KR20180044141A - 암 줄기세포 및 암세포 특이적 유전자 발현 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암 줄기세포 및 암세포에서 특이적으로 발현하는 유전자 발현 시스템과 이를 이용한 암 줄기세포와 암세포를 특이적으로 살상할 수 있도록 개발된 재조합 아데노바이러스에 관한 것이다. 본 발명의 유전자 발현 시스템을 이용하는 경우, 암세포 및 암 줄기세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있다.

Description

암 줄기세포 및 암세포 특이적 유전자 발현 시스템{Gene Expression System for Targeting Cancer Stem Cell and Cancer Cell}

본 발명은 암 줄기세포 및 암세포에서 특이적으로 발현하는 유전자 발현 시스템과 이를 이용한 암 줄기세포와 암세포를 특이적으로 살상할 수 있도록 개발된 유전자 전달체에 관한 것이다.

암은 전 세계적으로 질병사망의 수위를 차지하는 질병으로 수술, 방사선치료, 항암화학요법 등의 복합적인 치료를 하더라도 50% 이상의 환자는 결국 사망하게 되는 난치의 질환이다(WHO : World Health Report, 2001). 암 치료는 외과적 수술, 방사선치료, 항암제치료의 순으로 발전하였다. 초기의 암은 외과적 수술이 효과적이지만, 전이가 있는 대부분의 암은 수술이외에 방사선과 항암제 치료를 병행하게 되지만 정상세포에 미치는 부작용이 크고 암세포의 다중약제에 대한 내성으로 치료율이 극히 낮아 새로운 치료법의 개발이 절실히 요구된다.

특히, 암 줄기세포는 무한한 자기복제성과 항암제에 대한 저항성을 가지고 있다고 알려져 있다. 항암제와 방사선 치료로 대부분의 암세포를 치료하더라도 항암제 저항성이 있는 암 줄기세포가 존재하면 다시 암세포가 증식하여 재발이나 전이를 일으키는 원인이 된다. 따라서 암 줄기세포의 근본적인 치료법을 개발하는 것이 암의 재발과 전이의 극복으로 이어진다고 예상된다(참조: 도 1).

암세포에서만 선택적으로 증식하여 암세포만을 살상할 수 있는 종양 선택적 살상 아데노바이러스는 일차 감염세포에서만 치료효과를 보일 뿐 아니라 증식된 바이러스가 주변의 종양세포들을 이차적으로 그리고 삼차적으로 연쇄적으로 감염하고 암세포들을 살상함으로서 그 치료효과가 도미노 현상과 같이 계속 퍼져 나갈 수 있어 암 치료효과를 현격히 증대시킬 수 있다. 그러나 주변의 정상세포에서는 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 증식이 억제되므로 세포살상이 일어나지 않는 장점도 있다(참조: 도 2).

종래 대한민국 출원번호 제10-2010-0098498호(2010.10.08 출원)는 HRE 인헨서, E2F 및 TERT 프로모터를 포함하는 종양 특이적 살상용 아데노바이러스에 관한 것으로서, 특정 프로모터를 이용하여, 아데노바이러스의 종양 특이적 발현을 개선시켰다. 그럼에도 불구하고, 암 줄기세포에서 특이적으로 발현이 향상된 아데노바이러스에 대하여는 보고된 바가 없으며, 이의 개발이 요구되어지는 실정이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 암 줄기세포 및 암세포 특이적 유전자 발현 시스템을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 특정의 프로모터를 포함하는 유전자 발현 조절서열을 이용하여 암 줄기세포 및 암세포의 선택적 살상이 가능한 재조합 아데노바이러스를 제조할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 암 줄기세포 및 암세포 특이적 유전자 발현 조절서열을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상술한 유전자 발현 조절서열을 포함하는 암 줄기세포 및 암세포 특이적 발현이 개선된 유전자 전달체를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상술한 암 줄기세포 및 암세포 특이적 유전자 발현 조절서열을 포함하는 암 줄기세포 및 암세포 특이적 살상용 재조합 아데노바이러스를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상술한 재조합 아데노바이러스를 포함하는 암 줄기세포 및 암세포 특이적 억제용 항종양 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) HRE(hypoxia-response elements) 인헨서 서열; 및 (b) 상기 인헨서 서열의 다운스트림 영역에 위치한 Sox2, Oct4, 및 Nanog 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프로모터를 포함하는 암 줄기세포 및 암세포 특이적 유전자 발현 조절서열을 제공한다.

