ES2327491T3 - Formulaciones que comprenden polimeros de dextrina en combinacion con azucares para la admistracion de acidos nucleicos.sp. - Google Patents

Abstract

Uso de una disolución que comprende un ácido nucleico, dextrina y al menos un disacárido, en el que la cantidad de dextrina presente en la disolución es de entre el 2-20% (p/v), la cantidad de disacárido es de entre el 1-10% (p/v) y la osmolaridad de dicha disolución es esencialmente isotónica con la osmolaridad del medio fisiológico de la célula que va a tratarse, siendo la disolución para la fabricación de un medicamento para la administración de ácido nucleico a una célula.

Description

Formulaciones que comprenden polímeros de dextrina en combinación con azúcares para la administración de ácidos nucleicos.

Campo de la invención

La invención se refiere a composiciones cuya osmolaridad corresponde sustancialmente a la osmolaridad fisiológica que rodea a la célula o tejido para su uso en un método para la administración de ácido nucleico a células, particularmente pero no exclusivamente, en terapia génica.

Antecedentes de la invención

Se han desarrollado muchos métodos en los últimos 30 años para facilitar la introducción de ácido nucleico en células que han ayudado mucho, entre otras cosas, a la comprensión del control de la expresión génica.

Los métodos convencionales para introducir ADN en células se conocen bien en la técnica y normalmente implican el uso de reactivos químicos, lípidos catiónicos o métodos físicos. Los métodos químicos que facilitan la captación de ADN por células incluyen el uso de DEAE-dextrano (Vaheri y Pagano, Science 175:434). El DEAE-dextrano se asocia con e introduce el ADN en las células. Sin embargo, esto puede dar como resultado la pérdida de viabilidad celular. El fosfato de calcio también es un agente químico comúnmente usado que, cuando se coprecipita con ADN, introduce el ADN en las células (Graham et al. Virology (1973) 52: 456).

El uso de lípidos catiónicos (por ejemplo, liposomas (Felgner (1987) Proc. Natl. Acad. Sci USA, 84:7413) se ha convertido en un método común dado que no tiene el grado de toxicidad mostrado por los métodos químicos descritos anteriormente. La cabeza catiónica del lípido se asocia con la estructura principal de ácido nucleico cargada negativamente del ADN que va a introducirse. El complejo de lípido/ADN se asocia con la membrana celular y se fusiona con la célula para introducir el ADN asociado en la célula. La transferencia de ADN mediada por liposomas tiene varias ventajas con respecto a los métodos existentes. Por ejemplo, células que no responden a métodos químicos tradicionales se transfectan más fácilmente usando la transferencia mediada por liposomas.

Todavía más recientemente, métodos físicos para introducir ADN se han convertido en medios eficaces para transfectar células de manera reproducible. La microinyección directa es un método de este tipo que puede administrar ADN directamente al núcleo de una célula (Capecchi (1980) Cell, 22:p479). Esto permite el análisis de transfectantes de una única célula. Los llamados métodos "biolísticos" insertan físicamente ADN dentro de células y/u orgánulos usando partículas de alta velocidad recubiertas con ADN (Neumann (1982) EMBO J, 1: 841).

La electroporación es posiblemente el método más popular para transfectar ADN. El método implica el uso de una carga eléctrica de alto voltaje para permeabilizar membranas celulares momentáneamente, haciéndolas más permeables a complejos macromoleculares. Sin embargo, los métodos físicos para introducir ADN sí dan como resultado una pérdida considerable de viabilidad celular debido a daño intracelular. Por tanto, estos métodos requieren una optimización extensa y también requieren equipos caros.

Todavía más recientemente, un método denominado inmunoporación se ha convertido en una técnica reconocida para la introducción de ácido nucleico en células, véase Bildirici et al. Nature (2000) 405, 298. La técnica implica el uso de perlas recubiertas con un anticuerpo frente a un receptor específico. La mezcla de transfección incluye ácido nucleico, normalmente ADN de vector, perlas recubiertas con anticuerpo y células que expresan un receptor de superficie celular específico. Las perlas recubiertas se unen al receptor de superficie celular y cuando se aplica un esfuerzo cortante a las células las perlas se arrancan de la superficie celular. Durante la eliminación de las células, se crea un orificio transitorio a través del cual pueden entrar ácido nucleico y/u otras moléculas biológicas. Puede conseguirse una eficacia de transfección de entre el 40-50% dependiendo del ácido nucleico usado.

Normalmente, la terapia génica implica la transferencia, y opcionalmente la inserción estable, de nueva información genética dentro de células para el tratamiento terapéutico de una enfermedad. Los genes que se han expresado satisfactoriamente en ratones tras la transferencia mediante vectores de retrovirus incluyen la hipoxantina fosforribosil transferasa humana (Miller A et al., 1984, Science 255:630). También se han transferido genes bacterianos al interior de células de mamíferos, en forma de genes bacterianos de resistencia a fármacos. También se ha conseguido la transformación de células progenitoras hematopoyéticas para la resistencia a fármacos mediante vectores de virus eucariotas con sistemas de vectores basados en retrovirus recombinantes (Hock RA y Miller AD 1986, Nature 320:275-277; Joyner, et al. (1983) Nature 305:556-558; Williams DA et al. 1984, Nature 310:476-480; Dick JE et al., 1985, Cell 42:71-79); Keller G et al. 1985, Nature 318: 149-154; Eglitis M et al., 1985, Science 230: 1395-1398). Se han usado satisfactoriamente vectores de virus adenoasociados para transducir líneas celulares de mamíferos para la resistencia a neomicina (Hermonat PL y Muzyczka N, 1984, citado anteriormente; Tratschin JD et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:3251). Otros sistemas de vectores virales que se han investigado para su uso en transferencia génica incluyen papovavirus y virus vaccinia (véase Cline, ML (1985) Pharmac. Ther. 29:69-92).

Los problemas principales con respecto a la terapia génica se refieren al direccionamiento eficaz del ácido nucleico a células y el establecimiento de expresión transgénica de alto nivel en tejidos seleccionados. Se han desarrollado varias metodologías que afirman facilitar cualquiera de o ambos requisitos. Por ejemplo, el documento US6043339 da a conocer el uso de péptidos señal que, cuando se fusionan al ácido nucleico, pueden facilitar la translocación del ácido nucleico unido a través de membranas celulares. El documento US6083714 da a conocer un ácido nucleico combinado y medios de direccionamiento que usan el policatión polilisina acoplado a un receptor de integrina, seleccionando así como diana las células que expresan la integrina. El documento EP1013770 da a conocer el uso de señales de localización nuclear (NLS) acopladas a oligonucleótidos. El conjugado puede estar unido covalentemente a ADN de vector y el complejo puede usarse para transfectar células. La secuencia de NLS sirve para facilitar el paso del ADN de vector a través de la membrana nuclear, dirigiendo así la administración génica al núcleo.

Puede introducirse ácido nucleico, por ejemplo ADN de vector, en un animal a través de una variedad de vías que incluyen la vía enteral (vía oral, rectal o sublingual) o la vía parenteral (vía intravenosa, subcutánea, o por inhalación).

Se sabe que la introducción de ciertas disoluciones acuosas dentro de la cavidad peritoneal puede ser útil en el tratamiento de pacientes que padecen insuficiencia renal. Tal tratamiento se conoce como diálisis peritoneal. Las disoluciones contienen electrolitos similares a los presentes en plasma; también contienen un agente osmótico, normalmente dextrosa, que está presente en una concentración suficiente como para crear un grado deseado de presión osmótica a través de la membrana peritoneal. Bajo la influencia de esta presión osmótica, tiene lugar un intercambio a través de la membrana peritoneal y da como resultado la retirada de los productos de desecho del torrente sanguíneo, tales como urea y creatinina, que se han acumulado en la sangre debido a la falta de función renal normal. Mientras está teniendo lugar este intercambio, también hay una transferencia neta de dextrosa desde la disolución hasta la sangre a través de la membrana peritoneal, lo que provoca el descenso de la osmolalidad de la disolución. Debido a esto, la osmolalidad inicial de la disolución debe hacerse bastante alta (usando una concentración suficientemente alta de dextrosa) con el fin de que la disolución continúe efectuando la diálisis durante un tiempo razonable antes de que tenga que retirarse y sustituirse por disolución nueva.

Se han propuesto otros agentes osmóticos para su uso en diálisis peritoneal y en los últimos años se ha usado dextrina (un polímero de glucosa de hidrolizado de almidón). Cuando se instila en la cavidad peritoneal, la dextrina se absorbe lentamente a través del sistema linfático, alcanzando finalmente la circulación periférica. La estructura de dextrina es tal que las amilasas degradan la molécula para dar oligosacáridos en la circulación. Éstos se eliminan mediante metabolismo adicional para dar glucosa.

Normalmente, un medio elegido para introducir materiales de terapia génica en un paciente a través de una cavidad corporal podría ser una disolución salina tamponada, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato (PBS).

