PT807183E

PT807183E - Terapia genetica de doencas induzidas pelo sistema imunitario com auxilio de uma substancia reguladora do ciclo celular especifica das celulas

Info

Publication number: PT807183E
Application number: PT95931205T
Authority: PT
Inventors: Hans-Harald Sedlacek; Rolf Muller
Original assignee: Aventis Pharma Gmbh
Priority date: 1994-08-26
Filing date: 1995-08-25
Publication date: 2001-05-31
Also published as: DK0807183T3; GR3035322T3; ES2153045T3; CA2198462A1; US20030018005A1; JP2002502228A; EP0807183B1; EP0807183A1; AU3473395A; ATE198492T1; WO1996006941A1; DE59508945D1; AU690336B2; US6384202B1

Description

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DESCRIÇÃO "TERAPIA GENÉTICA DE DOENÇAS INDUZIDAS PELO SISTEMA IMUNITÁRIO, COM AUXÍLIO DE UMA SUBSTÂNCIA REGULADORA DO CICLO CELULAR, ESPECÍFICA DAS CÉLULAS" Âmbito técnico É descrita uma sequência de ADN destinada à terapia genética de doenças induzidas pelo sistema imunitário. A sequência de ADN é constituída nos seus elementos essenciais por uma sequência activadora, um módulo promotor e um gene para a substância activa. A sequência activadora é activada especificamente em relação a células ou a vírus e esta activação é regulada especificamente pelo ciclo celular por meio do módulo promotor. A escolha da sequência activadora e da substância activa depende do âmbito das indicações. A sequência de ADN é introduzida num vector virai ou não virai, complementado por um ligando com afinidade para a célula alvo.

Por cada escolha da sequência activadora e da substância activa, podem-se tratar por meio de administração da sequência de ADN: a produção deficienLe de células sanguíneas doenças autoimunes e alergias bem como rejeições contra órgãos transplantados - inflamações crónicas das articulações infecções virais e parasitárias e ainda profilaxia de infecções virais, bacterianas e parasitárias leucemias. 1 £

Um sistema imunitário deficiente é a causa de doenças que assumem muitas formas. Entre estas contam-se, por exemplo - a produção insuficiente de células sanguíneas devido à carência de citoquinas alergias, doença3 autoimunes e inflamações crónicas, em especial inflamações das articulações devido a um funcionamento deficiente do sistema imunitário - rejeição de órgãos transplantados por meio de uma inibição insuficiente do sistema imunitário - consequências de uma vacinação insuficiente e infecções crónicas, p. ex. por meio de vírus, na sequência de fraqueza imunitária - leucemias e linfomas sob a forma de degeneração tumoral do sistema imunitário.

As possibilidades terapêuticas actuais deste tipo de doenças são reconhecidamente insuficientes. Este facto pode ser ilustrado em alguns exemplos. 1) Terapia com citoquinas

Entretanto é conhecido um número considerável de citoquinas e factores de crescimento que actuam a nível do diferenciação, da multiplicação, da maturação e da função das células.

Assim, por exemplo, o sistema de produção de sangue é comandado por uma hierarquia de várias citoquinas, as quais por meio das suas diferentes funções permitem a multiplicação de cada uma das fases de diferenciação e, através de cada uma das fases de diferenciação, permitem a continuação da produção de glóbulo sanguíneos maduros como eritrócitos, trombór.i tos, granulócitos, macrófagos e linfócitos (Dexter et al., Haematopoietic Growth Factors, Gardiner Well Communication, Macclesfield (1993)). 2

Além disso sabe-se que as citoquinas e os factores de crescimento desempenham um papel significativo na cooperação das células entre si (Pusztal et al., J. Pathol. 169, 191 (1993), Cross et al., Cell 64, 271 (1991)).

Assim, por exemplo no caso da defesa imunitária, a cooperação entre células com apresentação de antigénio, linfócitos T e linfócitos B é controlada por várias citoquinas, sendo a sua sequência e concentração decisivas para o tipo de intensidade da reacção imunológica (Aulitzky et al., Drugs 48, 667 (1994), Sedlacek et al., Immune Reactions, Springer Verlag (1995)). Além disso, a defesa contra agentes infecciosos, como por exemplo vírus,, é influenciada e também comandada por citoquinas, como por exemplo interferões (Edgington, Biotechnol. ]Λ, 465 (1993)). 0 conhecimento desta interacção levou já ao desenvolvimento de citoquinas para a terapia de doenças humanas, por exemplo de eritropoietina para o tratamento da anemia - G-CSF para o tratamento da neutropenia GM-CSF para o tratamento de leucopenia IL-2 para a defesa imunológica contra tumores seleccionados IFNa para,a terapia da hepatite virai crónica IFNp para a terapia da esclerose múltipla

Outras citoquinas encontram-se actualmente em fase de ensaio (Aulitzky et al., Drugs 4_8, 667 (1994). Assim, por exemplo - trombopoietina para o tratamento de trombocitopenia (Metcalf, Nature, 369, 519 (1994) IL-3 para a terapia de tumores (de Vries et al., Stem Cells 11, 72 (1993) e para o apoio ao tratamento de estados de 3

citopenia do sistema hemopoiético (Freudl, Int. J. Immunopharm. ΛΛ_, 421 (1992) ) IL-4 para a terapia de tumores (Manate et al., Blood 83, 1731 (1994)) IL-6 para o tratamento de estados de citopenia do sistema hemoplástico (Brack et al., Int. J. Clin. Lab. Res. 22y 143 (1992)) IL-10 para a imunossupressão (Benjamin et al., Leuk. Lymph. 12, 205 (1994)) IL-11 para o tratamento de trombocitopenia (Kobayashi et al., Blood 4, 889 (1993)) IL-12 para terapia de tumores (Tahara et al., Câncer Res. 54, 182 (1994)) - TNFa para a terapia de tumores (Porter, Tibitech 9, 158 (1991)) . É um inconveniente comum à terapia com todas as citoquinas a necessidade, na maior parte das vezes, de uma administração por via parentérica, diária durante um longo período de tempo e ainda, para uma melhor eficácia possível, que sejam injectadas várias citoquinas na sequência hierárquica necessária ou que seja necessário que estejam presentes no corpo as citoquinas correspondentes numa concentração suficiente. É decisivo para a acção a concentração de cada citoquina no local da célula a estimular. Por causa da simplicidade, as citoquinas são injectadas por via subcutânea ou i.m. (intramuscular) diariamente. Este tipo de aplicaçao garante uma distribuição sistémica retardada pretendida, por outro lado são administradas quantidades relativamente elevadas a fim de se garantir uma concentração local suficiente no local onde se pretende produzir o efeito. A dose necessariamente elevada por este motivo constitui um factor de custo considerável devido ao elevado preço de fabrico das citoquinas que limita consideravelmente a utilização de citoquinas. 4 \$ ç: •i? 0. \s. ..Cí> /

Para além disso, algumas citoquinas, no nivel de dosagem terapêutica, provocam consideráveis efeitos secundários. Por exemplo a IL-1 (Smith et al. , New Engl. J. Med. 328, 756 (1993)), a IL-3 (Kurzrock et al., J. Clin. Oncol. 9, 1241 (1991)) e a 11-2 (Siegel et al., J. Clin. Oncol • 9, 694 (1991)) .

Existe, assim, uma falta considerável de novos processos, citoquinas ou combinações de citoquinas que possam fazer sentir o seu efeito ao longo de um período de tempo prolongado, numa concentração suficiente no local. 2) Inflamação crónica das articulações A inflamação crónica das articulações é, apesar do progresso dos medicamentos anti-inflamatórios e imunos-supressores, uma doença de tratamento ainda insuficiente, que limita consideravelmente a qualidade de vida e pode mcomo limitar a esperança de vida (Pincus et al., Buli. Rheum. Dis. 41, 1 (19992)). Devido à sua frequência (cerca de 10 % da população do mundo ocidental sofre de artrite) a artrite representa um factor de custo politico-económico considerável.

Perante uma terapia medicamentosa insuficiente, para muitos pacientes a remoção cirúrgica das bolsas sinoviais da cápsula articular (sinovectomia) ou a substituição cirúrgica da articulação constitui a última hipótese de uma terapia.

Perante estes problemas médicos e politico-económicos, a artrite crónica constitui um desafio para a investigação farmacêutica.

Porém, prevê-se já actualmente que os medicamentos, seja de que tipo forem, administrados por via oral ou parentérica, vão ter dificuldades em alcançar a área inflamada da articulação em quantidade suficiente, uma vez que têm de se difundir através dos capilares sinoviais passivamente, através 5

da bolsa sinovial para o espaço articular e daí para as células que revestem a articulação (Evans et al., Gene Therapeutics, J. Wolff, Editor, página 320, Birkhãuser, Boston 1994).

Esta difusão é ainda dificultada pela evidente diminuição da vascularização da bolsa sinovial, por exemplo no caso da artrite reumatóide (Stevens et al., Arthritis Rheum. 3£, 1508 (1991) ). Uma injecção intra-articular de medicamentos evita certamente o problema da difusão, porém, devido à elevada taxa de absorção o tempo de permanência do medicamento na articulação é demasiado curto, pelo que ao longo de um período de tempo prolongado são necessárias várias injecções intra--articulares. Estas estão sempre associadas a um considerável risco de infecção da articulação. Além disso podem causar efeitos secundários a uma escala considerável por meio da elevada concentração de medicamento no local que é necessária.

Para ultrapassar estes problemas foi proposta a administração sistémica ou local intra-articular de vectores ou de células sinoviais transduzidas para o tratamento da artrite crónica (Bandara et al., DNA Cell Biol. 11, 227 (1992), BBA 1134, 309 (1992 Evans et al., Transplant Proc. 2_4, 2966 (1992) ) . O princípio desta terapia genética consiste em atingir elevadas concentrações de substâncias anti-artrí.ticas, através de células transduzidas in vivo para o espaço articular ou por meio da injecção de células sinoviais transduzidas in vitro, como por exemplo (Evans et al., J. Rheumatol. 21, 779 (1994)) citoquinas anti-inflamatórias (p. ex. antagonista do receptor de IL-1, IL-4 ou IL-10) Inibidores de citoquinas (p. ex. receptores solúveis de IL-1, TNFa, IL-8, TGF0 ou de outras citoquinas e interleuquinas intensificadoras da inflamação) 6

Inibidores de enzimas (p. ex. TIMP, LIMP, IMP, PAI-1, PAI-2 ou outros) - Moléculas anti-adesão (p. ex. CD-18 solúvel, ICAM-1, CD44 solúvel) - Antagonistas de radicais de oxigénio (p. ex. dismutase de superóxido) ou de - Factores do crescimento de células de cartilagem (p. ex. TGFP ou IGF-1)

Em experiências com animais foi possível comprovar em coelhos pontos de referência de um efeito do IL-1 RA expresso após injecção intra-articular do gene correspondente (Bandara et al., PNAS 90_, 10764 (1993), Hung et al., Gene Therapy 1, 64 (1994)).

Porém estes métodos de terapia genética propostos até agora estão fundamentalmente associados a desvantagens consideráveis: - No caso da transdução in vivo de células sinoviais estas devem ser recolhidas do espaço intra-articular do paciente. Só este facto já sobrecarrega o paciente e comporta o risco de uma infecção da articulação. Por outro lado, as células sinoviais só são colhidas com grande dificuldade e em reduzido número. Daí que as células sinoviais tenham de ser multiplicadas in vitro para poderem ser transduzidas em número suficiente. Porém sabe-se que só as células sinoviais semelhantes a fibroblastos (tipo B) podem ser multiplicadas nas condições normais de cultura celular e não as semelhantes a macrófagos de tipo A (Evans et al., Gene Therapeutics, páqina 320, J.A. Wolf, Editor, Birkhãuser Boston (1994). A injecção de células sinoviais transduzidas in vitro implica, assim, consideráveis problemas e do ponto de vista técnico a maior parte das 7

vezes não é executável ou só é executável com um esforço considerável.

No caso da injecção sistémica ou intra-articular de vectores para uma transdução in vivo de células apresentada a discussão (Evans et al.. Gene Therapeutics, página 320, J.A. Wolff, Editor, Birkáuser Boston (1994)) falta um mecanismo regulador que permita uma expressão do gene transferido por meio do vector apenas nas células envolvidas na artrite crónica e só quando estiverem activadas por uma inflamação. Sem um mecanismo regulador destes, após· a administração sistémica do vector são transduzidas por todo o corpo células que produzem a respectiva substância anti--artrítica, o que provocaria uma influência sistémica da reacção imunológica ou então seria indiferente, relativamente ao processo inflamatório artrítico com a administração sistémica repetida de substâncias anti--artríticas, já considerada ineficaz ou insuficientemente eficaz.

Após uma administração local poderiam ser transduzidas in vivo, conforme o vector utilizado, quer células preferencialmente proliferativas (com utilização de um vector RTV) quer também, adicionalmente, células em repouso (com utilização de outros vectores virais ou não virais) produtoras de substância anti-artrítica. Uma vez que um grande número deste tipo de substâncias têm um efeito anti-inflamatório, as reacções imunológicas e inflamaLúrias nas articulações sâo inibidas, independentemente de a artrite crónica se encontrar numa fase de repouso ou numa situação aguda. O risco de uma reacção imunológica e inflamatória patológica aumentada após extinção do efeito das substâncias com acção anti--artrítica seria favorecido pela inibição local da reacção imunológica e provocado pelos factores causais da artrite crónica, no entanto sem qualquer alívio 8 f\ substancial ou cura da artrite.

Existe, portanto, uma necessidade urgente de novos processos ou de novas substâncias terapêuticas, - que possam ser administradas de forma local ou sistémica, conforme o número e gravidade das articulações com inflamação crónica de um paciente cujo efeito se limite preferencialmente, quando não exclusivamente, a células sinoviais activadas e proliferativas ou também a células inflamadas cujos efeito consistam preferencialmente na profilaxia e terapia a longo prazo das situações inflamatórias agudas. 3) Leucemias e linfomas

Pacientes com tumores do sistema hematopoiético que sofrem uma reincidência depois de uma quimioterapia temporária com sucesso têm um prognóstico relativamente negativo (Hiddermann et al., Blood Rev. 225 (1994). Em consequência foram desenvolvidas várias estratégias de tratamento intensivas para prolongar o tempo de sobrevivência.

Entre estas contam-se diferentes combinações de citostáticos (The Medica Letter 31, 49 (1989)), bem como o transplante de medula óssea (De Magalhaes-Silverman et al.,

Cell Transplant. 2, 75 (1993)). Porém, ambas as abordagens terapêuticas têm um efeito limitado (Sloane et al., 0

Histophathol. 22^ 201 (1993)). Existe, portanto, ainda uma procura médica considerável de novos meios terapêuticos para tumores do sistema hematopoiético.

As células tumorais do sistema hematopoiético possuem, conforme o tipo de tumor, alterações biomoleculares consideráveis (Resumo por Lotter et al., Câncer Surveys 1J5, 157 9 (1993), Yunis et al., Crit Rev. One. £ 161 (1993). Dentre estas são especialmente consideráveis, por exemplo

Linfoma de Burkitt (LB)

Leucemias das células B e linfomas das células B (LCB)

Leucemia das células B aguda (LCBa)

Linfoma das células T (LCT)

Leucemia mielóide crónica (LMC)

Leucemia linfática aguda (LLA) Leucemia mielóide aguda (LMA)

Desregulação de c-myc com ARNm de c-myc e produção de proteína c-myc excessivos (McKeithan, Seminars in Oncol 17, 30 (1990)) Sobre-expressão de bcl-2 (Tsujimoto et al., PNAS 8_6, 1958 (1989) ) Sobre-expressão de bcl-2 (em 85 % dos pacientes com linfoma folicular e 25 % dos pacientes com linfoma difuso) (Yunis et al., New Engl. J. Med. 316, 79 (1987)) Sobre-expressão de bcl-1 em pacientes com linfoma centro-cítico (Seto et al., Oncogene T_, 1401 (1992) ) Sobre-expressão de IL-6 (Lewis et al., Nature 317, 544 (1985)) Sobre-expressão de IL-10 (Levine, Blood 80, 8 (1992)) Expressão da proteína de fusão E2A-PBX-1 (Yunis et al.,. Crit. Rev. Onco. 4, 161 1993)) Sobre-expressão de c-myc (Cotter, Câncer Surveys 1_6, 157 (1993) ) Sobre-expressão de HOXll (sin. TCL3) (Hatano et al., Science 253, 79 (1991)) Expressão da proteína de fusão BCR-Abl Daley et al., PNAS £8, 11335 (1991) ) Sobre-expressão de IL-3 (Mecker et al., Blood 1_6, 285 (1990) ) Expressão da proteína de fusão PML/RARA (Alcalay et al., PNAS £9, 4840 (1992) , Pandolfi et al., EMBO J. 11, 1397 (1992))

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Até agora estas alterações de natureza biomolecular não puderam ser ainda empregues para processos de tratamento clínicos. 4) Descrição geral da presente invenção 0 objecto da presente invenção consiste por conseguinte numa substância activa (i.e. um medicamento) que pode ser administrada de forma local bem como sistémica aos pacientes e que provoca uma formação de substâncias activas específicas das células e regulada pelo ciclo celular para o tratamento de doenças do sistema imunitário. 0 componente essencial da substância activa consiste numa estrutura de ADN com a seguinte composição

(ADN é utilizado em todo o texto deste pedido como um conceito geral tanto para um ADN. complementar (ADNc) como para uma sequência de ADN genómica). 4.1 Descrição do módulo promotor O elemento central da substância activa de acordo com a presente invenção é constituído por um módulo promotor regulado pelo ciclo celular.

Como módulo promotor regulado pelo ciclo celular entende--se, por exemplo, a sequência de nucleótidos -CDE-CHR-Inr-(vide em seguida). A função essencial da parte do módulo promotor consiste na inibição da função da sequência activadora na fase G0/G1 do ciclo celular e numa expressão específica do ciclo celular na fase S/G2 e, assim, em células proliferativas. 11

__ r~ 0 módulo promotor CDE-CHR-Inr foi descoberto no âmbito de um estudo detalhado da expressão especifica G2 do promotor humano cdc25C. 0 ponto de partida foi a descoberta de um elemento repressor ("cell cycle dependent element"; CDE -elemento dependente do ciclo celular) que é responsável por desligar o promotor na fase G1 do ciclo celular (T.ucibello et al., EMBO J. 1A_, 132 (1995)). Por meio de footprinting genómico por sulfato de dimetilo (DMS) e de análises funcionais (fig. 1 e 2) foi possível mostrar que o CDE liga um repressor (" CDE --binding factor"; CDF - factor de ligação CDE) específico de G1 e produz desta forma uma inibição da transcrição em células (GO) não proliferativas. A função repressora do CDE localizado no domínio do promotor basal depende de uma "upstream activating sequence" (UAS)- sequência activadora a montante. Este facto levou à conclusão de que o factor de ligação CDE inibe o efeito activador da transcrição 5' da proteína activadora ligada de uma forma dependente do ciclo celular, isto é, em células não proliferativas, bem como na fase G1 do ciclo celular (fig. 3).

Esta conclusão pôde ser confirmada por meio de mais uma experiência: A fusão do intensificador virai precoce de SV40, não regulado pelo ciclo celular, com um promotor mínimo cdc25 (constituído por CDE e as posições de partida localizadas em 3') produziu uma clara regulação do ciclo do promotor quimérico (fig. 4). As investigações subsequentes do intensificador cdc25C têm mostrado que, no caso dos factores de transcrição regulados conforme o ciclo celular pelo CDF, se trata de NF-Y (CBF) (Dorn et al., Cell 50, 863 (1987), van Hujisduijnen et al., EMBO J. 9, 3119 (1990), Coustry et al., J. Biol. Chem. 270, 468 (1995), Sp 1 (Kadonaga et al., TIBS 11, 10 (1986) e um factor de transcrição (CIF) que liga a CBS7, possivelmente novo. Uma outra interessante descoberta deste estudo reside na observação que o NF-Y dentro do intensificador cdc25C só activa a transcrição de forma eficiente em cooperação com pelo menos um outro complexo NF-Y ou com CIF. Tanto o NF-Y como o Spl pertencem à classe dos activadores ricos em glutamina, o que dá 12

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\) η__Γ Β7 ν’ pistas importantes sobre o mecanismo da repressão (p. ex. interacção ou interferência com determinados factores de transcrição basais ou TAFs).

Uma comparação das sequências promotoras de cdc25C, ciclina A e cdc2 mostrou homologias em vários domínios (fig. 5) . Não só o CDE é conservado em todos os 3 promotores (os desvios existentes não são relevantes do ponto de vista funcional) como também as caixas Yc adjacentes. Todas estes domínios mostraram a formação de proteína in vivo esperada, no caso do CDE de forma dependente do ciclo celular. Além disso foi possível mostrar que todos os 3 promotores podem ser desregulados por meio de uma mutação do CDE (quadro 1) . Uma semelhança notável foi distinguida na comparação das sequências de cdc25C, da ciclina A e de cdc2, também no domínio directa-mente a 3'do CDE ("cell cycle genes homology region", CHR -região de homologia de genes do ciclo celular) (fig. 5) . Esta área é tão significativa do ponto dc vista funcional como o CDE (quadro 1), porém não é visível nas experiências de footprinting por DMS in vivo. Uma possível explicação reside na interacção do factor com o entalhe menor do ADN. Os resultados de experiências de "electrophoretic mobility.shift assay" (EMSA - análise de desvio da mobilidade electroforética) indicam que CDE e CHR ligam conjuntamente um complexo de proteínas. Estas observações apontam que a repressão induzida por CDF de activadores ricos em glutamina é um mecanismo mais frequente de transcrição regulada pelo ciclo celular.

