JP4426757B2 - 核酸移送のための糖類と組み合わせたデキストリンポリマーを含む製剤 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、その浸透圧が細胞または組織を取り巻く生理学的浸透圧に実質的に対応している組成物を含む、限定的にではないが、特に遺伝子治療において、細胞への核酸の移送方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
この30年に渡り、細胞内への核酸の導入を容易にするための多くの方法が開発され、中でも遺伝子発現制御の理解を大きく助けて来た。
DNAを細胞内へ導入する従来の方法は当業界で周知であり、典型的には化学試薬、カチオン性脂質、または物理的な方法の使用を含む。細胞によるDNAの取り込みを容易にする化学的な方法は、DEAE−デキストラン(Vaheri and Pagano, Science 175:434)の使用を含む。DEAE−デキストランはDNAと会合し、細胞内へDNAを導入する。しかしながら、このことは細胞の生存能力の損失に至る可能性がある。リン酸カルシウムも一般的に用いられる化学物質であり、DNAと共沈させられる時、細胞内へそのDNAを導入する(Grahamet al., Virology (1973) 52: 456)。
【0003】
カチオン性脂質(例えばリポソーム、Felgner (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413)の使用は、上記の化学的方法で示される程度の毒性は持たないことから、一般的な方法となっている。脂質のカチオン性頭部が、導入されるべきDNAの負に帯電した核酸骨格と会合する。この脂質/DNA複合体は細胞膜と会合し、細胞と融合して、会合したDNAを細胞内へ導入する。リポソームが仲介するDNA移入は、既存の方法を上回る幾つかの利点を持つ。例えば、伝統的な化学的方法に抵抗する細胞でも、リポソームが仲介する移入を用いて、より容易にトランスフェクションを受ける。
【0004】
更に最近では、DNAを導入する物理的な方法が、再現性を伴って細胞にトランスフェクトする有効な手段となって来た。直接の微小注入は、細胞の核へDNAを直接移送出来るそのような1つの方法である(Capecchi (1980) Cell, 22:p479)。これは、単独の細胞感染物の分析を可能にする。いわゆる「バイオリスティック」な方法は、DNAで覆われた高速の粒子を用いて、細胞および/またはオルガネラ内へ、DNAを物理的に挿入する(Neumann(1982) EMBO J., 1: 841)。
【0005】
エレクトロポレーションはおそらく、DNAをトランスフェクトする最も汎用の方法である。この方法は高電圧の電荷の使用を含み、ごく短時間だけ細胞膜を透過性にし、細胞膜を巨大分子複合体に対しても透過可能にする。しかしながら、DNAを導入する物理的な方法は、細胞内の障害により、細胞の生存能力の重大な損失を導く。これらの方法はそれ故、更なる最適化を必要とし、更なる補填も必要としている。
【0006】
更に最近では、イムノポレーションと呼ばれる方法が、細胞内への核酸の導入のための技術として認識されて来た(Bildirici et al., Nature (2000) 405, 298 参照)。この技術は、特異的な受容体に対する抗体で覆われたビーズの使用を含む。感染用混合物は、典型的にはベクターDNAである核酸、抗体で覆われたビーズ、および特異的な細胞表面受容体を発現している細胞を含む。この覆われたビーズは細胞表面受容体に結合し、剪断力が細胞に加わった時には、そのビーズがその細胞表面から引き剥がされる。ビーズが取り除かれる間、核酸および/または他の生物学的分子が通過して入り得る一時的な孔が作られる。40〜50%のトランスフェクション効率が、用いられる核酸によっては達成可能である。
【0007】
典型的には遺伝子治療は、疾病の治療的処置のための細胞内へ新しい遺伝情報の移入、場合によって安定な挿入を含む。レトロウィルスベクターによる移入後にマウスで首尾よく発現した遺伝子は、ヒトヒポキサンチンホスホリボース転移酵素を含む(A. Miller et al., 1984, Science 255:630)。微生物遺伝子も、微生物薬剤耐性遺伝子の形で、哺乳類細胞内へ移入されている。真核細胞用ウィルスベクターによる造血前駆細胞の薬剤耐性への形質転換も、組み換えレトロウィルスに基づいたベクター系を用いて達成されている(R.A. Hock and A. D. Miller, 1986, Nature 320:275-277; Joyner et al. (1983) Nature305:556-558; D. A. Williams et al. 1984, Nature 310:476-480; J. E. Dick et al.,1985, Cell 42:71-79; G. Keller et al., 1985, Nature 318: 149-154; M, Eglitis etal., 1985, Science 230:1395-1398)。アデノ関連ウィルスベクターは、哺乳類細胞株をネオマイシン耐性に変換するために首尾よく使われている(P.L. Hermonat and N. Muzyczka, 1984, 上記文献; J. D. Tratschin et al., 1985, Mol.Cell. Biol. 5:3251)。遺伝子移入に用いるために研究されてきた他のウィルスベクター系は、パポーバウィルスおよびワクシニアウィルスを含む(M.L. Cline (1985) Pharmac. Ther. 29:69-92 参照)。
【0008】
遺伝子治療に関する主要な問題は、細胞への核酸の効率的な標的化、および選択された組織における導入遺伝子の高水準な発現の確立に関する。これらの要請のいずれか、または双方を容易にするという多くの方法論が開発されている。例えば、US6043339 は、核酸と融合された時に、細胞膜を横切る連結された核酸の移動を容易にし得るシグナルペプチドの使用を開示している。US6083714は、組み合わされた核酸と、インテグリン受容体に結合し、これによってインテグリン発現細胞を標的とするポリカチオンであるポリリジンを使用する標的化手段とを開示している。EP1013770は、オリゴヌクレオチドに結合した核局在化シグナル(Nuclear localisation signals、NLS)の使用を開示している。その結合体はベクターDNAと共有結合されてもよく、その複合体はしばしば細胞にトランスフェクトする。NLS配列は、核膜を横切るベクターDNAの横断を容易にするように働き、このことによって核への遺伝子移送を標的化する。
例えばベクターDNAのような核酸は、消化管経由(経口、直腸、または舌下)で、または非経口(静脈内投与、皮下投与、または吸入による)を含む様々な経路で、動物内へ導入されてもよい。
【0009】
腹膜腔内への所定の水溶液の導入が、腎不全を罹患している患者の処置において役立つ可能性があることが知られている。このような処置は、腹膜透析として知られている。この溶液は、血漿中に存在するものと同様の電解質を含む。それら電解質は、腹膜を横断しての望ましい程度の浸透圧力を作り出すのに充分な濃度で存在する浸透圧剤、通常はデキストロースも含有する。この浸透圧力の影響下では、腹膜を介して交換が起こり、その結果、正常な腎臓機能の欠如のために血中に蓄積した尿素やクレアチニンのような老廃物が血流から取り除かれる。この交換が起きている間、この溶液から血液への腹膜を介したデキストロースの正味の移入も存在し、これはこの溶液の浸透圧の低下を引き起こす。このために、その溶液が取り除かれて新鮮な溶液で置き換えられる必要が生じる前に、この溶液が適度な期間有効な透析を続けるために、この溶液の初期浸透圧を(充分高濃度のデキストロースを用いることにより)非常に高くせねばならない。
【0010】
他の浸透圧剤も、腹膜透析での使用について提案され、ここ数年はデキストリン(スターチ加水分解グルコースポリマー)が使われて来た。腹膜腔に点滴される場合、デキストリンはリンパ系を経由して徐々に吸収され、最終的には末梢の循環血液に達する。デキストリンの構造は、アミラーゼが循環液中において、その分子をオリゴ糖に分解した結果の構造である。これらは、グルコースへの更なる代謝により、取り除かれる。
典型的には、体腔を経由して患者へ遺伝子治療物質を導入するために選ばれる溶媒は、緩衝化機能を持たせた生理食塩水、例えばリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でもよいだろう。
【0011】