Se han propuesto disoluciones de dextrina como medio para la administración de fármacos al cuerpo a través del peritoneo. En el documento GB-A-2207050, se propone una disolución de este tipo para la administración intraperitoneal de fármacos para los que la administración enteral no es satisfactoria. Se dice que un enfoque de este tipo es particularmente útil para la administración de fármacos peptídicos tales como eritropoyetina y hormonas del crecimiento. También se hace referencia a antibióticos de cefalosporina. También se han descrito disoluciones de dextrina para la administración de agentes quimioterápicos en el tratamiento de cánceres de ovario. El uso de formulaciones de icodextrina para aumentar la eficacia de agentes quimioterápicos (especialmente 5FU) aumentando su tiempo de permanencia en el espacio peritoneal se describe bien en Dobbie JW. (1997) Adv Perit Dial.13:162-7 y McArdle CS, et al. (1994) Br J Cancer 70(4):762-6. Además, se han usado disoluciones de dextrina para administrar vectores virales in vitro (véanse Conroy et al. Proc. Am. Ass. Cancer Res. nº 40, 2000; y Engler et al. Clin. Cancer Res. 6, 11, 2000). Sin embargo, ninguna de estas publicaciones da a conocer el uso de una disolución combinada de dextrina y un disacárido.

La presente invención se refiere a una disolución que contiene dextrina que muestra capacidad potenciada para administrar ácido nucleico a células, dando como resultado una expresión de alto nivel de genes transfectados.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona el uso de una disolución que comprende un ácido nucleico, dextrina y al menos un disacárido en la que la cantidad de dextrina presente en la disolución es de entre el 2-20% (p/v), la cantidad de disacárido es de entre el 1-10%(p/v) y la osmolaridad de dicha disolución es esencialmente isotónica con la osmolaridad del medio fisiológico de la célula que va a tratarse, siendo la disolución para la fabricación de un medicamento para la administración de ácido nucleico a una célula.

La presente invención proporciona además una disolución farmacéutica adecuada para la instilación intraperitoneal que comprende dextrina siendo la cantidad de dextrina presente en la disolución de entre el 2-20% (p/v); al menos un disacárido siendo la cantidad de disacárido de entre el 1-10%; un catión divalente y un vector recombinante siendo la osmolaridad de dicha disolución de desde aproximadamente 250 hasta 350 miliosmolar.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es un histograma que proporciona la medición de la expresión del gen de la beta-galactosidasa en tejidos epiteliales del peritoneo en conejos tras la instilación intraperitoneal de 100 ml de una disolución que contiene un vector adenoviral recombinante que codifica para la beta-galactosidasa en diversas formulaciones tal como se describe más completamente en el ejemplo 1 en el presente documento. El eje vertical representa los niveles de ARN viral en tejidos según se determinan mediante RT-PCR.

La figura 2 es una representación gráfica de los resultados del modelo de cáncer de próstata de xenoinjerto murino descrito en el ejemplo 2 en el presente documento. El eje vertical representa la fracción de animales que permanecen vivos. La gráfica horizontal representa el tiempo en días. Se representan los ocho grupos de tratamiento resumidos en la tabla 3.

La figura 3 es una representación gráfica de los resultados del modelo de cáncer de ovario de xenoinjerto murino descrito en el ejemplo 3 y presentado en la tabla 5.

La figura 3 es una representación gráfica de los resultados del modelo de cáncer de ovario de xenoinjerto murino descrito en el ejemplo 4 y presentado en las tablas 6, 7 y 8. El ejemplo usa un vector adenoviral replicativo.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende un ácido nucleico en una disolución que comprende dextrina y al menos un azúcar, correspondiendo sustancialmente la osmolaridad de dicha disolución a la osmolaridad fisiológica.

Dextrina

El término "dextrina" significa un polímero de glucosa que se produce mediante la hidrólisis de almidón y que consiste en unidades de glucosa unidas entre sí principalmente por medio de enlaces \alpha-1,4. Normalmente, las dextrinas de producen mediante la hidrólisis de almidón obtenido de diversos productos naturales tales como trigo, arroz, maíz y tapioca. Además de los enlaces \alpha-1,4 puede haber una proporción de enlaces \alpha-1,6 en una dextrina particular, dependiendo la cantidad del material de partida de almidón. Dado que la tasa de biodegradabilidad de los enlaces \alpha-1,6 es normalmente inferior a la de los enlaces \alpha-1,4, para muchas aplicaciones se prefiere que el porcentaje de enlaces \alpha-1,6 sea inferior al 10% y preferiblemente inferior a aproximadamente el 5%.

Cualquier dextrina es una mezcla de moléculas de poliglucosa de diferentes longitudes de cadena. Como resultado, no hay un único número que pueda caracterizar adecuadamente el peso molecular de un polímero de este tipo. En consecuencia, se usan diversos promedios, siendo los más comunes el peso molecular promedio en peso (Mw) y el peso molecular promedio en número (Mn). El Mw es particularmente sensible a cambios en el contenido en pesos moleculares altos del polímero mientras que el Mn está influido en gran parte por cambios en el bajo peso molecular del polímero. En la práctica preferida de la invención, el Mw de la dextrina está en el intervalo desde aproximadamente 1.000 hasta 200.000, más preferiblemente desde aproximadamente 2.000 hasta 55.000.

La expresión "grado de polimerización" (GP) también puede usarse con respecto a mezclas de polímeros. Para una única molécula de polímero, GP significa el número de unidades de polímero. Para una mezcla de moléculas de diferentes GP, el GP promedio de peso y el GP promedio en número corresponden a Mw y Mn. Adicionalmente, el GP también puede utilizarse para caracterizar un polímero haciendo referencia a la mezcla de polímeros que tiene un cierto porcentaje de polímeros de GP superior a un número particular o inferior a un número particular. Se prefiere que, en la presente invención, la dextrina contenga más de aproximadamente el 15% de polímeros de GP superior a 12 y, más preferiblemente, más de aproximadamente el 50% de polímeros de GP superior a 12.

La dextrina está presente en la disolución en una cantidad de entre el 2-20% (p/v). Preferiblemente, la dextrina está presente en la disolución en una cantidad seleccionada de aproximadamente: el 2% (p/v); 3% (p/v); 4% (p/v); 5% (p/v); 6% (p/v); 7% (p/v); 8% (p/v); 9% (p/v); 10% (p/v); 11% p/v; 12% p/v; 13% p/v; 14% p/v; 15% p/v; 16% p/v; 17% p/v; 18% p/v; 19% p/v; 20% p/v. Más preferiblemente, la dextrina está presente desde aproximadamente el 2 hasta al 5% en peso, lo más preferiblemente de manera aproximada el 4% en peso.

Osmolaridad fisiológica

Tal como se indica, la disolución tiene una osmolaridad esencialmente isotónica con la osmolaridad del medio fisiológico de la célula que va a tratarse. Generalmente, la osmolaridad fisiológica mantenida en cavidades corporales de mamíferos es de aproximadamente 330 miliosmolar y variará ligeramente con la cavidad corporal particular. Por ejemplo, una disolución isotónica para la instilación en la cavidad peritoneal humana tendría una osmolaridad de aproximadamente 290-300 miliosmolar. En la práctica preferida de la invención para la instilación intraperitoneal, la disolución tendrá una osmolaridad de desde aproximadamente 250 hasta 350 miliosmolar, más preferiblemente desde aproximadamente 275 hasta 330 miliosmolar. Los ajustes para mantener una osmolaridad isotónica aproximada dependiendo del medio fisiológico particular serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica.

Disacárido

Los disacáridos consisten en dos monosacáridos unidos por un enlace glicosídico. Ejemplos no restrictivos de disacáridos son sacarosa, maltosa, celobiosa, gentiobiosa, lactosa. Los azúcares pueden producirse de manera natural o fabricarse industrialmente.

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La cantidad de disacárido es de entre aproximadamente el 1-10% p/v. Preferiblemente, la cantidad de disacárido es de entre aproximadamente el 2-5% p/v. En una realización preferida de la invención, el disacárido es sacarosa y es aproximadamente el 3% p/v.

Según la invención, la cantidad de dextrina es de aproximadamente entre el 2%-20% p/v y la cantidad de sacarosa es de aproximadamente el 1-10% p/v.

De manera todavía más ideal, la cantidad de dextrina es de aproximadamente el 4% p/v y la cantidad de sacarosa es de aproximadamente el 3% p/v.

Será evidente que la combinación exacta dependerá de la osmolaridad del fluido que rodea a la célula o tejido. Normalmente, es deseable mantener un equilibrio isosmótico entre la disolución que incluye el ácido nucleico y el fluido que rodea a las células/tejidos.

Catión divalente

Aún más preferiblemente, dicha disolución comprende además un catión divalente. Preferiblemente, el catión divalente es al menos 0,2 mM. Todavía más preferiblemente, la concentración del catión divalente es de entre aproximadamente 0,2 - 3,0 mM. De manera ideal, el catión divalente es MgCl_{2} y la concentración es aproximadamente 2,0 mM. Alternativamente, el catión divalente se proporciona mediante CaCl_{2}.

Preferiblemente, la disolución comprende aproximadamente el 4% p/v de dextrina, aproximadamente el 3% p/v de sacarosa y MgCl_{2} aproximadamente 2,0 mM. Alternativamente, la concentración de dextrina es de aproximadamente el 15% p/v.

