product of component b) is activated to component c).
  • the arrangement of the individual components is shown by way of example in FIG. 1.
  • the minimal promoter from component d) contains at least one transcription activating element.
  • the mode of operation of the nucleic acid construct according to the invention is such that the activation of the cell-specific, metabolically activatable, virus-specific, cell cycle-specific or universally activable promoter [component a)] leads to a transcription of the gene [component b)] for the recombinant transcription activator, which in turn leads to its DNA - binding sequence [component c)] binds, thereby activating the minimal CDE-CHR containing promoter [component d)] and thereby initiating the transcription of the effector gene [component e)].
  • the CDE-CHR element of component d) is blocked by binding the so-called CDF protein and thus the activation of the transcription of component e) is inhibited.
  • nucleic acid construct according to the invention can be expanded in various forms:
  • effector genes [components e, e ', e "] can be introduced into the nucleic acid construct, these effector genes either being linked to one another with an IRES sequence or components c) and d) being added upstream to each effector gene .
  • Component a) can be added to component c) upstream, so that the recombinant transactivator, expressed by component b), also increases the activation of component a) in the sense of a self-reinforcing promoter.
  • the self-reinforcing promoter system can also be added to the expression system according to the invention, as shown for example in FIG. 2 / II.
  • the component b) can be introduced by introducing a component b3) which expresses a protein A which binds to a coupling substance [component f)] and by inserting a component b4) which expresses a protein B which also binds to the coupling substance f) binds to one through the
  • Coupling substance f ie pharmacologically controllable recombinant transactivator [component b ')]
  • component b ' pharmacologically controllable recombinant transactivator
  • the expression system according to the invention can be controlled pharmacologically.
  • Such expression systems have already been described in detail in the patent application
  • the expression system can experience additional control by inserting the nucleic acid sequence for a binding protein [component b5)] for a cellular regulator protein between or on components b1) and b2) [component b "consisting of component b1), b2) and b5)] This is due to the fact that the regulator protein adheres to the binding protein in the normal cell and thereby blocks the function of the recombinant transactivator expressed by component b "), namely its binding to component c).
  • the recombinant transactivator is in cells in which the cellular regulator protein is mutated and therefore cannot adhere to the binding protein or in which the regulator protein is reduced, is missing or is bound to cellular, viral, bacterial or parasitic binding proteins competing with component b5) [Component b ”)] functional and can bind to component c).
  • Component b is shown by way of example in FIG. 4.
  • the effector gene [component d)] codes for a pharmacologically active substance which is selected from the group comprising cytokines, growth factors, antibodies or antibody fragments, receptors for cytokines or growth factors, antiproliferative, apoptotic or cytostatic proteins, angiogenesis inhibitors, anticoagulants, thrombosis-induced Substances and anticoagulants, fibrinolytic substances, plasma proteins, complement-activating proteins, peptide hormones, virus envelope proteins, bacterial antigens and parasitic antigens, proteins and ribozymes acting on the bloodstream.
  • the effector gene preferably codes for a ribozyme which inactivates the mRNA which codes for a protein selected from the group comprising cell cycle control proteins, in particular cyclin A, cyclin B, cyclin D1, cyclin E, E2F1-5, cdc2, cdc25C or DP1 or virus proteins or Cytokines or growth factors or their receptors.
  • the effector gene codes for an enzyme which cleaves a precursor of a drug into a drug.
  • the effector gene can code for a ligand-effector fusion protein, where the ligand can be an antibody, an antibody fragment, a cytokine, a growth factor, an adhesion molecule or a peptide hormone and the effector can be a pharmacologically active substance or an enzyme as described above.
  • the structural gene can encode a ligand-enzyme fusion protein, the enzyme cleaving a precursor of a drug into a drug and the ligand binding to a cell surface, preferably to endothelial cells or tumor cells.
  • the nucleic acid constructs preferably consist of DNA.
  • nucleic acid constructs is understood to mean artificial structures made of nucleic acid which can be transcribed in the target cells. They are preferably inserted into a vector, plasmid vectors or viral vectors being particularly preferred. In a preferred embodiment, these vectors are administered to patients externally or internally, locally, into a body cavity, into an organ, into the bloodstream, into the airway, into the gastrointestinal tract, into the genitourinary tract or intramuscularly or subcutaneously.
  • an effector gene [component e)] can be expressed both cell-specifically, virus-specifically, under certain metabolic conditions and / or cell-cycle-specifically, the effector gene preferably being a gene which is for a pharmacologically active substance or for Enzyme encodes which cleaves an inactive precursor of a drug into an active drug.
  • Effector gene can be chosen such that the pharmacologically active substance or the enzyme is expressed as a fusion protein with a ligand and this ligand is applied to the surface of cells, e.g. proliferating endothelial or tumor cells binds.
  • the present invention also relates to cells from yeasts or mammals which contain a nucleic acid construct according to the invention.
  • the nucleic acid constructs are introduced into cell lines, which can then be used after transfection to express the transgene. These cells can thus be used to provide a remedy for patients.
  • a preferred use of the nucleic acid construct according to the invention is the treatment of a disease, the provision of the remedy comprising the introduction of a nucleic acid construct into a target cell and its virus- or target cell-specific or metabolically specific or non-specific and cell cycle-specific expression.
  • the invention furthermore relates to the administration of mammalian cells which contain a nucleic acid construct according to the invention for the production of a medicament for the treatment of a disease.
  • endothelial cells can be obtained from the blood, transfected in vitro with the nucleic acid construct according to the invention and injected into the patient, for example intravenously.
  • Such in vitro transfected cells can also be administered to patients in combination with a vector according to the invention.
  • This combination means that cells and vectors are administered or injected at the same time or at different times, at the same or at different locations.
  • nucleic acid constructs according to the invention do not occur in nature in this form, i.e. the effector gene for the active ingredient or for an enzyme or for a ligand-effector fusion protein is not naturally combined with the minimal promoter according to the invention containing a CDE-CHR element or an E2F-BS-CHR element and with a DNA binding sequence for a recombinant transactivator .
  • the promoters and the effector gene for the active substance (or for the enzyme) of the nucleic acid constructs according to the invention are selected depending on the intended use.
  • nucleotide sequences are to be used as promoter sequences which, after binding transcription factors, the transcription activate a structural gene located adjacent to the 3 'end.
  • the choice of the promoter sequence to be combined with the CDE-CHR or E2F-BS-CHR [component d)] is based on the disease to be treated and the target cell to be transduced.
  • the additional promoter sequence can be activated without restriction, target cell-specific, under certain metabolic conditions, cell cycle-specific or virus-specific.
  • the promoter sequences to be selected include, for example:
  • promoters and activator sequences which can be activated without restriction, such as, for example
  • viral promoter and activator sequences such as
  • Metabolically activatable promoter and enhancer sequences such as, for example, the enhancer inducible by hypoxia (Semenza et al., PNAS 88, 5680 (1991); McBumey et al., Nucl. Acids Res. 19, 5755 (1991)) or by radiation inducible promoters such as that from ionizing radiation inducible element of the egr-1 promoter (Hallahan et al., Nature Med. 1, 786, 1995)).
  • enhancer inducible by hypoxia Semenza et al., PNAS 88, 5680 (1991); McBumey et al., Nucl. Acids Res. 19, 5755 (1991)
  • radiation inducible promoters such as that from ionizing radiation inducible element of the egr-1 promoter (Hallahan et al., Nature Med. 1, 786, 1995)).
  • Promoters that can be activated specifically for the cell cycle are, for example, the promoter of the cdc25C gene, the cyclin A gene, the cdc2 (cdk-1) gene, the
  • binding sequences include monomers or multimers of the nucleotide sequence referred to as Myc E-Box [5'-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3 '; SEQ ID NO: 1]; Blackwood and
  • Tetracycline-activatable promoters such as the tetracycline operator in combination with a corresponding repressor.
  • These preferably include promoters or activator sequences from promoters or enhancers of those genes which code for proteins preferably formed in selected cells.
  • promoters for the following proteins are preferably to be used in the following cells:
  • Endothelin in particular Endothelin B or Endothelin-1
  • VCAM-1 Vascular Cell Adhesion Molecule
  • synthetic activator sequences can also be used which consist of oligomerized binding sites for transcription factors which are preferentially or selectively active in endothelial cells.
  • synthetic activator sequences consist of oligomerized binding sites for transcription factors which are preferentially or selectively active in endothelial cells.
  • GATA-2 Transcription factor GATA-2, whose binding site in the endothelin-1 gene is 5'-TTATCT-3 '[Lee et al., Biol. Chem. 266, 16188 (1991), Dormann et al., J. Biol. Chem. 267, 1279 (1992) and Wilson et al., Mol. Cell Biol. 10, 4854 (1990)].
  • the gene regulatory sequences for the VEGF gene are the 5 'flanking region, the 3' flanking region, the c-Src gene or the v-
  • the gene regulatory sequences for the VEGF gene have already been listed in the section "Promoters activated in cells in the vicinity of activated endothelial cells” (see above).
  • HHL Helix-Loop-Helix
  • MRF4 muscle-specific transcription factors.
  • the muscle-specific transcription factors also include the zinc finger protein GATA-4.
  • the HLH proteins and GATA-4 show muscle-specific transcription not only with promoters of muscle-specific genes, but also in a heterologous context, including with artificial promoters.
  • artificial promoters are, for example, multiple copies of the (DNA) binding site for muscle-specific HLH proteins such as the E-Box (Myo D) (e.g. 4x AGCAGGTGTTGGGAGGC, SEQ ID NO: 2); or multiple copies of the E-Box (Myo D) (e.g. 4x AGCAGGTGTTGGGAGGC, SEQ ID NO: 2); or multiple copies of the E-Box (Myo D) (e.g. 4x AGCAGGTGTTGGGAGGC, SEQ ID NO: 2); or multiple copies of the E-Box (Myo D) (e.g. 4x AGCAGGTGTTGGGAGGC, SEQ ID NO: 2); or multiple copies of the E-Box (Myo D) (e.g. 4x AGCAGGTGTTGGGAGGC, SEQ ID NO: 2);
  • DNA binding site for GATA-4 of the ⁇ -myosin heavy chain gene e.g. 5'- GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG3 ', SEQ ID NO: 3
  • genes that code for the following proteins include in particular the gene regulatory sequences or elements from genes that code for the following proteins, for example:
  • Such gene regulatory sequences include promoter sequences for genes of a cytokine or its receptor, which are expressed in hematopoietic cells or in neighboring cells such as the stroma.
  • IRF-1 Interferon Regulatory Factor 1
  • promoters and activator sequences activated in lymphocytes and / or macrophages
  • genes for cytokines, cytokine receptors and adhesion molecules and receptors for the Fc fragment of antibodies include, for example, the promoter and activator sequences of the genes for cytokines, cytokine receptors and adhesion molecules and receptors for the Fc fragment of antibodies.
  • IRF-1 Interferon Regulatory Factor 1
  • the promoter of IRF-1 is activated by IL-6 as well as by IFN ⁇ or IFN ⁇ ).
  • M-CSF Macrophage Colony Stimulating Factor
  • MMP matrix metalloproteinases
  • TMP-3 tissue inhibitors of metalloproteinases
  • c-myc proteins bind and activate multimers of the nucleotide sequence referred to as Myc E-Box (5'-GGAAGCAGACCAGCTGGTCTG CTTCC-3 ', SEQ ID NO: 1)
  • a gene regulatory nucleotide sequence is provided as the promoter or activator sequence, with which transcription factors, formed or actively interacting in tumor cells, interact.
  • the preferred promoters or activator sequences include gene regulatory sequences or elements from genes which encode proteins formed especially in cancer cells or sarcoma cells.
  • the promoter of the N-CAM protein is preferably used in small cell bronchial carcinomas
  • the promoter of the "hepatitis growth factor” receptor or the L-plastin is used in ovarian cancer
  • the promoter of L-plastin or the polymorphic epithelial mucin (PEM) is used in pancreatic carcinoma .
  • the recombinant transactivator consists of a DNA-binding domain [component b1) and a transactivation domain, rich in glutamine, Ser and / or Thr [component b2)].
  • components b3) and b4) are inserted for the proteins which bind the coupling substance, in the case of a recombinant transactivator [component b ")] controlled by oncogenes or viruses, component b5) for the binding protein for a regulatory protein inserted.
  • component b), b ') or b ") can be increased by inserting a nuclear localization signal (NLS).
  • NLS nuclear localization signal
  • the NLS from SV40 (Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991)) can be used as NLS .
  • the DNA-binding domain represents at least one sequence
  • lac I lac repressor
  • tet-R The tetracycline repressor (tet-R) protein (Gossen et al., PNAS USA 89, 5547 (1992);umblermann et al., EMBO J. 11, 1487 (1992)) or
  • the DNA of those transactivation domains which are rich in glutamine, serine and / or threonine is to be used.
  • these transactivation domains include, for example,
  • Oct-2 Activation domain of Oct-2 (amino acids 438 to 479; Tanaka et al., Mol. Cell Biol. 14, 6064 (1994)) or amino acids 3 to 154; Das et al., Nature 374, 657 (1995)) or
  • Proteins A and B include, for example:
  • FKBP FK506 binding protein
  • FKBP-rapamycin-associated protein that binds to the rapamycin-FKBP complex, or its partial sequence that binds to the rapamycin-FKBP complex (FRAP).
  • Fv Genes for rec. Fv are used which bind to rapamycin and / or inhibit the binding of FKBP or FRAP to rapamycin
  • FKBP FK506 binding protein
  • Cyclophilin Calcineurin or its binding to the Cyclosporin A / Cyclophilin complex
  • genes for different rec. Fv can be used, which bind to different epitopes of cyclosporin A.
  • cephalexin • Antibodies or antibody fragments (rec. Fv) against the acyl side chain at the C-7 position of the cephem
  • Folic acid binding protein • Antibodies or antibody fragments (rec. Fv) against folic acid for the coupling substance: retinoic acid
  • Estrogen-binding domain of the estrogen receptor protein • Antibodies or antibody fragments (rec. Fv) against the estrogen receptor
  • Such regulatory proteins include, for example, the proteins expressed by tumor suppressor genes.
  • Regulatory protein component b5) (cellular binding protein with binding sequence for the regulatory protein)
  • component b5) is a binding sequence from a non-cell-specific binding protein for a regulator protein.
  • a non-cell-specific binding sequence can be of viral, bacterial or parasitic origin, for example.
  • component b) is inhibited in normal cells by binding the associated regulator protein to component b5).
  • the associated regulatory protein is largely bound by the intracellular production of the binding protein containing the binding sequence by the respective infectious agent.
  • Component b) is thus free and functional in these cells.
  • component b5) is an antibody or part of an antibody with binding sequences (VH and VL) for a regulator protein.
  • pRb • monoclonal antibodies specific for active (non-phosphorylated) pRb
  • the epitope-binding parts of the antibody FVL and FVH should preferably be used as component b5), in the case of murine origin in humanized form. Humanization takes place in the method described by Winter et al. (Nature 349, 293 (1991) and Hoogenbooms et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993)).
  • the antibody fragments are prepared according to the prior art, for example in the manner described by Winter et al. , Nature 349, 293 (1991), Hoogenboom et al., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993), Girol. Mol. Immunol. 28, 1379 (1991) or Huston et al., Int. Rev Immunol., 10: 195 (1993).
  • Recombinant antibody fragments are produced directly from existing hybridomas or are isolated using the "phage display” technology (Smith, Science 228, 1315, (1985)) from libraries of murine or human antibody fragments (Winter et al., Annu. Rev. Immunol 12, 433 (1994)). This
  • Antibody fragments are then used directly at the genetic level for coupling with components b1) and b2).
  • VH, VL The genetic information required for the antigen-binding domains (VH, VL) is used to produce recombinant antibody fragments from hybridomas
  • Antibody encodes, by isolating the mRNA, the reverse transcription of the RNA in cDNA and the subsequent amplification by means of polymerase chain reaction (Saiki et al., Science 230, 1350 (1985)) and oligonucleotides complementary to the 5 'and 3' ends of the variable fragments (Orlandi et al. 1989).
  • VH and VL fragments are then converted into bacterial expression vectors, for example in the form of Fv fragments (Skerra and Plückthun, Science 240, 1038 (1988)), single-chain Fv fragments (scFv) (Bird et al., Science 242, 423 (1988); Huston et al., PNAS USA 85, 5879 (1988)) or as Fab fragments (Better et al., Science 240, 1041 (1988)).
  • Fv fragments Skerra and Plückthun, Science 240, 1038 (1988)
  • scFv single-chain Fv fragments
  • Fab fragments Better et al., Science 240, 1041 (1988)
  • New antibody fragments can also be isolated directly from antibody libraries (immune libraries, naive libraries) of murine or human origin using the "phage display” technology (McCafferty et al., Nature 348, 552 (1990); Reitling et al., Gene 104, 147 (1991); McCafferty et al., Nature 348, 552 (1990); Hoogenboom et al., Nucl. Acid Res. 19, 4133 (1991); Barbas et al., PNAS USA 88, 7978 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991); Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889 (1992); Marks et al., Bio / Technol. 11, 1145 (1993)) .
  • Immune libraries are prepared by PCR amplification of the variable antibody fragments from B-lymphocytes of immunized animals (Sastry et al., PNAS USA 86, 5728 (1989); Ward et al., Nature 341, 544 (1989); Clackson et al., Nature 352, 624 (1991)) or patients (Mullinax et al., PNAS USA 87, 8095 (1990); Barbas et al., PNAS USA 88, 7978 (1991)).
  • the affinity of antibody fragments can be further increased by means of the "phage display” technology, whereby new libraries from existing ones
  • the selection of the DNA binding sequence depends on the choice of the DNA binding domain. For the examples for the DNA binding domains listed under 11.1) there are, for example, the following options:
  • Gal4 protein [nucleotide sequence: 5'- CGGACAACTGTTGACCG-3 ', SEQ ID NO: 4]; Chasman and Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990) or [nucleotide sequence: 5'-CGGAGGACTGTCCTCCG 3 ', SEQ ID NO: 5]; or [nucleotide sequence: 5'-CGGAGTACTGTCCTCCG-3 ', SEQ ID NO: 6]; Giniger et al., PNAS USA 85, 382 (1988)
  • At least one binding sequence [nucleotide sequence: 5'-TACTGTATGTACATA-CAGTA-3 ', SEQ ID NO: 7]; for the LexA protein [LexA operator; Brent et al., Nature 612, 312 (1984)]
  • Lac-Opera binding sequence at least one Lac-Opera binding sequence (nucleotide sequence: 5'-GAATTGTG AGGCTCACAATTC-3 ', SEQ ID NO: 8); for the lac I repressor protein (Fuerst et al., PNAS USA 86, 2549 (1989); Simons et al., PNAS USA 81, 1624 (1984))
  • tetracycline operator (tet 0) binding sequence (nucleotide sequence: 5'-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3 ', SEQ ID NO: 9); for the tetracycline repressor (tet R) protein
  • At least one binding sequence (nucleotide sequence: 5'-TAATGATGGGCG-3 ', SEQ ID NO: 10); for the ZFHD-1 protein (Pomeranth et al., Science 267, 93
  • fragments For example, fragments
  • effector genes code for an active ingredient for the prophylaxis and / or therapy of a disease. Effector genes and promoter sequences should be selected with regard to the type of therapy for the disease and taking into account the target cell to be transduced.
  • Target cells a) Therapy of tumors a.1) Target cells:
  • Promoters - endothelial cell-specific and cell cycle-specific or
  • the retinoblastoma protein (pRb / p110) and the related p107 and p130 proteins are inactivated by phosphorylation.
  • Those genes of these cell cycle inhibitors which have mutations for the inactivation sites of the expressed proteins are preferably to be used without their function being impaired thereby. Examples of these mutations have been described for p110.
  • the DNA sequence for the p107 protein or the p130 protein is mutated in an analogous manner. - the ⁇ 53 protein
  • the protein p53 is inactivated in the cell either by binding to special proteins, such as MDM2, or by oligomerizing the p53 via the dephosphorylated C-terminal serine.
  • a DNA sequence is therefore preferably used for a p53 protein which is shortened at the C-terminal by the serine 392.
  • PAI-1 Plasminogen activator inhibitor-1
  • LIF Leukemia inhibitory factor
  • Interferons such as IFN- ⁇ , IFNß or IFN ⁇
  • TNF such as TNF ⁇ or TNFß
  • the cytostatic or cytotoxic antibodies include those directed against membrane structures of endothelial cells, as described, for example, by Burrows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155 (1994)), Hughes et al., (Cancer Res. 49, 6214 (1989)) and Maruyama et al., (PNAS USA 87, 5744 (1990)). In particular, these include antibodies against the VEGF receptors.
  • This also includes cytostatic or cytotoxic antibodies directed against membrane structures on tumor cells.
  • cytostatic or cytotoxic antibodies directed against membrane structures on tumor cells.
  • Such antibodies have been described, for example, by Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, Kunststoff (1988) and Contrib. to Oncol. 43, Karger Verlag, Kunststoff
  • This also includes antibodies directed against membrane structures of leukemia cells.
  • a large number of such monoclonal antibodies have already been described for diagnostic and therapeutic methods (reviews by Kristensen, Danish Medical
  • suitable ligands are, for example, monoclonal antibodies or their antigen-binding antibody fragments directed against the following membrane antigens: Cells membrane antigen
  • the ligands include all substances that bind to membrane structures or membrane receptors on endothelial cells. These include, for example, cytokines such as IL-1 or growth factors or their
  • Fragments or partial sequences of them that bind to receptors expressed by endothelial cells such as, for example, PDGF, bFGF, VEGF, TGF.
  • adhesion molecules that bind to activated and / or proliferating endothelial cells. These include, for example, SLex, LFA-1, MAC-1, LECAM-1, VLA-4 or Vitronectin.
  • This also includes substances that bind to membrane structures or membrane receptors of tumor or leukemia cells.
