MXPA01004989A - Vectores virales con expresion transgenica tardia - Google Patents

Abstract

La presente invención estádirigida a virus recombinante que contiene un transgen terapéutico ligado operativamente a un elemento regulador tardío;los vectores de la presente invención son capaces de replicación y lisis de células neoplásticas;los vectores pueden incluir opcionalmente modificaciones para el genoma de manera de impartir funciones adicionales terapéuticas, condicionalmente replicantes o funciones diana;la presente invención provee además formulaciones farmacéuticas de dichos vectores;la presente invención además provee métodos de uso de dichos vectores;la presente invención provee además métodos para preparar los vectores.

Description

VECTORES VIRALES CON EXPRESIÓN TRANSGENICA TARDÍA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El genoma del adenovirus ha sido bien caracterizado. Esta información ha sido usada para diseñar adenovirus recombinantes que son capaces de actuar como vectores para la introducción de ADN exógeno en células que constituyen el objetivo. Muchos de estos vectores contienen modificaciones para los productos génicos precoces a fin de dotar a los vectores con actividades específicas. Por ejemplo, los genes precoces E1 y E2, han sido transcritos temprano después de la infección. Los productos de estos genes son responsables de la supresión de la capacidad de la célula infectada para responder a la infección y para promover réplicas virales en el huésped. En particular, el gen precoz inmediato E1a ha sido rápidamente transcrito después de la infección. El producto E1a puede inmortalizar las células primarias in vivo. E1a ha demostrado también que se adhiere a la proteína celular p105 RB, que es el producto del gen de retinoblastoma. El gen E1b no es capaz de transformar las células por sí mismo, pero coopera con E1a para transformar las células en forma estable. Tanto el E1a como el E1b son necesarios para una completa transformación y formación de tumores en animales. El gen E1a tiene una variedad de funciones. El alcance completo de actividad de la región E1a del adenovirus ha sido descrito en Bayley, S. and Mymryk, J. (1994) Intl. J. of Oncology 5:425-444. Los genes E1 b se sabe que interactúan con las proteínas de las células huésped. En particular se producen dos proteínas mediante empalme diferencial de la secuencia E1b, p19 y p55. La proteína p55 ha sido bien caracterizada como interactuando con el producto génico p53. p53 es una proteína bien caracterizada y ha demostrado que activa las vías apoptóticas de la muerte programada de las células (PCD) cuando está presente en suficiente concentración intracelular. Se ha demostrado que la apoptosis inducida por p53 ocurre en respuesta a una amplia variedad de lesiones celulares que incluyen radiación, agentes perjudiciales para el ADN, etc. Mediante la adhesión al p53, el p55 evita la formación del tetramero fosforilado activo p53. Debido a que el p53 es secuestrado por p55, nunca se inicia una vía apoptótica primaria y la célula infectada se ve sometida a una replicación descontrolada en combinación con la actividad Rb en respuesta a las proteínas E 1 a 12S y 13S. Las E1a y E1b cooperan en sus actividades. En particular E1 ha demostrado que induce la apoptosis que depende de p53 y que es independiente de p53. Además de inducir otros genes virales precoces, E1a dirige la célula quiescente en la fase S lo cual es necesario para la replicación viral. Se cree que esta presión precoz para que la fase S sea invadida por el virus en la célula quiescente induce una respuesta apoptótica de la célula. El adenovirus responde mediante la expresión de la proteína E1b 55K para adherirse a p53 y demorar la inducción de la apoptosis de manera que el virus sea capaz de replicarse antes de la muerte de su huésped. El adenovirus produjo también la proteína E1 B19K que evita también o demora la apoptosis intermediada por E1a. Alternativo para este tipo de vector selectivamente replicante es el empleo de un vector adenoviral deficiente de replicación que contiene una extensa eliminación de la función E1. En particular, los vectores que contienen la eliminación de E1 , E3 y deleciones parciales E4 han sido empleados para liberar transgenes exógenos. Dichos vectores han sido empleados para liberar el gen p53 a las células objetivo. Se ha demostrado que la expresión de un tipo salvaje exógenamente administrado p53 en una célula tumoral deficiente en p53 (p53 mutado o p53 nulo) es capaz de inducir la apoptosis intermediada por p53 en la célula tumoral. Dichos vectores virales para la liberación de p53 son actualmente desarrollados por Schering Corporation. Nuevamente estos vectores han demostrado perfiles de toxicología aceptables y eficacia terapéutica para aplicaciones terapéuticas humanas y están en las pruebas clínicas de fase II en el hombre para el tratamiento de tumores malignos relacionados con p53. Los vectores de replicación deficiente y selectivamente replicantes tienen, por lo menos en teoría, inconvenientes de diseño que constituyen un problema para los clínicos. Debido a que los vectores deficientes de replicación no se propagan en forma descontrolada en el paciente, tienen un perfil de seguridad teóricamente más atractivo. Sin embargo, debido a que una eficaz eliminación de tumores requiere la infección de la sustancial mayoría de las células tumorales que están infectadas, comúnmente se usa un substancial exceso molar de vector para asegurar la eficacia terapéutica. Los vectores selectivamente replicantes se consideran como más que una solución desde la perspectiva de seguridad debido a su capacidad para replicarse y mutar potencialmente para formar vectores competentes de total replicación en el paciente. Sin embargo, la explotación de la capacidad natural del virus para propagarse bajo condiciones particulares permite que estos vectores se diseminen a las células tumorales circundantes. Debido a que los vectores por sí mismos son capaces de replicarse, se requiere una dosis inicial inferior de dichos vectores. Esto es favorable de una perspectiva inmunológica, así como también por razones económicas en la fabricación de dichos agentes. Con el propósito de facilitar la comprensión de la presente invención, se ofrece una breve revisión del ciclo de vida de un virus típico usado para liberar transgenes exógenos, que es el adenovirus. El ciclo de réplica adenoviral en células humanas puede dividirse en la fase precoz y tardía que está puntualizada por el inicio de la réplica de ADN viral. La fase precoz es cuando las partículas virales se adhieren a las células a través de la interacción entre el dominio de la fibra viriónica y los receptores de superficie de las células. El virión se desplaza dentro de la célula mediante endocitosis o mediante penetración directa de la membrana citoplásmica y es transportado hasta el núcleo donde se difunde la mayor parte de la capsida. En el núcleo, las proteínas del núcleo viriónico son removidas obteniéndose cromosomas virales que están casi enteramente libres de proteínas viriónicas. La expresión del genoma viral es temporalmente coordinada y comienza con la región E1a aproximadamente una hora después de la infección. Los otros genes precoces E1b, E2, E3 y E4 son expresados primero poco tiempo después del E1a a las 1.5-2.0 horas después de la infección. Son necesarias una cantidad de los productos proteínicos codificados por los genes precoces para una replicación de ADN viral, mientras que otros preparan la maquinaria de la síntesis de ADN de la célula infectada para la replicación de ADN viral eficiente. Algunas proteínas precoces viralmente codificadas han sido asociadas con la protección de células infectadas a partir de observación continua de la inmunidad. La fase tardía de infección comienza con la replicación de ADN a aproximadamente 7 horas después de la infección. En el adenovirus nativo, los ARN mensajeros para todos los productos génicos tardíos son empalmados desde un ARN primario el cual es transcrito a partir del promotor tardío principal (MLP). El MLP está situado en la posición 16.5 del filamento r. Aunque el promotor tardío principal es activo hasta un grado limitado en la fase precoz de la infección, la transcripción no prosigue más allá de la posición 39 del mapa. Durante la fase tardía del ciclo de vida viral, el MLP queda totalmente activado y continúa con la posición 99 del mapa. Cada una de las transcripciones de ARN primarias tardías es procesada en una de 5 ARNm diferentes, L1-L5. Estos ARNm contienen todos una secuencia líder tripartita común de 203 nucleótidos. Los ARNm tardíos codifican componentes de la capsida y las proteínas que se requieren para ensamblar los viriones y empaquetar el cromosoma viral. La replicación de ADN viral requiere la proteína terminal para la iniciación y prosigue por un mecanismo semi-conservador. Con el comienzo de réplica, se inicia una transcripción eficiente de las familias génicas tardías desde el promotor tardío principal y alcanza un nivel máximo aproximadamente 18 horas después de la infección. Durante la fase viral tardía, las proteínas bloquean el ADN celular y la síntesis de proteínas, presumiblemente de modo que pueda ocurrir una síntesis macromolecular viral máxima. La expresión génica intermedia, que comienza en realidad durante la fase tardía, alcanza un punto máximo entre 8-12 horas después de la infección. El ensamblaje del virión y el empaquetamiento del genoma viral comienza a aproximadamente 24 horas después de la infección. Las células infectadas mueren debido a la trituración y el rendimiento del lisado rinde aproximadamente 10,000 viriones por célula.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee un virus recombinante condicionalmente replicante que contiene un transgen terapéutico bajo el control de un elemento regulador tardío. La invención provee además formulaciones farmacéuticas y métodos de uso de las mismas. La presente invención provee además células productoras recombinantes que son capaces de complementar los genes de empaquetamiento defectuosos o delecionados en el vector. La presente invención provee también un método para preparar dichos vectores y formulaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 es un autorradiograma de un estudio a lo largo del tiempo donde se comparan los niveles de expresión de p53 de un virus MLP-p53 (Ad5dE1bMLPp53) competente de replicación en comparación con un vector p53 (ACN53) deficiente de replicación de dos concentraciones diferentes (1.8 x 108 partículas/ml (panel superior) y 1.8 x 109 partículas/ml (panel inferior), en células MRC9 de acuerdo con los procedimientos del presente ejemplo 2.a. Tal como puede observarse por los datos presentados, la replicación de las construcciones de MLP-p53 competentes dieron como resultados una expresión posterior en el tiempo a la del virus CMV-p53 (ACN53) deficiente de replicación. Los datos ilustran adicionalmente el hecho de que los niveles de la expresión p53 producida a partir del virus MLP-p53 competente de replicación, son significativamente superiores a los del virus CMV-p53 deficientes de replicación. La figura 2 presenta los resultados de un experimento sustancialmente similar al que se presenta en la figura 1 excepto que el experimento se llevó a cabo en células de carcinoma hepatocelulares SK-HEP1 de acuerdo con los procedimientos del ejemplo 2.b presente. Nuevamente el experimento a lo largo del tiempo demuestra la expresión temporal y mayor del p53 en la construcción MLP-p53 competente de replicación. La figura 3 presenta los resultados de un experimento sustancialmente similar al que se presenta en la figura 1 excepto que el experimento se llevó a cabo en células de cáncer de mama en NCI H358 de acuerdo con los procedimientos del presente ejemplo 2.c. Nuevamente el experimento a lo largo del tiempo demuestra la expresión temporal de p53 en la construcción MLP-p53 competente de replicación. La figura 4 presenta los resultados de un experimento similar al que se presenta en la figura 3, excepto que se incluyó un virus E1 bdJ55k-CMV-p53 competente de replicación para fines comparativos y se administró únicamente una sola dosis de acuerdo con los procedimientos del ejemplo 2.d presente. Este experimento a lo largo del tiempo demuestra la expresión temporal de p53 en la construcción MLP-p53 competente de replicación comparada con una construcción sustancialmente similar donde el gen p53 estaba bajo el control del promotor CMV constitutivo. Estos datos confirman que la construcción MLP-p53 expresa en realidad el p53 en una manera temporal tardía en el ciclo de replicación viral. La figura 5 es un digesto del ADN viral de la célula SK-BR3 infectadas con un pulso de una hora de los virus indicados en una concentración de 1.8 x 109 partículas/ml y cosechadas aproximadamente 48 horas después de acuerdo con los procedimientos del presente ejemplo 2.d. Los resultados presentados demuestran que Ad5 (AddWT), de tipo salvaje, el virus E1 Bd]55K (ZAZA), E1 Bdl55K-MLP-p53 (55K/MLP53) competente de replicación, replicaron todos bien su ADN viral mientras que el control de adenovirus de replicación deficiente (rAdcon) y el vector de replicación deficiente que codifica p53 (FTCB) no lo hicieron. La figura 6 es una representación gráfica de los datos obtenidos in vivo en un modelo de tumor de ratón PC-3. El volumen del tumor está gratificado en el eje vertical y los días después de la administración están gratificados en el eje horizontal. Tal como puede observarse por los datos presentados, el virus replicante E1Bdl55K-MLP-p53 (cFaMA) fue capaz de producir la regresión de los tumores en un modelo de ratón in vivo de cáncer humano. El virus p53 dirigido por CMV competente de replicación, replica también su ADN pero en menor grado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Lá presente invención provee un virus competente de replicación que contiene un transgen terapéutico ligado operativamente a un elemento regulador tardío.