본 발명자들은 암 줄기세포 및 암세포를 선택적으로 살상할 수 있는 재조합 아데노바이러스를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 특정의 프로모터를 포함하는 유전자 발현 조절서열을 이용하여 암 줄기세포 및 암세포의 선택적 살상이 가능한 재조합 아데노바이러스를 제조할 수 있음을 규명하였다.

본 명세서 상의 용어 "HRE 인핸서 서열"은 저산소-반응성 인핸서 서열을 의미한다. 저산소 조건에서 세포의 특정 유전자들의 발현이 조절된다(Bunn and Poyton Physiol. Rev. 76:839-885(1996); Dachs and Stratford Br. J. Cancer 74:5126-5132(1996); Guillemin and Krasnow Cell 89:9-12(1997)). 대부분의 종양세포는 불충분한 혈액공급을 받게 되는데, 이는 종양세포들이 일반적으로 혈관을 형성시키는 내피세포보다 빠르게 성장하기 때문이며, 이는 종양에서 저산소 상태를 유발하게 된다. 대부분의 고형 종양 내에서 야기되는 이러한 저산소 상태는 해당효소(glycolytic enzyme)나 혈관신생유발 전구인자(proangiogenic factor)와 같은 생존인자의 생산을 야기함으로써 방사선 치료나 화학 항암 치료에 저항성을 가지게 된다. 상기 HRE 인헨서는 서열목록 제1서열의 핵산서열을 포함한다. 이에 본 발명자들은 Sox2, Oct4, 및 Nanog 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프로모터와 HRE 인핸서에 의해 아데노바이러스의 E1의 발현이 조절되는 종양 선택적 살상 아데노바이러스를 개발하였다.

본 명세서 상의 용어 "Sox2(sex determining region Y-Box 2) 프로모터"는 배아 및 신경 줄기세포의 유지에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 SRY(sex determining region Y)-Box 2 유전자의 프로모터를 의미한다. 상기 Sox2 프로모터는 서열목록 제2서열의 핵산서열을 포함한다. 또한, "Oct4(octamer-binding transcription factor 4) 프로모터"는 POU5F1 유전자의 프로모터를 의미한다. 상기 Oct4 프로모터는 서열목록 제3서열의 핵산서열을 포함한다. 또한, "Nanog 프로모터"는 배아 줄기 세포에서 전사 인자로 작용하는 NANOG 유전자의 프로모터를 의미한다. 상기 Nanog 프로모터는 서열목록 제4서열의 핵산서열을 포함한다. 배아 줄기세포는 미분화 상태에서 자가 재생을 유지할 수 있으며, Oct4, Sox2 및 Nanog와 같은 인자들이 자가 재생에 작용하는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 Oct4, Sox2 및 Nanog 전사 인자들이 암 줄기세포에서 과발현되는 바, 암 줄기세포의 사멸을 위해 이들을 억제하고자 하는 종래의 시도들과는 달리, 오히려 이들의 프로모터들을 이용하여, 암 줄기세포에서 특이적으로 발현이 향상되는 유전자 전달체 및 재조합 아데노바이러스를 개발하였다.

본 발명자들은 Oct4, Sox2 또는 Nanog 프로모터를 포함하는 아데노바이러스를 이용하여, 모든 프로모터 각각의 암 줄기세포 및 암세포에서의 선택적 발현을 규명하였다. 특히 바람직하게 Sox2 프로모터를 이용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 조절서열은 E2F 프로모터를 추가적으로 포함하고, 상기 E2F 프로모터는 상기 HRE 인헨서 서열의 다운스트림 영역에 위치한다. 본 명세서 상의 용어 "E2F 프로모터"는 아데노바이러스의 E2 프로모터의 활성화를 촉진시키고, 세포주기의 진행을 주관하는 여러 유전자들의 전사도 함께 촉진시키는 전사인자인 E2F 유전자의 프로모터를 의미한다. E2는 암 유전자(oncogene)로서 pRb(retinoblastoma protein)와 결합하여 그 활성이 억제된다.