  • this includes growth factors or their fragments or partial sequences of them that bind to receptors expressed by leukemia cells or tumor cells.
  • MCP-2 - IL-2 - RANTES
  • MCAF monocyte chemotactic and activating factor
  • MIP-1 ⁇ , -ß macrophage inflammatory protein-1
  • NAP-2 - neutrophil activating protein-2
  • LIF human leukemia inhibitory factor
  • Cobra venom factor or partial sequences of the CVF which functionally correspond to the human complement factor C3b, i.e. which can bind to the complement factor B and after splitting by the factor
  • complement factor C3 which are functionally and structurally similar to the CVF - bacterial proteins which activate complement or trigger inflammation, such as, for example, porins from Salmonella typhi murium, "clumping" factors from Staphylococcus aureus, modulins especially from gram-negative bacteria, " Major outer membrane protein "from Legionella or from Haemophilus influenza type B or from Klebsielles or M-molecules from streptococcal group G.
  • CB Human carboxy peptidase
  • Phosphatase in particular human alkaline phosphatase, human acidic prostate phosphatase or type 5 acidic phosphatase
  • Oxidase in particular human lysyloxidase or human acidic D-aminooxidase
  • Target cells - proliferating endothelial cells or
  • Immunosuppressive antibodies are, for example, antibodies specific for the T cell receptor or its CD3 complex, against CD4 or CD8 furthermore against the IL-2 receptor, IL-1 receptor or IL-4 receptor or against the adhesion molecules CD2, LFA-1, CD28 or CD40 b.5) Effector genes for the therapy of antibody-mediated autoimmune diseases, for example for
  • Structural genes are used which are used for fusion proteins from antibodies or Fab or rec. Code Fv fragments of these antibodies or other ligands specifically for the target cell and the above cytokines, growth factors, receptors, cytostatic or cytotoxic proteins and enzymes.
  • structural genes are selected whose expressed protein directly or indirectly inhibits inflammation, for example in the joint, and / or promotes the reconstitution of extracellular matrix (cartilage, connective tissue) in the joint.
  • IL-1 -RA IL-1 receptor antagonist
  • soluble IL-1 receptor binds and inactivates IL-1
  • IL-6 increases the secretion of TIMP and superoxides and decreases the secretion of IL-1 and TNF ⁇ by synovial cells and chondrocytes
  • TNF receptor soluble TNF receptor binds and inactivates TNF.
  • IL-4 inhibits the formation and secretion of IL-1, TNF ⁇ and MMP - IL-10
  • IL-10 inhibits the formation and secretion of IL-1, TNFoc and MMP and increases the secretion of TIMP
  • IGF-1 insulin-like growth factor
  • IGF-1 stimulates the synthesis of extracellular matrix.
  • TGFß especially TGFßl and TGFß2
  • TGFß stimulates the synthesis of extracellular matrix.
  • TIMP-1 TIMP-1
  • TIMP-2 TIMP-3
  • LIF Leukemia Inhibitory Factor
  • NGF Nerve growth factor
  • BDNF Brain-derived neurotrophic factor
  • NT-3 Neurotrophin-3
  • IL-10 inhibits the formation of IFN ⁇ , TNF ⁇ , IL-2 and IL-4
  • tPA Tissue Plasminogen Activator
  • uPA Urokinase-type Plasminogen Activator
  • Serine proteinase inhibitors such as C-1S inhibitor, ⁇ 1-antitrypsin or antithrombin III
  • TFPI Tissue Factor Pathway Inhibitor
  • the active substance to be selected is the DNA of a protein formed by the infectious agent, which leads to neutralization and / or killing of the exciter by triggering an immune reaction, ie by antibody binding and / or by cytotoxic T-lymphocytes.
  • Such So-called neutralization antigens are already used as vaccine antigens (see overview in Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992)).
  • DNA coding for neutralization antigens of the following pathogens is preferred:
  • HSV Herpes Simplex Virus
  • RSV Respiratory Syncytial Virus
  • VZV Varizella Zoster Virus
  • Such active substances within the meaning of the invention also include the DNA of an anti-idiotype antibody or its antigen-binding fragments, the antigen binding structures (the "complementary determining regions") of which are copies of the protein or carbohydrate structure of the neutralizing antigen of the infectious agent.
  • anti-idiotype antibodies can replace carbohydrate antigens in particular in bacterial infectious agents.
  • antigens on tumor cells have been described, for example, by Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, Kunststoff
  • an enzyme that cleaves a precursor of an antiviral or cytotoxic substance into the active substance an enzyme that cleaves a precursor of an antiviral or cytotoxic substance into the active substance.
  • IFN ⁇ , IFNß, IFN- ⁇ , TNFß, TNF ⁇ , IL-1 or TGFß include, for example, IFN ⁇ , IFNß, IFN- ⁇ , TNFß, TNF ⁇ , IL-1 or TGFß
  • VH and VL fragments produced as already described are VH and VL fragments produced as already described.
  • Antibodies against virus antigens include:
  • Rev binding proteins Anti Coxackie Virus anti Hantaan Virus - a Rev binding protein. These proteins bind to the Rev-RNA and inhibit Rev-dependent post-transcriptional stages of retrovirus gene expression. Examples of Rev binding proteins are:
  • Ribozymes that digest the mRNA of genes for cell cycle control proteins or the mRNA of viruses have been clearly described, for example, by Christoffersen et al., J. Med. Chem. 38, 2033 (1995).
  • Antibacterial proteins include, for example, antibodies that neutralize bacterial toxins or opsonize bacteria.
  • An IRES enables the expression of two DNA sequences linked together by an IRES.
  • IRES IRES have been described, for example, by Montford and Smith (TIG 11, 179 (1995); Kaufman et al., Nucl. Acids Res. 19, 4485 (1991); Morgan et al., Nucl. Acids Res. 20, 1293 (1992) ; Dirks et al., Gene 128, 247 (1993); Pelletier and Sonenberg, Nature 334, 320 (1988) and Sugitomo et al., BioTechn. 12, 694 (1994)).
  • the corresponding DNA sequence of the IRES sequence of the poliovirus (position ⁇ 140 to> 630 of the 5 'UTR can be used.
  • preferred combinations of effector genes are, for example, for a) the therapy of tumors - identical or different, cytostatic, apoptotic, cytotoxic and / or inflammation-causing proteins or - same or different enzymes for cleaving the precursor of a cytostatic
  • IL-1 IL-1, IL-3, IL-6 or GM-CSF and erythropoietin, G-CSF or thrombopoietin
  • an antigen and an immunostimulating cytokine such as IL-1 ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-2, GM-CSF, IL-3 or IL-4 receptor
  • nucleotide sequence GCCACC or GCCGCC can be inserted at the 3 'end of the promoter sequence and immediately at the 5' end of the start signal (ATG) of the signal or transmembrane sequence (Kozak, J. Cell Biol. 108, 299 (1989) ) become.
  • the homologous signal sequence which may be present in the DNA sequence of the effector gene can be replaced by a heterologous signal sequence which improves the extracellular discharge.
  • a sequence for a transmembrane domain can be introduced as an alternative or in addition to the signal sequence.
  • the transmembrane sequence of the human macrophage colony-stimulating factor (DNA position ⁇ 1485 to>1554; Cosman et al., Behring Inst. Mitt. 83, 15 (1988)) or the DNA sequence for the signal and transmembrane region of the human respiratory syncytial virus (RSV) glycoprotein G (amino acids 1 to 63 or their
  • Partial sequences amino acids 38 to 63; Vijaya et al., Mol. Cell Biol. 8, 1709 (1988); Lichtenstein et al., J. Gen. Virol. 77, 109 (1996)) or the DNA sequence for the signal and transmembrane region of the influenza virus neuraminidase (amino acids 7 to 35 or the partial sequence amino acids 7 to 27; Brown et al., J. Virol. 62, 3824 (1988) ) are inserted between the promoter sequence and the sequence of the effector gene.
  • the nucleotide sequence for a glycophospholipid anchor can also be inserted.
  • a glycophospholipid anchor is inserted at the 3 'end of the nucleotide sequence for the structural gene and can also be used to insert a signal sequence.
  • Glycophospholipid anchors have been described, for example, for the CEA, for the N-CAM and for other membrane proteins, such as, for example, Thy-1 (see overview Ferguson et al., Ann. Rev. Biochem. 57, 285 (1988)).
  • a further possibility of anchoring active substances to the cell membrane according to the present invention is the use of a DNA sequence for a ligand-active substance fusion protein.
  • the specificity of the ligand of this fusion protein is directed against a membrane structure on the cell membrane of the selected target cell.
  • the ligands that bind to the surface of cells include, for example, antibodies or antibody fragments directed against structures on the surface of, for example
  • this includes antibodies against the VEGF receptors or against kinin receptors
  • muscle cells such as antibodies against actin or antibodies against angiotensin II receptors or antibodies against receptors for growth factors, such as against EGF receptors or against PDGF receptors or against FGF receptors or antibodies against endothelin A receptors
  • the ligands also include antibodies or their fragments which are directed against tumor-specific or tumor-associated antigens on the tumor cell membrane. Such antibodies have already been described.
  • the murine monoclonal antibodies are preferably used in humanized form.
  • Fv fragments and their fusion products are, as already described, produced using the technology known to the person skilled in the art.
  • the ligands also include all active ingredients, such as, for example
  • Cytokines or adhesion molecules, growth factors or their fragments or partial sequences thereof, mediators or peptide hormones, which bind to membrane structures or membrane receptors on the selected cell include ligands for endothelial cells such as IL-1, PDGF, bFGF, VEGF, TGGß (Pusztain et al., J. Pathol. 169, 191 (1993)) or kinin and derivatives or analogs of kinin.
  • Adhesion molecules such as SLex, LFA-1, MAC-1, LeCAM-1, VLA-4 or vitronectin and derivatives or analogs of vitronectin have already been used for
  • Endothelial cells are described (reviews by Augustin-Voss et al., J. Cell Biol. 119: 483 (1992); Pauli et al., Cancer Metast. Rev. 9, 175 (1990); Honn et al., Cancer Metast. Rev. 11, 353 (1992); Varner et al., Cell Adh. Commun. 3, 367 (1995)).
  • Example 1 Production and testing of an expression system containing a chimeric promoter system with a recombinant transcription factor in endothelial cells
  • the expression system according to the invention consists of the constructs RTA (recombinant transcription activator) construct and reporter construct 1 or 2 listed below with different nucleotide sequences which follow one another downstream:
  • Reporter construct 3 Corresponds to reporter construct 1, wherein in the basal promoter of cdc25C [nucleotide sequence -20 to +121; Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)] the CDE element TGGCGGA was mutated to TGGCtGA.
  • pGL3promoter from Promega: Expression system with the following nucleotide sequences - SV40 promoter
  • Cyclin A promoter (-214 to +100, Henglein et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 91, 5490-5494 (1994))
  • PGL3 Promega, luciferase cDNA reporter
  • the promoter elements cloned into this vector were amplified by PCR from human genomic DNA.
  • the oligonucleotides used for this each contained 4 nucleotides overhang (5 ' -GATC-3 ' ), followed by 6 nucleotides with the required ones Restriction sites (5 ' primer: BamHI (GGATCC) / 3 ' primer: Hindill (AAGCTT) for control plasmids 1 and 2 and reporter plasmids 1 and 3; 5 ' primer: Bgl II (AGATCT) / 3 ' primer: Hindill for the reporter plasmid 2) and then 20-25 nucleotides complementary to the promoter to be amplified (starting with the position in brackets relative to the start of transcription).
  • the positions in parentheses refer to the sequence listed in the cited reference.
  • PCR products were purified with QIAquickTM spin columns (Qiagen) according to the manufacturer's instructions, digested with the appropriate restriction enzymes (these enzymes are commercially available) and, after separation by agarose gel electrophoresis, purified again with QIAquickTM spin columns.
  • Gal4 binding sites were synthesized as oligonucleotides with overhangs required for the corresponding restriction sites (5 ' : BamHI / 3 ' : Bgl II), purified with SephadexG25 (Pharmacia) and hybridized.
  • the digested PCR products and hybridized oligonucleotides were then ligated into the appropriately cut and purified vectors using T4 DNA ligase (Promega).
  • the promoter activity of the constructs described under a) was determined by transient transfection or cotransfection in endothelial cells with subsequent measurement of the luciferase activity.
  • BAECs bovine aortic endothelial cells
  • bovine aortic endothelial cells bovine aortic endothelial cells
  • the Luciferase assay was performed as described in Lucibello et al. (EMBO J. 14, 132 (1995)).
  • Control construct 2 > 150x). These constructs served as controls for the experiments with the expression systems according to the invention.
  • reporter construct 1 5.5x
  • reporter construct 2 8.3x
  • the luciferase activity was significantly higher than after transfection of the respective reporter constructs alone.
  • Example 2 Production and testing of an expression system containing a chimeric promoter system with a recombinant
  • the expression system according to the invention consists of the following constructs with different nucleotide sequences which follow one another downstream: RTA constructs
  • the RTA (recombinant transcription activator) plasmids encode a fusion protein from the Gal4 DNA binding domain and the serine, threonine and glutamine-rich transactivation domain of the transcription factor NF-YA.
  • Tyr tyrosinase promoter 2 x distal element (TDE, -2014 / -1811) and 1 x proximal element (TPE, -209 / + 51) (Shibata et al, J. Biol. Chem. 267, 20584 (1992) ), cDNA for luciferase (pGL3, Promega) (Fig. 9B) - cdc25C cdc25C promoter (-290 / + 121) (Lucibello et al, EMBO J. 14, 132-142 (1995)), cDNA for luciferase (pGL3 , Promega); identical to control construct 3 under I (FIG. 6C)
  • PGL3 Promega, luciferase cDNA reporter was used as the vector for all reporter constructs and control constructs.
  • the promoter elements cloned into this vector were amplified by PCR from human genomic DNA.
  • the oligonucleotides used for this each contained 4 nucleotides overhang (GATC), followed by 6 nucleotides with the required restriction cleavage sites (BamHI (GGATCC) / Hindlll (AAGCTT) for the control plasmids cdc25C and cycA and the reporter plasmids 5G25C and 5G25CRT7; KpCll / GhelC) (GCTAGC) or Nhel / Xhol (CTCGAG) for the TDE and Xhol / Bgl II (AGATCT) for the TPE, Bgl II / Hind III for the reporter plasmids 8GCycA and 8GCycART7 and then 20 - 25 complementary to
  • PCR products were purified with QIAquick TM spin columns (Qiagen) according to the manufacturer's instructions, digested with the appropriate restriction enzymes (these enzymes are commercially available) and, after separation by agarose gel electrophoresis, purified again with QIAquick TM spin columns.
  • Gal4 binding sites were synthesized as oligonucleotides with overhangs required for the corresponding restriction sites (Kpnl (top: 5 ' -; bottom: 3 ' -) / Xhol (top: 5 ' -; bottom: 3 ' -) or BamHI (top: 5 ' -; bottom: 3 ' -) / Bgl II (top: 5 ' -; bottom: 3 ' -)), purified and hybridized with SephadexG25 (Pharmacia). The digested PCR products and hybridized oligonucleotides were then ligated into the appropriately cut and purified vectors using T4 DNA ligase (Promega).
  • the promoter activity of the constructs described under a) was determined by transient cotransfection in melanocytes (MeWo, human), fibroblasts (3T3, murine) and prostate carcinoma cells (PC-3, human) with subsequent measurement of the luciferase activity.
  • the cells were transiently transfected with DOTAP (Boehringer, Mannheim) according to the manufacturer's instructions.
  • Luciferase assay was carried out as described in Lucibello et al. (EMBO J, 14, 132 (1995)). 1 mg (reporter) + 2 mg (RTA) plasmid with 6 ml DOTAP per 3.5 cm dish transfected, pUC19 plasmid being used instead of the RTA plasmid in the controls.
  • proliferating cells complete medium
  • the non-cell cycle regulated construct SV40p was used for standardization (its activity was set to 1).
  • the cells in the G1 phase were synchronized by a 60-hour methionine withdrawal after the transfection.
  • Table 1 shows a clear cell type specificity of the system: (1) the 8GCycA construct has only a low activity, which is in the range of the activity of the empty vector basic, (2) by co-transfection of the CMV-GN construct, a clear activation takes place in all 3 Cell lines, (3) specific activation is achieved by cotransfection of the Tyr-GN construct only in the target cells, ie in the melanoma cells, achieved by selective expression of the Gal-NF-Y fusion protein and (4) there is only very little activation by co-transfection of the Tyr-G construct, i.e. the activation in (3) is due to the transactivation domain of the NF-YA.
  • the specificity of the 8GCycA + Tyr-GN system is 58 (comparison MeWo: PC-3) and 73 (comparison MeWo: 3T3) with very little activity in non-target cells.
  • the values in Table 2 demonstrate the cell cycle regulated activity of the system: -
  • the cyclinA promoter shows a 26-fold cell cycle regulation (activity proliferating MeWos: activity MeWos in G1, positive control)
  • RT7 A mutation of the CDE element (RT7) leads to a drastically increased activity in G1 cells and thus to a lower cell cycle regulation of 5-fold.
  • the cell cycle regulation is therefore above all to CDE / CHR-mediated repression in G1 (by the CDE / CHR-binding repressor who
  • CDE / CHR element also has both a clear cell type specificity (3.9 times) and cell cycle regulation (8.4 times).
  • tissue-specific expression of a Gal-NF-Y fusion protein which controls the expression of a gene both tissue-specifically and proliferation-dependent via Gal4-DNA binding sites upstream of a CDE / CHR element, could thus be shown by way of example.
  • a> 20-fold cell cycle regulation with> 50-fold cell type specificity was achieved.
  • the activity of the system is comparable to the activity of the wild-type cyclin A promoter in proliferating target cells and hardly higher than that of the empty vector pGL3basic in non-proliferating target cells and in non-target cells.
  • Example 3 In vivo experiments In order to find out whether the level of transcription which is achieved by the promoter system according to the invention is sufficient to achieve a biological effect, an in vitro TNF cytolysis assay was carried out. This assay, which measures cytotoxic effects on the TNF- ⁇ sensitive cell line L 929, was carried out with the medium of MeWo cells which had been cotransfected with activator (Tyr-GN) and effector (Gal Cyc ATNF) constructs. To construct Gal Cyc ATNF, the luciferase cDNA from Gal Cyc A was replaced by the TNF- ⁇ cDNA from the plasmid pAS3 (obtained from M. Clauss, Max Planck Institute, Bad Nauheim, Germany). pAS3 contains the mouse TNF- ⁇ cDNA cloned into the Pst I / Eco Rl restriction site of the vector pBluescript II SK.
  • MeWo cells using Lipofectin were used in accordance with the manufacturer's instructions.
  • a microgram of Gal Cyc ATNF and 1 ⁇ g pUC19 or Tyr-GN were mixed with 10 ⁇ l lipofectin in OptiMEM and the cells were incubated with it for 6 hours.
  • the MeWo cells were co-transfected with Gal Cyc ATNF / pUC19 or Gal Cyc ATNF / Tyr-GN in three parallel batches. The medium was replaced 24 hours after transfection and collected after a further 24 hours. The culture supernatants were examined for TNF bioactivity by determining their cytotoxicity on the transformed mouse fibroblast cell line L 929. Such L 929 cells were seeded in microtiter plates at a density of 4 ⁇ 10 4 cells per well. After 16 hours, serial dilutions of mouse TNF- ⁇ in conditioned medium from untransfected MeWo cells and the supernatants of the transfected cells and each actinomycin D were added to a final concentration of 1 ⁇ g / ml.
  • the cytolysis was in the range of 60% (corresponding to ⁇ 1.0 ng / ml TNF- ⁇ in the supernatant).
  • only a negligible proportion of dead cells was found in the supernatants from cells that had been transfected with the Gal Cyc ATNF effector construct alone.
  • FIG. 5 Schematic representation of the RTA construct
  • Figure 6 Schematic representation of the control constructs for I. Fein: pGL3-
  • Figure 7 Schematic representation of the RTA constructs for II, the vector structure originates from pGL3 (Promega)
  • Figure 9 Schematic representation of the control constructs for II. Fein: pGL3-

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Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Nukleinsäurekonstrukt, dadurch charakterisiert, dass es folgende Komponenten enthält: Komponente a): mindestens einen Promotor; Komponente b): DNA kodierend für mindestens einen rekombinanten Transaktivator, dessen Transkription durch die Komponente a) aktiviert wird und der enthält: Komponente b1): DNA, kodierend für eine DNA-bindende Domäne; Komponente b2): DNA, kodierend für eine Transaktivierungsdomäne, welche reich ist an Glutamin, Serin und Threonin; Komponente c): mindestens eine DNA-Sequenz zur Bindung des Expressionsproduktes von Komponente b); Komponente d): mindestens einen minimalen Promotor, der das CDE-CHR-Element oder das E2F-BS-CHR-Element enthält und mit seinem 5'-Ende an das 3'-Ende von Komponente c) gebunden ist; Komponente e): mindestens ein Effektorgen, dessen Transkription durch Bindung des Expressionsproduktes von Komponente b) an die Komponente c) aktiviert wird; seine Herstellung und Verwendung; Vektoren enthaltend das Nukleinsäurekonstrukt; Zellen enthaltend diese Vektoren und die Verwendung des Nukleinsäurekonstrukts zur Herstellung eines Heilmittels.

Description

Beschreibung
Expressionssysteme enthaltend Chimäre Promotoren mit Bindungsstellen für rekombinante Transkriptionsfaktoren
A) Einleitung
Die Transkription eines Genes wird durch Aktivierungssequenzen (Promotoren und Enhancer) gesteuert. Derartige Aktivierungssequenzen stellen Nukleotidsequenzen dar, an welche Transkriptionsfaktoren binden, die hierdurch die Transkription des zugehörigen Genes in die Wege leiten.
Zahlreiche Aktivierungssequenzen sind als Promotoren oder Enhancersequenzen mittlerweile bekannt.