I. Virus recombinante competente de replicación: El término "competente de replicación" se cita con referencia a un virus que es capaz de replicar su genoma y empaquetar el genoma viral replicado en partículas infecciosas en células de mamífero. Debe observarse que el término competente de replicación no se aplica generalmente a los virus que únicamente puede desarrollarse en células que han sido modificadas para proveer funciones virales delecionadas in trans. El término "virus recombinante" se refiere a cualquiera de los parásitos intracelulares obligados que no tienen un mecanismo sintetizador de proteína o generador de energía capaz de infectar una célula de mamífero cuyos genomas han sido modificados mediante técnicas convencionales de ADN recombinante. El genoma viral puede ser un ARN o ADN contenido en una estructura revestida de proteína de una manera lípida. Los términos virus y vectores vírales se usan aquí intercambiablemente. Los virus útiles en la práctica de la presente invención incluyen virus de ARN o ADN recombinante modificados, con envoltura o sin envoltura, seleccionados preferiblemente entre baculoviridiae, parvoviridiae, picornoviridiae, herpesveridiae, poxiviridiae, adenoviridiae o picornaviridiae. Los vectores virales quiméricos que explotan elementos ventajosos de cada una de las propiedades del vector principal (véase, por ejemplo Feng, et al. (1997) Nature Biotechnology 15:866-870) pueden ser también útiles en la práctica de la presente invención. Los sistemas vectores mínimos en los cuales el esqueleto viral contiene solamente las secuencias necesarias para empaquetar el vector viral y que pueden incluir opcionalmente un cassette de expresión transgénica pueden producirse también de acuerdo con la práctica de la presente invención. Aunque generalmente se favorece el empleo de un virus de la especie que se tratará, en algunos casos puede ser ventajoso usar vectores derivados de diferentes especies que posean características patogénicas favorables. Por ejemplo, los vectores del virus de herpes equino para terapia génica humana han sido descritas en la WO 98/27216 publicada el 5 de agosto de 1998. Los vectores se describen como útiles para el tratamiento de seres humanos debido a que el virus equino no es patogénico para los seres humanos. De manera similar, pueden usarse vectores adenovirales ovinos en terapia génica humana debido a que se manifiesta que evitan los anticuerpos contra los vectores adenovirales humanos. Dichos vectores han sido descritos en la WO 97/06826 publicada el 10 de abril de 1997. En la práctica preferida de la invención, el virus es un adenovirus. El término "adenovirus" es sinónimo del término "vector adenoviral" y se refiere al virus del género adenoviridiae. El término adenoviridiae se refiere colectivamente a los adenovirus animales del género mastadenovirus que incluye pero no está limitado a los subgéneros de los adenovirus humanos, bovino, ovino, equino, canino, porcino, murino y simio. En particular los adenovirus humanos incluyen los subgéneros A-F así como también los serotipos individuales de los mismos, los serotipos individuales y los subgénes A-F incluyendo pero sin limitarlo a los tipos de adenovirus humanos 1 , 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 (Ad11A y Ad 11 P), 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 19a, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 34a, 35, 35p, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 y 91. El término adenovirus bovino incluye pero no está limitado a los tipos de adenovirus bovino 1 , 2, 3, 4, 7 y 10. El término adenovirus canino incluye pero no está limitado a tipo 1 canino (cepas CLL, Glaxo R1261 , Utrect, Toronto 26-61 ) y 2. El término adenovirus equino incluye pero no está limitado a los tipos 1 y 2 equino. El termino adenovirus porcino incluye pero no está limitado a tipos 3 y 4 porcino. El término adenovirus recombinante incluye también vectores quiméricos (o incluso multiméricos), es decir vectores construidos usando secuencias codificadoras complementarias de más de un subtítulo viral. Véase por ejemplo Feng, et al. Nature Biotechnology 15:866-870. En la práctica preferida de la invención, el vector adenoviral recombinante deriva del género adenoviridiae. Los virus particularmente preferidos derivan de los tipos 2 o tipo 5 de adenovirus humano. En la práctica preferida de la invención ejemplificada aquí, el vector preferido deriva del adenoviridiae humano. Son más preferidos los vectores derivados del subgrupo C de adenovirus humano. Son más preferidos los vectores adenovirales derivados de los serotipos 2 y 5 de adenovirus humano. En la práctica más preferida de la invención, el virus deriva del adenovirus humano tipo 5 dl309, dl327, dl520 o del adenovirus de tipo salvaje.

II. Elemento regulador tardío El término "elemento regulador tardío" se refiere a un elemento regulador que impulsa la transcripción del transgen terapéutico en un punto posterior en el tiempo con respecto al elemento que induce la replicación viral inicial. Característicamente, se encuentra a estos elementos promotores dirigiendo la expresión de las proteínas de empaquetamiento y de otras proteínas tardías en el ciclo de vida viral. Un ejemplo de dicho elemento regulador tardío cuando el vector principal es el adenovirus consiste en el promotor tardío principal de adenovirus (MLP). Otros sistemas vectores virales poseen también promotores tardíos temporalmente regulados. Para los vectores baculovirales, el promotor génico básico AcNPV y los promotores génicos de polihedrina pueden también emplearse (Sridhar, et al. (1993) FEBS Lett. 315:282-286. Para los virus de herpes simplex, pueden emplearse los Promotores Activados Latentes. Véase por ejemplo Rivera-González, er al. (1994) Virology 202.550-564 e Imbal, et al. (1992) J. Virol. 66:5453-5463. Para los virus de papiloma humano puede emplearse el promotor HPV31 b (Ozbun and Meyers (1998), J. Virol 72:2715-22). Para los parvovirus, el promotor P39. Para el virus de vaccinia el promotor p11. En la práctica preferida de la invención, el virus deriva del género adenoviridiae y el elemento regulador tardío es el Promotor Tardío Principal. El Promotor Tardío Principal está bien caracterizado en la técnica y reside en aproximadamente la posición 16.5 del mapa del genoma del tipo 2 adenoviral.

III. Ligado operativamente: El término "ligado operativamente" se refiere a un enlace de los elementos polinucleótidos en una relación funcional. Una secuencia de ácido nucleico está "ligada operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o mejorador está ligado operativamente a una secuencia codificadora si afecta la transcripción de la secuencia codificadora. Ligado operativamente significa que las secuencias nucleótidas que están ligadas son típicamente contiguas. Sin embargo, debido a que los mejoradores funcionan generalmente cuando están separados del promotor por varios kilobases, y que las secuencias intrónicas pueden tener longitudes variables, algunos elementos polinucleotídicos pueden estar operativamente ligados pero no directamente flanqueados e incluso pueden funcionar en trans desde un cromosoma o alelo diferente.

IV. Transqen terapéutico: El término "transgen terapéutico" se refiere a una secuencia nucleotídica cuya expresión en la célula que constituye el objetivo produce un efecto terapéutico. El término transgen terapéutico incluye pero no está limitado a los genes supresores de tumores, a los genes antigénicos, a los genes citotóxicos, los genes citostáticos, los genes activadores de profármaco, a los genes apoptóticos, a los genes farmacéuticos o genes antiangiogénicos. Los vectores de la presente invención pueden usarse para producir uno o más transgenes terapéuticos, ya sea en tándem a través del uso de los elementos IRES o a través de promotores independientes regulados.

A. Gen supresor de tumores El término "gen supresor de tumores" se refiere a una secuencia nucleotídica, la expresión del cual en la célula objetivo es capaz de suprimir el fenotipo neoplástico y/o inducir apoptosis. Ejemplos de genes supresores de tumores que son útiles en la práctica de la presente invención incluye el gen p53, el gen APC, el gen DPC-4, el gen BRCA-1 , el gen BRCA-2, el gen WT-1 , el gen de retinoblastoma (Lee, et al. (1987) Nature 329.642), el gen MMAC-1 , la proteína adenomatosa de poliposiscoli (Albertsen, et al. patente de E.U.A. No. 5,783,666, concedida el 21 de julio de 1998), el gen delecionado en el carcinoma de colon (DCC), el gen MMSC-2, el gen NF-1 , el gen supresor del tumor de carcinoma nasofaríngeo que está mapeado en el cromosoma 3p21.3 (Cheng, et al. 1998. Proc Nat Acad. Sci 95:3042-3047), el gen MTS1 , el gen CDK4, el gen NF-1 el gen NF-2, y el gen VHL.

B. Genes antigénicos El término "genes antigénicos" se refiere a una secuencia nucleotídica, la expresión de la cual en las células que constituyen el objetivo da como resultado la producción de una proteína antigénica de superficie de célula que es capaz de reconocimiento por el sistema inmunitario. Ejemplos de genes antigénicos incluyen el antígeno carcinoembriónico (CEA), p53, (tal como ha sido descrito en Levine,, A PCT International Publication No. WO94/02167 publicado el 3 de Febrero de 1994). Con el fin de facilitar el reconocimiento inmune, el gen antigénico puede fusionarse con el antígeno MHC de clase 1.

C. Genes citotóxicos El término "gen citotóxico" se refiere a una secuencia nucleotídica, la expresión de la cual en una célula produce un efecto tóxico.

Ejemplos de dichos genes citotóxicos incluyen secuencias nucleotídicas que codifican la exotoxina pseudomonas, la toxina de risina, la toxina de difteria y similares.

D. Genes citostáticos El término "gen citostático" se refiere a una secuencia nucleotídica, la expresión de la cual en una célula produce una interrupción en el ciclo de la célula. Ejemplos de dichos genes citostáticos ¡ncluyen p21 , el gen de retinoblastoma, el gen E2F-Rb, genes que codifican los inhibidores de kinasa que dependen de ciclina tales como P16, p15, p18 y p19, el gen homeobox (GAX) específico de interrupción del desarrollo descrito en Branellec, et al. (Publicación PCT W097/16459 publicada el 9 de mayo de 1997 y publicación PCT WO96/30385 publicada el 3 de octubre de 1996).

E. Gen de citoquina El término "gen de citoquina" se refiere a una secuencia nucleotídica, la expresión de la cual en una célula produce una citoquina. Ejemplos de dichas citoquinas incluyen GM-CSF, las interleuquinas, especialmente IL-1 , IL-2, I L-4, IL-12, IL-10, IL-19, IL-20, interferones de los subtipos alfa, beta y gama, especialmente el interferon alfa-2b y fusiones tales como el interferon alfa-2alfa-1.

F. Gen de Quimioquina El término "gen de quimioquina" se refiere a una secuencia nucleotídica, la expresión de la cual en una célula produce una citoquina, el término quimioquina se refiere a un grupo de factores de citoquinas de bajo peso molecular estructuralmente relacionadas que son secretadas por células que están estructuralmente relacionadas que tienen actividades mitogénicas, quimiotácticas o inflamatorias. Consisten principalmente en proteínas catiónicas de 70 a 100 residuos aminoácidos que comparten cuatro residuos cisteína conservados. Estas proteínas pueden clasificarse en dos grupos basados en el espaciamiento de las dos cisteínas amino-terminales. En el primer grupo las dos cisteínas están separadas por un solo residuo (C-x-C), mientras que en el segundo grupo son adyacentes (C-C). Ejemplos de miembros de las quimioquinas 'C-x-C incluyen pero no están limitadas al factor de plaquetas 4 (PF4), proteína básica de plaquetas (PBP), interleuquina-8 (IL-8), proteína de actividad estimuladora del desarrollo de melanomas (MGSA), proteína 2 inflamatoria de macrófagos (MIP-2), Mig de ratón (m119), 9E3 de pollo (o pCEF-4), factores I y II quimiotácticos de macrófagos alveolares de cerdo (AMCF-I y -II), factor estimulador del desarrollo de célula pre-B (PBSF) y IP10. Ejemplos de miembros del grupo 'C- C incluyen pero no están limitados a la proteína 1 quimiotáctica de monocitos (MCP-1), proteína 2 quimiotáctica de monocitos (MCP-2), proteína 3 quimiotáctica de monocitos (MCP-3), proteína 4 quimiotáctica de monocitos (MCP-4), proteína 1alfa inflamatoria de macrófagos (MIP-1-alfa), proteína 1-beta inflamatoria de macrófagos (MIP-1-beta), proteína 1 -gamma inflamatoria de macrófagos (MIP-1 -gamma) proteína 3-alfa inflamatoria de macrófagos (MIP-3-alfa), proteína inflamatoria de macrófagos 3-beta (MIP-3-beta), quimioquina (ELC), proteína 4 inflamatoria de macrófagos (MIP-4), proteína 5 inflamatoria de macrófagos (MIP-5), LD78 beta, RANTES, SIS-epsilon (p500) quimioquina del timo y de activación regulada (TARC), eotaxina, I-309 proteína humana HCC-1/NCC-2, proteína humana HCC-3, proteína de ratón C10.

G. Genes de proteínas farmacéuticas El término "gen de proteína farmacéutica" se refiere a una secuencia nucleotídica, la expresión de la cual da como resultado la producción de proteínas que tienen un efecto farmacéutico sobre la célula que constituye el objetivo. Ejemplos de dichos genes farmacéuticos incluyen el gen de proinsulina y sus análogos (tal como se describe en la solicitud de patente internacional PCT No W098/31397, el gen de la hormona de crecimiento, dopamina, serotonina, factor de crecimiento epidérmico, GABA, ACTH, NGF, VEGF (para aumentar la perfusión sanguínea dirigida al tejido, inducir angiogénesis, publicación PCT WO98/32859 publicada el 30 de julio de 1998), trombospondina, etc.

H. Genes pro-apoptóticos El término "gen pro-apoptótico" se refiere a una secuencia nucleotídica, la expresión de la cual da como resultado la muerte de la célula programada en dicha célula. Ejemplos de genes pro-apoptóticos incluyen p53, los adenovirus E3-11.6K, el gen E4orf4 de adenovirus, los genes de la vía p53 y los genes que codifican las caspasas. El gen p16 es también apoptótico en los tumores de tipo Rb positivo, p16 negativo, p53 de tipo salvaje. (Frizelle, eí al. (1998) Oncogene 16:3087-95 y Sanding, et al. (1997) Nature Medicine 3:313).

