KR20210089135A

KR20210089135A - 글리코겐 합성효소 키나아제-3(gsk3)에 대한 코딩 영역을 포함하는 재조합 복제 가능 바이러스 및 비정상 세포 사멸 방법

Info

Publication number: KR20210089135A
Application number: KR1020217009417A
Authority: KR
Inventors: 원량 동; 탄자 데니스 드 그루이즐; 마르타 로페즈 곤자레즈; 빅터 빌럼 반 뷰세켐
Original assignee: 오르카 테라퓨틱스 비.브이.
Priority date: 2018-08-31
Filing date: 2019-08-30
Publication date: 2021-07-15
Also published as: WO2020046130A1; EP3844286A1; JP2022500013A; CN113015806A; US20210205383A1

Abstract

일 측면에서 본 발명은, 발현(expression) 조절(control) 서열에 작동 가능하게 연결된 글리코겐 합성효소 키나아제-3(glycogen synthase kinase-3, GSK3) 단백질에 대한 코딩 서열(coding sequence)을 아데노바이러스(adenovirus)의 게놈(genome)에 포함하는 숙주 세포 내에서 복제할 수 있으며 숙주 세포를 용해시킬(lyse) 수 있는, 재조합 복제 가능 아데노바이러스(recombinant replication competent adenovirus)에 관한 것이다. 특히, 바람직하게는 아데노바이러스의 맥락에서, 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 글리코겐 합성효소 키나아제-3(GSK3) 단백질에 대한 코딩 서열로 암을 치료하는 수단 및 방법에도 관련 있다. 이 작업은 부분적으로 유로피안 유니온 호라이존 2020 연구 및 혁신 프로그램(European Union Horizon 2020 research and innovation programme)인 마리 스크워도프스카 퀴리(Marie-Sklodowska-Curie) 수여 번호(grant number) 643130에 의해 지원되었다.

Description

글리코겐 합성효소 키나아제-3(GSK3)에 대한 코딩 영역을 포함하는 재조합 복제 가능 바이러스 및 비정상 세포 사멸 방법

글리코겐 합성효소 키나아제-3(GSK3)는 세포 증식(cell proliferation), 세포사멸(apoptosis), 신경 기능(neural function), 대사(metabolism), 배아 발달(embryonic development) 및 인슐린 신호 전달(insulin signaling)과 같은 다양한 세포 과정(cellular processes)에 관여하는 다기능 효소(multifunctional enzyme)이다(1, 2). 이 단백질에는 알려진 두개의 이소형(isoform)이 있다: GSK3-알파(GSK3-alpha) 및 GSK3-베타(GSK3-beta). 효소는 다른 잔기(residues)에서 인산화(phosphorylation)를 통해 활성화(activation) 또는 비활성화(inactivation)된다. 두 이소형은 유사한 구조를 가지고 있지만 세포 기능이 다르며 다른 유전자에 의해 암호화(encoded)된다(3).

단백질의 활성화 및 비활성화의 한 가지 방법은 티로신(Y)(tyrosine(Y)) 및 세린(S)(serine(S)) 잔기의 번역 후(post-translational) 인산화를 통해 발생한다. GSK3-알파 및 GSK3-베타는 비자극(non-stimulated) 휴지기(resting) 세포에서 활성인 것으로 생각된다. 두 이소형 모두 GSK3-알파의 Y279 잔기와 GSK3-베타의 Y216을 자가 인산화(auto-phosphorylate) 할 수 있다. 이러한 위치에서의 인산화는 단백질의 촉매(catalytic) 활성(activity)을 증가시키는 것으로 알려져 있다. GSK3-알파의 S21과 GSK3-베타의 S9의 인산화는 각각의 단백질을 비활성화시킬 수 있다; 이러한 인산화된 잔기는 기질 결합 부위를 차단하여 GSK3 기능(functionality)을 억제할 수 있다(4, 5).

GSK3의 규제 완화(deregulation)는 여러 질병과 관련이 있다. 주목할 만한 것은 신경 퇴행성 질환(neuro-degenerative disorders), 당뇨병(diabetes) 및 암이다(1, 2). GSK3의 과발현(over-expression)과 GSK3의 종양 촉진(tumor promoting) 또는 억제(suppression)에 미치는 영향(implication)이 보고되었다; 그러나, 세포 유형과 인산화 상태에 따라 달라질 수 있다(6-8).

GSK3의 과발현은, 생존(survival), 세포 성장(cell growth) 및 혈관 신생(angiogenesis)을 가능하게 하는(facilitating) 종양 촉진제(tumor promoter)로서 역할을 할 수 있는 여러 유형(types)의 종양에서 설명되었다(9, 10). GSK3는 다형교모세포종(glioblastoma multiform), 췌장암(pancreatic cancer), 대장암(colorectal cancer), 신장암(renal cancer), 백혈병(leukemia) 및 난소암(ovarian cancer)에서 암 촉진제(cancer promoter)로 여겨진다(5).

GSK3-베타의 비활성화는 여러 암 유형에서 보고되었다. GSK3-베타는 피부암(skin cancer), 유방암(mammary cancer), 구강암(oral cancer) 및 폐암(lung cancer)에서 종양 억제제(tumor suppressor)로 여겨진다(5, 11-13).

구성적으로(constitutively) 활성인 GSK3-베타를 생산하는 한 가지 방법은 위치 9(S9A-GSK3-베타)에서 알라닌(alanine)을 세린(serine)으로 치환하는(substituting) 것이고, 이것은 단백질을 비활성화 할 수 있는 위치에서 인산화된 세린의 형성을 방지한다. 몇몇 그룹은 GSK3가 종양을 유발(pro-tumorigenic)하는 것으로 알려진 암에서 GSK3-베타 활성을 억제하는 소분자(small molecules)를 설계했다(14-16).

복제 가능 아데노바이러스는 최근 몇 년 동안 암 치료 요법제(therapy)에서 종양용해성(oncolytic) 제제(agents)로서 새로운 관심을 끌고 있다. 현재의 접근법은, 정상 세포와 반대로 종양 세포에서 우선적인(preferential) 바이러스성(viral) 복제를 가능하게 하는 아데노바이러스 게놈의 변형(modifications)을 사용한다. 이러한 점에서 아데노바이러스 돌연변이체(mutant) "ONYX-015" 및 Delta24 아데노바이러스는 전형(archetypes)으로 작용할 수 있다. ONYX-015 바이러스는 E1B 55 kDa 단백질을 코딩하는 영역에 결실(deletion)을 갖고 있다. 그 결과, 바이러스는 효율적인 바이러스 복제에 필요한 p53 활성을 하향 조절(down-regulating)할 수 없다. Delta24 바이러스는 RB 단백질 결합을 담당하는 영역을 포함하는(encompass) 바이러스성 E1A 유전자에서 결실을 전달한다. RB의 결합은 세포를 포함하는 RB에서 효율적인 복제를 위해 필요하다.

본 발명은 GSK3가 아데노바이러스의 복제 및/또는 종양용해성(oncolytic) 속성(property)을 촉진하기 위해 사용되는 첫 번째 것이다. 이것은, 예를 들어, 감염된(infected) 종양 세포의 사멸을 촉진하고 암의 치료를 위해 본 발명에서 사용된다.

본 발명은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 글리코겐 합성효소 키나아제-3(glycogen synthase kinase-3, GSK3) 단백질에 대한 코딩 서열을 아데노바이러스의 게놈에 포함하는 재조합 복제 가능 아데노바이러스를 제공한다.

또한, 본 발명의 아데노바이러스를 암 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다.

추가로, 암에 걸린 개체의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 아데노바이러스가 제공된다.

추가로, 본 발명의 아데노바이러스와 함께 상기 암세포를 포함하는 종양을 제공하는 것을 포함하는 암세포를 사멸하는 방법이 제공된다.

또한, 허용 세포(permissive cell)에서 재조합 복제 가능 아데노바이러스의 복제의 속도(rate)를 향상시키는 방법에 있어서, 상기 세포에서 코딩 서열을 발현하기 위한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 GSK3 단백질에 대한 코딩 서열을 상기 아데노바이러스의 게놈에 제공하는 단계를 포함하는, 허용 세포에서 재조합 복제 가능 아데노바이러스의 복제의 속도를 향상시키는 방법이 제공된다.

추가로, 종양용해성 재조합 복제 가능 아데노바이러스의 종양용해성 속성을 증가시키는 방법에 있어서, 코딩 서열을 발현하기 위한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 GSK3 단백질에 대한 코딩 서열을 상기 아데노바이러스의 게놈에 제공하는 단계를 포함하는, 종양용해성 재조합 복제 가능 아데노바이러스의 종양용해성 속성을 증가시키는 방법이 제공된다.

추가적인 측면에서, 종양에서 재조합 복제 가능 아데노바이러스의 복제의 속도 및 확산을 증가시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 종양의 세포에서 코딩 서열 발현을 위한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 GSK3 단백질에 대한 코딩 서열을 종양용해성 아데노바이러스에 제공하는 단계를 포함한다.

또한, 재조합 아데노바이러스의 복제의 속도를 향상시키기 위한 코딩 서열을 발현하기 위해 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 GSK3 단백질에 대한 코딩 서열의 용도가 제공된다.

추가로, 본 발명의 아데노바이러스와 추가 약제(medicament), 바람직하게는 암 약제(cancer medicament)를 포함하는 병용물(combination)이 제공된다.

본 발명은 또한 치료 방법 또는 치료제에 사용하기 위한 본 발명의 아데노바이러스를 제공하며, 상기 치료제는 동시(concurrent) 또는 순차적(sequential) 방사선 요법제(radiotherapy), 항체 요법제(antibody therapy), 화학 요법제(chemotherapy), 세포 요법제(cell-therapy), 면역 요법제(immunotherapy) 또는 기타 항암 개입(anticancer intervention) 또는 치료제(treatment)의 투여(administration)를 더 포함한다.

도 1. GSK3-베타 발현 아데노바이러스는 시험관내에서(in vitro) 인간 암세포의 성장을 억제하지만(inhibits), 시험관내에서 원발성(primary) 비-악성(non-malignant) 인간 세포의 성장을 억제하지 않는다. 도 1A. GSK3-베타 발현 아데노바이러스는 시험관내에서 암세포 증식(proliferation)을 억제한다. GSK3-베타 발현 아데노바이러스(adGSK3b)는 4가지 흑색종(melanoma) 세포주(SK-MEL-28, JUSO, MEL57 및 WM9)의 성장을 억제한다. 대조군으로서 아데노바이러스(adLuc)를 발현하는 루시페라제(luciferase)가 사용되었다. 세포가 감염되었고 배양기(culture)에서 8일 동안 추적되었다(followed); IncuCyte으로 4 시간마다 웰의 사진을 찍었다. 도 1B. GSK3-베타 발현은 정상적인 원발성 섬유아세포(primary fibroblasts)의 성장에 영향을 미치지 않는다. GSK3-베타 발현 아데노바이러스는 형질 전환되지 않은 원발성 인간 섬유아세포의 성장을 억제하지 않는다. 대조군으로 암세포주 JUSO를 함께 사용하여 성장을 억제했다. 도 1C. ad.LUC 또는 ad.CA.GSK3-베타(Ad.CA.GSK3-beta)로 감염된 후 6일째에 원발성 섬유아세포 사진.
도 2. ad.CA.GSK3-베타를 사용한 형질 도입(transduction)에 의한 다른 흑색종 세포주에서 세포의 세포사멸(apoptosis) 유도(induction). 도 2A. Ad.CA.GSK3-베타로 감염된 암세포는 1일째에 눈에 띄게 영향을 받으며, 더 둥근 표현형(phenotype)은 세포사멸의 시작을 나타낸다. 3일째에 카스파제(caspase) 3/7 양성 세포(녹색)의 수가 증가한다. 6일째에 ad.CA.GSK3b가 있는 암세포는 대부분 세포사멸 마커(apoptotic marker)에 대해 양성인 반면 대조군 바이러스로 형질 도입된(transduced) 암세포는 세포사멸 세포(apoptotic cells)를 거의 보이지 않는다. SK-MEL-28 세포주 데이터가 예시로 표시된다. 도 2B. ad.LUC vs ad.CA.GSK3-베타로 형질 도입된 세포의 효과를 비교한 상이한 시점에서 상이한 흑색종 세포주의 상대적 세포사멸. Ad.CA.GSK3-베타는 Ad.Luc 보다 일찍 세포사멸을 유도하여, GSK3-베타의 구성적으로 활성인 형태를 발현하는 아데노바이러스로 흑색종 세포를 감염시키는 종양용해성 효과를 보여준다.
도 3. GSK3-베타 발현 아데노바이러스는 원발성 흑색종 종양(primary melanoma tumor) 현탁액(suspensions)에서 선택적으로 암세포 사멸을 유도한다.
도 4. GSK3-베타의 발현은 아데노바이러스의 복제를 향상시킨다.
도 4A는 감염되지 않은(uninfected) 911 세포(911 cells)와 그의 성장 동역학(growing kinetics)을 보여주며 3일째에 합류(confluency)에 도달한다. 도 4B는 1 MOI에서 ad.LUC로 감염된 911 세포를 보여주며 3일 반(감염 후 84시간)째에 완전한 세포병원성 효과(cytopathogenic effect, CPE)를 가졌다. GSK3-베타 발현 아데노바이러스(ad. CA-GSK3-베타)는 감염 후 1일째에 완전한 CPE를 가졌다(도 4C).
도 5. Dong et al. (2014, Human Gene Therapy 25: 897-904)에서 설명된 ORCA-10 바이러스(ORCA-10 virus)를 코딩하는 DNA 구조(DNA construct)의 도식적 표현, CMV 프로모터(CMV promoter)의 조절하에 GSK3베타S9A(GSK3betaS9A)에 대한 코딩 영역을 포함하는 상동성 재조합 구조(homologous recombination construct)의 도식적 표현; 및 CMV 프로모터의 조절하에 GSK3베타S9A(GSK3betaS9A)에 대한 코딩 영역을 갖는 ORCA-10 바이러스를 포함하는 재조합된(recombined) 구조의 도식적 표현.
도 6. Dong et al. (2014, Human Gene Therapy 25: 897-904)에서 설명된 ORCA-10 바이러스를 코딩하는 DNA 구조의 도식적 표현, SV40 프로모터(SV40 promoter)의 조절하에 GSK3베타S9A에 대한 코딩 영역을 포함하는 상동성 재조합 구조의 도식적 표현; 및 SV40 프로모터의 조절하에 GSK3베타S9A에 대한 코딩 영역을 갖는 ORCA-10 바이러스를 포함하는 재조합된 구조의 도식적 표현.
도 7. Dong et al. (2014, Human Gene Therapy 25: 897-904)에서 설명된ORCA-10 바이러스를 코딩하는 DNA 구조의 도식적 표현, CMV 프로모터의 조절하에 있는 루시페라제 코딩 영역인 rLuc에 대한 코딩 영역을 포함하는 상동성 재조합 구조의 도식적 표현; 및 상기 언급된 CMV 프로모터의 조절하에 rLuc에 대한 코딩 영역을 갖는 ORCA-10 바이러스를 포함하는 재조합된 구조의 도식적 표현.