Será evidente para un experto en la técnica que la disolución tiene utilidad con respecto a la administración in vitro de ácido nucleico a células para la producción recombinante de polipéptidos codificados por el ácido nucleico. La invención también abarca la terapia génica, tanto la introducción in vivo de ácido nucleico en células como la introducción ex vivo de ácido nucleico en células seguida de la introducción de células transfectadas dentro de un animal que necesita la terapia génica.

Ácido nucleico

Preferiblemente dicha molécula de ácido nucleico está adaptada para expresión eucariota. Normalmente dicha adaptación incluye, a modo de ejemplo y no a modo de limitación, la provisión de secuencias de control de la transcripción (secuencias promotoras) que median la expresión específica de célula/tejido. Estas secuencias promotoras pueden ser específicas de célula/tejido, inducibles o constitutivas.

"Promotor" es un término reconocido en la técnica y, por motivos de claridad, incluye las siguientes características que se proporcionan solamente a modo de ejemplo, y no a modo de limitación. Los elementos potenciadores son secuencias de ácido nucleico de actuación en cis que a menudo se encuentran en 5' con respecto al sitio de iniciación de la transcripción de un gen (los potenciadores también pueden encontrarse en 3' con respecto a una secuencia génica o incluso ubicarse en secuencias intrónicas). Los potenciadores funcionan aumentando la tasa de transcripción del gen al que está unido el potenciador. La actividad del potenciador es sensible a factores de transcripción de actuación en trans (polipéptidos) que se ha mostrado que se unen específicamente a elementos potenciadores. La unión/actividad de factores de transcripción (véase Eukaryotic Transcription Factors, por David S Latchman, Academic Press Ltd, San Diego) es sensible a numerosos impulsos fisiológicos/ambientales que incluyen, a modo de ejemplo y no a modo de limitación, metabolitos intermediarios (por ejemplo, glucosa, lípidos), efectores ambientales (por ejemplo, luz, calor,).

Los elementos promotores también incluyen las llamadas secuencias de selección de iniciación de ARN polimerasa (RIS) y caja TATA que funcionan seleccionando un sitio de iniciación de la transcripción. Estas secuencias también se unen a polipéptidos que funcionan, entre otras cosas, facilitando la selección de iniciación de la transcripción por ARN polimerasa.

Las adaptaciones también incluyen la provisión de marcadores seleccionables y secuencias de replicación autónoma que facilitan el mantenimiento de dicho vector en o bien la célula eucariota o bien el huésped procariota. Los vectores que se mantiene de manera autónoma se denominan vectores episomales. Los vectores episomales son deseables dado que estas moléculas pueden incorporar grandes fragmentos de ADN (ADN de 30-50 kb). Los vectores episomales de este tipo se describen en el documento WO 98/07876.

Las adaptaciones que facilitan la expresión de genes codificados por vectores incluyen la provisión de secuencias de terminación de la transcripción/poliadenilación. Esto también incluye la provisión de sitios de entrada interna del ribosoma (IRES) que funcionan para maximizar la expresión de genes codificados por vectores dispuestos en casetes de expresión bicistrónicos o multicistrónicos. Las secuencias de control de la expresión también incluyen las denominadas regiones de control de locus (LCR). Éstas son elementos reguladores que confieren expresión independiente de la posición, dependiente del número de copias a genes ligados cuando se someten a ensayo como constructos transgénicos. Las LCR incluyen elementos reguladores que aíslan los transgenes de los efectos silenciadores de la heterocromatina adyacente, Grosveld et al., Cell (1987), 51: 975-985.

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Las secuencias de control de la expresión también abarcan elementos ubicuos de apertura de cromatina (UCOE), véase el documento WO/GB00/05393. Los UCOE son elementos de ácido nucleico que son responsables de establecer una estructura de cromatina abierta a lo largo de un locus que consiste exclusivamente en genes de mantenimiento expresados de manera ubicua. Estos elementos no se derivan de una LCR. Un UCOE es un polinucleótido que abre la cromatina o mantiene la cromatina en un estado abierto y facilita la expresión reproducible de un gen operativamente unido en células de al menos dos tipos de tejido diferentes.

Estas adaptaciones se conocen bien en la técnica. Hay una cantidad significativa de bibliografía publicada con respecto a la construcción de vectores de expresión y técnicas de ADN recombinante en general. Véanse Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY y referencias en el mismo; Marston, F (1987) DNA Cloning Techniques: A Practical Approach Vol III IRL Press, Oxford Reino Unido; DNA Cloning: F M Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

Los vectores son normalmente basados en virus y pueden derivarse de virus que incluyen adenovirus; retrovirus; virus adenoasociados; herpesvirus; lentivirus; virus vaccinia; y baculovirus.

Las expresiones "virus terapéutico" y "vector viral terapéutico" se usan de manera intercambiable en el presente documento para referirse a virus usados como agentes terapéuticos (por ejemplo, virus de tipo natural, virus atenuados), vectores de vacunas o virus recombinantes que contienen modificaciones en el genoma para potenciar los efectos terapéuticos. El uso de virus o "vectores virales" como agentes terapéuticos se conoce bien en la técnica tal como se comentó anteriormente. Adicionalmente, se usan comúnmente numerosos virus como vectores para la administración de genes exógenos. Los vectores comúnmente empleados incluyen virus de ADN y ARN envueltos o no envueltos modificados de manera recombinante, preferiblemente seleccionados de baculoviridae, parvoviridae, picornoviridae, herpesveridae, poxviridae, adenoviridae o picornaviridae. También pueden emplearse vectores quiméricos que explotan elementos ventajosos de cada una de las propiedades del vector original (véase, por ejemplo, Feng, et al. (1997) Nature Biotechnology 15:866-870). Tales vectores virales pueden ser de tipo natural o pueden modificarse mediante técnicas de ADN recombinante para que sean de replicación deficiente, de replicación condicional o de replicación competente.

Los vectores preferidos se derivan de los genomas de adenovirus, virus adenoasociados y retrovirus. En la práctica más preferida de la invención, los vectores se derivan del genoma de adenovirus humano. Los vectores particularmente preferidos se derivan de los serotipos 2 ó 5 del adenovirus humano. La capacidad replicativa de tales vectores puede atenuarse (hasta el punto de considerarse de "replicación deficiente") mediante modificaciones o deleciones en las regiones codificantes E1a y/o E1b. Se prefieren otras modificaciones en el genoma viral para conseguir características de expresión particulares o permitir la administración repetida o una respuesta inmunitaria inferior. Los más preferidos son vectores adenovirales de tipo 5 humanos que contienen una secuencia de ADN que codifica para el gen supresor de tumores p53. En la práctica más preferida de la invención tal como se muestra a modo de ejemplo en el presente documento, el vector es el vector adenoviral de replicación deficiente que codifica para el gen supresor de tumores p53, A/C/N/53, tal como se describe en Gregory, et al., patente estadounidense número 5.932.210 expedida el 3 de agosto de 1999.

Alternativamente, los vectores virales pueden ser de replicación condicional o de replicación competente. Los vectores virales de replicación condicional se usan para conseguir una expresión selectiva en tipos de células particulares mientras que se evita la infección perjudicial de amplio espectro.

Se describen ejemplos de vectores de replicación condicional en Pennisi, E. (1996) Science 274:342-343; Russell, y S.J. (1994) Eur. J. of Cancer 30A(8):1165-1171. Los ejemplos adicionales de vectores de replicación selectiva incluyen aquellos vectores en los que un gen esencial para la replicación del virus está bajo el control de un promotor que solamente es activo en un tipo de célula o estado celular particular de manera que en ausencia de expresión de tal gen, el virus no se replicará. Se describen ejemplos de tales vectores en Henderson, et al., patente estadounidense número 5.698.443 expedida el 16 de diciembre de 1997 y Henderson, et al., patente estadounidense número 5.871.726 expedida el 16 de febrero de 1999.

Adicionalmente, el genoma viral puede modificarse para incluir promotores inducibles que consiguen la replicación o expresión solamente en ciertas condiciones. Se conocen en la bibliografía científica ejemplos de promotores inducibles (véanse, por ejemplo, Yoshida y Hamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230:426-430; Iida, et al. (1996) J. Virol. 70(9): 6054-6059; Hwang, et al. (1997) J. Virol 71(9):7128-7131; Lee, et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17(9):5097-5105; y Dreher, et al. (1997) J. Biol. Chem 272(46); 29364-29371.

Los virus pueden diseñarse también para que sean virus de replicación selectiva. Se describen virus de replicación selectiva particularmente preferidos en Ramachandra, et al. Publicación Internacional PCT número WO 00/22137, Solicitud Internacional número PCT/US99/21452 publicada el 20 de abril de 2000 y Howe, J., Publicación Internacional PCT número WO WO0022136, Solicitud Internacional número PCT/US99/21451 publicada el 20 de abril de 2000. Un adenovirus de replicación selectiva particularmente preferido es el virus d101/07/309 tal como se describe más completamente en Howe, J.

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Se ha demostrado que los virus que se atenúan para la replicación también son útiles en el campo terapéutico. Por ejemplo, el adenovirus dl1520 que contiene una deleción específica en el gen E1b55K (Barker y Berk (1987) Virology 156: 107) se ha usado con efecto terapéutico en seres humanos. Tales vectores también se describen en McCormick (patente estadounidense número 5.677.178 expedida el 14 de octubre de 1997) y McCormick, patente estadounidense número 5.846.945 expedida el 8 de diciembre de 1998. El método de la presente invención también puede usarse en combinación con la administración de tales vectores para minimizar la respuesta inmunitaria humoral preexistente o inducida frente a tales vectores.