Entsprechend ihrer Funktion oder Herkunft werden sie eingeordnet in universal, d.h. in jeder Zelle wirkende Aktivierungssequenzen, in Aktivierungssequenzen viraler Herkunft und in eingeschränkt wirkende Aktivierungssequenzen.
Die Einschränkung kann z.B. zellspezifisch, metabolisch (z.B. unter hypoxischen Bedingungen) oder zellzyklusspezifisch sein.
Diese Einschränkungen in der Funktion der Aktivierungssequenzen werden genutzt bei der gezielten Expression eines Strukturgenes, z.B. im Rahmen der Gentherapie. So ist es eine gängige Technologie, die Expression eines Strukturgenes unter die Kontrolle eines zellspezifischen Promotors zu stellen (Sikora, Trends Biotech. 11 , 197 (1993)).
Die durch einen zellspezifischen Promotor eingeschränkte Aktivierung der Transkription eines Effektorgenes ist jedoch in vielen Fällen nicht ausreichend, teils weil die Aktivierung des zellspezifischen Promotors nicht genügend zellspezifisch ist, teils weil die Expression des Effektorgenes nur in solchen Zellen des ausgewählten Zelltyps gewünscht wird, die einen bestimmten Funktionszustand aufweisen. Ein derartiger Funktionszustand kann beispielsweise die Zellzyklusphase der Zelle sein.
Für eine weitergehende Regulation der Expression eines Effektorgenes ist es somit wünschenswert, mehrere Promotoren unterschiedlicher Spezifität für die Kontrolle der Expression eines Strukturgenes einzusetzen.
Für die Kombination eines Promotors einer beliebigen Spezifität mit einem zellzyklusspezifischen Promotor wurde die Chimäre Promotortechnologie entwickelt (Patentanmeldungen z.B. PCT/GB95/02000, EP-A 0 790 313). Sie besteht in einer Verknüpfung eines stromaufwärts gelegenen Promotors beliebiger Spezifität mit dem stromabwärts gelegenen CDE-CHR Element oder dem E2FBS-CHR Element.
Die Zellteilung wird unterteilt in die aufeinanderfolgenden Phasen G0 oder G1 , S, G2 und M. Die S-Phase ist die DNA Synthese-Phase, ihr folgt die Übergangsphase G2 (G2-Phase), an die sich die Mitose-Phase (M-Phase) anschließt, in welcher sich eine Mutterzelle in zwei Tochterzellen teilt. Zwischen der M-Phase und der S-Phase liegt die Ruhephase G0 (GO-Phase) oder die Übergangsphase G1 (G1 -Phase).
Die Zellteilung wird vorangetrieben durch die Gruppe von Proteinkinasen, den Cyclin/cdk-Komplexen. Diese bestehen aus einer katalytischen Untereinheit [cyclin dependent kinase (cdk, zum Beispiel cdk-1 , -2, -3, -4, -5, -6, -7 oder -8) und einer regulativen Untereinheit, dem Cyclin (zum Beispiel Cyclin A, -B1-B3, -D1-D3, -E, -H oder -C].
In jeder Phase des Zellzyklus sind unterschiedliche cdk-Komplexe besonders aktiv, so in der
mittleren G1 -Phase cdk4/Cyclin D1 -3 und cdk6/Cyclin D1 -3 späten G1 -Phase cdk2/Cyclin E
S-Phase cdk2/Cyclin A
G2/M-Übergangsphase cdkl /Cyclin B1 -3 und cdkl /Cyclin A
Die Aktivität der Cyclin/cdk-Komplexe besteht in der Phosphorylierung und damit Aktivierung oder Inaktivierung von Proteinen, die an der Kontrolle der DNA- Synthese und der Mitose direkt oder indirekt beteiligt sind.
Korrespondierend mit ihrer Funktion im Zellzyklus werden die Gene für einige Cycline und cdk's periodisch transkribiert und/oder periodisch aktiviert oder inhibiert, so durch den regulierten Abbau von Cyclinen, durch zelizyklusphasenspezifische Bindung von Inhibitoren (z.B. p16INK4A, p15INK4B, p21 Cip1 , p27Kip1 , ρ18INK4C, p19INK4D, p57) oder durch Modifizierung durch aktivierende (z.B. durch die cdc25-Phosphatasen, wie cdc25A, cdc25B und cdc25C oder cdk7/Cyclin H) oder inhibierende (z.B. weel kinase) Enzyme (Übersicht bei Zwicker und Müller, Progr. Cell Cycle Res. 91 (1995); La Thangue, Curr Opin. Cell Biol. 443 (1994); MacLachlan et al., Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expr. 127 (1995)).
Die periodische Expression von cdc25C in der G2-Phase des Zellzyklus wird im wesentlichen geregelt durch ein Element (CDE-CHR) in der Promotorregion des Genes für cdc25C. Dieses CDE-CHR-Element ist in der G0-/G1 -Phase von einem reprimierenden Protein besetzt und in der G2-Phase frei. Die Nukleotidsequenz dieses Promotorelements konnte identifiziert und gleichermaßen auch in den Promotoren der Gene für Cyclin A und cdk-1 gefunden werden, während im Promotor für B-myb eine zum Teil unterschiedliche Nukleotidsequenz (E2FBS-CHR) nachgewiesen wurde. Die Untersuchung der zellzyklusabhängigen Funktionsweise dieser Promotorelemente zeigte, daß ihre Blockade in der G0-/G1 -Phase gefolgt wird von einer Hochregulierung der Transkription des jeweiligen Genes, welches beim B-myb Gen besonders früh (in der mittleren G1 -Phase), beim Cyclin A in der G1/S-Übergangsphase, beim cdk-1 Gen in der S-Phase und beim cdc25C Gen erst in der späten S-Phase stattfindet (Zwicker und Müller, Progr. Cell Cycle Res. 91 (1995); Lucibello et al., EMBO J. 132 (1995); Liu et al., Nucl. Acids Res. 2905 (1995); Zwicker et al., Nucl. Acids Res. 3822 (1995); EMBO J. 4514 (1995)).
Überraschenderweise wurde des weiteren gefunden, daß das Element CDE-CHR (des Promotors für das Cyclin 25C, Cyclin A und cdk-1 Gen) wie auch das Element E2FBS-CHR (des Promotors für das B-myb Gen) nicht nur die Aktivierung und Transkription der homologen Gene in der G0-/G1 -Phase inhibieren kann, sondern auch die Aktivierung und Transkription anderer Gene. Diese Erfindung führte zu den Patentanmeldungen PCT/GB95/02000, EP-A 0 777 739, EP-A 0 777 740, EP-A 0 804 601 , EP-A 0 807 183, EP-A 0 790 313 und EP-A 0 860 445.
In diesen Patentanmeldungen wird offenbart, einen zelizyklusabhängigen Promotor zu kombinieren mit einem unspezifischen, zellspezifischen, virusspezifischen oder metabolisch aktivierbaren Promotor zur regulierten Aktivierung der Transkription eines Effektorgenes, welches ein Protein kodiert für die Prophylaxe und/oder Therapie einer Erkrankung. Derartige Erkrankungen können beispielsweise Tumorerkrankungen, Leukämien, Autoimmunerkrankungen, Arthritiden, Allergien, Entzündungen, Abstoßungen von transplantierte Organen, Erkrankungen des Blutkreislaufsystems, des Blutgerinnungssystems, Infektionen oder Schäden des zentralen Nervensystems sein.
Für die Kombination von unterschiedlichen Promotoren mit einem zellzyklusspezifischen Promotorelement wurde der sogenannte Chimäre Promotor entwickelt. In diesem Chimären Promotor wird die Aktivität einer unspezifischen, zellspezifischen, virusspezifischen oder metabolisch aktivierbaren Atkivierungssequenz (bzw. Promotorsequenz) durch das sich stromabwärts unmittelbar anschließende Promotorelement CDE-CHR oder E2FBS-CHR weitgehend auf die S- und G2-Phase des Zellzyklus beschränkt. Weiterführende Untersuchungen zur Funktionsweise, insbesondere des Promotorelementes CDE-CHR, ergaben, daß die durch das CDE-CHR Element zellzyklusabhängige Regulation einer stromaufwärts gelegenen Aktivatorsequenz weitgehend davon abhängig ist, daß die Aktivierungssequenz von Transkriptionsfaktoren mit glutaminreichen Aktivierungsdomänen aktiviert wird (Zwicker et al., Nucl. Acids. Res. 3822 (1995)).
Zu derartigen Transkriptionsfaktoren gehört beispielsweise Oct-2, Sp1 und NF-Y.
Dieses schränkt konsequenterweise die Verwendung des Promotorelementes CDE- CHR für Chimäre Promotoren ein. Gleiches ist für das Promotorelement E2F-BS- CHB des B-myb Genes anzunehmen (Zwicker et al., Nucl. Acids Res. 23, 3822 (1995)).
Es besteht somit ein dringliches Bedürfnis nach einem Expressionssystem, in welchem ein beliebiger Promotor mit einem zellzyklusspezifischen Promotor kombiniert werden kann.
B) Allgemeine Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist nunmehr ein Nukleinsaurekonstrukt, in welchem ein beliebiger Promotor mit dem CDE-CHR Element oder dem E2FBS-CHR Element zu einem funktionsfähigen Chimären Promotor verknüpft werden kann und der folgende Komponenten enthält:
Komponente a) mindestens ein Promotor
Komponente b) DNA kodierend für mindestens einen rekombinanten Transaktivator, dessen
Expression durch die Komponente a) aktiviert wird und der enthält b1 ) DNA, kodierend für eine DNA bindende Domäne b2) DNA, kodierend für eine Transaktivierungdomäne, welche reich ist an Glutamin, Serin und Threonin.
Komponente c) mindestens eine DNA Sequenz zur Bindung des Expressionsproduktes von Komponente b)
Komponente d) mindestens ein minimaler Promotor, der das CDE-CHR Element oder das
E2F-BS-CHR Element enthält und mit seinem 5' Ende an das 3' Ende der Komponente c) gebunden ist
Komponente e) mindestens ein Effektorgen, dessen Transkription durch Bindung des
Expressionsproduktes der Komponente b) an die Komponente c) aktiviert wird.
Die Anordnung der einzelnen Komponenten ist beispielhaft in Figur 1 dargestellt. Der minimale Promoter aus Komponente d) enthält mindestens ein transkriptionsaktivierendes Element.
Die Funktionsweise des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstruktes ist dergestalt, daß die Aktivierung des zelispezifischen, metabolisch aktivierbaren, virusspezifischen, zellzyklusspezifischen oder universell aktivierbaren Promotors [Komponente a)] zu einer Transkription des Genes [Komponente b)] für den rekombinanten Transkriptionsaktivator führt, welcher wiederum an seine DNA- Bindesequenz [Komponente c)] bindet, hierdurch den minimalen CDE-CHR enthaltenden Promotor [Komponente d)] aktiviert und dadurch die Transkription des Effektorgenes [Komponente e)] in die Wege geleitet wird. In der G0/G1 -Phase des Zellzyklus ist das CDE-CHR Element der Komponenten d) durch Bindung des sogenannten CDF Proteins blockiert und damit die Aktivierung der Transkription der Komponente e) inhibiert.
Das erfindungsgemäße Nukleinsaurekonstrukt kann in verschiedener Form erweitert werden:
- Es können mehrere gleiche oder unterschiedliche Effektorgene [Komponenten e, e', e"] in das Nukleinsaurekonstrukt eingeführt werden, wobei diese Effektorgene entweder mit jeweils einer IRES-Sequenz miteinander verbunden oder aber jedem Effektorgen die Komponenten c) und d) stromaufwärts angefügt werden.
- Der Komponente a) kann die Komponente c) stromaufwärts angefügt werden, so daß der rekombinante Transaktivator, exprimiert von Komponente b), auch eine Verstärkung der Aktivierung der Komponente a) im Sinne eines selbst verstärkenden Promotors bewirkt.
Derartige Expressionssysteme sind beispielsweise in Figur 2/I dargestellt.
Derartige selbstverstärkende Promotoren wurden bereits in der Patentanmeldung
EP-A 0 848 061 im Detail beschrieben.
In einer besonderen Ausführungsform dieser Erfindung kann das selbstverstärkende Promotorsystem auch dem erfindungsgemäßen Expressionssystem angefügt werden, wie beispielsweise in Figur 2/II dargestellt.
- Die Komponente b) kann durch Einführung einer Komponente b3), die ein Protein A exprimiert, welches an eine Kupplungssubstanz [Komponente f)] bindet und durch Einfügung einer Komponente b4), die ein Protein B exprimiert, welches ebenso an die Kupplungssubstanz f) bindet, zu einem durch die
Kupplungssubstanz f), d.h. pharmakologisch kontrollierbaren rekombinanten Transaktivator [Komponente b')], erweitert werden. Eine derartige Erweiterung ist beispielsweise in Figur 3 dargestellt.
Durch Einfügung eines derartigen Transaktivators ist das erfindungsgemäße Expressionssystem pharmakologisch kontrollierbar. Derartige Expressionssysteme wurden bereits im Detail in der Patentanmeldung
EP-A 0 848 061 beschrieben.
- Durch Kombination der Komponente b) und/oder der Komponente f) mit der Progesteronrezeptorligand-Bindedomäne (Wang et al., Gene Therapy 4, 432 (1997)) entsteht ein weiteres, durch Progesteron induzierbares
Expressionssystem.
- Das Expressionssystem kann durch Einfügung der Nukleinsäuresequenz für ein Bindeprotein [Komponente b5)] für ein zelluläres Regulatorprotein zwischen oder an die Komponenten b1 ) und b2) [Komponente b" bestehend aus Komponente b1 ), b2) und b5)] eine zusätzliche Steuerung erfahren. Diese ist dadurch bedingt, daß in der normalen Zelle das Regulatorprotein an das Bindeprotein haftet und hierdurch die Funktion des von der Komponente b") exprimierten rekombinanten Transaktivators, nämlich seine Bindung an die Komponente c), blockiert. In Zellen, in denen das zelluläre Regulatorprotein mutiert ist und hierdurch nicht an das Bindeprotein haften kann oder in denen das Regulatorprotein vermindert ist, fehlt oder an mit der Komponente b5) konkurrierenden zellulären, viralen, bakteriellen oder parasitären Bindeproteinen gebunden ist, ist der rekombinante Transaktivator [Komponente b")] funktionsfähig und kann an die Komponente c) binden.
Die Komponente b") ist beispielhaft in Figur 4 dargestellt.
- Durch Einfügung eines nuklearen Lokalisationssignales in die Komponente b), b') oder b") kann die Funktionsfähigkeit des erfindungsgemäßen
Expressionssystems gesteigert werden. - Durch Kombination von zwei oder mehr der aufgeführten Erweiterungen.
Das Effektorgen [Komponente d)] kodiert für einen pharmakologisch aktiven Wirkstoff, der ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Cytokine, Wachstumsfaktoren, Antikörper oder Antikörperfragmente, Rezeptoren für Cytokine oder Wachstumsfaktoren, antiproliferativ, apoptotisch oder zytostatisch wirkende Proteine, Angiogeneseinhibitoren, Gerinnungshemmer, Thrombose-induzierte Substanzen und Gerinnungshemmer, fibrinolytisch wirkende Substanzen, Plasmaproteine, Komplement-aktivierende Proteine, Peptidhormone, Virushüllproteine, bakterielle Antigene und parasitäre Antigene, auf den Blutkreislauf wirkende Proteine und Ribozyme.
Bevorzugterweise kodiert das Effektorgen für ein Ribozym, welches die mRNA inaktiviert, welche kodiert für ein Protein ausgewählt aus der Gruppe umfassend Zellzykluskontrollproteine, insbesondere Cyclin A, Cyclin B, Cyclin D1 , Cyclin E, E2F1-5, cdc2, cdc25C oder DP1 oder Virusproteine oder Cytokine oder Wachstumsfaktoren oder deren Rezeptoren.
In einer anderen Ausführungsform kodiert das Effektorgen für ein Enzym, welches eine Vorstufe eines Pharmakons in ein Pharmakon spaltet.
In einer weiteren Ausführungsform kann das Effektorgen für ein Ligand- Effektorfusionsprotein kodieren, wobei der Ligand ein Antikörper, ein Antikörperfragment, ein Cytokin, ein Wachstumsfaktor, ein Adhäsionsmolekül oder ein Peptidhormon sein kann und der Effektor ein wie oben beschriebener pharmakologisch aktiver Wirkstoff oder ein Enzym. Beispielsweise kann das Strukturgen ein Ligand-Enzymfusionsprotein kodieren, wobei das Enzym eine Vorstufe eines Pharmakons in ein Pharmakon spaltet und der Ligand an eine Zelloberfläche bindet, bevorzugt an Endothelzellen oder Tumorzellen. Die Nukleinsäurekonstrukte bestehen bevorzugterweise aus DNS. Unter dem Begriff Nukleinsäurekonstrukte werden künstliche Gebilde aus Nukleinsäure verstanden, die in den Zielzellen transkribiert werden können. Sie sind bevorzugt in einen Vektor eingefügt, wobei Plasmidvektoren oder virale Vektoren besonders bevorzugt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform werden diese Vektoren Patienten äußerlich oder innerlich, lokal, in eine Körperhöhle, in ein Organ, in den Blutkreislauf, in den Atemweg, in den Magen-Darm-Trakt, in den Urogenitaltrakt oder intramuskulär oder subkutan verabreicht.
Durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte kann ein Effektorgen [Komponente e)] sowohl zellspezifisch, virusspezifisch, unter bestimmten metabolischen Bedingungen und/oder zellzyklusspezifisch exprimiert werden, wobei es sich bei dem Effektorgen bevorzugt um ein Gen handelt, das für einen pharmakologisch aktiven Wirkstoff oder aber für ein Enzym kodiert, welches eine inaktive Vorstufe eines Pharmakons in ein aktives Pharmakon spaltet. Das
Effektorgen kann so gewählt sein, daß der pharmakologisch aktive Wirkstoff oder das Enzym als Fusionsprotein mit einem Liganden exprimiert wird und dieser Ligand an die Oberfläche von Zellen, z.B. proliferierende Endothel- oder Tumorzellen, bindet.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Zellen von Hefen oder Säugern, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsaurekonstrukt enthalten. In besonders bevorzugter Ausführungsform werden die Nukleinsäurekonstrukte in Zellinien eingebracht, die dann nach Transfektion zur Expression des Transgens verwendet werden können. Diese Zellen können somit zur Bereitstellung eines Heilmittels für Patienten verwendet werden. Eine bevorzugte Verwendung des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstruktes besteht in der Behandlung einer Erkrankung, wobei die Bereitstellung des Heilmittels die Einführung eines Nukleinsäurekonstruktes in eine Zielzelle und dessen virus- oder zielzellspezifische oder metabolisch spezifische oder unspezifische und zellzyklusspezifische Expression umfaßt. Gegenstand der Erfindung ist des weiteren die Verabreichung von Säugerzellen, die ein erfindungsgemäßes Nukleinsaurekonstrukt enthalten, zur Herstellung eines Heilmittels zur Behandlung einer Erkrankung. Beispielsweise können Endothelzellen aus dem Blut gewonnen, in vitro mit dem erfindungsgemäßen Nukleinsaurekonstrukt transfiziert und dem Patienten beispielsweise intravenös injiziert werden.
Derartige in vitro transfizierte Zellen können auch in Kombination mit einem erfindungsgemäßen Vektor Patienten verabreicht werden. Diese Kombination beinhaltet, daß Zellen und Vektoren jeweils gleichzeitig oder zu unterschiedlichen Zeitpunkten, an gleichen oder an unterschiedlichen Orten verabreicht oder injiziert werden.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte kommen in dieser Form nicht in der Natur vor, d.h. das Effektorgen für den Wirkstoff oder für ein Enzym oder für ein Ligand-Effektor-Fusionsprotein ist nicht natürlicherweise kombiniert mit dem erfindungsgemäßen minimalen Promotor enthaltend ein CDE-CHR Element oder ein E2F-BS-CHR Element und mit einer DNA-Bindesequenz für einen rekombinanten Transaktivator.
Die Promotoren und das Effektorgen für den Wirkstoff (oder für das Enzym) der erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte werden je nach Verwendungszweck ausgewählt.
C) Detaillierte Beschreibung der Komponenten des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstruktes
I) Promotoren [Komponente a)]
Im Sinne der Erfindung sind als Promotorsequenzen Nukleotidsequenzen zu verwenden, welche nach Bindung von Transkriptionsfaktoren die Transkription eines am 3'-Ende benachbart gelegenen Strukturgenes aktivieren. Die Wahl der mit der CDE-CHR oder E2F-BS-CHR enthaltenden Promotorsequenz [Komponente d)] zu kombinierenden Promotorsequenz richtet sich nach der zu behandelnden Erkrankung und der zu transduzierenden Zielzelle. So kann die zusätzliche Promotorsequenz uneingeschränkt, zielzellspezifisch, unter bestimmten metabolischen Bedingungen, zellzyklusspezifisch oder virusspezifisch aktivierbar sein. Zu den auszuwählenden Promotorsequenzen gehören beispielsweise:
a) uneingeschränkt aktivierbare Promotoren und Aktivatorsequenzen, wie beispielsweise
- der Promotor der RNA-Polymerase III
- der Promotor der RNA-Polymerase II
- der CMV-Promotor und -Enhancer
- der SV40-Promotor und -Enhancer
b) virale Promotor- und Aktivatorsequenzen, wie beispielsweise
- HBV
- HCV
- HSV - HPV
- EBV
- HTLV
- HIV
Bei Verwendung des HlV-Promotors ist die gesamte LTR-Sequenz einschließlich der TAR-Sequenz [Position < -453 bis > -80, Rosen et al., Cell
41 , 813 (1985)] als virusspezifischer Promotor einzusetzen.
c) Metabolisch aktivierbare Promotor- und Enhancersequenzen, wie beispielsweise der durch Hypoxie induzierbare Enhancer (Semenza et al., PNAS 88, 5680 (1991 ); McBumey et al., Nucl. Acids Res. 19, 5755 (1991 )) oder durch Strahlung induzierbare Promotoren wie beispielsweise das durch ionisierende Strahlen induzierbare Element des egr-1 Promotors (Hallahan et al., Nature Med. 1 , 786, 1995)).
d) Zellzyklusspezifisch aktivierbare Promotoren. Solche sind beispielsweise der Promotor des cdc25C Gens, des Cyclin A Gens, des cdc2 (cdk-1 ) Gens, des
Bmyb Gens, des DHFR-Gens oder des E2F-1 Gens, oder aber Bindesequenzen für während der Zellproliferation auftretende oder aktivierte Transkriptionsfaktoren. Zu diesen Bindesequenzen sind Monomere oder Multimere der als Myc E-Box bezeichneten Nukleotidsequenz [5'- GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3'; SEQ ID NO: 1 ]; Blackwood und
Eisenmann, Science 251 , 1211 (1991 )] zu zählen.
e) Tetrazyklin aktivierbare Promotoren, wie beispielsweise der Tetrazyklin-Operator in Kombination mit einem entsprechenden Repressor.
f) Zellspezifisch aktivierbare Promotoren
Hierzu zählen bevorzugt Promotoren oder Aktivatorsequenzen aus Promotoren oder Enhancem von solchen Genen, die für Proteine bevorzugt gebildet in ausgewählten Zellen kodieren.