デキストリン溶液は、腹膜を経由して身体へ薬剤を移送するための溶媒として提案された。GB-A-2207050 では、このような溶液が、消化管投与が満足でない薬剤の腹膜投与のために提案されている。このようなアプローチは、エリスロポエチンや成長ホルモンのようなペプチド薬剤の移送に、特に有用であると述べられている。また、セファロスポリン系抗生物質にも言及されている。デキストリン溶液は、卵巣ガンの処置における化学療法剤の投与に関しても記載されている。腹膜腔での滞留期間を延長することにより、化学療法剤(特に5FU)の効果を高めるイコデキストリン製剤の使用は、J.W. Dobbie (1997) Adv. Perit.Dial. 13:162-7、及び C. S. McArdle et al. (1994) Br. J. Cancer 70(4):762-6 に充分に記載されている。
【0012】
本発明は、細胞へ核酸を移送する能力が増強されたことを示し、トランスフェクトされた遺伝子の高レベルの発現に至るデキストリン含有溶液に向けられている。
【0013】
(本発明の概要)
本発明は、溶液の浸透圧が生理学的浸透圧に実質的に相当する医薬製剤を提供し、この製剤は、デキストリンおよび少なくとも1種類の糖を含む溶液中に核酸を含む。
本発明は更に、細胞への核酸の移送方法を提供し、この方法では、デキストリンおよび少なくとも1種類の糖を含む、細胞を取り巻く環境の生理学的浸透圧に実質的に対応している浸透圧を有する溶液中で核酸が運ばれる。
本発明は更に、核酸を用いた哺乳類の処置方法を提供し、この方法では、デキストリンおよび少なくとも1種類の糖を含む医薬製剤中、その核酸が前記哺乳類へ投与される。
【0014】
(本発明の詳細な説明)
本発明は、デキストリンおよび少なくとも1種類の糖を含む溶液中に核酸を含み、前記溶液の浸透圧が生理学的浸透圧に実質的に相当する医薬製剤を提供する。
(デキストリン)
文言「デキストリン」は、スターチの加水分解により生成され、主にα−1,4結合により共に結合したグルコース単位にからなるグルコースポリマーを意味する。典型的には、デキストリンは小麦、米、トウモロコシ、およびタピオカのような種々の天然の生成物から得られるスターチの加水分解により生成される。α−1,4結合に加え、特定のデキストリンにはα−1,6結合の部分があってもよく、この量はスターチの出発原料に依存する。α−1,6結合の生物分解能力の割合は、典型的にはα−1,4結合に対してのそれよりも少ないので、多くの用途には、α−1,6結合の百分率は10%未満、好ましくは約5%未満であることが好ましい。
いかなるデキストリンも、異なる鎖長のポリグルコース分子の混合物である。この結果、単一の数字では、このようなポリマーの分子量を適切に特定することはできない。従って種々の平均が用いられ、最も一般的なものは重量平均分子量(Mw)、および数平均分子量(Mn)である。Mwは、ポリマーの高分子量内容物における変化に特に敏感であり、一方Mnは、ポリマーの低分子量内容物における変化に大きく影響を受ける。本発明の好ましい実行では、デキストリンのMwが約1,000〜200,000、より好ましくは約2,000〜55,000の範囲である。
文言「重合度」(DP)は、ポリマー混合物に関連しても用いることができる。1種類のポリマー分子については、DPはポリマー単位の数を意味する。異なるDPの分子の混合物については、重量平均DPおよび数平均DPが、MwおよびMnに対応する。加えてDPは、ある特定の数値より大きいか、またはある特定の数値よりも小さいDPのポリマーの所定の百分率を有するポリマー混合物に言及することにより、ポリマーを特徴付けるのに用いることも可能である。本発明においてデキストリンは、12より大きいDPのポリマーを約15%より多く含み、より好ましくは、12より大きいDPのポリマーを約50%より多く含むことが好ましい。
好ましくは、デキストリンは、約20%より少ない量で溶液中に存在する。
好ましくは、デキストリンは、約1%(w/v)、2%(w/v)、3%(w/v)、4%(w/v)、5%(w/v)、6%(w/v)、7%(w/v)、8%(w/v)、9%(w/v)、10%(w/v)、11%w/v、12%w/v、13%w/v、14%w/v、15%w/v、16%w/v、17%w/v、18%w/v、19%w/v、20%w/vから選ばれる量で溶液中存在する。より好ましくは、デキストリンは重量で約2〜5%、最も好ましくは、重量で約4%存在する。
【0015】
(生理学的浸透圧)
示されたように、前記溶液は、処置されるべき細胞の生理学的環境の浸透圧と本質的に等張の浸透圧を有する。一般的に、哺乳類の体腔内で維持される生理学的浸透圧は、約330ミリモル浸透圧濃度であり、特定の体腔によっていくらか変わるであろう。例えば、ヒト腹膜腔での点滴用等張溶液は、約290〜300ミリモル浸透圧濃度の浸透圧を持つであろう。腹膜点滴に関しての本発明の好ましい実行では、溶液は約250〜350ミリモル浸透圧濃度、より好ましくは約275〜330ミリモル浸透圧濃度の浸透圧を有するであろう。特定の生理学的環境に依存するおおよそ等張の浸透圧を維持するための調整は、当業者には容易に明らかであろう。
【0016】
(糖)
文言「糖」とは、単糖、二糖、またはオリゴ糖のことをいう。単糖は、実験式(CH2O)nを持ち、ここでnは3またはこれより大きい。単糖の例は、単に例示的なだけであって、限定的であることが意図されるものではないが、グルコース、ガラクトース、マンノース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、フルクトースである。二糖は、グリコシド結合によって連結された2つの単糖からなる。二糖の非限定的な例はスクロース、マルトース、セロビオース、ゲンチオビオース、ラクトースである。典型的にはオリゴ糖は、2より多い単糖単位を伴った糖である。オリゴ糖の非限定的な例は、ラフィノースおよびメレジトースである。糖は天然から得ることができ、または工業的に製造され得る。
本発明の好ましい方法では、前記糖は二糖である。更に好ましくは、二糖の量は約1〜10%w/vである。好ましくは、二糖の量は約2〜5%w/vである。本発明の好ましい実施形態では、前記二糖は、約3%w/vで存在するスクロースである。
本発明の更なる方法では、デキストリン量が約2〜20%w/vで、スクロース量が約1〜10%w/vである。
更に理想的には、デキストリン量は約4%w/vで、スクロース量が約3%w/vである。
精確な組み合わせは、細胞または組織を取り巻く液体の浸透圧に依存するであろうことは明らかであろう。典型的には、前記核酸を含む溶液と細胞/組織を取り巻く液体との間に等張の平衡を維持することが望ましい。
【0017】
(2価陽イオン)
更に好ましくは、上記溶液は、更に2価陽イオンを含む。好ましくは、その2価陽イオンは、少なくとも0.2mMである。更に好ましくは、その2価陽イオン濃度は、約0.2〜3.0mMである。理想的には、その2価陽イオンは塩化マグネシウムであり、その濃度は約2.0mMである。あるいはその2価陽イオンは、塩化カルシウムにより供給される。
好ましくは、その溶液は約4%w/vのデキストリン、約3%w/vのスクロース、および約2.0mMの塩化マグネシウムを含む。あるいは、デキストリン濃度は約15%w/vである。
核酸にコードされているポリペプチドの組み換え生成に対して、その溶液が in vitro での細胞への核酸の移送に関した有用性を持つことは、当業者には明らかであろう。本発明も、細胞への核酸の in vivo導入と、細胞への核酸の ex vivo 導入に次ぐ、遺伝子治療が必要な動物へのトランスフェクトされた細胞の導入との、両方の遺伝子治療を達成している。
【0018】
(核酸)
好ましくは、上記核酸分子は真核細胞での発現に適合される。典型的には、上記適合は、例示であって限定ではないが、細胞/組織特異的な発現を仲介する転写制御配列(プロモーター配列)の提供を含む。これらのプロモーター配列は細胞/組織特異的であり、誘導可能、または構築可能であってもよい。
【0019】
文言「プロモーター」は、技術的に認められた用語であり、明確にするために、例示のみによって与えられる以下の特徴を含むが、限定するものではない。エンハンサーエレメントは、遺伝子の転写開始部位に対して5’にしばしば見い出されるcis 作動性核酸配列である(エンハンサーは、遺伝子配列に対して3’に見出されることもでき、イントロン系配列に位置することさえあり得る)。エンハンサーが連結する遺伝子の転写の速度を上昇させるよう、エンハンサーは機能する。エンハンサー活性は、エンハンサーエレメントに特異的に結合することが示されているtrans 作動性転写因子(ポリペプチド)に応答する。転写因子の結合/活性は(「真核細胞の転写因子」David S. Latchman、AcademicPress Ltd., San Diego 参照)、例示であって限定ではないが、中間代謝物(例えばグルコース、脂質)、環境要因(例えば光、熱)を含む、多くの生理学的/環境的なきっかけに応答する。
【0020】
プロモーターエレメントはまた、いわゆるTATAボックス、および転写開始の部位を選択するように機能するRNAポリメラーゼ開始選択配列(RIS)を含む。これらの配列も、中でもRNAポリメラーゼによる転写開始選択を容易にするように機能するポリペプチドに結合する。