Porém, aparentemente reveste-se de significado para a regulação do promotor cdc25C náo só o domínio CDE-CHR como também um dos locais de início (posição +1) dentro da sequência de nucleótidos do promotor basal (posições < -20 a > +30, vide fig. 1). As mutações neste domínio, que inclui o local de ligação in vitro para YY-1 (Seto e Shenk, Nature 354, 241 (1991), Usheva e Shenk, Cell 7_6' 1115 (1994)) produzem uma desregulação total. Do ponto de vista da proximidade do CDE-CHR do promotor basal é muito possível uma interacção do CDF com o 13 τ—-

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complexo de transcrição basal. 4.2 Descrição da sequência activadora

Como sequência activadora (UAS = upstream activator sequence - sequência activadora a montante) deve-se entender uma sequência de nucleótidos (sequência do promotor ou do intensificador), com a qual interagem factores de transcrição, formada ou activa na célula alvo. Como sequência activadora pode ser utilizado o intensificador de CMV, o promotor de CMV (EP 0173.177.Bl) , o promotor de SV40 ou qualquer outra sequência do promotor ou do intensificador conhecida do especialista.

Do ponto de vista da presente invenção contam-se porém entre as sequências activadoras preferidas sequências reguladoras de genes ou elementos de genes, que codificam para as proteínas formadas especialmente em células do sistema hematopoiético, em linfócitos activados, em células sinoviais activadas ou macrófagos, em proteinas de células infectadas por virus ou em células afectadas por leucemia. 4.3 Descrição da substância activa

Deve-se entender como substância activa o ADN para uma proteína que produza no local afectado o efeito terapêutico, isto é, a reparação da afecção do sistema imunitário. A selecção da sequência de nucleótidos para a sequência activadora e para a substância activa é orientada para as células alvo e a substância activa desejada. 4.4 Preparação do plasmídeo ou vector A construção de ADN de acordo com a presente invenção é completada num vector de forma corrente para o especialista; assim, é introduzida, por exemplo, num vector virai (vide D. Jolly, Câncer Gene Therapy 51 (1994)) ou utilizada como 14 C\ (^ρ plasmídeo. Os vectores virais ou plasmídeos podem ser complexados com dispersões coloidais, por exemplo, com lipossomas (Farhood et al., Annals of the New York Academy of Sciences 716, 23 (1994)) ou então com conjugados de polilisina--ligando (Curiel et al., Annals of the New York Academy of Sciences 716, 36 (1994)). 4.5 Completar por meio de um ligando

Este tipo de vectores virais ou não virais podem ser completados por meio de um ligando com afinidade de ligação para uma estrutura de membrana nas células alvo seleccionadas. A escolha do ligando depende, assim, da escolha das células alvo. A substância activa de acordo com a presente invenção é descrita de forma mais pormenorizada nos. exemplos que se seguem: 5) Substância activa para reparação de uma formação deficitária de glóbulos sanguíneos 5.1 Selccção da sequência activadora paca células hematopoiéticas

No sentido da presente invenção é utilizada como sequência activadora, de preferência, uma sequência reguladora genética ou um elemento de um gene, o qual codifica para uma proteína que é expressa com especial intensidade ou selectivamente em células hematopoiéticas. Entre estas sequências reguladoras do gene contam-se as sequências promotoras para genes de uma citoquina ou do seu receptor, cuja expressão nas células hematopoiéticas imaturas (ou em células vizinhas como por exemplo no estroma) já está previamente ligada à seguinte citoquina desejada como substância activa e que actua sobre as células hematopoiéticas. Constituem exemplo deste tipo de citoquinas com acção sobre as células hematopoiéticas imaturas 15

Stem Cell Factor - factor de células germinativas (Martin et al., Cell j53, 203 (1990)) ligados todos os factores hematopoiéticos (McNiece et al., Exp. Heamtol.19, 226 (1991)) IL-1 (Durum et al., Ann. Rev. Immunol. 3^, 263 (1985)). IL-3 (Clark-Lewis et al., J. Blol, Chem. 259, 7488 (1984), Oster et al., Int. J. Cell Clon. _9, 5 (1991)) - IL-6 (Mizel, FASEB J. 3, 2379 (1989)) - GM-CSF (Gasson, Blood 6, 1131 (1991), Dunlop et al.,

Anticancer Drugs 2, 327 (1991))

As sequências promotoras destas citoquinas e os seus receptores podem ser consultadas nos seguintes trabalhos: - Receptor do Stem Cell Factor - factor de células germinativas (Yamamoto et al., Jap. J. Câncer Res. 84, 1136 (1993))

Stem Cell Factor - factor de células germinativas (Szcylik et al., J. Exp. Med. 178, 997 (1993), Bowen et al., Leukemia T_, 1883 (1993), Yamamoto et al., Jp. J. Câncer Res. 34, 11 (1993)) - IL-la (Hangen et al., Mol. Carcinog. 2, 68 (1986), Turner et et al., J. Immunol. 143, 3556 (1989), Mori et al., Blood 84, 1688 (1994))

Receptor de IL-1 - (Ye et al., PNAS USA 9Q, 2295 (1993)) - IL-3 (Mathey-Prevot et al., PNAS USA QT_, 5046 (1990),

Cameron et al., Blood 8J3, 2851 (1994), Arai et al., Lymphokine Res. 9, 551 (1990))

Receptor de IL-3 (subunidade oc) 16

í ΤΊ (Miyajima et al., Blood 85i, 1246 (1995), Rapaport et al., Gene 137, 333 (1993), Kosugi et al., BBRC 208, 360 (1995))

Receptor de IL-3 (subunidade β) (Gorman et al., J. Biol. Chem. 267, 15842 (1992),

Kitamura et al., Cell 66, 1165 (1991), Hayashida et al., PNAS USA 87, 9655 (1990)) - IL-6 - (Yukasawa et al., EMBO J. 6, 2939 (1987), Lu et al., J.

Biol. Chem. 270, 9748 (1995), Ray etal., PNAS 85, 6701 (1988), Droogmans et al., DNASequence 3, 115 (1992),

Mori et al., Blood 8_4, 2904 (1994), Liberman et. al. , Mol Cell. Biol. 10, 2327 (1990), Ishiki et al., Mol.

Cell. Biol. 10^, 2757 (1990), Gruss et al., Blood 80 2563 (1992))

Receptor de IL-6 (Yamasaki et al., Science 241, 825 (1988), Mullberg et al., J. Immunol. 152, 4958 (1994))

- GM-CSF (Nimer et al. , Mol. Cell Biol. 1_0' 6084 (1990), Staynow et al., PNAS USA 92, 3606 (1995), Koyano-Nakayawa et al., Int. Immunol. 5, 345 (1993), Ye et al., Nucl. Acids Res. 22, 5672 (1994)) - Receptor de GM-CSF (cadeia a) (Nakagawa et al., J. Biol. Chem. 269, 10905 (1994)) Interferon Regulatnry Factor 1 (IRF-1) - 0 promotor de IRF-1 é activado igualmente por IL-6 como por IFN-γ ou IFNp. (Harrock et al., EMBO J. 1^, 1942 (1994)). 5.2 Selecção da substância activa para células hematopoiéticas

Enquanto substância activa no sentido da presente invenção 17

η h deve-se entender uma sequência de ADN cuja proteína que é expressa produz a proliferação e/ou a diferenciação dos glóbulos sanguíneos.

Conforme o tipo da deficiência de células do sangue podem--se escolher, por exemplo, as seguintes substâncias activas: substância activa para a Sequência de ADN para anemia: eritropoietina (Jacobs et al., Nature 313, 806 (1985), Lin et al., PNAS 82, 7580 (1985), Krantz, Blood 77, 419 (1991), Dube et al., J.

Biol. Chem. 263, 17516 (1988)

substância activa para a Sequência de ADN para G-CSF leucopenia: (Nagata et al., EMBO J. .5, 575

(1986), Nagata et al., Nature 319, 415 (1986), Souza et al., Science 232, 6.1 (1986)) ou para GM-CSF (Gough et al., Nature 309, 763 (1984), Nicola et al., J. Biol. Chem. 254, 5290 (1979), Wong et al., Science 228, 810 (1985)) 18

substância activa para a ADN para IL-3 trombocitopenia: (Yang et al., Cell 4J7, 3 (1986) ADN para o Factor Inibidor de Leucemia (LIF) (Metcalf, Int. J. Cell Clon. 9, 85 (1991), Sutherland et al., Leuk. 3, 9 (1989) , Gough et al., PNAS USA 85, 2623 (1988), Gough et al., Ciba Found. Symp. 167, 24 (1992), Stahl et al., J. Biol. Chem. 265, 8833 (1990) , Rathjan et al., Cell 62, 1105 (1990))

Sequência de ADN para IL-11 (Kawashima et al., FEBS Lett. 283, 199 (1991), Paul et al., PNAS B7, 7512 (1990) e/ou ADN para trombopoietina (de Sauvage et al., Nature 369, 533 (1994), Kaushansky et al., Nature 369, 568 (1994),

Wendling et al., Nature, 369, 571 (1994)

Porém, enquanto substância activa no sentido da presente invenção pode-se também encontrar utilidade para sequências de ADN de proteínas de fusão entre as citoquinas introduzidas, factores de crescimento ou a parte extracelular dos receptores por um lado e a parte Fc da imunoglobulina humana por outro. Este tipo de sequências de ADN e a sua preparação são descritas na EPA 0464 633 Al. 5.3 Combinação de substâncias activas iguais ou diferentes para células hematopoiétiaae 0 objecto da presente invenção consiste ainda numa substância activa na qual existe uma combinação das sequências de ADN de várias substâncias activas iguais (A,A) ou substâncias activas diferentes (A,B). Para a expressão de duas sequências de ADN encontra-se preferencialmente o ADNc de um "internai ribosome entry site" (IRES - local de entrada interno de ribossoma) interligado como elemento regulador. 19

IRES deste tipo foram descritos, por exemplo, por Montford e Smith (TIG 11, 179 (1995), Kaufman et al., Nucl. Acids Res. 19, 4485 (1991), Morgan et al., Nucl. Acids Res. 20, 1293 (1992, Dirks et al., Gene 128, 247 (1993), Pelletier e Sonenberg, Nature 334, 320 (1988) e Sugitomo et al., BioTechn. 12, 694 (1994).

Assim, pode-se utilizar o ADNc da sequência IRES do vírus da polio (posição < 140 a > 630 do UTR a 5' (Pelletier e Sonenberg, Nature 334, 320 (1988)) para acoplagem do ADN da substância A anti-inflamatória (na extremidade 3' ) e do ADN da substância anti-inflamatória B (no terminal 5').

Uma substância activa deste género apresenta, conforme a combinação uma acção aditiva (A+A, A+B) ou sinergética (A+B). 5.4 Selecção do ligando para células hematopoiéticas 0 objectivo deveria consistir em trazer a substância activa até às células alvo ou às células vizinhas das células alvo. Para este fim os vectores virais ou não virais podem dispor de um ligando. O ligando deve ligar-se preferencialmente com estruturas de membrana ou receptores de membrana sobre células sanguíneas indiferenciadas ou pouco diferenciadas.

Entre os ligandos contam-se os anticorpos ou fragmentos de anticorpos orientados contra receptores expressos em células sanguíneas pouco diferenciadas.

Este tipo de anticorpos foram descritos a título de exemplo para os seguintes receptores: 20

Receptor do Stem Cell Factor - factor de células germinativas (Blechman et al., Cell 8£, 103 (1995), Oez et al., Eur.

Cytokine Netw. 4_, 293 (1993)) - Receptor de IL-1 (tipo I) (McMahan et al-, EMBO J. 10, 2821 (1991), Giri et al.,

Cytokine 4^, 18 (1992),

Receptor de IL-1 (tipo II) (Scapigliati et al., J. Immunol. Methods 138, 31 (1991)) - Receptor de IL-3 α (Sato et al., Blood £2, 752 (1993))

Receptor de IL-3 β (Korpelainen et al., Blood £6, 176 (1995)) - Receptor de IL-6 (Daveau et al., Eur. Cytokine Netw. 5_, 601 (1994), Sui et al., PNAS USA 92, 2859 (1995), Goto et al., Jpn. J. Câncer Res. £5, 958 (1994))

Receptor de GM-CSF (Nicola et al., Blood 82^, 1724 (1993))

Fazem ainda parte dos ligandos os anticorpos ou fragmentos de anticorpos monoclonais ou policlonais que se ligam com os seus domínios constantes a receptores Fc-γ de células imunitárias (Rojanasakul et al., Pharm. Res. 3Λ, 1731 (1994)).

Os anticorpos monoclonais de murinos são preferencialmente utilizados sob forma humanizada. A humanização é realizada da forma ilustrada por Winter et al., (Nature 349, 293 (1991)) e Hoogenbooms et al. (Rev. Tr. Transfus. Haemobiol. 36i, 19 (1993)). Os fragmentos de anticorpos são preparados de acordo com o estado da técnica, por exemplo da forma descrita por Winter et al. (Nature 349, 293 (1991), Hoogenboom et al. (Rev. 21 7

Tr. Transfus. Hemobiol. 36' 19 (1993), Girol (Mol. Immunol. 2£, 1379 (1991) e Huston et al. (Int. rev. Immunol. 10, 195 (1993).

Entre os ligandos contam-se ainda todas as substâncias que se ligam a estruturas de membrana ou receptores de membrana à superfície de células sanguíneas pouco diferenciadas. Por exemplo contam-se entre e3tes 03 factore3 de crescimento como SCF, I-L-l, IL-3, IL-6, GM-CSF ou fragmentos ou sequências parciais destes que exprimem em receptores ligam através deste tipo de células. 5.5 Preparação da substância activa para células hematopoiéticas A preparação da substância activa de acordo com a presente invenção é descrita de forma mais pormenorizada por meio dos exemplos que se seguem: a) Construção do promotor quimérico sCF-receptor-CDE--CHR-Inr 0 promotor do receptor SCF humano (posição < -180 a > -22, Yamamoto et al., Jpn. J. Câncer Res. £4, 1136 (1993)) ou uma variante encurtada na caixa TATA (posição < -180 a > -65) são acoplados na sua extremidade 3' com o terminal 5' do módulo CDE-CHR--Inr (posição < -20 a > +121) do gene humano cdc25C (Lucibello et al., EMBO J., 14, 132 (1995)) (fig. 6). A acoplagem é realizada com ajuda de enzimas conhecidas dos especialistas e disponíveis no comércio. b) Construção de um plasmideo que contém o promotor quimérico SCF-receptor-CDE-CHR-Inr no componente central da substância activa A unidade de transcrição módulo repressor-receptor- 22 -SCF quimérica descrita é acoplada na sua extremidade 3' aos terminais 5' de um ADN que contém o domínio que codifica para a trombopoietina completa (posição < 216 a > 1277), (de Sauvage et al., Nature 369, 533 (1994)) (fig. 6). Este ADN contém também a sequência de sinal necessária para uma secreção. As unidades de controlo da transcrição e o ADN que codifica para a trombopoietina são clonados para pUC19/19 ou vectores de plasmídeo derivados de Bluescript, os quais podem ser utilizados directamente ou em sistemas de dispersões coloidais para uma aplicação in vivo. Em alternativa os genes quiméricos podem ser transferidos para vectores virais ou em outros vectores apropriados c injcotados.

Construção do promotor quimérico IL-l-receptor-CDE--CHR-Inr 0 promotor do receptor 1L-1 humano (pos. < -489 a > -1, Ye et al., PNAS USA 30, 2295 (1993)) é acoplado na sua extremidade 3' ao terminal 5' do módulo CDE--CHR-Inr do gene cdc25C (posição < -20 a > +121 da sequência publicada por Lucibello et al., EMBO J., 14, 132 (1995) ) (vide fig. 6) . A acoplagem é realizada com o auxílio de enzimas conhecidas do especialista e disponíveis no mercado.

Construção de um plasmídeo que contém um promotor quimérico IL-l-receptor-CDE-CHR-Inr no componente central da substância activa A unidade de controlo da transcrição-módulo repressor-receptor-IL-1 quimérica, descrita em c) é acoplada na sua extremidade 3' ao terminal 5' de um ADN que contém o domínio que codifica para a trombopoietina completa (vide fig. 6). Este ADN contém também a sequência de sinal necessária para

uma secreção. As unidades de controlo da transcrição e o ADN para o Tissue Plasminogen Activator são clonados para pUC18/19 ou vectores de plasmídeo derivados de Bluescript, que podem ser utilizados directamente ou num sistema de dispersão coloidal para uma aplicação in vivo. Em alternativa, os genes quiméricos podem ser transferidos para vectores virais ou outros vectores adequados e podem ser injectados. e) Construção de um plasmídeo que contém dois genes para substâncias activas A unidade de transcrição SCF-receptor-CDE—CHR-Inr descrita em a) é acoplada na sua extremidade 3' ao terminal 5' do ADN que codifica para a interleuquina 3 (posição ^ 10 a ^ 468, Yang et al., Cell 47, 3 (1986)). A acoplagem é realizada com auxílio de enzimas conhecidas do especialista e disponíveis no comércio. A extremidade 3' do ADN para IL-3 é agora acoplada ao terminal 5' do ADNc do internai ribosome entry site (posições £ 140 a ^ 630; Pelletier e Sonnenberg,

Nature 334, 320 (1988)) e subsequentemente é acoplada a sua extremidade 3' ao terminal 5' do ADN que codifica para a trombopoietina (vide fig. 6) . Esta substância activa preparada desta forma é depois clonada para pucl8/19 ou vectores de plasmídeo derivados de Bluescript, que podem ser utilizados directamente ou em sistemas de dispersões coloidais para uma aplicação in vivo. Em alternativa os genes quiméricos podem ser transferidos para vectores virais ou outros vectores apropriados e podem ser in j ertados. 24

f) Construção de outras unidades de transcrição A possibilidade da combinação do promotor do receptor IL-3 (cadeia a) , do promotor do receptor de GM-CSF (cadeia a) ou do promotor do receptor GM-CSF (cadeia β) com o módulo repressor CDE-CHR-Inr e os genes efectores já mencionados cncontra-3e representada na fig. 6. 6. Substância activa para a terapia de doenças autoimunes, alergias, inflamações e prevenção da rejeição de órgãos 6.1 Selecção da sequência activadora para doenças autoimunes e outras São utilizadas como sequências activadoras as sequências promotoras do gene para aquelas proteínas cuja produção é reforçada nos macrófagos e/ou linfócitos na reacção imunológica. Este tipo de proteínas são, por exemplo - IL-1 (Bensi et al., Gene 52^ 95 (1987), Fibbe et al.,

Blut 59, 147 (1989)) - Receptor de IL-1 (Colotta et al., Immunol. Today 15, 562 (1994), Sims et al., Clin. Immunol. Immunopath. 72, 9 1994), Ye et al., PNAS USA 90, 2295 (1993)) IL-2 (Jansen et al. CII 39, 207 (1994), Ohbo et al., J. Biol. Chem. 270, 7479 (1995)) - Receptor de IL-2 (Semenzato et al., Int. J. Clin. Lab. Res. 22, 133 (1992)) IFN γ (Kirchner, DMW 111, 64 (1986), Lehmann et al. , J. Immunol. 153, 165 (1994)) - IL-4 (Paul, Blood TT_, 1859 (1991), te Velde et al., Blood 76, 1392 (1990))

Receptor de IL-4 (Vallenga et al., Leukemia 1_, 1131 (1993), Galizzi et al., Int. Immunol. 2, 669 (1990)) 25 IL-3 (Frendi, Int. J. Immunopharm. 1A_, 421 (1992)) - IL-b (Azuma et al., Nucl. Acid Res. 1£, 9149 (1986),

Yokota et al., PNAS 84_, 7388 (1987)) IL-6 (Brack et al., Int. J. Clin. Lab. Res. 2^2, 143 (1992)) - L1F (Metcalf, Int. J. Cell Clon. 9, 95 (1991), Samal, BBA 1260, 27 (1995)) - IL-7 (Joshi et al., 21, 681 (1991)) IL-10 (Benjamin et al., Leuk. Lymph. 12.t 205 (1994),

Fluchiger et al., J. Exp. Med. 179, 91 (1994)) IL-11 (Yang et al., Biofactors 4, 15 (1992)) - IL-12 (Kiniwa et al., J. Clin. Invest. 90, 262 (1992),

Gatelay, Câncer Invest. 1_1, 500 (1993)) IL-13 (Punnonen et al., PNAS 90, 3730 (1993), Muzio et al., Blood 83, 1738 (1994)) - GM-CSF (Metcalf, Câncer Γ5 2185 (1990))

Receptor de GM-CSF (Nakagawa et al., J. Biol. Chem. 269., 10905 (1994))

Proteínas integrina beta 2 (LFA-1, MAC-1, pl50/95) (Nueda et al., J. Biol. Chem. 268, 19305 (1993))

As sequências promotoras para estas proteínas foram descritas da seguinte maneira

Receptor de IL-1 (Ye et al., PNAS USA 90, 2295 (1993)) - IL-la (Hangen et al., Mol. Carcinog. 2, 68 (1986), Turner et al., J. Immunol. 143 , 3556 (1989), Mori et al-, Blood 84, 1688 (1994)) - IL-Ιβ (Fenton et al., J. Immunol. 138, 3972 (1987), Bensi et 26

al., Cell Growth Diff. 1, 491 (1990), Turner et al., J. Immunol. 143, 3556 (1989), Hiscott et al., Mol. Cell. Biol. 13, 6231 (1993)) IL-2 (Fujita et al., Cell 4_6, 401 (1986), Hama et al., J.

Exp. Med. 181, 1217 (1995), Kant et al., Lymph. Rec.