GSK3-알파(GSK3-alpha)는 글리코겐 합성효소 키나아제 3 알파(Glycogen Synthase Kinase 3 Alpha); 세린(Serine)/트레오닌(Threonine)-단백질 키나아제 GSK3A; GSK3 알파; 및 글리코겐 합성효소 키나아제-3 알파와 같은 이름으로도 알려져 있다. GSK3 알파에 대한 참조 서열(reference sequence)은 수탁 번호(accessions numbers): HGNC: 4616; 엔트레즈 유전자(Entrez Gene): 2931; 앙상블(Ensembl): ENSG00000105723; OMIM: 606784 또는 UniProtKB: P49840 에서 찾을 수 있다. GSK3-베타(GSK3-beta)는 글리코겐 합성효소 키나아제 3 베타; 세린/트레오닌-단백질 키나아제 GSK3B; GSK3 베타; 글리코겐 합성효소 키나아제-3 베타; 및 GSK3 베타 이소형(Isoform)과 같은 이름으로도 알려져 있다. GSK3 베타에 대한 참조 서열은 수탁 번호: HGNC: 4617; 엔트레즈 유전자(Entrez Gene): 2932; 앙상블(Ensembl): ENSG00000082701; OMIM: 605004; 및 UniProtKB: P49841 에서 찾을 수 있다. 참조 서열은 유전자를 확인하기 위해서만 제공된다. 유전자가 각각의 수탁 코드에 대해 데이터베이스에 표시된 것과 정확히 동일한 서열을 반드시 가지고 있음을 의미하지는 않는다. 서열의 자연 및 재조합 변이체(variants)는 유전자 이름에 포함된다(encompassed).

본원에 설명된 바와 같이 아데노바이러스에 의해 암호화되는 GSK3 단백질은 바람직하게는 GSK3-베타 단백질이다. GSK3 단백질은 바람직하게는 구성적으로 활성인 돌연변이체 단백질이다. 그 점에서 GSK3 단백질은 바람직하게는 위치 9(position 9)에서의 세린 잔기가 또 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌 잔기로 치환된 GSK3-베타 단백질이다.

GSK3에 대한 코딩 서열은 일반적으로 유전자의 cDNA를 포함한다. cDNA는 일반적으로 게놈 서열(genomic sequence)보다 짧고, 재조합 바이러스(recombinant virus)에서 짧은 서열이 선호된다. 다른 한편으로, 세포에서의 발현은 일반적으로 하나 이상의 인트론(introns)의 존재에 의해 향상된다. 이러한 인트론은 GSK3 유전자의 천연 인트론일 수 있다. 바람직하게는, 인트론은 인공(artificial) 인트론이며, 바람직하게는 코딩 영역을 포함하는 전구체-mRNA(pre-mRNA)의 5' -비 코딩 영역(5'-non coding region)에 도입된다(introduced).

코딩 영역은 바람직하게는 프로모터와 같은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 프로모터는 일반적으로 인핸서(enhancer) 서열에 연결된다. 프로모터와 인핸서의 조합을 때때로 총칭하여 프로모터라고 한다. 프로모터는 종양 세포에서 활성인 프로모터이다. 바람직한 프로모터는 CMV 프로모터, SV40 프로모터 또는 PGK 프로모터와 같은 하우스 키핑 유전자(house keeping gene) 프로모터이다. 또한, 발현 조절 서열은, 예를 들어, 아데노바이러스 혈청형(serotype) 5의 내인성 주요 후기 프로모터(major late promoter, MLP)의 내인성(endogenous) 바이러스성(viral) 프로모터일 수 있다. 이 경우, 코딩 서열은, 예를 들어, 아데노바이러스 혈청형 40 긴 섬유 유전자(adenovirus serotype 40 long fiber gene)의 삽입된 스플라이스-수용체 부위와 유사한(analogous to) 삽입된 스플라이스-수용체 부위(an inserted splice-acceptor site)에 대한 대체 스플라이싱(splicing)을 통해, MLP에 작동 가능하게 연결될 수 있다(Carette et al., J Gene Med. 2005 Aug; 7 (8) : 1053-62).

본 발명은 프로모터에 작동 가능하게 연결된 GSK3-베타 코딩 영역을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 바이러스를 제공한다. 재조합 바이러스는 바람직하게는 아데노바이러스(Ad), 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus, HSV), 우두증 바이러스(vaccinia virus), 소아마비 바이러스(poliovirus), 레오 바이러스(reovirus), 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus, VSV), 셈리키 숲 바이러스(semliki forest virus), 세네카 바이러스(senecavirus) 또는 마라바 바이러스(maraba virus)이다. 바이러스는 바람직하게는 복제 가능 바이러스(replication competent virus)이다. 본원에 설명된 바와 같은 재조합 복제 가능 아데노바이러스와 같은 복제 가능 바이러스는 암세포 내에서 복제 및 용해(lyse)될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 복제 가능(replication competent)은 허용 세포에서 복제하기 위해 필요한 모든 기구(machinery)를 보유한 바이러스를 의미한다. 복제 기능(replication competence)은, 예를 들어, 아데노바이러스를 사용하여 추가로 예시된다. 다른 바이러스에도 동일한 원칙이 적용된다. 복제 가능 아데노바이러스는 패키징 셀(packaging cell)에 추가적 아데노바이러스 단백질의 도움이 필요하지 않다. 예를 들어, E1이 삭제된(E1-deleted) 복제 결함이 있는(defective) 아데노바이러스는 효율적인 복제를 위해 트랜스에서(in trans) E1 단백질을 제공하는 보완 세포(complementing cell)가 필요하다. 많은 복제 가능 아데노바이러스는 정상 세포보다 암세포에서 더 효율적으로 복제한다. 이러한 바이러스에 대한 관심은 암세포에서 우선적인 복제를 향상시키기 위해 변형된 최초의 재조합 아데노바이러스와 함께 증가되었다. 변형은, 정상 세포에서 아데노바이러스의 효율적인 복제에 필요하지만 암세포에서는 필요하지 않은 하나 이상의 부분이 변형되거나, 제거되거나 또는 그렇지 않으면 정상 세포에서 발현되지 않도록 조작되는 바이러스 게놈의 변형을 포함한다. 암세포에서 우선적으로(preferentially) 복제하는 아데노바이러스를 "종양용해성 아데노바이러스(oncolytic adenoviruses)" 라고도한다. 본원에서 사용된 종양용해성 아데노바이러스는 비암(non-cancer) 세포에 비해 암세포를 우선적으로 사멸시키는 아데노바이러스를 의미한다. 바람직한 실시예에서, 본원에 설명된 복제 가능 아데노바이러스는 종양 세포에서 아데노바이러스의 우선적 복제를 가능하게 하는 바이러스 게놈의 변형을 포함한다. 변형은, 바람직하게는 바이러스 게놈의 돌연변이(mutation)이다. 돌연변이는, 바람직하게는 E1A 영역, E1B 영역, E4-영역 또는 이들 중 하나 이상의 조합에 있다. 많은 종양용해성 아데노바이러스는 하나 이상의 이러한 영역에 돌연변이를 포함한다. 본 발명에 따른 아데노바이러스는, 바람직하게는 E1A 영역에서 돌연변이, 바람직하게는 E1A의 CR2 도메인의 적어도 일부를 포함(encompassing), 바람직하게는 E1A의 아미노산 122 내지 129(LTCHEAGF)를 포함하는 결실(deletion)을 가지고 있다(carries). 이러한 결실을 델타-24(delta-24) 결실이라고 한다. 표시된 E1a-Δ24 돌연변이를 갖는 E1A의 예는, SEQ ID NO:5의 위치 1551에서 2512까지 표시된다. 본원에 사용된 용어 유전자(gene) 또는 영역(region)은, 예를 들어 인핸서 영역(enhancer region), 프로모터 영역(promoter region) 및 인트론 엔 엑손 서열(intronic en exonic sequences)을 포함하는 유전자의 발현에 필요한 완전한 게놈 영역(genomic region)을 포함한다. 종양 세포에서 우선적인 복제를 가능하게하는 또 다른 돌연변이는 단백질 E1b-55K의 제거(elimination) 또는 적어도 이의 발현이다. E1b-55K는 p53을 비활성화시켜(inactivates) 감염된 세포에서 세포주기(cell cycle)의 S기 진입을 유도하고 세포사멸(apoptosis)을 방지한다. E1b-55K에서 돌연변이된 아데노바이러스는 Onyx-015로 알려져 있다. 이 바이러스는 p53에서 결함이 있는 종양을 치료하는 데 사용되었다. 앞서 언급된 델타-24 돌연변이를 가진 아데노바이러스는 다른 방식으로 종양에서 선택적 복제를 달성한다. 델타-24 돌연변이는 E1a의 보존된 영역 2(CR2)에 영향을 미친다. 이 E1a 영역은 망막모세포종(Retinoblastoma, Rb) 계열의 단백질에 대한 결합을 매개한다. pRb 단백질은 Go/G1 단계에서 세포주기의 S기로의 전이(transition)를 차단하여 E2F와 함께 복합체 전사 억제제(complex transcription inhibitor)를 형성한다. E1a가 pRb에 결합하면, pRb-E2F 복합체의 E2F 전사 인자가 방출되고(released), E2F는 S기 및 E2와 같은 바이러스 유전자로 이동을 전담하는(responsible for) 유전자의 전사 활성화제(transcriptional activator)로 작용한다. 따라서, E2F의 방출은 아데노바이러스의 복제에서 핵심 단계이다. 종양 세포에서는, pRb가 없거나 pRb가 과인산화(hyperphosphorylation)에 의해 비활성화되고(inactivated), E2F가 자유롭기 때문에, 세포주기가 통제되지 않는다. 이러한 세포에서 E1a에 의한 pRb의 비활성화는 이제 필요하지 않다. 따라서, CR2에 돌연변이가 있는 아데노바이러스는, 많은 암세포와 같이 E2F가 없는 세포에서 증식하고(propagates), 기능적(functional) pRb를 갖는 정상 세포에서는 훨씬 덜 효율적으로 복제한다.

바이러스성 프로모터(viral promoter)를 종양 선택적 프로모터(tumor-selective promoter)로 대체하여 우선적 복제를 수행할 수도 있다. 이 실시예에서 변형은 E1A 또는 E1B의 조직 또는 세포 유형 특이적 발현의 프로모터를 포함한다. 예는, E1a 프로모터가 다른 프로모터로 대체된 변형이다. 알파-페토프로테인(alpha-fetoprotein) 프로모터, 전립선 특이적 항원(a prostatic-specific antigen, PSA) 프로모터, 칼리크레인(kallikrein) 프로모터, 뮤신(mucine) 1 프로모터 또는 오스테오칼신(osteocalcin) 프로모터와 같은 다양한 프로모터가 이 효과를 위해 사용되었다. 이러한 아데노바이러스는 (특정) 종양 세포에서 더 효율적으로 복제하지만, 대체 프로모터의 불완전한 차단(shut-off)의 결과로 정상 세포에서도 일부 복제가 수행된다. 오늘날 재조합 아데노바이러스는 하나 이상의 초기(early) 영역 프로모터가 종양 세포 선택적 프로모터로 대체된 경우 존재한다. 다양한 바이러스성 유전자의 조절은 각 바이러스성 유전자에 대한 다른 프로모터, 예를 들어, E1a에 대한 E2F1 프로모터 및 E4에 대한 텔로머라제(telomerase) 프로모터로 수행될 수 있다. 이 경우, 종양용해성 효능(potency)이 많은 종양 세포에 남아 있도록 바이러스성 복제를 허용하기 위해 2개의 프로모터가 적절한 수준으로 발현되어야 한다. 대안적으로, 2개의 바이러스성 유전자는 동일한 프로모터에 의해 조절될 수 있는데, 예를 들어 종양용해성 아데노바이러스 Onyx 411에서 E1a 및 E4는 E2F1 프로모터에 의해 조절된다.

일 실시예에서, 우선적 복제는 복제를 위한 필수 바이러스성 유전자의 바이러스성 프로모터를 종양-선택적 프로모터로 대체함으로써 달성된다. 본 발명의 특정 실시예는, E1A 프로모터의 전부 또는 일부를 E2F(예: E2F1) 반응성(responsive) 프로모터로 대체함으로써 아데노바이러스 E1 단백질, 바람직하게는 E1A 단백질을 선택적 발현함으로써 복제가 비조절된(deregulated) p16/Rb 경로(pathway)를 갖는 세포로 제한되는 종양용해성 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 바람직한 실시예에서 E1A 유전자는 E2F1 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 우선적 복제는 또한 선택성을 달성하기 위한 하나 이상의 다른 수단을 결합하여 달성될 수 있다. 바람직한 조합은 델타-24 돌연변이를 갖는 E1A 유전자를 조절하는 E2F1 프로모터이다(Majem et al., Cancer Gene Ther. 2006 Jul; 13 (7) : 696-705 and Alonso et al., Cancer Res. 2007 Sep 1 ; 67 (17) : 8255-63).