Zum Beispiel sind im Sinne der Erfindung in folgenden Zellen Promotoren für folgende Proteine bevorzugt zu verwenden:
f1 ) Promotor- und Aktivatorsequenzen aktiviert in Endothelzellen - Hirn-spezifischer, endothelialer Glucose-1 -Transporter
- Endoglin
- VEGF-Rezeptor-1 (flt-1 )
- VEGF-Rezeptor-2 (flk-1 , KDR)
- VEGF-Rezeptor-3 (flt-4) - tie-1 oder tie-2
- B61 -Rezeptor (Eck-Rezeptor) - B61
- Endothelin, im speziellen Endothelin B oder Endothelin-1
- Endothelin-Rezeptoren, insbesondere der Endothelin B-Rezeptor
- Mannose-6-Phosphat-Rezeptoren - von Willebrand Faktor
- PECAM-1
- ICAM-3
- IL-1α, IL-1 ß
- IL-1 -Rezeptor - Vascular Cell Adhesion Molecule (VCAM-1 )
- synthetische Aktivatorsequenzen
Als Alternative zu natürlichen endothelzellspezifischen Promotoren lassen sich auch synthetische Aktivatorsequenzen verwenden, die aus oligomerisierten Bindestellen für Transkriptionsfaktoren, die preferentiell oder selektiv in Endothelzellen aktiv sind, bestehen. Ein Beispiel hierfür ist der
Transkriptionsfaktor GATA-2, dessen Bindestelle im Endothelin-1 Gen 5'- TTATCT-3' ist [Lee et al., Biol. Chem. 266, 16188 (1991 ), Dormann et al., J. Biol. Chem. 267, 1279 (1992) und Wilson et al., Mol. Cell Biol. 10, 4854 (1990)].
f2) Promotoren oder Aktivatorsequenzen, aktiviert in Zellen in Nachbarschaft aktivierter Endothelzellen
- VEGF
Die genregulatorischen Sequenzen für das VEGF-Gen sind die 5' flankierende Region, die 3' flankierende Region, das c-Src-Gen oder das v-
Src-Gen
- Steroid-Hormonrezeptoren und deren Promotorelemente (Truss und Beato, Endocr. Rev. 14, 459 (1993)), insbesondere der Maus-Mammatumor-Virus- Promotor f3) Promotoren oder Aktivatorsequenzen aktiviert in Muskelzellen, insbesondere glatten Muskelzellen
- Tropomyosin
- α-Actin - α-Myosin
- Rezeptor für PDGF
- Rezeptor für FGF
- MRF-4
- Phosphofructokinase A - Phosphoglyceratmutase
- Troponin C
- Myogenen
- Rezeptoren für Endothelin A
- Desmin - VEGF
Die genregulato schen Sequenzen für das VEGF-Gen sind bereits im Abschnitt "Promotoren aktiviert in Zellen in Nachbarschaft aktivierter Endothelzellen" aufgeführt worden (s.o.)
- "artifizielle" Promotoren Faktoren der Helix-Loop-Helix (HLH)-Familie (MyoD, Myf-5, Myogenen,
MRF4) sind als muskelspezifische Transkriptionsfaktoren beschrieben. Des weiteren gehören zu den muskelspezifischen Transkriptionsfaktoren das Zinkfingerprotein GATA-4.
Die HLH-Proteine sowie GATA-4 zeigen muskelspezifische Transkription nicht nur mit Promotoren von muskelspezifischen Genen, sondern auch im heterologen Kontext, so auch mit artifiziellen Promotoren. Derartige artifizielle Promotoren sind beispielsweise multiple Kopien der (DNA) Bindestelle für muskelspezifische HLH-Proteine wie der E-Box (Myo D) (z.B. 4x AGCAGGTGTTGGGAGGC, SEQ ID NO: 2); oder multiple Kopien der
DNA Bindestelle für GATA-4 des α-Myosin-Heavy Chain Gens (z.B. 5'- GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG3', SEQ ID NO: 3)
f4) Promotoren und Aktivatorsequenzen, aktiviert in Gliazellen
Hierzu zählen im besonderen die genregulatorischen Sequenzen bzw. Elemente aus Genen, die beispielsweise für folgende Proteine kodieren:
- das Schwannzell-spezifische Protein Periaxin
- Glutaminsynthetase - das Gliazell-spezifische Protein (Glial fibrillary acid protein = GFAP)
- das Gliazellprotein S100b
- IL-6 (CNTF)
- 5-HT-Rezeptoren
- TNFα - IL-10
- Insulin-like Growth Factor Receptor I and II
- VEGF
Die genregulatorischen Sequenzen für das VEGF-Gen sind bereits oben aufgeführt worden.
f5) Promotoren und Aktivatorsequenzen aktiviert in blutbildenden Zellen
Zu solchen genregulatorischen Sequenzen gehören Promotorsequenzen für Gene eines Cytokins oder seines Rezeptors, die in blutbildenden Zellen oder in benachbarten Zellen, wie beispielsweise dem Stroma, exprimiert sind.
Hierzu gehören Promotorsequenzen für beispielsweise folgende Cytokine und ihre Rezeptoren:
- Stern Cell Factor-Receptor - Stern Cell Factor
- IL-1α - IL-1 -Rezeptor
- IL-3
- IL-3-Rezeptor (α-subunit)
- IL-3-Rezeptor (ß-subunit) - IL-6
- IL-6-Rezeptor
- GM-CSF
- GM-CSF-Rezeptor (α-Kette)
- Interferon Regulatory Factor 1 (IRF-1 ) Der Promotor von IRF-1 wird durch IL-6 gleichermaßen aktiviert wie durch
IFNγ oder lFNß
- Erythropoietin
- Erythropoietin-Rezeptor.
f6) Promotoren und Aktivatorsequenzen aktiviert in Lymphozyten und/oder Makrophagen
Hierzu gehören beispielsweise die Promotor- und Aktivatorsequenzen der Gene für Cytokine, Cytokinrezeptoren und Adhäsionsmoleküle und Rezeptoren für das Fc-Fragment von Antikörpern.
Hierzu gehören beispielsweise:
- IL-1 -Rezeptor
- IL-1α - IL-1 ß
- IL-2
- IL-2-Rezeptor
- IL-3
- IL-3-Rezeptor (α-subunit) - IL-3-Rezeptor (ß-subunit)
- IL-4 - IL-4-Rezeptor
- IL-5
- IL-6
- IL-6-Rezeptor - Interferon Regulatory Factor 1 (IRF-1)
(Der Promotor von IRF-1 wird durch IL-6 gleichermaßen aktiviert wie durch IFNγ oder lFNß).
- IFNγ Responsive Promotor
- IL-7 - IL-8
- IL-10
- IL-11
- IFNγ
- GM-CSF - GM-CSF-Rezeptor (α-Kette)
- IL-13
- LIF
- Makrophagen-Colony Stimulating Factor (M-CSF)-Rezeptor
- Typ I und II Makrophagen Scavenger Rezeptoren - MAC-1 (Leukozytenfunktionsantigen)
- LFA-1α (Leukozytenfunktionsantigen)
- p150,95 (Leukozytenfunktionsantigen)
f7) Promotor- und Aktivatorsequenzen aktiviert in Synovialzellen
Hierzu gehören die Promotorsequenzen für Matrix-Metalloproteinasen (MMP), beispielsweise für:
- MMP-1 (interstitielle Kollagenase)
- MMP-3 (Stromelysin/Transin) Hierzu gehören des weiteren die Promotorsequenzen für Tissue Inhibitors of Metalloproteinases (TIMP), beispielsweise
- TIMP-1
- TIMP-2 - TIMP-3
f8) Promotoren und Aktivatorsequenzen aktiviert in Leukämiezellen
Hierzu gehören beispielsweise Promotoren für - c-myc
- HSP-70
- bcl-1 /cyclin D-1
- bcl-2
- IL-6 - IL-10
- TNFα, TNFß
- HOX-11
- BCR-Abl
- E2A-PBX-1 - PML-RARA (Promyelocytic Leukemia - Retinoic Acid Receptor)
- c-myc
- c-myc-Proteine binden an und aktivieren Multimere der als Myc E-Box bezeichneten Nukleotidsequenz (5'-GGAAGCAGACCAGCTGGTCTG CTTCC-3', SEQ ID NO: 1 )
f9) Promotoren oder Aktivatorsequenzen aktiviert in Tumorzellen
Als Promotor- oder Aktivatorsequenz ist eine genregulatorische Nukleotidsequenz vorgesehen, mit der Transkriptionsfaktoren, gebildet oder aktiv in Tumorzellen, interagieren. Im Sinne dieser Erfindung zählen zu den bevorzugten Promotoren oder Aktivatorsequenzen genregulatorische Sequenzen bzw. Elemente aus Genen, die besonders in Krebszellen oder Sarkomzellen gebildete Proteine kodieren. So wird bei kleinzelligen Bronchialkarzinomen bevorzugt der Promotor des N- CAM-Proteins, bei Ovarialkarzinomen der Promotor des "Hepatitis growth factor"-Rezeptors oder des L-Plastin und bei Pankreaskarzinomen der Promotor des L-Plastins oder des polymorphen epithelialen Mucins (PEM) verwendet.
II) Der rekombinante Transaktivator [Komponente b)]
Der rekombinante Transaktivator besteht im einfachsten Falle aus einer DNA- bindenden Domäne [Komponente b1 ) und einer Transaktivierungsdomäne, reich an Glutamin, Ser und/oder Thr [Komponente b2)].
Im Falle eines pharmakologisch kontrollierbaren rekombinanten Transaktivators [Komponente b')] werden die Komponenten b3) und b4) für die die Kopplungssubstanz bindenden Proteine eingefügt, im Falle eines durch Onkogene oder Viren gesteuerten rekombinanten Transaktivators [Komponente b")] wird die Komponente b5) für das Bindungsprotein für ein Regulatorprotein eingefügt.
Durch Einfügung eines nuklearen Lokalisationssignals (NLS) kann die Funktionsfähigkeit der Komponente b), b') oder b") gesteigert werden. Als NLS kann beispielsweise die NLS von SV40 (Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991 )) verwendet werden.
1 ) Die DNA-bindende Domäne [Komponente b1 )]
Die DNA-bindende Domäne stellt dar mindestens eine Sequenz
- der cDNA für die DNA-Bindedomäne des Gal4-Proteins (Aminosäuren 1 bis 147; Chasman und Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990)) oder - des LexA-Proteins (Aminosäuren 1 bis 81 ; Kim et al., Science 255, 203 (1992) oder das ganze LexA-Protein (Aminosäuren 1 bis 202; Brent et al., Cell 43, 729 (1985)) oder
- des lac-Repressor (lac I) Proteins (Brown et al., Cell 49, 603 (1987); Fuerst et al., PNAS USA 86, 2549 (1989)) oder
- des Tetracycliπ-Repressor(tet-R)-Proteins (Gossen et al., PNAS USA 89, 5547 (1992); Dingermann et al., EMBO J. 11 , 1487 (1992)) oder
- des ZFHD1 -Proteins (Pomerantz et al., Science 267, 93 (1995)).
2) Die Transaktivierungsdomäne [Komponente b2)]
Im Sinne der Erfindung ist die DNA solcher Transaktivierungsdomänen zu verwenden, welche reich an Glutamin, Serin und/oder Threonin sind.
Der Begriff reich bedeutet im Sinne dieser Erfindung, daß insgesamt
mindestens 20x Glutamin (= mindestens 20 Glutaminreste) mindestens 10x Serin und/oder mindestens 10x Threonin
in der Transaktivierungsdomäne enthalten sind.
Im Sinne der Erfindung gehören zu diesen Transaktivierungsdomänen beispielsweise die
- Aktivierungsdomäne von Oct-2 (Aminosäuren 438 bis 479; Tanaka et al., Mol. Cell Biol. 14, 6064 (1994)) oder Aminosäuren 3 bis 154; Das et al., Nature 374, 657 (1995)) oder
- Aktivierungsdomäne von SP1 (Aminosäuren 340 bis 485; Courey und Tijan, Cell 55, 887 (1988)) oder - Aktivierungsdomäne von NFY-1A (Aminosäuren 1 bis 132 oder 1 bis 233; Li et al., J. Biol. Chem. 267, 8984 (1992); van Hujisduijnen et al., EMBO J. 9, 3119 (1990); Sinha et al., J. Biol. Chem. 92, 1624 (1995); Coustry et al., J. Biol. Chem. 270, 468 (1995)) oder
3) Die die Kopplungssubstanz [Komponente f)] bindenden Proteine A [Komponente b3)] und B [Komponente b4)]
Beispiele für Kopplungssubstanzen und die zugehörigen Proteine A und B wurden bereits im Detail in der Patentanmeldung EP-A 0 848 061 beschrieben, auf weiche ausdrücklich Bezug genommen wird.
Zu diesen Proteinen A und B gehören beispielsweise:
- für die Kopplungssubstanz: Rapamycin oder Rapamycin-Analoga
• das FK506 bindende Protein (FKBP)
• das an den Rapamycin-FKBP-Komplex bindende FKBP-Rapamycin assoziiertes Protein, oder dessen an den Rapamycin-FKBP-Komplex bindende Teilsequenz (FRAP) • statt Gene für das FKBP und das FRAP können Gene für rek. Fv verwendet werden, welche an Rapamycin binden und/oder die Bindung von FKBP bzw. von FRAP an Rapamycin inhibieren
- für die Kopplungssubstanz: Dimere (FK1012) von FK506
• das FK506 bindende Protein (FKBP) • Calcineurin oder dessen an den FK506 Komplex bindende Teilsequenz
• statt des Genes für Calcineurin kann das Gen für ein rek. Fv eingefügt werden, welches die Bindung von FK506 an Calcineurin inhibiert
- für die Kopplungssubstanz: Dimere von Cyclosporin A
• Cyclophilin • Calcineurin oder dessen an den Cyclosporin A/Cyclophilin Komplex bindende
Teilsequenz • statt des Genes für Cyclophilin kann das Gen für ein rek. Fv eingefügt werden, welches die Bindung von Cyclosporin A an Cyclophilin inhibiert
- für die Kopplungssubstanz: Monomere von Cyclosporin A mit folgenden bindenden Proteinen
• Cyclophilin
• Gen für einen rek. Fv, welcher an Cyclosporin A im Cyclophilin/Cyclosporin A- Komplex bindet
• alternativ zu Cyclophilin können Gene für unterschiedliche rek. Fv verwendet werden, welche an unterschiedliche Epitope von Cyclosporin A binden
- für die Kopplungssubstanz: Methotrexat
• Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen Methotrexate
• Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen die Pteridingruppe • Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen die Benzen-Gruppe
• Dihydrofolatreductase
- für die Kopplungssubstanz: Gentamycin
• Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen Gentamycin
- für die Kopplungssubstanz:
• Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen
- für die Kopplungssubstanz: Cephalexin • Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen die acyl Seitenkette an der C-7 Position des Cephem
- für die Kopplungssubstanz: Folsäure
• Folsäure bindendes Protein • Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen Folsäure für die Kopplungssubstanz: Retinoinsäure
• Retinoinsäure bindende Domäne des zelluläre Retinoinsäure-bindenden Proteins
• Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen Retinoinsäure
- für die Kopplungssubstanz:
• Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen Amoxicillin
• Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen die Benzylpenicilloyl- Gruppe • Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen Penicillin
• das Penicillin-bindende Protein
- für die Kopplungssubstanz: 4-Hydroxy-Tamoxifen oder Tamoxifen
• Östrogen-bindende Domäne des Östrogenrezeptor-Proteins • Antikörper oder Antikörperfragmente (rek. Fv) gegen den Östrogen-Rezeptor-
Östrogen- bzw. 4-Hydroxy-Tamoxifen-Komplex
- für die Kopplungssubstanz: Tetrazyklin
• das Tetrazyklin-Repressor-Protein • Antikörper und Antikörperfragmente gegen Tetrazyklin
- für die Kopplungssubstanz: Konjugat aus Tetrazyklin- und Isopropyl-ß-D- thiogalactoside
• das Tetrazyklin-Repressor-Protein • das lac-Repressor-(lac l)-Protein
4) Das Bindeprotein für ein Regulatorprotein [Komponente b5)]
Zahlreiche zelluläre Bindeproteine für Regulatorproteine sind bereits beschrieben worden [Zwicker und Müller, Progress in Cell Cycle Res. 1 : 91 (1995); Boulikas et al., Int. J. Oncol. 6: 271 (1995); Pawson, Nature 373: 573 (1995); Cotter, Leuk. Lymph. 18: 231 (1995); Hesketh, the Oncogene Facts Book Acad. Press, ISBN 0-12-344550-7 (1995); Miller and Sarver, Nature Med. 3: 389 (1997)].
Geeignet im Sinne der Erfindung sind inbesondere Bindeproteine oder deren Bindesequenzen für solche Regulatorproteine, welche in erkrankten Zellen nur gering exprimiert sind, in ihrer Bindung an die Bindesequenz inhibiert sind, durch einen Überschuß der Bindesequenz nicht oder nur geringfügig in freier Form vorliegen oder in ihrer Funktion anderweitig, wie zum Beispiel durch Mutation, beeinträchtigt oder verändert sind.
Zu solchen Regulatorproteinen gehören beispielsweise die Proteine exprimiert von Tumorsuppressorgenen.
Eine die Erfindung nicht beschränkende Auswahl für derartige Regulatorproteine und ihre zugehörigen Bindeproteine und deren Bindesequenzen ist in folgenden Beispielen aufgeführt:
Regulatorprotein Komponente b5) (zelluläres Bindeprotein mit Bindesequenz für das Regulatorprotein)
p53 MDM-2
PRb « » Transcription factor E2F, -1 , -2, -3
> Cyclin-D1 , D2, -D3, oder -C
» Cyclin-A, -E
► Transcription factor PU.1
► Transcription factor Elf-1 p130 ► Transcription factor E2F-5
» Cyclin A, - E
Max < • Myc
MAD » Myc
VHL » Elongin C, - B cdk4 p14, p15, p16, p18, p27, p57, p21
MTS-1 (p16) cdk4
WT-1 p53
SMAD2 (MADR2) DPC4
DPC-4 SMAD2 ß-catenin LEF-1
LEF-1 ß-catenin
In einer besonderen Ausführungsform dieser Erfindung ist die Komponente b5) eine Bindesequenz von einem nicht zelleigenen Bindeprotein für ein Regulatorprotein. Eine solche nicht-zelleigene Bindesequenz kann beispielsweise viralen, bakteriellen oder parasitären Ursprungs sein.
Die Verwendung einer derartigen nicht-zelleigenen Bindesequenz ermöglicht, daß in Normalzellen durch Bindung des zugehörigen Regulatorproteins an die Komponente b5) die Funktion der Komponente b) gehemmt ist. In infizierten Zellen wird jedoch durch die intrazelluläre Produktion des die Bindesequenz enthaltenden Bindeproteins durch den jeweiligen Infektionserreger das zugehörige Regulatorprotein weitgehend gebunden. Damit ist in diesen Zellen die Komponente b) frei und funktionsfähig.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform dieser Erfindung ist die Komponente b5) ein Antikörper oder ein Teil eines Antikörpers mit Bindesequenzen (VH und VL) für ein Regulatorprotein.
Eine die Erfindung nicht beschränkende Auswahl nicht-zelleigener Bindesequenzen ist in folgenden Beispielen aufgeführt: Regulatorprotein Komponente b2)
(virales Bindeprotein mit Bindesequenz für das
Regulatorprotein) p53 IE 84 von CMV
E1B(55Kd)vonAV
EBNA-5 von EBV
BHFR1 von EBV
E6 von HPV, z.B von HPV-16 oder -18
HBX protein von HBV
T-Antigen von SV40
PRb EIAvonAV EBNA-2 von EBV EBNA-1 oder -5 von EBV E7 von HPV T-Antigen von SV40
p130 EIAvonAV
CBF-1 (RBP-JK) EBNA-2 von EBV
NF-Kappa B Tax von HIV
Lyn-tyrosinkinase LMP-1 von EBV
LMP-2A oder LMP-2B von EBV
Bak E1B(16Kd)vonAV
Bax E1B(19kD)vonAv Regulatorprotein Antikörper bzw. Antikörperfragmente mit Bindesequenz (VH,
VL) für das Regulatorprotein p53 monoklonale Antikörper spezifisch für die nicht mutierte
DNA-Bindedomäne
pRb • monoklonale Antikörper spezifisch für aktives (nicht phosphoryliertes) pRb
myc • monoklonale Antikörper spezifisch für die DNA-
Bindedomäne
Bei Wahl eines Antikörpers sind bevorzugt die epitopbindenen Teile des Antikörpers FVL und FVH als Komponente b5) einzusetzen, bei murinem Ursprung in humanisierter Form. Die Humanisierung erfolgt in der von Winter et al. (Nature 349, 293 (1991 ) und Hoogenbooms et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993)) dargestellten Weise. Die Antikörperfragmente werden entsprechend dem Stand der Technik hergestellt, beispielsweise in der von Winter et al., Nature 349, 293 (1991 ), Hoogenboom et al., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993), Girol. Mol. Immunol. 28, 1379 (1991 ) oder Huston et al., Int. Rev. Immunol. 10, 195 (1993) beschriebenen Weise.