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용하는 E2F 프로모터 서열은 서열목록 제5서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명인 유전자 발현 조절서열은 "변형된(modified) E2F 프로모터"도 포함하는 것으로 해석되며, 이는 프로모터 서열의 사이즈를 축소시키는 것, 또는 c-Myc 및 SP1이 결합하는 핵산서열을 추가하여 기존의 E2F 프로모터의 활성을 증가시킨 것을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 조절서열은 ESEe_n 핵산 서열을 추가적으로 포함하고, 상기 ESEe_n 핵산 서열은 상기 HRE 프로모터의 다운스트림 영역에 위치하며, 상기 n은 1 내지 10의 정수이다. 다른 구체예에서 상기 n은 1 내지 8의 정수이고, 또 다른 구체예에서 상기 n은 1 내지 6이며, 또 다른 구체예에서 상기 n은 1 내지 5이고, 또 다른 구체예에서 상기 n은 1 내지 4이며, 또 다른 구체예에서 상기 n은 1 내지 3이다. 본 명세서 상의 용어 "ESEe" 핵산 서열은 E2F-SP1-E2F 핵산 서열을 의미하고, 본 명세서 상에서 "변형된 E2F 프로모터 서열"로도 기재할 수 있다. 상기 "ESEe"를 설명하며 언급된 상기 "n"은 ESEe 서열이 연속적으로 반복 배열된 횟수를 의미한다. ESEe_n 핵산 서열의 구체적인 예로서 n이 2인 경우 및 3인 경우의 서열을 서열목록 제6서열 및 제7서열에 나타내었다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 유전자 발현 조절 서열은 ESEe_n 서열에 결합된 "5Myc" 핵산 서열을 추가적으로 포함한다. 상술한 ESEe_n 서열에 결합된 5Myc 핵산 서열은 "5Myc-(ESEe_n)"와 같이 기재할 수 있고, 이는 5Myc 핵산 서열과 (E2F-SP1-E2F)_n 핵산 서열이 순차적으로 결합된 핵산 서열을 의미하며, "5Myc-(E2F-SP1-E2F)_n " 핵산 서열로도 나타낼 수 있다. 5Myc 결합된 변형된 E2F 프로모터 서열은 구체적으로 예를 들면, 서열목록 제8서열 내지 제10서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

상술한 5Myc 및 SP1은 정상세포에 비해 암세포에서 월등히 높게 발현되는 발암단백질인 c-Myc 또는 SP1 이 결합하는 핵산서열을 의미하는 것으로서 당업계에 일반적으로 알려져 있다(Genes Dev. 12:1769-1774(1998), Nucletic Acids Res. 28:669-677(2000), Cancer Res. 59:551-557(1999)). 상기 5Myc은 c-Myc 결합부위의 콘센수스 서열(consensus sequence, CACGTG) 5개가 연결되어 있는 것을 의미하며, 보다 구체적으로는 서열목록 제8서열 내지 제10서열을 통해 알 수 있는 바와 같이 CACGTGGTACCACGTGGTACCACGTGGTACCACGTGGTACCACGTG 서열을 나타낸다. SP1 결합부위의 콘센수스 서열은 CCGCCC 도입되었다.

보다 구체적으로, 본 발명의 5Myc-(ESEe_n) 핵산 서열에 있어서, n이 2인 경우는 5Myc-E2F-SP1-E2F-E2F-SP1-E2F 핵산 서열을 의미하고, n이 3인 경우, 5Myc-E2F-SP1-E2F-E2F-SP1-E2F-E2F-SP1-E2F의 핵산 서열을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 유전자 발현 조절 서열은 상기 ESEe_n 서열의 다운스트림 영역에 BIRC5(baculoviral IAP repeat-containing 5, survivin) 프로모터 및 변형된 hTERT(modifed human telomerase reverse transcriptase, mTERT) 프로모터 중에서 선택되는 하나 이상의 프로모터를 추가적으로 더 포함한다.