또 다른 측면에서, 변형은 E3-영역(E3-region)에서 핵산 서열의 돌연변이 또는 전체(entire) E3-영역의 결실을 포함한다. E3-영역의 돌연변이는 복제 가능 아데노바이러스의 종양용해성 효과를 향상시킬 수 있다. 그러한 돌연변이 중 하나는 E3-19K의 소포체 잔류 도메인(endoplasmic reticulum retention domain)에서의 돌연변이이다. E3-19K 단백질은 세포막에서 MHC-I의 존재를 조절하는 것으로 알려져 있다. 단백질의 한 기능은 MHC-I에 대한 결합과 관련되고 다른 기능은 소포체(endoplasmic reticulum)에서 E3-19 단백질과 그에 결합된 MHC-I의 잔류(retention)와 관련된다. 세포에서 E3-19k의 발현은 원형질막(plasma membrane)으로의 MHC-I의 이동(transit) 및 MHC-I와 관련된 항원(antigens)의 제시(presentation)를 방지한다. 따라서, E3-19K의 발현은 아데노바이러스 감염 세포에 대한 면역 반응(immune response) 감소와 관련이 있다. 반면에 E3-19K의 돌연변이가 소포체에서의 그것의 잔류를 방해하면 아데노바이러스의 종양용해 가능성(potential)을 높일 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 일 실시예에서 본 발명의 아데노바이러스는 변형된 E3-영역을 포함한다. 변형은 E3-영역의 전체 또는 하나 이상 부분의 결실일 수 있다. 일 실시예에서, 변형은 소포체에서 E3-19K의 잔류를 방지하는 E3-19K 단백질의 돌연변이를 포함한다. 특히, E3-19K의 카르복시-말단 도메인(carboxy-terminal domain)은 소포체에서 E3-19K의 잔류를 방지하고, 원형질막으로의 이동을 유발하기 위해 제거되거나 변형된다. 복제하고 E3-19K의 특정 돌연변이를 포함하는 아데노바이러스는 감염된 세포에서 보다 효율적으로 방출된다. 이러한 더 높은 방출은 더 높은 종양용해성 효과를 유발한다. 이 향상된 종양용해성 효과는 암 치료에 유용하다. E3-19K의 바람직한 돌연변이는 본원에 참고로 포함되는 WO2008/110579에 설명되어 있다. 적합한 E3-돌연변이는 SEQ ID NO:1, 2, 4 및 5에 의해 설명되고 예시된다. 서열은 본원에서 SEQ ID NO:1, 2, 3 및 4로서 반복된다. 본 발명의 복제성(replicative) 아데노바이러스는 바람직하게는 SEQ ID NO: 4를 갖는 카르복시-말단 꼬리를 갖는 E3-19K를 발현한다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, 복제성 아데노바이러스는 적어도 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6을 포함한다. 일 실시예에서 본 발명의 복제성 아데노바이러스는 SEQ ID NO:2를 갖는 카르복시-말단 꼬리(carboxy-terminus tail)를 갖는 E3-19K를 발현하고; 섬유 단백질에 RGD 모티프(RGD motif)의 삽입(insertion)을 갖고(SEQ ID NO:6의 위치 1648-1656으로 정의됨); 및 종양 세포에서 상기 아데노바이러스의 선택적 복제를 부여하는(conferring) 조절 영역(regulatory regions), 상기 조절 영역은 DM1 절연체(insulator)(SEQ ID NO:5의 위치 367-1095으로 정의됨), E2F1 프로모터의 단편(SEQ ID NO:5의 위치 1282-1545으로 정의됨), ccacc kozak 서열(SEQ ID NO:5의 위치 1546-1550으로 정의됨) 및 아데노바이러스 E1a-Δ24 돌연변이체 유전자(SEQ ID NO:5의 위치 1551-2512으로 정의됨)으로 구성된다. 본 발명의 또 다른 목적은 소포체에서 E3-19K의 체류를 방지하는 E3-19K의 소포체 체류 도메인에 돌연변이를 포함하는 복제성 아데노바이러스이며, 상기 아데노바이러스는 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO:1을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 복제성 아데노바이러스는 SEQ ID NO:2를 갖는 카르복시-말단 꼬리를 갖는 E3-19K를 발현한다. 한 실시예에서 복제성 아데노바이러스는 Dong, W et al. (2014, Human Gene Therapy 25: 897-904)에 설명된 ORCA-10이다. GSK3 베타 코딩 영역은 바람직하게는 도 5 또는 도 6에 나타낸 바와 같이 cDNA로서 삽입된다. GSK3 베타는 바람직하게는 구성적으로 활성인 GSK3 베타이다. 구성적으로 활성인 GSK3 베타는 바람직하게는 위치 9의 세린 잔기가 또 다른 아미노산 잔기로 대체된 GSK3 베타이다. GSK3 베타 돌연변이체는 바람직하게는 S9A 돌연변이체이고, 여기서 S는 세린이고 A는 알라닌이다.

본 발명에 따른 아데노바이러스는, 예를 들어, E3 영역의 잔류(Suzuki et al., Clin. Cancer Res. 8 (2002) : 3348-3359) 또는 E1B-19K 유전자의 결실 (Sauthoff et al. Hum. Gene Ther. 11 (2000) : 379- 388)과 같은 그것의 복제 가능성을 증가시키거나, 또는 암세포에서 초기 영역 유전자의 선택적 발현을 가능하게 하기(facilitate) 위한 변형을 포함하나 이에 제한되지 않는 특정 유형의 세포에 대한 복제 선택성을 증가시키거나, 또는 예를 들어, E1B 영역의 잔류와 같은 면역원성(immunogenicity)을 감소 또는 향상시키는 (즉, 동물 신체에 도입 될 때 면역 반응을 유도하는 그들의 효능) 변형을 포함 할 수 있다(Wang et al., Nature Biotechnol. 21 (2003) : 1328-1335).

종양 치료 요법은 종양 세포를 선택적으로 사멸하는 약제(medicaments) 및 치료제(treatments)를 기반으로 한다. 이러한 치료제는 가능한 한 정상적인 '건강한' 세포를 보존하는 것을 목표로 한다. 종양 세포는 다른 것을 중에서 바이러스의 내부 복제로 인한 세포병리(cytopathic) 효과의 결과, 추가적으로 도입된 유전자의 발현의 결과, 종양 세포에 대한 면역 반응 및/또는 기타 원인(예: 바이러스와 관련된 추가적인 독소(들)(toxin(s))에 제한되지는 않는다)로 죽을 수 있다. 종양의 용해를 소위 종양용해성라고 한다. 종양에서 선택적으로 복제하는 아데노바이러스를 종양용해성 아데노바이러스라고 한다. 종양용해성 아데노바이러스는 암세포에서 우선적으로 복제하도록 개발된 복제 가능 아데노바이러스이다. 바이러스가 암세포에서 유래한 것과 동일한 세포 유형에서 파생된 건강한 세포보다 상기 암세포에서 20 %, 바람직하게는 30 %, 40 %, 50 %, 80 % 더 바람직하게는 100 % 더 빠르게 복제할 때, 복제는 암세포에 대해 우선적이다.

본 발명은, 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 글리코겐 합성효소 키나아제-3(GSK3) 단백질에 대한 코딩 서열을 아데노바이러스의 게놈에 포함하는 재조합 복제 가능 아데노바이러스를 암 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.

암이라는 용어는 악성 원발성(malignant primary) 및/또는 전이된 암(metastasized cancers)을 의미한다. 암의 예는 암종(carcinoma); 육종(sarcoma), 림프종(lymphoma), 백혈병(leukemia), 흑색종(melanoma) 또는 골수종(myeloma)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 암은 바람직하게는 골암(bone cancer), 뇌암(brain cancer), 안암(eye cancer), 유방암(breast cancer), 흑색종과 같은 피부암(skin cancer), 두경부 편평 암종(head and neck squamous carcinoma, HNSCC), 방광암(bladder cancer), 폐암(lung cancer), 요관암(ureter cancer), 요도암(urethra cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 부갑상선암(parathyroid cancer), 침샘암(salivary gland cancer), 신장암(kidney cancer), 전립선암(prostate cancer), 자궁 경부암(cervix cancer), 난소암(ovary cancer) 및 고환암(testis cancer)을 포함한 생식계암(genital system cancer), 자궁내막 암(endometrium cancer), 혈액/혈액계암(blood/hematologic system cancer) 또는 대장암(colon cancer)과 같은 위장 조직 암(gastrointestinal tissue cancer)이다. 바람직한 실시예에서 상기 암은 전립선암, 피부암, 폐암 또는 췌장암이다. 숙주 세포는 바람직하게는 암세포다. 암세포는 바람직하게는 악성 원발성 및/또는 전이된 암세포이다. 암세포는 암종 세포; 육종 세포, 림프종 세포, 백혈병 세포, 흑색종 세포 또는 골수종 세포일 수 있다. 암세포는 또한 골암 세포, 뇌암 세포, 안암 세포, 유방암 세포, 흑색종 세포 또는 HNSCC 세포와 같은 피부암 세포, 방광암 세포, 폐암 세포, 요관암 세포, 요도암 세포, 갑상선암 세포, 부 갑상선암 세포, 침샘암 세포, 신장암 세포, 전립선암 세포, 난소암 세포 및 고환암 세포를 포함한 생식계암 세포, 자궁 내막암 세포, 혈액/혈액계암 세포, 또는 위장조직암 세포일 수 있다. 종양은 전형적으로 암에 걸린 세포(cancerous cell) 및 간질 세포(stroma cells), 혈관 세포(vascular cells), 혈액(blood) 및/또는 면역(immune) 세포와 같은 지지(supporting) 세포를 포함한다. 암세포라는 용어는 지지 세포가 아닌 암에 걸린 세포를 의미한다. 또한, 복제 가능 아데노바이러스는 지지 세포에서 감염 및 복제할 수 있습니다. 종양과 암이라는 단어는 본 명세서에서 상호 교환적으로(interchangeably) 사용된다.

암세포는 바람직하게는 GSK3를 발현하지 않거나 과발현하지 않는 암세포이다. 발현되지 않거나 과발현되지 않는 GSK3는 바람직하게는 GSK3 베타이다.

본 발명의 아데노바이러스에서 GSK-코딩 영역은 구성적으로 활성인 GSK3를 포함하는 것이 바람직하다. 구성적으로 활성인 GSK3는 바람직하게는 GSK3 알파의 위치 S21, 또는 GSK3 베타의 위치 S9에 활성화(activating) 돌연변이를 갖는 돌연변이체이다. 활성화 돌연변이는 바람직하게는 세린 잔기(각각 위치 21 또는 9)에 대한 코돈을 표시된 위치에서 알라닌 잔기에 대한 코돈으로 대체하는 것이다.

본 발명은 또한 상기 세포에서 상기 코딩 서열을 발현하기 위한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 GSK3 단백질에 대한 코딩 서열을 상기 아데노바이러스의 게놈에 제공하는 단계를 포함하는, 허용 세포에서 재조합 복제 가능 아데노바이러스의 복제의 속도를 향상시키는 방법을 제공한다. 복제 속도(replication rate)에 대한 척도는 아데노바이러스에 감염된 세포가 세포병리 효과(cytopathic effect, CPE)를 나타내는 데 걸리는 시간이다. 복제 속도는 감염 후 특정 시간에 생성되는 감염성(infectious) 입자(particles)의 수를 측정하여 측정될 수도 있다. 복제 속도는 일반적으로 다른 아데노바이러스와 비교하여 평가된다. 다른 동일한 환경에서 두 개의 다른 바이러스를 병렬로(in parallel) 테스트할 때 생성된 감염성 바이러스 입자의 수가 가장 빠르게 증가하거나 CPE를 가장 빠르게 유도하는 바이러스가 더 높은 복제 속도를 갖는다. 세포는 본원에 설명된 복제 가능 아데노바이러스의 복제를 지지하는 경우 허용 세포이다.

본 발명은 또한 코딩 서열을 발현하기 위한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 GSK3 단백질에 대한 코딩 서열을 아데노바이러스의 게놈에 제공하는 단계를 포함하는 종양용해성 재조합 복제 가능 아데노바이러스의 종양용해성 속성을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 종양에서 재조합 복제 가능 아데노바이러스의 복제 속도 및 확산을 증가시키는 방법이 추가로 제공하며, 상기 방법은 종양의 세포에서 코딩 서열을 발현하기 위한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 GSK3 단백질에 대한 코딩 서열을 종양용해성 아데노바이러스에 제공하는 단계를 포함한다.

본원에 설명된 바와 같이 아데노바이러스는 추가적 전이유전자(transgenes)를 위한 하나 이상의 코딩 영역을 가질 수 있다. 적합한 추가적 전이유전자의 예는 IL2, GM-CSF 및 TNF-알파이다. 다른 적합한 전이유전자는 본원의 다른 곳에서 설명된다.

인간 아데노바이러스는 현재 7종(A ~ G)과 57종 (혈청)형((sero)types)으로 세분화(subdivided)될 수 있다.

다른 혈청형은 현재 다음과 같이 분류된다:

- 종 A: 혈청형 12, 18, 31;

- 종 B: 혈청형 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 50, 55;

- 종 C: 혈청형 1, 2, 5, 6, 57;

- 종 D: 혈청형 8-10, 13, 15, 17, 19, 20, 22-30, 32, 33, 36-39, 42-49, 51, 53, 54, 56;

- 종 E: 혈청형 4;

- 종 F: 혈청형 40, 41; 및

- 종 G: 혈청형 52

본 발명의 아데노바이러스는 바람직하게는 B, C 또는 D 아데노바이러스이다. 바람직하게는, B 또는 C 아데노바이러스이다. 아데노바이러스는 바람직하게는 종 C 아데노바이러스이다. 바람직하게는, 아데노바이러스는 혈청형 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22-30, 32, 33, 34, 35, 36-39, 42-49, 50, 51, 53, 54, 55, 56 또는 57 아데노바이러스이다. 바람직한 실시예에서 아데노바이러스는 1, 2, 3, 5, 6, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 50, 55 또는 57 아데노바이러스이다. 아데노바이러스는 바람직하게는 1, 2, 5, 6 또는 57 아데노바이러스, 바람직하게는 2 또는 5 아데노바이러스이다. 하나의 아데노바이러스 혈청형의 일부와 다른 혈청형의 다른 부분을 포함하는 키메라(chimeric) 아데노바이러스를 생산하는 것은 그리 어렵지 않다. 동일한 종의 혈청형의 일부를 포함하는 키메라(chimeric) 아데노바이러스가 알려져 있다. 예를 들어, 키메라 혈청형 2 및 5 바이러스이다. 한 혈청형의 초기 유전자와 다른 혈청형의 후기 유전자를 포함하는 키메라 바이러스도 고려된다. 키메라 아데노바이러스 단백질을 포함하는 아데노바이러스도 알려져 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 5 바이러스의 섬유 샤프트(fiber shaft) 및 노브(knob) 도메인이 유전적으로 아데노바이러스-3, 아데노바이러스-11 또는 아데노바이러스-35의 해당 도메인으로 대체된 키메라 아데노바이러스 섬유 단백질은 Murakami et al (2010, Prostate Vol 70 (4) : 362-376 쪽)에서 설명된다. 이러한 특정 키메라 아데노바이러스는 아데노바이러스 5와 비교할 때 변형된 표적 세포(target cell) 향성(tropism)을 가진다.