Interact. 179 (1989), Kamps et al., Mol. Cell. Biol. 10, 5464 (1990), Williams et al., J. Immunol. 141, 662 (1988), Brunvand, FASEB J. 6, A998 (1992), Matsui et al., Lymphokines .12, 1 (1985), Tanaguchi et al., Nature 302, 305 (1983))

Receptor de IL-2 (Ohbo et al., J. Biol. Chem. 2 / 0, 7 479 (1995), Shibuya et al., Nucl. Acids Res. 1_8, 3697 (1990), Lin et al., Mol. Cell. Biol. 13, 6201 (1993), Semenzato et al.,

Int. J. Clin. Lab. Res. 22, 133 (1992)) IL-3 (Mathey-Prevot et al., PNAS USA 87, 5046 (1990),

Cameron et al., Blood £3, 2851 (1994), Arai et al.,

Lymphokine Res. 9, 551 (1990))

Receptor de IL-3 (subunidade a) (Miyajima et al., Blood 85, 1246 (1995), Rapaport et al., Gene 137., 333 (1993), Kosugi et al., BBRC 208, 360 (1995))

Receptor de IL-3 (subunidade β) (Gorman et al., J. Biol. Chem. 267, 15842 (1992), Kitamura et al., Cell (56, 1165 (1991), Hayashida et al., PNAS USA 87, 9655 (1990)) IL-4 (Rooney et al., EMBO J. 13, 625 (1994), Hama et al., J. Exp. Med. 181, 1217 (1995), Li-Weber et al., J.

Immunol. 153, 4122 (1994), 148, 1913 (1992), Min et al., J. Immunol. 148, 1913 (1992), Abe et al., PNAS 89, 27 7 2864 (1992))

Receptor de il-4 (Beckmann et al., Chem. Immunol. 51^ 107 (1992), Ohara et al., PNAS 85, 8221 (1988)) IL-5 (Lee et al., J. Allerg. Clin. Iiranunol. 9j4, 594 (1994), Kauhansky et al., J. Immunol. 152, 1812 (1994), Staynov et al., PNAS USA 92, 3606 (1995)) IL-6 (Lu et al., J. Biol. Chem. 270, 9748 (1995), Gruss et al., Blood 80, 2563 (1992), Ray et al., PNAS 85, 6701 (1908), Droogmans et al., DNA-Sequence 3_, 115 (1992),

Mori et al., Blood £4, 2904 (1994), Liberman et al.,

Mol Cell. Biol. 1£, 2327 (1990), Ishiki et al., Mol. Cell. Biol. 10, 2757 (1990))

Interferon Regulatory Factor 1 (IRF-1.) (0 promotor de IRF-1 é igualmente activado por IL-6 como por IFN-γ ou IFNp. (Harrock et al., EMBO J. 13, 1942 (1994)) IFN-γ Responsive Promotor (Lamb et al., Blood 83, 2063 (1994)) IL-7 (Pleiman et al., Mol. Cell. Biol. 11, 3052 (1991),

Lapton et al., J. Immunol. 144_, 3592 (1990) ) IL-8 (Chang et al., J. Biol. Chem. 269, 25277 (1994),

Sprenger et al., J. Immunol. 153, 2524 (1994)) IL-10 (Kim et al., J. Immunol. 148, 3618 (1992), Platzer et al., DNA Sequence £, 399 (1994), Kube et al., Cytokine 7, 1 (1995)) 28

IL-11 (Yang et al., J. Biol. Chem. 269, 32732 (1994)) IFN-γ (Ye et al., J. Biol. Chem. 269, 25728 (1994), Hardy et al., PNAS 82, 8173 (1985))

GM-CSF (Nimer et al., Mol. Cell. Biol. 10_, 6084 (1990),

Staynov et al., PNAS USA 92, 3606 (1995), Koyano-Nakayawa et al., Int. Immunol. 5, 345 (1993), Ye et al., Nucl. Acids Res. 22^, 5672 (1994))

Receptor de GM-CSF (cadeia a) (Nakagawa et al., J. Biol. Chem. 269, 10905 (1994)) IL-13 (Staynov et al., PNAS USA 92, 3606 (1995)

LIF (Gough et al., Ciba Found. Symp. 167, 24 (1992), Stahl et al., Cytokine 5_, 386 (1993))

Receptor do MacrophagenColony Stimulating Factor (M-CSF) (Yue et al., Mol. Cell. Biol. 13, 3191 (1993), Zhang et al., Mol. Cell. Biol. 1±, 373 (1994))

Receptores tipo I e II Macrophagen Scavenger (Moulton et al., Mol. Cell. Biol. 1_4, 4408 (1994)) MAC-1 (antigénio de funções de leucócitos) (Dziennis et al., Blood R5, 319 (199b), Bauer et al.,

Hum. Gene Ther. _5, 709 (1994), Hickstein et al., PNAS USA 89, 2105 (1992)) LFA-Ια (antigénio de funções de leucócitos) (Nueda et al., J. Biol. Chem. 268, 19305 (1993), Agura et al., Blood 79, 602 (1992), Cornwell et al., PNAS USA 90, 4221 (1993)) 29

r~ Κ'Ρ - pl50,95 (antigénio de funções de leucócitos) (Noti et al., DNA and (Jell Biol. 11, 123 (1992),

Lopezcabrera et al., J. Biol. Chem. 268, 1187 (1993)) A listagem dos promotores para citoquinas e receptores de citoquinas é apresentada apenas a titulo de exemplo e não deve ser entendida como uma limitação.

Na diferentes doenças a titulo de exemplo, as seguintes - em alergias:

Receptor, IL-2, - em doenças autoimunes mediadas por células ou anticorpos - para evitar a rejeição de órgãos 6.2 Selecção da substância act outras iloimunes pode-se escolher, a sequências promotoras: as sequências promotoras para IL-1, receptor de IL-1 e IL-2, IL-4 ou receptor de IL-4 as sequências promotoras para IL-1, receptor de IL-1, IL-2, receptor de IL-2 As sequências promotoras de IL-1, receptor de IL-1, IL-2, receptor de IL-2 va para doenças autoimunes e A substância activa no sentido da presente invenção é a sequência de ADN para uma citoquina, uma quimioquina, um factor de crescimento ou um dos seus inibidores, um anticorpo ou uma enzima. A selecção da substância activa é orientada pela doença fundamental a tratar e sequência activadora escolhida.

Por exemplo, no caso das seguintes doenças, pode-se escolher uma das seguintes substâncias activas: 30

V

a) Substância activa para Sequência de ADN para IFNcc o tratamento de (Henco et al., J. Mol. Bioi. alergias 185, 227 (19R5), Pestka et al.,

Ann. Rev. Biochem. 5_6, 727 (1987), Weissmann et al., Phil. Trans. R. Soc. Lond. B299, 7 (1982), Goeddel et al., Nature 290, 20 (1981)) ou IFNP (Sen et al., J. Biol. Chem. 267, 5017 (1992), Mark et al., EP 192 811, EP 234 599, US 45 88 585) ou IFN-γ (Gray et al., Nature 295, 503 (1982), Yip et al., PNAS USA 79, 1820 (1982), Rinderknecht et al., J. Biol. Chem. 259, 6790 (1984)) ou IL-10 (Moore et al., Science 248, 1230 (1990) , Vieira et al., PNAS USA 88, 1172 (1991), Kim et al., J. Immunol. 148 3618 (1992)) ou receptores de IL-4 solúveis (Idzerda et al., J. Exp. Med. 171, 861 (1990), EPA 0419 091 Al, Foxwell, Eur. J. Immunol. 19, 1637 (1989), Garrone et al., Eur. J. Immunol. 21^, 1365 (1991) , Gallizzi et al., Int. Immunol. 2, 226 (1990), Park et al., J. Exp. Med. 166, 476 (1987)) ou IL-12

(Kobayashi et al., J. Exp. Med. 170, 827 (1989), Gabler et al., PNAS 88, 4143 (1991), Gately et al., J. Immunol. 147, 874 (1991), Schoenhaut et al., J. Immunol. 148, 3433 (1992), Wolf et al., J. Immunol. 146, 3074 (1991)) ou TGFB (Massague, Ann. Rev. Cell. Biol. 6, 597 (1990), Kondiah et al., J. Biol. Chem. 265, 1089 (1990), Garnier et al., J. Molec. Biol. 120, 97 (1978)) 31 Γ\ \ b) Substância activa Sequência de ADN para IL-10 impedir a rejeição de (Moore et al., Science 248, 1230 órgãos transplantados (1990), Vieira et al., pnasusa

88, 1172 (1991), Kim et al., J.Immunol. 148, 3618 (1992)) ou TGFP (Massague, Ann. Rev. CellBiol. 6, 597 (1990), Kondiah et al., J. Biol. Chem. 265, 1089 (1990), Garnier et al., J. Mol. Biol. 120, 97 (1978) ou receptores de IL-1 solúveis (Sims et al., PNAS USA 8_6, 894 6 (1989)(1), Dower et al., J. Exp. Med. 162, 501 (1985), Chizzonite et al., PNAS 86, 8029 (1989)), McMahan et al., EMBO J. JL0, 2821 (1991) (II), Sims et al.,

Science 241, 585 (1988)) ou receptores de IL-2 solúveis (Taneguchi et al., Nature 302, 305 (1983), Greene et al., Ann. Rev. Immunol. 4^, 69 (1986), Hatakeyama et al., Science 244, 551 (1989), Takeshita et al., Science 257, 379 (1992), Russel et al., Science 262, 1880 (1993)) ou antagonistas de receptores de IL-1 (Eisenberg et al., Nature 343, 341 (1990), Cárter et al.,

Nature 344, 633 (1990)) ou receptores de IL-6 solúveis (Mackiewicz et al., Cytokine ]_, 142 (1995)) ou uma sequência de ADN para um anticorpo imunossupressivo ou os seus fragmentos que contêm VH e Vl ou os seus fragmentos VH e VL ligados através de um adaptador, preparada, por exemplo, por meio da metodologia descrita por Marasco et al. (Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 90, 7889 (1993)). Anticorpos imunossupressivos são por exemplo anticorpos específicos do receptor de células T ou o seu complexo CD3 contra CD4 ou CD8, para além de contra o receptor de IL-2 32

(Strom et al., Ann. Rev. Med. 44, 343 (1993), Scheringer et al., Ann. Hematol. 66, 181 (1993)), receptor de IL-1 ou receptor de IL-4 ou contra a molécula de adesão CD2, LFA-1, CD28 ou CD40 (Olive et al., Drug Carriers Syst. Jd), 29 (1993), Wendling et al., J. Rheumatol. 18, 325 (1991), Van der Lubbe et al., Arthritis ' Rheum. 34_, 89 (1991)). c) Substância activa para a terapia de doenças autoimunes mediadas por anticorpos

Sequência de ADN para TGF5 (Massague, Ann. Rev. Cell Biol. 6, 597 (1990), Kondiah et al., J. Biol. Chem. 265, 1089 (1990), Garnier et al., J. Molec. Biol. 120, 97 (1978)) ou IFNa (Henco et al., J. Mol. Biol. 185, 227 (1985), Pestka et al., Ann. Rev. Biochem. 5^, 727 (1987), Weissmann et al., Phil. Trans. R. Soc. Lond. B299, 7 (1982), Goeddel et al., Nature 290, 20 (1981), (Sen et al., J. Biol, Chem. 267 5017 (1992),

Mark et al. EP 192 811, EP 234 599, US 45 88 585) ou IFNB (Sen et al., J. Biol. Chem. 2 G7, 5017 (1992), Mark et al. EP 192 811, EP 234 599, US 45 88 585) ou IFNy (Gray et al., Nature 295, 503 (1982), Yip et al., PNAS USA 79, 1820 (1982), Rinderknecht et al., J. Biol. Chem. 250, 6790 (1984) ) ou IL-12 (Kobayashi et ai., J. Exp. Med. 170, 827 (1989), Gabler et al., PNAS 28, 4143 (1991), Gately et al., J. Immunol. 147, 874 (1991), Schoenhaut et al., J. Immunol. 148, 3433 (1992), Wolf et al., J. Immunol. 146, 3074 (1991)) 33 \

\ J ' ou receptores de IL-4 solúveis ((Idzerda et al., J. Exp. Ked. 171, 861 (1990), EPA 0419 C91 Al, Foxwell, Eur. J. Immunol. 19, 1637 (1989), Garrone et al., Eur. J. Immunol. 2^, 1365 (1991), Gallizzi et al., Int. Immunol. 2, 22b (1990), Park et al., J. Exp. Med. 166, 476 (1987)) ou receptores de IL-6 solúveis (Machiewicz et al., Cytokine 1_, 142 (1995)) ou sequência de ADN para um anticorpo imunossupressivo (vide secção 6.2.b) ou os seus fragmentos que contêm VH e VL ou os seus fragmentos VH e VL ligados através de um adaptador, preparada, por exemplo, por meio da metodologia descrita por

Marasco et al. (Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 90, 7889 (1993)) d) Substância activa para Sequência de ADN para IL-6 a terapia doenças (Wong et al., Immunol. Today 9, autoimunes mediadas por 137 (1988), Brakenhoff et al., células J. Immunol. 142, 1175 (1989),

Yasukawa et al., EMBO J. 6, 2939 (1987)) 34

ou IL-9 (Yang et al., Blood _7J_' 1880 Π989), Mock et al,

Immunogenetics 3^, 265 (1990)) ou IL-10 (Moore et al., Science 248, 1230 (1990) , Vieira et' al., PNAS USA 88, 1172 (1991), Kim et al., J. Immunol. 148 3618 (1992)) ou IL-13 (McKenzie et al., PNAS S)0, 3735 (1993), Minty et al., Nature 362, 248 (1993), McKenzie et al., J. Immunol. 150, 5436 (1993)) ou TNFa (Beutler et al., Nature 320, 584 (1986), Kriegler et al., Cell 53, 45 (1988)) ou IL-4 (Lee et al., PNAS 8^3, 2061 (1986), Paul, Blood 77, 1859 (1991) ; Yokota et al., PNAS USA 83, 5894 (1986), von Leuven et al., Blood 73, 1142 (1989), Arai et al., J. Immunol. 142,

274 (1989)) ou TNFB (Gray et al., Nature 312, 721 (1984) , Li et al., J. Immunol. 138, 4496 (1987), Aggarwal et al., J. Biol. Chem. 260, 2334 (1985) ) ou ou uma sequência de ADN para um anticorpo imunossupressivo ou os seus fragmentos que contêm VH e VL ou os seus fragmentos VH e VL ligados através de um adaptador (vide secção 6.2.b)

Na escolha de receptores como substância activa serão utilizadas as suas partes extracelulares.

Enquanto substância activa no sentido da presente invenção podem porém ser também utilizadas sequências de ADN de proteínas de fusão entre as citoquinas indicadas, factores de crescimento ou a parte extracelular dos vários receptores por um lado e por outro a parte Fc da imunoglobulina humana. 35

Sequências de ADN deste tipo e a sua preparação foram descritas na EP 0464 533 AI. e) Proteínas inibidoras

Como substância activa no sentida da presente invenção deve -3e entender também um inibidor do ciclo celular. Um inibidor do ciclo celular no sentido da presente invenção consiste numa sequência de ADN cuja proteína expressa inibe a proliferação de células. Entre estes inibidores do ciclo celular contam-se, por exemplo, as sequências de ADN das seguintes proteínas: a proteína do retinoblastoma (pRb=pll0) ou as proteínas relacionadas pl07 e p 130 (La Thangue, Curr. Opin. Cell Biol. 6, 443 (1994)) a proteína p53 (Prives et al., Genes Dev. 1_, 529 (1993)) a proteína p21 (WAF-1) (El-Deiry et al., Cell 75, 817 (1993) - a proteína pl6 (Serrano et al., Nature 366, 704 (1993),

Kamb et al., Science 264, 436 (1994), Nobori et al.,

Nature 368, 753 (1994)) - outros inibidores de cdK (Resumo em Pines, TIBS 1_9, 143 (1995)) - a proteína GADD45 (Papathanasiou et al., Mol. Cell. Biol. 11_, 1009 (1991), Smith et al., Science 266, 1376 (1994) ) a proteína bak (Farrow et al., Nature 374, 731 (1995),

Chittenden et al., Nature 374, 733 (1995), Kiefer et al., Nature 374, 736 (1995)).

Para evitar uma inactivação intracelular rápida deste inibidores do ciclo celular utilizam-se preferencialmente genes que apresentam mutações para as posições de inactivação das 36

proteínas expressas, sem que estas sejam afectadas nas suas funções. A proteína do retinoblastoma (pRb/pllO) e as proteínas relacionadas pl07 e p 130 são inactivadas por fosforilação. De preferência é utilizada uma sequência de ADNc pRb/pllO, pl07 ou pl30 com uma mutação pontual de tal forma que as posições de fosforilação da proteína codificada não são permutadas contra ácidos aminados não fosforiláveis.

Em conformidade com Hamel et al. (Mol. Cell. Biol. 12, 3431 (1992) a sequência de ADNc da proteína do retinoblastoma (pllO) deixa de poder ser fosforilada por meio de permuta dos ácidos aminados nas posições 246, 350, 601, 605, 780, 786, 787, 800 e 804, porém, a sua actividade de ligação com os antigénios T grandes não é afectada. Por exemplo, os ácidos aminados Thr--246, Ser-601, Ser-605, Ser-780, Ser-786, Ser-787 e Ser-800 são permutados com Ala, o ácido aminado Thr-350 com Arg e o ácido aminado Ger-804 com Glu.

De forma análoga submete-se a mutação a sequência de ADN para a proteína pl07 ou a proteína pl30. A proteína p53 é inactivada na célula, seja por meio de ligação a proteínas especiais, como por exemplo MDM2, seja por meio de oligomerização da p53 através de serina 392 C-terminal desfosforilada (Schikawa et al., Leukemia und Lymphoma 11, 21 (1993) e Brown, Annals of Oncology 4_, 623 (1993)). De preferência utiliza-se por conseguinte uma sequência de ADN para uma proteína p53 cujo terminal C é encurtado junto à serina 392. f) Proteínas citostáticas ou citotóxicas

Deve-se ainda entender como inibidor do ciclo celular uma sequência de ADN que exprime uma proteína citostática ou citotóxica. 37

Entre este tipo de proteínas contam-se, por exemplo - perforina (Lin et al., Immunol. Today 16, 194 (1995)) granzima (Smyth et al., Immunol. Today 1_6, 202 (1995)) TNF (Porter, TibTech 9, 158 (1991), Sidhu et al.,

Pharmc. Ther. 57, 79 (1993)), em especial * TNFa (Beutler et al., Nature 20, 584 (1986),

Kriegler et al., Cell 53, 45 (1988) * TNFp (Gray et al., Nature 312, 721 (1984), Li et al., J. Immunol. 138, 4496 (1987), Aggarwal et al., J. Biol. Chem. 260, 2334 (1985) g) Enzimas para a actlvaçao de precursores de citostáticos

Deve-se ainda considerar como inibidor do ciclo celular a sequência de ADN para uma enzima que transforma um precursor inactivo de um citostático num citostático.

Este tipo de enzimas que cindem pré-fármacos inactivos (prodrugs) em citostéticos activos (drugs) e os vários prodrugs e drugs pertencentes a esta categoria foram já descritos na generalidade por Deonarain et al., (Br. J. Câncer 70, 786 (1994), von Mullen, Pharmac. Ther. 63, 199 (1994) e Harris et al., Gene Ther. 1, 170 (1994)). A titulo de exemplo pode-se utilizar a sequência de ADN das seguintes enzimas: quinase de timidina do vírus de Herpes Simplex (Garapin et al., PNAS USA _76, 3755 (1979), Vile et al.,

Câncer Res. 53^, 3860 (1993), Wagner, et al., PNAS USA 75, 1441 (1981), Moelten et al., Câncer Res. 4_6, 5276 (1986), J. Natl. Câncer Inst. 82, 297 (1990)) quinase de timidina do vírus de Varizella Zoster (Huber et al·., PNAS USA 8j3, 8039 (1991), Snoeck, Int. 38 r\

J. Antiraicrob. Agents 4, 211 (1994)) nitroreductase bactcriana (Michael et al., FEMS Microbiol. Letters 124, 195 (1994), Bryant et al., J. Biol. Chem. 266, 4126 (1991), Watanabe et al., Nucleic Acids Res. 18^, 1059 (1990)) β-glucuronidase bacteriana (Jefferson et al., PNAS USA 8£, 8447 (1986)) β-glucuronidase vegetal de cereais Secaie (Schulz et al., Phytochemistry 26, 933 (1987)) β-glucuronidase humana (Bosslet et al., Br. J. Câncer 5í>, 234 (1992), Oshima et al., PNAS USA 84, 685 (1987)) carboxipeptidase (CB) humana p. ex. * CB-A dos mastócitos (Reynolds et al., cT_ Clin. Tnvest. 89, 273 (1992)) * CB-B do pâncreas (Yamamoto et al., J. Biol. Chem. .267, 2575 (1992),

Catasus et al., J. Biol. Chem. 270, 6651 (1995)) carboxipeptidase bacteriana (Hamilton et al., J. Bacteriol. 17 4, 1626 (1992),

Osterman et al., J. Protein Chem. 11, 561 (1992)) β-lactamase bacteriana (Rodrigues et al., Câncer Res. 55 63 (1995)', Hussain et al., J. Bacteriol. 164, 223 (1985), Coque et al., Embo J. 12, 631 (1993) desaminase de citosina bacteriana (Mullen et al., PNAS USA 89, 33 (1992), Austin et al., Mol. Pharmac. £3, 380 (1993), Danielson et al., Mol.