본 발명자들은 치료 유전자를 암세포 및 암줄기세포에서만 특이적으로 과발현 시키기 위하여 이 분야에서 많이 사용하고 있는 BIRC5(baculoviral IAP repeat-containing 5, survivin) 또는 사람 텔로머라아제 역전사효소 (human telomerase reverse transcriptase, hTERT) 프로모터를 상술한 HRE 인핸서 및 변형된 E2F 프로모터 다운 스트림 영역에 위치시켜 기존의 프로모터 활성을 증가시키고 종양 특이적으로 치료 유전자 발현이 조절되도록 함으로서 개선된 치료효과를 유도하고자 하였다. 본 발명에 사용한 hTERT 프로모터는 하나 이상의 c-Myc 결합부위 및 하나 이상의 SP1 결합부위를 포함한 mTERT 프로모터를 사용한다. 상기 survivin 또는 mTERT 프로모터는 각각 서열목록 제11서열 또는 제12서열의 핵산서열을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 유전자 발현 조절 서열은 상기 HRE 인헨서 다운스트림 영역에 Survivin 프로모터, Sox2 프로모터 및 mTERT 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프로모터를 추가적으로 더 포함한다. 암 줄기세포 및 암세포에서 특이적으로 유전자 발현을 조절할 수 있는 Survivin 프로모터, mTERT 및/또는 Sox2 프로모터를 HRE 인핸서 다운스트림 영역에 위치시켜 체내에서의 안전성은 높이고, 목적 유전자를 특이적으로 전달하여 발현시킴으로서, 암 줄기세포 및 암세포 타겟팅 효과를 극대화 시킬 수 있다.

상술한 유전자 발현 조절서열은 다음에서 설명하는 유전자 전달체 및 암 줄기세포 특이적 살상용 재조합 아데노바이러스에 포함되어 이용될 수 있고, 이에 대해 이하 자세히 설명한다.

암 줄기세포 특이적 발현이 개선된 유전자 전달체

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 유전자 발현 조절서열을 포함하는 암 줄기세포 및 암세포 특이적 발현이 개선된 유전자 전달체를 제공한다.

본 발명의 유전자 발현 조절서열은 상술한 유전자발현 조절서열과 동일하므로, 중복되는 내용은 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

본 발명의 유전자 전달체는 전달하고자 하는 목적 유전자가 상술한 유전자 발현 조절서열에 작동적으로 연결된 상태로 이용할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "작동적으로 연결된(operatively linked)"은 유전자 발현 조절서열(예: 프로모터, 시그널서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명의 유전자발현 조절서열에 작동적으로 연결된 목적 유전자는 특별하게 제한되지 않는다. 예를 들어, 발현하고자 하는 유전자는 유전자 전달체의 지놈에서 유래된 유전자, 예컨대 아데노바이러스의 ElA 유전자, E2 유전자, E3 유전자, E4 유전자, 또는 다양한 치료학적 트랜스 유전자(transgene)를 포함한다. 본 명세서 상의 다양한 치료학적 트랜스 유전자는 예를 들어, vastatin, p53, cytokines, immune-modulating genes, CD44v3/6, ADP (Adenovirus death protein), IFN-γ, HIF-1α siRNA, IDO2(idolamine 2,3-dioxygenase2) siRNA, Wnt decoy 단백질, VEGF decoy 단백질, endostatin, VEGF Trap, VEGF siRNA, cMet siRNA, microRNA(microRNA-26a), miR-99a, miR-143, miR-193a-3p, miR-206, miR-506(fokhead box Q1), IL-6, IL-12, shAkt1, shMYO6, CEA(Carcinoembryonic antigen), NIS(sodium-iodine symporter), GM-CSF, cytosine deaminase (CD), HSV-TK, LMP2A/LMP1, IP-10/CXCL10, PF-4var/CXCL4L1, Super-cytosine deaminase, oncostatin M, CD 147을 타겟팅하는 인간-마우스키메릭 항체(human-mousechimeric antibody), 인간 항체(humanized antibody), Lin28을 타겟팅하는 징크 핑거 단백질, VEGF 타겟팅 징크 핑거 단백질, cMet 타겟팅 징크 핑거 단백질, Cas 9 단백질과 guiding RNA, TALEN 단백질, TRAIL 단백질, 또는 PTEN(phosphatase and tensin homolog protein) 코딩 유전자가 있고, 본 발명의 치료학적 트랜스 유전자는 이에 한정되지 않는다. 상술한 miR-99a는 mTOR, AKT1 및 FGFR3를 타겟팅하고, miR-193a-3p는 PSEN1 유전자를 타겟팅한다.