상기 아데노바이러스는 바람직하게는 아데노바이러스 혈청형 5, 아데노바이러스 혈청형 24, 아데노바이러스 혈청형 35, 또는 아데노바이러스 혈청형 51 기반 바이러스, 또는 키메라 아데노바이러스, 예를 들어, 혈청형 5 섬유의 일부를 혈청형 35의 섬유의 일부로 대체함으로써 혈청형 35 향성을 갖는 혈청형 5에 기초한다. 상기 아데노바이러스는, 바람직하게는 p53, 종양 항원, 또는 성장 인자(growth factor), 사이토카인(cytokine) 또는 케모카인(chemokine)과 같은 분비 단백질(secreted protein)과 같은 치료용(therapeutic) 전이유전자의 발현을 추가로 제공할 수 있다. 상기 아데노바이러스는 복제 가능, 특히 종양용해성이다. 상기 아데노바이러스는 인간 및 영장류(primate) 세포의 감염 및 복제를 위한 인간 또는 영장류 아데노바이러스이다. 상기 아데노바이러스는 또 다른 포유 동물 아데노바이러스, 예를 들어 개 세포 또는 말 세포 각각의 감염 및 복제를 위한 개(canine) 또는 말(equine)의 아데노바이러스이다.

본 발명에 따른 바람직한 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스, 바람직하게는 혈청형 5이다.

복제 가능 아데노바이러스는 정확한 종 향성을 가진 아데노바이러스에서 유래하고 상기 세포가 상기 아데노바이러스에 대한 표면 수용체를 발현한다면, 동물 신체의 많은 다른 세포에서 복제할 수 있다. 복제 가능 아데노바이러스를 포함하는 재조합 아데노바이러스에 의한 특정 세포 표면 인식(surface recognition)은 당업자에게 알려진 바와 같이 위형(pseudotyping) 또는 표적화(targeting)에 의해 변경될 수 있다.

본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 아데노바이러스를 추가로 제공한다. 본 발명은 암 치료를 위한 약제로 사용하기 위한 본 발명에 따른 아데노바이러스를 추가로 제공한다. 아데노바이러스는 아데노바이러스학 및 아데노바이러스 벡터 분야의 표준 방법에 따라 증식된다(propagated). 바람직한 증식(propagation) 방법은 아데노바이러스의 복제를 허용하는 적절한 세포주를 감염시키는 것이다. 아데노바이러스를 생성하는 방법의 예는 바이러스 생성을 나타내는 세포병리 효과를 보일 때 세포를 수집하는 단계 및 세포 추출물을 생성하기 위한 세포의 동결-해동 단계(freeze-thawing)를 추가로 포함할 수 있다. 바이러스는 표준 기술을 사용하여 세포 추출물에서 정제할 수 있다. 예; 인산염 완충 식염수-10 % 글리세롤(Phosphate-Buffered Saline-10% glycerol)에 대한 염화 세슘 변화도(cesium chloride gradient) 및 투석(dialysis)에의 밴딩(banding). CsCl의 대안은 Vivapure 바이러스 정제 키트(Vivapure virus purification kit)(Sartorius)이다. 투석 및/또는 정제된 바이러스는 분취하여(aliquoted) -80℃에 보관할 수 있다. 플라크 형성(plaque-forming) 아데노바이러스 입자 및 단위 수의 정량화는 표준 프로토콜에 따라 수행된다. 10 % 글리세롤이 함유된 식염수 인산염 완충액(saline phosphate buffer)은 아데노바이러스 저장을 위한 표준 제형(standard formulation)이다.

아데노바이러스는 생체내에서(in vivo) 세포를 감염시키기 위해 동물 또는 인체에 투여될 수 있다. 투여는 종양 또는 종양이 있는 체강(body cavity)으로의 국소 주사(locoregional injection), 혈액 순환(blood circulation)으로의 주사, 흡입(inhalation) 및 특정 신체 부위의 표면에 대한 적용을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 여러 경로를 통해 수행될 수 있다. 감염 후, 복제 가능 아데노바이러스는 감염된 세포가 상기 재조합 아데노바이러스의 복제를 지지한다면 복제 및 다른 세포로 확산될 수 있다. 따라서, 복제 가능 아데노바이러스를 사용하여 새로운 세포를 재감염시켜 상기 복제 가능 아데노바이러스를 추가로 증식 및 확장시킬 수 있다.

아데노바이러스는 바람직하게는 유기체에 직접 투여될 수 있는 바이러스성 입자의 보존을 위해 수성(aqueous) 또는 용액(solution) 배지(medium)로 제형화된다(formulated). 제형(formulation)은 바람직하게는 약제학적으로(pharmaceutical) 허용되는 염(salts) 및 부형제(excipients), 예를 들어 인간 혈청 알부민(human serum albumin), 당(sugars), 예컨대 수크로오즈(sucrose) 및 만니톨(mannitol), 및/또는 계면활성제(surfactant), 예컨대 예를 들어 원발성 히드록실기(primary hydroxyl groups)에서 종결되는 이작용성 블록 공중합체(difunctional block copolymer) 계면 활성제(Pluronic F68 ^TM)을 포함한다.

일 실시예에서, 본 발명에 따른 복제 가능 아데노바이러스는 miRNA 또는 shRNA와 같은 하나 이상의 소형 또는 비-단백질 코딩 RNA 분자의 발현을 매개하는 하나 이상의 발현 카세트를 추가로 포함할 수 있다. 작은 또는 비-단백질 코딩 RNA 분자는 세포에서 p53 길항제(antagonist) 및/또는 p53 경로의 억제제 또는 이들의 조합에 특이적일 수 있다.

이전에, 우리는 감염된 암세포에서 아데노바이러스 자손(progeny)의 종양용해성 및 방출이 상기 암세포에서 p53 기능을 복원함으로써 가속화될 수 있음을 발견했다(van Beusechem et al., Cancer Res. 62 (2002) : 6165-6171; WO 03/057892, 본원에 참조로 포함됨). 상기 p53 기능의 회복은 상기 암세포에서 회복 인자(restoring factor), 즉 p53-의존적 세포사멸 경로의 기능적 인자를 발현함으로써 수행되며, 그 기능은 상기 암세포에서 발현되지 않거나 불충분하게 발현되며, 여기서 상기 회복 인자는 바람직하게는 단백질을 포함한다(WO 03/057892). 따라서, 상기 회복 인자는 p53-의존적 세포사멸 경로의 필수 양성 성분이다.

p53의 정상 기능의 손실은 프로그램된 세포사멸, 시험관내 세포 변형(transformation) 및 생체내 암 발생에 대한 내성(resistance)과 관련이 있다. 인간 암의 약 50 %에서 p53을 암호화하는 유전자는 결실 또는 돌연변이를 통해 기능하지 않는다(Levine et al, Nature 351 (1991) : 453-456; Hollstein et al, Science 253 (1991) : 49-53; Chang et al. al, J. Clin. Oncol.13 (1995) : 1009-1022). 야생형 p53 단백질을 발현하는 다른 많은 50 % 암세포에서, p53 기능은 p53 길항제의 작용에 의해 여전히 방해를 받는다(hampered). p53 길항제의 예는 MDM2이다. 종양 억제(tumor-suppressor) 단백질 p14ARF의 손실 또는 MDM2 단백질의 과발현은 MDM2 단백질에 결합하고 후속 분해(degradation)에 의해 p53의 기능적 비활성화로 이어질 수 있다. 또한, p53 기능 자체가 손상되지 않더라도, p53-의존성 세포 사멸(p53-dependent cell death)은, 항-세포사멸(anti-apoptotic) bcl-2 및 IAP 패밀리 구성 및 BI-1과 같은 p53의 p53 경로 하류(down-stream)에서 작용하는 항-세포사멸 단백질의 과발현으로 인해 방해를 받을 수 있다. 또 다른 예는 p53과 경쟁하는 p53-반응성 프로모터에 결합하여 p53-의존성 세포 사멸을 길항하는 p73DeltaN이다(Kartasheva et al, Oncogene 21 (2002) : 4715-4727). 세포에서 하나 이상의 p53 길항제 및/또는 p53 경로의 억제제 또는 이들의 조합에 특이적인 하나 이상의 RNAi-매개 분자의 발현은 기능성 p53을 포함하는 표적 세포에서 용균(lysogenic) 활성을 향상시킬 것이다.

p53 경로의 상기 길항제 및/또는 억제제는 바람직하게는 시노비올린(synoviolin), MDM2, Pirh2, COP1, Bruce, HPV-E6, 헤르페스바이러스-8 라나(herpesvirus-8 LANA), Parc, 모르탈린(Mortalin), Plk-1, BI-1, p73DeltaN, bcl-2, bcl-xL, bcl-w, bfl-1, brag-1, mcl-1, cIAP1, cIAP2, cIAP3, XIAP 및 서비빈(survivin)으로부터 선택된다. 발현 카세트는 하나 이상의 RNAi-매개 분자에 작동 가능하게 연결된 인핸서/프로모터 및 터미네이터(terminator)와 같이 상기 숙주 세포에서 기능하는 하나 이상의 발현 조절 서열을 추가로 포함한다. 대안으로서, 하나 이상의 p53 길항제 및/또는 p53 경로의 억제제 또는 이들의 조합의 발현은, 숙주 세포에서 표적 유전자의 발현을 감소시키는 기능을 하는 침묵 인자(silencing factor)를 코딩하는 적어도 하나의 DNA 서열의 발현을 매개하는 조절 요소(control elements)에 작동 가능하게 연결된다. 암세포는 하나 이상의 p53 길항제 및/또는 p53 경로의 억제제를 포함할 수 있음이 밝혀졌다. 이러한 세포는 이들 p53 길항제 및/또는 p53 경로의 억제제 중 적어도 2개에 대해 RNAi에 의해 제공될 때보다 더욱 효과적으로 용해된다.

추가적 실시예에서, 본 발명에 따른 복제 가능 아데노바이러스는 DNA 서열을 추가로 포함하고, 상기 DNA 서열은 숙주 세포에서 p53 의존성 세포사멸 경로를 복원하는데 기능하는 적어도 하나의 회복 인자(restoring factor)를 암호화하고, 숙주 세포에서 기능적인 하나 이상의 발현 조절 요소에 작동 가능하게 연결된다. 상기 회복 인자는 바람직하게는 bax, bak, bad, bid, bik, bim, bok, blk, hrk, puma, noxa 및 bcl-xS (Miyashita 및 Reed, Cell 80 (1995) : 293-299; Han et al., Genes Dev. 10 (1996) : 461-477; Zoernig et al., Biochim. Biophys. Acta 1551 (2001) : F1-F37), 및/또는 p53, 또는 이의 기능적 부분 또는 유도체와 같은 bcl-2 패밀리의 프로-세포사멸(pro-apoptotic) 사멸 유전자(death genes)로부터 선택된다. p53 의존성 세포사멸 경로를 복원하는데 기능하는 바람직한 회복 인자는 p53이다.

복제 가능 아데노바이러스는 암세포에서 POT1의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 기능을 하는 침묵 인자(silencing factor)를 코딩하는 DNA 서열을 추가로 포함할 수 있다. 침묵 인자는 바람직하게는 RNAi 또는 스플라이스(splice) 조절(modulating) 올리고 뉴클레오티드(oligonucleotide)와 같은 안티센스 RNA(anti-sense RNA)이다. 통상의 기술자는 암세포에서 POT1의 발현을 감소시키기 위한 적절한 RNA 기반 침묵 인자를 설계할 수 있다. POT1의 경우 암 및/또는 암세포가 전립선암인 것이 바람직하다. 전립선암의 치료는 상기 암을 조사하는(irradiating) 단계를 추가로 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

바이러스성 벡터는 복제 부족이고, 복제를 허용하는 상보적(complementary) 유전자를 제공하기 위해 패키징 세포(packaging cell)가 필요하다.

본원에 사용된 아데노바이러스 게놈은 아데노바이러스의 기능/생애주기와 관련된 구조적 단백질 및 요소를 암호화하는 DNA 서열을 의미한다.

본원에 정의된 복제 가능 아데노바이러스는, 그것의 게놈의 일부로서 숙주 세포에서 복제될 기능을 포함하는 아데노바이러스이며, 여기서 복제는 내인성 세포 기구(machinery)와 조합하여 바이러스에 의해 제공되는 복제 기능(replication functions)에 의존한다. 따라서, 숙주 세포의 게놈은 바이러스성 복제에 필요한 인자를 암호화하는 외인성(exogenous) 서열을 가질 필요가 없다. 용어 "내인성"은 이와 관련하여 바이러스성 복제에 필요한 세포 기구(따라서 코딩 서열 포함)는 자연적으로 존재하는 기구임을 의미하고, 예를 들어 사람에 의한 조작 기술에 의해 세포에 도입되지 않는다. 후자는 "외인성"으로 정의된다. 정의된 바와 같이 복제 기능은 숙주 세포에서 바이러스의 복제에 필요한 바이러스에 의해 암호화된 단백질과 같은 인자이며 본원에서 바이러스성 복제 인자(viral replication factors)라고도 한다.