Rekombinante Antikörperfragmente werden direkt aus existierenden Hybridomen hergestellt oder werden mit Hilfe der "phage display"-Technologie (Smith, Science 228, 1315, (1985)) aus Bibliotheken muriner bzw. humaner Antikörperfragmente isoliert (Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12, 433 (1994)). Diese
Antikörperfragmente werden dann auf genetischer Ebene direkt für die Kopplung mit den Komponenten b1 ) und b2) eingesetzt.
Zur Herstellung von rekombinanten Antikörperfragmenten aus Hybridomen wird die genetische Information, die für die antigenbindenden Domänen (VH, VL) der
Antikörper kodiert, durch Isolierung der mRNA, die reverse Transkription der RNA in cDNA und die anschließende Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion (Saiki et al., Science 230, 1350 (1985)) und Oligonukleotiden komplementär zu den 5'- bzw. 3'-Enden der variablen Fragmente (Orlandi et al. 1989) gewonnen. Die VH- und VL-Fragmente werden dann in bakterielle Expressionsvektoren z.B. in Form von Fv-Fragmenten (Skerra und Plückthun, Science 240, 1038 (1988)), einzelkettigen Fv-Fragmenten (scFv) (Bird et al., Science 242, 423 (1988); Huston et al., PNAS USA 85, 5879 (1988)) oder als Fab-Fragmente (Better et al., Science 240, 1041 (1988)) kloniert.
Neue Antikörperfragmente können mittels der "phage display"-Technologie auch direkt aus Antikörperbibliotheken (Immunbibliotheken, naive Bibliotheken) murinen oder humanen Ursprungs isoliert werden (McCafferty et al., Nature 348, 552 (1990); Reitling et al., Gene 104, 147 (1991 ); McCafferty et al., Nature 348, 552 (1990); Hoogenboom et al., Nucl. Acid Res. 19, 4133 (1991 ); Barbas et al., PNAS USA 88, 7978 (1991 ); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991 ); Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889 (1992); Marks et al., Bio/Technol. 11 , 1145 (1993)).
Immunbibliotheken werden hergestellt durch PCR-Amplifikation der variablen Antikörperfragmente aus B-Lymphozyten immunisierter Tiere (Sastry et al., PNAS USA 86, 5728 (1989); Ward et al., Nature 341 , 544 (1989); Clackson et al., Nature 352, 624 (1991 )) oder Patienten (Mullinax et al., PNAS USA 87, 8095 (1990); Barbas et al., PNAS USA 88, 7978 (1991 )).
Die Affinität von Antikörperfragmenten kann mittels der "phage display"-Technologie weiter erhöht werden, wobei neue Bibliotheken von bereits existierenden
Antikörperfragmenten durch zufällige (Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889 (1992);
Gram et al., PNAS USA 89, 3576 (1992)), kodonbasierende (Glaser et al., J.
Immunol. 149, 3903 (1992)) oder gezielte Mutagenese (Balint und Larrick, Gene
137, 109 (1993)), durch "chain shuffling" einzelner Domänen mit Fragmenten aus naiven Repertoires (Marks et al., Bio/Technol. 10, 779 (1992)) oder unter
Zuhilfenahme von bakteriellen Mutatorstämmen (Low et al., J. Mol. Biol. 260, 359 (1996)) hergestellt werden und durch Reselektion unter stringenten Bedingungen (Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889 (1992)) Antikörperfragmente mit verbesserten Eigenschaften isoliert werden.
III) Die DNA-Bindesequenz für Komponente b) [Komponente c)]
Die Auswahl der DNA-Bindesequenz richtet sich nach der Wahl der DNA-bindenden Domäne. Für die unter 11.1 ) aufgeführten Beispiele für die DNA-Bindedomänen bestehen beispielsweise folgende Möglichkeiten:
- mindestenes eine Bindesequenz für das Gal4-Protein [Nukleotidsequenz: 5'- CGGACAACTGTTGACCG-3', SEQ ID NO: 4]; Chasman und Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990) oder [Nukleotidsequenz: 5'-CGGAGGACTGTCCTCCG 3', SEQ ID NO: 5]; oder [Nukleotidsequenz: 5'-CGGAGTACTGTCCTCCG-3', SEQ ID NO: 6]; Giniger et al., PNAS USA 85, 382 (1988)
- mindestens eine Bindesequenz [Nukleotidsequenz: 5'-TACTGTATGTACATA- CAGTA-3', SEQ ID NO: 7]; für das LexA Protein [LexA-Operator; Brent et al., Nature 612, 312 (1984)]
- mindestens eine Lac-Opertor-Bindesequenz (Nukleotidsequenz: 5'-GAATTGTG AGGCTCACAATTC-3', SEQ ID NO: 8); für das lac I Repressorprotein (Fuerst et al., PNAS USA 86, 2549 (1989); Simons et al., PNAS USA 81 , 1624 (1984))
- mindestens einer Tetrazyklin-Operator(tet 0)-Bindesequenz (Nukleotidsequenz: 5'-TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3', SEQ ID NO: 9); für das Tetracyclin-Repressor(tet R)-Protein
- mindestens eine Bindesequenz (Nukleotidsequenz: 5'-TAATGATGGGCG-3', SEQ ID NO: 10); für das ZFHD-1 Protein (Pomeranth et al., Science 267, 93
(1995)) IV) Der minimale Promotor enthaltend CDE-CHR oder E2F-BS-CHR [Komponente d)]
Beispielsweise können Fragmente
- des cdc25C Genes (Nukleinsäuren -20 bis +121 oder Nukleinsäuren -20 bis +50)
- des cdc2 (cdk-1 ) Genes (Nukleinsäuren -26 bis +121 ; Liu et al., Nucl. Acids Res. 24, 2905 (1996))
- des CyclinA Genes (Nukleinsäuren -40 bis +94; Liu et al., Nucl. Acids Res. 24, 2905 (1996))
- des B-myb Genes (Nukleinsäuren -50 bis +50; Liu et al., Nucl. Acids Res. 24, 2905 (1996))
verwendet werden.
V) Effektorgene [Komponente e)]
Im Sinne der Erfindung kodieren die Effektorgene für einen Wirkstoff zur Prophylaxe und/oder Therapie einer Erkrankung. Effektorgene und Promotorsequenzen sind im Hinblick auf die Art der Therapie der Erkrankung und unter Berücksichtigung der zu transduzierenden Zielzelle auszuwählen.
Beispielsweise sind bei folgenden Erkrankungen folgende Kombinationen von Promotorsequenzen (Beispiele siehe Abschnitt C I) und Effektorgenen zu wählen (eine detaillierte Beschreibung erfolgte bereits in den Patentanmeldungen EP-A 0 777 739, EP-A 0 777 740, EP-A 0 804 601 , EP-A 0 807 183, EP-A 0 790 313 EP-A 0 805 209 und EP-A 0 848 063 auf die Bezug genommen wird).
a) Therapie von Tumoren a.1 ) Zielzellen:
- proliferierende Endothelzellen oder - der Endothelzelle benachbarte Stromazellen und Muskelzellen oder
- Tumorzellen oder Leukämiezellen
a.2) Promotoren: - endothelzellspezifisch und zellzyklusspezifisch oder
- zellunspezifisch oder muskelzellspezifisch und zellzyklusspezifisch oder
- tumorzellspezifisch (solide Tumoren, Leukämien) und zellzyklusspezifisch
a.3) Effektorgene für Inhibitoren der Zeilproliferation, zum Beispiel für - das Retinoblastomprotein (pRb=p110) oder die verwandten p107 und p130
Proteine
Das Retinoblastomprotein (pRb/p110) und die verwandten p107 und p130 Proteine werden durch Phosphorylierung inaktiviert. Bevorzugt sind solche Gene dieser Zelizyklusinhibitoren zu verwenden, welche Mutationen für die Inaktivierungsstellen der exprimierten Proteine aufweisen, ohne daß diese hierdurch in ihrer Funktion beeinträchtigt werden. Beispiele für diese Mutationen wurden beschrieben für das p110.
In analoger Weise wird die DNA-Sequenz für das p107 Protein oder das p130 Protein mutiert. - das ρ53 Protein
Das Protein p53 wird in der Zelle inaktiviert entweder durch Bindung an spezielle Proteine, wie beispielsweise MDM2, oder durch Oligomerisierung des p53 über das dephosphorylierte C-terminale Serin. Bevorzugt wird somit eine DNA-Sequenz für ein p53 Protein verwendet, welches C-terminal verkürzt ist um das Serin 392.
- das p21 (WAF-1 )
- das p16 Protein
- andere cdk-lnhibitoren
- das GADD45 Protein - das bak Protein' a.4) Effektorgene für Gerinnung induzierende Faktoren und Angiogeneseinhibitoren, zum Beispiel:
- Plasminogenaktivatorinhibitor-1 (PAI-1 )
- PAI-2 - PAI-3
- Angiostatin und/oder Endostatin
- Interferone (IFNα, IFNß oder IFNγ)
- Platelet factor 4
- IL-12 - TIMP-1
- TIMP-2
- TIMP-3
- Leukemia Inhibitory Factor (LIF)
- Tissue Factor (TF) und dessen gerinnungsaktive Fragmente
a.5) Effektorgene für zytostatische und zytotoxische Proteine, zum Beispiel für
- Perforin
- Granzym
- IL-2 - IL-4
- IL-12
- Interferone, wie beispielsweise IFN-α, IFNß oder IFNγ
- TNF, wie TNFα oder TNFß
- Oncostatin M - Sphingomyelinase
- Magainin und Magainin-Derivate
a.6) Effektorgene für zytostatische oder zytotoxische Antikörper und für Fusionsproteine zwischen antigenbindenden Antikörperfragmenten mit zytostatischen, zytotoxischen oder entzündungserregenden Proteinen oder
Enzymen. - Zu den zytostatischen oder zytotoxischen Antikörpern gehören solche gerichtet gegen Membranstrukturen von Endothelzellen wie sie beispielsweise von Burrows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155 (1994)), Hughes et al., (Cancer Res. 49, 6214 (1989)) und Maruyama et al., (PNAS USA 87, 5744 (1990)) beschrieben wurden. Insbesondere zählen hierzu Antikörper gegen die VEGF-Rezeptoren.
- Des weiteren gehören hierzu zytostatische oder zytotoxische Antikörper gerichtet gegen Membranstrukturen auf Tumorzellen. Derartige Antikörper wurden zum Beispiel von Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, München (1988) und Contrib. to Oncol. 43, Karger Verlag, München
(1992) übersichtlich dargestellt. Weitere Beispiele stellen dar Antikörper gegen Sialyl Lewis; gegen Peptide auf Tumoren, welche von T-Lymphozyten erkannt werden; gegen von Onkogenen exprimierte Proteine; gegen Ganglioside wie GD3, GD2, GM2, 9-0-acetyl GD3, Fucosyl GM1 ; gegen Blutgruppenantigene und deren Vorläufer; gegen Antigene auf dem polymorphen epithelialen Mucin; gegen Antigene auf Heat Shock Proteinen
- Des weiteren gehören hierzu gehören Antikörper gerichtet gegen Membranstrukturen von Leukämiezellen. Eine große Anzahl derartiger monoklonaler Antikörper sind bereits für diagnostische und therapeutische Verfahren beschrieben worden (Übersichten bei Kristensen, Danish Medical
Bulletin 41 , 52 (1994); Schranz, Therapia Hungarica 38, 3 (1990); Drexler et al., Leuk. Res. 10, 279 (1986); Naeim, Dis. Markers 7, 1 (1989); Stickney et al., Curr.. Opin. Oncol. 4, 847 (1992); Drexler et al., Blut 57, 327 (1988); Freedman et al., Cancer Invest. 9, 69 (1991 )). Je nach Typ der Leukämie sind als Liganden beispielsweise monoklonalen Antikörper oder deren antigenbindende Antikörperfragmente gerichtet gegen folgende Membranantigene geeignet: Zellen Membranantigen
AML CD13
CD15
CD33
CAMAL
Sialosyl-Le
B-CLL CD5
CD1c
CD23
Idiotypen und Isotypen der Membranimmunglobuline
T-CLL CD33
M38
IL-2-Rezeptoren
T-Zell-Rezeptoren
ALL CALLA
CD19
Non-Hodgkin Lymphoma
Die Humanisierung muriner Antikörper, die Herstellung und Optimierung der Gene für Fab und rek. Fv Fragmente erfolgt entsprechend der dem Fachmann bekannten Technik (Winter et al., Nature 349, 293 (1991 ); Hoogenbooms et al., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993); Girol. Mol. Immunol. 28, 1379 (1991 ) oder Huston et al., Intern. Rev. Immunol. 10, 195 (1993)). Die Fusion der rek. Fv-Fragmente mit Genen für zytostatische, zytotoxische oder entzündungserregende Proteinen oder Enzymen erfolgt gleichermaßen entsprechend dem dem Fachmann bekannten Stand der Technik. a.7) Effektorgene für Fusionsproteine von Zielzell-bindenden Liganden mit zytostatischen und zytotoxischen Proteinen. Zu den Liganden gehören alle Substanzen, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf Endothelzellen binden. Beispielsweise gehören hierzu - Cytokine wie beispielsweise IL-1 oder Wachstumsfaktoren oder deren
Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Endothelzellen binden, wie beispielsweise PDGF, bFGF, VEGF, TGF.
- Des weiteren gehören hierzu Adhäsionsmoleküle, welche an aktivierte und/oder proliferierende Endothelzellen binden. Hierzu gehören beispielsweise SLex, LFA-1 , MAC-1 , LECAM-1 , VLA-4 oder Vitronectin.
- Hierzu gehören des weiteren Substanzen, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren von Tumor- oder Leukämiezellen binden. Beispielsweise gehören hierzu Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Leukämiezellen oder Tumorzellen binden.
Derartige Wachstumsfaktoren wurden bereits beschrieben (Übersichten bei Cross et al., Cell 64, 271 (1991 ), Aulitzky et al., Drugs 48, 667 (1994), Moore, Clin. Cancer Res. 1 , 3 (1995), Van Kooten et al., Leuk. Lymph. 12, 27 (1993)).
- Die Fusion der Gene dieser an die Zielzelle bindenden Liganden mit zytostatischen, zytotoxischen oder entzündungserregenden Proteinen oder Enzymen erfolgt entsprechend dem Stand der Technik mit den dem Fachmann bekannten Methoden.
a.8) Effektorgene für Induktoren von Entzündungen, zum Beispiel für
- IL-1
- IL-2 - RANTES (MCP-2)
- monocyte chemotactic and activating factor (MCAF) - IL-8
- macrophage inflammatory protein-1 (MIP-1α, -ß)
- neutrophil activating protein-2 (NAP-2)
- IL-3 - IL-5
- human leukemia inhibitory factor (LIF)
- IL-7
- IL-11
- IL-13 - GM-CSF
- G-CSF
- M-CSF
- Cobra venom factor (CVF) oder Teilsequenzen vom CVF, welchem dem menschlichen Komplementfaktor C3b funktionell entsprechen, d.h. welche an den Komplementfaktor B binden können und nach Spaltung durch den Faktor
D eine C3 Konvertase darstellen
- der menschliche Komplementfaktor C3 oder seine Teilsequenz C3b
- Spaltprodukte des menschlichen Komplementfaktors C3, welche funktionell und strukturell dem CVF ähneln - bakterielle Proteine, welche Komplement aktivieren oder Entzündungen auslösen, wie beispielsweise Porine von Salmonella typhi murium, "clumping" Faktoren von Staphylococcus aureus, Moduline besonders von gram-negativen Bakterien, "Major outer membrane protein" von Legionellen oder von Haemophilus influenza Typ B oder von Klebsiellen oder M-Moleküle von Streptokokken Gruppe G.
a.9) Effektorgene für Enzyme für die Aktivierung von Vorstufen von Zytostatika, zum Beispiel für Enzyme, welche inaktive Vorsubstanzen (Prodrugs) in aktive Zytostatika (Drugs) spalten. Derartige Substanzen und die jeweils zugehörigen Prodrugs und Drugs sind bereits von Deonarain et al. (Br. J. Cancer 70, 786 (1994)), Müllen, Pharmac. Ther. 63, 199 (1994)) und Harris et al. (Gene Ther. 1 , 170 (1994)) übersichtlich beschrieben worden. Beispielsweise ist die DNA-Sequenz eines der folgenden Enzyme zu verwenden:
- Herpes Simplex Virus thymidinkinase
- Varizella Zoster Virus Thymidinkinase
- bakterielle Nitroreduktase
- bakterielle ß-Glucuronidase - pflanzliche ß-Glucuronidase aus Seeale cereale
- humane ß-Glucuronidase
- humane Carboxy peptidase (CB) zum Beispiel CB-A der Mastzelle, CB-B des Pankreatische oder bakterielle Carboxypeptidase
- bakterielle ß-Laktamase - bakterielle Cytosine deaminase
- humane Catalase bzw. Peroxidase
- Phosphatase, im besonderen humane alkalische Phosphatase, humane saure Prostataphosphatase oder Typ 5 saure Phosphatase
- Oxidase, im besonderen humane Lysyloxidase oder humane saure D- aminooxidase
- Peroxidase, im besonderen humane Gluthation Peroxidase, humane Eosinophilen Peroxidase oder humane Schilddrüsen Peroxidase
- Galaktosidase
b) Therapie von Autoimmunerkrankungen und Entzündungen
(eine detaillierte Beschreibung erfolgte bereits in der Patentanmeldung EP-A 0 807 183, auf die Bezug genommen wird)
b.1 ) Zielzellen: - proliferierende Endothelzellen oder
- Makrophagen und/oder Lymphozyten oder - Synovialzellen
b.2) Promotoren:
- endothelzellspezifisch und Zellzyklusspezifisch oder - makrophagen- und/oder lymphozytenspezifisch und/oder zellzyklusspezifisch oder
- synovialzellspezifisch und/oder Zellzyklusspezifisch
b.3) Effekorgene für die Therapie von Allergien, zum Beispiel für - IFNß
- IFNγ
- IL-10
- Antikörper bzw. Antikörperfragmente gegen IL-4
- lösliche IL-4-Rezeptoren - IL-12
- TGFß
b.4) Effektorgene für die Verhinderung der Abstoßung von transplantierten Organen, zum Beispiel für - IL-10
- TGFß
- lösliche IL-1 -Rezeptoren
- lösliche IL-2-Rezeptoren
- IL-1 -Rezeptorantagonisten - lösliche IL-6-Rezeptoren
- immunsuppressive Antikörper oder deren VH und VL enthaltende Fragmente oder deren über einen Linker verbundene VH- und VL-Fragmente. Immunsuppressive Antikörper sind beispielsweise Antikörper spezifisch für den T-Zell-Rezeptor oder seinen CD3-Komplex, gegen CD4 oder CD8 des weiteren gegen den IL-2-Rezeptor, IL-1 -Rezeptor oder IL-4-Rezeptor oder gegen die Adhäsionsmoleküle CD2, LFA-1 , CD28 oder CD40 b.5) Effektorgene für die Therapie von Antikörper-mediierten Autoimmunerkrankungen, zum Beispiel für
- TGFß - IFNα
- IFNß
- IFNγ
- IL-12
- lösliche IL-4-Rezeptoren - lösliche IL-6-Rezeptoren
- immunsuppressive Antikörper oder deren VH und VL-enthaltende Fragmente
b.6) Effektorgene für die Therapie von Zell-mediierten Autoimmunerkrankungen, zum Beispiel für - IL-6
- IL-9
- IL-10
- IL-13
- TNFα oder TNFß - IL-13
- einen immunsuppressiven Antikörper oder dessen VH- und VL-enthaltende Fragmente
b.7) Effektorgene für Inhibitoren der Zellproliferation, zytostatische oder zytotoxische Proteine und Enzyme für die Aktivierung von Vorstufen von Zytostatika
Beispiele für Gene kodierend für derartige Proteine sind bereits im Abschnitt "Effektorgene für die Therapie von Tumoren" aufgeführt.
In gleicher Form wie dort bereits beschrieben, können im Sinne der Erfindung
Strukturgene verwendet werden, welche für Fusionsproteine aus Antikörpern bzw. Fab oder rek. Fv-Fragmenten dieser Antikörper oder anderen Liganden spezifisch für die Zielzelle und den o.a. Cytokinen, Wachstumsfaktoren, Rezeptoren, zytostatischen oder zytotoxischen Proteinen und Enzymen kodieren.
b.8) Effektorgene für die Therapie der Arthritis
Im Sinne der Erfindung werden Strukturgene ausgewählt, deren exprimiertes Protein die Entzündung beispielsweise im Gelenk direkt oder indirekt hemmt und/oder die Rekonstitution von extrazellulärer Matrix (Knorpel, Bindegewebe) im Gelenk fördert.
Hierzu gehören zum Beispiel
- IL-1-Rezeptorantagonist (IL-1 -RA); IL-1-RA inhibiert die Bindung von IL-1α, ß
- löslicher IL-1 -Rezeptor; löslicher IL-1 -Rezeptor bindet und inaktiviert IL-1
- IL-6
IL-6 erhöht die Sekretion von TIMP und Superoxiden und vermindert die Sekretion von IL-1 und TNFα durch Synovialzellen und Chondrozyten
- löslicher TNF-Rezeptor löslicher TNF-Rezeptor bindet und inaktiviert TNF.