본 발명의 유전자발현 조절서열과 상기 유전자발현 조절서열에 작동적으로 결합된 전달하고자 하는 유전자 서열은 통상적인 유전자 치료에 이용되는 모든 유전자 전달체에 적용될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 유전자 전달체는 플라스미드, 아데노바이러스(Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련바이러스(Adeno associated viruses: AAV)(Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager (1999)), 레트로바이러스(Gunzburg WH, et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, (1999)), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995)), 백시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 리오바이러스, 폭스바이러스 (GCE, NJL, Krupa M, Esteban M., The poxvirus vectors MVA and NYVAC as gene delivery systems for vaccination against infectious diseases and cancer Curr Gene Ther 8(2):97-120(2008)), 셈리키 포리스터 바이러스, 폴리머 (Hwang et al., In vitro and In vivo Transfection Efficiency of Human Osteoprotegerin Gene using Non-Viral Polymer Carriers., Korean J. Bone Metab. 13(2):119-128(2006)), 리포좀 (Methods in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002), 나노물질 또는 니오좀에 적용될 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 유전자 전달체는 재조합 아데노바이러스에 적용하여 제조된다.

ⅰ. 아데노바이러스

아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기, 조작의 편의성, 높은 타이터, 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200 bp의 ITR (inverted terminal repeat)를 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스 엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역(E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주 세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 코딩한다. E2 영역(E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 코딩한다. 현재 개발된 아데노바이러스 벡터 중에서, E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다. 한편, E3 영역은 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다 (Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551(1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073(1989)). 따라서, 본 발명의 유전자발현 조절서열은 E1A 유전자의 프로모터 서열 위치에 삽입되어 E1A 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 또한, 본 발명의 유전자발현 조절서열-발현 유전자 카세트는 결실된 E1 영역(E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 결실된 E1 영역에 삽입된다. 또한, 본 발명의 유전자발현 조절서열-발현 유전자 카세트는 결실된 E4 영역에도 삽입될 수 있다. 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어, "결실"은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다.

또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105%까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2 kb를 추가적으로 패키징할 수 있다(Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6:1733-1739(1987)). 따라서, 아데노바이러스에 삽입되는 상술한 외래 서열은 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.

아데노바이러스에 의해 운반되는 외래 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며, 이에 숙주세포에 대해 유전적 독성이 매우 낮다. 따라서, 본 발명의 아데노바이러스 유전자 전달 시스템을 이용한 유전자 치료가 매우 안전할 것으로 판단된다.

ⅱ. 레트로바이러스

레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고, 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다.

레트로바이러스 벡터를 구축하기 위하여, 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열은 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 지놈에 삽입되어 복제불능의 바이러스를 생산한다. 바이리온을 생산하기 위하여, gag, pol 및 env 유전자를 포함하지만 LTR(long terminal repeat)와 Ψ서열은 없는 패키징 세포주를 구축한다(Mann et al., Cell, 33:153-159(1983)). 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열, LTR 및 Ψ서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포주에 이입하면, Ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며, 이 전사체는 바이러스로 패키징되고, 바이러스는 배지로 배출된다 (Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt(eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513(1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여 유전자 전달 시스템으로 이용한다.

2세대 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달이 발표되었다. Kasaharaet al. Science, 266:1373-1376(1994))는 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스의 변이체를 제조하였고, 여기에서 EPO(erythropoietin) 서열을 엔벨로프 부위에 삽입하여 새로운 결합 특성을 갖는 키메릭 단백질을 생산하였다. 본 발명의 유전자 전달 시스템도 이와 같은 2세대 레트로바이러스 벡터의 구축 전략에 따라 제조할 수 있다.