適合はまた、真核細胞か原核細胞宿主のいずれかにおける上記ベクターの維持を容易にする選択可能マーカーおよび自律的複製配列の提供を含む。自律的に維持されるベクターは、エピソームベクターとして言及される。これらの分子は大きなDNA断片(30〜50kbのDNA)を取り込むことができるので、エピソームベクターが望ましい。このタイプのエピソームベクターは、WO98/07876 に記載されている。
【0021】
ベクターにコードされている遺伝子の発現を容易にする適合は、転写終結/ポリアデニル化配列の提供を含む。これはまた、2つのシストロン、または多数のシストロンの発現カセット中で調整される、ベクターにコードされた遺伝子の発現を最大化するように機能する内部リボソームエントリー部位(IRES)の提供も含む。発現制御配列はまた、いわゆる遺伝子座制御領域(LCR)も含む。これらは、導入遺伝子構築物としてアッセイされる際、位置非依存的かつコピー数依存的な発現を、連結した遺伝子に授ける制御エレメントである。LCRは、導入遺伝子を、近接するヘテロクロマチンのサイレンサー効果から引き離す制御エレメントを含む(Grosveld et al., Cell (1987), 51:975-985)。
【0022】
発現制御配列はまた、遍在性クロマチンオープニングエレメント(UCOE、WO/GB00/05393 参照)も含む。UCOEは、普遍的に発現しているハウスキーピング遺伝子だけからなる遺伝子座を横切って開放クロマチン構造の樹立を担う核酸エレメントである。これらのエレメントはLCRに由来しない。UCOEは、クロマチンを開放し、またはクロマチンを開放状態に維持するポリヌクレオチドで、少なくとも2つの異なるタイプの組織の細胞中に操作可能に連結された遺伝子の再現性ある発現を容易にする。
これらの適合は、当業界で周知である。一般的に、発現ベクター構築、および組み換えDNA技術に関する非常に多くの量の文献が出版されている。分子クローニングに関しては、Sambrook et al. (1989) A Laboratory Manual, Cold Spring HarbourLaboratory, Cold Spring Harbour, NY およびこの中の文献、DNAクローニング技術に関しては、F. Marston(1987) A Practical Approach Vol III, IRL Press, Oxford, UK、DNAクローニングに関しては、F. M.Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,Inc. (1994) を参照のこと。
【0023】
ベクターは、典型的にはウィルスに基づいており、アデノウィルス、レトロウィルス、アデノ関連ウィルス、ヘルペスウィルス、レンチウィルス、ワクシニアウィルス、およびバキュロウィルスを含むウィルス由来でもよい。
【0024】
文言「治療用ウィルス」および「治療用ウィルスベクター」は、ここでは互換性を伴って用いられ、治療薬(例えば野生株ウィルス、弱毒化ウィルス)、ワクチンベクター、または治療効果を高めるためにゲノムへの修飾を含む組み換えウィルスとして用いられるウィルスのことを言う。治療薬としてのウィルスまたは「ウィルスベクター」の使用は、前に議論されたように、当業界で周知である。加えて、多くのウィルスが、外因性遺伝子の移送用ベクターとして一般的に用いられている。一般的に用いられるウィルスは、組み換え修飾された外被を有するまたは有しないDNAおよびRNAウィルスを含み、これらは好ましくは、baculoviridiae、parvoviridiae、picornoviridiae、herpesviridiae、poxviridiae、adenoviridiaeまたは picornnaviridiae から選ばれる。各親ベクターの性質の有利なエレメントを取り入れたキメラベクターも、用いてもよい(例えば Feng etal. (1997) Nature Biotechnology, 15:866-870 参照)。このようなウィルスベクターは、野生株であってもよく、または複製能力なし、条件により複製を行う、または複製能力を有するように、組み換えDNA技術によって修飾されてもよい。
【0025】
好ましいベクターは、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、およびレトロウィルスゲノムに由来する。本発明の最も好ましい実行では、ベクターはヒトアデノウィルスゲノムに由来する。特に好ましいベクターは、血清型2または5のヒトアデノウィルスに由来する。このようなベクターの複製能力は、E1aおよび/またはE1bコード領域における修飾または欠損によって(「複製不能」と考えられる点まで)弱められてもよい。特別な発現特性の達成、または繰り返し投与を許容し、または免疫応答をより低くするためのウィルスゲノムに対する他の修飾も好ましい。p53腫瘍抑制遺伝子をコードするDNA配列を含む、ヒトアデノウィルス5型ベクターが最も好ましい。ここに例示されるような、本発明の最も好ましい実行では、ベクターは1999年8月3日発行の Gregory et al., 米国特許 5,932,210 号(この教示の全ては、援用されて本明細書の一部とする)に記載されたような、p53腫瘍抑制遺伝子A/C/N/53 をコードする、複製不能なアデノウィルスベクターである。
【0026】
あるいは、ウィルスベクターは、条件により複製を行い、または複製能力を有していてもよい。条件により複製を行うウィルスベクターは、目的としない広いスペクトルムの感染を避けながらの、特定のタイプの細胞での選択的発現を達成するのに用いられる。条件により複製を行うベクターの例は、E. Pennisi (1996) Science 274:342-343、S. J. Russell (1994) Eur. J.of Cancer 30A(8):1165-1171 に記載されている。選択的に複製を行うベクターの追加例は、このような遺伝子の発現がない時にはそのウィルスは複製しないように、ウィルスの複製に不可欠な遺伝子が、特定の細胞のタイプまたは細胞状態においてのみ活性なプロモーターの制御下にあるようなベクターを含む。このようなベクターの例は、1997年12月16日発行のHenderson et al., 米国特許 5,698,443 号、および1999年2月16日発行の Henderson et al., 米国特許5,871,726 号に記載されており、この教示の全ては、援用されて本明細書の一部とする。
【0027】
加えて、ウィルスゲノムは、ある条件下でのみ複製または発現を達成する誘導可能なプロモーターを含むように修飾されてもよい。誘導可能なプロモーターの例は、科学文献中に知られている(例えば、Yoshida and Hamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230:426-430、Iida,et al. (1996) J. Virol. 70(9):6054-6059、Hwang, et al. (1997) J. Virol71(9):7128-7131、Lee, et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17(9):5097-5105、および Dreher,et al. (1997) J. Biol. Chem 272(46);29364-29371 参照)。
【0028】
ウィルスは、選択的に複製を行うウィルスになるようにデザインされてもよい。特に好ましい選択的複製ウィルスは、ラマチャンドラらの2000年4月20日公開の PCT 国際公開番号 WO 00/22137, 国際出願番号 PCT/US99/21452、J. Howe の、2000年4月20日公開のPCT 国際公開番号 WO WO0022136, 国際出願番号 PCT/US99/21451 に記載されている。特に好ましい選択的複製組み換えアデノウィルスは、J.Howe のものにおいてより充分に記載されているような dl01/07/309 ウィルスである。複製のために弱められたウィルスが、治療の舞台においても有用であることが示されている。例えば、E1b55K遺伝子(Bakerand Berk (1987) Virology 156: 107)における特異的欠損を含むアデノウィルス dl1520 が、ヒトにおいて治療効果を伴って用いられてきた。このようなベクターは、McCormickの1997年10月14日発行の米国特許 5,677,178 号、および McCormick の1998年12月8日発行の米国特許 5,846,945 号にも記載されている。本発明の方法は、このようなベクターに対する既存のまたは誘導された液性免疫応答を最小化するために、このようなベクターの投与と組み合わせて用いられてもよい。
【0029】