- IL-4
IL-4 inhibiert die Bildung und Sekretion von IL-1 , TNFα und MMP - IL-10
IL-10 inhibiert die Bildung und Sekretion von IL-1 , TNFoc und MMP und erhöht die Sekretion von TIMP
- Insulin-like growth factor (IGF-1 )
IGF-1 stimuliert die Synthese von extrazellulärer Matrix. - TGFß, im speziellen TGFßl und TGFß2
TGFß stimuliert die Synthese von extrazellulärer Matrix. - Superoxiddismutase
- TIMP, im speziellen TIMP-1 , TIMP-2 oder TIMP-3
c) Therapie der mangelhaften Bildung von Zellen des Blutes (eine detaillierte Beschreibung erfolgte bereits in der Patentanmeldung EP-A
0 807 183, auf die Bezug genommen wird) c.1 ) Zielzellen:
- proliferierende, unreife Zellen des blutbildenden Systems oder
- Stromazellen benachbart den blutbildenden Zellen
c.2) Promotoren:
- spezifisch für blutbildende Zellen und/oder Zellzyklusspezifisch
- zellunspezifisch und zellzyklusspezifisch
c.3) Effektorgene für die Therapie der Anämie, zum Beispiel für
- Erythropoietin
c.4) Effektorgene für die Therapie der Leukopenie, zum Beispiel für
- G-CSF - GM-CSF
- M-CSF
c.5) Effektorgene für die Therapie der Thrombozytopenie, zum Beispiel für
- IL-3 - Leukemia Inhibitory Factor (LIF)
- IL-11
- Thrombopoietin
d) Therapie von Schäden des Nervensystems (eine detaillierte Beschreibung erfolgte bereits in der Patentanmeldung EP-A
0 777 740, auf die Bezug genommen wird) d.1 ) Zielzellen:
- Gliazellen oder
- proliferierende Endothelzellen
d.2) Promotoren:
- Gliazell-spezifisch und zellzyklusspezifisch oder
- Endothelzell-spezifisch und Zellzyklusspezifisch oder
- unspezifisch und Zellzyklusspezifisch
d.3) Effektorgene für neuronale Wachstumsfaktoren, zum Beispiel
- FGF
- Nerve growth factor (NGF) Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) - Neurotrophin-3 (NT-3)
- Neurotrophin-4 (NT-4)
- Ciliary neurotrophic factor (CNTF) d.4) Effektorgene für Enzyme, zum Beispiel für
- Tyrosinhydroxylase - Dopadecarboxylase
d.5) Effektorgene für Cytokine und deren Inhibitoren, welche die neurotoxische Wirkung von TNFα inhibieren oder neutralisieren, zum Beispiel für
- TGFß - lösliche TNF-Rezeptoren
- TNF-Rezeptoren neutralisieren TNFα
- IL-10
IL-10 inhibiert die Bildung von IFNγ, TNFα, IL-2 und IL-4
- lösliche IL-1 -Rezeptoren - IL-1 -Rezeptor I
- IL-1 -Rezeptor II - lösliche IL-1 -Rezeptoren neutralisieren die Aktivität von IL-1
- IL-1-Rezeptor-Antagonist
- lösliche IL-6-Rezeptoren
e) Therapie von Störungen des Blutgerinnungs- und Blutkreislaufsystems
(eine detaillierte Beschreibung erfolgte bereits in den Patentanmeldungen EP-A 0 777 739, EP-A 0 790 313, EP-A 0 805 209 und EP-A 0 848 063, auf weiche Bezug genommen wird)
e.1 ) Zielzellen:
- Endothelzellen oder
- proliferierende Endothelzellen oder
- somatische Zellen in Nachbarschaft von Endothelzellen und glatte Muskelzellen oder - Makrophagen
e.2) Promotoren:
- zellunspezifisch und zellzyklusspezifisch oder
- spezifisch für Endothelzellen, glatte Muskelzellen oder Makrophagen und zellzyklusspezifisch
e.3) Effektorgene für die Inhibition der Gerinnung oder für die Förderung der Fibrinolyse, zum Beispiel für
- Tissue Plasminogen Activator (tPA) - Urokinase-type Plasminogen Activator (uPA)
- Hybride von tPA und uPA
- Protein C
- Hirudin
- Serin Proteinase Inhibitoren (Serpine), wie beispielsweise C-1S-lnhibitor, α1- Antitrypsin oder Antithrombin III
- Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI) e.4) Effektorgene für die Förderung der Gerinnung, zum Beispiel für
- F VIII
- F IX - von Willebrand factor
- F XIII
- PAI-1
- PAI-2
- Tissue Factor and Fragmente hiervon
e.5) Effektorgene für Angiogenesefaktoren, zum Beispiel für
- VEGF
- FGF
e.6) Effektorgene für die Blutdrucksenkung, zum Beispiel für
- Kallikrein
- Endothelzell "nitric oxide synthase"
e.7) Effektorgene für die Inhibition der Proliferation von glatten Muskelzellen nach Verletzungen der Endothelschicht, zum Beispiel für
- ein antiproliferatives, zytostatisches oder zytotoxisches Protein oder
- ein Enzym zur Aufspaltung von Vorstufen von Zytostatika in Zytostatika wie bereits oben (unter Tumor) aufgeführt oder - ein Fusionsprotein eines dieser Wirkstoffe mit einem Liganden, beispielsweise einem Antikörper oder Antikörperfragmenten spezifisch für Muskelzellen
e.8) Effektorgene für weitere Blutplasmaproteine, zum Beispiel für - Albumin
- C1 -lnaktivator - Serum Cholinesterase
- Transferrin
- 1-Antritrypsin
f) Impfungen
(eine detaillierte Beschreibung erfolgte bereits in den Patentanmeldungen EP-A 0 807 183, EP-A 0 790 313, EP-A 0 860 445, auf weiche Bezug genommen wird) f.1 ) Zielzellen:
- Muskelzellen oder - Makrophagen und/oder Lymphozyten
f.2) Promotoren:
- unspezifisch und zellzyklusspezifisch oder
- zielzellspezifisch und zellzyklusspezifisch
f.3) Effektorgene für die Prophylaxe von Infektionserkrankungen
Die Möglichkeiten, auf konventionellem Wege wirkungsvolle Impfstoffe herzustellen, sind beschränkt.
Demzufolge wurde die Technologie der DNA-Vakzine entwickelt. Diese DNA-
Vakzinen werfen jedoch Fragen zur Wirksamkeitsstärke auf (Fynan et al., Int. J. Immunopharm. 17, 79 (1995); Donnelly et al., Immunol. 2, 20 (1994)).
Gemäß dieser Erfindung ist mit einer größeren Wirksamkeit der DNA- Vakzine zu rechnen.
Als Wirksubstanz ist die DNA eines vom Infektionserreger gebildeten Proteins auszuwählen, welches durch Auslösung einer Immunreaktion, d.h. durch Antikörperbindung und/oder durch zytotoxische T-Lymphozyten zur Neutralisierung und/oder zur Abtötung des Erregers führt. Derartige sogenannte Neutralisationsantigene werden als Impfantigene bereits angewandt (siehe Übersicht bei Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992)).
Bevorzugt im Sinne der Erfindung wird die DNA kodierend für Neutralisationsantigene folgender Erreger:
- Influenza A-Virus
- HIV
- Tollwut-Virus
- HSV (Herpes Simplex Virus) - RSV (Respiratory Syncytial Virus)
- Parainfluenza-Virus
- Rotavirus
- VZV (Varizella Zoster Virus)
- CMV (Cytomegalo-Virus) - Masern-Virus
- HPV (Humanes Papillomvirus)
- HBV (Hepatitis B-Virus)
- HCV (Hepatitis C-Virus)
- HDV (Hepatitis D-Virus) - HEV (Hepatitis E-Virus)
- HAV (Hepatitis A-Virus)
- Vibrio cholera-Antigen
- Borrelia burgdorferi
- Helicobacter pylori - Malaria-Antigen
- Zu derartigen Wirksubstanzen im Sinne der Erfindung gehört jedoch auch die DNA eines Antiidiotyp-Antikörpers oder seiner Antigen-bindenden Fragmente, dessen Antigenbindungsstrukturen (die "complementary determining regions") Kopien der Protein- oder Kohlenhydratstruktur des Neutralisationsantigens des Infektionserregers darstellen. Derartige Antiidiotyp-Antikörper können besonders Kohlenhydratantigene bei bakteriellen Infektionserregern ersetzen.
Derartige antiidiotypische Antikörper und ihre Spaltprodukte wurden von Hawkins et al. (J. Immunother. 14, 273 (1993)) und Westerink und Apicella
(Springer Seminars in Immunopathol. 15, 227 (1993)) übersichtlich beschrieben. f.4) Effektorgene für "Tumorvakzinen"
- Hierzu gehören Antigene auf Tumorzellen. Derartige Antigene wurden zum Beispiel von Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, München
(1988) und Contrib. to Oncol 43, Karger Verlag, München (1992) übersichtlich dargestellt.
Weitere Beispiele stellen die Gene für folgende Antigene bzw. für Antiidiotypantikörper korrespondierend mit folgenden Antigenen dar:
- Sialyl Lewis
- Peptide auf Tumoren, welche von T-Lymphozyten erkannt werden
- von Onkogenen exprimierte Proteine - Blutgruppenantigene und deren Vorläufer
- Antigene auf dem polymorphen epithelialen Mucin
- Antigene auf Heat Shock Proteinen
g) die Therapie von chronischen Infektionserkrankungen (eine detaillierte Beschreibung erfolgte bereits in den Patentanmeldungen EP-A
0 807 183 und EP-A 0 860 445, auf weiche Bezug genommen wird) g.1 ) Zielzelle:
- Leberzelle
- Lymphozyt und/oder Makrophage - Epithelzelie
- Endothelzelle g.2) Promotoren:
- virusspezifisch oder zellspezifisch und zellzyklusspezifisch
g.3) Effektorgene, beispielsweise für
- ein Protein, welches zytostatische, apoptotische oder zytotoxische Wirkungen aufweist.
- ein Enzym, welches eine Vorstufe einer antiviralen oder zytotoxischen Substanz in die aktive Substanz spaltet.
g.4) Effektorgen für antivirale Proteine
- antiviral wirksame Cytokine und Wachstumsfaktoren. Hierzu zählen beispielsweise IFNα, IFNß, IFN-γ, TNFß, TNFα, IL-1 oder TGFß
- Antikörper einer Spezifität, die das jeweilige Virus inaktiviert oder dessen VH und VL enthaltende Fragmente oder dessen über einen Linker verbundene
VH und VL Fragmente hergestellt wie bereits beschrieben.
Antikörper gegen Virusantigen sind beispielsweise:
anti HBV anti HCV anti HSV anti HPV anti HIV anti EBV anti HTLV
Anti Coxackie Virus anti Hantaan Virus - ein Rev bindendes Protein. Diese Proteine binden an die Rev-RNA und inhibieren Rev-abhängige posttranskriptionelle Stufen der Retrovirus- Genexpression. Beispiele für Rev-bindende Proteine sind:
RBP9-27
RBP1 -8U RBP1 -8D Pseudogene von RBP1-8
- Ribozyme, welche die mRNA von Genen für Zellzykluskontrollproteine oder die mRNA von Viren verdauen. Ribozyme katalytisch für HIV wurden beispielsweise von Christoffersen et al., J. Med. Chem. 38, 2033 (1995) übersichtlich beschrieben.
g.5) Effektorgene für antibakterielle Proteine
Zu den antibakteriellen Proteinen gehören beispielsweise Antikörper, die bakterielle Toxine neutralisieren oder Bakterien opsonieren. Beispielsweise gehören hierzu Antikörper gegen
Meningokokken C oder B
E. coli
Borrelia
Pseudomonas
Helicobacter pylori Staphylococcus aureus
VI) Kombination gleicher oder unterschiedlicher Effektorgene
(eine detaillierte Beschreibung erfolgte in EP-A 0 777 739 und EP-A 0 860 445, auf welche Bezug genommen wird) Zur Expression von zwei oder mehreren Effektorgenen [z.B. Komponenten e, e', e"] ist jeweils eine weitere Komponente c) und Komponente d) oder vorzugsweise die cDNA einer "internal ribosome entry site" (IRES) als regulatorisches Element zwischen den jeweiligen Effektorgenen geschaltet.
Eine IRES ermöglicht die Expression zweier über eine IRES miteinander verbundener DNA-Sequenzen.
Derartige IRES wurden beispielsweise von Montford und Smith (TIG 11 , 179 (1995); Kaufman et al., Nucl. Acids Res. 19, 4485 (1991 ); Morgan et al., Nucl. Acids Res. 20, 1293 (1992); Dirks et al., Gene 128, 247 (1993); Pelletier und Sonenberg, Nature 334, 320 (1988) und Sugitomo et al., BioTechn. 12, 694 (1994)) beschrieben.
So kann beispielsweise die korrespondierende DNA-Sequenz der IRES-Sequenz des Poliovirus (Position < 140 bis > 630 des 5' UTR verwendet werden.
Bevorzugt im Sinne der Erfindung sind über weitere Komponenten c) und d) oder über eine IRES-Sequenz Effektorgene zu verknüpfen, welche eine additive Wirkung aufweisen.
Im Sinne der Erfindung sind bevorzugte Kombinationen von Effektorgenen beispielsweise für a) die Therapie von Tumoren - gleiche oder unterschiedliche, zytostatische, apoptotische, zytotoxische und/oder entzündungserregende Proteine oder - gleiche oder unterschiedliche Enzyme für die Spaltung der Vorstufe eines Zytostatikums
b) die Therapie von Autoimmunerkrankungen - unterschiedliche Cytokine oder Rezeptoren mit synergistischer Wirkung zur Hemmung der zellulären und/oder humoralen Immunreaktion oder
- unterschiedliche oder gleiche TIMPs
c) die Therapie von mangelhafter Bildung von Zellen des Blutes
- unterschiedliche, hierarchisch aufeinanderfolgende Cytokine, wie beispielsweise
IL-1 , IL-3, IL-6 oder GM-CSF und Erythropoietin, G-CSF oder Thrombopoietin
d) die Therapie von Nervenzellschäden
- ein neuronaler Wachstumsfaktor und ein Cytokin oder der Inhibitor eines Cytokines
e) die Therapie von Störungen des Blutgerinnungs- und Blutkreislaufsystems - ein Antithrombotikum und ein Fibrinolytikum (z.B. tPA oder uPA) oder
- ein zytostatisches, apoptotisches oder zytotoxisches Protein und ein Antithrombotikum oder ein Fibrinolytikum
- mehrere unterschiedliche, synergistisch wirkende Blutgerinnungsfaktoren, beispielsweise F VIII und vWF oder F VIII und F IX
f) Impfungen
- ein Antigen und ein immunstimulierendes Cytokin, wie beispielsweise IL-1α, IL-1 ß, IL-2, GM-CSF, IL-3 oder IL-4 Rezeptor
- unterschiedliche Antigene eines Infektionserregers oder unterschiedlicher Infektionserreger oder
- unterschiedliche Antigene eines Tumortyps oder unterschiedlicher Tumortypen
g) Therapie von viralen Infektionserkrankungen
- ein antivirales Protein und ein zytostatisches, apoptotisches oder zytotoxisches Protein - Antikörper gegen unterschiedliche Oberflächenantigene eines Virus oder mehrere Viren
h) Therapie von bakteriellen Infektionserkrankungen - Antikörper gegen unterschiedliche Oberflächenantigene und/oder Toxine eines
Keimes
VII) Einfügung von Signalsequenzen und Transmembrandomänen
a) Zur Verstärkung der Translation kann am 3' Ende der Promotorsequenz und unmittelbar am 5' Ende des Startsignals (ATG) der Signal- bzw. Transmembransequenz die Nukleotidsequenz GCCACC oder GCCGCC eingefügt (Kozak, J. Cell Biol. 108, 299 (1989)) werden.
b) Zur Erleichterung der Sekretion des Expressionsproduktes des Effektorgenes kann die ggf. in der DNA-Sequenz des Effektorgenes enthaltende homologe Signalsequenz ersetzt werden durch eine heterologe, die extrazelluläre Ausschleusung verbessernde Signalsequenz.
So kann beispielsweise die Signalsequenz für das Immunglobulin (DNA
Position < 63 bis > 107; Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988)) oder die Signalsequenz für das CEA (DNA-Position < 33 bis > 134; Schrewe et al., Mol. Cell Biol. 10, 2738 (1990); Berling et al., Cancer Res. 50, 6534 (1990)) oder die Signalsequenz des humanen Respiratory Syncytial Virus Glycoproteins (cDNA der Aminosäuren < 38 bis > 50 oder 48 bis 65; Lichtenstein et al., J.
Gen. Virol. 77, 109 (1996)) eingefügt werden.
c) Zur Verankerung des Wirkstoffes in die Zellmembran der den Wirkstoff bildenden transduzierten Zelle kann alternativ oder zusätzlich zur Signalsequenz eine Sequenz für eine Transmembrandomäne eingeführt werden. So kann beispielsweise die Transmembransequenz des menschlichen Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktors (DNA-Position < 1485 bis > 1554; Cosman et al., Behring Inst. Mitt. 83, 15 (1988)) oder die DNA-Sequenz für die Signal- und Transmembranregion des menschlichen Respiratory Syncytial Virus (RSV)-Glykoproteins G (Aminosäuren 1 bis 63 oder deren
Teilsequenzen, Aminosäuren 38 bis 63; Vijaya et al., Mol. Cell Biol. 8, 1709 (1988); Lichtenstein et al., J. Gen. Virol. 77, 109 (1996)) oder die DNA- Sequenz für die Signal- und Transmembranregion der Influenzavirus- Neuraminidase (Aminosäuren 7 bis 35 oder die Teilsequenz Aminosäuren 7 bis 27; Brown et al., J .Virol. 62, 3824 (1988)) zwischen der Promotorsequenz und der Sequenz des Effektorgens eingefügt werden.
d) Zur Verankerung des Wirkstoffes in die Zellmembran der den Wirkstoff bildenden transduzierten Zellen kann jedoch auch die Nukleotidsequenz für einen Glykophospholipid-Anker eingefügt werden.
Die Einfügung eines Glykophospholipid-Ankers erfolgt am 3' Ende der Nukleotidsequenz für das Strukturgen und kann zusätzlich zur Einfügung einer Signalsequenz erfolgen.
Glykophospholipid-Anker sind beispielsweise für das CEA, für das N-CAM und für weitere Membranproteine, wie beispielsweise Thy-1 , beschrieben worden (siehe Übersicht Ferguson et al., Ann. Rev. Biochem. 57, 285 (1988)).
e) Eine weitere Möglichkeit der Verankerung von Wirkstoffen an die Zellmembran entsprechend der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer DNA- Sequenz für ein Ligand-Wirkstoff-Fusionsprotein. Die Spezifität des Liganden dieses Fusionsproteins ist gerichtet gegen eine Membranstruktur auf der Zellmembran der gewählten Zielzelle. e.1 ) Zu den Liganden, welche an die Oberfläche von Zellen binden, gehören beispielsweise Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen Strukturen auf der Oberfläche von beispielsweise
- Endothelzellen. Insbesondere zählen hierzu Antikörper gegen die VEGF Rezeptoren oder gegen Kinin-Rezeptoren
- oder von Muskelzellen, wie Antikörper gegen Actin oder Antikörper gegen Angiotensin Il-Rezeptoren oder Antikörper gegen Rezeptoren für Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise gegen EGF-Rezeptoren oder gegen PDGF-Rezeptoren oder gegen FGF-Rezeptoren oder Antikörper gegen Endothelin A-Rezeptoren
- Zu den Liganden gehören auch Antikörper oder deren Fragmente, welche gerichtet sind gegen tumorspezifische oder tumorassoziierte Antigene auf der Tumorzellmembran. Derartige Antikörper wurden bereits beschrieben.
Die murinen monoklonalen Antikörper sind bevorzugt in humanisierter Form einzusetzen. Fab und rek. Fv-Fragmente und deren Fusionsprodukte werden, wie bereits beschrieben, mit der dem Fachmann bekannten Technologie hergestellt.
e.2)Zu den Liganden gehören des weiteren alle Wirkstoffe, wie beispielsweise
Cytokine oder Adhäsionsmoleküle, Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, Mediatoren oder Peptidhormone, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf der jeweiligen ausgewählten Zelle binden. Beispielsweise gehören hierzu - Liganden für Endothelzellen, wie IL-1 , PDGF, bFGF, VEGF, TGGß (Pusztain et al., J. Pathol. 169, 191 (1993)) oder Kinin und Derivate oder Analoga von Kinin. - Des weiteren gehören hierzu Adhäsionsmoleküle. Derartige Adhäsionsmoleküle, wie beispielsweise SLex, LFA-1 , MAC-1 , LeCAM-1 , VLA-4 oder Vitronectin und Derivate oder Analoga von Vitronectin, wurden bereits für
Endothelzellen beschrieben (Übersichten bei Augustin-Voss et al., J. Cell Biol. 119, 483 (1992); Pauli et al., Cancer Metast. Rev. 9, 175 (1990); Honn et al., Cancer Metast. Rev. 11 , 353 (1992); Varner et al., Cell Adh. Commun. 3, 367 (1995)).
Die Erfindung wird an folgenden Beispielen näher erläutert, ohne sich darauf zu beschränken.