ⅲ. AAV 벡터

아데노-관련 바이러스 (AAV)는 비분열 세포을 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제5,139,941 호 및 제 4,797,368 호에 상세하게 개시되어 있다. 유전자 전달 시스템으로서의 AAV에 대한 연구는 LaFace et al, Viology, 162:483486(1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933(1993), Walsh et al, J. Clin. Invest., 94:1440-1448(1994) 및 Flotte et al., Gene Therapy, 2:29-37(1995)에 개시되어 있다. 최근에, AAV 벡터는 낭포성 섬유증의 치료제로서 임상 I을 실시하고 있다.

전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열(릴랙신 유전자 및 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드 (McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963-1973(1988); 및 Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828(1989)) 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드(McCarty et al., J. Virol., 65:2936-2945( 1991))를 동시 형질전환시켜 제조된다.

ⅳ. 다른 바이러스 벡터

다른 바이러스 벡터들도 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 이용할 수 있다. 배시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492(1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148( 1986) 및 Coupar et al., Gene, 68:1-10(1988)), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995)), 리오바이러스, 폭스바이러스(GCE, NJL, Krupa M, Esteban M., The poxvirus vectors MVA and NYVAC as gene delivery systems for vaccination against infectious diseases and cancer Curr Gene Ther 8(2):97-120(2008)), 셈리키 포리스터 바이러스로부터 유래된 벡터들도, 목적 뉴클레오타이드 서열을 세포내로 운반할 수 있는 운반 시스템으로 이용할 수 있다.

ⅴ. 폴리머

비바이러스성 유전자 전달체로서 폭넓게 사용되는 폴리머계 전달체로는 젤라틴, 키토산(Carreno GB, Duncan R. Evaluation of the biological properties of soluble chitosan and chitosan microspheres. Int J Pharm 148:231-240(1997)) PLL(poly-LLysine)(Maruyama A, Ishihara T, Kim JS, Kim SW, Akaike T. Nanoparticle DNA carrier with poly (L-lysine) grafted polysaccharide copolymer and poly (D,Llactide). Bioconjugate Chem 8:735-742(1997)) 및 PEI(polyethyleneamine)(Abdallah B, Hassan A, Benoist C, Goula D, Behr JP, Demeneix BA. A powerful nonviral vector for in vivo gene transfer into the adult mammalian brain: Polyethyleneimine. Human Gene Ther 7:1947-1954(1996)) 등이 이용되고 있다. 폴리머계 유전자 전달체들의 장점은 면역반응과 급성독성의 발현율이 낮고 제조법이 간단하며 대량생산이 가능하다는 점이다.

ⅵ. 리포좀 및 니오좀

리포좀은 수상에 분산된 인지질에 의해 자동적으로 형성된다. 외래 DNA 분자를 리포좀으로 성공적으로 세포 내로 운반한 예는 Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982) 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)에 개시되어 있다. 한편, 리포좀을 이용한 동물세포의 형질전환에 가장 많이 이용되는 시약으로는 Lipofectamine(Gibco BRL)이 있다. 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 내포한 리포좀은 엔도사이토시스, 세포 표면에로의 흡착 또는 플라즈마 세포막과의 융합 등의 기전을 통해 세포와 상호 작용하여 세포내로 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 운반한다.

리포좀이 인지질을 이용하여 만들어 지는 것에 반하여 니오좀(niosome)은 사용하고 비-이온성 계면활성제(nonionic surfactant) 및 콜레스테롤(cholesterol)의 혼합으로 구성된 이중막 수송체로 극성 및 비극성 물질을 봉입할 수 있고, 삼투압적으로 활성이 있으며, 인지질 등에 의한 지질미립자의 운반체인 리포좀에 비하여 안정하고, 또한 제조시 사용되는 계면활성제가 보관 및 취급 시에 특별한 조건이 필요하지 않다는 장점을 가진다.

ⅵi. 나노물질

본 명세서 상의 용어 나노물질은 수 내지 수백 나노미터의 크기를 갖는 생체 적합성 고분자 물질을 의미하는 것으로서, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(polyetheleneglycol, PEG), 폴리락타이드(poly-lactide, PLA), 폴리글리콜리드(polyglycolide, PGA), 폴리락티드코글리콜리드(poly-lactide-co-glycolide, PLGA), 폴리카프로락톤(poly-ε-carprolactone, PCL), 히알루론산(hyaluronic acid, HA), 키토산(chitosan), 또는 혈청 알부민이 이에 해당할 수 있다.