加えて、治療用ウィルスは、感染細胞における発現のために、治療用導入遺伝子を取り込んでもよい。文言「治療用導入遺伝子」は、標的細胞において、その発現が治療効果を生み出すヌクレオチド配列をいう。治療用導入遺伝子という文言には、腫瘍抑制遺伝子、抗原遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞分裂抑制遺伝子(cytostatic genes)、プロドラッグ活性化遺伝子、アポトーシス遺伝子、医薬遺伝子、または抗脈管形成遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。本発明のベクターは、IRESエレメントの使用を通して引き続き、または独立に制御されたプロモーターを通して、1つ以上の治療用導入遺伝子を生成するのに用いられてもよい。
【0030】
文言「腫瘍抑制遺伝子」は、標的細胞での発現が、悪性新生物の表現型を抑制可能、および/またはアポトーシスを誘導可能なヌクレオチド配列をいう。本発明の実行において有用な腫瘍抑制遺伝子の例は、p53遺伝子、APC遺伝子、DPC−4遺伝子、BRCA−1遺伝子、BRCA−2遺伝子、WT−1遺伝子、網膜芽腫遺伝子(Lee, et al. (1987) Nature 329:642)、MMAC−1遺伝子、線腫様ポリープ・コリ(adenomatous polyposiscoli)タンパク質(1998年7月21日発行 Albertsen, et al., 米国特許 5,783,666 号)、結腸ガンにおいて欠損した(DCC)遺伝子、MMSC−2遺伝子、NF−1遺伝子、3p21.3.染色体に位置する鼻咽頭癌腫瘍抑制遺伝子(Cheng,et al., 1998. Proc. Nat. Acad. Sci. 95:3042-3047)、MTS1遺伝子、CDK4遺伝子、NF1遺伝子、NF2遺伝子およびVHL遺伝子を含む。特に好ましい治療用アデノウィルスは、1999年8月3日発行のGregory, et al., 米国特許 5,932,210 号(この教示の全ては、援用されて本明細書の一部とする)においてより充分に記載されているように、p53腫瘍抑制遺伝子をコードするA/C/N/53 ベクターである。
【0031】
文言「抗原遺伝子」は、標的細胞におけるその発現が、免疫系によって認識可能な細胞表面抗原タンパク質の生成に至るヌクレオチド配列をいう。抗原遺伝子の例は、癌胎児性抗原(CEA)、p53(1994年2月3日公開の A. Levine, PCT 国際公開番号 WO94/02167 に記載)を含む。免疫認識を容易にするために、抗原遺伝子は、MHCクラスI抗原と融合されてもよい。好ましくは抗原遺伝子は、腫瘍細胞特異的抗原に由来する。理想的には、腫瘍拒絶抗原である。腫瘍拒絶抗原は当業界で周知であり、この例には、腫瘍拒絶抗原のMAGE、BAGE、GAGEおよびDAGEファミリーが含まれるが、これらに限定されない(Schulzet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, pp991-993 参照)。
何年もの間、腫瘍細胞は、そのうちの幾つかが腫瘍細胞表面に提示される多くの腫瘍細胞特異的抗原を生成することが知られてきた。これらは一般的に腫瘍拒絶抗原として呼ばれ、腫瘍拒絶抗原前駆体として呼ばれるより大きなポリペプチドに由来する。腫瘍拒絶抗原は、HLAを介して免疫系に提示される。免疫系は、これらの分子を異物として認識し、自然に選択して、これらの抗原を発現している細胞を破壊する。もし形質転換細胞が探知を逃れて樹立されると、腫瘍は発達する。腫瘍の樹立に対する予備形成防御を個人に提供するために、主要腫瘍拒絶抗原に基づいてワクチンが開発されてきた。
【0032】
文言「細胞毒性遺伝子」は、細胞におけるその発現が、毒性効果を生じるヌクレオチド配列をいう。このような細胞毒性遺伝子の例は、pseudomonas 外毒素、リシン毒素、ジフテリア毒素などをコードするヌクレオチド配列を含む。
【0033】
文言「細胞分裂抑制遺伝子」は、細胞におけるその発現が、その細胞周期における進行阻止を生じるヌクレオチド配列をいう。このような細胞分裂抑制遺伝子の例は、p21、網膜芽腫遺伝子、E2F−Rb遺伝子、p16、p15、p18およびp19のような、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤をコードする遺伝子群、1997年5月9日公開の Branellec, et al., PCT 公開 WO97/16459、および1996年10月3日公開の PCT 公開WO96/30385 に記載されているような、成長阻止特異的ホメオボックス(GAX)遺伝子を含む。
【0034】
文言「サイトカイン遺伝子」は、細胞におけるその発現がサイトカインを生成するヌクレオチド配列をいう。このようなサイトカインの例は、GM−CSF、インターロイキン(特にIL−1、IL−2、IL−4、IL−12、IL−10、IL−19、IL−20)、α、β、およびγサブタイプのインターフェロン、共通の(consensus)インターフェロンおよび特にインターフェロンα−2b、およびインターフェロンα−2α−1のような融合体を含む。
【0035】
文言「ケモカイン遺伝子」は、細胞におけるその発現がサイトカインを生成するヌクレオチド配列をいう。ケモカインという文言は、構造的に関連していて、分裂促進、走化性、または炎症活性を持ち、細胞によって分泌される構造的に関連した低分子量サイトカイン因子の一群をいう。それらは第一義的に、4つの保存されたシステインを有する70〜100アミノ酸残基のカチオン性タンパク質である。これらのタンパク質は、2つのアミノ末端システインの空間的配置に基づいて、2つの群に分類することが出来る。第1のグループでは、2つのシステインが1つの残基によって隔てられ(C−x−C)、一方第2のグループでは、それらは隣接している(C−C)。「C−x−C」ケモカインの一員の例は、血小板第4因子(PF4)、血小板塩基性タンパク質(PBP)、インターロイキン8(IL−8)、黒色腫成長刺激活性タンパク質(MGSA)、マクロファージ炎症タンパク質2(MIP−2)、マウスMig(m119)、ニワトリ9E3(またはpCEF−4)、ブタ肺胞マクロファージ走化因子IおよびII(AMCF−IおよびII)、前B細胞成長刺激因子(PBSF)、およびIP10を含むがこれらに限定されない。「C−C」群の一員の例は、単球走化性タンパク質1(MCP−1)、単球走化性タンパク質2(MCP−2)、単球走化性タンパク質3(MCP−3)、単球走化性タンパク質4(MCP−4)、マクロファージ炎症タンパク質1α(MIP−1−α)、マクロファージ炎症タンパク質1β(MIP−1−β)、マクロファージ炎症タンパク質1−γ(MIP−1−γ)、マクロファージ炎症タンパク質3α(MIP−3−α)、マクロファージ炎症タンパク質3β(MIP−3−β)、ケモカイン(ELC)、マクロファージ炎症タンパク質−4(MIP−4)、マクロファージ炎症タンパク質5(MIP−5)、LD78β、RANTES、SIS−ε(p500)、胸腺活性化調整ケモカイン(TARC)、エオタキシン、I−309、ヒトタンパク質HCC−1/NCC−2、ヒトタンパク質HCC−3、マウスタンパク質C10を含むが、これらに限定されない。
【0036】
文言「医薬タンパク遺伝子」は、その発現が、標的細胞において薬効を持つタンパク質の生成をもたらすヌクレオチド配列に関する。このような医薬遺伝子の例は、インシュリン前駆体遺伝子および類似体(PCT 国際特許出願番号 WO98/31397 に記載)、成長ホルモン遺伝子、ドーパミン、セロトニン、上皮成長因子、GABA、ACTH、NGF、VEGF(標的組織への血液の灌流を増大させ、脈管形成を誘導する。1998年7月30日公開のPCT 公開 WO98/32859)、トロンボスポンジンなどを含む。また、医薬タンパク質遺伝子は、抗体、Fab断片、Fv断片、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖の抗体、および非ヒト原料由来のヒト抗体のような、免疫反応性タンパク質を含んでもよい。
【0037】
文言「プロアポトーシス遺伝子」は、これの発現が、細胞のプログラムされた細胞死への過程を誘導する結果となるヌクレオチド配列をいう。プロアポトーシス遺伝子の例は、p53、アデノウィルス E3-11.6K(10.5K)、アデノウィルスE4またはf4遺伝子、p53経路遺伝子、およびカスペース(caspases)をコードする遺伝子を含む。
【0038】
文言「プロドラッグ活性化遺伝子」は、その発現が、外部因子による死に対して細胞を敏感にし、または細胞内で有毒な条件を惹起する治療用化合物に、非治療用化合物を変換する能力のあるタンパク質の生成をもたらすヌクレオチド配列をいう。プロドラッグ活性化遺伝子の例は、シトシン脱アミノ化酵素遺伝子である。シトシン脱アミノ化酵素は、5−フルオロシトシンを、潜在性抗腫瘍剤である5−フルオロウラシルへと変換する。腫瘍細胞の溶解は、腫瘍の局在する点で、5FCを5FUへ変換する能力のあるシトシン脱アミノ化酵素の局所的な爆発的産生をもたらし、多くの周囲の腫瘍細胞の死をもたらす。これは、これらの細胞をアデノウィルスで感染させる必要なしに、極めて多くの腫瘍細胞の死をもたらす(いわゆる「傍観者効果」)。加えて、TK遺伝子産物を発現している細胞がガンシクロビル投与による選択的な死に感受性であるチミジンキナーゼ(TK)遺伝子(例えば、Woo, et al., 1997年5月20日発行米国特許 5,631,236 号および Freeman, et al., 1997年2月11日発行米国特許5,601,818 号参照)を用いてもよい。