I. Genes activadores de pro-fármacos El término "genes activadores de pro-fármacos" se refiere a secuencias nucleotídicas, la expresión de las cuales da como resultado la producción de proteínas que son capaces de convertir un compuesto no terapéutico en un compuesto terapéutico, que convierte a la célula susceptible a la muerte causada por factores externos o que causa un estado tóxico en la célula. Un ejemplo de un gen activador de profármaco es el gen de citosina desaminasa. La citosina desaminasa convierte la 5-fluorocitosina (5-FC) a fluoruracilo (5-FU) que es un potente agente antitumoral. La lisis de la célula tumoral provee una explosión de citosina desaminasa localizada que es capaz de convertir 5FC a 5FU en el punto localizado del tumor lo cual da como resultado la muerte de muchas células tumorales circundantes. Esto da como resultado la muerte de una gran cantidad de células tumorales sin necesidad de infectar estas células con un adenovirus (el denominado "efecto circundante"). Adicionalmente, puede emplearse el gen de timidina quinasa (TK), (véase, por ejemplo Woo, et al., patente norteamericana No 5,631,236, concedida el 20 de mayo de 1997) y Freeman eí al., patente norteamericana No 5,601 ,818 concedida el 11 de febrero de 1997), donde las células que expresan el producto del gen TK son susceptibles de muerte selectiva mediante la administración de gancyclovir.

J. Genes anti-angiogénicos El término "anti-angiogénicos" se refiere a una secuencia nucleotídica, cuya expresión da como resultado la secreción extracelular de factores anti-angiogénicos. Los factores anti-angiogénicos incluyen angiostatina, inhibidores del factor de desarrollo endotelial vascular (VEGF) tal como Tie 2 (descrito en PNAS (USA) (1998) 95:8795-8800), y endostatina.

K. Modificaciones de genes terapéuticos Resultará fácilmente aparente para los expertos en la técnica que las modificaciones y/o deleciones en los genes previamente mencionados para que codifiquen sus fragmentos funcionales de la proteína de tipo salvaje podrán ser fácilmente adaptadas para ser usadas en la práctica de la presente invención. El término "modificaciones" se refiere a cambios en la estructura genómica del vector adenoviral recombinante. Dichas modificaciones incluyen deleciones y/o cambios en la secuencia codificadora de aminoácidos para producir una proteína deficiente en adhesión a su substrato. Por ejemplo, la referencia al gen p53 incluye no solamente la proteína de tipo salvaje sino también las proteínas p53 modificadas, las variaciones alélicas de la misma o proteínas derivadas de otras especies de mamíferos. La secuencia p53 de tipo salvaje es bien conocida en la técnica. Otras moléculas p53 de mamíferos son también conocidas en la técnica y pueden incorporarse en la práctica de la presente invención, tal como murina p53, porcina p53, equina p53, bovina p53, canina p53, etc. El término "proteínas p53 modificadas" se refiere a modificaciones en la estructura primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria de la proteína p53 que retiene la función de las proteínas p53. Ejemplos de dichas proteínas p53 modificadas incluyen las modificaciones del p53 para aumentar la retención nuclear, las deleciones tales como delta 13-19 aminoácidos para eliminar el sitio de disociación de consenso de calpaina, modificaciones del dominio de oligomerización (descrito en Braceo, et al. solicitud publicada PCT WO97/0492 o patente norteamericana No. 5,573,925). Alternativamente, puede modificarse la secuencia p53 para reemplazar los dominios de tetramerización endógenos con un dominio de oligomerización cremallera de leusina. Resultará muy evidente para los expertos en la técnica que los precedentes genes terapéuticos pueden ser secretados en los medios o pueden localizarse en ubicaciones intracelulares particulares mediante la inclusión de una porción diaria tal como un péptido de señal o una señal de localización nuclear (NLS). Asimismo se incluyen en la definición del transgen terapéutico las proteínas de fusión del transgen terapéutico con la proteína estructural del tipo I de virus de herpes simplex (HSV-1), VP22. Las proteínas de fusión que contienen la señal VP22, cuando se sintetizan en una célula infectada, son exportadas fuera de la célula infectada y entran eficientemente en las células circundantes no infectadas hasta un diámetro de aproximadamente 16 células de ancho. Este sistema es particularmente útil conjuntamente con las proteínas transcripcionalmente activas (por ejemplo p53), debido a que las proteínas de fusión son eficientemente transportadas hasta los núcleos de las células circundantes. Véase por ejemplo Elliot, G. & O'Hare, P. Cell. 88.223:1997; Marshall, A. & Castellino, A. Research News Briefs. Nature Biotechnology. 15:205. 1997; O'Hare, et al. publicación PCT W097/5265 publicada el 13 de febrero de 1997. Una porción diana similar derivada de la proteína VIH Tat ha sido también descrita en Vives, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272. 16010-169017.

V. Modificaciones adicionales para el virus La presente invención provee también adenovirus recombinantes que contienen modificaciones adicionales para el genoma viral tal como modificaciones de diana, modificaciones para que los vectores se repliquen selectivamente en tipos de células o estados fenotípicos particulares, características de expresión controladas, genes suicidas o modificaciones adicionales para mejorar la citotoxicidad. Sin embargo, esto no significa que pueda implicar que no puedan incluirse también otras modificaciones en el genoma viral o que no puedan emplearse múltiples modificaciones.

A. Selectivamente replicante El término "selectivamente replicante" se refiere a un vector viral recombinante que es capaz de replicación preferencial en un tipo de células versus otro tipo de célula, en una célula en un estado fenotípico en relación a otro estado fenotípico, o en un tipo de célula determinada en respuesta a un estímulo externo. La replicación selectiva se logra mediante el uso de elementos de control de replicación. El término "elementos de control de replicación" se refiere a secuencias de ADN insertadas en el genoma viral o a modificaciones del genoma viral para producir vectores virales recombinantes que se replican selectivamente en un tipo de célula versus otro tipo de célula, en una célula en un estado fenotípico en relación con otro estado fenotípico (específico del estado de célula) o en un tipo de célula determinado en respuesta a un estímulo externo (inducible). Ejemplos de dichos elementos de control de replicación incluyen promotores específicos de tipo de célula, promotores específicos de estado de célula, y promotores inducibles. 1. Promotores específicos de tipo de célula Puede lograrse una replicación específica de tipo de célula mediante la unión de un promotor específico de tipo de célula en un gen precoz viral tal como un gen E1 , E1a, E2 o E4 cuando el virus está seleccionado del genoma de adenovirus. El término "promotor específico de tipo de célula" se refiere a promotores que son activados diferencialmente como resultado de la progresión en el ciclo de células o en tipo de células diferentes. Ejemplos de promotores específicos de tipo de célula incluyen promotores génicos reguladores de ciclo de células, promotores específicos de tejidos, o promotores que responden a las vías. En la práctica preferida de la invención, el promotor específico del tipo de células está ligado al gen E4 en vez de al gen E1 debido a que factores tales como NF-IL6 pueden substituir E1a en la regulación de promotores que responden a E1a en el adenovirus en ausencia de la función E1a. (Spergel, et al. (1992) J. Virol. 66. 1021-1030). a. Promotores génicos reguladores del ciclo de la células El término "promotores génicos reguladores del ciclo de células" describe promotores para genes que son activados substancialmente mediante la entrada en la fase S. Ejemplos de dichos promotores incluyen los promotores regulados E2F, (por ejemplo promotores DHFR, ADN, alfa polimeraza, timidilato sintasa, c-myc y b-myb). b. Promotores específicos de teiidos Los promotores específicos de tejidos son bien conocidos en la técnica e incluyen promotores activos preferiblemente en el músculo liso (promotor de a-actina), específico de páncreas (Palmiter, et al. (1987) cell 50:435), específico de hígado Rovet, ef al. (1992) J. Biol. Chem. 267:20765; Lemaigne, et al. (1993) J. Biol. Chem. 268.19896; Nitsch, eí al. (1993) Mol. Cell. Biol. 13.4494), específico de estómago (Kovarik, eí al. (1993) J. Biol. Chem. 268:9917, específico de pituitaria (Rhodes, eí al. (1993) Genes Dev. 7:913, específico de próstata (patente norteamericana No. 5,698,443, Henderson, et al. concedida el 16 de diciembre de 1997), etc. c. Promotores que responden a las vías El término "promotor que responde a las vías", se refiere a las secuencias de ADN que se adhieren a ciertas proteínas y que hacen que los genes cercanos responden transcripcionalmente a la adhesión de la proteína en células normales. Dichos promotores pueden generarse mediante la incorporación de elementos de respuesta que son secuencias a las cuales se adhieren los factores de transcripción. Dichas respuestas son generalmente inductivas, aunque hay varios casos en los cuales los niveles crecientes de proteínas disminuyen la transcripción. Los promotores que responden a las vías pueden ocurrir en forma natural o pueden ser sintéticos. Los promotores que responden a las vías están típicamente construidos con referencia a la vía o una proteína funcional a la que están dirigidos. Por ejemplo un promotor que responde a la vía p53 natural incluiría elementos de control de transcripción activados por la presencia de p53 funcional tal como el promotor p21 o bax. Alternativamente, los promotores sintéticos que contienen los sitios de adhesión p53 cadena arriba de un promotor mínimo (por ejemplo, la región de box SV40 TATA), pueden emplearse para crear un promotor sintético que responde a las vías. Los promotores sintéticos que responden a las vías, están generalmente construidos a partir de una o más copias de una secuencia que se aparea con un motivo de adhesión de consenso. Dichos motivos de adhesión de ADN de consenso pueden ser fácilmente determinados. Dichas secuencias de consenso generalmente están dispuestas como repetición directa o de cabeza a cola separados por unos pocos pares de bases. Los elementos que incluyen repeticiones de cabeza a cabeza (por ejemplo AGGTCATGACCT) se denominan palíndromos o repeticiones invertidas y aquellos con repeticiones de cola a cola se denominan repeticiones de eversión. i. Ejemplos de promotores de vías Ejemplos de promotores que responden a las vías y que son útiles en la práctica de la presente invención incluyen promotoress sintéticos de respuesta a las vías que contienen la secuencia de adhesión de insulina de consenso (Jacob, et al. (1995). J. Biol. Chem. 270:27773-27779), el promotor de respuesta a las vías de citoquina, el promotor de respuesta a las vías glucocorticoides (Lange, et al., (1992) J. Biol. Chem. 267:15673-80), IL1 y IL6, promotores que responden a las vías (Won K. -A y Baumann H. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 3965-3978), promotores que responden a la vía T3, promotores que responden a las vías de la hormona tiroides que contienen el motivo de consenso: 5' AGGTCA 3', promotores que responden a la vía TPA (TREs), promotores que responden a la vía TGF-ß, (tal como ha sido descrito por Grotendorst, eí al. (1996) Cell Growth and Differentiation 7: 469-480). Adicionalmente, pueden usarse promotores que reponden a la vía E2F natural o sintética. Un ejemplo de un promotor que responde a la vía E2F ha sido descrito en Parr, et al. (1997), Nature Medicine 3:145-1149 el cual describe un promotor E2F-1 que contiene cuatro sitios de adhesión E2F y que según se informa son activos en células tumorales con ciclos rápidos. Ejemplos de otros promotores que responden a las vías son bien conocidos en la técnica y pueden identificarse en bases de datos de Regiones Reguladoras de Transcripción en Genomas Eucarióticos accesibles a través de internet en http:/www.eimb. rssi.ru/TRRD. ii. Promotores de vías preferidas En la práctica preferida de la invención que se ejemplifica aquí, el vector que comprende un promotor activo sintético de la vía TGF-ß en presencia de una vía TGF-ß funcional tal como el promotor que contiene los promotores de respuesta a la vía SRE y PAI. PAI se refiere a un promotor que responde a la vía TGF-ß que comprende secuencias que responde a TGF-ß señaladamente aisladas de la región promotora de activador de plásminógeno I. El promotor que responde a la vía PAI puede aislarse en forma de un fragmento de 749 pares de bases aislable a partir del plásmido pdOOluc (tal como ha sido descrito por Zonneveld, eí al. (1988) PNAS 85:5525-5529 y que está disponible en GenBank bajo número de acceso J03836). SRE se refiere a un elemento de respuesta TGF-ß sintético que comprende una repetición de cuatro de las secuencias de adhesión de ADN Smad-4 (GTCTAGAC tal como ha sido descrito en Zawel, eí al. (1988) Mol. Cell 1 :611-617. El elemento de respuesta SRE puede generarse por apareamiento de oligonucleótidos complementarios que codifican las secuencias de adhesión Smad-4 y por clonación en el plásmido pGL#3- vector promotor de luciferasa (comercialmente disponible en ProMega). 1. Promotores de la vía p53 De manera similar, "promotor que responde a la vía p53" se refiere a un elemento de control transcripcional que es activo en presencia de una vía funcional p53. El promotor que responde a la vía p53 puede ser una región de control transcripcional natural activa en presencia de una vía p53 funcional tal como el promotor V21 o mdm2. Alternativamente, el promotor que responde a la vía p53 puede ser una región de control sintético activo en presencia de una vía p53 funcional tal como los promotores que responden a la vía SRE y PAI-RE. p53-CON describe un promotor que responde a la vía p53 que contiene un elemento de respuesta p53 sintético construido mediante la inserción de dos secuencias de adhesión de ADN de consenso p53 sintéticas (tal como ha sido descrito por Funk, eí al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12:2866-2871) cadena arriba del box SV40 TATA. RGC se refiere a un promotor que responde a la vía p53 sintético usando un tándem de los dominios de adhesión p53 identificados en el cúmulo de genes ribosomales. Los elementos de respuesta p53CON y RGC pueden construirse mediante el apareamiento de los oligonucleótidos complementarios y los promotores que responden a p53 pueden construirse mediante clonación del vector luciferasa promotor pGL3 plásmido (disponible comercialmente en ProMega). d. Promotores específicos de tejidos ligados operativamente a un gen precoz Los promotores específicos de tejido son bien conocidos en la técnica e incluyen promotores que son preferiblemente activos en el músculo liso (promotor alfa-actina), específico de páncreas (Palmiter, eí al. (1987) Cell 50:435), específico de hígado Rovet, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:20765; Lemaigne, eí al. (1993) J. Biol. Chem. 268:19896, Nitsch, eí al. (1993) Mol. Cell. Biol. 13:4494), específico de estómago (Kovarik, eí al. (1993) J. Biol. Chem. 268.9917, específico de pituitaria (Rhodhes, eí al. (1993) Genes Dev. 7:913 y promotor de antígeno específico de próstata. 2. Específico de estado de célula Ejemplos de diferentes estados fenotípicos incluirían el fenotipo neoplástico versus un fenotipo normal en un tipo de célula determinada. La replicación selectiva se logra mediante el uso de elementos de control de replicación viral. El término elemento de control de replicación viral que se refiere a una secuencia de ADN manipulada en el vector de la presente invención, de manera que el virus pueda preferiblemente replicar el genoma viral en un tipo particular de célula objetivo. Nuevamente estos promotores específicos de estado de célula pueden estar ligados a un gen precoz tal como E1 , E2 o preferiblemente E4 para lograr replicación selectiva en respuesta a estados fenotípicos específicos. a. Específico de tumores Para lograr la expresión del adenovirus en células tumorales, puede emplearse un promotor específico de tumores para dirigir la expresión de un gen precoz. El término "promotores específicos de tumores" se refiere a promotores que son activos en células tumorales y que se inactivan en células que no son transformadas. Ejemplos de promotores específicos de tumores incluyen el promotor de alfa-fetoproteína, el promotor de tirosinasa. El uso de promotores específicos de tumores para lograr la replicación condicional de los vectores adenovirales ha sido descrito en la solicitud de patente norteamericana copendiente 08/433.798 presentada el 3 de mayo de 1995 y en la solicitud de patente internacional No. PCT/US96/06199 publicada como publicación internacional No. WO 96/34969 el 7 de noviembre de 1996 cuyas enseñanzas se incorporan aquí como referencia. Por ejemplo el promotor de alfa-fetoproteína podría usarse para reemplazar el promotor E4 endógeno y para lograr mayor selectividad en la replicación condicional. Otros factores tales como NF-IL6 pueden sustituir E1a para regular los promotores de respuesta E1a en el adenovirus en ausencia de E1a (Spergel, et al., (1992) J. Viroll 66:1021-1030) y esto puede evitarse mediante la sustitución del promotor E4 con un promotor específico de tumores. b. Represor de replicación viral Aunque puede usarse el promotor de respuesta a las vías para dirigir la replicación del virus en presencia de una vía funcional, alternativamente, puede usarse un promotor de respuesta a las vías para dirigir la expresión de un represor de replicación viral para el control de la expresión. El término "represor de replicación viral" se refiere a una proteína, si se expresa en una célula determinada, que reprime sustancialmente la replicación viral. Tal como podrán apreciar los expertos en la técnica, el represor de replicación viral dependerá de la naturaleza del vector adenoviral principal a partir del cual deriva el vector recombinante de la presente invención. Por ejemplo en el caso de vectores adenovirales y de otros tipos de virus de tumores de ADN, puede emplearse la construcción de fusión E2F-Rb descrita en la solicitud de patente europea No. 94108445.1 publicada el 6 de diciembre de 1995 (publicación No. 0 685 493 A1 ). La proteína de fusión E2F-Rb consiste en la adhesión del ADN y los dominios de heterodimerización de DP1 de la proteína del factor de transcripción E2F humana (aminoácidos 95-286 del tipo E2F) de tipo salvaje fusionados con el dominio de supresión de desarrollo Rb (aminoácidos 379-928 de la proteína Rb de tipo salvaje). La proteína de fusión E2F-Rb es un potente represor de la transcripción que depende de E2F y detiene las células en G1. El dominio de adhesión de ADN está situado en los aminoácidos 128-193 y el dominio de dimerización está situado en 194-289. La secuencia de la proteína E2F-1 humana está disponible en GenBank bajo el número de acceso M96577 depositada el 10 de agosto de 1992. Las secuencias de E2F de otros miembros de la familia de E2F del E2F de otras especies pueden emplearse cuando se construye un vector para ser usado en otras especies. En la situación en la cual el virus recombinante está basado en virus adenoasociado, la proteína REP y sus derivados configuran un represor eficaz de replicación viral en ausencia de la infección de adenovirus. En la situación en la cual el virus de un virus de herpes simplex, el ICPO-NX, una forma delecionada de la proteína precoz inmediata ICPO (Lium, et al. (1998) J. Virol. 72:7785-7795), la proteína puede usarse como represor eficaz de replicación viral. De manera similar, cualquier proteína con actividad negativa dominante puede usarse como represor de replicación viral. Estas modificaciones pueden combinarse con los promotores génicos reguladores del ciclo de las células descritos precedentemente. Por ejemplo, puede usarse un promotor que responde a la vía E2F para dirigir la expresión de la secuencia codificadora modificada E1a. Usando un promotor que responde a la vía p53 que dirige la expresión de la proteína de fusión E2F-Rb, se logra la represión tanto de la función E1 como de la función E2 debido a que la proteína de fusión E2F-Rb suprimirá ambos elementos de respuesta E2 y el E2F. En células tumorales deficientes en p53, el elemento de respuesta p53 es inactivo y el E2F-Rb no está expresado. Por consiguiente, la expresión E1a mejora debido a la presencia del E2F en la célula tumoral y la carencia de represión del promotor E2 permite que prosiga la replicación viral. 3. Promotores inducibles El término "promotor inducible" se refiere a promotores que facilitan la transcripción del transgen terapéutico preferiblemente (o únicamente) bajo ciertas condiciones y/o es respuestas a estímulos químicos externos u otros estímulos. Se conocen ejemplos de promotores inducibles en la literatura científica (véase, por ejemplo, Yoshida and Hamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230:426-430; lida, eí al.. (1996) J. Virol. 70(9):605459; Hwang, et al. (1997) J. Virol 71 (9):7128-7131 ; Lee, et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17(9):5097-5105; y Dreher, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(46); 29364-29371. Ejemplos de promotores inducibles por radiación incluyen aquellos inducidos por radiación ionizante tales como el promotor Egr-1 (descrito en Manóme eí al., (1998) terapia génica humana 9:1409-17; Takahashi, eí al. (1997) Human Gene Therapy 8:827-833; Joki, eí al. Human Gene Therapy (1995) 6:1507-1513; Boothman, eí al. (1994) volumen 138 páginas suplementarias S68-S71 ; y Ohno, T (1995) Tanpakushitsu Kakusan Koso 40:2624-2630), promotores inducibles por rayos X tales como los promotores XRE (descrito en Boothman, et al. (1994) Radiation Research 138 (Suppl.1):S68-S71), y promotores inducibles por rayos UV tales como los aislados a partir de Clostridium perfringens (Garnier and Colé (1988) Mol. Microbiol. 2:607-614.