Microbiol. £, 1335 (1992) catalase ou peroxidase humanas 39

(Ezurum et al., Nucl. Acids Res. 21, 1607 (1993)) fosfatases, em especial * fosfatase alcalina humana (Gum et al., Câncer Res. 50, 1085 (1990)) * fosfatase ácida prostática humana (Sharieff et al., Am. J. Hum. Gen. 46, 412 (1991),

Song et al. , Gene .122, 291 (1993), Tailor et al.,

Nucl. Acids Res. 18_, 4928 (1990)) * fosfatase ácida tipo 5 (Gene 130, 201 (1993)) oxidases, em especial * Lisiloxidase humana (Kimi et al., J. Biol. Chem. 70, 7176 (1995)) * D-aminooxidase ácida humana (Fukui et al., J. Biol. Chem. 267, 18631 (1992)) - peroxidases, em especial * peroxidase de glutatião humana (Chada et al., Genomics 5, 268 (1990), Ishida et al., Nucl. Acids Res. 15, 10051 (1987)) * Peroxidase de Eosinófilos humana (Ten et al., J. Exp. Med. 169, 1757 (1989), Sahamaki et al., J. Biol. Chem. 264, 16828 (1989)) * Peroxidase da glândula tiróide humana (Kimura, PNAS USA 84, 5555 (1987)).

Para facilitar a secreção das enzimas indicadas, a sequência de sinal homóloga contida na sequência de ADN pode ser substituída por uma sequência de sinal heteróloga que melhore a passagem extracelular.

Assim, pode-se substituir, por exemplo, a sequência de 40

sinal da β-glucoronidase (posição no ADN ^ 27 a 93; Oshima et al., PNAS 8_4, 585 (1987)) pela sequência de sinal da imunoglobulina humana (posição no ADN ^ 63 a ^ 107; Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988).

Além disso são preferencialmente escolhidos os ADNs de enzimas que possam ser armazenadas numa escala reduzida em lisossomas, por meio de mutações pontuais. Este género de mutações pontuais foram descritas, por exemplo, para a β-glucuronidase (Shipley et al., J. Biol. Chem. 268, 12193 (1993)). 6.3 Combinação de substâncias activas iguais ou diferentes para doenças autoimunes e outras O ob~ecto da presente invenção consiste ainda numa substância activa, na qual se encontra uma combinação das sequências de ADN de várias substâncias activas iguais (A,A) ou substâncias activas diferentes (A,B). Para a expressão, p. ex. de várias sequências de ADN é preferencialmente intercalado o ADNc de um "internai ribosome entry site” (IRES) como elemento regulador. IRES deste tipo foram descritos por Mountford e Smith (TIG 1_1, 179 (1995), Kaufman et al., Nucl. Acids. Res . 19, 4485 1991), Morgan et al., Nucl. Acids Res. 20_, 1293 (1992) e Cirks et al., Gene 129, 247 (1993), Pelletier e

Sonenberg, Nature 334, 320 (1988), Sugitomo et al., BioTechn. 12, 694 (1994).

Conforme a combinação, uma substância activa deste tipo apresenta, no sentidc da presente invenção, um efeito aditivo ou sinergético. 41 6.4 Selecção do ligando para doenças autoimunes entre outras

Como ligando para vectores virais e não virais, por exemplo em dispersões coloidais preparadas com conjugados de ligandos de polilisina, são preferidas substâncias que se ligam especificamente à superfície de células imunitárias (macrófagos, linfócitos). Entre estes contam-se anticorpos ou fragmentos de anticorpos orientados contra estruturas de membranas de células imunitárias, tal como foi descrito, por exemplo, por Powelson et al., Biotech Adv. 1Λ, 725 (1993).

Fazem ainda parte dos ligandos anticorpos ou fragmentos de anticorpos monoclonais ou policlonais, que se ligam com os seus domínios constantes a Fc-γ ou receptores de Fc de células imunitárias (Rojanasakul et al., Pharm. Res. 11, 1731(1994)).

Os anticorpos monoclonais de murino são utilizados preíerencialmente sob forma humanizada. A humanização é efestuada da forma ilustrada por Winter et al., (Nature 349, 293 (1991)) e Hoogenbooms et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993)). Os fragmentos de anticorpos são preparados conforme o estado da técnica, por exemplo da forma descrita por Winter et al., (Nature 349, 293 (1991) e Hoogenbooms et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993), Girol (Mol. Immunol. 28_, 1379 (1991) e Huston et al. (Int. Rev. Immunol. 10, 195 (1993).

Fazem ainda parte dos ligandos todas as substâncias que se ligam a estruturas de membrana ou receptores de membrana à superfície de células imunitárias. Por exemplo, contam-se entre estas os factores de crescimento, como citoquinas, EGF, TGF, FGF ou PDGF ou os seus fragmentos ou sequências parciais, que se ligam a receptores expressos por células deste tipo.

Entre estes contam-se ainda ligandos. que se ligam a estruturas de membrana de células, como por exemplo o receptor de manose-6-fosfato em macrófagos no baço, fígado, pulmões e

outros tecidos.

Estes ligandos e estruturas de membrana são descritos de forma geral por Perales et al., Eur. J. Biochem. 226, 255 (1994) . 6.5 Preparação da substância activa para doenças autoimunes entre outras A preparação da substância activa de acordo com a presente invenção é descrita de forma mais pormenorizada por meio dos exemplos que se seguem a) Construção do promotor quimérico IL-2-CDE-CHR-Inr 0 promotor humano de IL-2 (posição ^ -373 a ^ -1,

Williams et al., J. Immunol. 141, 662 (1988)) é acoplado na sua extremidade 3' ao terminal 5' do módulo CDE-CHR-Inr (posição ^ -20 a ^ +121) do gene humano cdc25C (Lucibello et al., EMBO J., 14 132 (1995)) (fig. 7). A acoplagem é realizada com auxilio de enzimas conhecidas do especialista e disponíveis no comércio. b) Construção de um plasmídeo que contém o promotor quimérico IL-2-CDE-CHR-Inr no componente central da substância activa A unidade de transcrição-módulo repressor de IL-2 quimérica é acoplada na sua extremidade 3' ao terminal 5' de um ADN que contém o domínio completo que codifica para a IL-10 (posição <, 76 a £ 512, Moore et al., Science 246, 1230 (1990)) (fig. 7). Este ADN contém também a sequência de sinal necessária para uma secreção. As unidades de controlo da transcrição e o ADN para IL-10 são clonados em vectores plasmidicos derivados de pUC19/19 ou Bluescript, que podem ser utilizados directamente ou em sistemas de dispersão 43

coloidais para uma aplicação in vivo. Em alternativa podem-se transferir os genes quiméricos para vectores virais ou outros vectores adequados e injectar. c) Construção de um plasmídeo que contém dois genes para substâncias activas 0 promotor humano do receptor de IL-1 (posição £ -489 a £ -1, Ye et al., pNAS USA. 90, 229 (1993) é acoplado na sua extremidade 3' ao terminal 5' do módulo CDE-CHR-Inr do gene humano cdc25C (posição -20 a +121) (Lucibello et al., EMBO J., 14 132 (1995)) (vide fig. 7). A acoplagem é realizada com auxilio de enzimas conhecidas do especialista e disponíveis no comércio. A unidade de controlo da transcrição do módulo repressor do receptor de IL-1 é acoplada na sua extremidade 3' com o terminal 5' de um ADN que contém o domínio completo que codifica para a IL-10 (vide fig. 7) . Este ADN contém também a sequência de sinal necessária para uma secreção. A extremidade 3' do ADN para IL-10 é novamente acoplada ao terminal 5' do ADNc do internai ribosome entry site (posições £ 140 a £ 630: Pelletier e Sonnenberg, Nature 334, 320 (1988)) e subsequentemente a sua extremidade 3' é acoplada ao terminal 5' do ADN que codifica para a sequência de sinal da imunoglobulina (posição ^ 63 a ^107, Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988)). Na sua extremidade 3' é acoplado o 5' do ADN para a β-glucuronidase (posição ^ 93 a ^ -1982, sequência de ADNc sem sequência de sinal, Oshima et al., PNAS USA 84, 685 (1985)). Esta substância actíva preparada desta forma é subsequentemente cionada para vectores plasmíddicos pucl8/19 ou derivados de Bluescript, que podem ser utilizados directamente ou em sistemas de dispersão coloidal, para uma aplicação in vivo. Em 44 7 \) c r Qr alternativa, os genes quiméricos podem ser transferidos para vectores virais ou outros vectores adequados e ser injectados. 7) Substância activa para o tratamento da artrite 7.1 Selecção da sequência activadora para a artrite

Por sequência activadora deve entender-se uma sequência de nucleótidos (sequência do promotor ou intensificadora), com a qual os factores de transcrição formados ou activos nas células sinoviais e células inflamatórias interagem. No sentido da presente invenção contam-se entre as sequências activadoras preferidas sequências reguladoras dos genes ou elementos de genes codificadores de proteínas expressas especialmente em células sinoviais e células inflamatórias. Por exemplo:

Metaloproteinases (MMP) (colagenases, gelatinases, estroma lisina) em especial * MMP-l (colagenase intersticial) (Lewis et al., Int. J. Immunopharm. 1£, 497 (1992)) * MMP-2 (gelatinase 72 kD) (Okada et al., Eur. J. Biochem. 194, 721 (1990)) ’ * MMP-3 (estromelisina) (Saus et al., J. Biol. Chem. 263, 6742 (1988), Tetlow et al., Rheum. Internat. ]^3, 53 (1993)) * MMP-9 (gelatinas 92 kD) (Tetlov; et al., Rheum. Internat. _13, 53 (1993)) A sequências dos promotores para as metaloproteinases foram publicadas da seguinte forma: 45

"7 MMP-l (colagenase intersticial) (Angel et al., Mol. Cell. Biol. 7, 2256 (1987)) MMP-3 (Estromelisina/fransina) (Matrisian et al., Mol. Cell. Biol. 6, 1679 (1986),

Kerr et al., Cell 61, 267 (1999)

Inibidores de tecido das metaloproteinases (TIMP) em especial * TIMP-1 (Kolkenbrock et al., Eur. J. Biochem. 198, (1991), Faucher et al., Path. Biol. 37, 199 (1989)) * TIMP-2 (Kolkenbrock et al., Eur. J. Biochem. 198, * TTMP-3 (1991)) (Wick et al., J. Biol. Chemistry 269, 18953 (1994)).

As sequências promotoras para TIMPs foram publicadas da seguinte forma * TIMP-1 (Stearns et al., Proc. Annu. Meet. Am. Assoe. Câncer Res. 3^3, A131 (1992)) * TIMP-2 (De Clerck et al., Gene 139, 185 (1994)) * TIMP-3: 0 objecto da presente invenção consiste ainda na sequência do promotor abrangendo 500 pares de bases para o gene de TIMP-3 descrito por von Wick et al. (J. Biol. Chemistry 269, 18953 (1994)). Esta sequência do promotor é constituída, entre outros, pelas posições de ligação para os factores de transcrição NF-1 (Mcisterernst et al., Nucl. Acids Res. 16, 4419 (1988), Santoro et al., Nature 334_, 218 (1988)), Spl (Kadonaga et al., TIBS ΛΑ, 10 (1986)) e C/EBP (Cao et al., Genes Dev. 5^, 1538 (1991), Landschulz et al., Science 243, 1681 46 (1989)) e flanqueia a sequência genética transcrita de TIMP-3 na extremidade 5'. 7.1.1 Caracterização da sequência do promotor humano TIMP-3 a) Isolamento e análise sequencial da sequência do promotor do gene TIP-3 humano de flanco a 5' A indução da expressão de ARNm de TIMP-3 durante a progressão G0"^S depende principalmente de uma activação da transcrição do gene TIMP-3 (Wick et al., J. Biol. Chem. 269, 18963 (1994)). A sequência de flanco 5' do gene TIMP-3 humano foi clonada, o ponto de partida da transcrição do ARNm-TIMP-3 foi determinado e a área do promotor fronteiriça foi submetida a uma análise de função estrutural. Estas análises tinham por objectivo esclarecer os mecanismos reguladores na base da expressão especifica do TIMP-3 durante a progressão G0“^S e Gi->S.

Por meio de uma análise da mancha de Western genómica foi determinado em primeiro lugar se o TIMP-3 representa um gene isolado no genoma humano ou se existem vários locais para o gene TIMP-3 ou eventualmente até pseudogenes TIMP-3. Para esse fim foi isolado ADN genómico de células WI-38, foi tratado com endonucleases de restrição EcoRI, Pstl e HindIII e submetido ao teste da mancha de Western. Utilizou-se como sonda com marcação radioactiva um fragmento 3' de ADNc de TIMP-3 com 690 pb de comprimento. Dado que a sonda, em todos os casos, apenas reconhece um fragmento de ADN especifico, depreende-se que existe somente um único gene TIMP-3 no genoma humano.

Para o isolamento da sequência genética TIMP-3 de flanco 5' foram hibridados cerca de 7x10' fagos de uma biblioteca genética WI-38 genómica com um fragmento 5' de ADNc de TIMP-3 de 300 pb de comprimento. Dos treze clones de fagos recombinantes isolados após este exame primário, quatro foram também reconhecidos por um oligcnucleótido de 30 pb de comprimento do domínio terminal 5' do ADNc de TIMP-3. Dado que

estes fagos também provavelmente continham a.área sequenciadora 5' de flanco do codão de partida ATG, seleccionou-se um dos clones de fagos para uma caracterização e análise mais em pormenor. Por meio de tratamento combinado com várias endonucleases de restrição e subsequente análise por meio da mancha de Western foi possível determinar que a "inserção" de ADN genómico com 13 kb de comprimento deste fago continha cerca de 4,7 kb da sequência genética TIMP-3 de flanco 5'.

Por meio da análise da sequência das duas cadeias, foi determinada a sequência de nucleótidos de aproximadamente 1500 pb do domínio genético de flanco 5' . Os encurtamentos a 5' do domínio genético 5' clonada, preparados para este fim através de um tratamento com exonuclease III, encontram-se Ilustrados na fig. 8. 0 domínio de sequência que se revelou de especial significado para a função promotora TIMP-3 por meio das análises da função estrutural descritas em seguida, encontra-se representado na fig. 9. Por meio da análise apoiada por meios informáticos foram identificados na sequência do promotor TIMP-3 uma série de elementos que se assemelham a posições de ligação de factores de transcrição conhecidas, entre outras 4 posições de ligação Spl, uma posição de ligação possível NF1 bem como uma C/EBP (marcado na fig. 9). b) Mapeamento do ponto de início da transcrição do ARNm de TIMP-3

Para se determinar o ou os ponto (s) de partida da iniciação de transcrição foi determinado o terminal 5' do ARNm de TIMP-3 por meio de uma análise da extensão do iniciador. Para este fim foi identificada uma posição iniciadora de transcrição (sequência de nucleótidos: GGGCGGGCCCAACAGCCCG), que está localizada a 364 pb para 5' do codão iniciador ATG (marcado na fig. 9). Apesar Ue exames precisos da sequência dc nucleótidos a montante da posição de partida não foram encontradas nem uma caixa TATA nem sequências semelhantes a 48

ΤΑΤΑ. c) Análise da actividade da sequência do promotor de TIMP-3

Para determinar a actividade da sequência do promotor de TIMP-3 em células em proliferação normal, em repouso e estimuladas por soro e conter as primeiras pistas de áreas do promotor funcionais importantes foram clonados os fragmentos promotores encurtados a 5' utilizados para a sequenciação (vide fig. 8) antes do gene da luciferase no vector pXP-2 sem promotor (Nordeen, Biotechniques 6, 454 (1988)). Graças à sua actividade basal extremamente reduzida esta "construção relatora" é especialmente apropriada para a execução de análises de expressão transientes. d) Actividade da sequência do promotor de TIMP-3 em células NIH3T3 de proliferação normal e estimuladas por soro

Para mostrar que a sequência do promotor de TIMP-3 isolada está activa em análises de expressão transientes, isto é, que pode controlar a transcrição do gene relator da luciferase, transfectou-se a construção de eliminação do promotor TIMP-3 Δ-1010 (abrange os nucleótidos -1010 a +281, vide fig. 8) em células NIH3T3 e determinou-se a actividade de luciferase nestas células em proliferação normal ou estimuladas por soro. Para comparação determinou-se adicionalmente a expressão de OUtras construções do promoLor de luciferase que continham o promotor tk do vírus do herpes (pT81: Lucibello e Miiller, Meth. Mol. Cell R-iol. JL, 9 (1989)), um promotor mínimo 5xTRE (Angel et al., Mol. Cell Biol. 1_, 2256 (1987)), um RSV-LTR (Setoyama et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8_3, 3213 (1986)) ou um fragmento de 937 pb de comprimento do promotor Dl da ciclina humana (Herber et al., Oncogene 9, 1295 (1994)). Os resultados destas experiências encontram-se indicados no quadro 2.

Em células NIH3T3 de proliferação normal (quad. 2A) a construção do promotor de TIMP-3 Δ-1010 foi expressa em cerca 49 "7

de mais 3 vezes do que o promotor mínimo 5xTRE e apresenta uma expressão 7 vezes superior à da construção do promotor Dl da ciclina. Somente o plasmídeo relator RSV-LTR apresentou uma actividade 2 vezes superior à da construção do promotor TIMP-3. Estes resultados dão a entender que o promotor TIMP-3 humano é caracterizado por uma actividade de transcrição comparativamente elevada. Tal como se mostra no quadro 2B e fig. 11, a construção do promotor de TIMP-3 Δ-1010 foi ainda claramente induzida em células que foram estimuladas depois de uma privação de soro de dois dias, durante 4 h com soro fetal de vitelo a 20 %. Em comparação com células em repouso (Go) a expressão aumentou entre cerca de 7 a 8 vezes, o que é 3,5 ou 2,4 vezes superior aos valores de indução observados da construção relatora 5xTRE ou da construção do promotor Dl da ciclina. Em contrapartida a construção de luciferase do promotor tk do Herpes simplex (pt81) não mostrou qualquer indução da sua expressão após a estimulação com soro.

Na fig. 10 é apresentada a cinética da indução da construção do promotor de TIMP-3 Δ-1010 após estimulação com soro das células em repouso. A actividade de luciferase aumentou logo após lhe atingiu o valor máximo após 4 h com uma indução 7 vezes maior.

Em resumo estes resultados indicam que a construção do promotor de TIMP-3 Δ-1010 apresenta os elementos reguladores essenciais, quando não mesmo todos, que são necessários para uma transcrição eficiente bem como para a capacidade de indução por meio de soro. e) Análise estrutural e de função da sequência do promotor de TIMP-3

Uma análise estrutural e de função da sequência do promotor de TIMP-3 deveria fornecer as primeiras indicações daquelas regiões do promotor significativas do ponto de vista funcional, para a expressão basal, bem como para a capacidade de indução com soro. Para este fim determinou-se a actividade 50 das várias construções de eliminação do promotor de TIMP-3 preparadas para a sequenciação do promotor e clonadas para o vector pXP-2 (vide fig. 8) em análises de expressão transientes. A análise da expressão basal das várias construções de eliminação em células NIH3T3 de proliferação normal (fig. 11) forneceu três resultados essenciais: 1. A construção do promotor Δ-1010 apresentou a expressão mais intensa. Um encurtamento de mais 85 pb (construção Δ-925) conduziu a uma queda de aproximadamente 2 vezes da actividade do promotor. Este facto aponta para a presença de um ou vários elementos na região entre a posição -1010 e -925 que participam na activação da transcrição. 2. Por meio de mais encurtamentos da extremidade 5' até à posição -112 não se afectou de forma significativa a actividade do promotor. Por isso, a região entre -925 e -112 não contém provavelmente qualquer área de sequência importante para a actividade do promotor. 3. Em contrapartida, a região entre a posição -1300 e -1010 pareceu exercer um efeito negativo na actividade do promotor, o que se manifesta na expressão reduzida em cerca de 4 vezes da construção de eliminação Δ-1300 em comparação com a construção do promotor Δ-1010.

Numa experiência final foi analisada a capacidade de indução pelo soro das várias construções de eliminação do promotor de TIMP-3. Os resultados destas análises de expressão, realizadas tal como se descreve no quadro 2, encontram-3e -representados na fig. 11. É surpreendente a semelhança do perfil de expressão entre células em proliferação normal (fig. lla) , células em repouso e células estimuladas por soro (fig. llb) . Os valores de expressão em células em repouso situam-se a cerca de 2 vezes menos do que em células em proliferação e foram induzidas 4 h após a estimulação com soro em 2,9 a 8,5 vezes. Como se mostra com as células em proliferação normal 51

Γ\ / (fig. 11a), a região entre a posição Δ-1300 e Δ-1010 exerce um efeito negativo na actividade do promotor em células em repouso ou estimuladas com soro, porém não tem qualquer influência na capacidade de indução por soro da construção Δ-1300 (indução 8,5 vezes). Também neste caso as actividades de luciferase mais elevadas foram medidas com a construção de eliminação 1010.

Outros encurtamentos da extremidade 5' até à posição -660 provocaram apenas uma diminuição de 1,5 a 2 vezes da actividade do promotor. Todas estas construções (Δ-1300, Δ-1010, Δ-925, Δ-660) apresentavam porém uma clara indução entre 6 a 8 vezes após a administração do soro. 0 encurtamento em mais 200 pb até à posição -463 (Δ-463) provocou uma nova diminuição de 2 vezes da actividade, no entanto não teve qualquer influência na capacidade de indução por soro da construção. Só a construção Δ-112 apresentou juntamente com um aumento de 3 vezes após a estimulação com soro uma redução em 50 a 65 % da sua capacidade de indução com soro. Este facto aponta para a região entre a posição -463 e -112 conter elemento(s) significativo(s) para a capacidade de indução com soro do promotor TIMP-3. Regiões adicionais entre a posição -463 e -660, bem como -925 e -1010 reforçam geralmente e dependendo do ciclo celular a actividade do promotor induzida pelo soro.