【0039】
文言「抗脈管形成」遺伝子は、その発現が、抗脈管形成因子の細胞外分泌をもたらすヌクレオチド配列をいう。抗脈管形成因子は、アンジオスタチン、Tie2(PNAS(USA)(1998) 95:8795-8800 に記載)のような血管上皮成長因子(VEGF)阻害剤、エンドスタチンを含む。
野生株タンパク質の機能性副断片をコードするための上記遺伝子に対する修飾および/または欠損が、本発明の実行における使用のために容易に適合されてもよいことは、当業者には容易に明らかであろう。例えば、p53遺伝子に関しての言及は、野生株タンパク質を含むだけでなく、修飾されたp53タンパク質も含む。このような修飾されたp53タンパク質の例は、核の保持を増すためのp53に対する促進する修飾、カルパイン保存性開裂部位を排除するための13〜19番アミノ酸の欠損(Kubbutat and Vousden (1997) Mol. Cell. Biol. 17:460-468)、オリゴマー化ドメインに対する修飾(Bracco,et al. の PCT 公開出願 WO97/0492 または米国特許 5,573,925 号などに記載)を含む。
【0040】
シグナルペプチドまたは核局在化シグナル(NLS)のような標的部分を含むことにより、上記治療遺伝子が媒体中へ分泌され、または特定の細胞内の場所へ局在化されてもよいということは、当業者には容易に明らかであろう。治療用導入遺伝子とヘルペス単純ウィルスのタイプ1(HSV−1)構造タンパク質VP22との融合タンパク質もまた、治療用導入遺伝子の定義に含まれる。VP22シグナルを有する融合タンパク質は、感染細胞内で合成された際、その感染細胞から外へ出され、約16細胞分の広さの径内の周囲の非感染細胞に効率的に進入する。このシステムは、その融合タンパク質が効果的に周囲細胞の核へ運ばれるので、転写活性タンパク質(例えばp53)と組み合わせた場合に、特に有用である。例えば、G. Elliott & P. O'Hare, Cell. 88:223-233:1997、A. Marshall &A. Castellino, Research News Briefs. Nature Biotechnology. 15:205:1997、1997年2月13日公開のO'Hare, et al., PCT 公開 WO97/05265 参照。HIVTatタンパク質由来の類似の標的部分は、Vives, et al.(1997) J. Biol. Chem. 272:16010-16017 にも記載されている。
【0041】
幾つかの例において、特定のタイプの細胞における外因性導入遺伝子の導入を達成するために、ベクターを利用したりまたはデザインすることは、価値を有するかも知れない。ある種のベクターは、ある種のタイプの組織に対して天然の走向性を示す。例えば、herpesviridiae 属由来のベクターは、神経細胞に好ましい感染をすることが示されている。組み換え修飾された herpesviridiaeベクターの例は、1994年7月12日発行の米国特許 5,328,688 号において開示されている。細胞タイプ特異性、または細胞タイプによる標的化も、ウィルス外被タンパク質の修飾によって、特徴的に広い感染力を持つウィルス由来のベクターにおいて達成されてもよい。例えば、細胞を標的とすることは、独特な細胞表面受容体との特異的な相互作用を持つ、修飾されたノブ−ファイバー部位の発現を達成するためのウィルスゲノムのノブ−ファイバーをコードしている配列の選択的修飾により、アデノウィルスベクターを用いて達成されている。このような修飾の例は、Wickham,et al. (1997) J. Virol. 71(11):8221-8229(RGDペプチドのアデノウィルス線維タンパク質への取り込み)、Arnberg,et al. (1997) Virology 227:239-244(眼および生殖器官への走化性を達成するためのアデノウィルス線維遺伝子の修飾)、Harrisand Lemoine (1996) TIG 12(10):400-405、Stevenson, et al. (1997) J. Virol.71(6):4782-4790、Michael, et al. (1995) Gene Therapy 2:660-668(アデノウィルス線維タンパク質へのガストリン放出ペプチド断片の取り込み)およびOhno, et al. (1997) Nature Biotechnology 15:763-767(プロテインA−IgG結合ドメインの Sindbis ウィルスへの取り込み)に記載されている。細胞特異的標的化の他の方法は、外被タンパク質と抗体または抗体断片との組み合わせによって達成されている(例えば、Michael,et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:6866-6869、Watkins, et al. (1997) Gene Therapy4:1004-1012、Douglas, et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 1574-1578 参照)。あるいは、標的化を達成するために、特定の部分がウィルス表面と組み合わされてもよい(例えば、Nilson,et al. (1996) Gene Therapy 3:280-286(EGFのレトロウィルスタンパク質との組み合わせ)参照)。加えて、ウィルスにコードされている治療用導入遺伝子もまた、好ましくは特定のタイプの細胞でその導入遺伝子の発現が可能となる、組織特異的プロモーター領域の制御下にあってもよい。
【0042】
ベクターは非ウィルス性であってもよいし、当業者にとって容易に入手可能な多くの商業供給元から入手できる。例えば、ベクターがエピソーム、または統合されたプラスミドでもあり得るプラスミドであってもよい。
本発明の更に好ましい実施形態では、上記核酸はアンチセンスの核酸であり、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【0043】
ここで用いられている場合、文言「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「アンチセンス」は、つまりオリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、修飾されたオリゴリボヌクレオチド、または修飾されたオリゴデオキシリボヌクレオチドのことを述べており、これは生理学的条件下、特定の遺伝子を含むDNA、またはその遺伝子のmRNA転写物とハイブリダイズし、これにより、その遺伝子の転写および/またはそのmRNAの翻訳を阻害する。アンチセンス分子は、その標的遺伝子とのハイブリダイゼーションの際、標的遺伝子の転写または翻訳を妨げるようにデザインされている。アンチセンスオリゴヌクレオチドの精確な長さおよびそれの、それの標的との相補性の度合いが、標的の配列およびその配列を含む特定の塩基を含む、選択された特異的標的に依存するであろうと、当業者は認識するであろう。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、生理学的条件下でその標的と選択的に結合するように、つまり、生理学的条件下で標的細胞における、他のどの配列に対してよりも、標的配列とより実質的にハイブリダイズするように構築され、調整されることが好ましい。
阻害に関して充分に選択的であり潜在的な能力を有するためには、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的と相補的な少なくとも7つ(Wagner et al., Nature Biotechnology 14:840-844, 1996)、より好ましくは少なくとも15の連続した塩基を含むべきである。最も好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、20〜30塩基の相補的な配列を含む。
遺伝子またはmRNA転写物のどの領域に対してもアンチセンスであるオリゴヌクレオチドが選ばれてもよいが、好ましい実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、翻訳開始、転写開始、またはプロモーター部位のような、N末端または5’上流部位に対応する。加えて、3’非翻訳領域が標的とされてもよい。その3’非翻訳領域は、安定化を行うmRNA分子に関連したタンパク質に対する結合部位として作動する cis 作動性配列を含むことが知られている。これらの cis 作動性部位は、上記安定化タンパク質と結合するように機能するヘアループ構造をしばしば形成する。この形の安定性制御のよく知られた例はヒストンmRNAによって示され、これの度合いは、少なくとも部分的には転写後に制御される。