B. Modificaciones alternativas para el qenoma viral 1. Deleción E1Bdl55k Tal como se ha indicado previamente la proteína E1b de 55 K se adhiere a p53. Por consiguiente, para mejorar el efecto del p53 introducido por el vector viral se prefiere introducir las descripciones de las mutaciones de E1Bd|55K para eliminar el enlace de p53 que se describe en Mccormick, patente norteamericana No. 5,677.178, concedida el 14 de octubre de 1997, las enseñanzas completas de la cual se incorporan aquí como referencia. En la práctica preferida de la invención ejemplificada aquí, el virus es un vector adenoviral recombinante que codifica p53 bajo el control del promotor MLP que contiene una deleción de los nucleótidos 2247-3272 del genoma adenoviral para eliminar la función de la proteína E1b de 55K. 2. Modificaciones E4: Adicionalmente, las modificaciones para aumentar la potencia de los vectores de la presente invención incluyen pero no están limitados a las alteraciones de E1b. Los vectores de la presente invención pueden modificarse para introducir mutaciones en E14 con el fin de incrementar la citotoxicidad (Muller, eí al. (1992) J. Virol. 66:5867-5878) o contienen sobrerregulación de las proteínas virales citopáticas tales como las proteínas E4orf4 o E3 11.6K. Por ejemplo, la región E4 del genoma de adenovirus ha estado implicada en la replicación viral de ADN, en la interrupción de la síntesis de la proteína huésped y en el ensamblaje viral. La E4orf6 es suficiente para la replicación del ADN y la síntesis de la proteína tardía en células inmortalizadas. Sin embargo, parece ser necesaria la E4orf6/7 para la replicación en células no divisibles. Por consiguiente, la eliminación de la E4orf6/7 ayuda a restringir la replicación del virus en células inmortalizadas (es decir, células tumorales) y puede incorporarse a los vectores de la presente invención. Además, las deleciones E4 han demostrado que reducen la inmunogenicidad de los vectores (Wang, eí al. (1997) Gene Therapy 4:393-400; Dediu, eí al. (1997) J. Virol 71 :4626-37), pero pueden afectar la persistencia de la expresión transgénica dependiendo de los marcos de lectura de E4 retenidos y del promotor usado para dirigir la expresión del transgen (Armentano, eí al.. (1997) J. Virol 71 :2408-2416). La región E4 codifica también una proteína (E4orf6) que es capaz de adherirse e inactivar la actividad de transcripción de p53 (Dubner, eí a.. (1996) Science 272. 1470-73). Por lo tanto puede ser conveniente modificar la región E4 para delecionar aquellos marcos de lectura abierta que tienen propiedades indeseables para la construcción del virus particular al mismo tiempo que retienen aquellos que tienen propiedades deseables. Por ejemplo, para el virus de replicación condicional aquí descrito como E1Bd155K-MLP-p53, puede delecionarse la región E4 orf6 para reducir la inactivación de p53 al mismo tiempo que se retiene E4orf3 para permitir una expresión continua de p53 y la replicación del virus. A fin de preservar la competencia de replicación del virus, debería retenerse E4orf6 o E4orf3. Ejemplos de otros vectores adenovirales delecionados E4 han sido descritos en Gregory, eí al., patente norteamericana No. 5.670.488 concedida el 23 de septiembre de 1997. 3. Deleciones E1 para lograr la replicación selectiva en células que se dividen rápidamente Con el fin de obtener una replicación de los adenovirus en células que se dividen rápidamente, el adenovirus pueden contener modificaciones para la secuencia codificadora E1a para producir los productos génicos E1a que son deficientes en la adhesión a uno o más miembros de la familia de p300 proteínas y una o más proteínas miembros de la familia de proteínas Rb pero que retienen la función transactivadora del dominio E1a CR3 y una deleción de los aminoácidos desde aproximadamente 219 hasta aproximadamente 289 de la proteína E1a 289R (o aproximadamente de los aminoácidos 173 hasta aproximadamente el aminoácido 243 de la proteína E1a 243R. En la práctica preferida de la invención la deleción de la adhesión a los miembros de la familia p300 se logra mediante la introducción de una deleción que corresponde a los aminoácidos 4-25 de las proteínas E1a 243R y 289R o los aminoácidos 38-60 de las proteínas E1a 243R y 289R. En la práctica de la invención, la deleción de la adhesión a los miembros de la familia pRb se logra con los aminoácidos 111-123 de las proteínas E1a 243R y 289R. Alternativamente, la deleción de la adhesión a los miembros de la familia pRb puede lograrse mediante la eliminación de los aminoácidos 124-127 de las proteínas E 1 a 243R y 289R. 4. Modificaciones E3 La región E3 del adenovirus codifica proteínas que ayuda a las células adenoviralmente infectadas a evitar la eliminación por el sistema de inmunidad (Wold, et al. (1995) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 199:237-274). La sobrerregulación de esta región y los subfragmentos de la misma han demostrado que evitan o que disminuyen la respuesta inmunitaria para las células viralmente infectadas, lo cual conduce a expresión génica de término más prolongado (lian, et al. (1997) PNAS 94:2587:2592, Bunder, et al. (1997) J. Virol 71 :7623-28). Por lo tanto las modificaciones en la región E3 (o subcomponentes de la misma) para sobreexpresar sus proteínas (por ejemplo, mediante la sobrerregulación de la región E3 usando un fuerte promotor constitutivo tal como CMV) puede ser convenientes para obtener un grado superior de replicación viral debido a su capacidad de evitar o demorar la depuración intermediada por inmunidad de las células infectadas.

B. Modificaciones de diana La presente invención provee virus recombinantes que contienen "modificaciones de diana" para lograr una diana preferencial del virus a un tipo de célula particular. El virus "modificación de diana" se refiere a las modificaciones del genoma viral diseñado para dar como resultado una infectividad preferencial de un tipo de célula particular. La especificidad del tipo de célula o la diana del tipo de célula puede lograrse también en vectores derivados de virus que tienen característicamente amplias infectividades tales como los adenovirus mediante la modificación de las proteínas de envoltura viral. Por ejemplo, la diana en las células se logró con adenovirus vectores mediante modificación selectiva de las secuencias codificadoras de fibra y botón para lograr la expresión de los dominios modificados de fibra y botón que tienen una interacción específica con receptores de superficies de células únicas. Ejemplos de dichas modificaciones se describen en Wickham, eí al. (1997) J. Virol 71 (11 ):8221-8229 (incorporación de péptidos RGD en proteínas de fibras adenovirales); Amberg, eí al. (1997) Virology 227:239-244 (modificación de genes de fibras adenovirales para lograr tropismo del ojo y del tracto genital); Harris y Lemoine (1996) TIG 12(10):400-405; Stevenson, eí al. (1997) J. Virol. 71(6):4782-4790, Michael, eí al. (1995) terapia génica 2:660-668 (incorporación del fragmento peptídico liberador de gastrina en proteínas de fibras de adenovirus); y Ohno, eí al. (1997) Nature Biotechnology 15:763-767 (incorporación del dominio de adhesión de la proteína A-lgG en el virus Sindbis). Otros métodos de diana específica de células se han logrado mediante la conjugación de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos para las proteínas de envoltura (véase, por ejemplo Michael, eí al. (1993) J. Biol. Chem. 268:6866-6869, Watkins, eí al. (1997) terapia génica 4:1004-1012; Douglas, eí al. (1996) Nature Biotechnology 14:1574-1578. Alternativamente, pueden conjugarse porciones particulares con la superficie viral para lograr hacer diana (véase por ejemplo Nilson, eí al. (1996) terapia génica 3:280-286(conjugación de EGF para proteínas retrovirales).

