ES2557812T3

ES2557812T3 - Mutantes de E1a y E1b de adenovirus selectivos de tumor

Info

Publication number: ES2557812T3
Application number: ES10749205.0T
Authority: ES
Inventors: Tony Reid; Farah Hedjran; Shantanu Kumar
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2009-03-02
Filing date: 2010-03-02
Publication date: 2016-01-28
Anticipated expiration: 2030-03-02
Also published as: SI2403951T1; JP2012519014A; EP4123030A1; EP2403951A2; KR20110122866A; WO2010101921A3; JP2022023074A; US20230272349A1; US9073980B2; US11618888B2; JP6072414B2; JP7326396B2; WO2010101921A2; US10876097B2; KR20190104643A; JP2016028035A; EP2403951B1; KR20170077278A; JP2018113971A; KR101752910B1

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y un adenovirus recombinante, en donde el adenovirus comprende una secuencia regulatoria de E1 a modificada en donde al menos un sitio de unión de Pea3, o una porción funcional del mismo, es delecionada; en donde la porción funcional de al menos un sitio de unión de Pea3 es una porción del sitio de unión que, cuando es delecionada, disminuye la afinidad de unión del sitio de unión a Pea3.

Description

DESCRIPCIÓN

Mutantes de E1a y E1b de adenovirus selectivos de tumor.

Antecedentes de la invención

A pesar del gran conocimiento que existe de los mecanismos moleculares subyacentes que causan el cáncer, la mayor parte de los canceres avanzados aún son incurables con los protocolos actuales de quimioterapia y 5 radioterapia. Los virus oncolíticos han emergido como una plataforma tecnológica que tiene el potencial de aumentar significativamente el actual tratamiento estándar para una variedad de malignidades (Kumar, S. et al., Current opinion in molecular therapeutics 10(4):371-379 (2008); Kirn, D. Expert opinion on biological therapy 1(3):525-538 (2001); Kirn D. Oncogene 19(56):6660-6669 (2000)). El ONYX-015, que tiene una deleción del gen viral E1b-55k, se postuló que confería replicación selectiva de tumores en tumores con defectos en la ruta p53 (Heise, C. et al., Nat 10 Med 3(6):639-645 (1997); McCormick, F. Oncogene 19(56):6670-6672 (2000); Bischoff, J. R. et al., Science 274(5286):373-376 (1996)). El E1b-55k se une e inactiva el p53, permitiendo la síntesis de ADN no programada y la replicación viral. La inactivación de p53 por E1b-55k, aunque sea crítica para una replicación eficaz de adenovirus en células normales, fue hipotizado que era irrelevante en tumores que tienen mutaciones inactivantes en la ruta de p53. Estudios preclínicos demostraron que una amplia variedad de células tumorales humanas con secuencias del 15 gen p53 mutante o normal ayudaban a la replicación de ONYX-015 en cultivos celulares, demostrando que la replicación viral permisiva en tumores celulares no era estrictamente dependiente de los efectos de unión de p53 de E1b-55k (Heise, C. et al., Nat Med 3(6):639-645 (1997); Heise, C. et al., Clin Cancer Res 6(12):4908-4914 (2000); Rogulski, K. R. et al. Cancer Res 60(5): 1193-1196 (2000); Harada, J. N. et al., J Virol 73(7):5333-5344 (1999); Goodrum, F. D. et al., Journal de virology 72(12):9479-9490 (1998)). Estudios previos habían demostrado que E1b-20 55k es una proteína multifuncional que, además de unirse e inactivar a p53 durante la fase inicial de la infección, facilita el transporte de mARN a través de la membrana nuclear durante las fases últimas de la infección (Babiss, L. E. et al., Mol Cell Biol 5(10):2552-2558 (1985); Leppard, K. N. et al., Embo J 8(8):2329-2336 (1989)). La falta de un transporte eficaz de mARN debido a la deleción de E1b-55k dio como resultado una menor replicación viral incluso en células tumorales cuando se compara con el Ad5 tipo salvaje. Los análisis detallados demostraron que la pérdida 25 de la función del transporte de mARN proporcionado por E1b-55k podría ser complementario en líneas celulares tumorales, sugiriendo un nuevo mecanismo de replicación viral selectiva de tumor (O'Shea, C. C. et al., Cancer Cell 8(1):61-74 (2005)). Sin embargo, la complementación de funciones perdidas debidas a la deleción del gen viral fue incompleta en la mayor parte de las células tumorales ya que el título de ONYX-015 en células tumorales fue a menudo de uno a dos logaritmos inferior que el de Ad5 tipo salvaje en las mismas células tumorales (Heise, C. et al., 30 Clin Cancer Res 6(12):4908-4914 (2000); Goodrum, F. D. et al., Journal de virology 72(12):9479-9490 (1998)).

Los ensayos clínicos usando ONYX-015 en una variedad de malignidades, incluyendo cáncer de cabeza y cuello, colorectal, pancreático, pulmón, mama y cerebro han demostrado que este virus oncolítico era bien tolerado cuando se administraba solo o con quimioterapia (Heise, C. et al., Nat Med 3(6):639-645 (1997);Galanis, E. et al., Gene Ther 12(5):437-445 (2005); Chiocca, E. A. et al., Mol Ther 10(5):958-966 (2004); Hecht, J. R. et al., Clin Cancer Res 35 9(2):555-561 (2003); Reid, T. et al., Cancer Res 62(21):6070-6079 (2002); Vasey, P. A. et al., J Clin Oncol 20(6):1562-1569 (2002); Reid, T. et al., Gene Ther 8(21):1618-1626 (2001); Nemunaitis, J. et al., J Clin Oncol 19(2):289-298 (2001); Kirn, D. Gene Ther 8(2):89-98 (2001); Nemunaitis, J. et al., Gene Ther 8(10):746-759 (2001)). Sin embargo, las respuestas clínicas objetivo después de la administración de ONYX-015 fueron poco comunes dando lugar a dudas de que este virus, aunque fuera bien tolerado por administración intratumoral, intravenosa e 40 incluso intraarterial, carecía de suficiente potencia para ser ampliamente aplicable como agente terapéutico (Kirn, D. Gene Ther 8(2):89-98 (2001)). El bajo título viral para ONYX-015 en varias líneas celulares tumorales cuando se compara con Ad5 tipo salvaje dio lugar a dudas de que la potencia de ONYX-015 no fuera suficiente para ser clínicamente activo como agente anticáncer. Además, E1a, la primera proteína producida por el virus, no estaba bajo control selectivo de tumor, permitiendo la expresión de esta potente proteína viral en células normales así como en 45 células tumorales. Ya que la función de E 1a es facilitar la entrada de células en la división celular, un virus oncolítico tendría de forma óptima ambos E1a y E1b bajo control selectivo tumoral.

Se ha dirigido mucho trabajo a desarrollar un virus selectivo de tumor con mejor potencia anti-tumoral cuando se compara con ONYX-015. Un enfoque que los inventores y otros han tomado para preparar virus oncolíticos ha sido insertar elementos promotores selectivos de tumor secuencia arriba de unidades de transcripción críticas incluyendo 50 E1a, E1b y E4 (Li, Y. et al., Clin Cancer Res 11(24 Pt 1):8845-8855 (2005); Huang, T. G. et al., Gene Ther 10(15):1241-1247 (2003); Wirth, T. et al., Cancer Res 63(12):3181-3188 (2003); Gu, J. et al., Gene Ther 9(1):30-37 (2002); Johnson, L. et al., Cancer Cell 1(4):325-337 (2002); Li, X. et al., Cancer Res 65(5):1941-1951 (2005); Li, Y. et al., Mol Cancer Ther 2(10):1003-1009 (2003)). La incorporación de elementos promotores heterólogos, tales como el promotor para antígeno específico de próstata (PSA), antígeno embriónico carcinogénico (CEA), E2F1 y telomerasa, 55 ha alcanzado niveles variables de replicación selectiva de tumores. La utilidad potencial clínica de virus usando promotores heterólogos para proporcionar la replicación selectiva de tumores ha sido limitada por la expresión génica no selectiva y parcial, disminuyó la capacidad de estos vectores de replicarse cuando se compara con el virus tipo salvaje y acontecimientos de recombinación debidos a la secuencia promotora heteróloga. Por ejemplo, el ONYX-411 se desarrolló para mejorar en la potencia de ONYX-015 por inserción de la región del promotor de E2F1 60 secuencia arriba de E1a y E4 (Johnson, L. et al., Cancer Cell 1(4):325-337 (2002)). Sin embargo, este virus no ha sido desarrollado para uso clínico. En un esfuerzo de superar algunas de las limitaciones de secuencias

potenciadoras heterólogas, los inventores han evaluado la región control transcripcional viral nativa para E1a para determinar si la replicación viral selectiva de tumor podría lograrse mediante ingeniería dirigida al potenciador de E1a nativo.

Resumen breve de la invención

La invención es como sigue: 5

1. Una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y un adenovirus recombinante, en donde el adenovirus comprende una secuencia regulatoria de E1 a modificada en donde al menos un sitio de unión de Pea3, o una porción funcional del mismo, es delecionada, en donde la porción funcional de al menos un sitio de unión de Pea3 es una porción del sitio de unión que, cuando es delecionada, disminuye la afinidad de unión del sitio de unión a Pea3. 10

2. La composición farmacéutica del punto 1, en donde al menos un nucleótido en el intervalo de -305 a -141 es retenido.

3. La composición farmacéutica del punto 1 ó 2, en donde al menos uno de Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV, y Pea3 V, o una porción funcional del mismo, es delecionada, opcionalmente en donde la materia objeto seleccionada de a), b) y c) es delecionada: 15

a) al menos uno de Pea3 II y Pea3 III, o una porción funcional del mismo;

b) Pea3 II o una porción funcional del mismo, y Pea3 III o una porción funcional del mismo; y

c) al menos uno de Pea3 IV y Pea3 V, o una porción funcional del mismo.

4. La composición farmacéutica de cualquiera de los puntos 1-3, en donde Pea3 I, o una porción funcional del mismo, es retenido, opcionalmente en donde al menos un sitio de unión de E2F, o una porción funcional del mismo, 20 es retenido, en donde la porción funcional de al menos un sitio de unión de E2F es una porción del sitio de unión que, cuando es delecionada, disminuye la afinidad de unión del sitio de unión a E2F.

5. La composición farmacéutica del punto 1, en donde dicho adenovirus recombinante comprende la deleción de nucleótidos localizados secuencia arriba de un sitio de iniciación de E1a, en donde la deleción se selecciona de:

(a) nucleótido de -393 a -304; 25

(b) nucleótido de -305 a -255;

(c) nucleótido de -270 a -240;

(d) nucleótido de -299 a -293;

(e) nucleótido de -270 a -265; o

(f) nucleótido de -299 a -293, y nucleótido de -270 a -265. 30

6. Una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 5 para uso en el tratamiento del cáncer.

7. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con el punto 6, en donde la composición farmacéutica es para poner en contacto una célula diana.

8. Un método in vitro para expresar selectivamente un péptido en una célula diana que comprende poner en 35 contacto la célula diana con un adenovirus recombinante en donde el adenovirus comprende una secuencia regulatoria de E1 a modificada en donde al menos un sitio de unión de Pea3, o una porción funcional del mismo, es delecionada, en donde la porción funcional de al menos un sitio de unión de Pea3 es una porción del sitio de unión que, cuando es delecionada, disminuye la afinidad de unión del sitio de unión a Pea3, con la condición de que el método no sea un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia. 40

9. La materia objeto del punto 7 ó 8, en donde el virus recombinante comprende una secuencia regulatoria de E1a del mutante de deleción operativamente unido a la secuencia de nucleótidos que codifica un péptido.

10. La materia objeto de cualquiera de los puntos 7 a 9, en donde la célula diana se selecciona de una célula neoplásica y una célula normal.

11. La materia objeto de cualquiera de los puntos anteriores, en donde dicho virus recombinante expresa de forma 45 selectiva una isoforma de E1a, en donde la secuencia que codifica la isoforma de E1a está unida operativamente a dicha secuencia regulatoria de E1a modificada.

12. La materia objeto del punto 11, en donde el adenovirus recombinante expresa de forma selectiva E1a-12S o E1a13S.

13. La materia objeto de cualquiera de los puntos anteriores, en donde dicho adenovirus recombinante excluye sustancialmente la expresión de una isoforma de E1a, en donde la secuencia que codifica la isoforma de E1a está unida operativamente a dicha secuencia regulatoria de E1a modificada. 5

14. La materia objeto del punto 13, en donde la isoforma de E1a excluida es E1a-12S o E1a-13S.

15. La materia objeto de cualquiera de los puntos anteriores, en donde el adenovirus recombinante comprende además una secuencia de ADN insertada en un sitio de inserción de E1 b-19K.

16. La materia objeto del punto 15, en donde el sitio de inserción se localiza entre el sitio de inicio de E1 b-19K y el sitio de inicio de E1 b 55K. 10

17. La materia objeto del punto 15 ó 16, en donde el sitio de inicio de E1b-19K comprende una deleción de 202 pares de bases después del sitio de inicio de E1b-19K.

18. La materia objeto de cualquiera de los puntos 15 a 17, en donde la secuencia de ADN es una secuencia que codifica un factor de necrosis tumoral, o una porción funcional del mismo.

19. La materia objeto de cualquiera de los puntos 15 a 17, en donde la secuencia de ADN es una secuencia que 15 codifica kras, o una porción funcional del mismo.

Breve descripción de las figuras

Deleciones de la Región Control Transcripcional de E1a

Figura 1. Expresión de la proteína de E1A adenoviral en fibroblastos de pulmón y células cancerígenas infectadas con Wt Ad5. Los fibroblastos de pulmón primarios inactivos y las líneas celulares cancerígenas se infectaron con Wt 20 Ad5 en multiplicidad de infección (MDI) de 5 y las proteínas se extrajeron a varias horas después de las infecciones (h.d.i.) y se analizaron para la expresión de E1A. (A) Expresión de proteína de E1A en líneas celulares inactivas (MRC-5 y IMR-90) y líneas celulares cancerígenas (A549 y PANC-1). (B) Expresión de E1A en varias líneas celulares tumorales, AsPC-1, LNCaP, HeLa, y Calu-6. Varias variantes de empalme de la proteína E1A con restos de aminoácidos (R): 289R, 243R, y 55R se muestran mediante una flecha. β-tubulina (control de carga) se indican 25 cerca de las transferencias Western. Los cursos temporales se indican en la parte superior del panel, y las líneas celulares se indican a la izquierda de cada transferencia.

Figura 2. Inducción de mARN de E1A en células (MDI 5) (a) MRC-5, (b) A549, y (c) PANC-1 infectadas a varias horas después de la infección. El incremento en veces de la expresión de E1A se calculó respecto a la expresión de Wt Ad5 E1A en líneas celulares de MRC5 6 h.d.i. 30

Figura 3. La expresión de luciferasa a partir de un plásmido reportero (pE1P/EGL3), que se conduce mediante el promotor/potenciador de adenovirus E1A (de +143 a +552). Las células se transfectaron con plásmido reportero y se obtuvieron los valores luminiscentes de cada línea celular. Los resultados están en promedio de muestras duplicadas y son representativas de tres experimentos independientes. Los valores luminiscentes (log) se indican en el eje Y y las líneas celulares se indican en el eje X. 35

Figura 4. (A) Representación esquemática de la región control secuencia arriba de unidades de transcripción de Ad5 E1A. El sitio de inicio de la transcripción (+1), región del potenciador (de -305 a -141), y región ITR (de -498 a -395) se indican en la parte superior. Los sitios de unión de los factores de transcripción para Pea3 y E2F1 se indican mediante pequeñas flechas y estrellas, respectivamente. Los virus mutantes de deleción y sus nucleótidos de deleción acompañantes se indican mediante barras negras y la región se indica en su parte alta. El nombre de cada 40 virus mutante se indica a la izquierda de su diagrama esquemático. (B) La expresión de la proteína de E1A en MRC-5 y las células A549 infectadas con Wt Ad5 y los virus mutantes. Las células se infectaron con el virus individual con un MDI de 5 y las proteínas se recuperaron 24 h.d.i. Varias variantes de empalme de E1A con restos de aminoácidos (R); 289R, 243R y 55R se muestran mediante la flecha. β-tubulina (control de carga) se indican cerca de las transferencias Western. Las líneas celulares se indican a la izquierda de cada transferencia. (C) Ensayo del 45 curso temporal para la expresión de E1A por Wt Ad5 y TAV-255 en células MRC-5 y A549. Las células se infectaron con MDI de 5 y las proteínas se recuperaron a las horas indicadas después de la infección. Los virus se indican en la parte superior de la línea negra y las diversas variantes de empalme de la proteína E1A con los restos de aminoácidos (R): 289R, 243R y 55R se muestran mediante una flecha. β-tubulina (control de carga) se indican cerca de la transferencia Western. 50

Figura 5. La inducción de mARN de E1A en células (MDI 5) (a) MRC-5 y (b) A549 infectadas 24 h después de la infección se determinó por Q-PCR a tiempo real. La expresión de E1A, aumento o descenso en número de veces, se calculó respecto a Wt Ad5.

Figura 6. Análisis de transferencia Western de proteínas de E1A y E1b adenovirales en líneas celulares infectadas con varios adenovirus. (a) Líneas celulares cancerígenas (A549 y Panc-1) se infectaron con virus con un MDI de 5 y las proteínas se recogieron 24 h.d.i. Las flechas pequeñas indican la expresión de variantes de empalme de E1A, los virus se indican en la parte superior de la transferencia y las líneas celulares se indican en la parte superior de la barra negra. (b) Análisis de transferencia Western de proteína de E1B-55kDa adenoviral en células (MDI 5) MRC-5 y 5 A549 infectadas con Wt Ad5, Onyx-015 y TAV-255. Las muestras de proteína se recogieron 24 h.d.i. y se sondaron con anticuerpo monoclonal de E1B. La flecha pequeña indica el tamaño correcto de la proteína de E1B 55kDa; otras bandas son no específicas. Los virus se indican en la parte superior de la transferencia.

Figura 7. Inhibición del crecimiento de células normales y células tumorales por mutantes de Ad 5. (a) Línea celular normal MRC-5 y (b) líneas celulares tumorales (A549, HeLa y Calu-6) se infectaron con Wt Ad5/TAV-255/Onyx-015 10 en un MDI de 5, y el ensayo de viabilidad celular se realizó usando CCK-8 6 días después de la infección. Los resultados representan el promedio +/- SD (barra de error) de experimentos triplicados y se expresaron como células control tratadas con PBS. (c) Las células MRC-5 se infectaron con Wt Ad5 o TAV-255 con un MDI de 5, y las células tratadas con PBS sirvieron como control. Las células tratadas con virus y no tratadas (control) se fotografiaron 6 días después de la infección. 15

Figura 8. Mutantes de deleción de dl309 y expresión de E1a en células MRC-5. (A) Representación esquemática de la región control secuencia arriba de la unidad transcripcional de HAd-5 E1a. El sitio de inicio de la transcripción (+1), la región del potenciador (de -305 a -141) y la región ITR (de -498 a -395) se indican en la parte superior. Los cinco sitios de unión de Pea3 en el genoma de dl309 se indican mediante una flecha y los dos sitios de unión de E2F se indican mediante una estrella. Los virus mutantes de deleción y sus nucleótidos acompañantes se indican mediante 20 una barra negra y los nucleótidos se indican en su parte alta. El nombre del virus mutante se indica a la izquierda del diagrama esquemático. (B) Análisis de transferencia Western de proteínas de E1A extraídas a partir de células MRC-5 infectadas con virus mutantes después de 24 h.d.i.; la β-tubulina (control de carga) se muestra debajo de la transferencia de E1a (C) cuantificación relativa de mARN de E1A producida por adenovirus mutantes en células MRC-5 a 24 h.d.i. 25

Figura 9. Expresión de E1a en células A549 infectadas con adenovirus mutantes. (A) Las células se infectaron con adenovirus mutantes y la proteína se recogió 8 y 24 h.d.i. y se sondaron con antisuero específico deE1a; la β-tubulina (control de carga) también se muestra. (B) Análisis Q-PCR relativo de mARN de E1A producido en células A549 infectadas con mutantes de HAd-5 8 h.d.i.