이러한 인자는 바이러스성 게놈에 의해 암호화되며 외인성(exogenous) 인자에 의해 보완될 필요가 없다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 따라서, 복제가 하나 이상의 복제 기능에 의존하는 바이러스는 바이러스에서 삭제되었지만, 숙주 세포에 도입된 바이러스는 복제가 부족한 것으로 정의되므로 본 발명의 일부가 아니다. 청구된 바와 같은 본 발명은 복제 가능 바이러스에 관한 것으로, 즉, 숙주 세포에서 바이러스 복제의 조절에 필수적인 바이러스성 복제 인자를 암호화하는 바이러스성 유전자는 바이러스성 게놈에 존재한다. 숙주 세포는 일반적으로 암세포 또는 암 유사 세포이다.

명확하고 간결한 설명의 목적을 위해 본 명세서에서는 동일하거나 별개의 실시예의 일부로서 설명되지만, 본 발명의 범위는 설명된 모든 또는 일부의 조합을 갖는 실시예를 포함할 수 있음을 이해될 것이다.

실시예

그림과 실시예에서 동일한 바이러스를 나타내기 위해 다른 이름이 사용되었다. GSK3-베타 S9A 코딩 영역을 갖는 아데노바이러스는 adGSK3b; ad.CA.GSK3- 베타; Ad.CA.GSK3- 베타; 및 ad.CA.GSK3- 베타 S9A 등으로 지칭된다. 참조 루시페라제 코딩 영역을 갖는 아데노바이러스는 ad.LUC; Ad.LUC 및 Ad.Luc 등으로 지칭된다

실시예 1 시험관내에서 GSK3-베타 발현 아데노바이러스는 인간 암세포의 성장을 억제하지만 원발성(primary) 비-악성(non-malignant) 인간 세포는 억제하지 않는다.

GSK3-베타 발현 아데노바이러스가 암세포와 비-악성 세포에 미치는 영향을 평가하기 위해, 4 가지 상이한 흑색종 세포주(SK-MEL-28, JUSO, MEL57 및 WM9)와 건강한 피부에서 분리된 피부 유래 원발성 섬유아세포(Fibro)를 새로 배양했다.

세포를 완전 RPMI 배지(complete RPMI medium)(10 % 열-불활성화(heat-inactivated) FCS(HyClone), 100 IU/mL 나트륨-페니실린(sodium-penicillin), 100 ug/mL 스트렙토마이신(streptomycin), 2 mM L-글루타민(L-glutamine) 및 50 μM β머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)로 보충된 RPMI HEPES 및 L-글루타민 배지(Lonza))에서 배양했다. 세포(SK-MEL-28, JUSO, MEL57, WM9 또는 Fibro)를 96 웰 플레이트(웰당 10000개 세포)에 접종했다. 플레이팅 24 시간 후 세포를 500 다중(multiplicity) 감염(MOI) Ad.LUC(Ad5Luc1, (ref 17) Krasnykh et al. J. of Virology, 75 (2001) : 4176-4183) 또는 Ad.CA.GSK3-베타(Kim et al. (ref 18) J. of Bio. Chemistry, 277 (2002) : 41888-41896)로 감염시켰다. IncuCyte Zoom(EssenBioscience)에서 세포는 37 ℃ 및 5 % CO₂에서 인큐베이팅되었고(incubated), 배양기에서(in culture) 8일 동안 추적되었다. IncuCyte Zoom으로 4시간마다 웰 사진을 촬영했다. IncuCyte Zoom 소프트웨어를 사용하여 웰을 분석하고, 서로 다른 측정 시점에서 웰당 합류 백분율(percentage)을 얻기 위해 소프트웨어에 의해 합류(confluence) 마스크가 적용되었다. 합류 데이터는 Graphpad Prism(Graphpad)을 사용하여 그래프에 표시되었다(plotted).

바이러스의 감염성(infectious) 역가(titer)는 Adeno-X 신속 적정(titration) 키트(BD Clontech)를 사용하여 911 세포의 바이러스 적정에 의해 결정되었다. 500 MOI는 Adeno-X 신속 적정 키트를 사용한 바이러스 적정에 의해 결정된 세포당 500 개의 감염성 바이러스성 입자를 의미한다.

결과는 GSK3-베타 발현 바이러스로 감염된 암세포가 성장이 억제되고 감염 후 3 ~ 4일 후에 세포 수가 감소하기 시작하여 세포사멸을 나타냄을 보여주었다(그림 1A). 대조적으로, 루시페라제를 발현하는 바이러스는 암세포의 성장을 억제하지 않으며 웰은 약 4일 후에 합류하게 된다. 도 1B 및 1C에서 나타낸 바와 같이, 원발성 인간 섬유아세포가 Ad.CA.GSK3-베타 감염에 의해 성장이 억제되지 않기 때문에 이것은 특정 항암 효과이다.

종합해보면, 이러한 데이터는 구성적으로 활성인 GSK-베타 형태의 아데노바이러스 강제 발현(enforced expression)이 암세포를 사멸시키는 반면, 원발성 섬유아세포에는 어떠한 영향을 미치지 않음을 보여준다.

실시예 2. Ad.CA.GSK3-베타를 사용한 형질 도입에 의한 인간 흑색종 세포주에서 세포사멸의 유도.

ad.CA.GSK3-베타가 암세포 사멸을 유도할 수 있음을 보여주기 위해 10.000 흑색종 세포(SK-MEL-28, JUSO, Mel57 또는 WM9)를 완전 RPMI 배지에서 96 웰 플레이트에 플레이팅했다. 플레이팅 24 시간 후 세포를 제조업체의 절차에 따라 1:1000 FITC 카스파제(Caspase) 3/7 시약(IncuCyte)과 함께 500 MOI의 Ad.LUC 또는 Ad.CA.GSK3-베타로 감염시켰다. 세포는 IncuCyte Zoom에서 37 ℃ 및 5 % CO₂에서 8일 동안 인큐베이팅되었다. IncuCyte으로 4 시간마다 웰 사진을 찍었다. IncuCyte Zoom 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고, 웰당 합류 백분율 및 웰의 녹색 신호 백분율을 각각 얻기 위해 소프트웨어에 의해 합류 및 녹색 합류 마스크가 적용되었다. 녹색 마스크 값을 서로 다른 시점에서 합류 값으로 나눔으로써 세포사멸 세포 분획(fraction)이 결정되었다.

6일 동안, Ad.LUC 감염된 배양물(cultures)에 비해 Ad.CA.GSK3-베타로 감염된 배양물에서 카스파제(caspase) 3/7 양성 세포(세포사멸 세포)의 백분율이 더 빠르게 증가했다(그림 2A 및 B). 1일째에는, 대조군 바이러스(Ad.LUC)와 대조적으로 Ad.CA.GSK3-베타로 감염되었을 때 SK-MEL-28 세포의 형태(morphology)에 명확한 영향이 있다(그림 2A). 3일째에는, Ad.CA.GSK3-베타 (녹색 라벨로 표시)가 있는 배양물에서 여러 카스파제 3/7 양성 염색된 세포가 관찰될 수 있다. 6일째에는, Ad.CA.GSK3-베타로 형질 도입된 SK-MEL-28은 세포사멸 마커에 대해 대부분 양성인 반면, 대조군 바이러스로 형질 도입된 암세포는 거의 세포사멸 세포를 보이지 않는다.

이들 데이터는 구성적으로 활성인 형태의 GSK3-베타의 아데노바이러스 강제 발현이 암세포의 세포사멸을 촉진한다는 것을 보여주었다.

실시예 3. GSK3-베타 발현 아데노바이러스는 전이성(metastatic) 흑색종 종양 현탁액에서 선택적 암세포 사멸을 유도한다.

아데노바이러스 전달 GSK3-베타의 항-종양 효과를 보여주기 위해 전이성 흑색종 종양 세포 현탁액을 Ad.LUC 또는 Ad.CA.GSK3-베타로 감염시켰다.

흑색종 환자로부터 생존 가능한(viable) 종양 조직을 얻었다. 그런 다음 샘플을 메스(scalpels)로 잘게 썰고(minced), 0.1 % DNase I 형 및 0.14 % 콜라게나제(collagenase) I 형(Sigma Chemical)을 사용하여 HBSS(Whittaker Bioproducts)에서 해리했다(dissociated). 그런 다음 단일 세포 현탁액(Single-cell suspensions)을 제어 속도 냉동고(controlled-rate freezer)에서 1,500만 ~ 2,000만 세포/mL의 분취량(aliquots)으로 10 % DMSO로 냉동하고 사용할 때까지 액체 질소에 보관했다.

흑색종 세포-현탁액은 해동되었고(thawed), 1.200.000 전이성 흑색종 종양 세포는 6 웰 플레이트에서 완전 RPMI에서 배양되었으며 4 시간 후 500 MOI의 Ad.LUC 또는 Ad.CA.GSK3-베타로 감염시켰다. 그런 다음 세포는 37 ℃ 및 5 % CO₂에서 5일 동안 인큐베이팅되었다. 5일 후, 샘플이 수확되었고(1560rpm에서 5 분 동안 원심 분리), 0.1 % 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.02 % 아지드화 나트륨(sodium azide) 및 PBS 중 0.1 % BSA(FACS 완충액)가 보충된 PBS로 세척하고, 1560rpm에서 5분동안 원심분리되었다(centrifuged). 다음으로, 상층액(supernatants)을 제거하여 대략 50 마이크로리터(microliters)의 상층액에 세포 펠릿(cell pellet)을 남겼다. 세포는 나머지 상층액에 재현탁되었고 표면 마커(surface markers) CD45(AF700, Biolegend) 및 MCSP(APC, Miltenyi biotec)에 대해 4 ℃에서 30 분 동안 염색되었다. 배양 후, FACS 완충액으로 세척하여 과량의(excess) 항체는 제거되었다. 샘플은 유세포 분석기(flow cytometer) Fortessa (BD Bioscience) 및 Kaluza 분석 소프트웨어(Beckman)로 분석되었다.

이 분석의 결과는 그림 3에 나와 있다. 종양 미세 환경(microenvironment)에서 흑색종 세포와 건강한 면역 세포를 구별하기 위해 세포는 CD45 마커로 염색되었다. 면역 세포(보라색 게이트)는 CD45에 양성인 반면 종양 세포는 음성이다. 또한, 암세포와 비-면역 건강한 세포(섬유아세포 등)를 잘 구분하기(discriminate) 위해 MCSP 마커가 추가되었다. MCSP는 알려진 흑색종 마커이므로 흑색종 세포는 MCSP+CD45-세포(주황색 게이트)가 될 것이다. 그럼에도 불구하고, MCSP-CD45-세포 분획(파란색 게이트)은 비-면역 건강한 세포를 모두 포함할 수 있지만, 아마도 MCSP 마커를 발현하지 않는 일부 흑색종 세포도 포함할 수 있다(모든 흑색종 세포가 동일한 마커에 대해 양성인 것은 아니며 이와 관련하여 기증자 가변성(donor variability)이 있다).

흑색종 세포 현탁액을 Ad.CA.GSK3-베타로 형질 도입시켰을 때, 5일 후 흑색종 세포의 상대적 백분율은 1.72 %였다. 대조적으로, Ad.LUC에 감염된 흑색종 현탁액에서 생존하는 흑색종 세포의 상대적 백분율은 21.65 %였다. 더욱이, 면역 세포는 Ad.CA.GSK3-베타의 존재에 의해 영향을 받지 않는 것으로 나타났으며, Ad.LUC에서 50.77 % 생존하고 Ad.CA.GSK3-베타에서 64.29 % 생존하여 Ad.CA. GSK3-베타의 종양 특이성을 더욱 입증했다. 다른 세포(CD45-MCSP-, 섬유아세포와 같은 대부분 건강한 비-면역 세포)도 구성적으로 활성인 GSK3-베타를 코딩하는 아데노바이러스를 사용한 형질 도입의 영향을 받지 않았다.

결과는 특정 암세포 사멸을 유도하기 위해 구성적으로 활성인 GSK3-베타의 아데노바이러스 전달(delivery)을 이용할(exploit) 가능성을 보여준다.

실시예 4. GSK3-베타의 발현은 아데노바이러스 복제를 향상시킨다.

Ad.CA.GSK3-베타 및 Ad.LUC는 복제 부족 아데노바이러스 벡터이다. 복제 가능 아데노바이러스의 맥락에서 구성적으로 활성인 GSK3-베타의 효과를 검증하기(validate) 위해 911 세포(아데노바이러스 복제를 위한 복제 부족 아데노바이러스(replication deficient adenoviruses)를 보완하는 세포주)에서 실험을 수행했다(그림 4).

복제 부족 Ad.LUC 또는 Ad.CA.GSK3-베타는 911 세포(아데노바이러스 복제를 보완하는 세포주)에서 증폭되었다. 911 세포(Fallaux FJ et al. Hum Gene Ther., (1992) : 215-22)는 완전한 RPMI에서 배양되었다. 1일째에 911 세포를 96 웰 플레이트(10,000 개 세포/웰)에 플레이팅하고, 6 시간 후 MOI 1에서 ad.LUC 또는 ad.CA.GSK3-베타로 감염시켰다. 음성 감염 대조군으로서 감염되지 않은 911 세포가 사용된다. IncuCyte Zoom에서 37 ℃ 및 5 % CO₂에서 세포가 인큐베이팅되고 5일 동안 추적되었다. IncuCyte는 웰 사진을 다른 간격으로 촬영했다.

결과는, Ad.LUC가 감염 후 약 3일(그림 4B)에 가시적 CPE(세포병리 효과)를 유도한 반면, GSK3-베타 발현 바이러스(Ad.CA.GSK3-베타)는 이미 1일에 CPE를 표시함을 보여주고(그림 4C), GSK3-베타 및 복제 가능 아데노바이러스의 상조적인(synergistic) 세포독성(cytotoxic) 효과를 보여준다. 이 실험에 사용된 MOI는 세포당 1 개의 감염성 바이러스성 입자(1 MOI)였다. 따라서, 대부분의 경우 모든 세포가 접종원(inoculum)의 바이러스성 입자에 의해 감염되는 것은 아니다. Ad.CA.GSK3-베타 감염된 세포에서 세포 증식의 부족과 함께, 이것은 구성적으로 활성인 GSK3-베타의 존재가 바이러스성 복제 또는 바이러스성 방출을 가속화하고, 종양용해성 바이러스성 치료에 바람직한 특성임을 나타낸다.