VI Resultados experimentales. A. Construcciones de Vectores: Se preparó el vector E1Bdl55K-MLP-p53 (FAMA) de acuerdo substancialmente con lo descrito aquí en el ejemplo 1. Resumiendo, se modificó el genoma de adenovirus mediante la introducción de una deleción de los pares de bases 2247 a 3272 del genoma de adenovirus de modo que a capacidad de la proteína 55K quedará incapacitada de adherirse a un inhibidor de la actividad transcripcional de p53. En sustitución de esta deleción se colocó una señal poliA de la proteína de adenovirus IX para E1 b19K cadena arriba de la deleción y el ADNc que codifica el promotor tardío principal Ad2 y la secuencia líder tripartita que dirige la expresión de p53 desde el plásmido pA/M/53 tal como se describe en Wills, eí al. (1994) Human Gene Therapy 5:1079-88. El resto de la secuencia del virus es el Ad5 de tipo salvaje.

B. Experimentos in vitro Se llevaron a cabo los siguientes experimentos para demostrar que el promotor tardío principal funcionaba de manera temporal para expresar p53 a partir de un virus replicante. Se llevaron a cabo experimentos en sustancial acuerdo con lo descrito aquí en el ejemplo 2 para evaluar la expresión a lo largo del tiempo de p53 en varias líneas de células tumolares. Los datos se presentan en la figura 1-4 de los dibujos que se acompañan. Los datos presentados demuestran la expresión temporal del vector cFAMA en una variedad de líneas de células tumolares con genotipos variables así como también los niveles de expresión incrementados en la relación a los virus deficientes de replicación que expresan p53 (ACN53). En un experimento, se comparó la expresión de p53 a partir del vector FAMA con un vector substancialmente similar en el cual p53 estaba ligado operativamente al promotor constitutivo CMV. El experimento se llevó a cabo substancialmente de acuerdo con lo que se describe aquí en el ejemplo 2c y los resultados se presentan en la figura 4 de los dibujos que se acompañan. Esto demuestra que el virus FAMA no se replica de manera temporal en la comparación con el virus FAIC que contiene CMV. En un experimento adicional que se llevó a cabo de acuerdo con el ejemplo 2d, se comparó la replicación viral de FAMA con un vector FAIC substancialmente similar en el cual se reemplazó el promotor tardío principal temporal mediante el promotor CMV constitutivo. Mediante la expresión de la proteína p53 del promotor MLP de manera temporal, se logró una superior replicación del virus en relación con un promotor constitutivo. Los resultados se presentan en la figura 5 de los dibujos que se acompañan.

C. Experimentos in vivo A fin de confirmar la eficacia de los vectores de la presente invención in vivo en un animal, se evaluaron los vectores de la presente invención en un modelo de cáncer de próstata humano de ratón. El modelo y los experimentos se efectuaron sustancialmente de acuerdo con las enseñanzas del presente ejemplo 3. Los datos se presentan en el siguiente cuadro I y en la figura 6 de los dibujos que se acompañan.

CUADRO I Volumen de tumor siguiendo la administración in vivo de FAMA 2 Control salino/tratado Tal como puede observarse por los datos que se presentan, los vectores de la presente invención demuestran eficacia antitumoral in vivo. Debe observarse que no solamente dejaron de desarrollarse los tumores, sino que también tuvieron una reducción de tamaño de modo que 5 de los 6 animales quedaron libres de tumores a los 27 días después de la administración. Esto es particularmente sorprendente a la luz de que el FTCB vector p53 no replicante en el cual p53 está también expresado desde el promotor CMV. Además, el efecto no se debe simplemente a la deleción E1b55k (representada por cZAZA) que mostró menor eficacia a los 27 días después de la administración.

Vil Formulaciones farmacéuticas La presente invención provee además una formulación farmacéuticamente aceptable de los adenovirus recombinantes en una combinación con un portador. Los vectores de la presente invención pueden formularse para una administración de dosis de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional con adición de portadores y excipientes. Las formulaciones de las dosis pueden incluir liberación intravenosa, intratumoral, intramuscular, intraperitoneal, tópica, de matriz o aerosol.

A. Portadores El término "portador" se refiere a compuestos comúnmente usados para la formulación de los compuestos farmacéuticos usados para mejorar la estabilidad, la esterilidad y la capacidad de liberación del compuesto terapéutico. Cuando se formula el virus en forma de una solución o suspención, el sistema de liberación está en un portador aceptable preferiblemente un portador acuoso. Pueden usarse una variedad de portadores acuosos, por ejemplo agua, agua de regulador de pH, 0.8% de solución salina, 0.3% de glicina, ácido hialurónico y similares. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas, o pueden filtrarse hasta esterilidad. Las soluciones acuosos resultantes pueden empaquetarse para ser usadas tal cual o pueden liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con una solución estéril antes de la administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiere para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como ajuste de pH y agentes reguladores, agentes reguladores de la tonicidad, agentes humectantes y similares por ejemplo acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de absorción, oleato de tritenolamina, etc.

B. Agentes meíoradores de liberación La presente invención provee además formulaciones farmacéuticas de los vectores de los adenovirus recombinantes de la presente invención con un portador y agentes mejoradores de liberación. Los términos "mejoradores de liberación" o "agentes mejoradores de liberación" se usan aquí intercambiablemente e incluyen uno o más agentes que facilitan la absorción del virus en la célula objetivo. Ejemplos de mejoradores de liberación son los que se describen en la solicitud de patente norteamericana copendiente No. presentada el 7 de julio de 1998. Ejemplos de dichos agentes mejoradores de liberación incluyen detergentes, alcoholes, glicoles, agentes tensioactivos, sales biliares, antagonistas de heparina, inhibidores de ciclooxigenasa, soluciones de sales hipertónicas y acetatos, Los alcoholes incluyen por ejemplo los alcoholes alifáticos, tales como etanol, N-propanol, isopropanol, alcohol butílico, alcohol acetílico. Los glicoles incluyen glicerina, propilenglicol, polietilenglicol y otros glicoles de bajo peso molecular tales como glicerol y tioglicerol. Los acetatos tales como ácido acético, ácido glucónico y acetato de sodio son ejemplos adicionales de los agentes mejoradores de liberación. Las soluciones de sales hipertónicas tales como NaCI 1 M constituyen también ejemplos de mejoradores de liberación. Ejemplos de agentes tensioactivos son dodeciisulfonato de sodio (SDS) y lisolecitina, polisorbato 80, nonilfenoxipolioxietileno, lisofosfatidilcolina, polietilenglicol 400, polisorbato 80, esteres de polixietileno, agentes tensioctivos de éter poliglicólico y DMSO. Pueden usarse sales biliares tales como taurocolato, tauro-desoxicolato de sodio, desoxicolato, quenodesoxicolato, ácido glicocólico, ácido glicoquenodesoxicólico y otros astringentes tales como nitrato de plata. Las aminacuatemarias del tipo antagonistas de heparina tales como sulfato de protamina también pueden usarse. Pueden usarse inhibidores de ciclooxigenasa tales como salicilato de sodio, ácido salicílico y fármacos antiinflamatorios esteroidales (NSAIDS) tales como indometacina, naproxeno, diclofenac. Los agentes mejoradores de la liberación incluyen los compuestos que tienen la formula I: O H X1— C— N— (CH2)m-N-(CH2)n— N— R C=0 I x2 en la cual n es un número de 2-8, X1 es un grupo de ácido cólico o un grupo desoxicólico, y X2 y X3 están cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en un grupo de ácido cólico, ácido desoxicólico, y un grupo sacárido. Por lo menos un grupo de X2 y X3 es un grupo sacárido. El grupo sacárido puede seleccionarse del grupo que consiste en grupos monosácaridos de pentosa, grupos monosácaridos de hexosa, grupos disacáridos de pentosa-pentosa, grupos disacáridos de hexosa-hexosa, grupos disácaridos de pentos-haexosas y grupos disácaridos de hexosa-pentosa. El término "detergente" incluye detergentes aniónicos, catiónicos, zwitteriónicos y no iónicos. Ejemplos de detergentes incluyen pero no están limitados a taurocolato, desoxicolato, taurodesoxicolato, cetilpiridio, cloruro de benalconio, detergente Zwittergent3-14, hidrato de (3-[(3-Colamidopropil)dimetilamonio]-1-propansulfonato) CHAPS, Big CHAP, Deoxi Big CHAP, detergente Triton-X-100, C12E8, Octil-B-D-Glucopiranosida, detergente PLURONIC-F8, detergente Tween 20, y detergente TWEEN 80 (CalBiochem Biochemicals). Pueden incluirse unidades de dosificación unitaria de la presente invención en un equipo de productos que contienen el adenovirus recombinante de la reivindicación 1 liofilizada y una solución para la reconstitución del producto liofilizado junto con instrucciones para su uso. Los adenovirus recombinantes dentro de la presente invención pueden liofilizarse por medios convencionales y reconstituirse. Otro ejemplo de un agente liberador de la liberación que puede emplearse en las formulaciones de la presente invención incluyen inhibidores de calpaina. El "inhibidor de calpaina" (abreviado "Cl") se refiere a un compuesto que inhibe la acción proteolítica de la calpaina-1 por ejemplo µ-calpaina. El término inhibidores de calpaina tal como se emplea aquí incluye aquellos compuestos que tienen actividades inhibidoras de calpaina I además de o independientemente de sus otras actividades biológicas. Una amplia variedad de compuestos han demostrado que tienen actividad para inhibir la acción proteolítica de las calpainas. Ejemplos de inhibidores de calpaina que son útiles en la práctica de la presente invención incluyen la N-acetil-leu-leu-norleucina que se conoce también como "inhibidor de calpaina 1". Inhibidores de calpaina adicionales son los que se describen en las siguientes patentes norteamericanas que se incorporan aquí como referencia, patente norteamericana No. 5,716,980 titulada Derivados de Alcohol o Aldehido y su uso; patente norteamericana No. 5,714,471 titulada Inhibidores de Péptidos y de Proteasa análoga de péptidos: patente norteamericana No. 5,693.617 titulada inhibidores de complejo proteolítico 26s y de la proteasoma 20s contenida en los mismos; patente norteamericana No. 5,691.368 titulada Calpaina de oxazolidina sustituida y/o inhibidores B de catepsina; patente norteamericana No. 5,679,680 titulada Hidrazidas. alfa-sustituidas que tienen actividad inhibidora de calpaina; patente norteamericana No. 5,663,294 titulada Análogos de péptidos inhibidores de calpaina, de la cadena pesada de quininogeno; patente norteamericana No. 5,661 ,150 titulada Fármaco para neuroprotección; patente norteamericana No. 5,658,906 titulada inhibidores de sisteina proteasa y de serina proteasa; patente norteamericana No. 5,654,146 titulada Homólogo de hielo humano; patente norteamericana No. 5,639,783 titulada Derivados de cetona; patente norteamericana No. 5,635,178 titulada Inhibición de la respuesta intermediada por complemento usando anticuerpos monoclonales específicos para un componente que forma el complejo C56-9 que inhibe la función activadora de plaquetas o células endoteliales de complejo C56-9; patente norteamericana No. 5,629,165 titulada Inhibidores de proteinasa neutra activados por calcio neural; patente norteamericana No. 5,622,981 titulada Uso de agonistas receptores metabotrópicos en enfermedades neurodegenerativas progresivas; patente norteamericana No. 5,622,967 titulada inhibidores de calpaina de quinolona carboxamida; patente norteamericana No. 5,621 ,101 titulada Inhibidores de proteína kinasa para el tratamiento de trastornos neurológicos; patente norteamericana No. 5,554,767 titulada Derivados de ácido alfa-mercaptoacrílico que tienen actividad inhibidora de calpaina; patente norteamericana No. 5,550,108 titulada Inhibición de la repuesta inflamatoria intermediada por completo; patente norteamericana No. 5,541 ,290, titulada Compuestos inhibidores de calpaina ópticamente puros, patente norteamericana No. 5,506,243 titulada Derivados de sulfonamida; patente norteamericana No. 5,498,728 titulada Derivados de L-triptofanal y su uso como medicamentos; patente norteamericana No. 5,498,616 titulada Inhibidores de cisteina-proteasa y serina-proteasa; patente norteamericana No.5,461 ,146 titulada Inhibidores de proteína kinasa seleccionados para el tratamiento de trastornos neurológicos; patente norteamericana No. 5,444,042 titulada Método de tratamiento de neurodegeneración con inhibidores de calpaina; patente norteamericana No. 5,424,325 titulada Derivados de aminocetona; patente norteamericana No. 5,422,359 titulada Derivados de alfa-aminocetona; patente norteamericana 5,416,117 titulada Derivados de ciclopropenona; patente norteamericana No. 5,395,958 titulada Derivados de ciclopropeno; patente norteamericana No. 5,340,922 titulada Inhibidores de proteinasa neutra activada por calcio neural; patente norteamericana No. 5,336,783 titulada Cistamidina A inhibidora de calpaina y su producción; patente norteamericana No. 5,328,909 titulada Derivados de ciclopropenona; y patente norteamericana No. 5,135,916 titulada Inhibición de la respuesta inflamatoria intermediada por completo. Los usos de inhibidores de calpaina en los protocolos de terapia génica han sido descritos adicionalmente en Atencio, eí al., solicitudes de patentes norteamericanas co- pendientes No. de serie. 09/172,685 y 60/104,321 presentadas el 15 de octubre de 1998. En la práctica preferida de la invención, el inhibidor de calpaina es N-acetil-leu-leu-resorcinol (inhibidor de calpaina - 1 ) comercialmente disponibles en Boehringer-Manheim (Indianapolis, IN).