Figura 10. Adenovirus del mutante de deleción dentro de TAV-255 y expresión de E1a en células MRC-5. (A) 30 Representación esquemática de TAV-255 que abarca un sitio de E2F1 y dos sitios II y III de Pea3. La deleción de seis pares de bases dentro de TAV-255 se muestra mediante color negro oscuro y sus nucleótidos acompañantes se indican en la parte superior. Cada nombre de virus se indica a la izquierda del diagrama esquemático; dl200 elimina el sitio de unión de Pea3 III, dl212 elimina el sitio de unión de E2F, dl220 elimina el nucleótido de 6 bp (como control), dl230 elimina el sitio de unión de Pea3 II, y dl200+230 elimina el sitio II+III de Pea3. (B) Análisis de 35 transferencia Western de la proteína E1A expresada por varios virus mutantes 48 h.d.i.; la β-tubulina (control de carga) se muestra debajo de la transferencia de E1a. (C) Análisis Q-PCR relativo de mARN de E1A en células infectadas con varios mutantes del adenovirus 24 h.d.i.

Figura 11. Virus del mutante de deleción de E2F y expresión de E1a en células MRC-5 (A) Representación esquemática de sitios de E2F mostrada como estrellas en la región del potenciador de E1a y sus nucleótidos 40 acompañantes se muestran en la parte superior. Los nombres de los virus mutantes se indican a la izquierda de la Representación esquemática; dl 212 y dl275 tiene el único sitio de deleción de E2F, dl212+275 tienen ambos dos sitios de deleción de E2F y dl220 se prepara como control. (B) Análisis de transferencia Western de proteína de E1A expresada en células infectadas con varios mutantes de adenovirus 24 h.d.i.; la β-tubulina se muestra como control de carga (C) Q-PCR relativa para la expresión de mARN de E1A a 24 h.d.i. en células infectadas con varios 45 mutantes de adenovirus.

Figura 12. Expresión de la proteína de E1A en varias líneas celulares no transformadas y transformadas infectadas con adenovirus. (A) Líneas celulares no transformadas; (a) MRC-5, (b)IMR-90, y (c) WI-38 y (B) líneas celulares transformadas; (e) HeLa, (f) Panc-1, y (g) Calu-6 se infectaron con dl309/dl200+230 y la proteína se recogió en la infección indicada después de una hora y se analizó mediante transferencia Western para la expresión de E1a. 50

Figura 13. Actividad oncolítica in vitro. (A) Líneas celulares transformadas (A549, HeLa, Panc-1 y Calu-6) y la línea celular no transformada (MRC-5) se infectaron con virus; adenovirus de Wt HAd-5, y dl200+230 y se evaluaron respecto a su viabilidad usando un kit de CCK-8 después de 4 días y 5 días después de la infección, respectivamente. (B) El efecto citopático de varios adenovirus se analizó mediante el ensayo de violeta de cristal en células MRC-5 infectadas en el MDI indicado y se tiñeron después de 5 días después de la infección. 55

Figura 14. Células WI-38 no transformadas se cultivaron hasta confluencia y luego se infectaron con Ad5 o TAV-255 a un MDI de 10. Las células control no infectadas y las células infectadas se fijaron 7 días después de la infección, se tiñeron con violeta de cristal y se fotografiaron con ampliación de 40x. Las imágenes muestran una monocapa

uniforme de células sin evidencia de citolisis viral en las células control y las células tratadas con TAV-255. Por el contrario, se observa citolisis exhaustiva para las células tratadas con Ad5.

Figura 15. Se cultivaron hasta confluencia células A549 transformadas y luego se infectaron con Ad5 o TAV-255 a un MDI de 10. Las células control no infectadas y las células infectadas se fijaron 3 días después de la infección, se tiñeron con violeta de cristal y se fotografiaron con ampliación de 40x. Las imágenes muestran una monocapa 5 uniforme de células sin evidencia de citolisis viral en las células control. Por el contrario, se observa citolisis exhaustiva para las células tratadas con Ad5 y con TAV-255.

Expresión selectiva de las isoformas de E1a 12S y 13S

Figura 16. Cursos temporales de la expresión de E1a después de la infección con Ad5 tipo salvaje (WT) y adenovirus de PM975 en células (MDI=5) (A) WI-38 y (B) MRC-5. 10

Figura 17. Expresión de E1a en (A) A549 y (B) Panc 1.

Figura 18. A) Cursos temporales de expresión de E1A en células (MDI=5) a) WI-38 y b) células MRC-5. B) Cursos temporales de la expresión de E1A en células (MDI=5) c) A549 y d) células Panc-1.

Figura 19. Cursos temporales de la expresión de E1A en células (MDI=5) A) WI-38 y B) células A549.

Figura 20. Expresión de E1a en células WI-38 de crecimiento frenado infectadas con Ad5, TAV, y TAV-13s para E1a 15 a las 48 y 72 horas (MDI=5).

Figura 21. Viabilidad de células después de la infección con dl309, PM975, dl1520 o dl1520 en células WI-38 7 días después de la infección en MDI de 30 y A549, Panc-1, LnCap y Hep3b 5 días después de la infección en MDI de 3.

Figura 22. Expresión de E1a en A549 en MDI de 2: Se infectaron células A549 con Ad5, TAV, PM975 (13s) o 13sTAV a un MDI de 2. La proteína se aisló a partir de células infectadas 24 y 48 horas después de la infección y se 20 analizaron para la expresión de E1a mediante transferencia Western. La expresión de mARN de 13S de E1A (289R) se observa en todas las bandas a aproximadamente igual abundancia y es la única de la observada en el virus restringido a la expresión de 13S (PM975) y 13S-TAV. Esto demuestra que la introducción de la deleción del potenciador como se muestra (TAV y 13s-TAV) no da como resultado ninguna disminución significativa en la expresión de E1a-289R. 25

Figura 23. Expresión de E1a en WI138 en MDI de 2: células WI-38 con crecimiento frenado se infectaron con Ad5, TAV-255 (TAV), PM975 (expresión de 13S solo), y 13S-TAV (deleción del promotor de TAV-255 y restricción de la expresión a 13S). La proteína fue extraída a partir de células 24 y 48 horas después de la infección y se analizaron para la expresión de E1a mediante transferencia Western. La expresión de las formas de 289R y 243R de E1a se observan 48 horas después de la infección en las células infectadas con Ad5 y a un menor grado (TAV). La 30 expresión no detectable de E1a es observada en células infectadas con PM975 o 13S-TAV.

Inserto del clon de E1b 19K

Figura 24. Organización de la región de E1 del adenovirus tipo 5. E1b-19k y E1b-55k se derivan a partir de secuencias sobrelapantes por variantes de empalme de mARN. Los primeros 202 nucleótidos de E1b-19k se delecionaron después del sitio de inicio y los insertos de ADN se clonaron dentro de este sitio en marco sin 35 interrupción del sitio de inicio de E1b-55k.

Figura 25. Representación esquemática de las regiones de E1a y E1b con el sitio de inicio de E1b-19 k mostrado.

Figura 26a y b. Demuestra la secuencia de TNF estabilizada de membrana insertada de forma selectiva en la región de E1b-19k de Ad5.

Figuras 27. Demuestra la secuencia de la deleción del par de bases 50 en el promotor de E1a produciendo un vector 40 con una deleción en E1b-19k y la deleción del promotor de TAV-255.

Figura 28. Expresión de TNF en la pared celular tumoral después de la infección con AD19kTNF.

Figura 29. Ensayo de citotoxicidad en MRC5 (A) 3 días después de la infección y (B) 5 días después de la infección.

Figura 30. Ensayo de citotoxicidad en A549 (A) 3 días después de la infección y (B) 5 días después de la infección.

Figura 31. Ensayo de citotoxicidad en Panc 1 (A) 3 días después de la infección y (B) 5 días después de la infección. 45

Figura 32a-c. Análisis de la expresión en superficie de TNF por AdTAV19kmmTNF usando citometría de flujo.

Figura 33. Ensayo de violeta de cristal en SK-Mel-28 (melanoma) tres días después de la infección.

Figura 34. Activación de caspasa-3 en células Hep3b infectadas con Ad19k o AdTAV 19TNF a un MDI de 5, 48 horas después de la infección.

Figura 35. Expresión de E1b-55kD en AD-Δ19kD-kras/TAV a un MDI de 2, 48 horas después de la infección.

Figura 36. Amplificación PCR de GFP y promotor de E1A del lisado de transfección de Ad19kTAVhrGFP

Figura 37. Expresión de GFP en A549 infectado en MDI de 2 con Ad19kTAVGFP. 5

Descripción detallada de la invención

I. Abreviaturas y Definiciones

Las abreviaturas usadas en este documento tienen su significado convencional dentro de las técnicas química y biológica. Para facilitar su referencia, las abreviaturas usadas en este documento se definen a continuación:

Wt Ad5: adenovirus tipo 5 tipo salvaje 10

MDI: multiplicidad de infección

hdi: horas después de la infección

Las líneas celulares neoplásicas referidas en este documento incluyen:

A549: cáncer de pulmón

PANC-1: cáncer pancreático 15

AsPC-1: cáncer pancreático

LNCaP: cáncer de próstata

HeLa: cáncer cervical

Calu-6: cáncer de pulmón

SK-Mel-28: melanoma 20

Las líneas celulares no neoplásicas referidas en este documento incluyen las líneas celulares de fibroblasto respiratorio de pulmón MRC-5, WI-38, y IMR-90. La línea celular HEK-293A es células de riñón embriónico humano transformadas de adenovirus E1.

Los mutantes de deleción referidos en este documento se caracterizan por la deleción de los nucleótidos indicados más abajo. Los sitios de unión afectados por la deleción se muestran entre paréntesis. 25

dl309: de -498 a -395, de -305 a -141

dl309-6: de -393 a -304 (Pea3 V y Pea3 IV)

dl340-12: de -145 a -44

TAV-255: de -305 a -255 (Pea3 III, E2F II, Pea3 II)

dl87: de -201 a -195 (Pea3 I) 30

dl55: de -270 a -240 (Pea3 II)

dl275: de -225 a -218 (E2F I)

dl200: de -299 a -293 (Pea3 III)

dl212: de -287 a -281 (E2F II)

dl220: de -280 a -275 35

dl230: de -270 a -265 (Pea3 II)

dl200+230: de -299 a -293 (Pea3 III), -270 a -265 (Pea3 II)

dl212+275: de -287 a -281 (E2F II), de -225 a -218 (E2F I)

Los términos "uno/a" o "un", según se usan en este documento, significan uno o más, a menos que se diga específicamente el singular.

II. Investigación de Deleciones en la Región de Control Transcripcional de E1a

E1a es el primer gen expresado después de la infección de HAd-5 y es esencialmente requerido para una replicación con éxito del virus (Gaynor, R. B., y Berk, A. J. (1983). “Cis-acting induction of adenovirus transcription”. 5 Cell 33: 683-693). La región de control transcripcional del E1a adenoviral tiene elementos regulatorios múltiples incluyendo dos sitios de unión para E2F1 y cinco sitios de unión para Pea3 (Bruder, J. T. et al., J Virol 65(9):5084-5087 (1991)). Estos factores de transcripción se expresan comúnmente de forma aberrante en células tumorales (de Launoit, Y. et al., Adv Exp Med Biol 480:107-116 (2000); Hanahan, D. et al., Cell 100(1):57-70 (2000)). Ya que hay múltiples sitios de unión para estos factores de transcripción, los inventores buscaron determinar si algunos de estos 10 sitios de unión eran críticos para una expresión eficaz de E1a en células normales pero no en células tumorales. Los inventores observaron que mARN de E1A y la proteína se expresa en momentos iniciales y a mayores niveles en células tumorales comparado con las células infectadas no transformadas con Adenovirus 5 (Ad5) humano. Para entender el mecanismo de este efecto, los inventores evaluaron el impacto de una serie de pequeñas deleciones a través de la región de control transcripcional de E1a en la expresión de E1a en células tumorales y células epiteliales 15 respiratorias no transformadas. Varias deleciones en la región secuencia arriba del sitio de iniciación de E1a redujeron la expresión de E1a en células epiteliales respiratorias no transformadas mientras tenían el mínimo impacto en la expresión de E1a en células tumorales. En particular, el TAV-255 que tiene una deleción de una región de 50 pares de bases localizada entre -305 y -255 secuencia arriba del sitio de iniciación de E1a dio como resultado una reducción notable del mARN de E1A y de la expresión de la proteína en células no transformadas, al tiempo que 20 retenía una expresión de E1a similar a la de Wt Ad5 en células tumorales. Además, esta deleción de 50 bp dio como resultado una expresión notablemente menor de E1b en células no transformadas mientras la mantenía cercana a los niveles normales de E1b en células tumorales. Aunque está altamente atenuado en células no transformadas, el TAV-255 es similar al Ad5 tipo salvaje en la expresión de E1a y E1b y en la actividad citolítica en líneas celulares tumorales. 25

El mARN de E1A y la proteína se induce más pronto y en mayor abundancia en células tumorales que en células no transformadas. La región nativa del control transcripcional de Ad5 tiene sitios de unión para factores de transcripción comúnmente sobreexpresados en células tumorales incluyendo sitios de unión para E2F1, Sp1 y Pea3. Por lo tanto, la regulación de la expresión de E1a puede ser diferente en células tumorales que en células no transformadas. Para evaluar esta posibilidad, el Ad5 tipo salvaje se usó para infectar células tumorales y células no transformadas 30 (MDI=5) y la expresión de la proteína E1A se evaluó en varios puntos de tiempo después de la infección de las células. Los resultados (Fig. 1a) muestran que la expresión de E1a se detecta antes y con mayor abundancia en líneas celulares tumorales (A549 y PANC-1) comparado con las células epiteliales respiratorias no transformadas (MRC-5 y IMR-90). La abundante expresión de la proteína de E1A se observa de 6 a 8 horas después de la infección (h.d.i.) en las líneas celulares tumorales mientras que no se observa una expresión detectable de E1a a 35 estos tiempos en las líneas células epiteliales respiratorias no transformadas MRC-5 y IMR-90. 24 horas después de la expresión de la infección de E1a (289R y 243R, correspondiente a las especies de mARN 13s y 12s, respectivamente) se observa en ambos MRC-5 y IMR-90 a niveles comparables. Sin embargo, la cantidad de E1a (55R, 243R y 289R) detectada en las células tumorales mediante transferencia Western excede abundantemente la cantidad vista en las células no transformadas. La abundancia de E1a observada en las células tumorales 8 horas 40 después de la infección es comparable con la abundancia de E1a observada en las células no transformadas 24 horas después de la infección. Para valorar además este efecto, el inicio y la abundancia de la expresión de E1a se evaluó en un panel de líneas celulares tumorales (Fig. 1b) incluyendo células AsPc-1 y PANC-1 (pancreáticas), Calu-6 (pulmón), LNCaP (próstata) y HeLa (cervical). En cada una de estas líneas celulares, la expresión de E1a se detecta a 6 a 8 horas después de la infección en las células transformadas y la cantidad de E1a observada en las 45 células transformadas a 6 a 8 horas después de la infección es comparable con la de E1a observada en las células no transformadas 24 horas después de la infección (Fig. 1a).

La expresión de mARN de E1a ocurre pronto y es más abundante en células tumorales comparado con células no transformadas por PCR cuantitativa. Aparecieron incrementos detectables en el mARN de E1A en células A549 y PANC-1 en las 2 a 4 horas de la infección y superaron la expresión en células MRC-5 en casi 6 veces (Fig. 2). A las 50 8 y 24 horas de la expresión de E1a en las células transformadas se excede abundantemente la expresión de E1a en células MRC-5 (de 40 veces a 70 veces). Estos resultados muestran además que la transcripción de E1a es más eficaz en células tumorales que en células no transformadas dando como resultado una expresión temprana y abundante de E1a en células tumorales después de la infección con Ad5.

Para además evaluar la transcripción del potenciador/promotor de E1a, se transfectó en células transformadas y no 55 transformadas un indicador de plásmido con luciferasa en lugar de E1a. La luminiscencia se cuantificó 24 y 48 horas después de la transfección. Los ensayos realizados después de 24 h de la transfección dieron como resultado la expresión de luciferasa no detectable en líneas celulares MRC5 mientras que las líneas celulares cancerígenas mostraron 1000 veces la potenciación de la expresión de luciferasa cuando se comparaba con los valores control (datos no mostrados). La expresión de luciferasa detectable se observó en células MRC-5 y IMR-90 (fibroblasto de 60 pulmón) 48 horas después de la transfección pero permaneció aproximadamente 100-1000 veces menor que la

expresión de luciferasa en las líneas celulares cancerígenas (Fig. 3). La expresión de renilla también se midió y sirvió como control para determinar la eficacia de la transfección entre las líneas celulares.

Se prepararon mutantes de deleción de la región de control de la transcripción de E1A y se analizó la expresión de E1a en células tumorales y no transformadas. Para determinar si había diferencias entre el control transcripcional de E1a entre células tumorales y no transformadas, los inventores evaluaron la expresión de E1a en células tumorales 5 y no transformadas usando constructos adenovirales con varias deleciones en la región de control secuencia arriba para E1a, Figura 4a. Los resultados de la expresión de E1a en células no transformadas (MRC-5) y células transformadas (A549) de cada uno de estos vectores de deleción se muestra en la Figura 4b. Los resultados muestran que ninguna de las deleciones tenía un impacto significativo en la expresión de E1a en células A549. Sin embargo, los virus mutantes de deleción, dl309-6 y TAV-255, dieron como resultado reducciones en la expresión de 10 E1a en células MRC-5. De forma notable, la deleción que se extiende de la región entre -305 y -255, dio como resultado la casi completa pérdida de expresión de E1a de células MRC-5 pero no tuvo ningún impacto medible en la expresión de E1a de células A549. Esta deleción proporcionó la mayor expresión diferencial de E1a entre las células no transformadas y transformadas. Para evaluar además este efecto, los inventores compararon la expresión de proteína E1A en el tiempo después de la infección de células MRC-5 y A549 con Ad5 tipo salvaje y TAV-255, 15 Figura 4c. Estos resultados muestran una abundante expresión de E1a en líneas celulares A549 después de la infección con ambos vectores. Sin embargo, la expresión de E1a fue drásticamente reducida en las células MRC-5 no transformadas después de la infección con TAV-255.

La expresión de mARN de E1a a partir de mutantes del potenciador se analizó por PCR cuantitativa. Los inventores además caracterizaron la expresión de mARN de E1A después de la infección de células MRC-5 y A549 con Ad5 20 tipo salvaje, TAV-255, y dl87, que tiene una deleción que elimina el único sitio de Pea3 localizado lo más próximo al sitio de inicio de E1a. La expresión de mARN de E1a fue 20-30 veces menor en células MRC-5 infectadas con TAV-255 comparada con la del Ad5 tipo salvaje y dl87. Sin embargo, la expresión de mARN de E1a es aproximadamente equivalente en células A549 infectadas con cada uno de estos virus (Fig. 5).