【0044】
文言「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、当業界でよく知られた従来のオリゴヌクレオチド合成法を in vitro で用いるか、発現ベクター構築物を用いて組み換え合成されたオリゴヌクレオチドを用いて生産される物質として、解釈されるべきである。修飾されたオリゴヌクレオチドは、以下のように解釈される。ここで用いられるような文言「修飾オリゴヌクレオチド」は、次の場合のオリゴヌクレオチドについていう。
ii)通常は核酸と関連がない化学基が、オリゴヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチドに共有結合している。好ましい合成ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホロアミデート、カルバメート、リン酸トリエステル、アセトアミデート、ペプチド、およびカルボン酸メチルエステルである。
【0045】
文言「修飾オリゴヌクレオチド」は、共有結合で修飾された塩基および/または糖を伴ったオリゴヌクレオチドも含む。例えば、修飾オリゴヌクレオチドは、3’位の水酸基以外の、および5’位のリン酸基以外の低分子量有機基と共有結合した骨格糖を持つオリゴヌクレオチドを含む。これ故、修飾オリゴヌクレオチドは、2’−O−アルキル化リボース基を含んでもよい。加えて、修飾オリゴヌクレオチドは、リボースの代わりにアラビノースのような糖を含んでもよい。修飾オリゴヌクレオチドは、5位プロピン修飾塩基のような塩基類似化合物を含むこともできる(Wagner et al., Nature Biotechnology 14:840-844, 1996)。
【0046】
本発明はこのように、医薬的に許容可能なキャリアー(例えばポリマー、リポソーム/カチオン性脂質)と共に、その制御が有益な治療効果をもたらすタンパク質をコードする核酸と、生理学的条件下でハイブリダイズできるように相補的な、天然および/または修飾されたアンチセンス分子を含む医薬調剤を意図するものである。
【0047】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬組成物の1部分として投与されてもよい。このような医薬組成物は、当業界で既知であるいかなる標準的な生理学的および/または医薬的に許容可能なキャリアー(例えばリポソーム)とも組み合わせて、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでもよい。この組成物は無菌的であり、患者への投与について、治療に有効な量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むべきである。文言「医薬的に許容可能」とは、活性成分の生物学的活性の効果を妨げない無毒な物質を意味する。文言「生理学的に許容可能」とは、細胞、細胞培養、組織または器官のような生物学的システムと相容れる無毒な物質をいう。
【0048】
本発明のなお更に好ましい方法では、上記核酸は2本鎖RNA分子(RNA)である。遺伝子機能を特異的に除去する技術は、また阻害的RNA(RNAi)としても言及される2本鎖RNAの細胞への導入を通じてのものであり、その結果RNAi分子に含まれる配列に対して相補的なmRNAの破壊がもたらされる。このRNAi分子は、2本鎖RNA分子を形成するためにお互いにアニールされた2つの相補的なRNA鎖(センス鎖およびアンチセンス鎖)を含む。RNAi分子は、典型的には、除去されるべき遺伝子のエクソン配列またはコード配列に由来する。本発明の好ましい方法では、RNAi分子の長さは100塩基対〜1000塩基対である。より好ましくは、RNAiの長さは約100塩基対、200塩基対、300塩基対、400塩基対、500塩基対、600塩基対、700塩基対、800塩基対、900塩基対または1000塩基対から選ばれる。より好ましくは、上記RNAiは少なくとも1000塩基対である。
本発明の更に好ましい方法では、上記RNAiは、エクソンに由来する。
【0049】
あるいは、上記RNAi分子は、遺伝子のコード/エクソン配列に並ぶイントロン配列、または5’および/または3’非コード配列に由来する。最近の研究は、コード配列由来の100〜1000塩基対の範囲のRNAi分子が、遺伝子発現の有効な阻害剤であることを示唆している。驚いたことに、ほんの僅かなRNAi分子だけが、機序が触媒的であることを示唆する遺伝子発現をブロックするのに必要とされる。mRNA合成またはプロセッシングの間に、僅かなRNAiでも、そのRNAiがそれの効果を及ぼすことを示す細胞の細胞質中で検出可能であれば、作用部位は核であるように思われる。
【0050】
本発明の、なお更に好ましい方法では、上記RNAi分子は、修飾されたリボヌクレオチド塩基を有する。天然に存在する塩基であるシトシン、ウラシル、アデノシンおよびグアノシン同様に修飾塩基を含むことが、上記修飾塩基を有するRNAi分子に有利な性質を付与しうることがあることは、当業者にとっては明らかであろう。例えば、修飾塩基はRNAi分子の安定性を増加させることがあり、これによって、望まれる効果を創出するのに要求される量を減らすことが出来る。
【0051】
この現象を説明する理論はあるのだが、RNAiの作用の精確な機序は、まだ分かっていない。例えば、全ての器官は、外因性遺伝子発現の効果を制限する防御機序を進化させてきた。例えば、ウィルスはしばしば、感染する器官において有害な効果を引き起こす。それ故ウィルスの遺伝子発現および/または複製は、抑制される必要がある。加えて、遺伝子的形質転換の急速な発展、および遺伝子導入植物や動物の提供は、導入遺伝子も外来の核酸として認識され、抑制(Singer and Selker, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1995;197:165-77)、遺伝子のサイレンシング(MatzkeandMatzke, Novartis Found Symp. 1998;214:168-80; discussion 181-6. Review)および共抑制(Stamet al., Plant J. 2000;21(1):27-42)と様々に呼ばれる現象に付されてきた。
RNAiを用いる初期の研究は、線虫 Caenorhabditis elegans を使用した。その線虫の中へ注入されたRNAiは、そのRNAi分子を含む遺伝子配列に対応するポリペプチドの消失という結果になった(Montgomeryet al., 1998、Fire et al., 1998)。より最近では、RNAi阻害の現象は、例示であって限定ではないが、植物、鞭毛虫(Shi etal., 2000)、Drosophila spp.(Kennerdell and Carthew, 2000)を含む多くの真核生物おいて示されてきた。最近の実験は、RNAiがより高等な真核生物においても機能することがあることを示した。例えば、RNAiはマウス卵母細胞中のc-mos 遺伝子、およびマウス着床前期胚中のE−カドヘリンも除去できることが示された(Wianny and Zernicka-Goetz, 2000)。
【0052】
本発明のなお更に好ましい方法では、上記核酸はリボザイムである。リボザイムは、当業界でよく知られた触媒的RNAである。リボザイムは、基質RNAとハイブリダイズする配列に隣接して並ぶ配列を持つ触媒中心を有する。最も簡単な触媒中心は、ハンマーヘッドとして知られるRNAモチーフである。触媒RNAの発見以来、ウィルスmRNAおよび疾病遺伝子mRNAを選択的に除去できるような、標的とされた遺伝子機能を持つリボザイムをデザインしたいという要望がある。例えば、US6069007 は、HIV1のmRNAに対して活性なリボザイム、およびそれらのAIDS治療における使用を開示している。US6087172は、リューマチ関節炎に関連したインターロイキンであるIL−15をコードするmRNAを除去するようにデザインされたリボザイムを開示している。US6077705 は、変異遺伝子(この例ではα−1−アンチトリプシンである)の野生株タイプの複製での置き換えと組み合わせた、変異遺伝子の発現を阻害する遺伝子治療法を開示している。
【0053】
(投与/処置方法)
本発明の製剤は、組織中への核酸の移入を促進するのに有用である。本発明による溶液は、消化管経由(経口、直腸または舌下)または非経口(静注、皮下または吸入による)を含む様々な方法で、対象動物へ導入されてもよいことは、当業者には明らかであろう。その溶液は、移植されたカテーテルにより、哺乳類へ与えられてもよい。本発明の好ましい実行では、その溶液は、周囲の組織の形質導入を容易にするために体腔内へ点滴される。その溶液が核酸の移送のために供されてもよい体腔の例は、腹膜腔、胸膜腔、眼および腹腔を含む。加えてその溶液は、脳脊髄液、関節、結腸、膀胱、胆嚢のような他の液体を有している空間で供されてもよい。その溶液が同時に(混合物として)、別々に、または続けて、動物に投与されることが可能であることも、当業者にとって明らかであろう。