I IX. Aplicaciones Terapéuticas: A. Aplicaciones anti-neoplásticas: La presente invención provee un método de eliminación de células neoplásticas en un organismo de mamífero mediante la administración de un vector viral recombinante de la presente invención en un célula neoplástica. El término "célula neoplástica" se refiere a una célula que exhibe un fenotipo de desarrollo aberrante caracterizado por su independencia de controles de desarrollo celular normales. Debido a que las células neoplásticas no son necesariamente replicantes en cualquier punto de tiempo determinado, el término células neoplásticas se refiere a células que pueden replicarse activamente o en un estado de reposo no replicante (G1 o GO). Las poblaciones localizadas de células neoplásticas se denominan neoplasmas. Los neoplasmas pueden ser malignos o benignos. Los neoplasmas malignos se denominan también cánceres. El término cáncer se usa intercambiablemente aquí con el término tumor. Transformación neoplástica se refiere a la conversión de una célula normal en una célula neoplástica, a menudo una célula tumoral. El término "organismo de mamíferos" incluye pero no está limitado a seres humanos, cerdos, caballos, ganado, perros, gatos.

La presente invención provee un método de ablación de células neoplásticas en un organismo de mamífero in vivo mediante la administración de una formulación farmacéuticamente aceptable del adenovirus recombinante descrito más arriba. El término "ablación" se refiere a la reducción sustancial de la población de células neoplásticas viables de manera de aliviar los malestares fisiológicos causados por la presente de células neoplásticas. El término "sustancial" significa una reducción de la población de células neoplásticas viables en el organismo de mamíferos en más de aproximadamente 20% de la población de pretratamiento. El término "viable" se refiere a que tiene un desarrollo descontrolado y las características reguladoras del ciclo celular de una célula neoplástica. El término "célula neoplástica viable" se usa aquí para distinguir dichas células neopásticas que no son ya capaces de replicación. Por ejemplo, una masa tumoral puede permanecer después del tratamiento, pero, sin embargo, la población de células que comprenden la masa tumoral puede estar muerta. Estas células muertas han sido sometidas a ablación y carecen de capacidad para replicarse, incluso a pesar de que pueda permanecer cierta masa tumoral. En la práctica preferida de la invención ejemplificada aquí, un adenovirus recombinante que contiene una deleción de la función génica E1B-55K y que expresa un gen supresor de tumores de promotor tardío principal adenoviral, se formula con un portador farmacéuticamente aceptable para la administración por inyección intravenosa, intraperitoneal o intratumoral. La dosis apropiada y el método de administración del vector que se debe administrar al organismo de mamífero que necesita el tratamiento será determinada por un experto en la técnica el cual tendrá en cuenta el grado de metástasis del tumor primario, lo(s) mejorador(es) de liberación incluidos en la formulación, el grado hasta el cual se suprime la respuesta ¡nmunológica, etc. Cada uno de estos últimos factores disminuirá la dosificación del vector provisto para el organismo de mamífero que necesita tratamiento. En la práctica preferida de la invención, se administrará al organismo de mamífero una dosis de aproximadamente 1 x 105 a 1 x 1013 partículas, (preferiblemente 1 x 106 a 1 x1011 partículas, más preferiblemente 1 x 107 a 1 x 1010 partículas) en una o más dosis del régimen de tratamiento. El curso de tratamiento típico consistirá en la administración diaria de una formulación farmacéuticamente aceptable del vector de la presente invención por un período de tres a diez días, preferiblemente cinco a ocho días. En una modalidad preferida, el gen supresor de tumores es el gen p53 de tipo salvaje. En otra modalidad preferida, el gen supresor de tumores codificador es una proteína de fusión VP22-p53. En otra práctica preferida de la invención, el portador farmacéuticamente aceptable contiene un agente mejorador de la liberación. En otra práctica preferida adicional de la invención, el agente mejorador de liberación es un inhibidor de calpaina. En la práctica más preferida de la invención ejemplificada aquí, el vector adenoviral recombinante E1 B-d155K-MLP-p53 está formulado en una solución portadora que comprende además el inhibidor de calpaina n-acetil-leu-leu-norcinal (inhibidor de calpaina) en una concentración desde aproximadamente 1 a 50 micromoles. En tales casos, la dosis diaria puede reducirse en comparación con una formulación de la que están ausentes dichos mejoradores de liberación, en un factor de uno a dos logaritmos. Preferiblemente se emplea un vector adenoviral endógeno para el tipo de mamífero que se está tratando. Aunque generalmente es favorable emplear un virus de la especie que debe ser tratada, en algunos casos puede resultar ventajoso usar vectores derivados de diferentes especies que poseen favorables características patogénicas. Por ejemplo, se informó (WO 97/0682 publicada el 10 de abril de 1997) que los vectores adenovirales ovinos pueden usarse en terapia génica humana para minimizar la característica de respuesta inmunitaria de los vectores adenovirales humanos. Al minimizar la respuesta inmunitaria, se evita una rápida eliminación del vector, lo cual da como resultado una duración más prolongada de la acción del vector. Aunque la presente invención provee un método de uso de los adenovirus recombinantes solos, los adenovirus recombinantes de la presente invención y las formulaciones de los mismos pueden emplearse en combinación con agentes quimioterapéuticos o regímenes de tratamiento convencionales. Ejemplos de dichos agentes quimioterapéuticos incluyen inhibidores de la síntesis de purina (por ejemplo, pentostatina, 6-mercaptopurina, metotrexato de 6- tioguanina) o síntesis de pirimidina (por ejemplo, Pala, azarbina), la conversión de ribonucleótidos a desoxiribonucleótidos (por ejemplo, hidroxiurea), inhibidores de la síntesis de dTMP (5-fluoruracilo), agentes que perjudican el ADN (por ejemplo, radiación, bleomicinas, etoposida, teniposida, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, mitoxantrona, agentes alquilantes, mitomicina, cisplatina, procarbacina) así como también inhibidores de la función microtubular (por ejemplo, alcaloides vinca y colquicina) y los inhibidores de transferasa de la proteína farnesilo. Regímenes de tratamiento quimioterapéutico se refiere principalmente a procedimientos no químicos, diseñados para la ablación de células neoplásticas, tal como terapia de radiación. En dichos casos, la dosis diaria en el curso del tratamiento se reduce en comparación con aquellas dosis provistas con ausencia de dichos agentes quimioterapéuticos. Se ha observado que, el sistema inmunitario es capaz de reconocer y eliminar los vectores virales recombinantes. Debido a que esto reducirá efectivamente la cantidad de adenovirus que llegan a la célula objetivo, se prefiere en muchos casos administrar los compuestos de la presente invención en combinación con agentes inmunosupresores tales como etoposida. En la práctica preferida de la invención, el agente inmunosupresor se administra previamente, preferiblemente durante aproximadamente una semana antes de la introducción del vector viral recombinante de la presente invención para eliminar la respuesta humoral inmune para las partículas virales. En la práctica preferida de la invención, una formulación farmacéuticamente aceptable del vector de la presente invención se administra por vía intratumoral después de la administración de un agente inmunosupresor por un período desde aproximadamente un día hasta aproximadamente dos semanas antes de la administración del vector. El vector es preferiblemente un vector adenoviral y contiene además una deleción de la proteína E1B-55K y contiene un cassette de expresión que expresa el gen supresor del tumor p53 de un promotor principal tardío. En la práctica preferida de la invención, el agente inmunosupresor es etoposida y se administra diariamente durante un período desde aproximadamente 1 a 7 días (preferiblemente 3-7 días) antes de la administración del vector. En tales casos, la dosis diaria en el curso, de tratamiento se reduce en comparación con aquellas dosis de las cuales están ausentes dichos agentes inmunosupresores. La presente invención provee también un método de ablación de células neoplásticas en una población de células normales contaminadas por dichas células neoplásticas ex vivo mediante la administración de un adenovirus recombinante de la presente invención a dicha población. Un ejemplo de la aplicación de dicho método es empleado actualmente en aplicaciones ex vivo tal como la purga de productos de células de origen de estirpe conocidos. El término "producto de célula de origen de estirpe" se refiere a una población de células hematopoyéticas, progenitoras y de estirpe que son capaces de reconstituir la función hematopoyética a largo término en un paciente que ha recibido terapia mioablativa. Los productos de células de origen de estirpe se obtienen convencionalmente por aféresis de sangre periférica movilizada o no movilizada. La aféresis se logra convencionalmente a través del uso de procedimientos conocidos usando aparatos de aféresis comercialmente disponibles tales como COBE Spectra Apheresis System, comercialmente disponibles en COBE International, 1185 Oak Street, Lakewood, CO. Se prefiere que las condiciones de tratamiento se optimicen para lograr "una purga de 3 logaritmos" (es decir, la remoción de aproximadamente 99.9% de las células tumorales del producto de las células de origen de linaje) y más preferiblemente una "purga de 5 logaritmos" (remoción de aproximadamente 99.999% de las células tumorales del producto de las células de origen de linaje). En la práctica preferida de la invención, un producto de células de origen de linaje de un volumen de 100 ml se trataría en una concentración de aproximadamente 1 x 106 a 1 x 1010 partículas/ml del adenovirus recombinante de la presente invención durante un período de aproximadamente 4 horas a 37°C.

B. Reclutamiento de Células Dendríticas: La presente invención provee vectores virales recombinantes que son capaces de reclutar células dendríticas inmaduras en el sitio de tumor y exponer las células dendríticas a una alta concentración localizada de antígenos tumorales característicos del tumor que están presentes en el paciente. Los vectores de la presente invención están específicamente manipulados para inducir la muerte de las células tumorales. La célula del tumor lisado (o los cuerpos apoptóticos producidos por una célula tumoral sometida a apoptosis) provee una rica concentración localizada de proteínas específicas de tumores. Mediante la introducción de un gen que codifica un quimioatractor de células dendríticas, se reclutan células dendríticas inmaduras capaces de absorber los antígenos tumorales en el sitio de las células tumorales usadas absorbiendo de este modo los antígenos tumorales y presentando estos antígenos para el sistema inmunitario. El término "quimioatractores de células dendríticas" hace referencia a quimioquinas quimiotácticas que son capaces de atraer y/o dirigir la migración de células dendriticas a un lugar particular. Se ha demostrado que ciertas quimioquinas, fMLP (que son representativas de los formil péptidos de origen bacteriano), C5a y la proteína quimotáctica monocítica de C-C quimioquinas (MCP)-3, proteína inflamatoria de macrófagos (MIP)-1 alfa/LD78, y RANTES, han estado involucradas en el reclutamiento y en la migración quimiotáctica de células dentríticas. Sozzani, et al. (1995) J. Immunol. 1995 155 (7): 3292-5. Xu eí al. sugieren que todas las quimioquinas C-C incluyendo MCP-1 , MCP-2, MCP-3, MIP1 alfa, MIP-1 beta, y RANTES, indujeron la migración de células enriquecidas con DC cultivadas con o sin IL-4, XU, eí a/.(1996) J. Leukoc. Biol. 60 (3): 365-71. Greaves et al. (1997) J. Exp. Med. 186 (6):837-44, indican que la MIP-3-alfa interactúa específicamente con el receptor de CC quimioquina expresado en células dendríticas capaces de dirigir la migración de las células dendríticas. En la práctica preferida de la invención, el quimioatractor de células dendríticas es MIP-3-alfa. El quimioatractor de células dendríticas pueden expresarse en forma intracelular cuando.se libera por lisis de células o en forma secretada mediante el uso de un péptido de señal. Mediante la expresión del quimioatractor de células dendríticas, las células dendríticas absorben luego los cuerpos apoptóticos o antígenos tumorales, maduran y migran a través de las vías existentes hasta la linfa y presentan los antígenos tumorales a las células T. Las células T resultantes son luego capaces de reconocer y matar las células tumorales. El régimen de dosificación apropiada en tales casos está de acuerdo con el régimen y la formación de las dosis anti-neoplástica típica descritos más arriba.

IX. Aplicaciones para diagnóstico Además de las aplicaciones terapéuticas descritas más arriba, los vectores de la presente invención son también útiles para propósitos de diagnóstico. Por ejemplo, los vectores de la presente invención pueden incorporar un gen informante en lugar del gen terapéutico que se expresa por replicación viral. El término "gen informante" se refiere a un gen cuyo producto es capaz de producir una señal detectable sola o en combinación con elementos adicionales. Entre los ejemplos de genes informantes se incluyen el gen de beta-galactosidasa, el gen de luciferasa, el gen de proteína fluorescente verde, secuencias nucelotídicas que codifican proteínas que son detectables por sistemas de formación de imágenes tales como sistemas de formación de imágenes por rayos X o campo magnético (MRl). Alternativamente, dichos vectores pueden emplearse también para expresar una proteína de superficie de células que es capaz de reconocimiento mediante una molécula de adhesión tal como un anticuerpo fluorescentemente rotulado. Ejemplos de aplicaciones in vivo ¡ncluyen aplicaciones de imágenes tales como por rayos X, escaneo CT o formación de imágenes por resonancia magnética (MRl).