Adicionalmente, el virus terapéutico puede incorporar un transgén terapéutico para la expresión en una célula infectada. La expresión "transgén terapéutico" se refiere a una secuencia de nucleótidos cuya expresión en la célula diana produce un efecto terapéutico. La expresión transgén terapéutico incluye pero no se limita a genes supresores de tumores, genes antigénicos, genes citotóxicos, genes citostáticos, genes que activan profármacos, genes apoptóticos, genes farmacéuticos o genes antiangiogénicos. Los vectores de la presente invención pueden usarse para producir uno o más transgenes terapéuticos, o bien en tándem a través del uso de elementos IRES o a través de promotores regulados de manera independiente.

La expresión "gen supresor de tumores" se refiere a una secuencia de nucleótidos cuya expresión en la célula diana puede suprimir el fenotipo neoplásico y/o inducir apoptosis. Los ejemplos de genes supresores de tumores útiles en la práctica de la presente invención incluyen el gen p53, el gen APC, el gen DPC-4, el gen BRCA-1, el gen BRCA-2, el gen WT-1, el gen del retinoblastoma (Lee, et al. (1987) Nature 329:642), el gen MMAC-1, la proteína coli de poliposis adenomatosa (Albertsen, et al., patente estadounidense número 5.783.666 expedida el 21 de julio de 1998), el gen delecionado en el carcinoma de colon (DCC), el gen MMSC-2, el gen NF-1, el gen supresor de tumores de carcinoma nasofaríngeo que se mapea en el cromosoma 3p21.3. (Cheng, et al. 1998. Proc. Nat. Acad. Sci. 95:3042-3047), el gen MTS 1, el gen CDK4, el gen NF-1, el gen NF2 y el gen VHL. Un adenovirus particularmente preferido para su uso terapéutico es el vector A/C/N/53 que codifica para el gen supresor de tumores p53 tal como se describe más completamente en Gregory, et al., patente estadounidense número 5.932.210 expedida el 3 de agosto de 1999.

La expresión "genes antigénicos" se refiere a una secuencia de nucleótidos cuya expresión en las células diana da como resultado la producción de una proteína antigénica de superficie celular que puede reconocerse por el sistema inmunitario. Los ejemplos de genes antigénicos incluyen el antígeno carcinoembrionario (CEA), p53 (tal como se describe en Levine, A. Publicación Internacional PCT número WO 94/02167 publicada el 3 de febrero de 1994). Con el fin de facilitar el reconocimiento inmunitario, el gen antigénico puede fusionarse al antígeno del CMH de clase I.

Preferiblemente, el gen antigénico se deriva de un antígeno específico de células tumorales. De manera ideal, un antígeno de rechazo tumoral. Los antígenos de rechazo tumoral se conocen bien en la técnica e incluyen, a modo de ejemplo y no a modo de limitación, las familias MAGE, BAGE, GAGE y DAGE de antígenos de rechazo tumoral, véase Schulz et al Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88, págs. 991-993.

Se sabe desde hace muchos años que las células tumorales producen varios antígenos específicos de células tumorales, algunos de los cuales se presentan en la superficie de la célula tumoral. Éstos generalmente se denominan antígenos de rechazo tumoral y se derivan de polipéptidos mayores denominados precursores de antígenos de rechazo tumoral. Los antígenos de rechazo tumoral se presentan a través del HLA al sistema inmunitario. El sistema inmunitario reconoce estas moléculas como extrañas y selecciona y destruye de manera natural las células que expresan estos antígenos. Si una célula transformada escapa de la detección y se establece, se desarrolla un tumor. Se han desarrollado vacunas basadas en antígenos de rechazo tumoral dominantes para dotar a los individuos de una defensa preformada frente al establecimiento de un tumor.

La expresión "gen citotóxico" se refiere a una secuencia de nucleótidos cuya expresión en una célula produce un efecto tóxico. Los ejemplos de tales genes citotóxicos incluyen secuencias de nucleótidos que codifican para la exotoxina de Pseudomonas, la toxina ricina, la toxina diftérica y similares.

La expresión "gen citostático" se refiere a una secuencia de nucleótidos cuya expresión en una célula produce una detención en el ciclo celular. Los ejemplos de tales genes citostáticos incluyen p21, el gen de retinoblastoma, el gen E2F-Rb, genes que codifican para inhibidores de cinasas dependientes de ciclina tales como P16, p15, p18 y p19, el gen de la caja homeótica específico de detención del crecimiento (GAX) tal como se describe en Branellec, et al. (Publicación PCT WO 97/16459 publicada el 9 de mayo de 1997 y Publicación PCT WO 96/30385 publicada el 3 de octubre de 1996).

La expresión "gen de citocina" se refiere a una secuencia de nucleótidos cuya expresión en una célula produce una citocina. Los ejemplos de tales citocinas incluyen GM-CSF, las interleucinas, especialmente IL-1, IL-2, IL-4, IL-12, IL-10, IL-19, IL-20, interferones de los subtipos \alpha, \beta y \gamma, interferones consenso y especialmente interferón \alpha-2b y fusiones tales como interferón \alpha-2\alpha-1.

La expresión "gen de quimiocina" se refiere a una secuencia de nucleótidos cuya expresión en una célula produce una citocina. El término quimiocina se refiere a un grupo de factores de citocinas de bajo peso molecular estructuralmente relacionadas secretadas por células estructuralmente relacionadas que tienen actividades mitogénicas, quimiotácticas o inflamatorias. Son principalmente proteínas catiónicas de 70 a 100 residuos de aminoácidos que comparten cuatro cisteínas conservadas. Estas proteínas pueden clasificarse en dos grupos basándose en la separación de las dos cisteínas amino-terminales. En el primer grupo, las dos cisteínas están separadas por un único residuo (C-x-C), mientras que en el segundo grupo, son adyacentes (C-C). Los ejemplos de miembro de las quimiocinas "C-x-C" incluyen pero no se limitan al factor plaquetario 4 (PF4), proteína básica plaquetaria (PBP), interleucina-8 (IL-8), proteína de actividad estimuladora del crecimiento del melanoma (MGSA), proteína inflamatoria de macrófagos 2 (MIP-2), Mig de ratón (m119), 9E3 de pollo (o pCEF-4), factores quimiotácticos de macrófagos alveolares de cerdo I y II (AMCF-I y -II), factor estimulante del crecimiento de células pre-B (PBSF) e IP10. Los ejemplos de miembros del grupo "C-C" incluyen pero no se limitan a proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1), proteína quimiotáctica de monocitos 2 (MCP-2), proteína quimiotáctica de monocitos 3 (MCP-3), proteína quimiotáctica de monocitos 4 (MCP-4), proteína inflamatoria de macrófagos 1 \alpha (MIP-1-\alpha), proteína inflamatoria de macrófagos 1 \beta (MIP-1-\beta), proteína inflamatoria de macrófagos 1-\gamma (MIP-1-\gamma), proteína inflamatoria de macrófagos 3 \alpha (MIP-3-\alpha), proteína inflamatoria de macrófagos 3 \alpha (MIP-3-\alpha), quimiocina (ELC), proteína inflamatoria de macrófagos 4 (MIP-4), proteína inflamatoria de macrófagos 5 (MIP-5), LD78\beta, RANTES, SIS-épsilon (p500), quimiocina del timo y de activación regulada (TARC), eotaxina, I-309, proteína HCC-1/NCC-2 humana, proteína HCC-3 humana, proteína C10 de ratón.

La expresión "gen de proteína farmacéutico" se refiere a una secuencia de nucleótidos cuya expresión da como resultado la producción de proteína que tiene un efecto farmacéutico en la célula diana. Los ejemplos de tales genes farmacéuticos incluyen el gen de proinsulina y análogos (tal como se describe en la Solitud de Patente Internacional PCT número WO 98/31397), gen de hormona del crecimiento, dopamina, serotonina, factor de crecimiento epidérmico, GABA, ACTH, NGF, VEGF (para aumentar la perfusión sanguínea al tejido diana, inducir angiogénesis, Publicación PCT WO 98/32859 publicada el 30 de julio de 1998), trombospondina etc. También, el gen de proteína farmacéutico puede abarcar proteínas inmunorreativas tales como anticuerpos, fragmentos Fab, fragmentos Fv, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos humanos derivados de fuentes no humanas.

La expresión "gen proapoptótico" se refiere a una secuencia de nucleótidos, la expresión de la misma da como resultado la inducción de la ruta de muerte celular programada de la célula. Los ejemplos de genes proapoptóticos incluyen p53, E3-11,6K de adenovirus (10,5K), el gen E4orf4 de adenovirus, genes de la ruta de p53 y genes que codifican para las caspasas.