D) Beispiele zur Erläuterung des Erfindungsgedankens
Beispiel 1 : Herstellung und Prüfung eines Expressionssystems enthaltend ein chimäres Promotorsystem mit einem rekombinanten Transkriptionsfaktor in Endothelzellen
b) Klonierung der verwendeten Plasmide
Das erfindungsgemäße Expressionssystem besteht aus den im Folgenden aufgeführten Konstrukten RTA- (Rekombinanter Transkriptionsaktivator) Konstrukt und Reporterkonstrukt 1 oder 2 mit unterschiedlichen, stromabwärts aufeinanderfolgenden Nukleotidsequenzen:
RTA-Konstrukt (Fig. 5A)
— der SV40 Promotor und Enhancer (Genbank SV40 zirkuläres Genom, NID g965480: Nukleotide 5172 - 294)
— dem Kaninchen ß-Globin-Intron II (Genbank ß-Globin-Gen, Accession-Nr. V00882: Nukleotide 700 - 1305, van Ooyen et al., Science 206, 337 (1979))
— der cDNA für die DNA-Bindedomäne des Gal4 Proteins [Aminosäuren 1 bis 147; Chasman und Kornberg, Mol. Cell Biol. 2916 (1990)] — dem Linker: ATA GGC CGG GCC (SEQ ID NO: 11 ) — der cDNA für die Transaktivierungsdomäne von NF-YA [Aminosäuren 1 bis 261 + Stop-Codon (TAG); Li et al., J. Biol. Chem. 267, 8984 (1992); van Hujisduijnen et al., EMBO J. 9, 3119 (1990); Sinka et al., J. Biol. Chem. 92, 1624 (1995)] — dem SV40-Poly A-Signal (Vektor pGL3, Promega)
(dieses Transkriptionsterminationssignal ist am 3' Ende aller nachfolgend angeführten Konstrukte angefügt, ohne gesondert aufgeführt zu sein
Reporterkonstrukt 1 (Fig. 5B)
— 5x der Bindesequenz [Nukleotidsequenz: 5 x 5'- CGGAGTACTGTCCTCCG-3', SEQ ID NO: 6] für das Gal4 Protein (Webster et al., Cell 52, 169 (1988))
— dem basalen Promotor von cdc25C [Nukleotidsequenz -20 bis +121 ; Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)]
— der cDNA für Luciferase; sämtliche Luziferasekonstrukte sind in den Vektor pGL3 (Promega) kloniert, der zur Transkriptionstermination das SV40-Poly A-Signal beinhaltet
Reporterkonstrukt 2 (Fig. 5C)
— 3x der Bindesequenz [Nukleotidsequenz: 5 x 5'- CGGAGTACTGTCCTCCG-3', SEQ ID NO: 6] für das Gal4 Protein (Webster et al., Cell 52, 169 (1988)) — dem basalen Promotor von cyclin A (Nukleotidsequenz -40 bis +94; Henglein et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA 91 , 5490-5494 (1994))
— der cDNA für Luciferase (pGL3, Promega)
Als Kontrollen dienten folgende Konstrukte
Reporterkonstrukt 3 (Fig. 5D) Entspricht dem Reporterkonstrukt 1 , wobei in dem basalen Promotor von cdc25C [Nukleotidsequenz -20 bis +121 ; Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)] das CDE Element TGGCGGA mutiert wurde zu TGGCtGA.
Kontrollkonstrukt 1 (Fig. 6A)
"pGL3promoter" von Promega: Expressionssystem mit folgenden Nukleotidsequenzen — SV40 Promotor
— cDNA für Luciferase
Kontrollkonstrukt 2 (Fig. 6B)
Expressionssystem mit folgenden Nukleotidsequenzen
— cyclin A Promotor (-214 bis +100, Henglein et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA 91 , 5490-5494 (1994))
— cDNA für Luciferase
Kontrollkonstrukt 3 (Fig. 6C)
Expressionsprodukt mit folgenden Nukleotidsequenzen
— cdc25C Promotor (-290 bis +121 , Lucibello et al., EMBO J. 14, 132-142 (1995)) — cDNA für Luciferase
Zur Klonierung sämtlicher Reporterkonstrukte und Kontrollkonstrukte wurde pGL3 (Promega, Luziferase-cDNA-Reporter) als Vektor verwendet. Die in diesen Vektor klonierten Promotorelemente wurden mittels PCR aus humaner, genomischer DNA amplifiziert. Die dazu verwendeten Oligonukleotide enthielten jeweils 4 Nukleotide Überhang (5'-GATC-3'), gefolgt von 6 Nukleotiden mit den benötigten Restriktionsschnittstellen (5'-Primer: BamHI (GGATCC)/ 3'-Primer: Hindill (AAGCTT) für die Kontrollplasmide 1 und 2 und die Reporterplasmide 1 und 3; 5'- Primer: Bgl II (AGATCT)/ 3'-Primer: Hindill für das Reporterplasmid 2) und anschließend 20 - 25 zu dem zu amplifizierenden Promotor komplementäre Nukleotide (beginnend mit der in Klammern angezeigten Position relativ zum Transkriptionsstart). Die in Klammern angegebenen Positionen beziehen sich auf die in der zitierten Literaturstelle aufgeführte Sequenz.
Die PCR-Produkte wurden mit QIAquickTM Spin-Säulen (Qiagen) nach Anleitung des Herstellers aufgereinigt, mit den entsprechenden Restriktionsenzymen verdaut (diese Enzyme sind käuflich zu erwerben) und nach Auftrennung durch Agarosegelelektrophorese erneut mit QIAquickTM Spin-Säulen aufgereinigt.
Gal4-Bindungsstellen wurden als Oligonukleotide mit für die entsprechenden Restriktionsschnittstellen benötigten Überhängen synthetisiert (5': BamHI/ 3': Bgl II), mit SephadexG25 (Pharmacia) aufgereinigt und hybridisiert.
Die verdauten PCR-Produkte und hybridisierten Oligonukleotide wurden anschließend in die entsprechend geschnittenen und aufgereinigten Vektoren unter Verwendung von T4 DNA-Ligase (Promega) ligiert.
Sämtliche durch PCR und unter Verwendung von Oligonukleotiden erhaltenen Konstrukte wurden sequenziert, um Mutationen auszuschließen.
b) Reporterassays: Transiente Transfektion, Synchronisation und Luziferaseassay
Die Promotoraktivität der unter a) beschriebenen Konstrukte wurde durch transiente Transfektion bzw. Kotransfektion in Endothelzellen mit anschließender Messung der Luziferaseaktivität bestimmt. BAECs (bovine aortic endothelial cells = Rinder- aortaendothelzellen) wurden nach der DEAE/Dextran-Methode [modifiziert nach Sompayrac et al., PNAS 78, 7575 (1981 )] transient transfiziert. Der Luciferaseassay wurde, wie in Lucibello et al. (EMBO J. 14, 132 (1995)) beschrieben, durchgeführt.
Es wurden 8 mg Plasmid pro 3,5 cm-Schale transfiziert. Bei Kotransfektionen wurden 4 + 4 μg Plasmid transfiziert, wobei bei den Kontrollen mit dem pUC19- Plasmid aufgefüllt wurde. Zur Messung einer zelizyklusabhängigen Promtoraktivität wurden proliferierende Zellen (Vollmedium) mit durch einen 48-stündigen Methioninentzug in der G1 -Phase des Zellzyklus arretierten Zellen verglichen. Dabei diente das nicht zellzyklusregulierte Kontrollkonstrukt 1 (enthaltend den SV40-Promotor) zur Standardisierung (seine Aktivität wurde gleich 1 gesetzt).
c) Ergebnisse
Folgende Ergebnisse wurden erzielt (in Klammern angegebene Meßwerte stellen die relative Luziferaseaktivität (standardisiert mit dem SV40-Promotor = Kontrollkonstrukt 1 ) in proliferierenden Zellen/relative Luziferaseaktivität in G1- Zellen dar):
Mit den Kontrollkonstrukten 2) und 3) transfizierte Endothelzellen bilden deutlich mehr Luziferase wenn sie proliferieren (DNA > 2S), als wenn sie in der G1 -Phase des Zellzyklus (DNA = 2S) arretiert sind (Kontrollkonstrukt 3: > 40x;
Kontrollkonstrukt 2: > 150x). Diese Konstrukte dienten als Kontrollen für die Experimente mit den erfindungsgemäßen Expressionssystemen.
Bei Kotransfektion der Reporterkonstrukte 1 ) und 2) mit dem RTA-Konstrukt konnte ebenfalls eine höhere Luziferaseaktivität in proliferierenden als in G1 arretierten Endothelzellen gezeigt werden (Reporterkonstrukt 1 : 5,5x; Reporterkonstrukt 2: 8,3x). Kein Unterschied wurde nach Kotransfektion des Kontrollkonstruktes 3) mit dem RTA-Konstrukt gesehen (1 ,0x). Die Luziferaseaktivität lag jeweils deutlich höher als nach Transfektion der jeweiligen Reporterkonstrukte alleine.
Eine deutliche Zelizyklusregulation des erfindungsgemäßen Expressionssystems in Endothelzellen konnte somit gezeigt werden
Beispiel 2: Herstellung und Prüfung eines Expressionssystems enthaltend ein chimäres Promotorsystem mit einem rekombinanten
Transkriptionsfaktor in Melanomzellen
a) Klonierung der verwendeten Plasmide
Das erfindungsgemäße Expressionssystem besteht aus folgenden Konstrukten mit unterschiedlichen, stromabwärts aufeinanderfolgenden Nukleotidsequenzen: RTA-Konstrukte
Die RTA (Rekombinanter Transkriptionsaktivator)-Plasmide kodieren für ein Fusionsprotein aus der Gal4-DNA-Bindungsdomäne und der Serin-, Threonin- und Glutamin-reichen Transaktivierungsdomäne des Transkriptionsfaktors NF-YA.
— CMV-GN Gal4 (As 1 -147), Linker: ATA GGC CGG GCC (SEQ ID. NO: 11 ), mNF-YA
(As 1 -261 + Stop-Codon (TAG)) unter Kontrolle des CMV-Promotors und -Enhancers (nts 232-863 aus pcDNA3,
Invitrogen), SV40-PolyA (Fig. 7A)
(Li et al, J. Biol. Chem. 267, 8984-8990 (1992)) — Tyr-GN Gal4 (As 1 -147), Linker: ATA GGC CGG GCC (SEQ ID NO: 11 ), mNF-YA (As 1-261 + Stop-Codon (TAG)) unter Kontrolle des Tyrosinase-Promotors (s. Konstrukt Tyr), SV40-PolyA (Fig. 7B)
(Li et al., J. Biol. Chem. 267, 8984-8990 (1992)) — Tyr-G Gal4 -Stop (As 1 -147 + Stop-Codon (TAG)) unter Kontrolle des
Tyrosinase-Promotors, SV40-PolyA (Fig. 7C)
Reporterkonstrukte
— 5G25C identisch dem Reporterkonstrukt 1 ) unter I) — - 5G25CRT7 identisch dem Reporterkonstrukt 2) unter I)
— 8GCycA 8 x Gal4-DNA-Bindungsstelle + cyclin A-Promotor (-40/+94; Henglein et al, Proc. Natl Acad. Sei.
USA 91 , 5490-5494 (1994)) (Fig. 8A)
— 8GCycART7 wie 8GCycA, mit mutiertem CDE (TCGCGGG
->TCGCtGG, Zwicker et al. EMBO J. 14: 4514, 1995) (Fig. 8B) Gal4-DNA-Bindungsstelle: 5'-CGGAGTACTGTCCTCCG-3',
SEQ ID NO: 6
Kontrollkonstrukte
— basic = "pGL3basic" (Promega, ohne Promotor oder Enhancer)
(Fig. 9A)
— SV40p = "pGL3promoter" (Promega, mit dem Simian Virus 40
Basalpromotor) identisch dem Kontrollkonstrukt 1 unter I (Fig. 6A)
— Tyr Tyrosinase-Promotor: 2 x distales Element (TDE, -2014/-1811) und 1 x proximales Element (TPE, -209/+51 ) (Shibata et al, J. Biol. Chem. 267, 20584 (1992)), cDNA für Luziferase (pGL3, Promega) (Fig. 9B) — cdc25C cdc25C-Promotor (-290/+121 ) (Lucibello et al, EMBO J. 14, 132-142 (1995)), cDNA für Luziferase (pGL3, Promega); identisch dem Kontrollkonstrukt 3 unter I (Fig. 6C)
— cycA cyclin A-Promotor (-214/+100) (Henglein et al, Proc. Natl Acad.
Sei. USA 91 , 5490-5494 (1994)), cDNA für Luziferase (pGL3, Promega); identisch dem Kontrollkonstrukt 2 unter I (Fig. 6B)
Bei sämtlichen Reporterkonstrukten und Kontrollkonstrukten wurde pGL3 (Promega, Luziferase-cDNA-Reporter) als Vektor verwendet. Die in diesen Vektor klonierten Promotorelemente wurden mittels PCR aus humaner, genomischer DNA amplifiziert. Die dazu verwendeten Oligonukleotide enthielten jeweils 4 Nukleotide Überhang (GATC), gefolgt von 6 Nukleotiden mit den benötigten Restriktionsschnittstellen (BamHI (GGATCC)/Hindlll (AAGCTT) für die Kontrollplasmide cdc25C und cycA und die Reporterplasmide 5G25C und 5G25CRT7; Kpnl (GGTACC) /Nhel (GCTAGC) bzw. Nhel/Xhol (CTCGAG) für das TDE und Xhol/Bgl II (AGATCT) für das TPE, Bgl ll/Hindlll für die Reporterplasmide 8GCycA und 8GCycART7 und anschließend 20 - 25 zu dem zu amplifizierenden Promotor komplementäre Nukleotide (beginnend mit der in Klammern angezeigten Position relativ zum Transkriptionsstart). Die in Klammern angegebenen Positionen beziehen sich auf die in der zitierten Literaturstelle aufgeführte Sequenz.
Die PCR-Produkte wurden mit QIAquick™ Spin-Säulen (Qiagen) nach Anleitung des Herstellers aufgereinigt, mit den entsprechenden Restriktionsenzymen verdaut (diese Enzyme sind käuflich zu erwerben) und nach Auftrennung durch Agarosegelelektrophorese erneut mit QIAquickTM Spin-Säulen aufgereinigt.
Gal4-Bindungsstellen wurden als Oligonukleotide mit für die entsprechenden Restriktionsschnittstellen benötigten Überhängen synthetisiert (Kpnl (top: 5'-; bottom: 3'-)/Xhol (top:5'-; bottom: 3'-) oder BamHI (top: 5'-; bottom: 3'-) /Bgl II (top: 5'-; bottom: 3'-)), mit SephadexG25 (Pharmacia) aufgereinigt und hybridisiert. Die verdauten PCR-Produkte und hybridisierten Oligonukleotide wurden anschließend in die entsprechend geschnittenen und aufgereinigten Vektoren unter Verwendung von T4 DNA-Ligase (Promega) ligiert.
Sämtliche durch PCR und unter Verwendung von Oligonukleotiden erhaltenen Konstrukte wurden sequenziert, um Mutationen auszuschließen.
b) Reporterassays: transiente Transfektion, Synchronisation und Luziferaseassay
Die Promotoraktivität der unter a) beschriebenen Konstrukte wurde durch transiente Kotransfektion in Melanozyten (MeWo, human), Fibroblasten (3T3, murin) und Prostatakarzinomzellen (PC-3, human) mit anschließender Messung der Luziferaseaktivität bestimmt. Die Zellen wurden mit DOTAP (Boehringer, Mannheim) nach Angaben des Herstellers transient transfiziert.
Der Luciferaseassay wurde wie in Lucibello et al. (EMBO J, 14, 132 (1995)) beschrieben durchgeführt. Es wurden 1 mg (Reporter) + 2 mg (RTA) Plasmid mit 6 ml DOTAP pro 3,5 cm-Schale transfiziert, wobei bei den Kontrollen pUC19-Plasmid anstelle des RTA-Plasmids eingesetzt wurde.
Zur Messung einer zelizyklusabhängigen Promotoraktivität wurden proliferierende Zellen (Vollmedium) mit in der G1 -Phase des Zellzyklus arretierten Zellen verglichen. Dabei diente das nicht zellzyklusregulierte Konstrukt SV40p zur Standardisierung (seine Aktivität wurde gleich 1 gesetzt). Die Synchronisation der Zellen in der G1 -Phase erfolgte durch einen 60-stündigen Methioninentzug nach der Transfektion.
Zur Messung der zelltypspezifischen Promotoraktivität wurden die Luziferase- Aktivitäten der verschiedenen Zelltypen nach Standardisierung mit den Werten für den ubiquitären SV40-Promotor verglichen (mit SV40p = 1 ).
c) Ergebnisse
Tabelle 1 zeigt eine deutliche Zelltypspezifität des Systems: (1 ) das 8GCycA- Konstrukt hat eine nur geringe Aktivität, die im Bereich der Aktivität des Leervektors basic liegt, (2) durch Kotransfektion des CMV-GN-Konstruktes erfolgt eine deutliche Aktivierung in allen 3 Zellinien, (3) eine spezifische Aktivierung wird durch Kotransfektion des Tyr-GN-Konstruktes nur in den Targetzellen, d.h. in den Melanomzellen, durch selektive Expression des Gal-NF-Y-Fusionsproteins erzielt und (4) es erfolgt eine nur sehr geringe Aktivierung durch Kotransfektion des Tyr-G- Konstruktes, d.h. die Aktivierung in (3) ist auf die Transaktivierungsdomäne des NF- YA zurückzuführen.
Die Spezifität des Systems 8GCycA+Tyr-GN liegt bei 58 (Vergleich MeWo : PC-3) bzw. 73 (Vergleich MeWo : 3T3) bei sehr geringer Aktivität in Nicht-Targetzellen.
Die Werte in Tabelle 2 belegen die zellzyklusregulierte Aktivität des Systems: — der cyclinA-Promotor zeigt eine 26-fache Zelizyklusregulation (Aktivität proliferierende MeWos : Aktivität MeWos in G1 , Positivkontrolle)
— das System 8GCycA + Tyr-GN zeigt eine Zelizyklusregulation von 22.5-fach (ist also annähernd so gut reguliert wie der cyclinA Wildtyppromotor, bei nahezu gleicher Aktivität in proliferierenden Zellen) und
— eine Mutation des CDE-Elementes (RT7) führt zu einer drastisch erhöhten Aktivität in G1 -Zellen und damit zu einer geringeren Zelizyklusregulation von 5-fach. Die Zelizyklusregulation ist daher v.a. auf die CDE/CHR-vermittelte Repression in G1 (durch den CDE/CHR-bindenden Repressor, der die durch
NF-YA bedingte Transaktivierung in G1 -Zellen reprimiert) zurückzuführen. Die verbleibende Zelizyklusregulation der RT7-Mutante kann auf eine ebenfalls geringe Zelizyklusregulation des Tyrosinase-Promotors selbst (4.2- fach) zurückgeführt werden. Die Tabellen 3 und 4 zeigen, daß das System bei Verwendung des cdc25C-
CDE/CHR-Elementes ebenfalls sowohl eine deutliche Zelltypspezifität (3,9-fach) sowie Zelizyklusregulation (8,4-fach) aufweist.
Die gewebespezifische Expression eines Gal-NF-Y-Fusionsproteins, das über Gal4- DNA-Bindungsstellen stromaufwärts eines CDE/CHR-Elementes die Expression eines Gens sowohl gewebespezifisch als auch proliferationsabhängig steuert, konnte damit beispielhaft gezeigt werden. Dabei wurde bei Verwendung des melanozytenspezifischen Tyrosinase-Promotors und des cyclinA-CDE/CHR- Elementes eine >20-fache Zelizyklusregulation bei >50-facher Zelltypspezifität erzielt. Die Aktivität des Systems ist in proliferierenden Targetzellen mit der Aktivität des Wildtyp-cyclin A-Promotors vergleichbar und in nicht-proliferierenden Targetzellen und in Nicht-Targetzellen kaum höher als die des Leervektors pGL3basic.
Beispiel 3: In vivo Experimente Um herauszufinden ob der Level der Transkription, der durch das erfindungsgemäße Promotorsystem erreicht wird, ausreichend ist, um einen biologischen Effekt zu erreichen, wurde ein in vitro TNF- Cytolyseassay durchgeführt. Dieser Assay, welcher cytotoxische Effekte auf die TNF-α sensitive Zellinie L 929 mißt, wurde mit dem Medium von MeWo-Zellen durchgeführt, die mit Aktivator-(Tyr-GN) und Effektor (Gal Cyc ATNF)-Konstrukten kotransfiziert worden waren. Zur Konstruktion von Gal Cyc ATNF wurde die Luziferase cDNA von Gal Cyc A ersetzt durch die TNF-α cDNA aus dem Plasmid pAS3 (erhalten von M. Clauss, Max Planck Institut, Bad Nauheim, Deutschland). pAS3 enthält die Maus TNF-α cDNA kloniert in die Pst I/Eco Rl Restriktionsstelle des Vektors pBluescript II SK.
Um möglichst hohe Transfektionsraten beim TNFα-Bioassay zu erhalten wurden MeWo-Zellen unter Benutzung von Lipofectin (Life Technologies) gemäß der Anleitung des Herstellers verwendet. Ein Mikrogramm von Gal Cyc ATNF und 1 μg pUC19 oder Tyr-GN wurden mit 10 μl Lipofectin in OptiMEM gemischt und die Zellen damit für 6 Stunden inkubiert.