Os resultados da caracterização, bem como da análise de estrutura e funcional do domínio genético TIMP-3 de flanco 5' podem ser resumidos da seguinte forma: TIMP-3 representa um gene livre de caixa TAT. Porém a transcrição é iniciada apenas numa posição de iniciação a 364 pb para montante do codão de iniciação ATG. Em comparação com outros promotores, a sequência do promotor TIMP-3 apresenta um actividade relativamente elevada, para a qual bastam os primeiros 112 pb. Nesta região encontram-se numerosas posições de ligação Spl. Além disso apresenta uma clara indução da sua actividade após estimulação de células em repouso com soro, cuja cinética corresponde à expressão de ARNm de TIMP-3 durante 52

a progressão Go~S. Os elementos de regulação responsáveis pela capacidade de indução do soro estão localizados na região entre a posição -112 e -463.

As sequências activadoras no sentido da presente invençãc são ainda promotores de

- receptor de GM-CSF (Nakagawa et al., J. Biol. Chem. 269, 10905 (1994)) - receptor do Macrophagen-Colony Stimulating Factor (M-CSF) (Yue et al., Mol. Cell. Biol. Γ3» 3191 (1993), Zhang ei al., Mol. Cell. Biol. 14, 373 (1994)) - receptores de Macrophagen Scavenger tipo I e II (Mouton et al., Mol. Cell. Biol. Γ4, 4408 (1994)) 7.2 Selecção da substância activa para artrite

Enquanto substância activa, no sentido da presente invenção, deve entender-se uma sequência de ADN, cuja proteína expressa inibe a inflamação na articulação directa ou indirectamente e/ou fomenta a reconstrução da matriz extracelular (cartilagem, tecido conjuntivo) na articulação. Entre estas proteínas contam-se por exemplo, as seguintes proteínas (a sequência de ADN para cada proteína encontra-se na literatura indicada): - Antagonista do receptor de IL-1 (IL-l-RA) (Thompson et al. (1992), Eisenberg et al., Nature 343, 341 (1990), Cárter et al., Nature 4_4, 63 (1990)) 0 IL-l-RA inibe a ligação de IL-loc,B ao receptor específico (Conti et al., (1992), Granowietz et al., (1992)), a IL-1 activa as células sinoviais, favorecendc desta forma a inflamação (Dayer et al., Eur. Cytokine NetWork 5/6, 563 (1994)) 53

Receptor solúvel de IL-1 (Sims et al., Clin. Immun. Immunopath. 72, 9 (1994), Sims et al., Nature 35^, 88 (1988), Sims et al., PNAS USA 86, 8946 (1989) (I) , Dower et al., J. Exp, . Med. 162, 501 (1985) , Chizzonite et al ., PNAS 86, 8029 (1989), McMahan et al. , EMBO J. 10 , 2821 (1991) (TT) , Sims et al. , Science 241, 585 (1988)) O receptor solúvel de. TT.-l liga e inactiva a IL-1 (Fanslow et al., Science 248, 739 (1990) , Jacobs et al., J. Immunol. 146, 2983 (1991)) IL-6 (Hirano, Int. J. Cell Clonir.g 9, 166 (1991), Brach et al., Int. J. Clin. Lab Rec. 22, 143 (1992), Wong et al., Immunol. Today 9, 137 (1988), Brakenhoff et al., J. Immunol. 143, 1175 (1989), Yasukawa et al., EMBO J. 6, 2939 (1987)) A IL-6 aumenta a secreção de TIMP e superóxidos e diminui a secreção de IL-1 e de TNFx através de células sinoviais e condrócitos (Shingu et al., Clin. Exp. Immunol. 94^ 145 (1993), Shingu et al-, Inflarmation 18, 613 (1994)).

Receptor de TNF solúvel (Olson et al., Eur. Cytckine Network £, 169 (1993),

Tartaglia et al., Immunol. Today .Γ3, 151 (1992), Nophar et al., EMBO J. 9, 3269 (1910), Himmler et al., DNA Cell Biol. 9, 705 (1990), Aggarv.al et al., Nature 318, 665 (1985), Gray et al., PNAS zl_, 7380' (1990), Tartaglia et al., Immunol. Today L3, 151 (1992), Loetcher et al., Cell 61, 351 (1990), Schall et al., Cell 61, 361 (1990), Smith et al., Science 248, 1019 (1990), Goodwin et al., Mol.

Cell. Biol. 11, 3020 (1991) O receptor de TNF solúvel liga e inactiva o TNF. O TNF activa Q3 cclulas sinoviais para aumentar a secreção de metaloproteinases (Dayer et al., Eur. Cytokine Network 5/6, 563, 1994)) 54

IL-4 (Paul, J. Am. Soc. Hemat. 1J_, 1859 (1991), Yokota et al., PNAS USA 83, 5894 (1986), Paul, Blood 77, 1859 (1991), von Leuven et al., Blood 73, 1142 (1989), Arai et al., J.

Immunol, 142, 274 (1989)) A IL-4 inibe a formação e secreção de IL-1, TNF<* e de mmp (Corcoran et al., J. Biol. Chemistry 267, 515 (1992),

Dayer et al., Eur. Cytokine NetWork 5/6, 563 (1994), te

Velde et al., Blood ]_6, 1392 (1990)) IL-10 (Moore et al., Science 248, 1230 (1900), Vieira et al. , PNAS USA 88:, 1172 (1991), Kim et al. , J. Immunol. 148, 3618 (1992)) A IL-10 inibe a formação e a secreção de IL-1, TNFa. e MMP e aumenta a secreção de TIMP (Dayer et al., Eur. Cytokine NetWork 5/6, 563 (1994)) insulin-like growth factor (IGF-1 - factor de crescimento semelhante a insulina) (Jansen et al., Nature 306, 609 (1983), Ullrich et al., EMBO J. 3, 361 (1984), Bell et al·., PNAS 82, 6450 (1985), Rotwein et al., PNAS 83^, 77 (1986), J. Biol. Chem. 261, 4828 (1986), Jansen et al., FEBS Lett. Γ79, 243 (1985))

Tobin et al., Mol. Endocrin. 4_, 1914 (1990), Macaulay,

Brit. J. Câncer 65, 311 (1992)) O IGF-1 estimula a síntese da matriz extracelular.

TGFB em especial • TGFBl e TGFB2 (Massague, Ann. Rev. Cell. Biol. 6, 597 (1990), Kondiah et al., J. Biol. Chem. 265, 1089 (1990), Garnier et al., J. Molec. Biol. 120, 97 (1978), Wahl et al.,

Immunol. Today _10, 258 (1989), Dupuy D'Angeac er al., J. Cell Physiol. L47, 460 (1991)) 55

Γν Ç~v 0 TGFfl estimula a síntese da matriz extracelular. - Dismutase de superóxido (Folz et al., Genomics 22^ 162 (1994), Wan et al. 13/11, 1127 (1994)) - TIMP (Tissue Inhibitors of Metalloproteinases) em especial • TIMP-1 (Docherty et al., Nature 318, 66 (1985)) • TTMP-2 (Stetler-Stevenson et al., J. Biol. Chem. 265, 13933 (1990)) • TIMP-3 (Wick et al., J. Biol. Chemistry, 269, 18953 (1994))

No entanto podem-se utilizar também como substância activa no sentido da presente invenção sequências e ADN de proteínas de fusão entre as citoquinas apresentadas, factores de crescimento ou a parte extracelular dos receptores por um lado e a parte Fc da imunoglobulina humana por outro. Este tipo de sequências de ADNc e a sua preparação foram descritas na EPA 0464 633 Al. 7.3 Combinação de substâncias iguais ou diferentes para a artrite O objecto da presente invenção consiste ainda numa substância activa, na qual se encontra uma combinação das sequências de ADN de várias substâncias anti-inflamatórias iguais (A,A) ou substâncias anti-inflamatórias diferentes (A, B) . Para a expressão, p. ex. de várias sequências de ADN é preferencialmentc intercalado o ADNc de um "internai ribosom& entry site" (IRES) como elemento regulador.

56

IRES deste tipo foram descritos por Mountford e Smith (TIG 11, 179 (1995), Kaufman et al. , Nucl. Acids. Res. 1J3, 4485 (1991), Morgan et al., Nucl. Acids Res. 2_0, 1293 (1992) e Dirks et al., Gene 129, 247 (1993), Pelletier e Sonenberg, Nature 334, 320 (1988), Sugitomo et al., BioTechn. 12, 694 (1994).

Assim, o ADNc da sequência IRES do vírus da polio (posição £ 140 a £ 630 do UTR 5' (Pelletier e Sonenberg, Nature 334, 320 (1988) ) pode ser utilizado para a acoplagem do ADN da substância anti-inflamatória A (na extremidade 3') com o ADN da substância anti-inflamatória B (no terminal 5').

Uma substância activa deste género apresenta, conforme a combinação, um efeito aditivo (A+A, A+Bi) ou sinergético no sentido da presente invenção. 7.4 Selecção do ligando para artrite

Como ligando para vectores virais e não virais, por exemplo nos conjugados de polilisina-ligando, são preferidas substâncias que se ligam à superfície da células sinoviais. Entre estas contam-se anticorpos ou fragmentos de anticorpos monoclonais ou pol i r.1 onai s, que r.om os seus domínios variáveis se ligam a estruturas de membrana de células sinoviais ou células inflamatórias, que são, por exemplo vimentina (Miettinen et al., Am. J. Pathol. 117, 18 (1984)) fibronectina (Wojciak et al., Clin. ·Εχρ. Immunol. jK3, 108 (1993))

Entre estes contam-se também anticorpos ou fragmentos de anticorpos monoclonais ou policlonais que se ligam ao receptor Fc com os seus domínios constantes (Rojanasakul et al., Pharm. Res. 11, 1731 (1994)).

Os anticorpos monoclonais de murino utilizam-se de preferência sob forma humanizada. A humanização é realizada da 57

forma descrita por Winter et al., (Nature 349, 293 (1991) e Hoogenbooms et al., (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 3_6, 19 (1993). Fragmentos de anticorpos são preparados conforme o estado da técnica, por exemplo da forma descrita por Winter et al., (Nature 349, 293 (1991) e Hoogenboom et al., (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993) ou Huston et al., Int. Rev. Immunol. 1_0, 195 (1993).

Entre estes contam-se ainda todas as substâncias activas que se ligam a estruturas de membrana ou a receptores de membrana de células sinoviais. Por exemplo, contam-se entre estas, citoquinas ou factores de crescimento ou fragmentos destes ou sequências parciais destes que se ligam a receptores expressos por células sinoviais como por exemplo IL-l-RA, TNFa, IL-4 IL-6, IL-10, IGF e TGFp.

Além disso, fazem parte deste grupo ligandos cujo componente essencial é manose de cadeia terminal, que se liga a receptores manose-6-fosfato em macrófagos (Perales et al., Eur. J. Biochem. 226, 255 (1994)). 7.5 Preparação da substância activa para a artrite a) Construção do promotor quimérico Timp-3-CDE-CHR-Inr 0 promotor de TIMP-3 humano (pos. ^ -463 a £ -2) ou variantes encurtadas (pos. £ -112 a £ -2 ou ^ -463 a £ -10 ou £ -112 a £,-10) são acoplados na sua extremidade 3' ao terminal 5' do módulo CDE-CHR-Inr (pos. ^ -20 a £ +121) do gene cdc25C humano (pos. ^ -20 a £ +121) (fig. 12). A acoplagem é realizada com auxilio de enzimas conhecidas do técnico e disponíveis no comércio. São utilizados vários fragmentos diferentes da sequência do promotor de TIMP-3 para (1) se poder utilizar um fragmento promotor o mais curto possível (numa transcrição o mais eficiente possível) e (2) excluir efeitos indesejáveis do iniciador de TIMP-3 (domínio junto a +1) na regulação por CDE/CHR. 58 b) Construção de um plasmídeo que contém o componente central da substância activa

As unidades de controlo da transcrição do módulo promotor de TIMP-3 quimérico, descritas em a) , são acopladas na sua extremidade 3' com o terminal 5' de um ADN que contém o domínio completo que codifica para o antagonista do receptor de IL-1 de 152 ácidos aminados de comprimento (ADN pos. ^25 a ^ 557; Eisenberg et ai., Nature 343, 341 (190)). Este ADN contém igualmente a sequência de sinal necessária para uma secreção (25 ácidos aminados N-teminais) (fig. 12) . As unidades de controlo da transcrição e o ADN do antagonista do receptor de IL-1 são clonados para vectores plasmídicos pUC18/19 ou derivados de Bluescript, que podem ser utilizados directamente (Yovandich et al., Hum. Gene Ther. 6, 603 (1995)) ou em sistemas de dispersão coloidais para uma aplicação in vivo para transducção de células sinoviais. Em alternativa, as unidades de controlo da transcrição e o ADN do antagonista do receptor de IL-1 indicados podem ser transferidos para vectores virais ou outros vectores adequados e ser injectados. 8) Preparação de uma substância activa contra agentes infecclosos A substância activa pode ser preparada em duas formas basicamente diferentes - para a terapia de infecções virais e invasões parasitárias ou então para a profilaxia de doenças infecciosas virais. bacterianas ou parasitárias

Para a profilaxia de doenças infecciosas são utilizadas substâncias inoculantes. As possibilidades de preparação de substâncias de inoculantes activas por meios convencionais são limitadas (Brown, Int. J. Technol. Assessm, Health Care 10, 161 (1994), Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992), Arnon et 59

al., FASEB J. 6 3265 (1992)).

Em consequência, foi desenvolvida a tecnologia das vacinas de ADN. Porém, estas vacinas de ADN levantam questões de segurança e de efeitos secundários (Fynan et al., Int. J. Immunopharm. Y]_, 79 (1995), Donnely et al., Immunol. 2, 20 (1994)) .

As substâncias activas para a profilaxia de doenças infecciosas no sentido da presente invenção caracterizam-se pela sua segurança em elevado grau, graças à sua especificidade celular e regulação do ciclo celular. 8.1 Selecção da sequência activadora a) para a terapia de doenças infecciosas

Como sequência activadora seleccionam-se sequências do promotor de proteínas formadas essencialmente por bactérias ou parasitas ou escolhem-se sequências do promotor de vírus que transformam as células por eles infectadas e provocam a proliferação.

Entre estes vírus contam-se por exemplo HBV; HCV; HSV; HPV, HIV, EBV e HTLV.

As sequências do promotor dos vírus deste tipo foram descritas da seguinte forma:

*HBV (Sato et al., Annals Int. Med. 122, 241 (1995), Raney et al. , J. Gen. Virol. 15_, 2671 (1994), Raney et al. J. Virol. 6_6, 6912 (1992), Zhang et al., J. Virol. 6J_, 1472 (1993), Guo et al., J. Virol. 65, 6686 (1991))

*HCV (Matsuura et al-, Intervirol. 3]_, 114 (1994), Kumar et 60 <λ

/ t al., J. General Virol. 73, 1521 (1992), Kim et al., Jap. J. Med. Sei. Biol. 47, 211 (1994))

*HSV (Greco et al., J. Gen. Virol. 75, 1693 (1994),

Papavassiliou et al., J. Biol. Chem. 265, 9402 (1990))

*HPV (May et al., EMBO J. ^3, 1460 (1994), Thierry et al., EMBO J. 6, 3391 (1987))

*EBV (Chen et al., DNA and Cell Biol. 1_4, 205 (1995), Nonkwelo et al., Virol. 206, 183 (1995), Smith et al., J. Virol. £6, 706 (1992), Lear et al., J. Virol. 66, 7461 (1992),

Rooney et al., J. Virol. 66, 496 (1992))

*HTLV

(Ohtani et al., EMBO J. 6, 389 (1987)) HIV *HIV (Koken et al., Virol. 191, 968 (1992), Berghout et al., J. Virol. 66^, 139 (1992), Cherrington et al., EMBO J. 11, 1513 (1992), Rosen et al., Cell 41, 813 (1985)) A sequência LTR (long terminal repeat) de HIV serve de posição de ligação para factores transactivadores celulares que se encontram em muitas células e tecidos diferentes (Levy, AIDS 4_, 1051 (1990) ) . Fazem parte deste grupo os factores de

transcrição SP1, EBP-1, UBP-1, NF-KB, LBP-1 e CTN-NF (Garcia et al., EMBO J. 6, 3761 (1987)). Na extremidade 3' do LTR encontra-se a região transactivadora (TAR - transactivator region) onde se liga a proteína transactivadora (TAT) de HIV (Cullen, Cell ([3, 655 (1986), Selby et al., Genes and Dev. 3,

547 (1989) ) . Uma outra posição de ligação para a proteína TAT

foi descrita no domínio NF-KB do LTR-HIV (Taylor et al. , EMBO J. ]^1 3395 (1992)). A proteína transactivadora (TAT) do HIV pode aumentar a expressão do gene LTR do HIV em mais de cem vezes (Dayton et al., Cell 59, 283 (1989)). A região TAR é 61

assim parte integral da transcrição e tradução do LTR-HIV (Garcia et al., EMBO J. 8 765 (1989)). O LTR-HIV pode servir como promotor não só para os genes do HIV como também para genes relatores heterólogos e para estes últimos também sem a presença de TAT-HIV (Banerjee et al., Hepatol. 10, 1008 (1989), Virology 179, 410 (1990)). Constituem pontos de referência a activação desta actividade promotora por meio de factores de transcrição celular que se assemelham do ponto de vista funcional ao tat de HIV. Esta activação por meio de factores semelhantes a TAT celulares é geralmente menor do que por meio de TAT de HIV (Sodroski et al., Science 229, 74 (1985), Dayton et al., Cell £4, 941 (1986), Rosen et al., Nature 319, 555 (1986) ). Uma activação relativamente forte do LTR de HIV por meio de factores semelhantes a TAT celular pode porém ser observada em células hepáticas (Pizzela e Banerjee, DNA and Cell Biol. 13, 67 (1994)). TAR existe tanto como ADN como ARN. Estudos experimentais indicam porém que o TAR como ARN se liga a TAT por meio da sua estrutura secundária e é funcionalmente activo (Roy et al., J. Virol £4, 1402 (1990) ) , isto é, liga-se ao ADN do promotor correspondente e activa-o (Berkhout et al., Cell 62, 757 (1990)). O TAR é, quando principal, apenas mocieradamente activo ligado a um promotor heterólogo (Maesing et al., Cell 4_8, 691 (1987) , Berkhout et al., Cell &2, 757 (1990)), além disso um funcionamento óptimo do TAR só é possível no caso de vizinhança directa da sequência de nucleótidos do promotor LTR-HIV limítrofe do terminal 5' de TAR, em especial a região de ligação NF-KB/SP1 (Berkhout et al., Cell 62, 757 (1990)).

No caso do HIV utiliza-se, assim, toda a sequência LTR, incluindo a sequência TAR (posição £ -453 a £ +80, Rosen et al., Cell 813 (1985) como promotor específico do vírus. c) para a profilaxia de doenças infecciosas

Como sequência activadora devem-se escolher sequências 62 promotoras dos genes de proteínas que são formadas especialmente em macrófayos activados e linfócitos activados. Exemplos de proteínas deste tipo e dos seus genes são indicados na secção 6.1. 8.2 Sâlecção da substância activa a) para a terapia de doenças infecciosas

Como substância activa deve-se escolher o ADN de uma proteína que apresente actividade citostática, citotóxica ou antiviral. Foram já indicados exemplos de proteínas citotóxicas ou citostáticas na secção 6.2 e a g) . A escolha de uma enzima (vide secção 6.2.g) implica a administração do precursor de uma substância antiviral citotóxica ou antiparasitária separado por esta enzima.

As substâncias activas para proteínas antivirais, no sentido da presente invenção, são também citoquinas e factores de crescimento com actividade antiviral. Entre estes contam-se, por exemplo as sequências de ADN das seguintes substâncias activas: - IFNoc. (Henco et al., J. Mol. Biol. 185, 227 (1985), Pestka et al., Ann. Rev. Biochem. 56i, 727 (1987), Weissmann et al., Phil. Trans. R. Soc. Lond. B299, 7 (1982), Goeddel et al., Nature 290, 20 (1981)) - IFNfl (Sen et al., J. Biol. Chem. 267 5017 (1992), Mark et al. EP 192 811, EP 234 599. US 45 88 585) - IFN-γ

(Gray et al-, Nat.nre 7 95, 503 (1982), Yip et al., PNAS USA 7_9' 1820 (1982), Rinderknecht et al., J. Biol.

Chem. 259, 6790 (1984)) 63

tnfP (Gray et al., Nature 312, 721 (1984), Li et al., J.

Immunol. 138, 4496 (1987), Aggarwal et al., J. Biol.

Chem. 260, 2334 (1985)) - TNFa. (Beutler et al., Nature 320, 584 (1986), Kriegler et al., Cell 53, 45 (1988) IL-1 (Furntani et al. , Nucl. Acids Res. 14, 3167 (1986) , Lafage et al • t Blood 73, 104 (1989), March et al., Nature 315, 641 (1985) , Bensi et al., Gene 52, 95 (1987) , Auron et ai. , PNAS 81, 7907 (1984), Clark et al., Nucl. Acids Res. 14_., 7897 (1986))

- TGFB (Massague, Ann. Rev. Cell Biol. 6, 597 (1990), Kondiah et al., J. Biol. Chem. 265, 1089 (1990), Garnier et al., J. Molec. Biol. 120, 97 (1978))

Como substância activa no sentido da presente invenção podem também ser utilizadas sequências de ADN de proteínas de fusão entre as citoquinas, factores de crescimento ou a parte extracelular dos receptores indicados por um lado e por outro a parte Fc da imunoglobulina humana. Este tipo de sequências de ADN e a sua preparação foram descritas na EP 0 464 633 Al.