Fueron comparados Onyx-015 y TAV-255 con respecto a la expresión de E1a y E1b. Onyx-015 tiene una deleción 25 del gen viral de E1b-55k pero no tiene modificación para restringir la expresión de E1a en células no transformadas. La Figura 6a muestra niveles de expresión comparables de E1a en células A549 y Panc-1 infectadas con Ad5, TAV-255 y Onyx-015. Para determinar el impacto de TAV-255 sobre la expresión de E1b, los inventores evaluaron la expresión de proteína en células MRC-5 y A549. Los resultados, mostrados en la Figura 6b, muestran que la expresión de E1b de TAV-255 disminuyó en células MRC-5 comparado con Ad5. Onyx-015, que tiene una deleción 30 de E1b-55k, no tiene una expresión de E1b detectable. Por el contrario, E1b-55k se expresa a niveles similares en células tumorales a partir de ambos Ad5 y TAV-255 y está ausente en las líneas celulares tumorales infectadas con Onyx-015. Estos resultados muestran la atenuación funcional de la expresión de E1b en células no transformadas mientras que la expresión de E1b es mantenida a aproximadamente los niveles en células tumorales tipo salvaje.

Los inventores evaluaron el efecto de TAV-255 en la viabilidad celular. Se infectaron células MRC-5, A549, HeLa y 35 CaLu-6 con Ad5 tipo salvaje, Onyx-015, y TAV-255. El Ad5 tipo salvaje mató de forma eficaz células MRC-5 en este ensayo; aunque ambos Onyx-015 y TAV-255 mostraron una mínima citotoxicidad hacia las células MRC-5 (Figura 7a). Por el contrario, la citotoxicidad de TAV-255 fue comparable al Ad5 tipo salvaje en tres líneas celulares tumorales (A549, HeLa y CaLu-6) y fue significativamente mejor que el Onyx-015 en ambas células A549 y HeLa (Fig. 7b). Una fotomicrografía de células MRC-5 infectadas con virus tipo salvaje y TAV-255 (Fig. 7c) muestra 40 esencialmente una completa eliminación celular de células MRC-5 con Ad5 tipo salvaje mientras se observa una mínima citotoxicidad con TAV-255, 6 días después de la infección. Se observó una completa citotoxicidad para células A549 infectadas con tanto Wt Ad5 como TAV-255 (datos no mostrados).

El ONYX-015 es el prototipo de un virus oncolítico y se han realizado análisis clínicos del mismo en una variedad de malignidades incluyendo cánceres de cabeza y cuello, pulmón, colorectal, ovario, pancreático y cerebro. Más de 45 1000 inyecciones intratumorales de ONYX-015 se administraron a pacientes con tumores de cabeza y cuello y más de 200 infusiones se administraron dentro de la arteria hepática de pacientes con cáncer colorectal metastásico sin que padecieran eventos adversos serios relacionados con el tratamiento (Reid, T. et al., Cancer Res 62(21):6070-6079 (2002); Nemunaitis, J. et al., Gene Ther 8(10):746-759 (2001); Khuri, F. R. et al., Nat Med 6(8):879-885 (2000);Nemunaitis, J. et al., Cancer Gene Ther 10(5):341-352 (2003); Nemunaitis, J. et al., Cancer Gene Ther 50 14(11):885-893 (2007) Reid, T. R. et al., Cancer Gene Ther 12(8):673-681 (2005)). Los efectos secundarios principales fueron síntomas tipo gripe grado I/II incluyendo fiebres y escalofríos. Aunque sea bien tolerado, las velocidades de respuesta objetiva frente a ONYX-015 se restringieron a una minoría de los pacientes. Ya que las velocidades de respuesta objetiva frente a ONYX-015 fueron modestas, los esfuerzos se han dirigido a desarrollar un vector oncolítico con una mejor potencia (Kirn D. Oncogene 19(56):6660-6669 (2000); Li, Y. et al., Clin Cancer 55 Res 11(24 Pt 1):8845-8855 (2005); Johnson, L. et al., Cancer Cell 1(4):325-337 (2002); Hermiston, T. Current opinion in molecular therapeutics 8(4):322-330 (2006)). Varios enfoques se han usado para mejorar la selectividad tumoral y la potencia del virus oncolítico, incluyendo esfuerzos de colocar E1a y E1b bajo el control de distintos promotores heterólogos específicos de tumor. Sin embargo, estos vectores han sufrido una transcripción parcial de E1a y E1b en células no transformadas, recombinación y un bajo potencial replicativo comparado con Ad5 tipo 60 salvaje.

Para superar algunas de las limitaciones inherentes en el uso de promotores heterólogos que controlan la expresión de E1a y E1b, los inventores centraron su atención en el análisis del promotor y del potenciador adenoviral endógeno para E1a. Los inventores encontraron que el inicio de mARN de E1A y la expresión de proteína aparecía más pronto y era más abundante en líneas celulares tumorales que en células epiteliales respiratorias. La expresión temprana y abundante de E1a se observó en una variedad de líneas celulares tumorales incluyendo líneas celulares 5 de cáncer de pulmón, páncreas, cervical y próstata. La proteína E1A pudo ser detectada mediante transferencia Western de 6 a 8 horas después de la infección en el panel de células tumorales analizado. La abundancia de la expresión de E1a de 6 a 8 horas después de la infección fue similar a la expresión de E1a observada en dos líneas de células epiteliales respiratorias no transformadas 24 horas después de la infección.

Para evaluar además la expresión temprana y abundante de E1a en células tumorales, los inventores estudiaron la 10 expresión de E1a a partir del virus con varias deleciones en la secuencia de ADN secuencia arriba del sitio de inicio de E1a. Las secuencias del potenciador potencian la transcripción independiente de la posición o la orientación y se han descrito en una variedad de sistemas incluyendo los adenovirus (Hearing, P. et al., Cell 33(3):695-703 (1983)). Se identificaron secuencias centrales de 200 a 300 nucleótidos secuencia arriba del sitio de inicio de E1a que podrían potenciar la expresión de E1a independientemente de la posición u orientación (Hearing, P. et al., Cell 15 33(3):695-703 (1983)). Estudios anteriores han demostrado que las deleciones de esta secuencia del potenciador central dieron como resultado de 2 a 5 veces una disminución en la expresión de mARN en células HeLa 5 horas después de la infección; sin embargo, estas deleciones tuvieron poco impacto en la expresión de mARN 24 horas después de la infección y ningún impacto en la replicación viral (Hearing, P. et al., Cell 33(3):695-703 (1983)). Sin embargo, el análisis previo del potenciador de E1a se realizó en células tumorales, principalmente células HeLa, en 20 vez de en células epiteliales respiratorias, las células huéspedes naturales para las infecciones de tipo 5 adenovirales. Los sitios de unión del factor de transcripción específico dentro de la región del potenciador Ad5 incluyen 2 sitios de unión para E2F1 y 5 sitios de unión para Pea3. Ya que estos factores de transcripción comúnmente se sobreexpresan en células tumorales las funciones importantes del potenciador de E1a pueden haberse ocultado por el análisis del potenciador en el contexto de tumores celulares más que en células epiteliales 25 respiratorias.

Los inventores han extendido el análisis de la región del potenciador de adenovirus comparando el impacto de deleciones dentro de la región secuencia arriba del sitio de inicio de E1a en la expresión de E1a en células tumorales y en células epiteliales respiratorias no transformadas. Consistente con las publicaciones previas, los inventores encuentran que las deleciones de grandes regiones de la región de E1a del potenciador tienen poco 30 impacto en la expresión de E1a y en la replicación viral en líneas celulares tumorales (Hearing, P. et al., Cell 33(3):695-703 (1983)). Sin embargo, los inventores ahora muestran que varias deleciones, incluyendo las deleciones fuera de la región del potenciador previamente definida, tienen un impacto significativo en la expresión de E1a y la replicación viral en células epiteliales respiratorias no transformadas. En particular, los inventores encontraron que la deleción de una secuencia de 50 pares de base del potenciador de Ad5 nativo que elimina un sitio de E2F1 y dos 35 sitios de Pea3 dio como resultado la supresión marcada de mARN de E1a y E1b y la expresión de proteína en células epiteliales respiratorias; sin embargo, esta deleción tuvo poco impacto en la expresión de E1a en un panel de líneas celulares tumorales. Los inventores además muestran que la deleción de una secuencia de 99 nucleótidos secuencia arriba del potenciador de E1a propuesto reduce sustancialmente la expresión de E1a en células epiteliales respiratorias no transformadas mientras que tiene un impacto mínimo en la expresión de E1a a partir de 40 las líneas celulares tumorales analizadas. Esta región abarca los dos sitios de Pea3 más alejados secuencia arriba del sitio de inicio de E1a. Por el contrario, una pequeña deleción que elimina el sitio de Pea-3 más próximo al sitio de inicio de E1a, no tuvo ningún impacto significativo en la expresión de E1a en las células tumorales o en las células epiteliales respiratorias. Además, una deleción de 101 nucleótidos de las regiones entre el potenciador y el sitio de inicio de E1a da como resultado un incremento del 22 al 30 % en la expresión de E1a en células epiteliales 45 respiratorias sin impactar significativamente la expresión de E1a de las células tumorales. Estos resultados muestran que las deleciones que implican la región del potenciador tienen profundos efectos en la expresión de E1a en células epiteliales respiratorias que no se observan en células tumorales. Por tanto, la región del potenciador de E1a adenoviral es más compleja y se extiende en una región mayor cuando se analiza en células epiteliales respiratorias en vez de en células tumorales. 50

La deleción de 50 nucleótidos de la extensión de la región de -255 a -305 abarca dos sitios de unión para Pea3 y un sitio de unión para E2f1 (Bruder, J. T. et al., J Virol 65(9):5084-5087 (1991)). Estos factores de transcripción se sobreexpresan comúnmente en una amplia variedad de tumores. E2f es un factor de transcripción específico de secuencia que forma un complejo con Rb y desempeña una función crítica en la regulación de la progresión del ciclo celular y de la diferenciación celular. La fosforilación de RB por quinasas dependientes de ciclina da como resultado 55 la liberación de E2F1 y la activación transcripcional de genes implicados en la replicación, reparación y recombinación del ADN (Johnson, D. G. et al., Front Biosci 3:d447-448 (1998); Muller, H. et al., Biochimica et biophysica acta 1470(1):M1-12 (2000)). La desregulación de la ruta de RB ocurre comúnmente en malignidades y alcanza el 100% en varios tumores incluyendo el cáncer de pulmón (Hanahan, D. et al., Cell 100(1):57-70 (2000)). Dos sitios de unión para E2F1 ocurren en la región de control para E1a. La deleción que acompaña los dos sitios de 60 Pea3 más alejados del sitio de inicio de E1a tuvo solo un impacto moderado en la expresión de E1a. Sin embargo, la deleción del sitio de E2F distal junto con los dos sitios de Pea3 inmediatamente flanqueantes del sitio de E2F1 da como resultado una reducción significativa en la expresión de E1a, E1b y la replicación viral en las células no

transformadas. Estos resultados sugieren que E2F1 y/o los sitios de Pea3 localizados dentro de este fragmento de 50 pares de bases son los sitios dominantes para el control de E1a en células respiratorias o que los factores adicionales impactados por esta deleción determinan la expresión de E1a.

Pea3 es un miembro de la familia del factor de transcripción de Ets altamente conservado (de Launoit, Y. et al., Biochimica et biophysica acta 1766(1):79-87 (2006)). Pea3 se expresa normalmente durante la embriogénesis y está 5 implicado en eventos de remodelación de los tejidos, de diferenciación y proliferación celular. Pea3 activa transcripcionalmente una variedad de genes incluyendo las metaloproteasas de matriz (MMP), cuya función es degradar la matriz extracelular durante los eventos de remodelación normales. Pea3 se sobreexpresa comúnmente en una variedad de cánceres incluyendo cáncer de mama, pulmón, colon, ovario e hígado donde la sobreexpresión de las MMP se piensa que promueve la metástasis (de Launoit, Y. et al., Adv Exp Med Biol 480:107-116 (2000); 10 Hakuma, N. et al., Cancer Res 65(23):10776-10782 (2005); Boedefeld, W. M., 2ª et al., Mol Carcinog 43(1):13-17 (2005); Cowden, D. et al., Mol Cancer Res 5(5):413-421 (2007)). Estudios previos han demostrado que la unión cooperativa entre los sitios de Pea3 incrementa la expresión de E1a (Bruder, J. T. et al., J Virol 65(9):5084-5087 (1991)). Por lo tanto, el impacto de los sitios de unión del factor de transcripción específico y la cooperatividad entre estos sitios de unión puede ser más evidente en células no transformadas donde los factores de transcripción son 15 limitantes que en células tumorales donde la abundante expresión de factores de transcripción puede anular la necesidad de unión cooperativa que potencia la transcripción de E1a. La relativa importancia de los diversos sitios de unión del factor de transcripción, solo y como un complejo, se está investigando más.

Los resultados de los investigadores muestran además que la expresión selectiva de tumor de la unidad de transcripción de E1b puede lograrse mediante la modificación del potenciador de E1a. El promotor de E1b es un 20 promotor relativamente simple comprendido en el cuadro de TATA y un cuadro de GC, que se une al factor de transcripción específico de la secuencia SP-1. Ambos dominios son necesarios para la expresión eficaz de E1b (Wu, L. et al., Nature 326(6112):512-515 (1987)). Previos estudios han demostrado que E1b se expresa como un transcrito de lectura rápida de E1a (Montell, C. et al., Mol Cell Biol 4(5):966-972 (1984)). La terminación de la transcripción de la lectura rápida de E1b a partir de E1a por la inserción de la secuencia de terminación de la beta-25 globina dio como resultado una expresión notablemente menor de E1b (Maxfield, L. F. et al., J Virol 71(11):8321-8329 (1997); Falck-Pedersen, E. et al., Cell 40(4):897-905 (1985)) mientras que la inserción de un promotor fuerte, tal como el promotor CMV obvia la necesidad de la transcripción de lectura rápida. Los hallazgos de los inventores muestran que la expresión de E1b puede ser atenuada de forma coordinada en las células epiteliales respiratorias no transformadas junto con E1a debido a la pequeña deleción en el potenciador de E1a. Estos resultados son 30 consistentes con la transcripción de lectura rápida ineficaz de E1b en células no transformadas. Por el contrario, ambos E1a y E1b se expresan a casi niveles tipo salvaje en células A549, indicando la transcripción de lectura rápida eficaz a partir de E1a en las células tumorales.

Ya que E1b 55k es una proteína multifuncional crítica para la replicación viral, la atenuación selectiva de tumor de la expresión de esta proteína, al contrario que la deleción de este gen, puede mejorar la potencia de este virus en 35 células tumorales mientras se retiene un alto grado de atenuación en células no transformadas debido a la menor expresión de ambos E1a y E1b. Los inventores compararon la actividad oncolítica de TAV-255 frente a ONYX-015 en células tumorales y normales y encontraron que TAV-255 es más potente en la inducción de la lisis celular en células tumorales que ONYX-015 mientras se retiene un nivel similar de atenuación como ONYX-015 en células no transformadas. 40

La deleción de sitios de E2F presentes en -225 y -287, respecto al sitio de inicio de transcripción de E1a denominado como +1, no tuvo ningún impacto en la expresión de E1a en células transformadas (Bruder, J. T., y Hearing, P. (1989). “Nuclear factor EF-1A binds to the adenovirus E1A core enhancer element and to other transcriptional control regions”. Mol Cell Biol 9: 5143-5153). Los sitios de unión para Pea3 se localizan en -200, -270, -300, -344 , -386 y la deleción de los sitios de unión de Pea3 I , II, y III solo tuvieron un impacto mínimo en la 45 expresión de E1a en células HeLa (Hearing, P., y Shenk, T. (1983). “The adenovirus type 5 E1A transcriptional control region contains a duplicated enhancer element”. Cell 33: 695-703). Previos estudios definieron la importancia de la región de control transcripcional de E1a en líneas celulares transformadas. Sin embargo, las células tumorales difieren significativamente de las células no transformadas, el huésped natural para el virus. Las células tumorales están proliferando activamente y tienen una expresión anormal de muchas rutas de transducción de señal, 50 reguladoras celulares y apoptóticas. Varios factores de transcripción incluyendo E2F y Pea3, que se unen a la región del control de la transcripción de E1a, se expresan de forma aberrante en células tumorales (de Launoit, Y., et al. (2000). “The PEA3 group of ETS-related transcription factors. Role in breast cancer metastasis”. Adv Exp Med Biol 480: 107-116; Hanahan, D., y Weinberg, R. A. (2000). “The hallmarks of cancer”. Cell 100: 57-70). Expresión de E1a. Por tanto, el control del estudio de la transcripción de E1a podría estar afectada en células tumorales por la 55 expresión alterada de estos factores de transcripción.

La comprensión de la función del potenciador de E1a en células tumorales in vitro puede ser más reveladora cuando la regulación de E1a en células tumorales se compara con la regulación de E1a en células humanas no transformadas. Se han usado ampliamente fibroblastos diploides humanos (MRC-5, WI-38 y IMR-90) durante varias décadas como líneas celulares estándar de laboratorio en el desarrollo de vacunas, virología diagnóstica y los 60 laboratorios de investigación cultivan y estudian un amplio rango de virus incluyendo adenovirus, virus del herpes, citomegalovirus y muchos otros (Friedman, H. M., y Koropchak, C. (1978). “Comparison of WI-38, MRC-5, and IMR-

90 cell strains for isolation of viruses from clinical specimens”. J Clin Microbiol 7: 368-371). Los inventores hicieron una serie de deleción en la región de control transcripcional de E1a de Had-5 para determinar la función del elemento de ADN que se une a Pea3 y E2F y se comparó la expresión de E1a en un panel de líneas celulares transformadas y no transformadas. Los inventores proponen que la secuencia del potenciador de E1a, cuando se evalúa en el contexto de células no transformadas, es mayor y más complejo que la que fue previamente publicada. 5 Los inventores discuten el potencial del virus mutante de HAd-5 como un potente agente oncolítico.

III. Investigación de deleciones del sitio de unión

Se prepararon mutantes de deleción de la región de control transcripcional de E1a de HAd-5 y se investigó la expresión de E1a en células no transformadas y transformadas. La región de control de la transcripción de HAd-5 contiene sitios de unión para múltiples factores de transcripción, muchos de los cuales se sobreexpresan en células 10 cancerígenas. Por lo tanto, el uso de células transformadas para estudiar la transcripción de E1a afectará a la expresión aberrante de varios factores de transcripción que influyen a estas secuencias regulatorias críticas. Para superar esta limitación, los inventores han utilizado líneas celulares epiteliales humanas de pulmón con crecimiento frenado para estudiar la expresión génica de E1a y compararon estos resultados con la expresión de E1a en un panel de líneas celulares tumorales. Varios mutantes de deleción se generaron dirigiéndose específicamente a sitios 15 de unión de Pea3 y E2F. La Figura 8a muestra los sitios de unión para Pea3 y E2F y mutantes de deleción que abarcan estos sitios de factores de transcripción. Estos mutantes de deleción se prepararon en los plásmidos y se introdujeron dentro del genoma de HAd-5 a través de la recombinación de homólogos. Los virus mutantes de HAd-5 que llevaban estas mutaciones se usaron para infectar células MRC-5 (pulmonares no transformadas) y A549 (pulmonares transformadas) y entonces se analizaron para la expresión de E1a génica mediante transferencia 20 Western (Figura 8b) y Q-PCR (Figura 8c). En células no transformadas, dl309-6, que elimina los sitios de Pea3 número IV y V, mostró una expresión reducida de la proteína de E1a comparado con Wt HAd-5 (d1309). El mutante de deleción, d187, que elimina el sitio de Pea3 número I y d1275 que elimina el sitio de unión de E2F no mostraron diferencias en la expresión de E1a comparado con Wt HAd-5. TAV-255, que elimina el sitio de Pea3 número II y III junto con el E2F localizado entre los dos sitios de Pea3, y d155, que elimina el sitio de Pea3 número II, no mostraron 25 ninguna expresión detectable de proteína E1A 24 horas después de la infección (h.d.i.). Una banda minoritaria presente en las bandas correspondientes a TAV-255 y d155 es similar a la banda presente en la línea de control, sugiriendo la reacción no específica con antisuero de E1a. La Q-PCR relativa realizada a partir de mARN extraído 24 h.d.i. sugirió que el d1309-6 expresaba 2,5 veces menos de mARN de E1A comparado con Wt HAd5 mientras que la deleción de d187 no tuvo un efecto significativo en la expresión de E1a génica. El mutante dl275 mostró un 20 por 30 ciento de reducción en mARN de E1A comparado con Wt HAd-5. El mutante de deleción, d155, mostró una reducción de 10 veces en la expresión de mARN de E1a mientras que TAV-255 mostró una reducción de 33 veces en la expresión de mARN de E1a comparado con Wt HAd-5.