실시예 5. GSK3-베타를 발현하는 복제 가능 아데노바이러스를 구축하는 방법.

아데노바이러스 게놈의 상이한 클로닝 단계의 E4 및 오른쪽(right-hand) ITR 사이에 GSK3b를 포함하는 복제 가능 아데노바이러스는, 다음과 같이 제조될 수 있다. GSK3b 발현 카세트를 운반하는 아데노바이러스 셔틀(shuttle) 벡터가 만들어진다. 두 번째 단계에서 이 셔틀 벡터는 선형화되고(linearized) 전장(full length) 선형화된 아데노바이러스 DNA(예: ORCA-010; 즉, E1AΔ24, T1 돌연변이 및 섬유 RGD 삽입이 있는 종양용해성 아데노바이러스)와 재조합된다. GSK3-베타 DNA 서열은 세린 9에서 알라닌으로의 돌연변이와 C-말단 영역에서 HA (헤마글루티닌(haemaglutinin)) 태그 서열을 포함할 수 있다.

GSK3-베타 발현 카세트(GSK3-beta expression cassette)

GSK3-베타 발현 카세트는 아래 서열을 포함한다. 발현 카세트는 DNA 합성(GeneArt Gene Synthesis, ThermoFisher Scientific)에 의해 생성된다. 발현 카세트는 EcoRI 제한 부위(EcoRI restriction site)를 사용하여 pMK 클로닝 벡터 (ThermoFisher Scientific)에 클로닝된다.

CMV-GSK3-베타HA-pA(CMV-GSK3-betaHA-pA)

EcoRI 부위

GAATTC-

SpeI 부위

ACTAGT-

CMV 인핸서(CMV enhancer)

CMV 프로모터(CMV promotor)

I-CeuI 제한 부위를 포함하는 서열(Sequence containing I-CeuI restriction site)

CGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAAA-

HA 태그된 GSK3 베타 서열(HA tagged GSK3 beta sequence)(HA 태그 서열은 이탤릭체 및 밑줄표시됨)

polyA

SpeI 부위

ACTAGT

EcoRI 부위

GAATTC-

GSK3-베타 발현 카세트 구성(construction)을 운반하는 셔틀 벡터(Shuttle vector)

셔틀 벡터 백본(backbone)으로 pEndK/Spel 벡터(Dr.R. Alemany, Institut Catala d' Oncologia, Barcelona, Spain 제공)가 사용될 것이다. pEndK/Spel은 pEndK을 생성하기 위해, 벡터 pTG3602의 KpnI 소화(KpnI digestion)(Chartier et al., J. Virol, 70 (1996) : 4805-4810) 및 Ad5 맵 유닛 0-7 및 93-100을 포함하는 벡터 단편의 연결(relegation)에 의해 만들어졌다. Spel 부위는 pEndK/Spel을 생성하기 위해 부위 지정 돌연변이 유발(mutagenesis)에 의해 Ad5 뉴클레오티드 35813을 A에서 T로 변경함으로써 pEndK에 도입되었다. pEndK/Spel은 두개의 Ad5 ITR 옆에 있는 PacI 제한 부위를 전달한다.

DNA 합성에 의해 생성된 GSK3-베타 발현 카세트는 SpeI 제한 부위를 사용하여 pEndK/SpeI에 클로닝되어 pEndK/SpeI-GSK3베타(pEndK/SpeI-GSK3beta)가 된다. 올바른 pEndK/SpeI-GSK3-베타 클론은 벡터에 존재하는 다른 제한 효소(restriction enzymes)(예: I-CeuI 고유 제한 부위)를 사용하여 제한 분석(analysis)을 통해 식별될 수 있다.

GSK3-베타를 운반하는 전장(full-length) 아데노바이러스 게놈 생성을 위한 재조합 플라스미드

pEndK/SpeI-GSK3베타는 KpnI로 선형화된다(linearized). 선형화된 플라스미드는 전장 복제 가능 아데노바이러스 DNA(예: ORCA-010)와 함께 박테리아 (예: BJ5183) 또는 효모(yeast)(예: YPH857)에서 재조합 될 수 있다.

전장 아데노바이러스 DNA는, 아데노바이러스 입자로부터 분리될 수 있거나, 대안적으로 전장 아데노바이러스 DNA 삽입물(insert)을 운반하는 플라스미드로부터 제한 효소 소화(restriction enzyme digestion)에 의해 방출될 수 있다.

상동성 재조합은 GSK3-베타 발현 카세트가 E4 영역과 오른쪽 ITR(right-hand ITR) 사이에 삽입되는 전장 아데노바이러스 게놈을 가진 플라스미드를 생성한다. 예를 들어, E3 결실(E3 deleted), 향상된 종양 선택성(tumor-selectivity) 또는 종양용해성 가능성, 변화된 향성(tropism) 또는 전이유전자 삽입과 같은 추가적 변형을 갖는 재조합 아데노바이러스를 포함하는 임의의 복제 가능 아데노바이러스가 이 방법에 따라 GSK3b 발현 카세트를 삽입하는데 사용될 수 있다는 점에 주목해야 한다. 그러나, 상기 전장 복제 가능 아데노바이러스 게놈은 그것의 게놈에 PacI 제한 부위를 포함하지 않는 것이 바람직하다.

바이러스 생성(Virus generation)

GSK3b 발현 카세트가 삽입된 복제 가능 아데노바이러스 게놈은 이후(subsequently) PacI 소화(digestion)에 의해 플라스미드로부터 방출된다. 이 DNA는 예를 들어, 리포펙타민 시약(lipofectamine reagent)을 사용하여, 10% FBS (Hyclone) 및 100 U/mL Pen/Strep이 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지에서 배양된 A549와 같은 인간 세포로 형질 감염된다. 본 발명에 따른 생성된 재조합 복제 가능 아데노바이러스는 당업계에 공지된 표준 세포 배양 및 바이러스학 방법에 따라 분리되고 추가로 증식(propagated) 및 정제된다(purified).

실시예 6. GSK3-베타를 발현하는 복제 가능 아데노바이러스를 구축하는 방법.

GSK3-베타 발현 카세트가 아래의 서열을 갖는 실시예 5와 유사하다.

SV40-GSK3-betaHA-pA

EcoRI 부위

GAATTC-

SpeI 부위

ACTAGT -

SV40 프로모터(SV40 promoter)

CGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAAA-

폴리 A(polyA)

SpeI 부위

ACTAGT

EcoRI 부위

GAATTC-

실시예 7. 루시페라제를 발현하는 복제 가능 아데노바이러스를 구축하는 방법.

대조군으로서 조건부 복제 가능 종양용해성 아데노바이러스를 발현하는 루시페라제를 만들 수 있다. 방법론은 실시예 5 또는 6과 유사하며, 여기서 발현 카세트에서 DNA 합성된 HA 태그된 GSK3-베타 서열이 아래의 루시페라제 서열로 대체되었다.

레닐라 루시페라제 서열(Renilla luciferase sequence)

실시예 8. 복제 가능 아데노바이러스를 발현하는 GSK3-베타의 종양용해성 효능을 평가하는 방법.

실시예 5 및 6에서 생성된 GSK3-베타 발현 복제 가능 아데노바이러스의 종양용해성 효능은 관련 대조군(프로모터 기반), 실시예 7에서 생성된 복제 가능 아데노바이러스를 발현하는 루시페라제와 비교 될 것이다. 대안적으로, CMV 또는 SV40 프로모터 하에서 루시페라제를 발현하는 이미 이용가능한 다른 조건부 복제 가능 전장 아데노바이러스도 사용될 수 있다.

인간 암 세포주에 대한 다양한 바이러스 세포독성(cytotoxicity) 분석의 종양용해성 효능을 비교하기 위해 수행된다. 다양한 암 세포주를 분석에 사용할 수 있다(예: Hep3B, A549, U2OS, HCT 116, SK-MEL-28, UM-SCC-22A, LNCaP, NP9, DU-145, UM-SCC-11B, UM- SCC -14C, PC-3, VU1131, MDA-MB-231 및/또는 FaDu). 세포 독성 분석은 실시예 5, 6 및 7에서 생성된 바이러스를 사용하여 Dong et al. (Human Gene Therapy 25 (2014) : 897-904)에 따라 수행될 수 있다.

이 작업은 부분적으로 유로피안 유니온 호라이존 2020 연구 및 혁신 프로그램(European Union Horizon 2020 research and innovation programme)인 마리 스크워도프스카 퀴리(Marie-Sklodowska-Curie) 수여 번호(grant number) 643130에 의해 지원되었다.

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일부 서열(SOME SEQUENCES)

<210> 1

<211> 484

<212> DNA

<213> 인공 서열(Artificial sequence)

<220>

<223> 인간 아데노바이러스의 E3-19K 단백질에 대한 코디파잉 영역의 돌연변이 혈청형 5(Mutant of codifying region for protein E3-19K of human adenovirus serotype 5)

<400> 1

atgattaggt acataatcct aggtttactc acccttgcgt cagcccacgg taccacccaa 60

aaggtggatt ttaaggagcc agcctgtaat gttacattcg cagctgaagc taatgagtgc 120

accactctta taaaatgcac cacagaacat gaaaagctgc ttattcgcca caaaaacaaa 180

attggcaagt atgctgttta tgctatttgg cagccaggtg acactacaga gtataatgtt 240

acagttttcc agggtaaaag tcataaaact tttatgtata cttttccatt ttatgaaatg 300

tgcgacatta ccatgtacat gagcaaacag tataagttgt ggcccccaca aaattgtgtg 360

gaaaacactg gcactttctg ctgcactgct atgctaatta cagtgctcgc tttggtctgt 420

accctactct atattaaata caaaaagcag acgcagcttt attgaggaaa agaaaatgcc 480

ttaa 484

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 인공 서열(Artificial sequence)

<220>

<223> 인간 아데노바이러스 5 형 단백질 E3-19K의 돌연변이된 카르복시-말단 단편의 단편(Fragment of mutated carboxy-terminal fragment of protein E3-19K of human adenovirus type 5)

<400> 2

Lys Lys Gln Thr Gln Leu Tyr

1 5

<210> 3

<211> 483

<212> DNA

<213> 인공 서열(Artificial sequence)

<220>

<223> 인간 아데노바이러스 5 형 단백질 E3-19K에 대한 코디파잉 영역의 돌연변이체(Mutant of codifying region for protein E3-19K of human adenovirus type 5)

<400> 3

atgattaggt acataatcct aggtttactc acccttgcgt cagcccacgg taccacccaa 60

aaggtggatt ttaaggagcc agcctgtaat gttacattcg cagctgaagc taatgagtgc 120

accactctta taaaatgcac cacagaacat gaaaagctgc ttattcgcca caaaaacaaa 180

attggcaagt atgctgttta tgctatttgg cagccaggtg acactacaga gtataatgtt 240

acagttttcc agggtaaaag tcataaaact tttatgtata cttttccatt ttatgaaatg 300

tgcgacatta ccatgtacat gagcaaacag tataagttgt ggcccccaca aaattgtgtg 360

gaaaacactg gcactttctg ctgcactgct atgctaatta cagtgctcgc tttggtctgt 420

accctactct atattaaata caaaagcaga cgcagcttta ttgaggaaag cagcatgcct 480

taa 483

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 인공 서열(Artificial sequence)

<220>

<400> 4

Lys Ser Arg Arg Ser Pro Ile Glu Glu Ser Ser Met Pro

1 5 10

<210> 5

<211> 2512

<212> DNA

<213> 인공 서열(Artificial sequence)

<220>

<223> 조절 영역 DM1 절연체를 사용한 서열 (위치 367에서 1095까지); E2F1 프로모터의 단편 (위치 1282에서 1545까지); ccacc kozak 서열 (위치 1546에서 1550까지); 및 E1a-24 유전자 (위치 1551에서 2512까지)(Sequence with the regulatory regions DM1 insulator (from position 367 to 1095); a fragment of the E2F1 promoter (from position 1282 to 1545); the ccacc kozak sequence (from position 1546 to 1550); and the E1a- 24 gene (from position 1551 to 2512)).