Além disso, é substância activa no sentido da presente invenção a sequência de ADN de um anticorpo de uma especificidade que inactiva o respectivo vírus ou o seu fragmento que contém VH e VL ou o seu fragmento VH e VL ligado através de um adaptador, preparada por exemplo por meio da metodologia descrita por Marasco et al., (Proc. Natl. Acad. Sei. Usa 9(), 7889 (1993)). Os exemplos dos anticorpos de uma especificidade deste tipo contra vírus são indicados na secção 8.4. 64

Além disso é uma substância activa no sentido da presente invenção a sequência de ADN de uma proteína de ligação Rev. Estas proteínas ligam-se ao ARN-Rev e inibem as fases pós--transcrição dependentes de Rev da expressão genética de retrovírus. Constituem exemplos de proteínas de ligação Rev: - RBP9-27 (Constantoulakis et al., Science 259., 1314 (1993), Reid et al., PNAS USA 86, 840 (1989))

- RBP1-8U (Kerr e Stark, FEBS Lett. 285 , 194 (1991), Friedman et al., Cell 38, 745 (1984))

- RBP1-8D (Lewin et al., Eur. J. Biochem. 199, 417 (1991)) - Pseudogene de RBP1-8 (Lewin et al., Eur. J. Biochem. 199 , 417 (1991)). b) para a profilaxia de doenças infecciosas

Escolhe-se como substância activa o ADN de uma proteína formada pelo agente infeccioso, a qual, por meio de uma reacção imunológica, isto é, através da formação de anticorpos e/ou por meio de linfócitos T citotóxicos, causam a neutralização e/ou morte do agente. Este tipo de antigénios de neutralização são já utilizados como antigénios de inoculação (vide resumo de Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992)). Os exemplos de sequências de ADN que codificam para antigénios de neutralização são conhecidos por meio dos seguintes trabalhos:

Antigénio do vírus Influenza A (Ulmer et al., Science 259 , 1745 (1993), Robinson et al., Vaccine 1Λ, 957 (1993), Fynan et al., Int. J.

Immunopharmac. 17_, 79 (1995))

- Antigénio de HIV 65

(Wang et al., PNAS USA 90, 4156 (~ 993))

Antigénio do vírus Tollwut (Donnelly et al., Immunol. 2/1, 20 (1994))

Antigénio de HSV (Herpes Simplex Vírus) (Fleckenstein et al., Nature 274, 57 (1978))

Antigénio de RSV (Respiratory Syncytial Virus) (Du et al., Bio/Tech. 12, 813 (1994), Hall, Science 265, 1393 (1993))

Antigénio do vírus Parainfluenza (Du et al., Bio/Techn. 12, 813 (1994)) Antigénio de Rotavirus (Albert et al., J. Clin. Microbiol. 25 183 (1987), Anderson et al., J. Infect. Dis. 153, 823 (1986), Battaglia et al., J. Infect. Dis. 155, 140 (1987), Chanock et al., J. Infect. Dis. 148, 49 (1983), Dyall-Smith et al., J. Virol. 38, 1099 (1981), Glass et al., Science 265, 1389 (1994)) Antigénio de VZV (Varizella Zoster Virus) (Straus et al., Ann. Intern. Med. 109, 438 (1988), Gershon, Pediatr. Infect. Dis. 2, 171 (1991), Kinchington et al., J. Virol. 64_j_ 4540 (1990) )

Antigénio de CMV (Citomegalovírus) (Plotkin, Science 265, 1383 (1994))

Antigénio do vírus Masern (Katz e Kellin, Science 265, 1391 (1994))

Antigénio de HPV (vírus do papiloma humano) (Tindl eFrazer, Curr. Topics Microbiol. Immunol. 186, 217 (1994))

Antigénio de HBV (vírus da hepatite B) (Valenzuela et al., Nature 280, 815 (1979), Heerman et 66

al., J. Virol. 52, 396 (1984))

Antigénio de HCV (vírus da hepatite C) (Cerny et al., Curr. Topics Microbiol. Immunol. 189, 169 (1994), Esteban et al., Progr. Liver Dis. 10, 253 (1992) , Jung et al., Eur. J. Clin. Invest. 2£, 641 (1994))

Antigénio de HDV (vírus da hepatite D) (Iwarson, Scand. J. Infect. Dis. 2Λ, 129 (1992),

Consolo et al., Nephron. 61, 251 (1992))

Antigénio de HEV (vírus da hepatite E) (Iwarson, Scand. J. Infect. Dis. 2_4, 129 (1992),

Consolo et al., Nephron. j61, 251 (1992))

Antigénio de HAV (vírus da hepatite A) (d'Hondt, Vaccine 10, 48 (1992), Andre, J. Infect. Dis. 171, 33 (1995), Lemon et al., Vaccine 10, 40 (1992),

Melnick et al., Vaccine JJ), 24 (1992), Flehmig,

Baillieres Clin. Gastroenterol. £, 707 (1990))

Antigénio do vibrião do cólera (Levine e Kaper, Vaccine ΊΛ, 207 (1993))

Antigénio de Borrelia burgdorferi (Schaible et al., Immunol. Letters 36, 219 (1993), Wallich et al., Lab. Med. \J_, 669 (1993))

Antigénio de Helicobacter pylori (Crabtree et al., Lancet 338, 332 (1991), Blaser, J.

Infect. Dis. 161, 626 (1990), Cover e Blaser, J. Biol. Chem. 267, 10570 (1993), Cover et al., Infect. Immunol. 58, 603 (1990), Dunn et al., J. Biol. Chem. 265, 9464 (1990), Dunn a tal., Infect. Immunol. ^0, 1946 (1992), Lage et al., Acta Gastroenterol. Belg. 5jj (supl.), 61 (1993) , Moblcy ct al., Scand. J. Caotroint. 2_6 (3upl. 187), 39 (1991))

Antigénio da malária 67

r->7 (Nussenzweig e Long, Science 265, 1381 (1994), Maurice, Science 267, 320 (1995), Enders et al., Vaccines 1_0, 920 (1992), Knapp et al., Infect. Imm. 60, 2397 (1992))

Faz parte também das substâncias activas deste género, no sentido da presente invenção, o ADN de um anticorpo anti--idiotípico ou os seus fragmentos que se ligam a antigénios, cujas estruturas de ligação a antigénios apresentam "complementary determining regions", cópias da estrutura proteica ou de hidratos de carbono do antigénio de neutralização do agente infeccioso.

Este tipo de anticorpos anti-idiotípicos podem substituir especialmente os antigénios de hidratos de carbono no caso de agentes infecciosos bacterianos.

Este tipo de anticorpos anti-idiotípicos e os seus produtos de cisão foram descritos resumidamente por Hawkins et al., (J. Immunother. 14^ 273 (1993)) e Westerink e Apicella (Springer Seminars in Immunopathol. 1_5, 227 (1993)). 8.3 Combinação de substâncias activas iguais ou diferentes para a terapia ou profilaxia de doenças infecciosas 0 objecto da presente invenção consiste ainda numa substância activa, na qual se encontra uma combinação das sequências de ADN de substâncias activas iguais (A, A) ou substâncias activas diferentes (A,B). Para a expressão de várias sequências é preferencialmente intercalado o ADNc de um "internai rlbosome e/itry site" (IRES) como elemento regulador. IRES deste tipo foram descritos por Mountford e Smith (TIG 11, 179 (1995), Kaufman et al., Nucl. Acids. Res. 1_9, 4485 (1991), Morgan et al., Nucl. Acids Res. 20, 1293 (1992) e Dirks et al., Gene 128, 247 (1993), Pelletier e Sonenberg, Nature 334, 320 (1988), Sugitomo et al., BioTechn. 12, 694 (1994). 68

Assim, ο ADNc da sequência de IRES do vírus da polio (posição ^ 140 a ^ 630 do UTR 5' (Pelletier e Sonenberg, Nature 334, 320 (1988)) pode ser utilizado para a acoplagem do ADN da substância virai A (na extremidade 3') com o ADN da substância virai B (no terminal 5')·

Uma substância activa deste género apresenta, conforme a combinação, um efeito aditivo (A+A, A+Bi) ou sinergético no sentido da presente invenção.

Assim, podem-se combinar entre si duas substâncias activas antivirais iguais ou duas substâncias activas antivirais diferentes, por exemplo, para a terapia de doenças infecciosas.

No caso da profilaxia de doenças infecciosas, podem ser combinadas entre si várias substâncias activas que codificam para diferentes antigénios de um agente infeccioso ou de diferentes agentes infecciosos. Além disso a substância activa que codifica para o antigénio de um agente infeccioso pode ser combinada com a substância activa que codifica para uma citoquina ou para um receptor de citoquina.

As citoquinas ou os receptores de citoquinas que se formam, assim, em simultâneo com os antigénios de agentes infecciosos (após injecção da substância activa) podem influenciar o tipo e intensidade da reacção imunológica que se desenvolve.

As sequências de ADN para citoquinas e receptores de citoquinas, as quais intensificam a reacção imunológica humoral, foram já descritas em 6.2.d), enquanto que as destinadas ao reforço da reacção imunológica celular foram descritas em 6.2.a) e 6.2.c). 69

JX v? / -.Λ'"'? /

As sequências de ADN para citoquinas que reforçam a totalidade da reacção imunológica são, por exemplo: - IL-lot (Fenton, Int. J. Immunopharm. .14, 401 (1992), Furntani et al., Nucl. Acid3 Reo. 14^ 3167 (1986), Lafage et al., Blood 73, 104 (1989), March et al., Nature 315, 641 (1985)) - IL-Ιβ

(Bensi et al., Gene 52y 95 (1987), Auron et al., PNAS 81, 7907 (1984), Clark et al., Nucl. Acids Res. 14, 7897 (1986)) - IL-2 (Fletscher et al., Lymphok. Res. 6, 45 (1987), Matsui et al., Lymphokines 12, 1 (1985), Tanaguchi et al., Nature 302, 305 (1983))

- GM-CSF (Gough et al., Nature 309, 763 (1984), Nicola et al., J. Biol. Chem. 254, 5290 (1979), Wong et al., Science 228, 810 (1985)) 8.4 Selecção dos ligandos para agentes infecciosos

Para a terapia de doenças infecciosas, fazem parte dos ligandos anticorpos ou fragmentos de anticorpos orientados para o agente infeccioso. Por exemplo, aqueles que, no caso de uma infecção virai, exprimem antigénios de vírus na membrana de células infectadas pelo dito vírus.

Este tipo de anticorpos foram descritos, por exemplo, para as células infectadas com os seguintes vírus: * HBV (Shonval et al., PNAS USA 7_S' 650 (1982),

Intercell. Intracell. Comm. 2, 221 (1986), Klein et al. , Virus Genes 5, 157 (1991)) 70

* HCV (Takahashi et al., Virol. 191, 431 (1992)) * HSV (Sanchez-Pescador et al., J. Infect. dis. 166, 623 (1992)) * HPV (Doorbar et al., Virol. 187, 353 (1992)) * HIV (Nishino et al., Vaccine 10., 677 (1992)) * EBV (Thorley-Lawson et al., Cell 3J3, 415 (1982)) * HTLV (Robert-Garoff et al., J. Virol. 53, 214 (1985), , Matsushita et al., J. Virol. 62, 2107 (1988)).

Além disso, fazem também parte dos ligandos anticorpos ou fragmentos de anticorpos monoclonais ou policlonais que se ligam com os seus domínios constantes a FC-γ ou a receptores de FC de células imunológicas (Rojanasakul et al., Pharm. Res. 11, 1731 (1994)).

Os anticorpos monoclonais de murino são utilizados preferencialmente sob forma humanizada. A humanização é realizada do modo apresentado por Winter et al. (Nature 349, 293 (1991)) e Hoogenbooms et al., (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993)). Os fragmentos de anticorpos são preparados conforme o estado da técnica, por exemplo, do modo descrito por Winter et al. (Nature 349, 293 (1991)) e Hoogenbooms et al., (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. ^36, 19 (1993)), Girol (Mol.

Immunol. 2_8, 1379 (1991), e Huston et al., (Int. Rev. Immunol. 10, 195 (1993).

Contam-se ainda entre os ligandos todas as substâncias que se ligam a estruturas de membrana ou a receptores de membrana na superfície de células infectadas por vírus. Por exemplo, contam-se entre estas factores de crescimento como citoquinas, EGF, TGF, FGF ou PDGF ou fragmentos seus ou sequências parciais que se ligam a receptores expressos por células deste tipo.

Entre estes contam-se ainda ligandos que se ligam a estruturas de membranas de células, que são selectivos de 71

determinados tecidos. Entre estes contam-se, por exemplo:

Ligandos

Estrutura de membrana Células de tecidos

Receptores de FC-γ Imunoglobulina G

Receptor de asialoglicoproteína

Receptor de transferrina Receptor de insulina

Receptor dc manooe 6-fosfato

Asialoorosomucóide Neoglicoproteína Galactose transferrina

Insulina

Manose Células hepáticas Fígado, outras células de tecidos Fígado, outras células de tecidos Macrófagos em baço, fígado, pulmões, outros tecidos Sistema reticuloendotelial, outros tecidos

Estes ligandos e estruturas de membrana foram descritos resumidamente por Perales et al., Eur. J. Biochem. 226, 255 (1994) .

Para a profilaxia de doenças infecciosas são adequadas como ligandos todas as substâncias que se ligam a estruturas de membrana de macrófagos e/ou linfócitos. Este tipo de ligandos foram já descritos na secção 6.4. 8.5 Selecção dos ligandos para uma substância activa destinada à profilaxia de agentes infecciosos

Como ligandos para vectores virais e não virais, por exemplo em dispersões coloidais ou em complexos de polilisina--ligando, são preferidas substâncias que se ligam especifica-mente à superfície de macrófagos e/ou linfócitos. Os ligandos deste tipo foram já descritos na secção 6.4.

Estes ligandos são componente dos vectores. No sentido da presente invenção podem-se, porém, misturar ligandos aos vectores. Para esta mistura utilizam-se especialmente ligandos que estejam em posição de activar macrófagos e/ou linfócitos. Entre estes contam-se, por exemplo: - Citoquinas como por exemplo IL-la, IL-Ιβ, IL-2, IL-3, 72

IL-4. IL-5, IL-6, IL-IO, IL-12, IFN-γ, GM-CSF ou M-CSF (Hadden, Int. J. Immunopharm. 3ç6 703 (1994)) - Receptores de citoquina solúveis, como por exemplo o receptor de IL-4.

Em alternativa ou adicior.almente podem-se misturar adjuvantes. Entre estes contam-se, por exemplo: - adjuvantes sintéticos (Revisão em: Parant, Int. J. Immunopharm. 26, 445 (1994), Cernescu, Int. J. Immunopharm. ]J5, 369 (1994)) -lipossomas (Revisão em: Alving, J. Immunol. Methods 140, 1 (1991) e BBA 1113, 307 (1992), Sato e Sanamoto, Prog. Lipid. Res. 31, 345 (1992))

- lipossacáridos ou lípido A (Revisão em: Alving, Immunobiol. 187, 430 (1993)). - polimeros biodegradáveis, ccno por exemplo * poli-(DL-lactideo-Cc-glicólido) (Eldridge et al., Infect. Immun. 59_, 2978 (1991)) * pseudolátices (Coffin e McGiuity, Pharmsceut. Re3 . 9j_ 200 (1992)) - muramildipeptídeos (Morin et al., Int. J. Immuncpharm. 1_6, 451 (1994)).

Além disso, no sentido da presente invenção, misturam-se substâncias aos vectores que os tornam adequados para uma absorção através da mucosa e, por exemplo, para uma 'imunização por via oral.

Este tipo de substâncias e formulações foram apresentadas de forma resumida por Walker [Vaccitne 12, 387 (1994)). 8.6 Preparação da substância activa contra infecções virais A preparação da substância activa de acordo com a presente invenção é descrita de forma mais pormenorizada por meio dos 73

seguintes exemplos: a) Construção do promotor quimérico HIV-LTR-TAR-CDE-CHR-Inr 0 promotor HIV-LTR-TAR (posição ^ -453 a ^ +80, (Rosen et al., Cell ££, 813 (1985)) é acoplado na sua extremidade 3' ao terminal 5' do módulo CDE-CHR-Inr do gene cdc25C (posição á -20 a > +121, Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)) (fig. 13). A acoplagem é realizada com auxilio de enzimas conhecidas do especialista e disponíveis no comércio. b) Construção de um plasmídeo que contém o promotor quimérico HIL-LTR-TAR-CDE-CHR-Inr no componente central da substância activa A unidade de transcrição do módulo promotor quimérico é acoplada na sua extremidade 3' ao terminal 5' de um ADN que contém o domínio de codificação completo do interferão a-1 (posição ^ -69 a ^ + 501, (Streuli et al., Science 209, 1343 (1980) ) . Este ADN contém também a sequência de sinal necessária para uma secreção. As unidades de controlo de transcrição e o ADN do interferão a-1 são clonados para pUC19/19 ou vectores de plasmídeos derivados de Bluescript, que podem ser utilizados directamente ou em sistemas de dispersões coloidais para uma aplicação in vivo. Em alternativa os genes quiméricos podem ser transferidos para vectores virais ou outros vectores adequados e podem ser injectados. c) Construção de um plasmídeo que contém dois genes para substâncias activas A unidade de transcrição HIV-LTR-TAR-CDE-CHR-Inr descrita em a) é acoplada na sua extremidade 3' com a extremidade 5' do ADN do interferão a-1 (posição £ -69 a £ +501; Streuli et al., Science 209, 1343 (1980)). A acoplagem é realizada com auxílio de enzimas conhecidas do especialista e disponíveis no comércio. 74

A extremidade 3' do ADN do interferão oc-1 é por conseguinte acoplada à extremidade 5' do ADNc do internai ribosome entry site (posição á 140 a £ 630; Pelletier e Sonenberg, Nature 334, 320 (1988)) e excluindo a sua extremidade 3' é acoplada com a extremidade 5' do ADN da proteína de ligação Rev (RbP9-27 (posição <. 1 a ^ 378, Reid et al., PNAS USA 86, 840 (1989)) (cf. Fig 13). Esta substância activa preparada deste modo é subsequentemente clonada em pucl8/19 ou em vectores de plasmideo derivados de Bluescript, que podem ser utilizados directamente ou em sistemas de dispersões coloidais para uma aplicação in vivo. Em alternativa, os genes quiméricos podem ser transferidos para vectores virais ou outros vectores adequados e podem ser injectados. 9) Preparação de uma substância activa contra leucemias (e linfomas) 9.1 Selecção da sequência activadora para leucemias

Como sequência activadora (UAS = upstream activator sequence) encontra-se uma sequência de nucleótidos (sequência do promotor ou intensificadora) com a qual interagem os factores de transcrição, formados ou activos nas células afectadas pela leucemia.

No sentido da presente invenção, fazem porém parte das sequências activadoras preferidas sequências reguladoras dos genes ou elementos de genes que codificam em especial para as proteínas formadas nas células afectadas pela leucemia.

Entre estas contam-se, por exemplo, as sequências do promotor, indicadas na literatura apresentada em seguida, de genes que codificam para as seguintes proteínas: c-myc (Bentley et al., Mol. Cell. Biol. 6 3481 (1986), Lang 75

et al., Oncogene 6, 2067 (1991), Meulia et al., Mol.

Cell. Biol. 12^ 4590 (1992), Desjardins, Mol. Cell.

Biol. 13, 5710 (1993)) - HSP-70 (Taira et al., BBA 1130, 166 (1992)) ' - bcl-l/ciclina D-l (Herber et al., Oncogene _9, 1295 (1994)) - bcl-2 (Young et al., Mol. Cell. Biol. 13, 3686 (1993)) - IL-6 (Droogmans et al., DNA-Sequence _3' 115 (1992), Mori et al., Blood £4, 2904 (1994), Liberman et al., Mol. Cell. Biol. 10, 2327 (1990), Ishiki et al., Mol. Cell. Biol. 10, 2757 (1990)) - IL-10 (Kim et al., J. Iinmunol. 148 , 3618 (1992), Kube et al., Cytokine 1_, 1 (1995), Platzer et al., DNA-Sequence £, 399 (1994), Kube et al., Cytokine 1_, 1 (1995))

- NFu, TNFP (Sidhu et al., Pharmac. Ther. 5T_., 79 (1993), Vilcek et al., J. Biol. Chem. 266, 7313 (1991), Tahashiba et al., Gene 131, 307 (1993), Nedwin et al., Nucl. Acids Res. 13, 6361 (1985), Paul et al., J. Virol. 64' 5412 (1990), Shakhov et al., J. Exp. Med. 171, 35 (1990), van der Ake et al., Nucleic Acids Res. 21, 5636 (1993)) .

Além disso, fazem parte deste conjunto as sequências de ligação para proteínas formadas a partir dos seguintes genes: - HOX-11 (Dear et al., PNAS USA 90, 443’1990)) 76

- BCR-Abl (Zhu et al., Nucl. Acid Res. 1J), 7119 (1990), shah et al. Mol. Cell. 11, 1854 (1991)) - E2A-PBX-1 (Monica et al., Mol. Cell. Biol. 14, 8304 (1994)

Numata et al., Leukemia 1_, 1441 (1993), von Di j k et al., PNAS USA 90, 6061 (1993))

- PML-RARA (Promyelocytic Leukemia - Retinoic Acid Receptor) (Potter et al., Leukemia 1_, 1302 (1993), Yoshida et al.. Genes, Chromosomes Câncer 1_2, 37 (1995), Brand et al., Nucl. Acids Res. 3J3, 6799 (1990)) c-myc

As proteínas c-myc ligam-se e activam multímeros da sequência de nucleótidos designada por Caixa Myc E (5'-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3') (Blackwood e Eisenman, Science 215, 1211 (1991)) 9.2 Selecção da substância activa para leucemias A substância activa no sentido da presente invenção é uma sequência de ADN cuja proteína expressa inibe a proliferação de células, especialmente de células afectadas pela leucemia. Fazem parte destes inibidores do ciclo celular, por exemplo, as sequências de ADN de proteínas e enzimas citostáticas e citotóxicas, tal como foi já descrito na secção 6.2 e a ç[) .