La expresión "genes que activan profármacos" se refiere a secuencias de nucleótidos cuya expresión da como resultado la producción de proteína que puede convertir un compuesto no terapéutico en un compuesto terapéutico, que hace que la célula sea susceptible a la destrucción mediante factores externos o que provoca un estado tóxico en la célula. Un ejemplo de un gen que activa profármacos es el gen de la citosina desaminasa. La citosina desaminasa convierte la 5-fluorocitosina en 5 fluorouracilo, un potente agente antitumoral. La lisis de la célula tumoral proporciona un aumento brusco localizado de citosina desaminasa que puede convertir 5FC en 5FU en el punto localizado del tumor dando como resultado la destrucción de muchas células circundantes. Esto da como resultado la destrucción de un gran número de células tumorales sin necesidad de infectar estas células con un adenovirus (el denominado efecto de espectador). Adicionalmente, puede emplearse el gen de la timidina cinasa (TK) (véanse por ejemplo Woo, et al. patente estadounidense número 5.631.236 expedida el 20 de mayo de 1997 y Freeman, et al. patente estadounidense número 5.601.818 expedida el 11 de febrero de 1997) en el que las células que expresan el producto del gen de la TK son susceptibles de destrucción selectiva mediante la administración de ganciclovir.

La expresión genes "antiangiogénicos" se refiere a una secuencia de nucleótidos cuya expresión da como resultado la secreción extracelular de factores antiangiogénicos. Los factores de antiangiogénesis incluyen angiostatina, inhibidores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) tales como Tie 2 (tal como se describe en PNAS(USA)(1998) 95:8795-8800), endostatina.

Será fácilmente evidente para los expertos en la técnica que pueden adaptarse fácilmente modificaciones y/o deleciones en los genes mencionados anteriormente para codificar subfragmentos funcionales de la proteína de tipo natural para su uso en la práctica de la presente invención. Por ejemplo, la referencia al gen p53 incluye no solamente la proteína de tipo natural sino también proteínas p53 modificadas. Los ejemplos de tales proteínas p53 modificadas incluyen modificaciones en p53 para aumentar la retención nuclear, deleciones tales como los aminoácidos \Delta13-19 para eliminar el sitio de escisión consenso de calpaína (Kubbutat y Vousden (1997) Mol. Cell. Biol. 17:460-468), modificaciones en los dominios de oligomerización (tal como se describe en Bracco, et al. solicitud PCT publicada WO 97/0492 o patente estadounidense número 5.573.925, etc.).

Será fácilmente evidente para los expertos en la técnica que los genes terapéuticos anteriores pueden secretarse en el medio o localizarse en ubicaciones intracelulares particulares mediante la inclusión de un resto de direccionamiento tal como un péptido señal o señal de localización nuclear (NLS). La definición de transgén terapéutico también incluye proteínas de fusión del transgén terapéutico con la proteína estructural del virus del herpes simple tipo 1 (VHS-1), VP22. Las proteínas de fusión que contienen la señal de VP22, cuando se sintetizan en una célula infectada, se exportan fuera de la célula infectada y entran eficazmente en las células no infectadas circundantes hasta un diámetro de aproximadamente 16 células de ancho. Este sistema es particularmente útil junto con proteínas transcripcionalmente activas (por ejemplo p53) a medida que las proteínas de funcionan se transportan eficazmente a los núcleos de las células circundantes. Véanse, por ejemplo, Elliott, G. & O'Hare, P. Cell. 88:223-233:1997; Marshall, A. & Castellino, A. Research News Briefs. Nature Biotechnology. 15:205:1997; O'Hare, et al. solicitud PCT WO 97/05265 publicada el 13 de febrero de 1997. También se describe un resto de direccionamiento similar derivado de la proteína Tat del VIH en Vives, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:16010-16017.

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Puede ser valioso en algunos casos utilizar o diseñar vectores para conseguir la introducción del transgén exógeno en un tipo celular particular. Ciertos vectores presentan un tropismo natural para ciertos tipos de tejido. Por ejemplo, se ha demostrado que los vectores derivados del género herpesviridae tiene una infección preferente de células neuronales. Se dan a conocer ejemplos de vectores de herpesviridae modificados de manera recombinante en la patente estadounidense número 5.328.688 expedida el 12 de julio de 1994. También pueden conseguirse especificidad del tipo de célula o selección como diana del tipo de célula en vectores derivados de virus que tienen infecciosidades característicamente amplias mediante la modificación de las proteínas de la envuelta viral. Por ejemplo, la selección como diana de células se ha conseguido con vectores de adenovirus mediante la modificación selectiva de las secuencias de codificación de tipo knob y fibras del genoma viral para conseguir la expresión de dominios de tipo knob y de fibras que tienen interacción específica con receptores de superficie celular únicos. Ejemplos de tales modificaciones se describen en Wickham, et al. (1997) J. Virol 71(11):8221-8229 (incorporación de péptidos RGD en proteínas de fibras adenovirales); Arnberg, et al. (1997) Virology 227:239-244 (modificación de genes de fibras adenovirales para conseguir tropismo al ojo y el tracto genital); Harris y Lemoine (1996) TIG 12(10):400-405; Stevenson, et al. (1997) J. Virol. 71(6):4782-4790; Michael, et al. (1995) Gene Therapy 2:660-668 (incorporación de fragmento de péptido que libera gastrina en proteína de fibras de adenovirus); y Ohno, et al.(1997) Nature Biotechnology 15:763-767 (incorporación de dominio de unión a IgG de la proteína A en el virus Sindbis). Otros métodos de selección como diana de células específicas se han conseguido mediante la conjugación de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos a las proteínas de la envuelta (véanse, por ejemplo Michael, et al. (1993) J. Biol. Chem 268:6866-6869, Watkins, et al. (1997) Gene Therapy 4:1004-1012; Douglas, et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 1574-1578. Alternativamente, pueden conjugarse restos particularmente a la superficie viral para conseguir el direccionamiento (Véase, por ejemplo Nilson, et al. (1996) Gene Therapy 3:280-286 (conjugación de EGF a proteínas retrovirales)). Adicionalmente, el transgén terapéutico codificado de manera viral también está bajo el control de una región promotora específica de tejido que permite la expresión del transgén preferentemente en tipos de células particulares.

Los vectores también pueden ser no virales y están disponibles de varias fuentes comerciales fácilmente disponibles para el experto en la técnica. Por ejemplo, los vectores pueden ser plásmidos que pueden ser plásmidos episomales o integrativos.

En una realización preferida adicional de la invención, dicho ácido nucleico es un ácido nucleico antisentido, preferiblemente un oligonucleótido antisentido.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "oligonucleótido antisentido" o "antisentido" describe un que es un oligorribonucleótido, oligodesoxirribonucleótido, oligorribonucleótido modificado u oligodesoxirribonucleótido modificado que se hibrida en condiciones fisiológicas a ADN que comprende un gen particular o a un transcrito de ARNm de ese gen y por tanto, inhibe la transcripción de ese gen y/o la traducción de ese ARNm. Las moléculas antisentido se diseñan de modo que interfieran con la transcripción o traducción de un gen diana al hibridarse con el gen diana. Los expertos en la técnica reconocerán la longitud exacta del oligonucleótido antisentido y su grado de complementariedad con su diana dependerá de la diana específica seleccionada, incluyendo la secuencia de la diana y las bases particulares que comprenden esa secuencia.

Se prefiere que el oligonucleótido antisentido se construya y disponga de modo que se una selectivamente con la diana en condiciones fisiológicas, es decir, que se hibride sustancialmente más a la secuencia diana que a cualquier otra secuencia en la célula diana en condiciones fisiológicas.

Con el fin de ser suficientemente selectivos y potentes para la inhibición, tales oligonucleótidos antisentido deben comprender al menos 7 (Wagner et al., Nature Biotechnology 14:840-844, 1996) y más preferiblemente, al menos 15 bases consecutivas que son complementarias a la diana. Lo más preferiblemente, los oligonucleótidos antisentido comprenden una secuencia complementaria de 20-30 bases.

Aunque pueden elegirse los oligonucleótidos que son antisentido a cualquier región del gen o transcritos de ARNm, en realizaciones preferidas los oligonucleótidos antisentido corresponden a los sitios aguas arriba en 5' o N-terminales tales como sitios promotores, de iniciación de la transcripción o de iniciación de la traducción. Además, pueden seleccionarse como diana regiones no traducidas en 3'. Se sabe que las regiones no traducidas en 3' contienen secuencias de actuación en cis que actúan como sitios de unión para proteínas implicadas en la estabilización de moléculas de ARNm. Estos sitios de actuación en cis forman a menudo estructuras de blucle en horquilla que funcionan uniéndose a dichas proteínas estabilizantes. Un ejemplo bien conocido de esta forma de regulación de la estabilidad se muestra por los ARNm de histonas, cuya abundancia está controlada, al menos parcialmente, de manera postrans-
cripcional.