【0054】
本発明の更なる態様によれば、デキストリン、糖、2価陽イオンおよび核酸分子を有する組成物が与えられる。好ましくは、上記組成物は、遺伝子治療のための核酸の移送における使用のためのものである。本発明の好ましい実行において、この手順は、ヒトのガンの処置のための組み換えアデノウィルスによる治療と組み合わせて用いられる。従来の腫瘍学診療によれば、患者は、治療薬の最大寛容量で投与される。一連の臨床研究では、7.5x1013個の組み換えアデノウィルス粒が、ヒト対象ではよく寛容された。p53を発現する複製不能組み換えアデノウィルスを用いた臨床治験は、最大5ヶ月まで毎月繰り返される5日間の治療期間に、約7.5x1013個の組み換えウィルス粒を注入するという一連の治療が、ヒトにおける卵巣ガンの処置において有効であることを示唆している。
【0055】
本発明の特に好ましい実施形態では、p53をコードする複製不能組み換えアデノウィルスを含む本発明の製剤が、卵巣ガンの処置のために腹膜中へ点滴される。この薬剤を使った典型的な一連の治療は、5日間に渡り、毎日7.5x1013個のウィルス粒の投与を含む。A/C/N/53 ウィルスを用いる卵巣ガン処置のための典型的な臨床プロトコールは、化学療法剤であるカルボプラチンおよびパクリタキセルの投与と組み合わせて、上記の典型的な5日間の治療を含む。本発明の好ましい実行では、哺乳類とはヒトであって、休止期間を挟んで3通りまたはこれより多い一連の治療、好ましくは5〜6通りの治療を受ける。
アデノウィルス以外の治療用ウィルスについてのこの手順の修飾は、当業者にとっては容易に明らかであろう。
【0056】
本発明の製剤は更に、追加的なキャリア、賦形剤または希釈剤を含んでもよい。この組成物は、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなど、pH調整および緩衝剤、浸透圧調整剤、湿潤剤などのような、およその生理学的条件に求められるような、医薬的に許容可能な補助剤を含んでもよい。その医薬製剤における本発明の組成物の濃度は、幅広く、つまり重さにして約0.1%未満から、通常では、または少なくとも約2%、20%〜50%くらい、またはこれ以上で変わることができ、選択された特定の投与方法に応じて、液体の体積、粘性などによって、第一義的に選択されるであろう。
【0057】
(実施例)
以下の例は、ただ単に本発明の実行を例示しているだけであって、これによって範囲を限定することは意図されていない。
【0058】
(実施例1)
(イコデキストリン製剤を用いたラットにおける(腹膜投与)rAd仲介導入遺伝子発現の増幅)
組み換えアデノウィルスベクターによる導入遺伝子発現を増幅する能力を評価するため、導入遺伝子発現の相対的なレベルを比較する実験が行われた。βガラクトシダーゼ遺伝子(rAd-bgal)をコードする組み換えアデノウィルスベクターが、実質的に Gregory et al., 米国特許 5,932,210 号の教示により調製された。以下の溶液が100mlの体積で調製された。
【0059】
【表1】
【0060】
10匹の雌ニュージーランド白ウサギをケタミン/キシラジンで麻酔し、上記溶液を腹膜点滴した。その溶液は、背側で1時間および腹側で1時間インキュベートされた。その動物は屠殺され、腹膜壁の生検が獲られた。獲られた組織中のウィルスRNAの水準は、RT−PCR法を用いて測定された。その腹膜壁から単離された導入遺伝子特異的RNA濃度の結果は、添付図面の図1に提示されている。提示されたデータから分かるように、ウィルス緩衝溶液に15%イコデキストリンを加える(溶液A)と、緩衝コントロール溶液のみ(溶液B)に比べて、導入遺伝子発現において著しい増加という結果になった。
【0061】
(実施例2)
(マウス異種移植前立腺ガンモデルにおけるイコデキストリンrAd−p53製剤の効果)
組み換えアデノウィルスの製剤を含むイコデキストリンが増強された治療効果を与えることを示すために、p53腫瘍抑制遺伝子(「rAd−p53」)をコードする複製不能組み換えアデノウィルスベクターの抗腫瘍効果を比較する実験が行われた。このベクターの効果は、G. D. Paine-Murrieta et al., Cancer Chemother. Pharmacol., 1997, 40:209. に記載されたような、マウス異種移植前立腺ガンモデルにおいて比較された。効果の測定手段としては、生存数の増加が用いられた。
【0062】
ACN53と名付けられたrAd−p53ベクターは、実質的に Gregory et al., 米国特許 No. 5,932,210 号の教えるところにより調製された。PC−3前立腺ガン細胞は、受託番号CRL−1435であるM. D. Bethesda の American TypeCulture Collection から入手された。約5週齢の51匹の雌ヌードマウスが、Harlan Laboratories から入手された。HBSS−FBS(ハンクス調整塩溶液w/10% ウシ胎児血清。HBSSは Fisher Scientific から入手され、FBSは BioWhittaker から入手された)0.2mL体積中約5x106個のPC3細胞が各動物に腹膜注入された。これらの細胞は、処置開始前の9日間、腫瘍を樹立するようにさせられた。
7種類の異なる製剤が、以下の表2によって調製された。
【0063】
【表2】
【0064】
それらの動物は、以下の表3においてより充分に記載されるように、最大8つの処置群に分けられた。
【0065】
【表3】
【0066】
処置は9日目(Day9)に始められた(注:ここで述べられている「Day」で書き表された全ての処置日は、PC−3細胞の注入日から数えられる)。処置レジメンの開始時点においては、全ての動物は健康な様相を呈していた。無処置のコントロール群1以外、各群は腫瘍細胞の注入後、9、11、14、15および18日目に、各々1.0mLの適切な製剤の単回腹膜注入からなる処置からなる処置レジメンを与えられた。この処置レジメンが完了した際、動物はランダムに籠に入れられ、目に見えて明らかな体重の減少、背中の彎曲および鎮静によって特徴付けられるような病態動物に対しては、毎日(ブラインドされて)モニターされた。病態動物は屠殺され、全体を病理学的に検査された。動物数、屠殺(または死亡が発見された)日、および全体的な病理学的知見が記録された。結果が、以下の表4にまとめられている。
【0067】
【表4】
【0068】
注入後の生存日数は Kaplan-Meier survival を用いてプロットされ、処置群1〜4の結果を、添付図面の図2においてグラフ表示する。群間の比較はLogrank 試験 (Statview Software) を用いて行われた。p<0.05の場合、差は有意であるとみなされた。
【0069】
提示されたデータから分かるように、イコデキストリンを含むACN53製剤を用いた処置は、5x1010個のウィルス粒のウィルス投与量でvPBS中で製剤されたACN53またはコントロールと比較して、統計的に有意な生存の延長という結果になった。イコデキストリン中ウィルスの最大投与量を受けた1匹の動物は、研究の完了時(100日目)に、腫瘍の成長の臨床的な兆候から免れていた。この動物は腹膜腔内での腫瘍の成長が最小だったが、このことは、この動物が腫瘍細胞を注入され、腫瘍が形成されても、腫瘍の成長は阻害されることを示した。
【0070】
(実施例3)
(マウス異種移植卵巣ガンモデルにおけるイコデキストリンrAd−p53製剤の効果)
(上記表2中の製剤BおよびC)を含むアデノウィルス製剤を含むイコデキストリンの効果は、ヒト卵巣ガンのマウス腹膜異種移植モデルで評価された。44匹の雌ヌードマウス(20〜25g)は、0.2mL中1x107個のヒト2774卵巣ガン細胞の腹膜注入を受け、腫瘍は2日間成長させられた。マウスは2、5、8および12日目に、以下の内の1つの0.5mL腹膜注入を受ける6匹ずつの6群に分けられた。
PBSまたはイコデキストリン中、1x1010個のrAd−p53粒子
PBSまたはイコデキストリン中、5x109個のrAd−p53粒子
PBSまたはイコデキストリン中、1x109個のrAd−p53粒子
残りの動物は、1つの無処置群(N=4)、及び0.5mLイコデキストリンのみで処置した1つの群(N=4)に分けられた。マウスはランダムに籠に帰属され、マスクされた観察者により、腫瘍成長期間に渡りモニターされた。細胞注入後の生存数は、処置群間で比較された。結果を図3及び表5に提示する。
【0071】
(実施例4)
(ヒト卵巣ガンの通常モデルにおける腫瘍性アデノウィルス(K9TB)のvIco促進効果)
マウスのヒト卵巣ガンモデルが、条件付きで複製を行うアデノウィルスベクター製剤を含むイコデキストリンの効果を評価するのに使われた。このモデルはヌードマウス(20〜25g、Harlan, Indianapolis, IN から市販)において、ハンクス調整塩溶液(HBSS)0.5mL中の、1x107個のMDAH2774ヒト卵巣ガン細胞(受託番号CRL−10303によりAmerican Type Culture Collection から入手可能)の懸濁液の単回腹膜注入投与により樹立された。腫瘍は7日間成長を許容され、マウスは、触診可能な腫瘍の存在に関して評価された。腫瘍を証明するそれらのマウスは、処置のために群に分けられた。