Como inibidor do ciclo celular deve-se ainda considerar uma sequência de ADN que exprime uma proteína que apresenta directa ou indirectamente uma acção citostática ou citotóxica sobre a leucemia. Entre as proteínas deste género contam-se: IL-la, (Fenton, Int. J. Immunopharm. 1_4, 401 (1992), Furntani 77

et al., Nucl. Acids Res. L4, 3167 (1986), Lafage et al., Blood T3, 104 (1989), March et al., Nature 315, 641 (1985)) IL-Ιβ (Bensi et al., Gene 52, 95 (1987), Auron et al., PNAS 8^, 7907 (1984), Clark et al., Nucl. Acids Res. 14, 7897 (1986)) IL-2 (Fletscher et al., Lymphok. Res. 6, 45 (1987), Matsui et al-, Lymphokines 12, 1 (1985), Tanaguchi et al., Nature 302, 305 (1983)) IL-4 (Lee et al., PNAS 8_3, 2061 (1986); Paul, Blood 77, 1859 (1991) , Yokota et al., PNAS USA 53, 5894 (1986), von Leuven et al., Blood 73, 1142 (1989), Arai et al., J. Immunol. 142, 274 (1989)) IL-10 (Vieira et al., PNAS USA 8£, 1172 (1991), Moore et al.,

Science 248, 1230 (1990), Kim et al., J. Immunol. 148, 3618 (1992) ) IL-12 (Gubler et al., PNAS USA 88, 4143 (1991), Wolf et al., J.

Immunol. 146, 3074 (1991), Kobayashi et al., J. Exp. Med. 170, 827 (1989), Gately et al., J. Immunol. 147, 874 (1991), Schoenhaut et al., J. Iuuuunol. 148, 3433 (1992),

Interferões como, por exemplo * IFNa (Henco et al., J. Mol. Biol. 185, 227 (1985), Pestka et al., Annu. Rev. Biochem. 56, 727 (1987), Weissmann et al., Phil. Trans. R. Soc. Lond. B299, 7 (1982), Goeddel et al., Nature 290, 20 (1981)) * IFNP (Sen et al., J. Biol. Chcm. 267, 5017 (1992), Mark et al. EP 192.811, EP 234.599, US 4588.585 * IFN-y(Gray et al., Nature 295, 503 (1982), Yip et al., 78 '7

PNAS USA 7_i/

Leukemia inhibitory Factor (LIF) (Metcalf, Int. J. Cell Clon. 9, 85 (1991), Sutherland et al., Leuk. 3, 9 (1989), Gough et al., PNAS USA 85, 2623 (1988), Gough et al., Ciba Found. Symp. 167, 24 (1992), Stahl et al., J. Biol. Chem. 265, 8833 (1990), Rathjan et al., Cell 62, 1105 (1990))

- TNF (Porter, TiBTech 9, 158 (1991); Sidhu et al., Pharmac. Ther. 57, 79 (1993)) em especial * TNFa. (Beutler et al., Nature 320, 584 (1986), Kriegler et al., Cell 53 45 (1988)) * TNFP (Gray et al., Nature 312, 721 (1984), Li et al., J.

Iramunol. 138, 4496 (1987), Aggarwal et al., J. Biol. Chem. 250, 2334 (1985)) - TGFb (Kehrl et al., J. Immunol. 137, 3855 (1986), J. Exp. Med. 163, 1037 (1986), Ten Dikje et al., PNAS USA 85, 4715 (1988), Derynck et al., EMBO J. 7, 3737 (1988), Massague,

Anil. Rev. Cell Biol. 6, 597 (1990), Kondiah et al., J. Diol.

Chem. 265, 1089 (1990), Garnier et al., J. Mol. Biol. 120, 97 1978))

Oticostatin M (Brown et al., J. Immunol. 147, 2175 (1991); Grove et al., J. Biol. Chem. 266, 18194 (1991); Hamilton et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 180 652 (1991), Malik et al-, Mol.

Cell. Biol. 9, 2847 (1989), Kallstad et al., J. Biol. Chem. 266, 8940 (1991)

Como substância activa no sentido da presente invenção podem-se também utilizar sequências de ADN de proteínas de fusão entre as citoquinas, factores de crescimento ou a parte extracelular dos receptores indicados, por um lado e a parte Fc da imunoglobulina humana por outro. Este tipo de sequências de 79

ADN e a sua preparação são descritas na EP 0464 633 AI. A selecção do inibidor do ciclo celular depende do tipo de leucemia. - Assim, a IL-4 e a TT.-6 têm um efeito especialmente anti--poliferativo em B-CLL (von Kooten et al., Leuk. Lymph. 12, 27 (1993)) . - 0 TGFp inibe de preferência a proliferação de linfócitos (Kehrl et al., J. Immunol. 143, 1868 (1989)). - Os TNF, em especial o TNFcc, inibe células afectadas pela leucemia mielocitica (Porter FEMS Microbiol. Immunol. 64, 193 (1990)) e células de linfoma (Sidhu et al.,

Pharm. Therp. 52, 79 (1993)). - O IFN-γ inibe células de mieloma (Portier et al., Blood 81, 3076 (1993)) . - O IFN inibe a leucemia das células capilares (Gutterman, PNAS USA 91, 1198 (1994)), tal como o linfoma não de

Hodgkin (Solal-Celigny et al., New Engl. J. Med. 329, 1608 (1993), CLL, T-CLL, CML e ALL (Gutterman, PNAS USA 91, 1198 (1994), Dorr, Drugs 4j>f 177 (1993)). - 0 LIF inibe a proliferação de células de CML (Metcalf, Int. J. Cell Clon. 9 95 (1991)). - A IL-10 induz a apoptose em células de B-CLL (Fluchinger et al., J. Exp. Med. 179, 91 (1994)).

Por outro lado, especialmente as IL-1, IL-2, IL-4 e IL-12 ou os interferões provocam uma reacção inflamatória, por meio da activação de células imunitárias vizinhas das células afectadas pela leucemia transduzidas (Fenton et al., Int. J. Immunopharm. 14_, 401 (1992), Janssen et al., Câncer Immunol. 80

Immunother. 39, 207 (1994), Kirchner, DMW 111, 64 (1986), Paul, Blood 77, 1859 (1991), Gateley et al., Câncer Invest. 1Λ, 500 (1993)), a qual mata as células afectadas pela leucemia.

No entanto, constitui um requisito para a utilização da sequência de ADN de uma citoquina introduzida como inibidor do ciclo celular na substância activa o facto de ter sido verificado antes da administração da substância activa se para as células afectadas pela leucemia de cada paciente o inibidor do ciclo celular escolhido não constitui um factor de crescimento. 9.3 Combinação de substâncias activas iguais ou diferentes para leucemias 0 objecto da presente invenção consiste ainda numa substância activa, na qual se encontra uma combinação de dois inibidores do ciclo celular iguais (A,A) ou dois inibidores do ciclo celular diferentes (A,B). Para a expressão de ambas as sequências é preferencialmente intercalado o ADNc de um "internai xibosome entry site" (IRES) como elemento regulador.

IRES deste tipo foram descritos por Mountford e Smith (TIB 11, 179 (1995), Kaufman et al., Nucl. Acids. Res. 1_9, 4485 (1991), Morgan et al., Nucl. Acids Res. 20, 1293 (1992) e Dirks et al., Gene 128, 247 (1993), Pelletier e Sonenberg, Nature 334, 320 (1988), Sugitomo et al., BioTechn. 12, 694 (1994).

Assim, o ADNc da sequência IRES do virus da polio (posição £ 140 a ^ 630 do UTR 5' ) pode ser utilizado para a acoplagem do 81

ADN do inibidor do ciclo celular A (na extremidade 3') e do ADN do inibidor do ciclo celular B (no terminal 5')·

Uma substância activa deste género apresenta, conforme a combinação, um efeito aditivo (A+A, Α+Βχ) ou sinergético no sentido da presente invenção. 9.4 Selecção dos ligandos para leucemias

Como ligandos para vectores virais ou vectores não virais, por exemplo em conjugados de polilisina-ligandos, são preferidas substâncias que se ligam à superfície de células afectadas pela leucemia. Entre estes contam-se os anticorpos ou fragmentos de anticorpos orientados contra estruturas de membrana de células afectadas pela leucemia. Um grande número de anticorpos monoclonais deste tipo foi já descrito para processos de diagnóstico e terapêuticos (revisões em Kristensen, Danish Medicai Bulletin _41, 52 (1994), Schranz,

Therapia Hungarisa 388, 3 (1990), Drexler et al., Leuk. Res. 10, 279 81986), Naeim, Dis. Markers Ί_, 1 (1989), Stickney et al., Current Op. Oncol. 4_ 847 (1992), Drexler et al., Blut 57, 327 (1988), Freedman et al., Câncer Invest. 9, 69 (1991)).

Conforme o tipo de leucemia são apropriados como ligandos os seguintes anticorpos monoclonais ou os seus fragmentos de anticorpos de ligação a antigénios: Células Antigénio de Anticorpos monoclonais descrito por membrana

AML CD13 CD14 CD15

Kaneko et al., Leuk. Lymph. 1£, 219 (1994) Muroi et al., Blood 79, 713 (1992) Bali, Bone Marrow.Transplant. 3^ 387 (1988) Guyotat et al., Bone Marrow Transplant. 6, 385 (1990) Campos et al., Eur. J. Câncer 28, 37 (1992) 82 CD33 Jurcic et al. Leukemia 9, 244 (1995), Caron et al. Câncer 73, 1049 (1994) CAMAL Shellard et al., Exp. Hematol. 19, 136 (1991) Si a 1 nsyl -T.e Muroi et al., Blood 79, 713 (1992) B-CLL CD5 Kaminski et al., Câncer Treat. Res. 38, 253 (1988) Tassone et al. Immunology Lett. 39, 137 (1994) CDlc Orazi et al., Eur. J. Haematol. 47, CD23 28 (1991) Idiótipos e Schroeder et al., Immunol. Today isótipos da 15, 289 (1994) iiuuxiu- globulina da membrana T-CLL CD33 Imai et al., J. Immunol. 151, 6470 M38 (1993) Receptores de IL-2 Waldmann et al., Blood 82, 701 1993) Receptores células T ALL CALLA Morishima et al., Bone Marrow Transplant. 11, 255 (1993) CD19 Anderson et al., Blood 80, 84 (1993) Linfoma não Okazaki et al., Blood £1 84 (1993) de Hodgkin

Os anticorpos monoclonais de murino são preferencialmente utilizados sob forma humanizada. A humanização é realizada 83

segundo o modo descrito por von Winter et al. (Nature349, 293 (1991)) e Hoogenboom et al., (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993)) . Os fragmentos de anticorpos são preparados conforme o estado da técnica, por exemplo do modo descrito por von Winter et al. (Nature349, 293 (1991)) e Hoogenboom et al., (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, 19 (1993)) ou Huston et al., Int. Rev. Immunol. 10, 195 (1993).

Fazem ainda parte do conjunto dos ligandos todas as substâncias activas que se ligam a estruturas de membranas ou receptores de membranas de células afectadas por leucemia. Por exemplo, contam-se entre estes os factores de crescimento ou os seus fragmentos ou sequências parciais que se ligam a receptores exprimidos por células de leucemia.

Este tipo de factores de crescimento foram já descritos (Revisões em Cross et al., Cell 6£, 271 (1991), Aulitzky et al., Drugs 4j3, 667 (1994), Moore Clin, Câncer Res. JL, 3 (1995),

Van Kooten et al., Leuk. Lymph. 12^ 27 (1993)). - iFNa em linfomas não de Hodgin (Hiddemann et al., Blood Rev. £, 225 (1994))

- IL-2, especialmente em leucemias das células T (Waldmann, J. Nat. Câncer Inst. £1, 914 (1989),

Kreitmen et al., Int. J. Immunopharm. 1_4, 465 (1992)

- FGF em em leucemias monoc.itárias, mielóides, erit.róides e megacarioblásticas das células T (Armstrong et al., Câncer Res. _52, 2004 (1992) - TGFP em leucemias (Keller et al., J. Cell Biochem. 3^, 79 (1989))

Retinóides, p. ex. "retinoic acid (ácido retinóico)" no caso de leucemia promielociLica aguda (Cornic et al., Anticancer Res. 14, 2339 (1994)). 84

9.5

Preparação da substância activa para leucemias A preparação da substância activa é esclarecida por meio dos exemplos que se seguem: a) Construção do promotor quimérico Myc E-Box-CDE-CHR-Inr 5 cópias da caixa Myc E humana (sequência de nucleótidos 5'—GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3', Blackwood e Eisenman, Science 251, 1211 (1991)) são acopladas entre si na orientação 5' - 3' e na sua extremidade 3' são ligadas ao terminal 5' do módulo CDE-CHR-Inr do gene cdc25 humano (posição -20 a ^ +121 de von Lucibello et al., EMBO J. JL4., 132 (1995)) (ver fig. 14).

As acoplagens são realizadas com auxilio de enzimas disponíveis no comércio e conhecidas dos especialistas. A unidade de transcrição do módulo do promotor da caixa Myc E quimérico preparado desta forma é acoplada na sua extremidade 3' ao terminal 5' de um ADN que contém o domínio que codifica para a β-glucuronidase completa (posição ADN ^ 27 a 1982 de Oshima et al., PNAS USA 84^ 684 (1987)) (ver fig. 14).

Este ADN contém também a sequência de sinal necessária para uma secreção (ácidos aminados 22N-terminais). Para facilitar a libertação celular deve-se trocar preferencialmente esta sequência de sinal por uma sequência de sinal da imunoglobulina (posição £ 63 a ^ 107; Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988), ver fig. 15). As unidades de controlo da transcrição e o ADN para a β-glucuronidase humana são clonados em pUC18/19 ou em vectores plasmídicos derivados de Bluescript, que são utilizados directamente ou em sistemas de dispersões coloidais, para uma aplicação in vivo. Em alternativa, os genes quiméricos podem ser transferidos para vectores virais ou outros vectores adequados e podem serem injectados. 85

10) Eficácia da substância activa

Uma substância activa de acordo com a presente invenção, após administração local (p. ex. em tecidos, cavidades corporais, tracto gastro-intestinal, espaços intertecidos, intervalos entre articulações ou citoquinas) ou sistémica, de preferência intravenosa ou intra-arterial, possibilita uma acção predominantemente quando não exclusivamente nas células alvo, uma vez que é produzida por meio da combinação de uma sequência activadora especifica de tecidos e módulo promotor regulado pelo ciclo celular, em que a substância activa é principalmente ou exclusivamente expressa em células alvo.

Desta forma pode-se alcançar uma reparação prolongada de citopenias hematopoiéticas e uma clara mitigação de alergias e doenças autoimunes. No caso de inflamações crónicas de articulações, a injecção intra-articular da substância activa produz uma inibição da proliferação de células sinoviais. No caso de infecções virais crónicas é possível uma terapia por meio da substância activa. Além disso a substância activa oferece uma possibilidade eficaz e segura de inoculação contra agentes infecciosos. No caso de leucemias é oferecida a possibilidade de acção terapêutica.

Dado que a substância activa promete um elevado nível de segurança por meio da uma especificidade celular ou do ciclo celular pode ser administrada em elevadas dosagens e, em caso de necessidade, por várias vezes com intervalos de dias, semanas ou meses na profilaxia ou terapia.

Legendas das fig. 1 a 15:

Fig. 1:

Sequência de nucleótidos do domínio cdc25C - promotor com os locais de ligação de proteínas in vivo encontrados (Footprinting com DMS genómico; · (círculo a cheio): protecção 86

constitutiva total ; o (circulo aberto): protecção constitutiva parcial; * (asterisco): protecção especifica Gl, regulada pelo ciclo celular). CBS: constitutive binding site (local de ligação constitutiva); CDE: cell cycle-dependent element (elemento dependente do cilco celular). As zonas com fundo cinzento mostram as caixas Yc (posições de ligação NF—Y) . As posições de partida estão marcadas por quadrados a cheio.

Fig. 2:

Des-repressão do promotor cdc25C especifico em Go por meio de mutação do cdc.

Fig. 3:

Representação esquemática da regulação do intensificador de cdc25C por meio do CDE.

Fig. 4:

Repressão especifica de Go/Gi do intensificador de SV40 por meio de CDE.

Fig. 5:

Homologias no dominio CDE-CHR e caixas Yc colocadas em 5/ no cdc25C, ciclicna A e promotores cdc2

Fig. 6:

Promotores quiméricos para a expressão de trombopoietina

As indicações relativas à posição remetem para a seguinte literatura:

Receptor do promotor de SCF: Yamamoto et al., Jpn. J. Câncer

Res. 84,1136 (1993) 87

Receptor do promotor de TT.-1.: Ye et al., PNAS USA 90, 2295(1993) Receptor do promotor (a) de Miyajima et al., Blood 85, 1246 IL-3: (1995) Receptor do promotor (a) de Nakagawa et al., J. Biol. Chem. GM-CSF: 269,10905 (1994) Cadeia β (IL-3-Rec./GM-CSF): Gorman et al., J. Biol. Chem. 267, 15842 (1992) CDE-CR-Inr: Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995) m 1 hP H Yang et al.,.Cell 47, 3 (1986) internai ribosome entry site: Pelletier e Sonenberg, Nature Trombopoietina: 334, 320 (1988) de Sauvage et al., Nature369, 533 (1994) Fiq. 7:

Promotores quiméricos para a profilaxia ou terapia de doenças autoimunes e/ou alergias.

As indicações relativas à posição remetem para a seguinte literatura: Promotor de IL-2: Williams et al., J. Immunol. 141, 662 (1988) Receptor do promotor de IL-1: Ye et al., PNAS USA 90, 2295(1993) CDE-CHR-Inr: Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995) IL-10:

Moore et al., Science 248, 1230 (1990) 88

(1990) internai ribosome entry site: β-Glucuronidase: Imunoglobulina de sequência de sinal:

Pelletier e Sonenberg, Nature 334, 320 (1988)

Oshima et al-, PNAS USA 84/ 685 (1985) Riechmann et al., Nature 332. 323 (1988)

Fig. 8:

Representação esquemática dos encurtamentos de exonuclease III do domínio genético de TIMP-3 de flanco a 5'. Para facilitar a sequenciação foram encurtados aproximadamente 1600 pb do domínio genético de TIMP-3 que flanqueia a 5' por meio de tratamento com exonuclease III a partir da extremidade 5' e foram clonados no vector Bluescript SK(-). Os nomes dos plasmídeos designam o seu encurtamento 5' (p. ex. Δ-1300 contém 1300 pb a 5' da posição de partida de transcrição) . A posição de partida de transcrição está marcada com +1.

Fig. 9:

Sequência de nucleótidos de 500 pb do promotor de TIMP-3 humano bem como 101 pb da região 5' não traduzida. As caixas GC (posições de ligação Spl), duas metades de uma posição de ligação NF1 possívél, bem como um elemento semelhante à posição de ligação C/EBP estão marcados. A posição de início de transcrição está indicada por meio de um flecha.

Fig. 10:

Cinética da indução da construção de luciferase do promotor de ΤΜΡΙ-3-Δ-1010 após estimulação de células NIH3T3 com 20 % de soro fetal de bovino. 89

Representação gráfica. Após transfecção em DEAE de 7 pg de ADN de plasmideo foram incubadas as células NIH3T3rt durante 40 horas em meio isento de soro, foram estimuladas com 20 % de soro fetal de bovino e em momentos específicos determinou-se a expressão do gene relator da luciferase.

Fig. 11:

Análise da expressão transiente da construção de luciferase do promotor de TIMP-3 encurtada em 5', em células NIH3T3rt com crescimento normal, em repouso e estimuladas por soro.

Os plasmídeos foram designados conforme os seus encurtamentos (vide. Fig. 8) (a) Análise em células NIH3T3 com crescimento normal (b) Análise das mesmas construções que em (a) em repouso em oposição a células NIH3T3 estimuladas durante 4 h com 20 % de soro fetal de bovino.

As experiências em (a) e (b) foram realizadas por três vezes com ADNs de plasmideo preparados independentemente uns dos outros, tal como se descreve no quadro 1. Os desvios padrão são representados como travessões. Uma falta de um travessão indica um desvio padrão muito baixo, não representável no gráfico.

Fig. 12:

Construção quimérica constituída por várias fracções do promotor de TIMP-3 humano, o módulo promotor fundido a 3' com os elementos repressores CDE e CHR, bem como um ADN dos antagonistas do receptor de IL-1 (domínio de codificação completo) como efector. As indicações relativas à posição referem-se à posição de partida principal do gene de TIMP-3, no

sistema utilizado por Lucibello et al., (EMBO J. 15, 132 (1995)) para cdc25C ou em posições no ADN do antagonista do receptor de IL-1 (Eisenberg et al., Nature 343, 341 (1990)).

Fig. 13:

Promotores quiméricos para a terapia de uma infecção por

HIV

As indicações relativas à posição referem-se à seguinte literatura: HIV-LTR (Rosen et al ., Cell 41, 813 (1985)) CDE-CHR-Inr (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)) IFNa (Streuli et al., Science 209, 1343 (19880)) IRES (Pelletier (1988)) e Sonenberg, Nature 334, 320 RBP9-27 (Reid, PNAS USA 86, 840 (1989)) Fig. 14:

Construção quimérica constituída por 5 caixas Myc E (Blackwood e Eisenmann, Science 251, 1211 (1991)), promotor basal de cdc25C fundido a 3' com os elementos repressores CDE e CHR, bem como um ADN para β-glucuronidase (domínio de codificação completo) como efector.