Los inventores compararon la expresión del mARN de E1A y la proteína en células A549 infectadas con estos virus mutantes (como se describe en la Figura 8a) 8 y 24 h.d.i. Estos resultados, mostrados en la Figura 9a, muestran una 35 pequeña disminución en la expresión de proteína de E1a 8 h.d.i. mientras que estos virus no mostraron ninguna diferencia significativa en la expresión de E1a después de 24 h.d.i. Usando el análisis Q-PCR d187, TAV-255, d155, y d1275 mostraron aproximadamente una reducción de 2 veces en la expresión de E1a génica mientras que el virus mutante d1309-6 mostró un incremento del 20 por ciento en la expresión de E1a en comparación con Wt HAd-5 8 h.d.i. (Figura 9b). 40

La Q-PCR realizada 24 h.d.i. no mostró ninguna diferencia en la expresión de E1a génica comparado con Wt HAd-5 (datos no mostrados). A partir de estos resultados es evidente que el mutante de deleción del potenciador de E1a tuvo un impacto mayor en la expresión de E1a génica cuando se estudió en el contexto de células MRC-5 comparado con las células A549. Para entender más la función de los nucleótidos presentes dentro de TAV-255, los inventores hicieron varias deleciones de 6 bp dentro de TAV-255 y reconstruyeron estas mutaciones en el genoma 45 de HAd-5 y estudiaron la expresión de E1a en líneas celulares no transformadas.

El mutante de deleción, TAV-255, abarca sitios de unión del factor de transcripción de dos pea3 y un E2F. Para caracterizar la función de cada elemento regulador, los inventores hicieron la deleción de los elementos de Pea3 y E2F individuales y reconstruyeron estas mutaciones en el genoma de HAd-5 (Figura 10a). Una deleción de 6 bp (d1220) aleatoria entre dos sitios de Pea3 también se generó como control. La expresión de la proteína de E1a se 50 determinó para los virus mutantes y Wt HAd-5 48 h.d.i. en células MRC-5 (Figura 10b). Se observaron perfiles de expresión similar de E1a para TAV-255 y d1200+230, que tienen deleción de los sitios de unión de Pea3 número II y III. El mutante de deleción de E2F (dl212) y el mutante de deleción control (dl220) no tuvieron ningún efecto significativo en la expresión de E1a comparado con Wt HAd-5. Las células infectadas con el virus mutante dl200+230, mostró una reducción de 50 veces en el mARN de E1A en comparación con Wt HAd-5 24 h.d.i. en el 55 análisis Q-PCR (Figura 10c). El TAV-255, que tiene una deleción del sitio de Pea3 número II + III junto con el sitio de E2F tuvo una reducción de 33 veces en la expresión de E1a. El mutante de deleción, d1212, que eliminó el sitio de E2F, tuvo un 20 por ciento de disminución en la expresión génica de E1a. El d1220 no mostró ninguna diferencia significativa en la expresión de E1a comparado con Wt HAd-5.

Para evaluar además la función de los sitios de E2F presentes en el elemento potenciador de E1a y su impacto en la 60 expresión de E1a, los inventores generaron la mutación única y doble de los sitios de E2F y estudiaron el impacto de

estas mutaciones en la expresión de E1a. El elemento del potenciador del adenovirus contiene dos sitios de unión para el factor de transcripción de E2F en -225 y -287 (Figura 11A). El sitio de unión de E2F Individual así como ambos sitios juntos se mutaron y reconstruyeron en el genoma de HAd-5 por recombinación homóloga. La expresión de proteína de E1a se estudió en células MRC-5 infectadas con el virus mutante 24 h.d.i. (Figura 11B). Estos virus mutantes no mostraron ninguna diferencia significativa en la expresión génica de E1a en comparación con Wt HAd-5 5, sugiriendo que E2F no desempeña una función significativa en la expresión génica de E1a en células MRC-5 de crecimiento frenado. El análisis Q-PCR realizado 24 h.d.i. mostró de 20 a 30 por ciento de reducción con los virus mutantes d1212 así como con los dl212+275, mientras que el virus mutante dl275 no mostró ninguna reducción en la expresión génica de E1a en comparación con Wt HAd-5 (Figura 11C). Los estudios realizados con estos virus mutantes en la línea celular (A549) transformada no dio como resultado ningún impacto significativo en la expresión 10 de E1a (datos no mostrados).

Los inventores analizaron la expresión de E1a y la citotoxicidad exhibida por el virus mutante d1200+230 en varias células transformadas y no transformadas. El virus mutante dl200+230, que mostró la reducción más alta en la expresión de E1a en la línea celular MRC-5 sin ninguna reducción significativa en las líneas celulares A549 24 h.d.i., se analizó en varias líneas celulares no transformadas para evaluar el impacto de la deleción de los sitios de unión 15 de Pea3 II && III. Estudios realizados en líneas celulares IMR-90 y WI-38 mostraron resultados similares como los obtenidos a partir de células MRC-5 sugiriendo que la reducción de la expresión de E1a no estaba limitada a células MRC-5 pero era similar en otras líneas celulares pulmonares no transformadas. En la línea celular no transformada, el virus d1200+230 no mostró un nivel detectable de expresión de la proteína de E1a 24 h.d.i. Después de 48 h.d.i., el virus mutante sí que mostró bajos niveles de expresión génica de E1a en células MRC-5 y IMR-90 pero no en 20 células WI-38. Al contrario que para el virus mutante, la expresión de Wt HAd-5 E1a podría ser detectada 24 h.d.i. y excedió significativamente la expresión de E1a a partir de los virus mutantes 48 h.d.i. (Figura 12a). Los investigadores también analizaron la expresión del virus mutante en varias líneas celulares transformadas (HeLa, Panc-1 y Calu-6) y no encontraron ninguna diferencia significativa en la expresión de proteína de E1a entre d1200+230 y Wt HAd-5 24 h.d.i. (Figura 12b). Los inventores compararon el impacto de la citotoxicidad de los virus 25 Wt HAd-5, ONYX-015 y dl200+230 en varias líneas celulares transformadas (HeLa, Panc-1, Calu-6, y A549) 4 días después de la infección y en líneas celulares no transformadas (MRC-5) 5 días después de la infección. El virus mutante, dl200+230, mostró un nivel similar de la citotoxicidad comparado con Wt HAd-5 y mostró una eficacia mayor comparado con ONYX-015 en líneas celulares A549 y Calu-6. En líneas celulares no transformadas, dl200+230 mostró una citotoxicidad muy baja comparada con HAd-5 y exhibió un nivel muy similar de seguridad 30 comparado con ONYX-015 (Figura 13 A y B).

La región control de la transcripción de HAd-5 E1A contiene sitios de unión para varios factores de transcripción que se expresan de forma aberrante en células tumorales incluyendo dos sitios de unión para E2F y cinco sitios de unión para Pea3 [19, 20]. Los estudios previos han buscado definir el dominio del potenciador para E1a; sin embargo, estos estudios se realizaron en células malignas en vez de en células no transformadas, el huésped natural para las 35 infecciones adenovirales. Para definir más precisamente el potenciador de E1 a, se generaron mutantes de deleción de E2F y Pea3 y se evaluó su impacto en la expresión de E1a en células no transformadas.

El Pea3 es un factor de transcripción comúnmente sobreexpresado en muchas líneas celulares tumorales y se asocia con un fenotipo invasivo y metastásico (de Launoit, Y., et al. (2000). “The PEA3 group of ETS-related transcription factors. Role in breast cancer metastasis”. Adv Exp Med Biol 480: 107-116). Los mutantes de deleción, 40 TAV-255, que eliminan sitios de unión de Pea3 II & III así como el sitio de E2F distal mostró una reducción de 33 veces en la expresión de mARN de E1a 24 horas después de la infección. Por el contrario, el mutante de deleción, dl200+230, que elimina los sitios de unión de Pea3 II y III pero retiene el sitio de E2F distal, mostró una reducción de 50 veces en la expresión de mARN de E1a en células no transformadas 24 horas después de la infección. Estos hallazgos muestran que los sitios de unión del factor de transcripción de Pea3 número II y III tienen una función 45 principal en la modulación de la expresión de E1a en células no transformadas. La expresión de la proteína de E1a a las 24 horas asemejó los hallazgos para mARN de E1A. Sorprendentemente, dl200+230, que tiene deleciones de sitios de unión de Pea3 número II y III pero retiene el sitio de E2F, mostró la reducción más alta en la expresión de E1a. Estos resultados sugieren que el sitio de E2F es mínimo en la expresión de E1a y sugiere la posibilidad de que el sitio de E2f puede actuar como represor durante el periodo inicial de la expresión de E1a. De hecho, en los 50 ensayos de transfección, los inventores han encontrado que las mutaciones del punto de inactivación de sitios de E2F dieron como resultado una mayor expresión de E1a favoreciendo una función represora para E2F en vez de una activación transcripcional de E1a por E2F (datos no mostrados). La posibilidad de que E2F funcione como un represor transcripcional bajo condiciones específicas ha sido sugerida anteriormente (Weintraub, S. J., Prater, C. A., y Dean, D. C. (1992). “Retinoblastoma protein switches the E2F site from positive to negative element”. Nature 358: 55 259-261).

Los inventores evaluaron la importancia relativa de cada uno de los sitios de Pea3 en la transcripción de E1a en células no transformadas y transformadas. La deleción del sitio de Pea3 I (d187) tiene un impacto mínimo en la expresión de E1a en células no transformadas. Por el contrario, la deleción de los sitios de Pea3 11 y III dio como resultado una disminución de aproximadamente 10 y 20 veces en la expresión de mARN de E1a en células no 60 transformadas respectivamente. La deleción de ambos sitios de Pea3 II y III dio como resultado una reducción de 50 veces en la expresión de mARN de E1a en células no transformadas. Además de la menor expresión de mARN de E1a, la expresión de la proteína E1A también disminuye significativamente debido a la deleción de estos sitios de

unión de Pea3. La proteína E1A está por debajo del nivel de detección en un panel de 3 líneas celulares no transformadas 24 horas después de la infección y es detectable pero disminuye de forma severa 48 horas después de la infección. Estos resultados sugieren que estos sitios de Pea3 son de importancia crítica respecto a la expresión eficaz de E1a en células no transformadas. Sin embargo, estos sitios de Pea3 no son los determinantes exclusivos de la expresión de E1a ya que puede ocurrir una expresión final a bajos niveles de E1a en células no transformadas. 5 Los hallazgos de los inventores indican además que la deleción de ambos sitios de Pea3 II y III tienen un impacto mínimo en la expresión de E1a en un panel de líneas celulares tumorales 24 horas después de la infección. Los resultados de los inventores en las líneas celulares tumorales son consistentes con los estudios previos demostrando que la deleción del sitio de Pea3 número I o III solo reduce la transcripción del gen de E1a en solo 2-3 veces 5 h después de la infección (Hearing, P., y Shenk, T. (1983). “The adenovirus type 5 E1A transcriptional 10 control region contains a duplicated enhancer element”. Cell 33: 695-703). En estos estudios previos, la expresión de proteína de E1a en los puntos de tiempo posteriores no fue determinada.

E2F es un factor de transcripción que se sobreexpresa comúnmente en células tumorales debido a la desregulación de la ruta de Rb. La fosforilación de Rb por quinasas dependientes de ciclina da como resultado la liberación de E2F, que luego se une a las unidades reguladoras transcripcionales e induce que los genes medien la entrada en S-15 fase. Los resultados de los inventores muestran que la deleción de uno o ambos sitios de unión de E2F localizados secuencia arriba del sitio cap de E1a tuvo un impacto mínimo en la expresión de E1a en líneas celulares no transformadas. Específicamente, la deleción del sitio de E2F más próximo al sitio cap, de -218 a -225, no tuvo ningún impacto en el mARN de E1A o en la expresión de la proteína. La deleción del sitio de E2F más distal al sitio cap, de -281 a -287 dio como resultado una reducción del 30% en la expresión de mARN pero no tuvo un impacto 20 significativo en la expresión de proteína de E1a como se determina por análisis de transferencia Western. La deleción de ambos sitios dio como resultado una reducción del 20% en la expresión de mARN de E1a pero no hubo ninguna diferencia detectable en los niveles de proteína de E1A comparado con el control. Estos resultados muestran que la deleción de los dos sitios de unión del factor de transcripción de E2F localizados secuencia arriba del sitio cap de E1a tienen solo una función menor en la expresión de E1a en células no transformadas. Consistente 25 con los estudios anteriores, los inventores encuentran que la deleción de ambos sitios de E2F mostraron un impacto mínimo en la expresión de E1a en un panel de líneas celulares tumorales (datos no mostrados) (Bruder, J. T., y Hearing, P. (1989). “Nuclear factor EF-1A binds to the adenovirus E1A core enhancer element and to other transcriptional control regions”. Mol Cell Biol 9: 5143-5153).

El E1a regula la expresión génica adenoviral inicial y es esencial para la multiplicación viral eficaz (Hearing, P., y 30 Shenk, T. (1983). “The adenovirus type 5 E1A transcriptional control region contains a duplicated enhancer element”. Cell 33: 695-703). Ya que la deleción de los sitios de Pea3 II y III da como resultado una expresión severamente atenuada de E1a en un panel de células no transformadas pero tiene poco impacto en la expresión de E1a en un panel de células tumorales, estos mutantes de deleción del potenciador pueden ser útiles como virus oncolíticos. Los inventores evaluaron la actividad citolítica de dl200+300 (doble deleción de los sitios de Pea3 II y III) en células 35 tumorales y no transformadas. La actividad citolítica de dl200+300 es similar a la del virus control en un panel de líneas celulares tumorales mientras que muestran una citotoxicidad mínima en las células no transformadas (Figura 13a y b). Estudios previos han demostrado que dl1520 (ONYX-015) está significativamente atenuado cuando se compara con el virus tipo salvaje en una variedad de líneas celulares tumorales. La menor capacidad para que dl1520 se replique en células tumorales se ha vinculado al hecho de que E1b-55 es una proteína multifuncional. 40 Además de unirse e inactivar p53, E1b-55k está implicado en el transporte de mARN a través de la membrana nuclear. En ausencia de un transporte eficaz de mARN, dl150 se replica de forma ineficaz en una variedad de líneas celulares tumorales. Los estudios clínicos entre pacientes con una variedad de cánceres, principalmente cáncer de de cabeza y cuello y colorectal, han mostrado respuestas clínicas significativas en una minoría de pacientes y el desarrollo clínico de ONYX-015 se interrumpió. La falta de potencia del virus debido a la deleción de una proteína 45 multifuncional crítica puede haber limitado la efectividad clínica de tal virus oncolítico. Los inventores se han centrado en el desarrollo de un virus oncolítico determinando los sitios de unión del factor de transcripción específicos que son críticos para una expresión eficaz de E1a y la replicación de Had5 en células respiratorias no transformadas. La deleción de los sitios de Pea3 del potenciador de E1a endógeno tiene varias ventajas cuando se desarrolla un virus oncolítico. Primero, se han introducido secuencias de ADN no heterólogas para lograr la 50 expresión de E1a selectiva de tumor. Segundo, E1a es el primer gen expresado después de la infección de células con adenovirus y este gen, que regula la expresión génica del virus inicial subsecuente, se expresa a aproximadamente los niveles observados para infecciones adenovirales control. Tercero, el gen de E1b-55k multifuncional se deja intacto.

Las Figuras 14 y 15 muestran fotomicrografías de células normales (WI-38) y células tumorales (A549) células 55 infectadas con Ad5 o con el virus de deleción del promotor (TAV-255). En células normales, no hay evidencia de efectos citolíticos virales mediados hasta 7 días después de la infección con TAV-255. Por el contrario, se observa muerte celular extensiva para células normales infectadas con Ad5. En las células tumorales (A549), se observa muerte celular tumoral extensiva con ambos Ad5 y TAV-255 3 días después de la infección. Por tanto, TAV-255 es selectivo para la lisis de células tumorales, moderando las células normales. 60

En resumen, los inventores han determinado que el mecanismo de la transcripción de E1a es claramente diferente entre células no transformadas y transformadas. Además, los inventores muestran que, en los estudios en células no transformadas, el potenciador de E1a se extiende en una región mayor y es más compleja que la previamente

reconocida. Estos resultados muestran que los sitios de unión del factor de transcripción de Pea3 II y III, pero no los sitios de unión de E2F, son críticos para la expresión eficaz de E1a en un panel de células no transformadas pero no en células transformadas. Estos resultados sugieren que los virus con deleciones selectivas de los dominios de unión del factor de transcripción de Pea3 II y III pueden tener una potente actividad oncolítica.

IV. Secuencia Reguladora Modificada 5

En un aspecto de la descripción, la secuencia reguladora de E1a se modifica. La "secuencia reguladora modificada tiene una deleción, sustitución o adición de uno o más nucleótidos comparado con la secuencia tipo salvaje. En un aspecto de la descripción, la secuencia de un sitio de unión del factor de transcripción puede modificarse para reducir la afinidad para el factor de transcripción, por ejemplo, delecionando una porción del mismo, o insertando una única mutación de punto dentro del sitio de unión. Los mutantes de deleción pueden exhibir una estabilidad 10 potenciada respecto a otras formas mutantes. Preferiblemente, la secuencia reguladora modificada permite la expresión en células neoplásicas, pero atenúa la expresión en células normales. Dichas secuencias reguladoras modificadas pueden emplearse dentro de un vector viral o célula transformada como se describe más abajo.

A. Mutantes de deleción

En un aspecto de la descripción, la secuencia reguladora de E1a modificada (Región de Control Transcripcional de 15 E1a) es un mutante de deleción. Es decir, uno o más nucleótidos han sido delecionados comparado con la secuencia reguladora tipo salvaje.

Los nucleótidos delecionados pueden ser contiguos, formando por medio de ello una región delecionada única. En este caso, la deleción total es la misma que la región delecionada. En otra realización, la deleción es no contigua. En un aspecto de la descripción, la deleción total comprende uno, dos, tres, cuatro o más regiones delecionadas. En un 20 aspecto de la descripción, la deleción total comprende tres regiones delecionadas. En otro aspecto de la descripción, la deleción total comprende dos regiones delecionadas. A menos que se mencione otra cosa, el término genérico "deleción" se usa para describir las características de la "deleción total" y/o alguna o más "regiones delecionadas."