<400> 5

catcatcaat tataccttcc attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60

ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120

gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180

gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240

taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300

agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tctctagcat cgatgtcgag 360

gatccctcga gaccctgaaa ctgtcttcga ctccggggcc ccgttggaag actgagtgcc 420

cggggcacgg cacagaagcc gcgcccaccg cctgccagtt cacaaccgct ccgagcgtgg 480

gtctccgccc agctccagtc ctgtgatccg ggcccgcccc ctagcggccg gggagggagg 540

ggccgggtcc gcggccggcg aacggggctc gaagggtcct tgtagccggg aatgctgctg 600

ctgctgctgg ggggatcaca gaccatttct ttctttcggc caggctgagg ccctgacgtg 660

gatgggcaaa ctgcaggcct gggaaggcag caagccgggc cgtccgtgtt ccatcctcca 720

cgcaccccca cctatcgttg gttcgcaaag tgcaaagctt tcttgtgcat gacgccctgc 780

tctggggagc gtctggcgcg atctctgcct gcttactcgg gaaatttgct tttgccaaac 840

ccgctttttc ggggatcccg cgcccccctc ctcacttgcg ctgctctcgg agccccagcc 900

ggctccgccc gcttcggcgg tttggatatt tattgacctc gtcctccgac tcgctgacag 960

gctacaggac ccccaacaac cccaatccac gttttggatg cactgagacc ccgacattcc 1020

tcggtattta ttgtctgtcc ccacctagga cccccacccc cgaccctcgc gaataaaagg 1080

ccctccatct gcccctcgag tctagagatg gccgcaataa aatatcttta ttttcattac 1140

atctgtgtgt tggttttttg tgtgaatcga tagtactaac atacgctctc catcaaaaca 1200

aaacgaaaca aaacaaacta gcaaaatagg ctgtccccag tgcaagtgca ggtgccagaa 1260

catttctcta tcgataggta ccatccggac aaagcctgcg cgcgccccgc cccgccattg 1320

gccgtaccgc cccgcgccgc cgccccatct cgcccctcgc cgccgggtcc ggcgcgttaa 1380

agccaatagg aaccgccgcc gttgttcccg tcacggccgg ggcagccaat tgtggcggcg 1440

ctcggcggct cgtggctctt tcgcggcaaa aaggatttgg cgcgtaaaag tggccgggac 1500

tttgcaggca gcggcggccg ggggcggagc gggatcgagc cctcgccacc atgagacata 1560

ttatctgcca cggaggtgtt attaccgaag aaatggccgc cagtcttttg gaccagctga 1620

tcgaagaggt actggctgat aatcttccac ctcctagcca ttttgaacca cctacccttc 1680

acgaactgta tgatttagac gtgacggccc ccgaagatcc caacgaggag gcggtttcgc 1740

agatttttcc cgactctgta atgttggcgg tgcaggaagg gattgactta ctcacttttc 1800

cgccggcgcc cggttctccg gagccgcctc acctttcccg gcagcccgag cagccggagc 1860

agagagcctt gggtccggtt tctatgccaa accttgtacc ggaggtgatc gatccaccca 1920

gtgacgacga ggatgaagag ggtgaggagt ttgtgttaga ttatgtggag caccccgggc 1980

acggttgcag gtcttgtcat tatcaccgga ggaatacggg ggacccagat attatgtgtt 2040

cgctttgcta tatgaggacc tgtggcatgt ttgtctacag taagtgaaaa ttatgggcag 2100

tgggtgatag agtggtgggt ttggtgtggt aatttttttt ttaattttta cagttttgtg 2160

gtttaaagaa ttttgtattg tgattttttt aaaaggtcct gtgtctgaac ctgagcctga 2220

gcccgagcca gaaccggagc ctgcaagacc tacccgccgt cctaaaatgg cgcctgctat 2280

cctgagacgc ccgacatcac ctgtgtctag agaatgcaat agtagtacgg atagctgtga 2340

ctccggtcct tctaacacac ctcctgagat acacccggtg gtcccgctgt gccccattaa 2400

accagttgcc gtgagagttg gtgggcgtcg ccaggctgtg gaatgtatcg aggacttgct 2460

taacgagcct gggcaacctt tggacttgag ctgtaaacgc cccaggccat aa 2512

<210> 6

<211> 1773

<212> DNA

<213> 인공 서열(Artificial sequence)

<220>

<223> 인간 아데노바이러스 5 형의 섬유를 코디파잉하는 서열 (위치 1에서 1638까지; 및 위치 1666에서1773까지) RGD 모티프 (1648에서 1656까지)를 함유하는 펩티드 RGD (위치 1639 에서 1665까지)의 삽입을 포함(Sequence codifying the fiber of the human adenovirus type 5 (from position 1 to 1638; and position 1666 to 1773) containing an insertion of the peptide RGD (from position 1639 to 1665) containing the RGD motif (from 1648 to 1656)).