La expresión "oligonucleótidos antisentido" debe interpretarse como materiales fabricados o bien in vitro usando métodos de síntesis de oligonucleótidos convencionales que se conocen bien en la técnica o bien oligonucleótidos sintetizados de manera recombinante usando constructos de vectores de expresión. El oligonucleótido modificado se interpreta de la siguiente manera. La expresión "oligonucleótido modificado" tal como se usa en el presente documento describe un oligonucleótido en el que;

i)

al menos dos de sus nucleótidos están unidos covalentemente mediante un enlace internucleosídico sintético (es decir, un enlace diferente de un enlace fosfodiéster entre el extremo 5' de un nucleótido y el extremo 3' de otro nucleótido). Alternativamente o preferiblemente, dicho enlace puede ser el extremo 5' de un nucleótido unido al extremo 5' de otro nucleótido o el extremo 3' de un nucleótido con el extremo 3' de otro nucleótido; y/o

ii)

un grupo químico no asociado normalmente con ácidos nucleicos se ha unido covalentemente al oligonucleótido u oligorribonucleótido. Enlaces internucleosídicos sintéticos preferidos son fosforotioatos, alquilfosfonatos, fosforoditioatos, ésteres de fosfato, alquilfosfonotioatos, fosforoamidatos, carbamatos, triésteres de fosfato, acetamidatos, péptidos y ésteres carboximetílicos.

La expresión "oligonucleótido modificado" también abarca oligonucleótidos con un azúcar y/o base modificados covalentemente. Por ejemplo, los oligonucleótidos modificados incluyen oligonucleótidos que tienen azúcares de estructura principal que están unidos covalentemente a grupos orgánicos de bajo peso molecular diferentes de un grupo hidroxilo en la posición 3' y diferentes de un grupo fosfato en la posición 5'. Los oligonucleótidos así modificados pueden incluir un grupo ribosa 2'-O-alquilado. Además, los oligonucleótidos modificados pueden incluir azúcares tales como arabinosa en lugar de ribosa. Los oligonucleótidos modificados también pueden incluir análogos de bases tales como bases modificadas con propino en C-5 (Wagner et al., Nature Biotechnology 14:840-844, 1996).

Por tanto, la presente invención contempla preparaciones farmacéuticas que contienen moléculas antisentido naturales y/o modificadas que son complementarias a y, en condiciones fisiológicas, pueden hibridarse con ácidos nucleicos que codifican para proteínas cuya regulación da como resultado efectos terapeúticos beneficiosos, junto con vehículos farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, polímeros, liposomas/lípidos catiónicos).

Los oligonucleótidos antisentido pueden administrarse como parte de una composición farmacéutica. Una composición farmacéutica de este tipo puede incluir oligonucleótidos antisentido en combinación con cualquier vehículo fisiológica y/o farmacéuticamente aceptable convencional que se conozca en la técnica (por ejemplo, liposomas). Las composiciones deben ser estériles y contener una cantidad terapéuticamente eficaz de los oligonucleótidos antisentido para su administración a un paciente. La expresión "farmacéuticamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica de los principios activos. La expresión "fisiológicamente aceptable" se refiere a un material no tóxico que es compatible con un sistema biológico tal como una célula, un cultivo celular, un tejido o un organismo.

Aún en un método todavía preferido adicional de la invención, dicho ácido nucleico es una molécula de ARN bicatenario (ARN). Una técnica para suprimir específicamente la función génica es a través de la introducción de ARN bicatenario, denominado también ARN inhibidor (ARNi), en una célula dando como resultado la destrucción del ARNm complementario a la secuencia incluida en la molécula de ARNi. La molécula de ARNi comprende dos hebras complementarias de ARN (una hebra sentido y una hebra antisentido) hibridadas entre sí para formar una molécula de ARN bicatenario. La molécula de ARNi se deriva normalmente de una secuencia codificante o exónica del gen que va a suprimirse. En un método preferido de la invención, la longitud de la molécula de ARNi es de entre 100 pb-1000 pb. Más preferiblemente todavía, la longitud del ARNi se selecciona de aproximadamente 100 pb; 200 pb; 300 pb; 400 pb; 500 pb; 600 pb; 700 pb; 800 pb; 900 pb; o 1000 pb. Más preferiblemente todavía dicho ARNi tiene al menos 1000 pb.

En un método preferido adicional de la invención, dicho ARNi se deriva de un exón.

Alternativamente, dicha molécula de ARNi se deriva de secuencias intrónicas o las secuencias no codificantes en 5' y/o en 3' que flanquean a secuencias codificantes/de exones de genes. Estudios recientes sugieren que las moléculas de ARNi que oscilan desde 100-1000 pb derivadas de secuencias codificantes son inhibidores eficaces de la expresión génica. De manera sorprendente, sólo se requieren unas pocas moléculas de ARNi para bloquear la expresión génica, lo que implica que el mecanismo es catalítico. El sitio de acción parece ser nuclear ya que puede detectarse poco, si acaso algún, ARNi en el citoplasma de células, lo que indica que el ARNi ejerce su efecto durante la síntesis o el procesamiento del ARNm.

Aún en un método preferido adicional de la invención, dichas moléculas de ARNi comprenden bases de ribonucleótidos modificadas. Para un experto en la técnica será evidente que la inclusión de bases modificadas, así como las bases que se producen de manera natural, citosina, uracilo, adenosina y guanosina, pueden conferir propiedades ventajosas a las moléculas de ARNi que contienen dichas bases modificadas. Por ejemplo, las bases modificadas pueden aumentar la estabilidad de la molécula de ARNi reduciendo de ese modo la cantidad requerida para producir un efecto deseado.

Se desconoce el mecanismo exacto de acción del ARNi, aunque hay teorías que explican este fenómeno. Por ejemplo, todos los organismos han desarrollado mecanismos protectores para limitar los efectos de la expresión génica exógena. Por ejemplo, un virus provoca a menudo efectos perjudiciales sobre el organismo que infecta. Por tanto, se necesita que se reprima la replicación y/o expresión génicas virales. Además, el rápido desarrollo de la transformación genética y la provisión de animales y plantas transgénicos ha conducido a la comprensión de que los transgenes también se reconocen como ácido nucleico foráneo y se someten a fenómenos denominados de manera muy diversa extinción ("quelling") (Singer y Selker, Curr Top Microbiol Immunol. 1995.197:165-77), silenciamiento génico (Matzkeand Matzke, Novartis Found Symp. 1998.214:168-80; discusión 181-6. Revisión) y cosupresión (Stam et al., Plant J. 2000.21(1):27-42.

Los estudios iniciales que usaban ARNi usaron el nematodo Caenorhabditis elegans. El ARNi inyectado en el gusano dio como resultado la desaparición de polipéptidos correspondientes a las secuencias génicas que comprendían la molécula de ARNi (Montgomery et al., 1998; Fire et al., 1998). Más recientemente, se ha mostrado el fenómeno de inhibición mediante ARNi en varios eucariotas incluyendo, a modo de ejemplo y no a modo de limitación, plantas, tripanosomas (Shi et al., 2000), Drosophila spp. (Kennerdell y Carthew, 2000). Experimentos recientes han mostrado que el ARNi también puede funcionar en eucariotas superiores. Por ejemplo, se ha mostrado que el ARNi puede suprimir c-mos en un ovocito de ratón y también E-cadherina en un embrión antes de su implantación en un ratón (Wianny y Zernicka-Goetz, 2000).

Aún en un método preferido adicional de la invención, dicho ácido nucleico es una ribozima. Una ribozima es un ARN catalítico que se conoce bien en la técnica. Una ribozima comprende un núcleo catalítico que tienen secuencias flanqueantes adyacentes a la secuencia que se hibrida con el ARN sustrato. El núcleo catalítico más sencillo es un motivo de ARN conocido como cabeza de martillo. Desde el descubrimiento del ARN catalítico, se ha deseado diseñar ribozimas que tengan una función génica seleccionada como diana de manera que puedan suprimirse selectivamente ARNm de genes de enfermedades y ARNm viral. Por ejemplo, el documento US6069007 da a conocer ribozimas activas contra el ARNm de VIH1 y su uso en el tratamiento del SIDA. El documento US6087172 da a conocer ribozimas diseñadas para suprimir el ARNm que codifica para IL-15, una interleucina implicada en la artritis reumatoide. El documento US6077705 da a conocer un método de terapia génica para inhibir la expresión de genes mutados combinada con la sustitución del gen mutado, en este ejemplo \alpha-1-antitripsina, por una copia de tipo natural.