En un aspecto de la descripción, la deleción (la deleción total y/o cualquier región delecionada) es de aproximadamente 1 a aproximadamente 400, de aproximadamente 1 a aproximadamente 300, de aproximadamente 25 1 a aproximadamente 200, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100, de aproximadamente 50 a aproximadamente 100, de aproximadamente 25 a aproximadamente 75, de aproximadamente 5 a aproximadamente 50, de aproximadamente 5 a aproximadamente 25, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 nucleótidos. En otro aspecto de la descripción, la deleción es de aproximadamente 100, aproximadamente 90, aproximadamente 50, aproximadamente 30, aproximadamente 10 o aproximadamente 5 nucleótidos. En otro aspecto de la descripción, la 30 deleción es de 250 nucleótidos o menor, 150 o menor, 100 o menor, 90 o menor, 50 o menor, 30 o menor, 20 o menor, 15 o menor, 12 o menor, 11 o menor, 10 o menor, 9 o menor, 8 o menor, 7 o menor, 6 o menor ó 5 ó menor.

En un aspecto de la descripción, al menos un nucleótido es delecionado en la región de -255 a -393, de -304 a -393, de -255 a -305, de -265 a -270 o de -293 a -299 de la secuencia reguladora de E1a.

En un aspecto de la descripción, al menos un nucleótido en la región del potenciador (de -141 a -305) es retenido 35 (es decir, no delecionado). En otro aspecto de la descripción, al menos un nucleótido próximo al sitio de Pea3 II (de -1 a -255) es retenido. En todavía otro aspecto de la descripción, al menos un nucleótido distal al sitio de Pea3 V (de -395 a -498) es retenido. En otro aspecto de la descripción, al menos un nucleótido es retenido en uno de los siguientes intervalos: de -1 a -255, de -141 a -305 y de -395 a -498.

Como se describe anteriormente, Pea3 y E2F son factores de transcripción que se unen a la secuencia promotora. 40 La secuencia reguladora de E1a contiene cinco sitios de unión de Pea3, denominados Pea3 I, Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV, y Pea3 V, donde Pea3 I es el sitio de unión de Pea3 más próximo al sitio de inicio de E1a, y Pea3 V es el más alejado. La secuencia reguladora de E1a también contiene dos sitios de unión de E2F, denominados por ello E2F I y E2F II, donde E2F I es el sitio de unión E2F más próximo al sitio de inicio de E1a, y E2F II está más alejado. A partir del sitio de inicio de E1a, los sitios de unión se distribuyen: Pea3 I, E2F I, Pea3 II, E2F II, Pea3 III, Pea3 IV, y 45 Pea3 V.

En un aspecto de la descripción, al menos uno de estos siete sitios de unión, o una porción funcional de los mismos, es delecionada. Una "porción funcional" es una porción del sitio de unión que, cuando es delecionada, disminuye la funcionalidad, por ejemplo, la afinidad de unión del sitio de unión frente a su factor de transcripción respectivo (Pea3 o E2F). En un aspecto de la descripción, uno o más sitios de unión enteros son delecionados. En otro aspecto de la 50 descripción, una porción funcional de uno o más sitios de unión es delecionada. Un "sitio de unión delecionado" abarca ambas la deleción de un sitio de unión entero y la deleción de una porción funcional. Cuando dos o más sitios de unión se delecionan, puede usarse cualquier combinación de la deleción del sitio de unión entero y deleción de la porción funcional.

Por otra parte, en algunos aspectos de la descripción, al menos uno de los sitios de unión, o una porción funcional 55 de los mismos, es retenido (por ejemplo, no delecionado de) en la secuencia reguladora de E1a. Al retener al menos una porción funcional del sitio de unión, la afinidad de unión frente al factor de transcripción respectivo es mantenida

sustancialmente. Un "sitio de unión retenido" abarca retener un sitio de unión entero y retener una porción funcional del mismo. Cuando dos o más sitios de unión se retienen, puede usarse cualquier combinación de retención de los sitios de unión enteros y retención de las porciones funcionales.

En un aspecto de la descripción, al menos un sitio de unión de Pea3, o una porción funcional del mismo, es delecionada. El sitio delecionado de unión de Pea3 puede ser Pea3 I, Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV, y/o Pea3 V. En un 5 aspecto de la descripción, el sitio delecionado de unión de Pea3 es Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV, y/o Pea3 V. En otro aspecto de la descripción, el sitio delecionado de unión de Pea3 es Pea3 IV y/o Pea3 V. En otro aspecto de la descripción, el sitio delecionado de unión de Pea3 es Pea3II y/o Pea3 III. En otro aspecto de la descripción, el sitio delecionado de unión de Pea3 es ambos Pea3 II y Pea3 III.

En otro aspecto de la descripción, el sitio de unión de Pea3 I, o una porción funcional del mismo, es retenido. 10

En un aspecto de la descripción, al menos un sitio de unión de E2F, o una porción funcional del mismo, es delecionada.

En otro aspecto de la descripción, al menos un sitio de unión de E2F, o una porción funcional del mismo, es retenido. En un aspecto de la descripción, el sitio de unión de E2F retenido es E2F I y/o E2F II. En otro aspecto de la descripción, el sitio de unión de E2F retenido es E2F II. 15

En otro aspecto de la descripción, la deleción total consiste esencialmente en uno o más de Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV, y/o Pea3 V, o porciones funcionales del mismo. En otras palabras, son retenidos otros sitios de unión: los sitios de Pea3 restantes y ambos sitios de unión de E2F.

En un aspecto de la descripción, el mutante de deleción es dl309-6, dl340-12, TAV-255, dl87, dl55, dl275, dl200, dl212, dl220, dl230, dl200+230, o dl212+275. En un aspecto de la descripción, el mutante de deleción es dl309-6, 20 TAV-255, dl55, dl200, dl230, o dl200+230. En otro aspecto de la descripción, el mutante de deleción es TAV-255, dl55, dl200, dl230, o dl200+230. En un aspecto de la descripción, el mutante de deleción es TAV-255.

V. Expresión Selectiva de las Isoformas de E1a 12S y 13S

Como se describe anteriormente, las deleciones del potenciador de adenovirus que elimina la región de -305 a -255 (TAV-255) da como resultado la expresión selectiva del tumor de E1a y la replicación preferencial de este virus en 25 células tumorales. Estudios anteriores han demostrado que E1a tiene actividad pro-apoptótica (Flinterman, Gaken et al. 2003) generando la posibilidad de que la expresión selectiva de tumor de E1a podría potenciar la eliminación celular tumoral. La proteína de E1A adenoviral es un complejo de proteínas modificadas por empalme del ARN que da como resultado mARN de 13s, 12s, y 9s principalmente.

Los inventores evaluaron la expresión, replicación viral y actividad lítica de adenovirus modificados que expresan de 30 forma selectiva el producto génico de E1a-13s en células no transformadas y transformadas cuando se expresa a partir del promotor de E1a nativo y a partir de vectores que albergan la deleción del potenciador (TAV-255), que facilita la expresión preferente de E1a en células tumorales. Los inventores demuestran que el virus que expresa selectivamente el producto génico 13s expresa eficazmente la proteína 289R en un panel de células tumorales y que la replicación viral y actividad lítica de este virus es similar a la de Ad5 tipo salvaje. Por el contrario, los inventores 35 encuentran que la expresión 13s de E1a está notablemente retrasada y disminuida en células no transformadas con crecimiento frenado comparado con células tumorales. La actividad oncolítica del virus 13s restringido se comparó con dl1520 (Onyx-015). El virus 13s restringido estaba tan atenuado como el dl1520 en las células no transformadas y fue notablemente más potente que el dl1520 en algunas líneas celulares tumorales evaluadas. Estos resultados muestran que los vectores virales oncolíticos basados en la expresión selectiva de tumor del virus 13s restringido 40 eran viables y pueden proporcionar una replicación viral eficaz en células tumorales mientras restringen fuertemente la replicación viral en células no transformadas.

La expresión de las proteínas E1A se evaluó en células WI-38 con crecimiento frenado que no están transformadas, fibroblastos diploides de pulmón (Hayflick y Moorhead, 1961). Los resultados, mostrados en la Figura 16a-b, muestran que la infección con adenovirus tipo salvaje da como resultado la expresión de dos proteínas. La proteína 45 de 289 aminoácidos se deriva del mARN de 13s mientras que la proteína de 243 aminoácidos se deriva del mARN de 12s. El mARN de 12s es un producto de empalme de mARN que difiere del mARN de 13s por la eliminación de un dominio interno que funciona para transactivar otros genes virales tempranos. En las células WI-38, la proteína de 243 aminoácidos es la especie dominante. La abundancia de ambas especies incrementa entre 24 y 48 horas después de la infección, seguido de una disminución significativa en la abundancia relativa del producto de 289 50 aminoácidos 72 horas después de la infección. Al contrario que el virus tipo salvaje, el virus de PM975, que está restringido a la expresión de los 289 aminoácidos a partir de E1a, demuestra un notable retraso en el inicio de la expresión de E1a y no se observa hasta 48 horas después de la infección. Además, la abundancia de la isoforma de 289R de E1a, es sustancialmente menor comparado con el virus tipo salvaje 24 y 28 horas después de la infección. A las 72 horas después de la infección, la abundancia de la isoforma de 289R es similar entre el virus tipo salvaje y 55 PM975; sin embargo, la expresión total de proteína E1A está significativamente reducida en PM975 ya que no se produce 243R, que es la especie dominante. Similares resultados se observan para otra línea celular no transformada, la MRC-5, Figura 16b.

El inicio de expresión de E1a a partir del adenovirus tipo salvaje y PM975 se evaluó en dos líneas celulares tumorales A549 (pulmón) y Panc-1 (páncreas) y los resultados se muestran en la Figura 17a-b. Al contrario que las células no transformadas donde no fue observada ninguna expresión detectable de la forma grande de E1a hasta 48 horas después de la infección, la expresión de 289R fue detectable en las líneas celulares tumorales de 8 a 24 horas después de la infección en las líneas celulares tumorales. Aunque la especie de 243R de E1a era la forma más 5 abundante en las células WI-38, incluso en los puntos de tiempo más tempranos, la abundancia de las especies 289R y 243R fue similar en los puntos de tiempo más tempranos en las células tumorales, excediendo principalmente la expresión de la isoforma 289R respecto a la isoforma 243R en los tiempos más tempranos después de la infección. Durante el curso de la infección, se observó una acumulación preferente de la especie 243R de 48 a 72 horas después de la infección en las líneas células tumorales. La expresión de la forma de 289R de 10 E1a a partir de PM975 fue similar a la expresión observada para el virus tipo salvaje en cada línea celular, apareciendo la expresión máxima aproximadamente 24 horas después de la infección, pero con una expresión abundante continuada 48 y 72 horas después de la infección. La abundancia de la especie 289R a partir de PM975, 72 horas después de la infección igualaba o excedía la abundancia de 289R expresada en células infectadas con el virus tipo salvaje. 15

Los inventores evaluaron el inicio de la expresión de la isoforma de 243R de E1a a partir de dl1500, un virus que expresa exclusivamente la isoforma de 243R de E1a en células (WI-38 y MRC-5) no transformadas con crecimiento frenado y en células tumorales (A549 y Panc1). La expresión de la isoforma de 243R está retrasada en células infectadas con dl1500 cuando se compara con células infectadas con el virus tipo salvaje. El retraso en la expresión de la isoforma de 243R se observó para ambas líneas celulares no transformadas (WI-38 y MRC-5) Figura 18a 20 (paneles a y b). La expresión de la isoforma de 243R es claramente evidente 24 horas después de la infección con el virus tipo salvaje; sin embargo, 243R está al mismo nivel o por debajo de la detección 24 horas después de la infección con dl1500. La expresión de la isoforma de 243R es evidente 48 horas después de la infección con dl1500 en ambas líneas celulares y 72 horas después de la infección es aproximadamente igual a la abundancia observada después de la infección con el virus tipo salvaje. Al contrario que las líneas celulares no transformadas, la expresión 25 de la isoforma de 243R es claramente evidente de 16 a 24 horas después de la infección con dl1500 en las líneas células tumorales, Figura 18b (paneles a y b). Con fines comparativos, la expresión del E1a se muestra respecto al tiempo en células WI-38 y A549 (Figura 19, paneles A y B, respectivamente). El inicio de la expresión de E1a a partir de células WI-38 infectadas está claramente retrasado, particularmente en las células infectadas con dl1500.

Los inventores han demostrado previamente el inicio retrasado de la expresión de E1a a partir del virus con una 30 deleción del promotor de E1a que elimina dos sitios de Pea3 y un sitio de E2f (TAV-255). Los inventores han introducido esta deleción de 50 bp en un vector que expresa de forma selectiva la forma de 289R de E1a y lo han comparado con el inicio de la expresión de E1a en células WI-38 y A549.

Los inventores evaluaron el inicio de la expresión de E1a en células WI-38 con crecimiento frenado infectadas con 1) Ad5, PM975 y TAV-13s para E1a las 24, 48 y 72 horas (MDI=5). Estos resultados muestran que la expresión de E1a 35 está al mismo nivel o por debajo de la detección para TAV-13S hasta 72 horas después de la infección. (Véase la Figura 20.)

Una transferencia Western de células A549 infectadas con 1) Ad5, PM975, TAV-13s para E1a a las 24, 48 y 72 horas (MDI=5) muestra que no hay un retraso significativo en la expresión de E1a a partir de TAV-13s comparado con el virus tipo salvaje o PM975 en células A549. 40

La Figura 21 muestra la viabilidad de células después de la infección con dl309, PM975, dl1520 o dl1520 en células WI-38 7 días después de la infección en MDI de 30 y A549, Panc-1, LnCap, y Hep3b 5 días después de la infección en MDI de 3. Estos resultados muestran que el virus que expresa exclusivamente la isoforma de 289R de E1a (PM975) y la isoforma de 243R de E1a (dl1500) tiene un impacto mínimo en la supervivencia celular fuera de los 7 días después de la infección incluso a MDIs muy elevados (30). La toxicidad celular para estos dos virus restringidos 45 de E1a fue significativamente menor tanto para el virus tipo salvaje (dl309) como para el virus delecionado de E1b-55k (dl1520). Las líneas celulares tumorales se evaluaron atendiendo a su supervivencia celular 5 días después de la infección y con MDI de 3 (1 log inferior que el virus de entrada para el experimento con células WI-38). Estos resultados muestran que la infección de estas líneas células tumorales con el virus que expresa la forma de 289R de E1a (PM975) tiene mayor actividad citolítica comparado tanto con dl1520 como con dl1500 y que el nivel de 50 actividad citolítica para PM975 es similar que para el virus tipo salvaje en estas líneas celulares.

El gen de E1a de Ad5 es procesado por empalme de mARN para proporcionar cinco isoformas distintas; 13S, 12S, 11S, 10S y 9S. Las principales formas 13S y 12S codifican para dos proteínas de E1A, 289R y 243R respectivamente, regulan la transcripción de ambos genes virales y celulares en células infectadas por adenovirus y son esenciales para la replicación adenoviral. La forma 289R incluye un dominio de transactivación crítico que activa 55 la transcripción de los genes adenovirales tempranos: E2, E3, y E4 (Berk, Lee et al. 1979; Jones y Shenk 1979). Este dominio se empalma fuera para generar la isoforma 243R de E1a y los virus que expresan solo la forma 243R son incapaces de transactivar la expresión a partir de los genes virales tempranos (Montell, Courtois et al. 1984). E1a induce la expresión de genes celulares incluyendo c-Fos, c-Jun, y c-Myc y reprime la transcripción de c-erbB2 y el receptor del factor de crecimiento epidérmico. Las proteínas E1A pueden conducir a células inactivas en la 60

división celular por la interacción con proteínas del ciclo de la célula celular crítico incluyendo pRB, p27, ciclina A, ciclina E, CtBP y p300/CBP.

Estudios anteriores han demostrado que los adenovirus modificados que expresan de forma selectiva la forma 289R de E1a tienen aproximadamente una expresión normal de proteínas virales tempranas y tardías, pero tienen menor síntesis de ADN viral en células WI-38 con crecimiento frenado (Spindler, Eng et al. 1985). Se usaron células WI-38 5 con crecimiento frenado como modelo de una infección viral natural, y estos inventores demostraron que la síntesis de ADN viral se reduce hasta el 20-30% de los niveles control 24 a 36 horas después de la infección en células con crecimiento frenado pero no en células WI-38 o células HeLa proliferantes (subconfluentes). Aunque se observó una menor síntesis de ADN viral en células infectadas con el virus restringido a la expresión de la forma de 289R de E1a, los inventores no encontraron diferencias significativas en la expresión de mARN viral temprana y ninguna diferencia 10 tanto en la síntesis de proteína viral temprana como tardía. Sin embargo, la expresión de proteína viral temprana se determinó por análisis de las proteínas de E1b y E2 en vez de por análisis de la expresión de E1a. Al contrario que el trabajo previamente publicado, los inventores muestran que el inicio de la expresión de E1a está significativamente retrasado y que la abundancia es menor en células (WI-38 y MRC-5) no transformadas con crecimiento frenado cuando se infectan con el adenovirus restringido a la expresión de solo la isoforma de 289R 15 para E1a (PM975) cuando se compara con las mismas células infectadas con el virus tipo salvaje (dl309). En las células no transformadas, la expresión de 289R no fue observada hasta 48 horas después de la infección aunque la expresión de E1a a partir del Ad5 tipo salvaje se observa a las 24 horas en las células no transformadas. Incluso cuando es observada, la abundancia de E1a es considerablemente inferior que los niveles control. Los inventores amplían los estudios anteriores y muestran que la expresión de la forma de 243R de E1a está retrasada en células 20 WI-38 con crecimiento frenado cuando son infectadas con dl1500 comparado con el virus tipo salvaje. Estos resultados muestran que en ausencia de un procesamiento normal de E1a, la expresión de ambas formas 289R y 243R de E1a está retrasada y es reducida en abundancia en células no transformadas con crecimiento frenado.

El requerimiento para el procesamiento de E1a para alternar las formas de empalme para la expresión eficaz de la forma de 289R en estas células no transformadas es menos astringente en células tumorales. Los inventores 25 evaluaron la expresión de E1a a partir de células tumorales infectadas con PM975 y dl309. Los resultados de estos estudios muestran que las líneas celulares tumorales expresan la forma de 289R de E1a tan pronto como 8 horas después de la infección y que el procesamiento de E1a para alternar formas de empalme no es requerido para alcanzar una expresión eficaz de la forma de 289R en líneas celulares tumorales. Al contrario que las líneas celulares no transformadas, la abundancia de 289R expresado en líneas celulares tumorales infectadas con el virus 30 restringido a la expresión de 289R (PM975) puede igualar o incluso exceder la abundancia de 289R expresado a partir de células infectadas con el virus tipo salvaje (dl309).

Se determinó la viabilidad de las células infectadas con el virus tipo salvaje (dl309), el virus con una deleción en el gen de E1b-55 (dl1520/Onyx-015), y el virus que expresa selectivamente la forma 298R (PM975) y 243R (dl1500) de E1a. No se observó una disminución significativa en la viabilidad celular en células WI-38 con crecimiento frenado 35 fuera de los 7 días después de la infección con tanto PM975 como dl1500 hasta con MDI tan altos como 30. Estos resultados muestran que la restricción de productos de empalme de E1a a cada isoforma de E1a puede reducir drásticamente la actividad lítica de estos virus en células no transformadas con crecimiento frenado. Al contrario, PM975 tiene una potente actividad lítica, aproximadamente al nivel del virus tipo salvaje, en la líneas celulares tumorales analizadas. Además, este análisis muestra que PM975 tiene actividad lítica cuando se compara con 40 dl1520 (Onyx-015) en las líneas celulares analizadas. Ya que E1a es la primera proteína producida por adenovirus, la restricción selectiva de esta proteína a la forma de 289R tiene un potencial significativo como virus oncolítico.