한편, 상술한 본 발명의 유전자 전달 시스템을 세포내로 도입하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다.

본 발명에서, 유전자 전달 시스템이 바이러스 벡터에 기초하여 제작된 경우에는, 당업계에 공지된 바이러스 감염 방법에 따라 실시된다. 바이러스 벡터를 이용한 숙주 세포의 감염은 상술한 인용문헌에 기재되어 있다.

본 발명에서 유전자 전달 시스템이 내이키드 (naked) 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드인 경우에는, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980); 및 Harland와 Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099(1985)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973); 및 Chen과 Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752(1987)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982); 및 Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980); Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982); 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 방법에 의해 유전자를 세포내로 이입시킬 수 있다.

암 줄기세포 및 암세포 특이적 살상용 재조합 아데노바이러스

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 유전자 발현 조절서열을 포함하는 암 줄기세포 및 암세포 특이적 살상용 재조합 아데노바이러스를 제공한다.

본 발명의 유전자 발현 조절서열은 상술한 유전자발현 조절서열과 동일하므로, 중복되는 내용은 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 프로모터는 Sox2로 선택된다. 본 발명인 재조합 아데노바이러스에 포함되는 유전자 발현 조절서열은 Oct4, Sox2 또는 Nanog 프로모터를 포함할 수 있고, 특히 바람직하게 Sox2 프로모터를 이용할 수 있다. 본 발명자들은 하기의 실시예를 통해 각각의 프로모터를 포함하는 재조합 아데노바이러스의 암 줄기세포 선택적 살상 효능을 규명하였고, 특히 Sox2 프로모터를 이용하는 경우, 암 줄기세포 선택적 살상 효능이 가장 크게 향상됨을 규명하였다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 조절서열은 E2F 프로모터를 추가적으로 포함하고, 상기 E2F 프로모터는 상기 HRE 프로모터의 다운스트림 영역에 위치한다. 본 발명인 재조합 아데노바이러스는 상술한 '암 줄기세포 및 암세포 특이적 유전자 발현 조절서열'을 포함하는 재조합 아데노바이러스에 관한 것인바, 중복되는 내용에 대하여는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.

본 발명인 유전자 발현 조절서열은 상술한 바와 같이 "변형된(modified) E2F 프로모터"도 포함하는 것으로 해석되며, 이는 프로모터 서열의 사이즈를 축소시키는 것, 또는 c-Myc 및 SP1이 결합하는 핵산서열을 추가하여 기존의 E2F 프로모터의 활성을 증가시킨 것을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 조절서열은 ESEe_n 핵산 서열을 추가적으로 포함하고, 상기 ESEe_n 핵산 서열은 상기 HRE 프로모터의 다운스트림 영역에 위치하며, 상기 n은 1 내지 10의 정수이다. ESEe 핵산 서열에 대해서는 본 발명의 다른 일 양태인 "유전자 발현 조절서열"에 대한 설명을 위해 이미 상술한 바 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 유전자 발현 조절서열은 ESEe_n 서열에 결합된 "5Myc" 핵산 서열을 추가적으로 포함한다. 상술한 ESEe_n 서열에 결합된 5Myc 핵산 서열은 "5Myc-(ESEe_n)"와 같이 기재할 수 있고, 이는 5Myc 핵산 서열과 (E2F-SP1-E2F)_n 핵산 서열이 순차적으로 결합된 핵산 서열을 의미하며, "5Myc-(E2F-SP1-E2F)_n " 핵산 서열로도 나타낼 수 있다.