Modos de administración/tratamiento

Las formulaciones de la presente invención son útiles para potenciar la transferencia de ácidos nucleicos en tejidos. Para un experto en la técnica, será evidente que pueden introducirse disoluciones según la invención en un sujeto animal de una variedad de modos incluyendo por vía entérica (por vía oral, por vía rectal o por vía sublingual) o por vía parenteral (por vía intravenosa, por vía subcutánea o por inhalación). Las disoluciones pueden proporcionarse al mamífero mediante catéteres implantados, en la práctica preferida de la invención, las disoluciones se instilan en una cavidad corporal para facilitar la transducción de los tejidos circundantes. Los ejemplos de tales cavidades corporales en las que pueden proporcionarse las disoluciones para la administración de ácidos nucleicos incluyen la cavidad peritoneal, la cavidad pleural, el ojo y la cavidad abdominal. Adicionalmente, las disoluciones pueden proporcionarse en otros espacios que contienen fluidos tales como líquido cefalorraquídeo, articulaciones, el colon, la vejiga, la vesícula biliar. También será evidente para un experto en la técnica que las disoluciones pueden administrarse de manera simultánea (como una mezcla), separada o secuencial a un animal.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona una disolución que comprende un ácido nucleico, dextrina y al menos un disacárido en la que la cantidad de disolución de dextrina presente es de entre el 2-20% (p/v), la cantidad de disacárido es de entre el 1-10%(p/v) y la osmolaridad de dicha disolución es esencialmente isotónica con la osmolaridad del medio fisiológico de la célula que va a tratarse, para su uso en la administración de ácido nucleico a una célula. Preferiblemente, dicha composición es para su uso en la administración de ácido nucleico para terapia génica. En la práctica preferida de la invención, este procedimiento se emplea junto con la terapia adenoviral recombinante para el tratamiento de cánceres humanos. Según la práctica oncológica convencional, se les dosifica a los pacientes la dosis tolerada máxima del agente terapéutico. En el transcurso de la investigación clínica, una dosis de 7,5 x 10^{13} partículas adenovirales recombinantes se toleró bien en sujetos humanos. La experiencia clínica con adenovirus recombinantes de replicación deficiente que expresan p53 ha indicado que un ciclo de terapia de inyección de aproximadamente 7,5 x 10^{13} partículas virales recombinantes durante un periodo de 5 días de ciclo de terapia repetido mensualmente hasta cinco meses es eficaz en el tratamiento de cáncer de ovario en seres humanos.

En una realización particularmente preferida de la presente invención, se instila una formulación de la presente invención que comprende un adenovirus recombinante de replicación deficiente que codifica para p53 en el peritoneo para el tratamiento de cáncer de ovario. Un ciclo de terapia típico con este agente implica la administración de 7,5x10^{13} partículas virales cada día durante un periodo de 5 días. Un protocolo clínico típico para el tratamiento de cáncer de ovario usando células con virus A/C/N/53 implica un ciclo de terapia de 5 días típico descrito anteriormente junto con la administración de los agentes quimioterápicos carboplatino y paclitaxel. En la práctica preferida de la invención, el mamífero es un ser humano que recibe tres o más ciclos de terapia, preferiblemente 5-6 ciclos de terapia, con periodos de descanso intermedios. Para el experto en la técnica resultarán evidentes modificaciones en este procedimiento para usar virus terapéuticos diferentes de adenovirus.

Las formulaciones de la presente invención pueden comprender además vehículos, excipientes o diluyentes adicionales. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de tamponamiento y ajuste del pH, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, etc. La concentración de las composiciones de la invención en las formulaciones farmacéuticas puede variar ampliamente, es decir, desde menos de aproximadamente el 0,1%, habitualmente a o al menos aproximadamente el 2% hasta tanto como del 20% al 50% o más en peso, y se seleccionarán principalmente por las viscosidades, volúmenes de fluidos, etc., según el modo particular de administración seleccionado.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos son simplemente ilustrativos de la práctica de la presente invención y no pretenden limitar el alcance de la misma.

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Ejemplo 1

Potenciación de la expresión transgénica mediada por rAd en conejos (administración intraperitoneal) usando una formulación de icodextrina

Con el fin de evaluar la capacidad de potenciar la expresión transgénica a partir de vectores adenovirales recombinantes, se realizó un experimento para comparar los niveles relativos de expresión transgénica. Se preparó un vector adenoviral recombinante que codificaba para el gen de la beta-galactosidasa (rAd-bgal) sustancialmente según las enseñanzas de Gregory, et al., patente estadounidense 5.932.210. Se prepararon las siguientes disoluciones en un volumen de 100 ml.

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1

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Se anestesiaron diez conejos blancos New Zealand hembra con ketamina/xilazina y se instilaron por vía intraperitoneal las disoluciones precedentes. Se dejó incubar la disolución durante 1 hora (en el lado dorsal) y una hora (en el lado ventral). Se sacrificaron los animales y se recogieron biopsias de la pared peritoneal. Se sometieron a ensayo los niveles de ARN viral en los tejidos recogidos usando RT-PCR. Los resultados de las concentraciones de ARN específicas de transgén aisladas de la pared peritoneal se presentan en la figura 1 de los dibujos adjuntos. Tal como puede observarse a partir de los datos presentados, la adición de icodextrina al 15% a la disolución tampón de virus (disolución A) dio como resultado un marcado aumento en la expresión transgénica en relación con la disolución control tampón sola (disolución B).

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Ejemplo 2

Eficacia de la formulación de rAd-p53 con icodextrina en el modelo de cáncer de próstata de xenoinjerto murino

Con el fin de demostrar que las formulaciones de adenovirus recombinantes que contienen icodextrina proporcionan un efecto terapéutico potenciado, se realizó un experimento para comparar la eficacia antitumoral de vectores adenovirales recombinantes de replicación deficiente que codificaban para el gen supresor de tumores p53 ("rAd-p53"). Se comparó la eficacia de los vectores en un modelo de cáncer de próstata de xenoinjerto murino tal como se describe en Paine-Murrieta GD et al. Cancer Chemother Pharmacol 1997, 40: 209. Se usó el aumento de la supervivencia como medición de la eficacia.

Se preparó el vector de rAd-p53 denominado ACN53 sustancialmente según las enseñanzas de Gregory, et al., patente estadounidense número 5.932.210. Se obtuvieron células de cáncer de próstata PC-3 de la Colección Americana de Cultivos Tipo, Bethesda MD con el número de registro CRL-1435. Se obtuvieron cincuenta y un ratones desnudos hembra, de aproximadamente 5 semanas de edad, de Harlan Laboratories. Se inyectaron por vía intraperitoneal en cada animal aproximadamente 5 x 10^{6} células PC3 en un volumen de 0,2 ml de HBSS-FBS (solución salina equilibrada de Hank con suero bovino fetal al 10%; se obtuvo la HBSS de Fisher Scientific, se obtuvo el FBS de BioWhittaker). Se dejó que las células establecieran tumores durante un periodo de nueve días antes del inicio del
tratamiento.

Se prepararon siete formulaciones diferentes según la tabla 2 a continuación:

2

Se dividieron los animales hasta en ocho grupos de tratamiento tal como se describe más completamente en la tabla 3 a continuación:

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4

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Se inició el tratamiento en el día 9. (Nota: se hace referencia a todos los días de tratamiento indicados por "Día" mencionados en el presente documento desde la fecha de inyección de las células PC-3). Todos los animales parecían sanos al inicio del régimen de tratamiento. Aparte del grupo 1 control no tratado, se proporcionó a cada grupo un régimen de tratamiento que consistía en tratamientos que consistían cada uno en una única inyección intraperitoneal de 1,0 ml de la formulación apropiada en los días 9, 11, 14, 15 y 18 tras la inyección de células tumorales. Tras la finalización del régimen de tratamiento, se enjaularon los animales al azar y se monitorizaron diariamente (enmascarado) para detectar animales enfermos caracterizados por pérdida visible de peso corporal, espalda encorvada y sedación. Se sacrificaron los animales enfermos y se examinaron patológicamente de manera macroscópica. Se registraron el número del animal, la fecha de sacrificio (o en la que se encontró muerto) y los hallazgos patológicos macroscópicos. Los resultados se resumen en la tabla 4 a continuación:

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5

Se representaron gráficamente los días de supervivencia tras la inyección usando una supervivencia de Kaplan Meier y los resultados de los grupos de tratamiento 1-4 se presentan gráficamente en la figura 2 de los dibujos adjuntos. Se realizó la comparación entre grupos usando la prueba de Logrank (software Statview). Se consideraron las diferencias significativas si p<0,05.

Tal como puede observarse a partir de los datos presentados, el tratamiento con formulaciones de ACN53 que contienen icodextrina dio como resultado una prolongación estadísticamente significativa de la supervivencia en comparación con ACN53 formulado en vPBS o controles a una dosis viral de 5x10^{10} partículas virales. Un animal que recibió la dosis viral máxima en icodextrina estaba libre de signos clínicos de crecimiento tumoral tras la finalización del estudio (día 100). Este animal tuvo un crecimiento tumoral mínimo en la cavidad peritoneal, lo que indicaba que se le inyectó al animal células tumorales y que el tumor se formó pero que se inhibió el crecimiento
tumoral.

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Ejemplo 3

Eficacia de la formulación de rAd-p53 con icodextrina en el modelo de cáncer de ovario de xenoinjerto murino

Se evaluó el efecto de formulaciones adenovirales que contenían icodextrina (formulaciones B y C en la tabla 2 anterior) en un modelo de xenoinjerto intraperitoneal murino de cáncer de ovario humano. Cuarenta y cuatro ratones desnudos hembra (20-25 g) recibieron una injección intraperitoneal de 1x10^{7} células de cáncer de ovario 2774 humano en 0,2 ml y se dejó que crecieran los tumores durante 2 días. Se estratificaron los ratones en seis grupos de 6 animales que recibieron inyecciones intraperitoneales de 0,5 ml de una de las siguientes en los días 2, 5, 8, y
12:

1x10^{10} partículas de rAd-p53 en PBS o icodextrina

5x10^{9} partículas de rAd-p53 en PBS o icodextrina

1x10^{9} partículas de rAd-p53 en PBS o icodextrina.