Para restringir más la expresión de E1a a células tumorales y limitar la expresión de E1a en células no transformadas, los inventores introdujeron la deleción de una región corta del promotor de E1a que abarca los dos sitios de Pea3 y un sitio de E2F (TAV-255) dentro de un virus que expresa selectivamente la forma de 298R de E1a. 45 Los inventores muestran que este virus ha disminuido notablemente la expresión de E1a en células WI-38 con crecimiento frenado pero que la expresión de 289R en células A549 es similar a la del virus tipo salvaje en células A549. La introducción de esta deleción del promotor puede minimizar la expresión de E1a en células no transformadas.

Los múltiples mARN expresados de forma diferencial a partir de la misma secuencia codificante permiten la 50 expresión génica adenoviral compleja a partir de un genoma compacto y se acumulan distintos mARN a diferentes puntos durante la infección. El pre-mARN de E1a se empalma de forma diferente dentro de los mARN de 13S, 12S, y 9S siendo predominante el mARN de 13S durante la fase inicial de infección y siendo predominante el 12S/9S durante los puntos de infección tardíos. Estos mARN se generan usando sitios diferentes de empalme 5' unidos a un sitio de empalme común 3' (Imperiale, Akusjnarvi et al. 1995). El proceso de empalme del mARN viral depende de 55 los factores de empalme celular y el cambio de la expresión de mARN de 13S a 12S y 9S se piensa que es debido a una titulación de factores de empalme específicos durante el curso de la infección viral (Gattoni, Chebli et al. 1991; Larsson, Kreivi et al. 1991; Himmelspach, Cavaloc et al. 1995). La interrupción del empalme de E1a normal por la sobreexpresión de factores de control de empalme para el 13s de E1a puede reducir la acumulación del mARN tardío y reducir el rendimiento viral (Molin y Akusjarvi 2000). Los inventores muestran que el empalme restringido de 60 E1a a la forma disminuyó la expresión de 289R y de 289R en células no transformadas pero tiene solo un modesto impacto en el inicio de expresión la 289R en células tumorales y puede dar como resultado la acumulación de 289R

a niveles que son mayores que los logrados durante la infección con el virus tipo salvaje. Una posible explicación para este efecto es que el inicio de la síntesis de ADN viral está retrasada en células WI-38 infectadas con PM975 (Spindler, Eng et al. 1985). Ya que la nueva síntesis de ADN viral puede impactar el procesamiento del mARN (Larsson, Kreivi et al. 1991), el retraso en la síntesis de nuevo ADN viral puede tener un impacto en el procesamiento de E1a en células WI-38 con crecimiento frenado. Por el contrario, ya que las células tumorales 5 tienen una proliferación desregulada, el inicio de la síntesis de ADN viral puede no estar retrasado y puede facilitar la expresión de 289R incluso en ausencia de la expresión de 243R.

En resumen, la replicación selectiva de tumores de virus y la lisis mediada viral preferencial de células tumorales es la base para el concepto del virus oncolítico. El prototipo de un virus oncolítico es el Onyx-015 (dl1520). Este virus tiene una deleción del gen de E1b-55k que se postuló que confería una replicación selectiva de tumores del virus y 10 por lo tanto una lisis selectiva del tumor mientras moderaba a las células normales. Los inventores compararon la actividad oncolítica del virus restringido a la expresión de E1a-289R frente a dl1520 en un panel de células no transformadas y transformadas. Los inventores muestran que la restricción de la expresión de E1a frente a la forma de 289R de E1a da como resultado un virus que está más atenuado que dl1520 en ambas líneas celulares no transformadas analizadas. Además, los inventores muestran que la restricción de la expresión de E1a frente a la 15 forma de 289R da como resultado un virus oncolítico altamente potente en las líneas celulares tumorales analizadas. El virus restringido de 289R era más potente que el dl1520 en las líneas celulares analizadas y logró el nivel de actividad citolítica observada para Ad5 tipo salvaje en estas líneas celulares tumorales. La expresión de E1a restringida, posiblemente acoplada con la deleción del promotor de E1a descrita, puede conducir a un vector viral oncolítico con una actividad lítica cercana a la del tipo salvaje en células tumorales al tiempo que posee una 20 actividad lítica muy limitada en células no transformadas.

De acuerdo con esto, en un aspecto de la descripción, se proporciona un virus recombinante que expresa de forma selectiva al menos una isoforma de E1a. La expresión "selectiva" de una isoforma significa que la isoforma seleccionada expresa más que una o más de las otras isoformas (como se mide por expresión de mARN). En un aspecto de la descripción, una isoforma se expresa a niveles que se aproximan a la expresión tipo salvaje, aunque 25 la expresión de una o más otras isoformas está atenuada. En una realización, la expresión de la isoforma seleccionada es al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 99% de la expresión tipo salvaje. En otro aspecto de la descripción, la expresión de una o más otras isoformas se atenúa a no más que el 25%, no más que el 15%, no más que el 10%, no más que el 5%, no más que el 3%, o no más que el 1% de la expresión de tipo salvaje. 30

En algunos aspectos de la descripción, el virus recombinante excluye sustancialmente la expresión de al menos una isoforma. En este caso, la expresión de una isoforma es atenuada a no más que el 25%, no más que el 15%, no más que el 10%, no más que el 5%, no más que el 3%, o no más que el 1 % de la expresión de tipo salvaje.

En un aspecto de la descripción, el virus recombinante expresa de forma selectiva E1a-12S. En un aspecto de la descripción, el virus recombinante expresa de forma selectiva E1a-12S comparado con E1a-13S. En todavía otro 35 aspecto de la descripción, el virus recombinante expresa de forma selectiva E1a-12S y sustancialmente excluye la expresión de E1a-13S.

En un aspecto de la descripción, el virus recombinante expresa de forma selectiva E1a-13S. En una realización, el virus recombinante expresa de forma selectiva E1a-13S comparado con E1a-12S. En todavía otro aspecto de la descripción, el virus recombinante expresa de forma selectiva E1a-13S y sustancialmente excluye la expresión de 40 E1a-12S.

VI. Inserto del clon de E1b 19K

La modificación del promotor de E1 da como resultado la expresión preferente de proteínas E1a y E1b en un panel de líneas celulares tumorales. Aunque la expresión temprana y abundante de proteínas de E1 aparece en tumores celulares infectados con la modificación del promotor de E1, aparecen bajos niveles de expresión de proteína en los 45 puntos de tiempo tardío en células no transformadas. Sin embargo, este bajo nivel de expresión de proteína no fue suficiente para dar como resultado una lisis celular significativa durante hasta siete días después de la infección en las células no transformadas analizadas. Por el contrario, se observa una expresión abundante de E1a y E1b en células tumorales tan temprana como de 8 a 12 horas después de la infección en células tumorales y se observa una gran muerte celular entre un panel de líneas celulares tumorales a los 3 días después de la infección. Estos 50 hallazgos indican que la deleción del vector del promotor de E1a podría usarse como una plataforma eficaz para la expresión de proteínas preferentemente en células tumorales. Además, este vector podría usarse para enviar bajos niveles de proteínas a las células normales también. Por lo tanto, el vector de deleción del promotor de E1a podría ser un vector de expresión eficaz con una función dual: 1) una potente actividad oncolítica cuando se infecta en células tumorales y 2) potentes propiedades de activación inmune o de vacuna cuando se infecta a células no 55 transformadas. Los inventores describen este vector como una vacuna oncolítica. Los inventores además describen el nuevo uso de la región de E1b-19k como un sitio para clonar la secuencia del ADN de interés. El uso de E1b-19k como sitio de clonación permite la conservación de proteínas virales de E1a y E1b-55k intactas. La conservación de estas proteínas virales críticas permite la replicación viral logrando niveles virales de tipo salvaje en un panel de líneas celulares tumorales. 60

Como se describe anteriormente, la expresión selectiva de tumor de E1a puede lograrse modificando el promotor de E1 endógeno. Por lo tanto, la expresión selectiva de transgenes puede lograrse usando el potenciador de E1a modificado. Previamente, la clonación de genes en adenovirus comúnmente implicó la deleción genética del E1 entero, un casete con reemplazo del transgen de interés, típicamente bajo el control de un promotor fuerte tal como el promotor CMV. Sin embargo, este enfoque no permite la expresión selectiva de tumor de estos transgenes. Los 5 inventores describen el uso de E1b-19k como un sitio de clonación en adenovirus. No hay publicaciones previas que usen esta región como sitio de clonación. La unidad E1 está compuesta de dos genes principales, E1a y E1b, ambos con múltiples productos de empalme que generan varias proteínas. Las principales proteínas de E1a se denominan 289R y 243R y las principales proteínas de E1b se denominan E1b-19k y E1b-55k.

El locus de E1b 19k puede usarse como sitio de clonación por varias razones. Primero, E1a es esencial para una 10 replicación viral eficaz y la interrupción de este gen puede restringir drásticamente una replicación viral eficaz. Por lo tanto, este no era un sitio ideal para clonar los transgenes. Segundo, el gen de E1b-55k es una proteína multifuncional que está implicada en la unión e inactivación de p53 así como en el transporte del mARN a través de la membrana nuclear. La deleción del gen de E1b-55k era la base de la selectividad propuesta de Onyx-015 para tumores con mutaciones en p53. Sin embargo, la deleción de E1b-55k también interrumpe el transporte eficaz del 15 transporte de mARN desde el núcleo al citoplasma. Por lo tanto, la deleción del gen de E1b-55k viral, dio como resultado un virus inactivado que se replica pobremente en muchas líneas celulares cancerígenas. Por lo tanto, este no era un sitio ideal para clonar los transgenes. Y tercero, el gen de E1b-19k funciona principalmente como un gen anti-apoptótico y es un homólogo del gen anti-apoptótico celular, BCL-2. Ya que la muerte de la célula huésped antes de la maduración de las partículas virales de la progenie restringiría la replicación viral, E1b-19k se expresa 20 como parte del casete de E1 para prevenir la muerte de la célula prematura permitiendo con ello que la infección proceda y produzca viriones maduros. Dado que muchas células tumorales han adquirido la capacidad de superar las señales apoptóticas, por ejemplo, mediante la sobreexpresión de BCL-2, E1b-19k es potencialmente redundante en el tumor y podría interrumpirse para proporcionar un sitio para insertar genes y las secuencias de ADN. Sin embargo, ya que E1b-19k es un producto de empalme del gen de E1b-55, la clonación dentro de la región de E1b-25 19k, sin interrumpir E1b-55k, es técnicamente desafiante. No hay publicaciones que describan el uso de la región de E1b-19k para clonar los genes. Los inventores muestran que la clonación selectiva de genes dentro del gen de E1b-19k puede lograrse sin interrupción del gen de E1b-55k.

Los inventores muestran que los genes exógenos, incluyendo TNF y péptidos kras mutados, pueden clonarse dentro de la región de E1b-19k, y que estos genes se expresan eficazmente. Los inventores muestran además un potente 30 efecto antitumoral para el virus con expresión de transgenes a partir de E1b-19k y a partir del virus con la deleción del promotor de E1a combinada con la inserción de genes dentro de la región de E1b-19k.

Como se muestra en la Figura 24, la región de E1b codifica varias proteínas que se definen por sitio de inicio de mARN distintos y producciones de empalme. E1b-19 y E1b-55k tienen secuencias sobrelapantes pero sitios de inicio de mARN diferentes. Una región de 202 pares de bases siguiente al sitio de inicio para E1b-19k se delecionó para 35 proporcionar un sitio de clonación dentro de la región de E1b-19k. El sitio de inicio de E1b-55k no fue interrumpido de modo que la expresión de E1b-55k pudo ser retenida.

El análisis de expresión en superficie de TNF expresado a partir de E1b-19k por citometría de flujo se muestra en la Figura 28. Este resultado muestra una abundante expresión de TNF de Ad19k TNF en a) cáncer pancreático R-40 de ratón y b) líneas celulares cancerígenas pancreáticas MiaPaca. Como control, se insertó TNF en un vector de 40 expresión adenoviral comúnmente usado con deleción de la región de E1 del virus e inserción de TNF. La expresión de TNF está bajo el control del promotor CMV, un fuerte promotor comúnmente usado en vectores de expresión adenovirales. Este vector se denomina dE1a-TNF. Los inventores han demostrado previamente que títulos muy altos de este vector son necesarios para lograr una expresión detectable de TNF en un rango de tipos celulares de tumor. En este estudio, se usa dE1a-TNF en 750 unidades formadoras de placa (pfu) por célula. Usando 750 pfu por célula, 45 aproximadamente 30% de las células R40 y 85% de las células Mia-PaCa tuvieron una expresión detectable en la superficie de TNF. Los lisados de células del vector de Ad19kTNF se añadieron a las células para determinar la expresión de TNF en la superficie de las células. La concentración precisa de partículas virales no fue determinada en este experimento; sin embargo, en estudios posteriores los inventores han demostrado que Ad19kTNF usado a 2 pfu/célula tiene tanta o más expresión de TNF que el vector de dE1a-TNF usado a 750 pfu/célula. Los resultados del 50 presente estudio muestran que el 70-80% de células R-40 expresan TNF en su superficie después de la infección con el vector de Ad 19kTNF comparado con solo aproximadamente el 30% de células cuando se infectan con el vector de dE1a-TNF. En células Mia-PaCa, la infección con el vector de dE1a-TNF usado a 750 pfu/célula da como resultado una expresión detectable de TNF en aproximadamente el 80% de las células mientras que la infección con lisados con el vector de Ad19kTNF expresa TNF en aproximadamente el 15-25% de las células. El análisis detallado 55 que muestra los datos de la citometría de flujo se muestra en las Figuras 5b y 5c. En resumen, estos datos muestran que la expresión de TNF biológicamente activo puede lograrse a partir del vector de Ad19kTNF.

Los ensayos de viabilidad celular se realizaron en células no transformadas 3 y 5 días después de la infección (Figura 29). Estos resultados muestran una mínima muerte celular con todos los virus analizados con la excepción de una muerte celular moderada con Ad5 en el MDI más alto. Una muerte celular significativa para los virus Ad5 y 60 Ad19k TNF se observa 5 días después de la infección. De forma destacable, no hay una muerte celular detectable con el virus de deleción del promotor, TAV-255, en el MDI más alto fuera de los 5 días después de la infección. El

virus no replicante que expresa TNF no muestra muerte celular en el MDI más alto fuera de los 5 días después de la infección.

Los ensayos de viabilidad celular se realizaron en células transformadas (A549) 3 y 5 días después de la infección (Figura 30). Estos resultados muestran una muerte celular extensiva con los virus Ad5, TAV y Ad19k TNF a bajos MDI y una muerte celular moderada con dl1520 en el MDI más alto. A los 5 días después de la infección, hubo una 5 muerte celular significativa para el virus Ad19k TNF a un MDI de 0,1, significativamente mejor que la observada para el Ad5 solo. El virus no replicante que expresa TNF no muestra muerte celular en el MDI más alto fuera de los 5 días después de la infección y se observa una actividad modesta para dl1520 en el MDI más alto.

Los ensayos de viabilidad celular se realizaron en células transformadas (Panc1) 3 y 5 días después de la infección (Figura 31). Estos resultados muestran una amplia muerte celular con los virus Ad5, TAV y Ad19k TNF a bajos MDI y 10 una muerte celular moderada con dl1520 en el MDI más alto. A los 5 días después de la infección, hubo una muerte celular significativa para los virus Ad5, TAV y Ad19k TNF a un MDI de 0,1, significativamente mejor que la observada para el virus no replicante que expresa TNF lo que demuestra que no hubo muerte celular en el MDI más alto fuera de los 5 días después de la infección. Se observa actividad citolítica para dl1520 pero son necesarios MDI más altos que para TAV y Ad19k TNF para una actividad citolítica similar. 15

Análisis de expresión en superficie de TNF por AdTAV19kmmTNF usando citometría de flujo (Figura 32): Este análisis muestra una abundante expresión de la expresión de TNF a partir de AdTAV19k TNF en las líneas celulares cancerígenas a) CaLu-6, b) LnCap y c) Hep3b. Se logra una abundante expresión de TNF, llegando al 100% de las células tumorales, con una multiplicidad de infección (MDI) de 2, igual a 2 pfu/célula. Como control, se muestra dE1a-TNF y un MDI de 750. A este MDI alto, aproximadamente el 90% de las células en estas líneas celulares 20 tenían una expresión detectable de TNF. Por el contrario, el Ad19kTNF usado a 2-5 pfu/célula tenía una expresión detectable de TNF en el 80-00% de células. El análisis detallado que muestra los datos de la citometría de flujo se muestra en las Figuras 9c-e. En resumen, estos datos muestran que la expresión del TNF biológicamente activo puede lograrse a partir del vector de Ad19kTNF en MDI de 2 a 5, similar a los resultados logrados con el vector de dE1a-TNF a un MDI de 750. Estos resultados muestran además que la expresión eficaz de TNF puede lograrse con 25 la deleción de TAV-255 de 50 pares de bases en el promotor de E1a. Los inventores han demostrado que esta deleción del promotor restringe la expresión de E1a y E1b en células no transformadas mientras retiene la expresión de E1a y e1b en líneas celulares tumorales. Estos resultados confirman una expresión eficaz de TNF a partir del vector que contiene la deleción de TAV-255 y con el TNF clonado dentro de la región de E1b-19k del virus.

La supervivencia de SK-Mel-28 (células tumorales de melanoma) se evaluó después de la infección con 30 AdTAV19TNF, dE1a-TNF y Ad19k (Figura 33). La línea celular de SK-Mel-28 es refractaria a la muerte por vectores adenovirales. No se observa una citotoxicidad significativa con dE1a-TNF en el MDI más alto y solo se observa una modesta citotoxicidad con Ad19k. Por el contrario, se observa una completa citotoxicidad con AdTAV19TNF a un MDI de 10, el MDI más bajo analizado.

El TNF induce la muerte celular a través de la inducción de caspasas (véase la Figura 34). La activación del receptor 35 de TNF por la unión de TNF da como resultado el reclutamiento de las proteínas de dominio muertas y una subsecuente activación de caspasa-8 y luego la activación de caspasa-3 lo que provoca la inducción de muerte celular apoptótica. Los inventores determinaron la activación de caspasa-3 en células Hep3b infectadas con Ad 19k o AdTAV19TNF a un MDI de 5. Los resultados muestran una inducción notable de caspasa-3 en células infectadas con AdTAV19TNF. No se observó un incremento significativo en la actividad de caspasa-3 en células infectadas con 40 Ad 19k.

Determinación de la expresión de E1b-55k en vectores con deleciones de E1b-19k (Figura 35): El sitio de inserción en los vectores delecionados de E1b-19k se diseñó de modo que el sitio de inicio de E1b-55k no era interrumpido. Para determinar si la expresión génica E1b-55k era retenida, la expresión de E1b-55k se evaluó en vectores con TNF o Kras insertados en la región de E1b-19k. Los resultados muestran una expresión normal de E1b-55k para el 45 virus con Kras insertado en E1b-19k. El nivel de expresión de E1b-55k es equivalente al nivel de expresión de E1b-55k observado en células infectadas con Ad5 tipo salvaje. Esto confirma que la expresión de E1b-55k puede ser retenida a pesar de las inserciones de ADN dentro de la región de E1b-19k. De modo destacable, no hay una expresión detectable de E1b-55k a partir del vector que expresa TNF. En este punto, los inventores no saben la causa de este efecto. TNF puede inhibir directamente la expresión de E1b-55 o la naturaleza de la inserción puede 50 disminuir la expresión a partir de E1b-55k. Esto se está evaluando.