X. Método de preparación de las composiciones La presente invención provee además un método de producción de un adenovirus recombinante que comprende las modificaciones de empaquetar los dominios descritos precedentemente, comprendiendo dicho método las etapas de: a. infectar la célula productora con un virus recombinante; b. cultivar dicha célula productora infectada bajo condiciones que permiten la replicación del genoma viral en la célula productora; c. cosechar las células productoras, y d. purificar el adenovirus recombinante. El término "infectar" significa exponer el adenovirus recombinante a la célula productora bajo condiciones que facilitan la infección de la célula productora con el virus recombinante. En las células que han sido infectadas por copias múltiples de un virus determinado, las actividades necesarias para la replicación viral y el empaquetamiento de viriones son cooperativas. Por lo tanto, se prefiere ajustar las condiciones de manera que exista una significativa probabilidad de que las células productoras estén múltiplemente infectadas con el virus. Un ejemplo de una condición que mejora la producción del virus en la célula productora consiste en un incremento de la concentración de virus en la fase de infección. Sin embargo, es posible que la cantidad total de infecciones virales por célula productora pueda estar superado, lo cual da como resultado efectos tóxicos para la célula. Por consiguiente, sería necesario trabajar para mantener las infecciones en una concentración de virus dentro de la escala de 106 hasta 1010, preferiblmente aproximadamente 109 viriones por ml. También pueden emplearse agentes químicos para aumentar la infectividad de la línea de células productoras. Por ejemplo, ia presente invención provee un método para incrementar la infectivídad de las líneas de células productoras para infectividad viral mediante la inclusión de un inhibidor de calpaina. Ejemplos de inhibidores de calpaina que son útiles en la práctica de la presente invención incluyen el inhibidor de calpaina 1 (conocido también como N-acetil-leuci-leucil-norleucinal, comercialmente disponible de Boehringer Mannheim). El término "célula productora" significa una célula capaz de facilitar la replicación del genoma viral de adenovirus recombinante que debe producirse y que es capaz de completar los defectos de empaquetamiento del adenovirus recombinante. Se encuentran a disposición del público una variedad de líneas de células de mamífero para el cultivo de adenovirus recombinantes. Por ejemplo, la línea de células 293 (Graham y Smiley (1997) J. Gen. Virol, 36:59-72) ha sido manipulada para complementar las deficiencias en la función E1 y es una línea de célula preferida para la producción de los vectores corrientes. De manera similar, pueden desarrollase líneas de células que incorporan secuencias virales establemente integradas en el genoma viral. Por ejemplo, Cunningham and Davidson ((1997, Vol. 197:116-124) han demostrado que pueden usarse cósmidos superpuestos para complementar las funciones virales delecionadas para los vectores virales de herpes. Puede emplearse una realización similar para complementar elementos adenovirales y otros elementos virales. Pueden incluirse genes adicionales tales como aquellos que codifican la resistencia a los fármacos, para permitir la selección o rastreo para verificar la presencia del vector complementario recombinante. Dichos genes adicionales pueden incluir, por ejemplo, genes que codifican la resistencia a la neomicina, resistencia a los multifármacos, timidina kinasa, beta-galactosidasa, dihidrofolato reductasa (DHFR) y cloramfenicol acetil transferasa. Ejemplos de otras células productoras de líneas de células progenitoras que pueden emplearse incluyen células HeLa, células PERC 6 (tal como las descritas en la publicación WO/97/00326, solicitud No. de serie PCT/NL96/00244) y la línea de células A549-E1 (descrita en la solicitud internacional de patente No. PCT/US97/810039 publicada el 23 de febrero de 1998 como publicación internacional No. W098/US3473. El término "cultivar bajo condiciones que permiten la replicación del genoma viral "significa mantener las condiciones para la célula productora infectada con el fin de permitir que el virus se propague en la célula productora. Es conveniente controlar las condiciones para maximizar la cantidad de partículas virales producidas por cada célula. Por consiguiente, será necesario monitorear y controlar las condiciones de reacción tales como la temperatura, el oxígeno disuelto, el pH etc. Los biorreactores comercíalmente disponibles tales como CelliGen Plus Bioreactor (disponible comercialmente en New Brunswick Scientific, Inc. 44 Talmadge Road, Edison, NJ) tienen condiciones para controlar y mantener dichos parámetros. La optimización de las condiciones de infección y cultivo variarán en cierto modo, pero sin embargo, las condiciones para una eficiente replicación y producción de los virus puede ser lograda por los expertos en la técnica teniendo en cuenta las propiedades conocidas de la línea de células productoras, las propiedades de virus, el tipo de biorreactor, etc. Cuando se emplean 293 células como líneas de células productoras, la concentración de oxígeno se mantiene preferiblemente desde aproximadamente 50% hasta aproximadamente 120% de oxígeno disuelto, preferiblemente 100% de oxígeno disuelto. Cuando la concentración de partículas vírales (determinada por métodos convencionales tales como CLAR usando una columna Resource Q) comienza a estabilizarse, se cosecha el reactor. El término "cosechar" significa la recolección de las células que contienen el adenovirus recombinante a partir del medio. Esto puede lograrse mediante métodos convencionales tales como centrifugación diferencial o medios cromatográficos. En esta etapa, las células cosechadas pueden almacenarse o pueden procesarse adicionalmente mediante lisis y purificación para aislar el virus recombinante. Para el almacenamiento, las células cosechadas deberían tener un pH regulado en o aproximadamente a pH fisiológico y congelarse a -70°C. El término "lisis" se refiere a la ruptura de las células productoras. La lisis puede efectuarse por una variedad de medios bien conocidos en la técnica. Cuando se desea aislar las partículas virales de las células productoras, las células son usadas, usando una variedad de medios que son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse células de mamífero bajo condiciones de baja presión (100-200 psi de presión diferencial) o por métodos convencionales de congelación descongelación. Se extrae el ADN/ARN exógeno libre por degradación con ADNse/ARNse. El término "purificar" significa el aislamiento de una población sustancialmente pura de partículas de virus recombinantes a partir de las células productoras usadas. Pueden emplearse técnicas de purificación convencionales tales como métodos de centrifugación de gradiente de densidad diferencial o cromatográfica. En la práctica preferida de la invención, el virus se purifica por cromatografía en columna en sustancial acuerdo con el procedimiento de Huyghe eí al. (1995) Human Gene Therapy: 6 1403-1416 tal como se describe en la solicitud de patente norteamericana co-pendiente No. de serie 08/400.793, presentada el 7 de marzo de 1995. Métodos adicionales y procedimientos para optimizar la producción de los adenovirus recombinantes de la presente invención se describen en la solicitud de patente norteamericana co-pendiente No. de serie 09/073.076, presentada el 4 de mayo de 1998. El virus purificado se mezcla luego con excipientes y portadores apropiados o con agentes mejoradores de liberación. La solución se esteriliza para empaquetamiento individual y se embotella para ser almacenada. Alternativamente, el virus puede ser liofilizado para almacenamiento y puede ser reconstituido en una solución que contiene agente mejoradores de liberación, reguladores de pH, conservadores, crioprotectores y/o portadores. El virus liofilizado y la solución para reconstitución puede envasarse conjuntamente como un equipo para consumo para el usuario final junto con instrucciones para una manipulación y administración apropiadas.

EJEMPLOS Los expertos en la técnica a la cual pertenece esta invención comprenderán claramente que la presente invención puede estar abarcada en formas distintas de las que se describen más adelante específicamente, sin apartarse del espíritu o características esenciales de la invención. Las modalidades particulares de la invención que se describirán más adelante, se considerarán por consiguiente ilustrativas y no restrictivas. El alcance de la presente invención es tal como se establece en las reivindicaciones anexas en vez de limitarlo a los ejemplos que se proveen a continuación.

EJEMPLO 1 Construcción de E1Bdl55K-MLP-p53 (cFAMA) El adenovirus E1 B55K-MLP-p53 (cFAMA) se preparó usando la técnica de mutagénesis dirigida al sitio oligonucleotídico de Deng y Nickolofff (1992) Anal. Biochem 200, 81-88. Todos los reactivos, cepas bacterianas y vectores usados para la mutagénesis fueron provistos en el equipo de mutagénesis "Transformer Site-Directed" (comercialmente disponible en Clontech, Palo Alto, CA). La región Ad5 que contiene la secuencia que debe ser mutada, fue insertada en el plásmido de Clontech pEGFP-1 y se denominó pXB-E1 B. Se diseñaron dos cebadores para acoplarlos a: (1 ) secuencia Ad5 2236 a 2260 y modificar G2247 a timidina y T2248 a citosina y (2) secuencia Ad5 y 3255 a 3284 y modificar T3272 a citosina. Se diseñó un tercer cebador para eliminar el sitio Hindlll dentro de la secuencia del vector original, y para proveer un método para la selección. Para la reacción de mutagénesis, los oligonucleótidos mutagénicos fueron en primer lugar fosforilados en el extremo 5', y luego se acoplaron para desnaturalizar el ADN molde pXB-E1 B. Las reacciones de cebador acoplado/molde se incubaron con polimerasa de ADN T4, ligasa de ADN T4 y desoxirribonucleótidos (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) para sintetizar un filamento mutante complementario. La reacción de síntesis de filamento complementario fue luego transformada en la cepa bacteriana BMH 71-18 mutS. Esta cepa bacteriana es defectuosa para la reparación del mal- apareamiento, lo cual evita una reparación indeseable del filamento mutante. Los transformantes fueron digeridos con Hindlll para cortar cualquier filamento plásmido progenitor, y se retransformaron en DH5a para la amplificación. Luego se rastrearon potenciales mutantes E1 B mediante análisis de enzima de restricción para confirmar las mutaciones deseadas. Este procedimiento se usó para introducir sitios de disociación de la enzima de restricción nucleasa en la región codificadora E1B 55K. El primer sitio fue introducido modificando las posiciones 2247 y 2248 del genoma Ad5 de tipo salvaje en el cual la guanina 2247 fue reemplazada con una timidina y la timidina 2248 fue reemplazada con citosina (respectivamente) para introducir el sitio de disociación EcoRl . Esto da como resultado una modificación de la secuencia codificadora E1 B en la posición 77 de valina a serina. Se introdujo un segundo sitio de restricción en la posición 3272 donde la timídina 3272 fue reemplazada con el sitio citosina (mutación silente) para ser introducida como sitio Xhol . Los nuevos sitios de enzima de restricción fueron usados en un digesto de enzima de restricción con EcoRI y Xhol . Se extrajo un cassette que contenía la secuencia codificadora p53, bajo el control del adenovirus Major Late Promoter y la secuencia líder tripartida, fue extraída con EcoR1 y digestión parcial de Xhol del plásmido, pAd-MLP-p53. Este plásmido se basa en el derivado de pBR322, pML2 (pBR322 delecionado para los pares de base 2240-2490) y contiene secuencias de tipo 5 de adenovirus que se extienden desde el par de base 1 hasta 5788 excepto que está delecionada para los pares de base 357-3327 para adenovirus de tipo 5. En este sitio la deleción Ad5 357-3327 se inserta una unidad de transcripción que está constituida por el promotor tardío principal de adenovirus de tipo 2, el ADN líder tripartito de adenovirus de tipo 2 y el ADN p53 humano. Este fragmento EcoRI/Xho1 se inserta en los sitios EcoR1 y Xhol introducidos en la región codificadora E1B55k. La secuencia poli A que sigue wtAd5 plX fue amplificada mediante PCR (secuencia Ad5 4001-4368). Los cebadores usados para la amplificación incluyeron secuencias para introducir un sitio EcoR1 en el extremo 5' de la secuencia Ad5, y un sitio Sacll en el extremo 3' de la secuencia Ad5. Este fragmento fue luego insertado en los sitios EcoR1- Sacll inmediatamente a continuación de la secuencia codificada EIB19k. El sito Sacll fue incluido en el cassette MLP-p53 insertado previamente, y lo fue cadena arriba de la secuencia promotora MLP. La mutación E1 B resultante da como resultado una secuencia codificadora de los primeros 76 amino ácidos de la proteína E1B55K seguida de 11 amino ácidos de malsentido que dan como resultado una proteína E1B no funcional delecionada. La construcción del adenovirus E1Bdj55K-MLP-p53 se llevó a cabo usando recombinación homologa en la región E1 del adenovirus que contenía la línea de células 293 mediante el método de McGory eí al. (1988) Virology 163, 614-617. Este método requiere dos fragmentos de ADN, uno de plásmido de transferencia que contiene el cassette delecionado E1 B55K/MLP-p53 y el otro ADN viral Ad5 que contenía el' genoma wtAdd ("fragmento grande Ad5") de Ad5pb918 hasta el ITR 3' (pb 35935). El plásmido de transferencia usado, pXC-E1 B55-2A, contiene las secuencias wtAd5 desde 22-2246. Para la recombinación con el fin de producir adenovirus cFAMA, el fragmento viral grande y pXC1-E1 B53-2A fueron cotransfectados en 293 células mediante transfección intermediada con fosfato de calcio. Después de 5 horas se enjuagó el precipitado de las células y se reemplazó con medio normal. A los 15 días después de la transfección ¡nicial, se aislaron los "cometas" virales, se purificaron en placa dos veces, y subsiguientemente se rastreó el ADN viral usando análisis de enzima de restricción y secuenciamiento de ADN. Se purificaron las cargas virales mediante gradientes de cloruro de cesio dobles y se cuantificaron mediante cromatografía en columna tal como fue descrito por Huyghe, eí al. (1995) Human Gene Therapy 6:1403-1416.

EJEMPLO 2 Evaluación in vitro de E1 Bdl55K-MLP-p53 (FAMA) Ejemplo 2.a. Expresión p53 en células MRC9 Se evaluaron niveles de expresión p53 de dos construcciones virales diferentes (E1 BdJ55K-MLP-p53 (c FAMA) y ACN53 (Wills et al. (1994) Human Gene Therapy, supra)) en MRC9. Se sembraron seis placas de receptáculos con 6 x 105 células RC9 por receptáculo. La infección se llevó a cabo durante un pulso de una hora en un volumen de 250 microlitros en dos concentraciones diferentes de 1.8 x 108 partículas/ml y 1.8 x 109 partículas/ml.