K9TBと名付けられ、条件付きで複製を行う組み換えアデノウィルスベクターは、実質的にラマチャンドラらの教えるところにより調製された(2000年4月20日公開 PCT 国際公開番号 WO00/22137)。K9TBウィルスは、E1a領域の4〜25番目のアミノ酸の欠損、E3領域に挿入されたE2F−Rb融合タンパク質(2000年6月13日発行、Antelmanet al., 米国特許 6,074,850 号)の発現を司るp53応答エレメントを含む、条件付きで複製を行うウィルスである。
【0072】
以下の表6中与えられる以下の製剤が、上記腫瘍モデルにおける評価のために調製された。
【0073】
【表5】
【0074】
腫瘍保有動物は、処置のために以下の群に分割された。
【0075】
【表6】
【0076】
各群は、腫瘍細胞の注入後、7、9、12および14日目に0.5mLの適切な製剤の単回腹膜注入よりなる処置レジメンを与えられた。この処置レジメンが完了した際、それら動物はランダムに籠に入れられ、明らかな体重の減少、背中の彎曲および鎮静によって特徴付けられるような瀕死の動物については、毎日(ブラインドされて)モニターされた。瀕死の動物は屠殺され、全体を病理学的に検査された。動物数、屠殺(または死亡が発見された)日、および総合的な病理学的知見が記録され、その結果が以下の表8にまとめられた。
【0077】
【表7】
【0078】
注入後の生存日数は、Kaplan-Meier プロットを使ってまとめられ、1〜4の処置群の結果は、添付図面の図3にグラフ提示されている。群間の比較は Logrank試験 (Statview Software) を用いて行われた。p<0.05の場合、差は有意と見なした。
【0079】
データのグラフ表示は、添付図面の図3に提示されている。製剤H/処置群2はxで表され、製剤I/処置群1は4角で表され、製剤J/処置群3は丸で表され、製剤L/処置群4は3角で表されている。
提示されたデータから分かるように、vIcoとvPBSとの両方の製剤中の組み換えアデノウィルスベクターK9TBを用いた腫瘍保有マウスの処置は、ベヒクルコントロールと比較して生存を延長させた。しかし、vIco中で製剤されたK9TBは、vPBS中製剤されたK9TBに比較して生存の延長を示した(p<0.01、1処置群につき動物のn=7)。
【0080】
【表8】
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、ベータガラクトシダーゼをコードする組み換えアデノウィルスベクターを、ここでの実施例1でより充分に記述されるような様々な製剤中に含む100mL溶液の腹膜点滴後の、ウサギにおける腹膜の上皮組織でのベータガラクトシダーゼ遺伝子の発現の測定を提供するヒストグラムである。縦軸はRT−PCR法で決定される組織中のウィルスRNAの水準を表す。
【図2】 図2は、ここでの実施例2に記述されているマウス異種移植前立腺ガンモデルの結果のグラフ表示である。縦軸は、生存して残っている動物のフラクションを表す。横軸は時間を日数で表している。表3にまとめられた8つの処置群が表されている。
【図3】 図3は、実施例3に記載され、表5に提示された、マウス異種移植卵巣ガンモデルの結果のグラフ表示である。
【図4】 図4は、実施例4に記載され、表6、7および8に提示されたマウス異種移植卵巣ガンモデルの結果のグラフ表示である。この例は、複製を行うアデノウィルスベクターを用いている。
Claims (40)
- 細胞への核酸の移送において使用する医薬の製造のための、核酸、デキストリンおよび少なくとも1種類の二糖の溶液を含む組成物の使用であって、デキストリンの量が2%〜20%w/vであり、二糖の量が1〜10%w/vで組成物に存在し、溶液の浸透圧が250〜350ミリモル浸透圧濃度である、該使用。
- デキストリンの分子量が1,000〜200,000の範囲内である、請求項1記載の使用。
- デキストリンの分子量が2,000〜55,000である、請求項2記載の使用。
- デキストリンが、12より大きい重合度のポリマーを15%w/vより多く含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用。
- デキストリンが、12より大きい重合度のポリマーを50%w/vより多く含む、請求項4記載の使用。
- デキストリンが、20%w/vより少ない量で前記溶液中に存在する、請求項2〜5のいずれか1項に記載の使用。
- デキストリンが、2%w/v、3%w/v、4%w/v、5%w/v、6%w/v、7%w/v、8%w/v、9%w/v、10%w/v、11%w/v、12%w/v、13%w/v、14%w/v、15%w/v、16%w/v、17%w/v、18%w/v、19%w/v、20%w/vから選ばれる量で前記溶液中に存在する、請求項1記載の使用。
- デキストリンが2〜5%w/vで存在する、請求項1記載の使用。
- デキストリンが4%w/vである、請求項8記載の使用。
- 二糖が2〜5%w/vの量である、請求項1記載の使用。
- 二糖がスクロースであり、スクロースの量が3%w/vである、請求項1に記載の使用。
- デキストリンの量が15%w/vであり、スクロースの量が3%w/vである、請求項1記載の使用。
- デキストリンの量が4%w/vであり、スクロースの量が3%w/vである、請求項1記載の使用。
- 前記溶液が更に2価陽イオンを含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の使用。
- 前記2価陽イオンが、少なくとも0.2mMの濃度で存在する、請求項14記載の使用。
- 前記2価陽イオン濃度が0.2〜3.0mMである、請求項14記載の使用。
- 前記2価陽イオンが塩化マグネシウムにより供給され、その濃度が2.0mMである、請求項14〜16のいずれか1項に記載の使用。
- 前記溶液が4%w/vのデキストリン、3%w/vのスクロースおよび2.0mMの塩化マグネシウムを含む、請求項17記載の使用。
- 前記核酸分子がベクターである、請求項1〜18のいずれか1項に記載の使用。
- 前記ベクターが真核細胞での発現に適用される、請求項19記載の使用。
- 前記ベクターがウィルスに基づいたものであり、以下のウィルス、アデノウィルス、レトロウィルス、アデノ関連ウィルス、ヘルペスウィルス、レンチウィルス、ワクシニアウィルス、バキュロウィルスから選ばれる、請求項19または20記載の使用。
- 前記ウィルスがアデノウィルスである、請求項21記載の使用。
- 前記アデノウィルスが導入遺伝子をコードする、請求項22記載の使用。
- 前記導入遺伝子が腫瘍抑制遺伝子である、請求項23記載の使用。
- 前記腫瘍抑制遺伝子がp53である、請求項24記載の使用。
- 前記ベクターが複製能力を有する、請求項21〜24のいずれか1項に記載の使用。
- 前記ベクターが、条件付きで複製を行う複製能力を有するベクターである、請求項26記載の使用。
- 前記核酸分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項1〜18のいずれか1項に記載の使用。
- 前記核酸分子が阻害的RNAである、請求項1〜18のいずれか1項に記載の使用。
- 前記核酸分子がリボザイムである、請求項1〜18のいずれか1項に記載の使用。
- 細胞への核酸の移送において使用するための、核酸、デキストリンおよび少なくとも1種類の二糖を含む溶液であって、デキストリンの量が2%〜20%w/vであり、二糖の量が1%〜10%w/vで存在し、溶液の浸透圧が250〜350ミリモル浸透圧濃度である、該溶液。
- 前記核酸分子がベクターである、請求項31に記載の溶液。
- 前記ベクターがアデノウィルスベクターである、請求項32に記載の溶液。
- 前記アデノウィルスベクターが複製能力を有するベクターである、請求項33に記載の溶液。
- 核酸、デキストリン、少なくとも1種類の二糖及び2価陽イオンを含む、腹腔投与用医薬溶液製剤であって、デキストリンの量が2%〜20%w/vであり、二糖の量が1%〜10%w/vで存在し、溶液の浸透圧が250〜350ミリモル浸透圧濃度である、該医薬溶液。
- 前記2価陽イオン濃度が0.2〜3.0mMである、請求項35に記載の医薬溶液製剤。
- 前記2価陽イオンが塩化マグネシウムにより供給される、請求項35または36に記載の医薬溶液製剤。
- 前記核酸分子がベクターである、請求項35〜37のいずれか一項に記載の医薬溶液製剤。
- 前記ベクターがアデノウィルスベクターである、請求項38に記載の医薬溶液製剤。
- 前記アデノウィルスベクターが複製能力を有するベクターである、請求項39記載の医薬溶液製剤。
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