Determinación de la inserción de GFP en E1b-19k. La inserción de GFP en el E1b-19k se demostró por PCR (Figura 36).

Las células tumorales expresan GFP después de la infección con Ad19kTAVhrGFP (Figura 37).

El concepto de un vector de función dual: La modulación del potenciador de E1a puede dar como resultado un 55 vector de expresión que expresa las proteínas E1 abundantemente y es lítico en células tumorales. Sin embargo, este virus expresa proteínas de E1 a bajos niveles y tiene una actividad lítica limitada en células no transformadas. Por tanto, el vector viral podría ser oncolítico en células tumorales pero usarse para expresar los transgenes

terapéuticos y proteínas mutadas (vacuna) en células no transformadas. Los inventores han demostrado previamente una abundante expresión de proteínas de E1 en células tumorales después de la infección con la del vector deleción del promotor de E1. Por el contrario, la expresión de proteínas de E1 está retrasada y ser significativamente menor en células no transformadas. Véase la Figura 4c.

El concepto de una vacuna de tumor oncolítica dirigida en el Kras mutado: Kras está cadena abajo del receptor del 5 factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Las mutaciones en Kras dan como resultado una activación constitutiva de la ruta de Ras. Ya que el Kras mutado es constitutivamente activo, las terapias dirigidas en el receptor de EGFR tal como Erbitux y Vectivix son ineficaces. Kras está comúnmente mutado en una variedad de malignidades que aparecen en aproximadamente 50% de cánceres de colon y aproximadamente el 90% de cánceres pancreáticos. Varias mutaciones de punto de Kras se han descrito y es común a la secuencia para mutaciones de Kras determinar 10 si los pacientes responderán al EGFR dirigido a terapias cancerígenas. Los inventores han clonado las mutaciones de Kras más comúnmente descritas en el vector de expresión de 19K.

Vectores de expresión de E1b-19k para aumentar la inmunidad frente a antígenos de tumor: Las proteínas mutadas de Kras se han clonado en el vector de expresión de E1b-19k en tres formas distintas para proporcionar una plataforma robusta para la expresión de antígenos tumorales. Primero, el ADN que codifica las secuencias de Kras 15 mutadas se insertó en la región de E1b-19k. Segundo, el gen de flagelina bacteriano se clonó en la región de E1b-19k. Se introdujo un sitio de clonación en la secuencia de flagelina de ADN y se introdujeron secuencias específicas de Kras en el medio del gen de flagelina. La flagelina es una proteína altamente inmunogénica y puede ayudar a potenciar una respuesta inmune frente a secuencias mutadas de Kras. Tercero, se delecionó TNF del dominio transmembrana del constructo de E1b-19K CD154-TNF y las secuencias de ADN mutadas de Kras se ligaron a 20 CD154. Esto proporciona una abundante expresión de péptidos mutados de Kras en la superficie de la célula. Dependiendo del constructo usado, Kras podría ser restringido a la expresión en la superficie de la célula tumoral o permitirse que se escinda proteolíticamente permitiendo la liberación del péptido mutado de Kras a células inmunes y nodos de linfa para el reconocimiento inmune y el procesamiento.

De acuerdo con esto, en un aspecto de la descripción, se proporciona un virus recombinante que incluye un sitio de 25 inicio de E1b-19K. El sitio de inserción de E1b-19K puede usarse, por ejemplo, para la inserción de una secuencia de ADN. La secuencia insertada de ADN puede codificar cualquier secuencia, incluyendo, por ejemplo, un transgen, gen cancerígeno o la secuencia de ADN mutada. En un aspecto de la descripción, el transgen es TNF. En otra realización, el transgen es kras. En todavía otro aspecto de la descripción, el transgen es una secuencia de p53 mutada. 30

En un aspecto de la descripción, se mantiene la secuencia de E1b-55K o una porción funcional del mismo. En un aspecto de la descripción, se mantiene la secuencia del E1b-55K sitio de inicio. En un aspecto de la descripción, el sitio de inserción comprende la deleción de aproximadamente 1 a aproximadamente 200, de al menos aproximadamente 100, de aproximadamente 100 a aproximadamente 200, de aproximadamente 1 a aproximadamente 150, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, o de al menos aproximadamente 10 pares de 35 bases entre el sitio de inicio de E1b-19K y el sitio de inicio de E1b 55K. En un aspecto de la descripción, el sitio de inserción comprende la deleción de 202 pares de bases siguientes al sitio de inicio de E1b-19K.

VII. Vectores virales

En un aspecto de la descripción, los genes modificados y las secuencias descritas en este documento se emplean dentro de un vector viral. Las expresiones "vector viral" y "virus" se usan de forma intercambiable en este documento 40 para referirse a cualquiera de los parásitos intracelulares obligados que no tienen un mecanismo sintetizador de proteínas o generador de energía. El genoma viral puede ser ARN o ADN contenido con una estructura revestida de proteína de una membrana lipídica. Los virus útiles en la práctica de la presente invención incluyen virus de ADN y ARN encapsulados modificados recombinantemente o no encapsulados, preferiblemente seleccionados a partir de baculoviridiae, parvoviridiae, picornoviridiae, herpesviridiae, poxviridae o adenoviridiae. Los virus pueden ser virus 45 que aparecen de forma natural o sus genomas virales pueden modificarse mediante técnicas de ADN recombinante para incluir la expresión de transgenes exógenos y pueden modificarse para ser deficientes en la replicación, condicionalmente replicantes o competentes en la replicación. Los vectores virales quiméricos que explotan elementos ventajosos de cada una de las propiedades del vector parenteral (véase, por ejemplo, Feng, et al.(1997) Nature Biotechnology 15:866-870) también pueden ser útiles en la práctica de la presente invención. Los sistemas 50 del vector mínimos en los que la estructura viral contiene solo las secuencias necesarias para empaquetar el vector viral y que pueden incluir opcionalmente un casete de expresión transgénica también pueden producirse de acuerdo con la práctica de la presente invención. Aunque generalmente esté favorecido emplear un virus de la especie que se trate, en algunos casos puede ser ventajoso usar vectores derivados de diferentes especies que posean características patogénicas favorables. Por ejemplo, los vectores del virus del herpes equino para terapia génica 55 humana se describen en el documento WO98/27216. Los vectores se describen como útiles para el tratamiento de seres humanos, ya que el virus equino no es patogénico para seres humanos. De forma similar, pueden usarse vectores ovinos adenovirales en terapia génica humana como se reivindica para evitar los anticuerpos frente a los vectores adenovirales humanos. Dichos vectores se describen en el documento WO 97/06826.

Preferiblemente, el vector viral es un adenovirus. Los adenovirus son virus de tamaño medio (90-100 nm), no encapsulados (desnudos), icosahédricos compuestos de una nucleocápsida y un genoma de ADN lineal bicatenario. Los adenovirus se replican en el núcleo de las células de mamíferos usando la maquinaria de replicación del huésped. El término "adenovirus" se refiere a cualquier virus en el género Adenoviridiae incluyendo, pero sin limitación, los subgéneros de adenovirus humano, bovino, ovino, equino, canino, porcino, murino y simio. En 5 particular, los adenovirus humanos incluyen el subgénero A-F así como sus serotipos individuales, los serotipos individuales y el subgénero A-F incluyendo, pero sin limitación, los tipos de adenovirus humanos 1, 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 (Ad11A y Ad11P), 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 19a, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26; 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34a, 35, 35p, 36, 37,38, 39, 40, 41, 42; 43, 44, 45, 46, 47, 48, y 91. Los vectores preferidos son los derivados de los tipos 2 y 5 de adenovirus humanos. 10

En un aspecto de la descripción, la secuencia reguladora modificada está unida operativamente a una secuencia que codifica una proteína. En un aspecto de la descripción, al menos uno de los genes E1a y E1b (regiones codificantes) está unido operativamente a la secuencia reguladora modificada. En un aspecto de la descripción, al menos uno de los genes de E1a y E1b está presente en la forma tipo salvaje.

En un aspecto de la descripción, el gen de E1a está unido operativamente a la secuencia reguladora modificada. En 15 otro aspecto de la descripción, el gen de E1a es de tipo salvaje. En otro aspecto de la descripción, el gen de E1a se modifica para expresar de forma selectiva una isoforma de E1a.

En todavía otro aspecto de la descripción, y/o un gen de E1b modificado está unido operativamente a la región del promotor de tipo salvaje. En otro aspecto de la descripción, el gen de E1a modificado y/o el gen de E1b modificado está unido operativamente a una secuencia reguladora modificada. 20

La expresión "operativamente unido" se refiere a un enlace de elementos polinucleótidos en una relación funcional. Una secuencia de ácidos nucleicos "se une operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia codificante. Operativamente unido significa que las secuencias de nucleótidos que se unen sean típicamente contiguas. Sin embargo, como los potenciadores 25 generalmente funcionan cuando se separan del promotor por varios kilobases y las secuencias intrónicas pueden ser de longitudes variables, algunos elementos polinucleótidos pueden unirse operativamente pero no estar flanqueadas directamente y pueden incluso funcionar en trans a partir de un alelo o cromosoma diferente.

En otro aspecto de la descripción, la secuencia reguladora modificada está operativamente unida a un transgen citotóxico. La expresión "transgen citotóxico" se refiere a una secuencia de nucleótidos cuya expresión en la célula 30 diana induce la lisis o la apoptosis de la célula. La expresión "transgen citotóxico" incluye, pero sin limitación, genes supresores tumorales, genes de toxina, genes citostáticos, genes activantes de pro-fármaco o genes apoptóticos.

En un aspecto de la descripción, cualquiera de estos transgenes citotóxicos puede insertarse en un sitio de inserción de E1b-19K como se describe antes.

La expresión "gen supresor tumoral" se refiere a una secuencia de nucleótidos, cuya expresión en la célula diana es 35 capaz de suprimir el fenotipo neoplásico y/o la apoptosis inductora. Ejemplos de genes supresores tumorales útiles en la práctica de la presente invención incluyen el gen p53, el gen APC, el gen DPC-4, el gen BRCA-1, el gen BRCA-2, el gen WT-1, el gen de retinoblastoma (Lee, et al. (1987) Nature 329:642), el gen MMAC-1, la proteína de coli de poliposis adenomatosa (Albertsen, et al., patente de EE.UU. 5.783.666 publicada el 21 de julio de 1998), el gen delecionado en carcinoma de colon (DCC), el gen MMSC-2, el gen NF-1, el gen supresor tumoral de carcinoma 40 nasofaríngea que mapea en el cromosoma 3p21.3. (Cheng, et al. 1998. Proc. Nat. Acad. Sci. 95:3042-3047), el gen MTS 1, el gen CDK4, el gen NF-1, el gen NF2 y el gen VHL.

La expresión "gen de toxina" se refiere a una secuencia de nucleótidos, cuya expresión en una célula produce un efecto tóxico. Ejemplos de dichos genes de toxina incluyen secuencias de nucleótidos que codifican exotoxina de pseudomonas, toxina de ricino, toxina de difteria y similares. 45

La expresión "gen pro-apoptótico" se refiere a una secuencia de nucleótidos, cuya expresión da como resultado la muerte celular programada de la célula. Ejemplos de genes pro-apoptóticos incluyen p53, adenovirus E3-11.6K, el gen del adenovirus E4orf4, genes de la ruta de p53 y genes que codifican las caspasas.

La expresión "genes activantes de pro-fármaco" se refiere a una secuencia de nucleótidos, cuya expresión da como resultado la producción de proteína capaz de convertir un compuesto no terapéutico en un compuesto terapéutico, 50 que da lugar a que la célula sea susceptible de eliminarse por factores externos o causa una condición tóxica en la célula. Un ejemplo de un gen activante de pro-fármaco es el gen de citosina desaminasa. La citosina desaminasa convierte 5-fluorocitosina en 5-fluorouracilo, un potente agente antitumoral). La lisis de la célula tumoral proporciona una ráfaga localizada de citosina desaminasa capaz de convertir 5FC en 5FU en el punto localizado del tumor dando como resultado la eliminación de muchas células tumorales circundantes. Esto da como resultado la eliminación de 55 un gran número de células tumorales sin la necesidad de infectar estas células con un adenovirus (el denominado "efecto observador"). Adicionalmente, puede emplearse el gen de timidina quinasa (TK) (véase, por ejemplo, Woo, et al., patente de EE.UU. Nº. 5.631.236 presentada el 20 de mayo de 1997 y Freeman, et al. patente de EE.UU. Nº.

5.601.8 18 presentada el 11 de febrero de 1997) en las cuales las células que expresan el producto génico de TK son susceptibles de matar selectivamente mediante la administración de ganciclovir.

La expresión del "gen de citoquina" se refiere a una secuencia de nucleótidos cuya expresión en una célula produce una citoquina. Ejemplos de dichas citoquinas incluyen GM-CSF, las interleuquinas, especialmente interferones de IL-1, IL-2, EL-4, IL-12, IL-10, IL-19, EL-20, de los subtipos α, β y gamma especialmente el interferón α-2b y fusiones 5 tales como el interferón α-2α-1.

VIII. Células transformadas

Los vectores pueden usarse para transformar células in vitro o in vivo. Las células pueden ser células neoplásicas y/o células normales.

Una "célula neoplásica" es una célula que despliega un fenotipo con crecimiento aberrante caracterizada por las 10 independencia de controles de crecimiento celular normal. Como las células neoplásicas no son necesariamente replicantes en ningún punto de tiempo dado, las células neoplásicas comprenden células que pueden replicarse activamente o en un estado de reposo no replicativo temporal (G1 o GO). Las poblaciones localizadas de células neoplásicas se denominan neoplasmas. Los neoplasmas pueden ser malignos o benignos. Los neoplasmas malignos también se denominan cánceres. La transformación neoplásica se refiere a la conversión de una célula 15 normal en una célula neoplásica, a menudo en una célula tumoral. Las células que no son neoplásicas se denominan "normales" o "no neoplásicas".

IX. Métodos de expresión selectiva de tumor

En un aspecto de la descripción, el virus recombinante exhibe una expresión selectiva. En particular, el virus recombinante permite la expresión en células neoplásicas, pero se atenúa su expresión en células normales. 20

De acuerdo con esto, en un aspecto de la descripción, un método de expresar selectivamente un péptido (por ejemplo, una proteína) en una célula diana comprende poner en contacto una célula con un virus recombinante que comprende una secuencia regulatoria de E1a del mutante de deleción unido operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido. En este contexto, el péptido puede ser de cualquier longitud, incluyendo proteínas y sus porciones. En un aspecto de la descripción, el péptido se asocia con la replicación viral, tal como 25 E1a y/o E1b. En otro aspecto de la descripción, el péptido se asocia con el cáncer.

En otro aspecto de la descripción, un método de expresar selectivamente un péptido en una célula diana comprende poner en contacto una célula con un virus recombinante que expresa de forma selectiva una sola isoforma de E1a, por ejemplo, E1a-12S o E1a-13S.

En otro aspecto más de la descripción, un método de expresar selectivamente un péptido en una célula diana 30 comprende poner en contacto una célula con un virus recombinante que comprende un transgen insertado en un sitio de inserción de E1b-19K.

En un aspecto de la descripción, la célula diana es una célula neoplásica, tal como una célula cancerígena. En este caso, el péptido se expresa, preferiblemente a niveles que se aproximan a la expresión tipo salvaje. En un aspecto de la descripción, la expresión (según se mide por la expresión de mARN o transferencia Western) es al menos del 35 75%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 99% de la expresión tipo salvaje.

En otro aspecto de la descripción, la célula diana es una célula normal. En este caso, la expresión del péptido es atenuada de forma selectiva comparada con la expresión tipo salvaje. En un aspecto de la descripción, la expresión (según se mide por la expresión de mARN o transferencia Western) se reduce a no más que 25%, no más que 15%, no más que 10%, no más que 5%, no más que 3%, o no más que 1% de la expresión tipo salvaje. En un aspecto de 40 la descripción, se logra una atenuación de aproximadamente 0% a aproximadamente 5%.

Estos métodos de expresión selectiva pueden llevarse a la práctica in vitro o in vivo.

X. Métodos de tratamiento

Los "métodos para tratar una enfermedad," como se usa en este documento, se refieren a métodos para tratar un estado de enfermedad, una condición causada por un estado de enfermedad o síntomas de enfermedad. El 45 "tratamiento" de una enfermedad incluye uno o más de: evaluar una causa fisiológica de la enfermedad, evaluar una causa fisiológica de un síntoma de enfermedad, reducir la gravedad de la enfermedad, ralentizar la progresión de la enfermedad, mejorar un síntoma de la enfermedad y acortar la duración de la enfermedad (por ejemplo, acelerando la remisión).

El "sujeto", como se usa en este documento, es un sujeto que necesita un tratamiento para el cáncer. El sujeto es 50 preferiblemente un ser humano, aunque también puede incluir animales de laboratorio, mascotas, animales domésticos o de granja. En un aspecto de la descripción, el sujeto es un mamífero.

En un aspecto de la descripción, un método para tratar el cáncer comprende administrar una formulación farmacéutica que comprende un virus recombinante como se describe antes. La formulación farmacéutica puede administrarse sistémicamente o localmente para tratar una amplia variedad de estados y tipos de cánceres incluyendo, pero sin limitación, cánceres pulmón, páncreas, próstata, cérvix, ovario, hígado, cabeza y cuello, vesícula, mama, colon y rectal, endometrial, de riñón, leucemia, piel (melanoma y no melanoma), linfoma no de 5 Hodgkin y cánceres de tiroides.

También se proporcionan formulaciones farmacéuticas que comprenden los vectores. Los vectores pueden formularse para su administración por métodos conocidos en la técnica. Pueden formularse sistemas de liberación particulares para su inyección intramuscular, intravenosa, intraarterial o intratumoral.

Las formulaciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables cuando se requieran para 10 aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste del pH y tamponantes, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, etc.

La concentración del agente activo en las formulaciones farmacéuticas puede variar ampliamente, por ejemplo, de menos de aproximadamente 0,1%, normalmente o al menos aproximadamente 2% hasta tanto como de 20% a 50% 15 o más en peso, y será seleccionado principalmente por volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado.

Las formulaciones y métodos descritos en este documento pueden ponerse en práctica solas o en combinación con agentes quimioterapéuticos convencionales o regímenes de tratamiento.

XI. Ejemplos 20

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar ciertas realizaciones de la invención y no limitar el alcance de la invención descrita en este documento.