Las células fueron cosechadas y se probaron usando un equipo BioRad Catálogo Número 500-0006 sustancialmente de acuerdo con las instrucciones provistas por el fabricante. Las células fueron cosechadas por raspaje a las 24, 48 y 72 horas según lo indicado. Las células fueron resuspendidas en regulador de pH de lisis (50 mM de Tris, 250 mM de NaCI 0.1 % de NP49, 50 mM de NaF, 5 mM de EDTA) y se usaron mediante método de congelación descongelación (repetido tres veces). Las células fueron coloreadas con el concentrado reactivo colorante BioRad provisto con el equipo y la absorbancia se determinó a una longitud de onda de 595 nm. El anticuerpo primario era un anticuerpo anti-p53 de murinos (comercialmente disponible en Novacastra como catálogo número 801 diluido a 1 :1000). El anticuerpo secundario era HRP de cabra-anti-Ratón (comercialmente disponible en Amersham como catálogo número NA931). Los datos se presentan en la figura 1 de los dibujos anexos. Tal como puede observarse por los datos presentados, la construcción MLP-p53 competente de replicación dio como resultado una expresión en el tiempo posterior a la del virus deficiente de replicación CMV-p53 (ACN53).

Ejemplo 2.b. Células SK-HEP1 de expresión p53 Esta evaluación se llevó a cabo sustancialmente de acuerdo con la descripción del ejemplo 2.a. anterior, excepto que el experimento se efectuó con células de carcinoma hepatocelular SK-HEP1 y la placa de seis receptáculos fue sembrada con 7.5 x 105 células por receptáculo. Los resultados se presentan en la figura 2 de los dibujos anexos.

Ejemplo 2.c. Células NC1 H358 de expresión p53 Esta evaluación se llevó a cabo sustancíalmente de acuerdo con la descripción del ejemplo 2.a. anterior, excepto que el experimento se llevó a cabo en células NCI H358, y excepto que la placa de seis receptáculos fue sembrada con 1.5 x 105 células por receptáculo. Las células fueron infectadas tal como en el ejemplo 2.a. anterior usando una concentración de 1.8 x 109 partículas/ml de los virus indicados para la figura 3 y 1.8 x 108 para la figura 4. Los resultados se presentan en la figura 3 y 4 de los dibujos anexos.

Ejemplo 2.d Replicación viral en el curso del tiempo Se infectaron células SK-BR3 con un pulso de una hora con los siguientes vectores adenovirales recombinantes a una concentración de 1.8 x 109 partículas/ml: 1. Mock: Células no infectadas. 2. rAdcon: Un adenovirus recombinante que carece de E1 y la función de la proteína IX sin una secuencia codificadora p53 (Wills, eí al.). 3. E1Bdl55K: Un adenovirus recombinante que contiene la deleción E1B-55K descrita en el ejemplo 1 anterior sin ningún cassette transgénico exógeno. 4. 55K/MLPp53: El adenovirus recombinante cFAMA preparado sustancialmente de acuerdo con lo descrito en el ejemplo 1 anterior. . rAd-p53: ACN53 (Wills, et al.). 6. 55K/CMVp53: Un adenovirus recombinante cFAIC que contiene la deleción E1B-55K descrita anteriormente que comprende además un cassette de expresión que codifica p53 bajo el control del promotor CMV. 7. AddWT: Adenovirus de tipo salvaje 5. Las células fueron cosechadas aproximadamente a las 48 horas después de la infección. El ADN se aplicó a gel de agarosa y se tiñó con bromuro de etidio de acuerdo con técnicas bien conocidas en la técnica. Los resultados se presentan en la figura 5 de los dibujos anexos.

EJEMPLO 3 Demostración de la eficacia terapéutica in vivo Se inyectaron células PC-3 subQ (carcinoma de próstata, p53 nulo) en flancos de ratones desnudos. Cuando los tumores fueron palpables (a los 11 días), se inyectaron intratumoralmente virus durante 5 días consecutivos a razón de una dosis de 1 x 1010 partículas por inyección desde los días 11-15 después de la inyección de células PC-3. Se compararon las seis diferentes construcciones virales cFAMA, cFAIC, FTCB, ZZCB, cZAZA y Ad5 de tipo salvaje (descrito en el ejemplo 2 anterior). V-PBS se refiere a solución salina regulada con fosfato, 3% de sucrosa y 2 mm de cloruro de magnesio. Se evaluó el volumen de los tumores los días 1 , 4, 7, 11 , 15, 19, 23 y 27. Los resultados de las evaluaciones se presentan en la figura 5 de los dibujos que se acompañan y que se presentan en el cuadro 1 anterior.

EJEMPLO 4 Construcción de E1Bdl55K-MLP-Citosina Desaminasa El vector E1 Bd]55K-MLP-Citosina Desaminasa se preparó sustancialmente de acuerdo con lo descrito aquí en el ejemplo 1. Sin embargo el plásmido de transferencia que contenía la secuencia codificada p53 se reemplazó con una secuencia de ADN que codifica el gen de citosina desaminasa.

EJEMPLO 5 Construcción de AFP-E4-E1Bdl55K-MLP-p53 El AFP-E4-E1 Bdl55K-MLP-p53 es un adenovirus recombinante que es similar al vector E1Bdl55K-MPL-p53 se prepara sustancialmente de acuerdo con lo descrito aquí en el ejemplo 1. Sin embargo, en esta construcción el gen E4 está ligado operativamente a la secuencia de promotor específico de tumor de alfa-fetoproteína (AFP) lo cual facilita la replicación de este virus en células de carcinoma hepatocelular. Otros factores tales como NF-IL6 pueden sustituir E1a en la regulación de los promotores que responden a E1a en el adenovirus en ausencia de la función E1a (Spergel, eí el (1992) J. Viroll 66:1021-1030) y esto puede evitarse mediante la sustitución del promotor E4 con un promotor específico de tumores.

EJEMPLO 6 Construcción de AFP-E4-E1Bdl55K-MLP-IFN2a El AFP-E4-E1Bdl55K-MLP-IFN2a describe un adenovirus recombinante que es similar al vector AFP-E4-E1BdJ55K-MLP-p53 se prepara sustancialmente de acuerdo con lo descrito aquí en el ejemplo 5. Sin embargo en esta construcción el gen p53 es reemplazado con la secuencia ADN que codifica el interferon alfa-2b.

EJEMPLO 7 Construcción de E1Adl01/07-E1Bdl55K-MLP-p53 El Adl01/07-E1 Bd]55K-MLP-p53 es un adenovirus recombinante sustancialmente similar al vector E1 BdJ55K-MLP-p53 que se prepara sustancialmente de acuerdo con lo descrito aquí en el ejemplo 1. Sin embargo, en este virus el gen E1a está modificado para contener las mutaciones de deleción en-marco d|1101 a di 1107, descrita en Jelsma eí al., (1998) Virology 163 494-502 y se construyeron usando la técnica dirigida al sitio oligonucleotídico de Zoeller y Smith (1984) DNA 3, 479-488, modificado por Kunkel (1985) PNAS 82, 488-492. Todos los reactivos, las cepas bacterianas y los vectores M13 usados para mutagénesis se proveyeron con el equipo de mutagénesis Muta-Gene in vitro (comercialmente disponible en Bio Rad, Hercules, CA). El ADN molde M13, que es útil para la mutagénesis de la región E1A, contiene las secuencias Ad5 de las posiciones nucleotídicas 22-1339 insertadas entre los sitios de la enzima de restricción BamHl y Xbal en la secuencia de clonación múltiple de M13mp19. La construcción becteriófaga resultante, M13mp19E1A, se propagó luego en la cepa bacteriana CJ236 de dut ung E. coli que da como resultado una ocasional incorporación de uracilo en lugar de timidina en el ADN recientemente sintetizado. Los oligonucleótidos, para la construcción de los mutantes E1 , se sintetizaron y consistieron en las secuencias de 11 o bien de 12 nucleótidos de ADN de sentido Ad5 en cualquier lado de la secuencia que debía ser removida. Para la reacción de mutagénesis, los oligonucleótidos mutagénicos fueron primero fosforilados en el extremo 5', y luego se acoplaron a uracilo que contenía ADN molde de filamento único M13mp1E1A. Las reacciones de cebador acoplado/molde se incubaron con polimerasa ADN T4, ligasa ADN T4 y desoxirribonucleótidos (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) para sintetizar un filamento complementario que contenía la mutación E1A de interés. La reacción de síntesis del filamento complementario es luego transformada en la cepa bacteriana huésped de tipo salvaje ung +, MV1190. Después de la transformación el filamento de ADN M13mp19E1A progenitor, que contiene uracilo, no puede ser eficientemente replicado en MV1190. Por lo tanto se enriquece el ADN de doble filamento de forma replicativa que contiene la mutación E1A de interés. El fago ADN M13mp19E1A de potenciales mutantes E1A es rastreado primero mediante análisis de enzima de restricción y luego mediante secuenciamiento de ADN en ambos filamentos, para confirmar las mutaciones E1A deseadas. La construcción de un adenovirus que comprende las E1Adl01/delecones se efectúa usando recombinación homologa en el adenovirus región-E1 que contiene la línea de célula 293, mediante el método de McGory, eí al., (1988) Virology 163, 614-617. Este método requiere dos plásmidos, un plásmido viral que contiene el genoma entero wtAdd modificado tal como en el ejemplo 1 de manera de contener la deleción E1 bd155K y el promotor MLP (pXC1-E1 B55-2A), y el otro un plásmido de transferencia que contiene el gen E1A con el dl01/07 doble E1A mutante. El plásmido de transferencia, pLE2 contiene las secuencias WtAdd desde 22- 1774 clonadas en el gen de tetraciclina de pBR322 Jelsma eí al., (1988) Virology 163, 494-502. Para la transferencia de los mutantes E1A d]1101 y dl1107 E1-a del origen M13mp19 en el cual fueron construidos los fragmentos de enzima de restricción E1A de tipo salvaje en pLE2 fueron reemplazados con fragmentos E1A salvajes en pLE2 fueron reemplazados con fragmentos E1A mutados parientes a partir de M13mp19E1dJ1101 y M13mp19E1Adl1107 para crear pLE2E1 AdI01/07. Para la recombinación a fin de producir adenovirus E1AdJ01/07 el plásmido viral, pXC1-E1B55-2A y pLE2E1AdJ01/07 fueron cotransfectados en 293 células mediante transfección intermediada por fosfato de calcio. Después de 5 horas el precipitado se enjuagó y las células fueron recubiertas con medio de cultivo que contenía agarosa para aislar placas virales. A los 7-10 días después de la transfección inicial se aislaron placas virales, se purificaron las placas dos veces, y subsiguientemente se rastreó el ADN viral usando análisis de enzima de restricción y secuenciamiento de ADN. Se purificaron las cargas virales mediante gradientes dobles de cloruro de cesio y se cuantificaron por cromatografía en columna tal como fue descrito en Huyghe et al. (1995) Human Gene Therapy 6:1403-1416.

Claims (21)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un virus recombinante competente de replicación que contiene un transgen terapéutico ligado operativamente a un elemento regulador tardío.

2.- El virus de la reivindicación 1 en el cual el virus es un adenovirus.

3.- El virus de la reivindicación 2 donde el elemento regulador tardío es el promotor tardío principal adenoviral.

4.- El virus de la reivindicación 3 en el cual el transgen terapéutico es un gen supresor de tumores.

5.- El virus de la reivindicación 4 en el cual el gen supresor de tumores es p53.

6.- El virus de la reivindicación 5 que comprende además una deleción de la función E1 B-55K.

7.- El virus de la reivindicación 6 que comprende además una secuencia de control de replicación ligada operativamente a un gen precoz.

8.- El virus de la reivindicación 7 en el cual la secuencia de control de replicación es un promotor específico de tumores.

9.- El virus de la reivindicación 7 en el cual la secuencia de control de replicación es la alfa-fetoproteína.

10.- El virus de la reivindicación 9 en el cual el gen precoz es el gen E4.

11.- El virus de la reivindicación 6 que comprende además una deleción de las funciones 12S y 13S de E1a. (01/07).

12.- Una formulación farmacéutica que comprende un virus recombinante competente de replicación que contiene un transgen terapéutico ligado operativamente a un elemento regulador tardío y un portador farmacéuticamente aceptable.

13.- La formulación de la reivindicación 12, que comprende además un agente mejorador de liberación.

14.- La formulación de la reivindicación 13 en la cual el agente mejorador de liberación es un inhibidor de calpaina.

15.- La formulación de la reivindicación 14 en el cual el inhibidor de calpaina es N-acetil-leu-leu-norcinal.

16.- La formulación de la reivindicación 13 en la cual dicho agente mejorador de la liberación es un detergente.

17.- Un método ex vivo para la ablación de una célula neoplástica mediante el contacto de dicha célula neoplástica con un virus recombinante competente de replicación que contiene un transgen terapéutico que está operativamente ligado a un elemento regulador tardío.

18.- El método de la reivindicación 17 en el cual el método se lleva a la práctica para eliminar células tumorales de los productos de células de origen de linaje.

19.- El uso de un virus recombinante competente de replicación que contiene un transgen terapéutico ligado operativamente a un elemento regulador tardío para la fabricación de una composición para la ablación de una célula neoplástica. 5

20.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 19, en donde dicha composición se administra por inyección intraperitoneal, intravenosa o intratumoral.

21.- Una célula transformada con un virus recombinante competente de replicación que contiene un transgen terapéutico ligado 10 operativamente a un elemento regulador tardío. t «