<400> 6

atgaagcgcg caagaccgtc tgaagatacc ttcaaccccg tgtatccata tgacacggaa 60

accggtcctc caactgtgcc ttttcttact cctccctttg tatcccccaa tgggtttcaa 120

gagagtcccc ctggggtact ctctttgcgc ctatccgaac ctctagttac ctccaatggc 180

atgcttgcgc tcaaaatggg caacggcctc tctctggacg aggccggcaa ccttacctcc 240

caaaatgtaa ccactgtgag cccacctctc aaaaaaacca agtcaaacat aaacctggaa 300

atatctgcac ccctcacagt tacctcagaa gccctaactg tggctgccgc cgcacctcta 360

atggtcgcgg gcaacacact caccatgcaa tcacaggccc cgctaaccgt gcacgactcc 420

aaacttagca ttgccaccca aggacccctc acagtgtcag aaggaaagct agccctgcaa 480

acatcaggcc ccctcaccac caccgatagc agtaccctta ctatcactgc ctcaccccct 540

ctaactactg ccactggtag cttgggcatt gacttgaaag agcccattta tacacaaaat 600

ggaaaactag gactaaagta cggggctcct ttgcatgtaa cagacgacct aaacactttg 660

accgtagcaa ctggtccagg tgtgactatt aataatactt ccttgcaaac taaagttact 720

ggagccttgg gttttgattc acaaggcaat atgcaactta atgtagcagg aggactaagg 780

attgattctc aaaacagacg ccttatactt gatgttagtt atccgtttga tgctcaaaac 840

caactaaatc taagactagg acagggccct ctttttataa actcagccca caacttggat 900

attaactaca acaaaggcct ttacttgttt acagcttcaa acaattccaa aaagcttgag 960

gttaacctaa gcactgccaa ggggttgatg tttgacgcta cagccatagc cattaatgca 1020

ggagatgggc ttgaatttgg ttcacctaat gcaccaaaca caaatcccct caaaacaaaa 1080

attggccatg gcctagaatt tgattcaaac aaggctatgg ttcctaaact aggaactggc 1140

cttagttttg acagcacagg tgccattaca gtaggaaaca aaaataatga taagctaact 1200

ttgtggacca caccagctcc atctcctaac tgtagactaa atgcagagaa agatgctaaa 1260

ctcactttgg tcttaacaaa atgtggcagt caaatacttg ctacagtttc agttttggct 1320

gttaaaggca gtttggctcc aatatctgga acagttcaaa gtgctcatct tattataaga 1380

tttgacgaaa atggagtgct actaaacaat tccttcctgg acccagaata ttggaacttt 1440

agaaatggag atcttactga aggcacagcc tatacaaacg ctgttggatt tatgcctaac 1500

ctatcagctt atccaaaatc tcacggtaaa actgccaaaa gtaacattgt cagtcaagtt 1560

tacttaaacg gagacaaaac taaacctgta acactaacga tcacactaaa cggtacacag 1620

gaaacaggag acacaacttg tgactgccgc ggagactgtt tctgcccatc tgcatactct 1680

atgtcatttt catgggactg gtctggccac aactacatta atgaaatatt tgccacatcc 1740

tcttacactt tttcatacat tgcccaagaa taa 1773

<110> ORCA Therapeutics B.V. <120> Recombinant replication competent viruses comprising a coding region for glycogen synthase kinase-3 (GSK3) and methods of killing aberrant cells <130> P120105PC00 <150> EP 18192104.0 <151> 2018-08-31 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 484 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant of codifying region for protein E3-19K of human adenovirus serotype 5 <400> 1 atgattaggt acataatcct aggtttactc acccttgcgt cagcccacgg taccacccaa 60 aaggtggatt ttaaggagcc agcctgtaat gttacattcg cagctgaagc taatgagtgc 120 accactctta taaaatgcac cacagaacat gaaaagctgc ttattcgcca caaaaacaaa 180 attggcaagt atgctgttta tgctatttgg cagccaggtg acactacaga gtataatgtt 240 acagttttcc agggtaaaag tcataaaact tttatgtata cttttccatt ttatgaaatg 300 tgcgacatta ccatgtacat gagcaaacag tataagttgt ggcccccaca aaattgtgtg 360 gaaaacactg gcactttctg ctgcactgct atgctaatta cagtgctcgc tttggtctgt 420 accctactct atattaaata caaaaagcag acgcagcttt attgaggaaa agaaaatgcc 480 ttaa 484 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment of mutated carboxy-terminal fragment of protein E3-19K of human adenovirus type 5 <400> 2 Lys Lys Gln Thr Gln Leu Tyr 1 5 <210> 3 <211> 483 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant of codifying region for protein E3-19K of human adenovirus type 5 <400> 3 atgattaggt acataatcct aggtttactc acccttgcgt cagcccacgg taccacccaa 60 aaggtggatt ttaaggagcc agcctgtaat gttacattcg cagctgaagc taatgagtgc 120 accactctta taaaatgcac cacagaacat gaaaagctgc ttattcgcca caaaaacaaa 180 attggcaagt atgctgttta tgctatttgg cagccaggtg acactacaga gtataatgtt 240 acagttttcc agggtaaaag tcataaaact tttatgtata cttttccatt ttatgaaatg 300 tgcgacatta ccatgtacat gagcaaacag tataagttgt ggcccccaca aaattgtgtg 360 gaaaacactg gcactttctg ctgcactgct atgctaatta cagtgctcgc tttggtctgt 420 accctactct atattaaata caaaagcaga cgcagcttta ttgaggaaag cagcatgcct 480 taa 483 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment of mutated carboxy-terminal fragment of protein E3-19K of human adenovirus type 5 <400> 4 Lys Ser Arg Arg Ser Pro Ile Glu Glu Ser Ser Met Pro 1 5 10 <210> 5 <211> 2512 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence with the regulatory regions DM1 insulator (from position 367 to 1095); a fragment of the E2F1 promoter (from position 1282 to 1545); the ccacc kozak sequence (from position 1546 to 1550); and the E1a- 24 gene (from position 1551 to 2512) <400> 5 catcatcaat tataccttcc attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60 ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120 gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180 gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240 taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300 agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tctctagcat cgatgtcgag 360 gatccctcga gaccctgaaa ctgtcttcga ctccggggcc ccgttggaag actgagtgcc 420 cggggcacgg cacagaagcc gcgcccaccg cctgccagtt cacaaccgct ccgagcgtgg 480 gtctccgccc agctccagtc ctgtgatccg ggcccgcccc ctagcggccg gggagggagg 540 ggccgggtcc gcggccggcg aacggggctc gaagggtcct tgtagccggg aatgctgctg 600 ctgctgctgg ggggatcaca gaccatttct ttctttcggc caggctgagg ccctgacgtg 660 gatgggcaaa ctgcaggcct gggaaggcag caagccgggc cgtccgtgtt ccatcctcca 720 cgcaccccca cctatcgttg gttcgcaaag tgcaaagctt tcttgtgcat gacgccctgc 780 tctggggagc gtctggcgcg atctctgcct gcttactcgg gaaatttgct tttgccaaac 840 ccgctttttc ggggatcccg cgcccccctc ctcacttgcg ctgctctcgg agccccagcc 900 ggctccgccc gcttcggcgg tttggatatt tattgacctc gtcctccgac tcgctgacag 960 gctacaggac ccccaacaac cccaatccac gttttggatg cactgagacc ccgacattcc 1020 tcggtattta ttgtctgtcc ccacctagga cccccacccc cgaccctcgc gaataaaagg 1080 ccctccatct gcccctcgag tctagagatg gccgcaataa aatatcttta ttttcattac 1140 atctgtgtgt tggttttttg tgtgaatcga tagtactaac atacgctctc catcaaaaca 1200 aaacgaaaca aaacaaacta gcaaaatagg ctgtccccag tgcaagtgca ggtgccagaa 1260 catttctcta tcgataggta ccatccggac aaagcctgcg cgcgccccgc cccgccattg 1320 gccgtaccgc cccgcgccgc cgccccatct cgcccctcgc cgccgggtcc ggcgcgttaa 1380 agccaatagg aaccgccgcc gttgttcccg tcacggccgg ggcagccaat tgtggcggcg 1440 ctcggcggct cgtggctctt tcgcggcaaa aaggatttgg cgcgtaaaag tggccgggac 1500 tttgcaggca gcggcggccg ggggcggagc gggatcgagc cctcgccacc atgagacata 1560 ttatctgcca cggaggtgtt attaccgaag aaatggccgc cagtcttttg gaccagctga 1620 tcgaagaggt actggctgat aatcttccac ctcctagcca ttttgaacca cctacccttc 1680 acgaactgta tgatttagac gtgacggccc ccgaagatcc caacgaggag gcggtttcgc 1740 agatttttcc cgactctgta atgttggcgg tgcaggaagg gattgactta ctcacttttc 1800 cgccggcgcc cggttctccg gagccgcctc acctttcccg gcagcccgag cagccggagc 1860 agagagcctt gggtccggtt tctatgccaa accttgtacc ggaggtgatc gatccaccca 1920 gtgacgacga ggatgaagag ggtgaggagt ttgtgttaga ttatgtggag caccccgggc 1980 acggttgcag gtcttgtcat tatcaccgga ggaatacggg ggacccagat attatgtgtt 2040 cgctttgcta tatgaggacc tgtggcatgt ttgtctacag taagtgaaaa ttatgggcag 2100 tgggtgatag agtggtgggt ttggtgtggt aatttttttt ttaattttta cagttttgtg 2160 gtttaaagaa ttttgtattg tgattttttt aaaaggtcct gtgtctgaac ctgagcctga 2220 gcccgagcca gaaccggagc ctgcaagacc tacccgccgt cctaaaatgg cgcctgctat 2280 cctgagacgc ccgacatcac ctgtgtctag agaatgcaat agtagtacgg atagctgtga 2340 ctccggtcct tctaacacac ctcctgagat acacccggtg gtcccgctgt gccccattaa 2400 accagttgcc gtgagagttg gtgggcgtcg ccaggctgtg gaatgtatcg aggacttgct 2460 taacgagcct gggcaacctt tggacttgag ctgtaaacgc cccaggccat aa 2512 <210> 6 <211> 1773 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence codifying the fiber of the human adenovirus type 5 (from position 1 to 1638; and position 1666 to 1773) containing an insertion of the peptide RGD (from position 1639 to 1665) containing the RGD motif (from 1648 to 1656) <400> 6 atgaagcgcg caagaccgtc tgaagatacc ttcaaccccg tgtatccata tgacacggaa 60 accggtcctc caactgtgcc ttttcttact cctccctttg tatcccccaa tgggtttcaa 120 gagagtcccc ctggggtact ctctttgcgc ctatccgaac ctctagttac ctccaatggc 180 atgcttgcgc tcaaaatggg caacggcctc tctctggacg aggccggcaa ccttacctcc 240 caaaatgtaa ccactgtgag cccacctctc aaaaaaacca agtcaaacat aaacctggaa 300 atatctgcac ccctcacagt tacctcagaa gccctaactg tggctgccgc cgcacctcta 360 atggtcgcgg gcaacacact caccatgcaa tcacaggccc cgctaaccgt gcacgactcc 420 aaacttagca ttgccaccca aggacccctc acagtgtcag aaggaaagct agccctgcaa 480 acatcaggcc ccctcaccac caccgatagc agtaccctta ctatcactgc ctcaccccct 540 ctaactactg ccactggtag cttgggcatt gacttgaaag agcccattta tacacaaaat 600 ggaaaactag gactaaagta cggggctcct ttgcatgtaa cagacgacct aaacactttg 660 accgtagcaa ctggtccagg tgtgactatt aataatactt ccttgcaaac taaagttact 720 ggagccttgg gttttgattc acaaggcaat atgcaactta atgtagcagg aggactaagg 780 attgattctc aaaacagacg ccttatactt gatgttagtt atccgtttga tgctcaaaac 840 caactaaatc taagactagg acagggccct ctttttataa actcagccca caacttggat 900 attaactaca acaaaggcct ttacttgttt acagcttcaa acaattccaa aaagcttgag 960 gttaacctaa gcactgccaa ggggttgatg tttgacgcta cagccatagc cattaatgca 1020 ggagatgggc ttgaatttgg ttcacctaat gcaccaaaca caaatcccct caaaacaaaa 1080 attggccatg gcctagaatt tgattcaaac aaggctatgg ttcctaaact aggaactggc 1140 cttagttttg acagcacagg tgccattaca gtaggaaaca aaaataatga taagctaact 1200 ttgtggacca caccagctcc atctcctaac tgtagactaa atgcagagaa agatgctaaa 1260 ctcactttgg tcttaacaaa atgtggcagt caaatacttg ctacagtttc agttttggct 1320 gttaaaggca gtttggctcc aatatctgga acagttcaaa gtgctcatct tattataaga 1380 tttgacgaaa atggagtgct actaaacaat tccttcctgg acccagaata ttggaacttt 1440 agaaatggag atcttactga aggcacagcc tatacaaacg ctgttggatt tatgcctaac 1500 ctatcagctt atccaaaatc tcacggtaaa actgccaaaa gtaacattgt cagtcaagtt 1560 tacttaaacg gagacaaaac taaacctgta acactaacga tcacactaaa cggtacacag 1620 gaaacaggag acacaacttg tgactgccgc ggagactgtt tctgcccatc tgcatactct 1680 atgtcatttt catgggactg gtctggccac aactacatta atgaaatatt tgccacatcc 1740 tcttacactt tttcatacat tgcccaagaa taa 1773 <210> 7 <211> 379 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV enhancer <400> 7 gacattgatt attgacagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 60 atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 120 cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 180 tttccattga cgtcaatggg tggactattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 240 agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 300 gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 360 agtcatcgct attaccatg 379 <210> 8 <211> 204 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV promotor <400> 8 gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60 ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 120 tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 180 tgggaggtct atataagcag agct 204 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence containing I-CeuI restriction site <400> 9 cgtaactata acggtcctaa ggtagcgaaa 30 <210> 10 <211> 1311 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HA tagged GSK3 beta sequence <400> 10 atggcagggc ggcccagaac caccgccttt gcggagagct gcaagccggt gcagcagcct 60 tcagcttttg gcagcatgaa agttagcaga gacaaggacg gcagcaaggt gacaacagtg 120 gtggcaactc ctgggcaggg tccagacagg ccacaagaag tcagctatac agacactaaa 180 gtgattggaa atggatcatt tggtgtggta tatcaagcca aactttgtga ttcaggagaa 240 ctggtcgcca tcaagaaagt attgcaggac aagagattta agaatcgaga gctccagatc 300 atgagaaagc tagatcactg taacatagtc cgattgcgtt atttcttcta ctccagtggt 360 gagaagaaag atgaggtcta tcttaatctg gtgctggact atgttccgga aacagtatac 420 agagttgcca gacactatag tcgagccaaa cagacgctcc ctgtgattta tgtcaagttg 480 tatatgtatc agctgttccg aagtttagcc tatatccatt cctttggaat ctgccatcgg 540 gatattaaac cgcagaacct cttgttggat cctgatactg ctgtattaaa actctgtgac 600 tttggaagtg caaagcagct ggtccgagga gaacccaatg tttcgtatat ctgttctcgg 660 tactataggg caccagagtt gatctttgga gccactgatt atacctctag tatagatgta 720 tggtctgctg gctgtgtgtt ggctgagctg ttactaggac aaccaatatt tccaggggat 780 agtggtgtgg atcagttggt agaaataatc aaggtcctgg gaactccaac aagggagcaa 840 atcagagaaa tgaacccaaa ctacacagaa tttaaattcc ctcaaattaa ggcacatcct 900 tggactaagg tcttccgacc ccgaactcca ccggaggcaa ttgcactgtg tagccgtctg 960 ctggagtata caccaactgc ccgactaaca ccactggaag cttgtgcaca ttcatttttt 1020 gatgaattac gggacccaaa tgtcaaacat ccaaatgggc gagacacacc tgcactcttc 1080 aacttcacca ctcaagaact gtcaagtaat ccacctctgg ctaccatcct tattcctcct 1140 catgctcgga ttcaagcagc tgcttcaacc cccacaaatg ccacagcagc gtcagatgct 1200 aatactggag accgtggaca gaccaataat gctgcttctg catcagcttc caactccact 1260 agctacccat acgatgttcc agattacgca agcttgggtg gtcccaacta a 1311 <210> 11 <211> 236 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polyA <400> 11 tggatccaga catgataaga tacattgatg agtttggaca aaccacaact agaatgcagt 60 gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta accattataa 120 gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg 180 aggtgtggga ggttttttaa agcaagtaaa acctctacaa atgtgatatg gctgat 236 <210> 12 <211> 317 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SV40 promoter <400> 12 ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 60 agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 120 tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa 180 ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 240 aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag 300 gcctaggctt ttgcaaa 317 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence containing I-CeuI restriction site <400> 13 cgtaactata acggtcctaa ggtagcgaaa 30 <210> 14 <211> 936 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Renilla luciferase sequence <400> 14 atgacttcga aagtttatga tccagaacaa aggaaacgga tgataactgg tccgcagtgg 60 tgggccagat gtaaacaaat gaatgttctt gattcattta ttaattatta tgattcagaa 120 aaacatgcag aaaatgctgt tattttttta catggtaacg cggcctcttc ttatttatgg 180 cgacatgttg tgccacatat tgagccagta gcgcggtgta ttataccaga ccttattggt 240 atgggcaaat caggcaaatc tggtaatggt tcttataggt tacttgatca ttacaaatat 300 cttactgcat ggtttgaact tcttaattta ccaaagaaga tcatttttgt cggccatgat 360 tggggtgctt gtttggcatt ttattatagc tatgagcatc aagataagat caaagcaata 420 gttcacgctg aaagtgtagt agatgtgatt gaatcatggg atgaatggcc tgatattgaa 480 gaagatattg cgttgatcaa atctgaagaa ggagaaaaaa tggttttgga gaataacttc 540 ttcgtggaaa ccatgttgcc atcaaaaatc atgagaaagt tagaaccaga agaatttgca 600 gcatatcttg aaccattcaa agagaaaggt gaagttcgtc gtccaacatt atcatggcct 660 cgtgaaatcc cgttagtaaa aggtggtaaa cctgacgttg tacaaattgt taggaattat 720 aatgcttatc tacgtgcaag tgatgattta ccaaaaatgt ttattgaatc ggacccagga 780 ttcttttcca atgctattgt tgaaggtgcc aagaagtttc ctaatactga atttgtcaaa 840 gtaaaaggtc ttcatttttc gcaagaagat gcacctgatg aaatgggaaa atatatcaaa 900 tcgttcgttg agcgagttct caaaaatgaa caataa 936 <210> 15 <211> 936 <212> DNA <213> Renilla reniformis <400> 15 atgacttcga aagtttatga tccagaacaa aggaaacgga tgataactgg tccgcagtgg 60 tgggccagat gtaaacaaat gaatgttctt gattcattta ttaattatta tgattcagaa 120 aaacatgcag aaaatgctgt tattttttta catggtaacg cggcctcttc ttatttatgg 180 cgacatgttg tgccacatat tgagccagta gcgcggtgta ttataccaga ccttattggt 240 atgggcaaat caggcaaatc tggtaatggt tcttataggt tacttgatca ttacaaatat 300 cttactgcat ggtttgaact tcttaattta ccaaagaaga tcatttttgt cggccatgat 360 tggggtgctt gtttggcatt ttattatagc tatgagcatc aagataagat caaagcaata 420 gttcacgctg aaagtgtagt agatgtgatt gaatcatggg atgaatggcc tgatattgaa 480 gaagatattg cgttgatcaa atctgaagaa ggagaaaaaa tggttttgga gaataacttc 540 ttcgtggaaa ccatgttgcc atcaaaaatc atgagaaagt tagaaccaga agaatttgca 600 gcatatcttg aaccattcaa agagaaaggt gaagttcgtc gtccaacatt atcatggcct 660 cgtgaaatcc cgttagtaaa aggtggtaaa cctgacgttg tacaaattgt taggaattat 720 aatgcttatc tacgtgcaag tgatgattta ccaaaaatgt ttattgaatc ggacccagga 780 ttcttttcca atgctattgt tgaaggtgcc aagaagtttc ctaatactga atttgtcaaa 840 gtaaaaggtc ttcatttttc gcaagaagat gcacctgatg aaatgggaaa atatatcaaa 900 tcgttcgttg agcgagttct caaaaatgaa caataa 936 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> part of the CR2 domain of E1A <400> 16 Leu Thr Cys His Glu Ala Gly Phe 1 5

Claims

발현 조절 서열(expression control sequence)에 작동 가능하게 연결된 글리코겐 합성효소 키나아제-3(glycogen synthase kinase-3, GSK3) 단백질에 대한 코딩 서열을 아데노바이러스(adenovirus)의 게놈에 포함하는, 재조합 복제 가능 아데노바이러스(recombinant replication competent adenovirus).
제1항에 있어서,
종양 세포에서 아데노바이러스의 우선적(preferential) 복제를 가능하게 하는 변형(modification)을 포함하는, 아데노바이러스.
제2항에 있어서,
상기 변형은 E1a 유전자(E1a gene), E1b 유전자(E1b gene) 또는 이들 유전자 모두에서 돌연변이(mutation)를 포함하는, 아데노바이러스.
제2항 또는 제3항에 있어서,
상기 변형이 E1A 또는 E1B의 종양 특이적 발현을 위한 프로모터를 포함하는, 아데노바이러스.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 변형은 E1A 또는 E1B의 조직 또는 세포 유형 특이적 발현을 위한 프로모터를 포함하는, 아데노바이러스.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
E3 영역에서 핵산 서열의 변형을 포함하는, 아데노바이러스.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 아데노바이러스는 종양용해성(oncolytic) 아데노바이러스인 것인, 아데노바이러스.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 GSK3 단백질은 GSK3-베타 단백질인 것인, 아데노바이러스.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 GSK3 단백질은 구성적으로 활성인 돌연변이체 단백질인 것인, 아데노바이러스.
제9항에 있어서,
상기 GSK3 단백질은 GSK3-베타 단백질이고, 위치 9에서의 세린(serine) 잔기는 또 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 알라닌(alanine) 잔기로 치환된 것인, 아데노바이러스.
발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 글리코겐 합성효소 키나아제-3(GSK3) 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자를 암 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 암 치료 방법.
제11항에 있어서,
상기 암은 활성 GSK3, 바람직하게는 GSK3-베타를 발현 또는 과발현하지 않는 것인, 방법.
제11항 또는 제12항에 있어서,
상기 방법은, 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 글리코겐 합성효소 키나아제-3(GSK3) 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 바이러스를 투여하는 단계를 포함하고, 바람직하게는 상기 재조합 바이러스는 재조합 아데노바이러스인 것인, 방법.
제13항에 있어서,
상기 아데노바이러스는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 아데노바이러스인 것인, 방법.
발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 글리코겐 합성효소 키나아제-3(GSK3) 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자를 암세포에 제공하는 단계를 포함하는, 암세포를 사멸하는 방법.
허용 세포(permissive cell)에서 재조합 복제 가능 아데노바이러스의 복제 속도(rate)를 향상시키는 방법에 있어서, 상기 세포에서 코딩 서열을 발현하기 위한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 GSK3 단백질에 대한 코딩 서열을 상기 아데노바이러스의 게놈에 제공하는 단계를 포함하는, 허용 세포에서 재조합 복제 가능 아데노바이러스의 복제 속도를 향상시키는 방법.
종양용해성 재조합 복제 가능 아데노바이러스의 종양용해성 속성을 증가시키는 방법에 있어서, 코딩 서열을 발현하기 위한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 GSK3 단백질에 대한 코딩 서열을 상기 아데노바이러스의 게놈에 제공하는 단계를 포함하는, 종양용해성 재조합 복제 가능 아데노바이러스의 종양 용해 속성을 증가시키는 방법.
종양에서 재조합 복제 가능 아데노바이러스의 복제 속도(rate replication) 및 확산(spreading)을 증가시키는 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 종양의 세포에서 코딩 서열을 발현하기 위한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 GSK3 단백질에 대한 코딩 서열을 종양용해성 아데노바이러스에 제공하는 단계를 포함하는, 종양에서 재조합 복제 가능 아데노바이러스의 복제 속도 및 확산을 증가시키는 방법.
재조합 아데노바이러스의 복제의 속도를 향상시키기 위한 코딩 서열을 발현하기 위해 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 GSK3 단백질에 대한 코딩 서열의 용도.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
추가적으로 전이유전자(transgene), 바람직하게는 IL2, GM-CSF 및/또는 TNF-알파에 대한 코딩 영역을 더 포함하는, 아데노바이러스.
제1항 내지 제10항, 또는 제20항 중 어느 한 항에 기재된 아데노바이러스 및 추가 약제(medicament)를 포함하는, 병용물.
제21항에 있어서,
상기 추가 약제는 항체, 바람직하게는 이중 특이적(bispecific) 항체를 더 포함하는, 병용물.
제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
추가적으로 동시(concurrent) 또는 순차적(sequential) 방사선 요법제(radiotherapy), 항체 요법제(antibody therapy), 화학 요법제(chemotherapy), 세포 요법제(cell-therapy), 면역 요법제(immunotherapy) 또는 기타 항암 개입(anticancer intervention) 또는 치료제(treatment)의 투여(administration)를 더 포함하는, 방법 또는 사용하기 위한 아데노바이러스 벡터.