Die MeWo-Zellen wurden mit Gal Cyc ATNF/pUC19 oder Gal Cyc ATNF/Tyr-GN in drei parallelen Ansätzen kotransfiziert. 24 Std. nach Transfektion wurde das Medium ersetzt und nach weiteren 24 Std. gesammelt. Die Kulturüberstände wurden auf TNF -Bioaktivität untersucht durch Bestimmung ihrer Cytotoxizität auf die transformierte Maus-Fibroblasten Zellinie L 929. Solche L 929 Zellen wurden in Mikrotiterplatten bei einer Dichte von 4 x 104 Zellen pro Well ausgesäht. Nach 16 Std. wurden serielle Verdünnungen von Maus TNF-α in konditioniertem Medium von nicht- transfizierten MeWo-Zellen und die Überstände der transfizierten Zellen und jeweils Actinomycin D zu einer Endkonzentration von 1 μg/ml hinzugefügt. Nach 24 Std. wurden die übrig gebliebenen L 929 Zellen fixiert, mit Kristall-Violett gefärbt und der anhaftende Farbstoff mit einem ELISA-Meßgerät bei einer Wellenlänge λ = 450 nm quantifiziert. 48 Std. nach der Transfektion war die Cytolyse im Bereich von 60 % (entsprechend ~ 1 ,0 ng/ml TNF-α im Überstand). Im Gegensatz dazu zeigte sich bei den Überständen von Zellen, die mit dem Gal Cyc ATNF Effektor Konstrukt alleine transfiziert worden waren, nur ein vernachlässigbar kleiner Anteil von toten Zellen (< 2 %). Diese Resultate zeigten, daß die Transkriptionsrate die durch das erfindungsgemäße Promotorsystem erreicht wird, zur Erzielung eines deutlichen biologischen Effekts geeignet ist.
Tabelle 1
Konstrukte Luziferase-Aktivität
(RLUs, SV40p = 1 )
MeWo 3T3 PC-3
Basic 0.01 0.01 0.07
SV40p 1.00 1.00 1.00
Tyr 57.6 0.03 0.05
8GcycA 0.04 0.02 0.06
8GcycA+CMV-GN 3.39 0.42 1.35
8GcycA+Tyr-GN 2.92 0.04 0.05
8GcycA+Tyr-G 0.18 0.02 0.02
Tabelle 2
Konstrukte Luziferase-Aktivität (RLUs, SV40
MeWo MeWo proliferierend G1
Basic 0.01 0.05
SV40p 1.00 1.00
Tyr 57.60 13.60
CycA 3.38 0.13
8GcycA 0.01 0.07
8GcycA+Tyr- GN 2.70 0.12
8GcycART7 0.04 0.05
8GcycART7+Tyr-GN 7.25 1.44
Tabelle 3
Konstrukte Luziferase-Aktivität (RLUs, SV40p = 1)
MeWo 3T3
SV40p 1,00 1,00
5G25C 0,05 0,14
5G25C+CMV-GN 6,50 7,13
5G25C+Tyr- GN 5,46 1,39
Tabelle 4
Konstrukte Luziferase-Aktivität ( (RRLLLUs, SV40p = 1 )
MeWo Me\Λ proliferierend G1
SV40p 1 ,00 1 ,00
Cdc25C 1 ,08 0,11
5G25C 0,05 0,22
5G25C+Tyr-GN 5,46 0,65
5G25CRT7 0,00 0,17
5G25CRT7+Tyr-GN 3,98 2,58
Figurenlegende:
Figur 1 bis 4: Erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukte
Figur 5: Schematische Darstellung des RTA-Konstruktes und der
Reporterkonstrukte zu I
Figur 6: Schematische Darstellung der Kontrollkonstrukte zu I. Fein: pGL3-
Vektor von Promega; fett: Promotoren in der MCS von pGL3
Figur 7: Schematische Darstellung der RTA-Konstrukte zu II, das Vektorgerüst stammt von pGL3 (Promega)
Figur 8: Schematische Darstellung der Reporterkonstrukte zu II
Figur 9: Schematische Darstellung der Kontrollkonstrukte zu II. Fein: pGL3-
Vektor von Promega; fett: Promotoren in der MCS von pGL3

Claims

Patentansprüche
1 ) Nukleinsaurekonstrukt, dadurch charakterisiert, daß es folgende Komponenten enthält:
Komponente a): mindestens einen Promotor
- Komponente b): DNA kodierend für mindestens einen rekombinanten
Transaktivator, dessen Transkription durch die Komponente a) aktiviert wird und der enthält:
• Komponente b1 ): DNA, kodierend für eine DNA- bindende Domäne
• Komponente b2): DNA, kodierend für eine Transaktivierungsdomäne, welche reich ist an Glutamin, Serin und Threonin
- Komponente c): mindestens eine DNA-Sequenz zur Bindung des
Expressionsproduktes von Komponente b)
- Komponente d): mindestens einen minimalen Promotor, der das CDE-CHR-
Element oder das E2F-BS-CHR Element enthält und mit seinem 5'-Ende an das 3'-Ende von Komponente c) gebunden ist.
- Komponente e): mindestens ein Effektorgen, dessen Transkription durch Bindung des Expressionsproduktes von Komponente b) an die Komponente c) aktiviert wird.
2) Nukleinsaurekonstrukt nach Anspruch 1 ), dadurch charakterisiert, daß an das 5'-Ende der Komponente a) mindestens eine Komponente c) angefügt ist und das Expressionssystem selbst amplifizierend ist. ) Nukleinsaurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 ) oder 2) enthaltend die Komponente b'), bei welcher
- die Komponente b1 ) gekoppelt ist an Komponente b3), welche für ein Protein A kodiert, welches an eine Kopplungssubstanz f) bindet und
- die Komponente b2) gekoppelt ist an Komponente b4), welche für ein Protein B kodiert, welches ebenso an die Kopplungssubstanz f) bindet und
- bei welchem die Kopplungssubstanz f) die Expressionsprodukte der Komponenten b1 ), b3), b4) und b2) zu einem funktionsfähigen rekombinanten Transaktivator verbindet.
4) Nukleinsaurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 ) bis 3) enthaltend die Komponente b"), bei welcher die Komponenten b1 ) und b2) verbunden sind mit der Komponente b5), welche kodiert für mindestens ein Bindeprotein für ein zelluläres Regulatorprotein, wobei die Bindung des zellulären Regulatorproteins an das zugehörige Bindeprotein die Funktion des Transaktivators exprimiert von Komponente b") inhibiert.
5) Nukleinsaurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 ) bis 4), dadurch gekennzeichnet, daß mehrere gleiche oder unterschiedliche Effektorgene
[Komponenten e), e'), e")] durch eine IRES-Sequenz oder durch eine Aktivierungssequenz bestehend aus den Komponenten c) und d) miteinander verbunden sind.
6) Nukleinsaurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 ) bis 4), dadurch gekennzeichnet, daß der Komponente b), b') oder b") ein nukleares Lokalisationssignal angefügt ist.
7) Nukleinsaurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 ) bis 6), dadurch gekennzeichnet, daß ein in der Komponente a) vorliegende Promotor ausgewählt ist aus - unspezifischen Promotorsequenzen, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend den Promotor der RNA-Polymerase III oder der RNA-Polymerase II, CMV- Promotor und Enhancer, den SV40-Promotor - viralen Promotor- und Aktivatorsequenzen, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend solche Sequenzen von HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV, HIV;
- zellzyklusspezifisch aktivierbaren Promotorsequenzen, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend solche Sequenzen vom cdc25C-, Cyclin A-, cdc2- (cdk-1), Bmyb-, DHFR-, E2F-1 -Gen oder Bindesequenzen für zellproliferationsabhängig auftretende oder aktivierte Transkriptionsfaktoren wie Monomere oder Multimere der Myc E-Box;
- zellspezifisch aktivierbare Promotoren, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Promotoren, die zellspezifisch aktivierbar sind in Endothelzellen, Bindegewebszellen, Muskelzellen, Gliazellen, blutbildenden Zellen, Lymphozyten, Makrophagen, Synovialzellen, Leukämiezellen oder
Tumorzellen, Zellen der Magen-Darmschleimhaut, der Niere, des Respirationsorgans der Geschlechtsorgane und der harnableitenden Wege;
- metabolisch aktivierbaren Promotoren, ausgewählt aus der Gruppe enthaltend durch Hypoxie induzierbare Enhancersequenzen.
8) Nukleinsaurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 ) bis7), dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente b1 ) ausgewählt ist aus einer Gruppe enthaltend DNA-Bindedomänen entstammend dem Gal4-Protein, dem LexA- Protein, dem lac-Repressor Protein, dem Tetracyclin Repressorprotein oder dem ZFHD1 -Protein.
9) Nukleinsaurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 ) bis 8), dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente b2) ausgewählt ist aus solchen Transaktivierungsdomänen, welche insgesamt mindestens 20x Glutamin, 10x Serin und 10x Threonin enthalten. 0) Nukleinsaurekonstrukt nach Anspruch 9), bei welchem die Komponente b2) ausgewählt ist aus einer Gruppe enthaltend die Transaktivierungsdomänen von Oct-2, SP1 und NFY-1.
1 ) Nukleinsaurekonstrukt nach einem der Ansprüche 3) bis10), dadurch gekennzeichnet, daß
- in den Komponenten b3) oder b4) mindestens eine der die Kopplungsstruktur f) bindenden Proteine A und B ein rekombinanter Antikörper oder ein rekombinantes Antikörperfragment ist.
12) Nukleinsaurekonstrukt nach Anspruch 11 ), dadurch gekennzeichnet, daß
- mindestens eines der die Kopplungssubstaπz f) bindenden Proteine A und B ein einzelkettiges Fv-Fragment ist, enthaltend eine variable Kette und eine leichte Kette, die durch eine kurze Peptidsequenz kovalent verbunden sind.
13) Nukleinsaurekonstrukt nach einem der Ansprüche 3) bis12), dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der die Kopplungssubstanz f) bindenden Proteine A und B die Bindungsdomäne eines in der Natur vorkommenden Bindeproteins für die jeweilige Komponente f) darstellt.
14) Nukleinsaurekonstrukt nach einem der Ansprüche 3) bis13), dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplungssubstanz f) ein Arzneimittel ist.
15) Nukleinsaurekonstrukt nach einem der Ansprüche 3) bis13), dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplungssubstanz f) eine Substanz ist, welche durch die Zellmembran in die Zelle eindringen kann. 16) Nukleinsaurekonstrukt nach einem der Ansprüche 14) oder 15), dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplungssubstanz f) ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltend Rapamycin, FK506, Cyclosporin A, Methotrexat, Folsäure, Retinoinsäure, Penicillin, 4-Hydroxy-Tamoxifen, Tamoxifen, Tetrazyklin oder ein Tetrazyklin-isopropyl-ß-D-thiogalactosidkonjugat.
17) Nukleinsaurekonstrukt nach einem der Ansprüche 4) bis 16) dadurch charakterisiert, daß die Bindesequenz [Komponente b5)] für ein zelluläres Regulatorprotein ein zelluläres Bindeprotein oder ein Teil dieses Bindeproteins ist.
18) Nukleinsaurekonstrukt nach Anspruch 17), dadurch charakterisiert, daß das zelluläre Bindeprotein oder ein Teil dieses Bindeproteins an ein zelluläres Regulatorprotein bindet, das ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend p53, pRb, p130, Max, MAD, VHL, cdk-4, MTS-1 (p16), WT-1 , SMAD-2, DPC-4.
19) Nukleinsaurekonstrukt nach Anspruch 17), dadurch charakterisiert, daß die Komponente b5) ausgewählt ist aus einer Gruppe von zellulären Bindeproteinen umfassend E2F-1 , -2, -3, -4, -5, Cyclin-D1 , -D2, -D3 oder -C, Cyclin A, -E, Myc, Transkriptionsfaktor PU.1 oder Elf-1 , Elongin-B, -C, p14, p15, p16, p18, p21 , p27, p53, Myc, cdk-4, DPC-4 und SMAD-2.
20) Nukleinsaurekonstrukt nach Anspruch 17), dadurch charakterisiert, daß die Bindesequenz [Komponente b5)] für ein zelluläres Regulatorprotein ein virales Bindeprotein oder ein Teil dieses Bindeproteins ist.
21 ) Nukleinsaurekonstrukt nach Anspruch 20), dadurch charakterisiert, daß das virale Bindeprotein oder ein Teil dieses Bindeproteins an ein zelluläres Regulatorprotein bindet, das ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend p53, pRb (p110), NFKB, p130, CBF-1 , Lyn-Tyrosinkinase, bak und bax. 2) Nukleinsaurekonstrukt nach Anspruch 20), dadurch charakterisiert, daß die Komponente b5) ausgewählt ist aus einer Gruppe von viralen Bindeproteinen, umfassend IE 84 von CMV, E1 B (55 kD) von AV, EBNA-5 von EBV, BHFR von EBV, E6 von HPV-16 oder -18, x Protein von HBV, T-Antigen von SV40, E1A von AV, EBNA-2 von EBV, EBNA-1 von EBV, E7 von HPV, Tax von HIV, LMP-1 von EBV, LMP-2A oder LMP-2B von EBV, E1 B (16 kD) von AV, E1 B (10 kD) von AV.
23) Nukleinsaurekonstrukt nach Anspruch 4), dadurch charakterisiert, daß die Bindesequenz [Komponente b5)] für ein zelluläres Regulatorprotein ein
Antikörper oder ein Teil dieses Antikörpers ist.
24) Nukleinsaurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 ) bis 23), dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz [Komponente c)] zur Bindung von Komponente b), b') oder b") ausgewählt ist aus einer Gruppe enthaltend die
Bindesequenz für das Gal4-Protein, die Bindesequenz für das LexA-Protein, die Bindesequenz für das Lac I Repressorprotein, die Bindesequenz für den Tetrazyklin-Operator und die Bindesequenz für das ZFHD-1 Protein.
25) Nukleinsaurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 ) bis 23), dadurch gekennzeichnet, daß der minimale Promotor (Komponente d)] enthaltend CDE- CHR entnommen ist aus einer Gruppe umfassend das cdc25C Gen, das cdc2 (cdk-1 ) Gen und das Cyclin A Gen.
26) Nukleinsaurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 ) bis 23), dadurch gekennzeichnet, daß der minimale Promotor [Komponente d)] enthaltend E2F- BS-CHR entnommen ist dem Bmyb Gen.
27) Nukleinsaurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 ) bis 20), dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Effektorgen (Komponente c) um ein Gen handelt, das für einen Wirkstoff kodiert, der ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltend Cytokine, Chemokine oder Wachstumsfaktoren, antiproliferativ oder zytostatisch oder apoptotisch wirkende Proteine, entzündungserregende oder immunsuppressive Proteine, Antikörper, Antikörperfragmente, Angiogeneseinhibitoren, Peptidhormone, Gerinnungsfaktoren, Gerinnungshemmer, fibrinolytische Proteine, auf den Blutkreislauf wirksame
Peptide oder Proteine, Blutplasmaproteine und Antigene von Infektionserregern oder von Zellen oder von Tumoren, wobei das ausgewählte Antigen eine Immunreaktion bewirkt.
28) Nukleinsaurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 ) bis 26), dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Effektorgen um ein Gen handelt, das für ein Enzym kodiert, welches eine Vorstufe eines Pharmakons in ein Pharmakon spaltet.
29) Nukleinsaurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 ) bis 26), dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Effektorgen um ein Gen handelt, das für ein Ligand-Wirkstoff-Fusionsprotein oder ein Ligand-Enzym-Fusionsprotein kodiert, wobei der Ligand ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend Cytokine, Wachstumsfaktoren, Antikörper, Antikörperfragmente, Peptidhormone, Mediatoren und Zelladhäsionsmoleküle.
30) Nukleinsaurekonstrukt nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Nukleinsäure um DNS handelt.
31 ) Nukleinsaurekonstrukt nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsaurekonstrukt eingefügt ist in einen Vektor.
32) Nukleinsaurekonstrukt nach Anspruch 30), dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen Plasmidvektor handelt. 33) Nukleinsaurekonstrukt nach Anspruch 32), dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen viralen Vektor handelt.
34) Nukleinsaurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 ) bis 33), dadurch gekennzeichnet, daß es äußerlich, peroral, intravesikal, nasal, intrabronchial oder in den Magen-Darm-Trakt verabreicht oder in ein Organ, in eine Körperhöhle, in die Muskulatur, subkutan oder in den Blutkreislauf injiziert wird zur Prophylaxe oder Therapie einer Erkrankung.
35) Isolierte Zelle dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Nukleinsaurekonstrukt gemäß einem der Ansprüche 1 ) bis 33) enthält.
36) Isolierte Zelle gemäß Anspruch 35), wobei diese Zelle ausgewählt ist aus einer Gruppe enthaltend Endothelzellen, Lymphozyten, Makrophagen, blutbildende Zellen, Fibroblasten, Muskelzellen, Leberzellen, Nierenzellen, Epithelzellen des
Magen-Darm-Traktes, der Luftwege, der harnableitenden Wege, der Geschlechtsorgane, der Haut, Gliazellen, Zellen des Nervensystems, Tumorzellen und Leukämiezellen.
37) Verwendung eines Nukleinsäurekonstruktes nach einem der Ansprüche 1 ) bis 34) oder einer Zelle nach Anspruch 33) zur Herstellung eines Heilmittels zur Behandlung einer Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Infektionen, Tumore, Leukämien, Autoimmunerkrankungen, Allergien, Arthritiden, Entzündungen, Organabstoßungen, Transplantat gegen Wirt- Reaktionen, Blutgerinnungserkrankungen, Kreislauferkrankungen, Blutarmut,
Hormonerkrankungen und ZNS-Schäden.
38) Verfahren zur Herstellung der Nukleinsäurekonstrukte nach einem der Ansprüche 1 ) bis 37), bei dem die einzelnen Komponenten schrittweise zusammenligiert werden. 9) Verwendung einer Zelle nach einem der Ansprüche 35) oder 36) zur
Herstellung eines Heilmittels zur Therapie von Erkrankungen gemäß Anspruch 32) dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Zelle äußerlich, intravesikal, nasal, intrabronchial, oral oder in den Magen-Darm-Trakt verabreicht oder in ein Organ, in eine Körperhöhle, in die Muskulatur, subkutan oder in den Blutkreislauf injiziert wird zur Prophylaxe oder Therapie einer Erkrankung.
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2801319A1 (fr) * 1999-11-18 2001-05-25 Inst Nat Sante Rech Med Construction d'acide nucleique porteuse d'un systeme regulant l'expression d'un gene
US20030157704A1 (en) * 2001-08-29 2003-08-21 Roninson Igor B. Reagents and methods for identifying and modulating expression of genes regulated by CDK inhibitors
GB0123856D0 (en) * 2001-10-05 2001-11-28 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd Method for determining cell cycle position
US20050022259A1 (en) * 2003-05-08 2005-01-27 Pruitt Steven C. Transgenic animal model for cancer and stem cells
WO2005085455A1 (en) * 2004-03-09 2005-09-15 Kam Man Hui Compositions and methods for treating disease
WO2007041350A2 (en) * 2005-10-01 2007-04-12 Charles Stout Regulatable fusion promoters
WO2012122025A2 (en) * 2011-03-04 2012-09-13 Intrexon Corporation Vectors conditionally expressing protein
KR102328069B1 (ko) 2014-02-21 2021-11-17 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 알로스테릭 단백질의 신생 설계
CN103898113A (zh) * 2014-03-11 2014-07-02 北京理工大学 转录因子结合位点调节启动子强度的方法
US11718860B2 (en) * 2017-03-13 2023-08-08 Massachusetts Institute Of Technology Synthetic promoters
CN113436683B (zh) * 2020-03-23 2024-08-16 北京合生基因科技有限公司 筛选候选插入片段的方法和系统
CN113462686B (zh) * 2020-03-30 2023-06-02 中国科学院深圳先进技术研究院 制备具有梯度活性的半乳糖诱导合成启动子的方法、及其制备的启动子、应用
CN116297120B (zh) * 2023-03-30 2023-12-01 深圳市血液中心(深圳市输血医学研究所) 一种检测样本中药物抗体的方法
CN120505348A (zh) * 2025-05-06 2025-08-19 湖北省农业科学院粮食作物研究所 一种检测蛋白转录活性载体组合及其制备方法和应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0705334A1 (de) * 1993-06-14 1996-04-10 Basf Aktiengesellschaft Strenge kontrolle der genexpression in eukaryotischen zellen durch auf tetrazyklin ansprechende promotoren
GB9506466D0 (en) * 1994-08-26 1995-05-17 Prolifix Ltd Cell cycle regulated repressor and dna element
PT807183E (pt) * 1994-08-26 2001-05-31 Aventis Pharma Gmbh Terapia genetica de doencas induzidas pelo sistema imunitario com auxilio de uma substancia reguladora do ciclo celular especifica das celulas
WO1996006938A1 (de) * 1994-08-26 1996-03-07 Hoechst Aktiengesellschaft Gentherapeutische behandlung von gefässerkrankungen durch einen zellspezifischen, zellzyklusabhängigen wirkstoff
CA2219080A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-27 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Rapamycin-based regulation of biological events
US5851796A (en) * 1995-06-07 1998-12-22 Yale University Autoregulatory tetracycline-regulated system for inducible gene expression in eucaryotes
DE19605274A1 (de) * 1996-02-13 1997-08-14 Hoechst Ag Nukleinsäurekonstrukte für die zellzyklusregulierte Expression von Genen, derartige Konstrukte enthaltende Zellen sowie deren Verwendung zur Herstellung von Heilmitteln
DE19639103A1 (de) * 1996-09-24 1998-03-26 Hoechst Ag Nukleinsäurekonstrukte mit Hybridpromotoren für gentherapeutische Maßnahmen
DE19651443A1 (de) * 1996-12-11 1998-06-18 Hoechst Ag Selbstverstärkende, pharmakologisch kontrollierbare Expressionssysteme
DE19751587A1 (de) * 1997-11-21 1999-07-29 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Onkogen- oder virusgesteuerte Expressionssysteme
DE19756975A1 (de) * 1997-12-20 1999-06-24 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Bindungspartner für Inhibitoren von cyclinabhängigen Kinasen und ihre Verwendung zur Suche nach Inhibitoren, zur Diagnose oder zur Therapie einer Erkrankung

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
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AU5155799A (en) 2000-02-07
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CA2333912A1 (en) 2000-01-27
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US20020137699A1 (en) 2002-09-26

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