As indicações relativas às posições referem-se ao sistema utilizado por Lucibello et al. (1995) para cdc25C ou a posições no ADN de β-glucuronidase (Oshima et al., 1987).

Fig. 15:

As indicações de posição da sequência de sinal MGWSCIILFLVATAT) da imunoglobulina (HuVHCAMP) referem-se a Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988) 91

B) Alternativa: Inserção do peptídeo de sinal da Ig para uma melhor libertação extracelular da β-glucuronidase

Quadro 1: Função de CDE e CHR na transcrição regulada pelo ciclo celular de cdc25C, ciclina A e cdc2

Quadro 1

Go Factor de crescimento wt cdc25C 0, 8 13,1 17,5 ciclina A 0,7 27,1 41,7 cdc2 1,0 41,2 41,2 mCDE(-13) cdc25C 7,6 11,6 1,5 ciclina A 13,4 23,9 1,8 cdc2 11,3 33,9 3,0 mCER(-6/-3) cdc25C 14,4 21,0 1,5 ciclina A 15, 5 28,3 1,8 odc2 18,6 38,6 2,1 Os resultados de transfecções transientes em célula: HIH3T3 são representados como RLUs/1000 . mCDE: CDE mutado (pos -13: G T); mCHR: CHR mutado (pos. -6 a -3). 92

Quad. 2:

Expressão de várias construções de luciferase do promotor em células NIH3T3 com proliferação normal (A) e estimuladas com soro (B) . Após transfecção em DEAE de 7 μς de ADN de plasmideo, incubaram-se as células NIH3T3, durante 40 horas em meio com soro (A) ou isento de soro (B), estimularam-se durante 4 h com soro fetal de bovino (B) a 20 % e determinou-se a expressão do gene relator da luciferase.

Quadro 2: A. Expressão em células proliferativas (RLUxlO3) 189,5 + 6,4 308,1 ± 23,4 59,1 ± 2,2 27,8 + 3,5 0,2 TIMP-3 Δ-1010

pRSV-LTR

póxTRE

Ciclina Dl 0-973 pXP2 B. Indução relativa por meio de soro fetal de bovino

a 20% em células estimuladas por SFB em oposição a células GO (Factor) TIMP-3 Δ-1010 co *» + 0,4 p5xTRE 2,4 ± 0,2 Ciclina Dl A-973 3,5 ± 0,3 pT81 1,0 ± 0,2 pXP2 1,2

Lisboa, 16 de Fevereiro de 2001 (/agente oficial da propriedade industrial

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Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Substância activa para a profilaxia ou terapia de doenças condicionadas pelo sistema imunitário, caracterizada por conter uma construção de ADN que é constituída por uma sequência activadora, uiu módulo do promotor regulado pelo ciclo celular e uma sequência de ADN para a substância activa.
2. Substância activa de acordo com a reivindicação 1, em que o módulo do promotor possui o elemento CDE-CHR-Inr e contém as posições ^ -20 a ^ +30 do domínio do promotor cdc25C (sequência de nucleótidos GGCTGGCGGAAGGTTTGAATGGTCAACGCC-TGCGGCTGTTGATATTCTTG), em que CDE representa o "cell cycle dependent element - elemento dependente do ciclo celular" (sequência de nucleótidos TGGCGG), CHR representa a cell cycle gene homology region - região de homologia com o gene do ciclo celular (sequência de nucleótidos GTTTGAA) e Inr representa a posição de iniciação (posição +1) bem como as sequências vizinhas importantes para a iniciação.
3. Substância activa de acordo com a reivindicação 1, que contém uma sequência activadora (sequência do promotor ou intensificadora), que é regulada através de factores de transcrição formados especialmente em células do sistema hematopoiético, em células sinoviais e em células infectadas por vírus, em parasitas, em macrófagoa, em linfócitos ou células afectadas por leucemia.
4. Substância activa de acordo com a reivindicação 3, que contém uma sequência do promotor de CMV, a sequência intensificadora de CMV ou a sequência do promotor de SV40.
5. Substância activa de acordo com a reivindicação 3, destinada à terapia de uma formação insuficiente de glóbulos vermelhos, na qual a sequência activadora 1

constitui a sequência do promotor de um gene para uma citoquina ou de um receptor para esta citoquina, que é activado em células pouco diferenciadas ou indiferenciadas do sistema hematopoiético ou em células do estroma directamente vizinhas.
6. Substância activa de acordo com a reivindicação 5, que contém a sequência do promotor para o Stem Cell Factor -factor de células germinativas para a interleuquina (IL)-la, IL-Ιβ, IL-3, IL-6, LIF ou factor estimulante das colónias de granulócitos e macrófagos ou a sequência do promotor dos receptores para o Stem Cell Factor - factor de células germinativas -, para a IL-1 ou IL-3, IL-6, LIF, GM--CSF ou a sequência do promotor para o factor regulador de interferão 1 (IRF-1).
7. Substância activa de acordo com a reivindicação 3, para a terapia de doenças autoimunes, alergias, inflamações e prevenção da rejeição de órgãos, na qual a sequência activadora constitui a sequência do promotor de um gene para uma proteína que, perante a activação dos macrófagos ou linfócitos, é formada com maior intensidade.
8. Substância activa de acordo com a reivindicação 7, que contém a sequência do promotor para interleuquina (IL)-la ou IL-Ιβ, receptor de IL-1, IL-2, receptor de IL-2, interferão γ, IL-3, receptor de IL-3, IL-4, receptor de IL-4, IL-5, IL-6, . Interferon Regulatory Factor - factor regulador do interferão - 1, Responsive Promotor - promotor de resposta - de IFN-γ, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL- -12, IL-13, factor de estimulação de colónias de granulócitos-macrófagos (GM—CSF), receptor de GM-CSF, factor de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF), receptor do Colony Stimulating Factor - factor estimulante de colónia - de macrófagos, receptor tipo I ou tipo II Scavenger - de eliminação - de macrófagos ou factor inibidor de leucemia (LIF), LFA-1, MAC-1 ou pl50,95. 2
9. Substância activa de acordo com a reivindicação 1, para a terapia da artrite, que contém uma sequência activadora (sequência do promotor ou intensificadora) , que é regulada por meio de factores de transcrição formados em células sinoviais ou células inflamatórias.
10. Substância activa de acordo com a reivindicação 9, que contém a sequência do promotor para um gene de metaloproteinase matriz (MMP), um gene de Tissue Inhibitor of Metalloproteinases - inibidor de tecido de metaloproteinases - (TIMP) ou para o receptor de M-CSF ou receptor tipo I ou tipo II Scavenger - de eliminação - de macrófagos.
11. Substância activa de acordo com a reivindicação 10, que contém a sequência do promotor para o gene de MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9, TIMP-1 ou TIMP-2.
12. Substância activa de acordo com a reivindicação 10, que contém a sequência do promotor para o gene do Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-3 - inibidor de tecido de metaloproteinase-3, que contém fragmentos de ADN activo do promotor, que contém a posição ^ -4 63 a 2: -2 da seguinte sequência de nucleótidos: -500 ATGGCTTCCC ATATCCCAGA GAGTAAGAAC CAGAGAGAGA GAGAGAAAGA GAGAGAGTTT -440 GGGTCTTTCT CCTCTGTGCC TGCTCTCTCC AGAGAAACTG GAGGGGTAGC AGTTAGCATT -380 CCCCCGCTGG TTCCACCAAG CACAGTCAAG GTCTCTAGGA CATGGCCACC CCTCACCTGT -320 GGAAGCGGTC CTGCTGGGGT GGGTGGGTGT TAGITGGTTC TGGTTTGGGT CAGAGACACC NF1 -260 CAGTGGCCCA GGTGGGCGTG GGGCCAGGGC GCAGACGAGA AGGGGCACGA GGGCTCCGCT -200 CCGAGGACCC AGCGGCAAGC ACCGGTCCCG GGCGCGCCCC AGCCCACCCA CTCGCGTGCC Spl Spl -140 CACGGCGGCA TTATTCCCTA TAAGGATCTG AACGATCCGG GGGCGGCCCC GCCCCGTTAC Spl C/EBP -80 CCCTTGCCCC CGC-CCCCGCC CCCTTTTTGG AGGGCCGATG AGGTAATGCG GCTCTGCCAT Scl iinício -20 TGGTCTGAGG GGGCGGGCCC CAACAGCCCG AGGCGGGGTC CCCGGGGGCC CAGCGCTATA 3
13. Substância activa de acordo com a reivindicação 12, que contém fragmentos de ADN activo promotor para o gene do Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-3 - inibidor de tecido de metaloproteinase-3 - que contém -Posição £ -463 a ^ -10 ou -Posição £ -112 a ^ -2 ou -Posição ^ -112 a ^ -10 da sequência de nucleótidos apresentada na reivindicação 12.
14. Substância activa de acordo com as reivindicações 1 a 3 destinada à terapia de infecções virais, na qual a sequência activadora constitui a sequência do promotor para vírus que transformam as células infectadas por estes causando a proliferação.
15. Substância activa de acordo com a reivindicação 14, que contém a sequência do promotor do virus da hepatite B, do virus da hepatite C, do víruo de Herpes Simplex I e TT, dos vírus do papiloma humanos, em especial HPV-16 e HPV-18, do vírus da imunodeficiência humana, em especial HIV-1, HIV-2 e HIV-3, do vírus de Epstein-Barr ou do vírus da leucemia das células T humanas.
16. Substância activa de acordo com a reivindicação 1, para a profilaxia de infecçõe3, que contém a sequência do promotor para interleuquina (IL)-lcc ou IL-Ιβ, receptor de IL-1, IL-2, receptor de IL-2, interferão γ, IL-3, receptor de IL-3, IL-4, receptor de IL-4, IL-5, IL-β, Interferon Regulatory Factor - factor regulador de interferão - 1, Responsive Promotor - promotor de resposta - de IFN-γ IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, factor de estimulação de colónias de granulócitos-macrófagos (GM- 4

-CSF), receptor de M-CSF, receptor tipo I ou tipo II Scavenger - de eliminação - de macrófagos, receptor de GM-CSF, factor de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF) ou factor inibidor de leucemia (LIF), LFA-1, MAC-1 ou pl50,95.
17. Substância activa de acordo com a reivindicação 1, para a terapia de leucemias, que contém uma sequência activadora (sequência do promotor ou inLensificadora), a qual é activada através de factores de transcrição formados em células afectadas pela leucemia.
18. Substância activa de acordo com a reivindicação 17, que contém - a sequência do promotor para c-myc, bcl-2, bcl-1 IL-6, IL-10, TNFa ou TNFP - ou a sequência de ligação para proteínas formada em HOX—11, BCR-Abl, E2A-PBX-1, PML/RARA ou a caixa myc E humana sob forma simples ou múltipla.
19. Substância activa de acordo com a reivindicação 5, em que a sequência de ADN codifica para a substância activa eritropoietina, G-CSF, GM-CSF, IL-3, LIF, IL-11 e/ou trombopoietina.
20. Substância activa de acordo com a reivindicação 7, em que a sequência de ADN codifica para - IFNa, IFNP,IFN γ, IL-10, receptores de IL-4 solúveis, TGFp, IL-12, receptores de IL-1 solúveis, receptores de IL-2 solúveis, receptores de IL-6 solúveis, antagonistas de receptores de IL-1, IL-1, IL-4, IL-6, IL-9, IL-13, TNFa ou TNF3 ou um anticorpo imunossupressor, em especial com especificidade para CD4, CD8, CD3, receptor de IL-2, receptor de IL-1 ou receptor de IL-4, CD2, LFA-1, CD28, 5

adaptador de CD40 ou CD40 ou fragmentos deste anticorpo que contêm VH e VL ou os seus fragmentos VH ou VL ligados através de um adaptador.
21. Substância activa de acordo com a reivindicação 9, em que a sequência de ADN codifica para uma substância anti-inflamatória um inibidor de interleuquina.? ou factores de crescimento causadores de inflamação ou uma interleuquina inibidora da inflamação ou um factor de crescimento que estimula a sintese da matriz extracelular ou a dismutase de superóxido ou - um inibidor de proteinase.
22. Substância activa de acordo com a reivindicação 21, em que o inibidor das interleuquinas ou dos factores de crescimento causadores da inflamação é o antagonista do receptor da interleuquina-1, o receptor de interleuquina-1 solúvel ou o receptor do Tumor Necrosis Factor - factor de necrose de tumores - α (TNFa) solúvel ou é a interleuquina inibidora da inflamação é IL-4, -6 ou -10 ou é o factor de crescimento que estimula a síntese da matriz extracelular, o Insulin-like Growth Factor -factor de crescimento semelhante a insulina - ou o Transforming Growth Factor - factor de crescimento transformante - β (TGFP) ou constitui o inibidor de proteinase Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 - inibidor de metaloproteinase de tecido-1 - (TIMP-1), TIMP-2 ou TIMP-3.
23. Substância activa de acordo com a reivindicação 14, em que a sequência de ADN codifica para a substância activa 6 'ν

Γ\ Μ

IFNa, IFNp, IFN γ, TNF, em especial TNFa IL-1 ou TGFP ou - um anticorpo de uma especiticidade que lnactiva o respectivo vírus ou um fragmento deste anticorpo que contém VH e VL ou o seu fragmento VH e VL ligado através de um adaptador ou uma proteína que liga Rev, em especial RBP9-27, RBP1-8U ou o RBP1-8D.
24. Substância activa de acordo com a reivindicação 16, em que a sequência de ADN codifica para a substância activa - o antigénio de neutralização ou de inactivação de um vírus, de uma bactéria ou de um parasita ou um anticorpo anti-idlotipo ou um fragmento desse anticorpo cujas "complementary determining regions" regiões de determinação complementares - sejam uma cópia da estrutura de proteínas ou de hidratos de carbono do antigénio de neutralização de um agente infeccioso.
25. Substância activa de acordo com a reivindicação 24, em que a sequência de ADN codifica para os antigénios da gripe, HIV, raiva, HSV, RSV, vírus de parainfluenza, rotavírus, VZV, CMV, vírus do sarampo, HPV, HBV, HCV, HDV, HEV, HAV, toxina da vibriocólera, Borrelia-Burgdorferi, Helicobacter pylori ou malária.
26. Substância activa de acordo com as reivindicações 7, 14 e 17, em que a substância activa constitui uma sequência de ADN para um inibidor do ciclo celular.
27. Substância activa de acordo com a reivindicação 26, em que a sequência de ADN codifica para o inibidor do ciclo celular a proteína do retinoblastoma pRb/pll'0 ou as proteínas aparentadas pl07 e p 130 ou a proteína p53 ou a proteína p21, a proteína P16 ou um outro inibidor 7

"Cyclin-dependent Kinase ~ quinase dependente da ciclina - (cdK)" ou a proteína GSDD45 ou - a proteína bak ou uma proteína citotóxica ou uma citoquina citostática ou uma enzima para a cisão entre precursores de citostáticos em citostáticos.
28. Substância activa de acordo com a reivindicação 27, em que a sequência de ADN da proteína do retinoblastoma (pRb/pllO) deixa de poder ser fosforilada através de permuta dos ácidos aminados nas posições 246, 350, 601, 605, 780, 786, 787, 800 e 804, sem que no entanto a pRb/pllO mutada perca a sua actividade de ligação com o antigénio T grande, em especial permutando os ácidos aminados Thr-246, Ser-601, Ser-605, Ser-780, Ser-786, Ser-787 e Ser-800 com Ala, o ácido aminado Thr-350 com Arg e o ácido aminado Ser-804 com Glu ou em que a sequência de ADN para a proteína pl07 ou pl30 sofre uma mutação de forma análoga à mutação de pRb/pllO.
29. Substância activa de acordo com a reivindicação 27, em que a sequência de ADN para a proteína p53 é encurtada no terminal C na serina 392.
30. Substância activa de acordo com a reivindicação 27,em que a sequência de ADN codifica para a proteína citotóxica ou citoquina citostática perforina, granzima, IL-2, IL-4, IFNa, IFNP, IFNy, TNFa, TNFP, TGFp ou oncostatina M.
31. Substância activa de acordo com a reivindicação 27, em que a enzima é uma quinase de timidina do virus Herpeo aimplcx, desaminase de citosina, quinase de timidina do vírus da Varizella Zoster, nitro-redutase, β-glucuronidase (em 8

p especial uma β-glucuronidase humana, vegetal ou bacteriana), carboxipeptidase (de preterência de Pseudomonas), lactamase (de preferência de Bacillus cereus), aminopeptidase de piroglutamato, D-aminopeptidase, oxidase, peroxidase, fosfatase, hidroxinitriliase, protease, esterase ou uma glicosidase, em que se utiliza a sequência de sinal homóloga ou, para uma melhor secreção celular, uma sequência de sinal heteróloga.
32. Substância activa de acordo com a reivindicação 31, em que as mutações pontuais da sequência de ADN da enzima diminui a acumulação de lisossomas e aumenta a secreção extra-celular.
33. Substância activa de acordo com as reivindicações 19 a 32, que contém as sequências de ADN de várias substâncias activas iguais ou diferentes, em que duas sequências de ADN estão ligadas entre si através de uma sequência de ADN para o internai ribosome entry site - local de entrada interno de ribossoma.
34. Substância activa de acordo com a reivindicação 33, em que uma substância activa codifica para o antigénio ou o anticorpo anti-idiotipo para este antigénio de um agente infeccioso e a segunda substância activa codifica para uma citoquina ou um receptor de citoquina, em especial ΤΘΓβ, IFNa, IFNP, IFNy, IL-12 ou receptores solúveis de IL-4 ou - IL-4, IL-6, LIF, IL-9, IL-10, IL-13, TNFa ou TNFp ou - IL-1, IL-2, M-CSF ou GM-CSF.
35. Substância activa de acordo com as reivindicações la 34, introduzida num vector.
36. Substância activa de acordo com a reivindicação 35, em que o vector é um vírus. 9
37. Substância activa de acordo com a reivindicação 36, em que o vírus é um retrovírus, adenovírus, virus adeno-associado, vírus de Herpes simplex ou vírus Vaccinia.
38. Substância activa de acordo com as reivindicações 1 a 34, introduzido num plasmídeo.
39. Substância activa de acordo com as reivindicações 35 a 38, preparado num sistema de dispersão coloidal.
40. Substância activa de acordo com a reivindicação 39, em que o sistema de dispersão coloidal é constituído por lipossomas.
41. Substância activa de acordo com a reivindicação 39, em que o sistema de dispersão coloidal é constituído por ligandos de polilisina.
42. Substância activa de acordo com as reivindicações 1 a 41, completado por meio de um ligando, que se liga a estruturas de membrana de células hematopoiéticas, a linfócitos activados, macrófagos activados, células sinoviais activadas, células infectadas por virus ou células afectadas por leucemia.
43. Substância activa de acordo com a reivindicação 42, em que o ligando é - um anticorpo policlonal ou monoclonal ou um fragmento de anticorpo desse tipo que, com os seus domínios variáveis, se liga especificamente à membrana da célula ou - um anticorpo policlonal ou monoclonal ou um fragmento de anticorpo desse tipo que, com os seus domínios constantes, se liga a receptores Fc na membrana celular ou uma citoquina ou um factor de crescimento ou um fragmento ou uma sequência parcial destes que se liga aos 10

receptores correspondentes na membrana celular ou um ligando em posição terminal que contém uma galactose que se liga ao receptor de asialglicoproteina ou - uma transferrina ou um fragmento desta que se liga ao receptor de transferina ou - uma insulina ou um fragmento desta que se liga ao receptor de insulina ou - um ligando que contém manose em posição terminal que se liga ao receptor de manose-6-fosfatc.
44. Substância activa de acordo com a reivindicação 43, em que as estruturas da membrana celular constituem receptores para citoquinas, factores de crescimento, interferões, quimioquinas, em especial receptores para o Stem Cell Factor - factor de células germinativss - para IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, interferão a, interferâo β, interferão γ, LIF, GM-CSF, G-CSF, TFFoc, EGF, FGF, TGFp, PDGF ou IGF.
45. Substância activa de acordo com a reivindicação 21, em que a estrutura de membrana das células sinoviais ou células inflamadas é vimentina, fibronectina, receptor de IL-1, receptor de IL-2, receptor de TNFa, receptor de il-4, receptor de IL-10, receptor de IGF, receptor de TGFp ou receptor de manose-6-fosfato.
46. Substância activa de acordo com a reivindicação 43, em que as estruturas de membrana celular sã: antigénios que são suscitados através da infecção com vírus, em especial através de HBV, HCV, HAV, HSV, HPV, EEV, HTLV ou HiV.
47. Substância activa de acordo com a reivindicação 43, em que a estrutura de membrana de células afastadas por leucemia é constituída por receptores para IFNa. IL-2, FGF, TGFP ou para retinóides.
48. Substância activa de acordo com as reivindicações 1 a 47, 11 em que o vector é misturado com uma citoquina, um receptor de citoquina, um adjuvante ou com substâncias que facilitam a absorção e a imunização através da mucosa.
49. Substância activa de acordo com a reivindicação 48, em que se misturou - IL-la, IL-Ιβ, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-γ, M-CSF, GM-CSF e/ou receptor de IL-4 ou lipossomas, polimeros biodegradáveis, dipeptideos de muramilo, lipopolissacáridos, lípido A ou A1(0H)3 ou Ca(OH)3.
50. Substância activa de acordo com as reivindicações 1 a 49, num preparado medicinal para injecção num tecido como músculo, tecido conjuntivo, fígado, rins, baço, pulmões, pele, para a aplicação local na pele ou nas mucosas, para a injecção em cavidades corporais como articulações, espaço pleural, espaço peritoneal, espaço subaraquinoidal ou para injecção no sistema vascular, tal como injecção intra--arterial ou intravenosa ou para administração oral.

Lisboa, 16 de Fevereiro de 2001

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