A. Región de control transcripcional de deleciones de E1a

Líneas celulares, virus, y plásmidos: Las células HEK-293A (células de riñón embriónico humanas E1-transformadas de adenovirus), HeLa (cáncer cervical), A549 (cáncer de pulmón), LNCaP (cáncer de próstata), Calu-6 (cáncer de 25 pulmón), PANC-1 (cáncer pancreático), AsPc-1 (cáncer pancreático), y MRC-5, WI-38, y IMR-90 (fibroblasto de pulmón) se obtuvieron de la Colección de Cultivo Tipo Americana (ATCC), y se cultivaron en medio Eagle Modificado de Dulbecco suplementado con suero de becerro fetal al 10% en presencia de CO2 al 5%. Las células primarias se inhibieron por contacto haciéndolas crecer hasta confluencia del 100 por ciento y seguido por una incubación prolongada en medio completo. 30

Reconstrucción de la mutación en el genoma de Ad5: Ad5 tipo salvaje (D1309), región de E3 de deleción parcial y varios mutantes de deleción del promotor/potenciador de Ad5 E1A; D1309-6, D1340-12, y D187 fueron amablemente proporcionados por Patrick Hearing (Universidad Stony Brook, EE.UU.). Para construir el virus de TAV-255, la región del potenciador del promotor de E1a se delecionó usando el plásmido del vector adenoviral pXC1 (Microbix Biosystem Inc.) usando un kit de mutagénesis dirigida de QuickChange II XL (Stratagene, La Jolla, CA) de 35 acuerdo con el manual recomendado. El cebador d194_243_F5' - AAA GTG ACG TTT TTG GTG TGC GCC GGT GTT TTG GGC GTA ACC GAG TAA GAT TTG GCC A - 3' (SEQ ID NO:1) y d194_243_R5' - TGG CCA AAT CTT ACT CGG TTA CGC CCA AAA CAC CGG CGC ACA CCA AAA ACG TCA CTT T - 3' (SEQ ID NO:2) se usaron para esta deleción. Los plásmidos obtenidos denominados pXC1_TAV-255 se amplificaron en E. coli, se secuenciaron y se purificaron usando el Kit HiPur Plasmid Filter Midiprep (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para obtener los plásmidos 40 TAV-255, pXC1_TAV del adenovirus se co-transfectaron con pJM17 en células HEK-293 (ATCC, Manassas, VA) usando el reactivo de transfección de Fugene®6 (Roche, Suiza). Las células fueron revestidas con Agarosa de Placa Sea al 1,0% en medio de cultivo para obtener plagas individuales en 12 días. Después de dos rondas de purificación de placa, los virus de una sola placa se amplificaron en células HEK-293. Fue extraído el ADN viral a partir del sobrenadante del cultivo usando el Kit de Extracción de ADN Genómico AccuPrep (Bioneer Inc., Alameda, 45 CA) y fue secuenciado para confirmar las mutaciones esperadas.

Reconstrucción de la mutación de deleción en el genoma de dl309: Todas las deleciones se prepararon inicialmente en pXC1 usando el kit de mutagénesis dirigida (Quick change II XL) obtenido de Stratagene, CA, de acuerdo con la recomendación del fabricante. Todos los cebadores usados para preparar la deleción específica son como sigue (SEQ ID NOs:3-12, respectivamente): para dl212 (dl212S- CGG TGT ACA CAG GAA GTG ACA ATC GGT TTT AGG 50 CG y dl212 As-CGC CTA AAA CCG ATT GTC ACT TCC TGT GTA CAC CG), dl220 (dl220S AGT GAC AAT TTT CGC GCA GGC GGA TGT TGT AGT A y dl220AS: AGT GAC AAT TTT CGC GCA GGC GGA TGT TGT AGT A), dl275 (dl275S: GTA ACC GAG TAA GAT TTG GCC ATG GAA AAC TGA ATA AGA GG y dl275AS: CCT CTT ATT CAG TTT TCC ATG GCC AAA TCT TAC TCG GTT AC), dl200 (dl200S: GCG CCG GTG TAC ACA GAC AAT TTT CGC GCG y dl200AS: CGC GCG AAA ATT GTC TGT GTA CAC CGG CGC), dl230 (dl230S: TTC GCG CGG TTT 55 TAG GCT GTA GTA AAT TTG GGC G y dl230AS: CGC CCA AAT TTA CTA CAG CCT AAA ACC GCG CGA A). Los plásmidos mutados fueron primero secuenciados para verificar la mutación deseada y la letra fue amplificada usando el Kit HiPur Plasmid Midiprep (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para crear la mutación deseada en el genoma de

dl309, el pXC1 mutado que contenía la mutación deseada fue co-transfectado con pJM17 en células HEK-293 (ATCC, Manassas, VA) usando el Reactivo de Transfección Fugene6 (Roche, Suiza). Las células fueron revestidas con Agarosa de Placa Sea al 1,0 % en medio de cultivo para obtener plagas individuales en 10 días. Después de la purificación de la plaga dos veces, los virus de una sola placa se amplificaron en células HEK-293. Fue extraído el ADN viral a partir de las células cultivadas infectadas con el virus mutante usando el Kit de Extracción de ADN 5 Genómico AccuPrep (Bioneer INc, Alameda, CA) y se amplificó por PCR y después de secuenció para confirmar las mutaciones esperadas.

Infección del virus, multiplicación y cuantificación: Todos los virus se multiplicaron en células HEK-293A. Las células se infectaron con MDI de 5 (para el genoma de Ad5) o 10 (para el genoma de dl309) y después de 3 días después de la infección, las células se recogieron y se re-suspendieron en medio completo y se lisaron mediante 3 ciclos de 10 congelación/descongelación. Los lisados se clarificaron haciéndolos pasar a través de un filtro de 0,4 µm (Millipore, EE.UU.). Se añadió glicerol a las muestras a una concentración final de 10 % (v/v) y se congelaron a -80 °C. Para cuantificar el título del virus, se realizaron ensayos de placa como se describe por Clontech, EE.UU.

Preparación de lisados de células y análisis de inmunotransferencia: Para el análisis de transferencia Western, se prepararon extractos de células a partir de varias líneas celulares infectando células con adenovirus con MDI de 5 y 15 se prepararon lisados de células enteras usando reactivo de extracción de proteína mamífera M-PER® (Pierce, EE.UU.) a varios puntos de tiempo después de la infección. La proteína se estimó usando el reactivo de Bradford (Bio-Rad, EE.UU.), y se ebullieron 25 µg de muestras de proteína durante 5 min en tampón de muestra que contenía SDS al 2%, ditiotreitol 100 mM, Tris-HCl 0,05 M (pH 6,8), glicerol al 10% y azul de bromofenol al 0,1%. Las proteínas se analizaron en geles bis-Tris de 4 a 12% de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, CA). Las 20 muestras de proteína se separaron por SDS-PAGE, se corrieron en un gel de Bis-Tris al 4-12% (para genoma Ad5), y se transfirieron en una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF), Immobilon-Psq (Millipore, EE.UU.) como se describe por el fabricante. Las proteínas de E1a y/ E1b se detectaron, por ejemplo, usando anticuerpo policlonal frente a proteína de E1A de Ad2 (Santa Cruz, EE.UU,) y antisuero monoclonal frente a proteína de E1b-55, recibida del Dr. A.J. Levine (Nueva Jersey, EE.UU.). 25

Análisis PCR cuantitativa a tiempo real: Se extrajo ARN usando el mini kit RNase Easy plus (Qiagen, EE.UU.) y 1,5 µg de total ARN se transcribieron a la inversa en cADN usando Transcriptasa Inversa de AMV (Invitrogen, EE.UU.). Se realizó la PCR cuantitativa (Q-PCR) por triplicado usando reactivo verde de Power Cyber de Applied Biosystems, y la reacción se realizó en un sistema de detección de secuencia 7900 HT de AB Prism. Se usaron como control muestras de ARN sin transcripciones inversas. Los datos se analizaron usando el software SDS 2.2.1 proporcionado 30 por Applied Biosystems, EE.UU.

Construcción del plásmido: Se amplificó por PCR la secuencia de ADN del promotor/potenciador de E1A del adenovirus (Ad5) (de +52 a -357) usando los cebadores Ad143F y Ad552R (Directo 5'GGGGTACCAC ATG TAAG CGAC GGATG TGGC3' (SEQ ID NO:13) e Inverso 5'AAACTCGAGCCCGGTGTCGG AGCGGCT3' (SEQ ID NO:14)) con los sitios de restricción de 5' BamHI y XhoI, respectivamente e insertado en vector reportero de luciferasa pGL3-35 Basic, un vector sin promotor y sin potenciador (Promega, EE.UU.) y denominado pE1AP/EGL3. El plásmido se secuenció (Eton Biosciences, EE.UU.) para verificar la exactitud del promotor/potenciador de E1A.

Transfección transitoria y actividad de luciferasa: Para los experimentos de transfección transitoria, las células se pusieron en placas de 6 pocillos (5x105 células/pocillo) el día anterior a la transfección. Las células se transfectaron mediante el método de transferencia génica mediada de PolyFect® como se describe en el manual de Qiagen. 40 Brevemente, se mezclaron 25 microlitros de reactivo de polyFect con 125 microlitros de DMEM (Highclone) conteniendo 1 microgramo del plásmido reportero de luciferasa (pE1AEG13) o el vector pGL3-Control de luciferasa (Promega, Madison, EE.UU.) y 20 ng (relación 50:1) del vector de expresión de luciferasa de Renilla pRLCMV (Promega) como control interno para normalizar los valores obtenidos con el constructo de luciferasa. La mezcla se incubó durante 10 min a temperatura ambiente para permitir la formación de complejos. La mezcla entonces se 45 diluyó en 1,0 ml de DMEM y se añadió a los cultivos de células. Se cultivaron las células durante 24 a 48 h, y se lisaron con tampón de lisis pasivo (Promega). Se midió la actividad de luciferasa de Firefly y Renilla mediante el kit de ensayo de luciferasa dual (Promega, EE.UU.), como se especifica por el fabricante, en un luminómetro, Veritas (Turner Biosystems, CA, EE.UU.). Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces y representan la actividad de luciferasa relativa como promedio. 50

Ensayo de viabilidad celular: Se realizaron ensayos de viabilidad celular por triplicado usando el Kit-8 de recuento de células (Dojindo, Rockville, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se sembraron células (MRC-5, A549, PANC-1 o AsPC-1) en placas de cultivo celular de 96 pocillos a una densidad de 1x104 por pocillo. Al día siguiente, las células se infectaron con el virus (Wt Ad5, TAV-255, ONYX-015, dl309, o dl200+230) con un MDI de 5. Posteriormente, los virus se aspiraron, se añadió medio reciente a cada pocillo y se incubó durante 4-6 55 días. A cada pocillo, se añadieron 10 µl de reactivo y se incubó en un incubador de CO2 durante 4h, y luego la placa se leyó a 450 nm en un GENious pro (Tecan, EE.UU.), lector de placa de 96 pocillos. Las absorbancia se registró y se calculó la viabilidad celular como sigue:

Valor de promedios de A450 nm de

células no infectadas

Valor de promedios de A450 nm de

células infectadas

Viabilidad celular

También se visualizó el efecto citopático bajo la luz del microscopio y se fotografiaron con una amplificación 100x. También se realizaron experimentos con violeta de cristal para cuantificar la viabilidad celular en algunos casos (Fueyo, J., et al. (2003). “Preclinical characterization of the antiglioma activity of a tropism-enhanced adenovirus 5 targeted to the retinoblastoma pathway”. Journal of the National Cancer Institute 95: 652-660).

B. Expresión selectiva de las isoformas de E1a 12S y 13S

Virus y células: Se obtuvieron células A549 (carcinoma de pulmón), Calu-6 (carcinoma de pulmón), Panc-1 (carcinoma pancreático), LnCaP (adenocarcinoma de próstata), Hep-3b (carcinoma hepatocelular), y MRC-5 y WI-38 (fibroblasto de pulmón) de la Colección de Cultivo Tipo Americana (ATCC), y se cultivaron en medio Eagle de 10 Dulbecco Modificado suplementado con suero de becerro fetal al 10% en presencia de CO2 al 5% excepto LnCap, que se mantuvo en RPMI suplementado con suero de becerro fetal al 10% , carbonato de sodio al 1%, piruvato de sodio al 1% y aminoácidos no esenciales al 1%. Se pusieron en contacto cultivos de MRC5 y WI-38 inhibidos haciéndolos crecer hasta una confluencia del 100 % seguido de una incubación de 5 días con inhibición de contacto antes de la infección. Se proporcionaron los virus PM975 y dl1500 a los inventores por gentileza del Dr. Arnold Berk 15 en UCLA.

Análisis de transferencia Western: Se prepararon lisados de células enteras de muestra usando reactivo de extracción de proteína mamífera de M-PER (Pierce) con inhibidor de proteasa HALT (Pierce) a 1 µl/ml en varios puntos de tiempo después de la infección. La proteína se estimó usando el reactivo Bradford (Bio-Rad, EE.UU.) y se ebullieron 20 mg de muestras de proteína. Las muestras se sometieron a electroforesis en geles de Bis-Tris 20 (Invitrogen, CA) al 4-12% de 1,5 mm en tampón de corrido de NuPAGE MOPS SDS durante 60 / min a 190V. Las muestras se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF), Immobilon-Psq (Millipore, EE.UU.) durante 60 min a 100V. Después de la transferencia, las membranas se bloquearon durante 60 min en tampón de bloqueo T20 (TBS) (Thermo Scientific) con agitación suave. Después del bloqueo, las membranas se incubaron en una dilución 1:250 de anticuerpo policlonal de E1A adenoviral (#sc-430, Santa Cruz Biotechnology) diluido en 25 tampón de bloqueo toda la noche (12-18 h) a 4°C. Las membranas se lavaron con TBST, se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min con IgG anti-conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (#sc-2357, Santa Cruz Biotechnology) en una dilución 1:2000 en TBST, se aclararon tres veces con TBST durante 5 min y luego se lavaron en TBS durante 5 min. Las membranas se transfirieron secas, se incubaron en 2 ml de Sustrato Quimioluminescente SuperSignal West Pico (Pierce, Rockford, IL) y se transfirieron secas. Las transferencias se 30 colocaron en una carpeta de revelado y se transfireron a un casete de película. Las membranas se expusieron a la película (Denville Scientific, Metuchen, NJ). Se obtuvieron exposiciones de 2 y 5 s.

Análisis de citotoxicidad: Se realizaron ensayos de viabilidad celular por triplicado usando el Kit-8 de recuento de células (Dojindo, Rockville, EE.UU.). Las células se sembraron en placas de cultivo celular de 96 pocillos a una densidad de 1000 por pocillo. Las placas se trataron 16 horas después de colocar en las placas con los virus WT, 35 Onyx-015, PM975, o dl1500 a varios MDI con 10 µl de una solución viral/medio de cultivo. Las placas se incubaron durante el tiempo deseado a 37°C y CO2 al 5%. Después de la incubación, las muestras se trataron con 10 µl de solución CCK-8 de Dojindo en cada pocillo. Las placas se leyeron a 450 nm usando un lector de placas de 96 pocillos de GENious pro (Tecan, EE.UU.) después de 4 horas de incubación.

C. Inserto del clon de E1b 19K 40

Construcción del Virus: Ad TAV-255/dl 19kCD154-TNF se construyó como sigue: Se usó el plásmido pXC1( Microbic, Ontario, Canadá) para delecionar 50 bp del elemento de E1a del potenciador/promotor desde 194-254 respecto al brazo izquierdo de la repetición terminal invertida de Ad 5 mediante mutagénesis dirigida. El plásmido resultante se modificó para que contuviera un Sal I en bp1716 y un XhoI en 1916, lo que da como resultado una deleción de la proteína E1b-19KD bajo restricción de estas enzimas. El CD154-TNF se amplificó por PCR usando el 45 plásmido pCDNA3CD154-TNF y se clonó en los sitios Sal I y Xho I del plásmido descrito. El virus recombinante se preparó por recombinación homóloga entre el plásmido JM 17 y el plásmido de expresión de pXC1 conteniendo el casete de TNF estabilizado de membrana en células 293. Brevemente, se cultivaron células 293 hasta una confluencia del 60-70% en el día de la transfección. Las células y el sobrenadante se recogieron 10 días después de la infección. Después de tres ciclos de congelación-descongelación, se realizó el ensayo de placa, las placas 50 individuales se purificaron y el ADN del virus recombinante se aisló y se caracterizó para la expresión de moléculas de TNF.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y un adenovirus recombinante, en donde el adenovirus comprende una secuencia regulatoria de E1 a modificada en donde al menos un sitio de unión de Pea3, o una porción funcional del mismo, es delecionada; en donde la porción funcional de al menos un sitio de unión de Pea3 es una porción del sitio de unión que, cuando es delecionada, disminuye la afinidad 5 de unión del sitio de unión a Pea3.
2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde al menos un nucleótido en el intervalo de -305 a -141 es retenido.
3. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 ó 2, en donde al menos uno de Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV y Pea3 V, o una porción funcional del mismo, es delecionada, opcionalmente en donde la materia objeto seleccionada 10 de a), b) y c) es delecionada:

a) al menos uno de Pea3 II y Pea3 III, o una porción funcional del mismo;

b) Pea3 II o una porción funcional del mismo y Pea3 III o una porción funcional del mismo; y

c) al menos uno de Pea3 IV y Pea3 V o una porción funcional del mismo.
4. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde Pea3 I, o una porción funcional 15 del mismo, es retenido, opcionalmente en donde al menos un sitio de unión de E2F, o una porción funcional del mismo, es retenido; en donde la porción funcional de al menos un sitio de unión de E2F es una porción del sitio de unión que, cuando es delecionada, disminuye la afinidad de unión del sitio de unión a E2F.
5. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde dicho adenovirus recombinante comprende la deleción de nucleótidos localizados secuencia arriba de un sitio de iniciación de E1a, en donde la deleción se 20 selecciona de:

(a) nucleótido de -393 a -304;

(b) nucleótido de -305 a -255;

(c) nucleótido de -270 a -240;

(d) nucleótido de -299 a -293; 25

(e) nucleótido de -270 a -265; o

(f) nucleótido de -299 a -293, y nucleótido de -270 a -265.
6. Una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para uso en el tratamiento del cáncer.
7. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la composición farmacéutica 30 es para poner en contacto una célula diana.
8. Un método in vitro de expresar selectivamente un péptido en una célula diana que comprende poner en contacto la célula diana con un adenovirus recombinante en donde el adenovirus comprende una secuencia reguladora de E1a modificada en donde al menos un sitio de unión de Pea3, o una porción funcional del mismo, es delecionada; en donde la porción funcional de al menos un sitio de unión de Pea3 es una porción del sitio de unión que, cuando es 35 delecionada, disminuye la afinidad de unión del sitio de unión a Pea3, con la condición de que el método no es un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia.
9. La materia objeto de la reivindicación 7 u 8, en donde el virus recombinante comprende una secuencia reguladora del mutante de deleción E1 unido operativamente a una secuencia de nucleótido que codifica un péptido.
10. La materia objeto de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde la célula diana se selecciona de una 40 célula neoplásica y una célula normal.
11. La materia objeto de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho virus recombinante expresa de forma selectiva una isoforma de E1a, en donde la secuencia que codifica la isoforma de E1a está operativamente unida a dicha secuencia reguladora de E1 a modificada.
12. La materia objeto de la reivindicación 11, en donde el adenovirus recombinante expresa de forma selectiva E1a-45 12S o E1a13S.
13. La materia objeto de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho adenovirus recombinante excluye sustancialmente la expresión de una isoforma de E1a, en donde la secuencia que codifica la isoforma de E1a está operativamente unida a dicha secuencia regulatoria de E1a modificada.
14. La materia objeto de la reivindicación 13, en donde la isoforma excluida de E1a es E1a-12S o E1a-13S.
15. La materia objeto de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el adenovirus recombinante 5 comprende además una secuencia de ADN insertada en un sitio de inserción de E1b-19K.
16. La materia objeto de la reivindicación 15, en donde el sitio de inserción se localiza entre el sitio de inicio de E1 b-19K y el sitio de inicio de E1b 55K.
17. La materia objeto de la reivindicación 15 ó 16, en donde el sitio de inserción de E1b-19K comprende una deleción de 202 pares de bases siguientes al sitio de inicio de E1b-19K. 10
18. La materia objeto de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en donde la secuencia de ADN es una secuencia que codifica un factor de necrosis tumoral o una porción funcional del mismo.
19. La materia objeto de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en donde la secuencia de ADN es una secuencia que codifica kras o una porción funcional del mismo.

15