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Se dividieron los animales restantes en un grupo no tratado (N=4) y un grupo (N=4) tratado con 0,5 ml icodextrina sola. Se asignaron al azar los ratones a las jaulas y se monitorizaron con el tiempo para detectar crecimiento tumoral por observadores enmascarados. Se comparó la supervivencia tras la inyección de células entre los grupos de tratamiento. Los resultados se presentan en la figura 3 y la tabla 5.

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Ejemplo 4

Eficacia potenciada por vIco de un adenovirus oncolítico (K9TB) en un modelo ortotópico de cáncer de ovario humano

Se empleó un modelo murino de cáncer de ovario humano para evaluar el efecto de formulaciones de un vector adenoviral de replicación condicional que contienen icodextrina. Se estableció el modelo en ratones desnudos (20-25 g, comercialmente disponible de Harlan, Indianapolis, IN) mediante la administración de una única inyección intraperitoneal de una suspensión de 1x10^{7} células de cáncer de ovario humano MDA H2774 (disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo con el número de registro CRL-10303) en 0,5 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS). Se permitió que los tumores crecieran durante 7 días y se evaluaron los ratones para detectar la presencia de tumores palpables. Se separaron los ratones que manifestaban tumores en grupos para el
tratamiento.

Se preparó un vector adenoviral recombinante de replicación condicional denominado K9TB sustancialmente según las enseñanzas de Ramachandra, et al. (publicación internacional PCT número WO 00/22137 publicada el 20 de abril de 2000). El virus K9TB es un virus de replicación condicional que contiene una deleción de los aminoácidos 4-25 de la región E1a, un elemento de respuesta a p53 que dirige la expresión de la proteína de fusión E2F-Rb (Antelman, et al., patente estadounidense número 6.074.850 expedida el 13 de junio de 2000) insertado en la región
E3.

Se prepararon las siguientes formulaciones proporcionadas en la tabla 6 a continuación para su evaluación en el modelo de tumor descrito anteriormente.

6

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Se segregaron los animales que portaban tumores en los siguientes grupos para el tratamiento:

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7

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A cada grupo se le proporcionó un régimen de tratamiento que consistía en una única inyección intraperitoneal de 0,5 ml de la formulación apropiada en los días 7, 9, 12 y 14 tras la injección de células tumorales. Tras la finalización del régimen de tratamiento, se enjaularon los animales al azar y se monitorizaron diariamente (enmascarado) para detectar animales moribundos caracterizados por una pérdida visible de peso corporal, espalda encorvada y sedación. Se sacrificaron los animales moribundos y se examinaron patológicamente de manera macroscópica. Se registraron el número del animal, la fecha de sacrificio (o en la que se encontró muerto) y los hallazgos patológicos macroscópicos y los resultados se resumen en la tabla 8 a continuación.

9

Se resumieron los días de supervivencia tras la inyección usando una gráfica de Kaplan-Meier y los resultados de los grupos de tratamiento 1-4 se presentan gráficamente en la figura 3 de los dibujos adjuntos. Se realizó la comparación entre grupos usando la prueba Logrank (software Statview). Se consideraron las diferencias significativas si p<0,05.

Se presenta una representación gráfica de los datos en la figura 3 de los dibujos adjuntos. Formulación H/grupo de tratamiento 2 está representado por X, formulación I/grupo de tratamiento 1 está representado por cuadrados, formulación J/grupo de tratamiento 3 está representado por círculos; y formulación L/grupo de tratamiento 4 está representado por triángulos.

Tal como puede observarse a partir de los datos presentados, el tratamiento de ratones que portaban tumores con el vector adenoviral recombinante K9TB tanto en formulaciones de vIco como de vPBS prolongó la supervivencia en comparación con los controles de vehículo. Sin embargo, K9TB formulado en vIco mostró una prolongación de la supervivencia en comparación con K9TB formulado en vPBS (p<0,01, n=7 animales/grupo de tratamiento).

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TABLA 5

10

Claims (37)

1. Uso de una disolución que comprende un ácido nucleico, dextrina y al menos un disacárido, en el que la cantidad de dextrina presente en la disolución es de entre el 2-20% (p/v), la cantidad de disacárido es de entre el 1-10% (p/v) y la osmolaridad de dicha disolución es esencialmente isotónica con la osmolaridad del medio fisiológico de la célula que va a tratarse, siendo la disolución para la fabricación de un medicamento para la administración de ácido nucleico a una célula.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que el peso molecular de la dextrina está en el intervalo de aproximadamente 1.000 - 200.000.

3. Uso según la reivindicación 2, en el que el peso molecular de la dextrina es de entre aproximadamente 2.000 - 55.000.

4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la dextrina contiene más de aproximadamente el 15% (p/v) de polímeros de un grado de polimerización superior a 12.

5. Uso según la reivindicación 4, en el que la dextrina contiene más de aproximadamente el 50% (p/v) de polímeros de un grado de polimerización superior a 12.

6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la dextrina está presente en la disolución en una cantidad seleccionada de aproximadamente: el 2% p/v; 3% p/v; 4% p/v; 5% p/v; 6% p/v; 7% p/v; 8% p/v; 9% p/v; 10% p/v; 11% p/v; 12% p/v; 13% p/v; 14% p/v; 15% p/v; 16% p/v; 17% p/v; 18% p/v; 19% p/v; 20% p/v.

7. Uso según la reivindicación 6, en el que la dextrina está presente desde el 2-5% p/v.

8. Uso según la reivindicación 7, en el que la dextrina es de manera preferible aproximadamente el 4% p/v.

9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el disacárido es una cantidad de entre aproximadamente el 2 y el 5% p/v.

10. Uso según la reivindicación 9, en el que el disacárido es sacarosa y la cantidad de sacarosa es de aproximadamente el 3% p/v.

11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que la cantidad de dextrina es de aproximadamente entre el 2% y el 20% y la cantidad de sacarosa es de entre aproximadamente el 1% y el 10%.

12. Uso según la reivindicación 11, en el que la cantidad de dextrina es de aproximadamente el 15% p/v y la cantidad de sacarosa es de aproximadamente el 3% p/v.

13. Uso según la reivindicación 12, en el que la cantidad de dextrina es de aproximadamente el 4% p/v y la cantidad de sacarosa es de aproximadamente el 3% p/v.

14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que dicha disolución comprende además un catión divalente.

15. Uso según la reivindicación 14, en el que dicho catión divalente está en una concentración de al menos 0,2 mM.

16. Uso según la reivindicación 15, en el que la concentración del catión divalente es de entre 0,2 y 3,0 mM.

17. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en el que el catión divalente se proporciona mediante MgCl_{2} y la concentración es de aproximadamente 2,0 mM.

18. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en el que la disolución comprende aproximadamente el 4% p/v de dextrina, aproximadamente el 3% p/v de sacarosa y MgCl_{2} aproximadamente 2,0 mM.

19. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en el que la molécula de ácido nucleico es un vector.

20. Uso según la reivindicación 19, en el que el vector está adaptado para expresión eucariota.

21. Uso según la reivindicación 19 ó 20, en el que el vector está basado en virus y se selecciona de los siguientes virus: adenovirus; retrovirus; virus adenoasociados; herpesvirus; lentivirus; virus vaccinia; baculovirus.

22. Uso según la reivindicación 21, en el que dicho vector es un adenovirus.

23. Uso según la reivindicación 22, en el que dicho adenovirus codifica para un transgén.

24. Uso según la reivindicación 23, en el que dicho transgén es un gen supresor de tumores.

25. Uso según la reivindicación 24, en el que dicho gen supresor de tumores es p53.

26. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 19-25, en el que dicho vector es de replicación competente.

27. Uso según la reivindicación 26, en el que dicho vector es un vector de replicación competente de replicación condicional.

28. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en el que la molécula de ácido nucleico es un oligonucleótido antisentido.

29. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en el que la molécula de ácido nucleico es un ARN inhibidor.

30. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en el que la molécula de ácido nucleico es una ribozima.

31. Disolución que comprende un ácido nucleico, dextrina y al menos un disacárido, en la que la cantidad de dextrina presente en la disolución es de entre el 2-20% (p/v), la cantidad de disacárido es de entre el 1-10% (p/v) y la osmolaridad de dicha disolución es esencialmente isotónica con la osmolaridad del medio fisiológico de la célula que va a tratarse, para su uso en la administración de ácido nucleico a una célula.

32. Disolución según la reivindicación 31, que incluye además una cualquiera o más de las características de las reivindicaciones 2 a 30.

33. Disolución farmacéutica adecuada para instilación intraperitoneal que comprende dextrina, siendo la cantidad de dextrina presente en la disolución de entre el 2-20% (p/v); al menos un disacárido siendo la cantidad de disacárido de entre el 1-10% (p/v); un catión divalente y un vector recombinante o un ácido nucleico siendo la osmolaridad de dicha disolución de desde aproximadamente 250 hasta 350 miliosmolar.

34. Formulación según la reivindicación 33, en la que la concentración del catión divalente es de entre 0,2 mM y 3,0 mM.

35. Formulación según la reivindicación 33 ó 34, en la que dicho catión divalente se proporciona mediante MgCl_{2}.

36. Formulación según cualquiera de las reivindicaciones 33-35, en la que dicho vector es un vector adenoviral.

37. Formulación según la reivindicación 36, en la que dicho vector adenoviral es un vector de replicación competente.