상술한 5Myc 및 SP1에 대해서는 본 발명의 다른 일 양태인 "유전자 발현 조절서열"에 대한 설명을 위해 이미 상술한 바와 동일하고, 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

본 발명의 유전자 발현 조절서열은 재조합 아데노바이러스의 E1A 유전자의 업스트림, 결실된 E3 유전자 영역 또는 E1A, E2, E3, E4 유전자의 업스트림과 결실된 E1, E2, E3, E4유전자 영역 모두에 위치할 수 있다. 본 발명의 유전자발현 조절서열이 E1A 유전자의 업스트림에 위치하는 경우, 즉 E1A 유전자에 본 발명의 유전자 발현 조절서열이 작동적으로 연결된 경우, 재조합 아데노바이러스의 복제가 본 발명의 유전자 발현 조절서열에 의해 조절된다. 본 발명의 유전자발현 조절서열이 결실된 E1, E2, E3, E4 유전자 영역에 위치하는 경우에는, "유전자발현 조절서열-트랜스 유전자-폴리 A" 발현카세트 형태로 결실된 E1, E2, E3, E4 유전자 영역에 삽입될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 아데노바이러스는 ITR(inverted termanal repaet) 서열을 추가적으로 더 포함한다. 아데노바이러스 지놈의 양 말단은 100-200 bp의 ITR(inverted terminal repeat)을 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스 엘리먼트이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 아데노바이러스는 상술한 유전자 발현 조절서열에 작동적으로 연결된(operatively linked) 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 항체 유전자, 세포독성 유전자, 세포증식 억제 유전자, 친-세포사멸 유전자 및 항-신생 혈관 생성 유전자, 전이 억제 유전자, 항종양 항체 및 항체 유래 fragment, 면역 조절 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 치료학적 트랜스 유전자를 추가적으로 더 포함한다. 본 명세서 상의 용어 "치료학적 트랜스 유전자(therapeutic transgene)"는 암세포, 보다 더 구체적으로 암 줄기세포 내에서 발현되어 치료학적 효과를 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

본 발명의 명세서에서 용어 "종양 억제인자 유전자(tumor suppressor gene)"는 표적 세포내에서 발현되어 종양 표현형을 억제할 수 있거나 세포사멸을 유도할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 본 발명의 실시에 유용한 종양 억제인자 유전자에는, p53 유전자, APC 유전자, DPC-4/Smad4 유전자, BRCA-1 유전자, BRCA-2 유전자, WT-1 유전자, 망막아세포종 유전자 (Lee et al., Nature, 1987, 329,642), MMAC-1 유전자, 선종양 폴립증 코일 단백질(adenomatouspolyposis coil protein)(미국특허공보 5,783,666호), 결손된 결장 종양(DCC) 유전자, MMSC-2 유전자, NF-1 유전자, 염색체 3p21.3에 위치한 비인후 종양 억제인자 유전자 (Cheng et al. Proc.Nat.Acad.Sci, 95:3042-3047 (1998)), MTS1 유전자, CDK4 유전자, NF-1 유전자, NF-2 유전자 및 VHL 유전자가 포함된다.

본 발명의 명세서에서 용어"항원성 유전자(antigenic gene)"는 표적 세포 내에서 발현되어 면역 시스템에서 인식할 수 있는 세포 표면 항원성 단백질을 생산하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 항원성 유전자의 예에는 암태아성항원 (carcinoembryonic antigen, CEA), HER-2, PSA(prostate specific antigen) 및 p53(Levine, A., 국제특허출원공개 WO94/02167호)이 포함된다. 면역 시스템이 용이하게 인식하도록 하기위해, 상기 항원성 유전자를 MHC 제I형 항원에 결합시킬 수 있다.

본 발명의 명세서 용어 "항체 유전자 (antibody gene)"는 정상세포와 달리 암세포에서 우선적 또는 독점적으로 발현되는 항원들에 결합하여 암세포의 세포사멸을 유도할 수 있는 특정 항체를 생산하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 항체 유전자의 예에는 anti-DR4/DR5, anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1, anti-Her2/neu, anti-VEGF, anti-VEGFR, anti-cMet, anti-Survivin, anti-EGFR, anti-Wnt, anti-Ly49 등을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 포함된다.

본 발명의 명세서에서 용어 "세포독성 유전자(cytotoxic gene)"는 세포내에서 발현되어 독성 효과를 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 세포독성 유전자의 예에는 슈도모나스 외독소(exotoxin), 리신 독소, 디프테리아 독소, CD(cytosine deaminase), TK(thymidine kinase) 등을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 포함된다.

본 발명의 명세서에서 용어 "세포증식 억제 유전자(cytostatic gene)"는 세포 내에서 발현되어 세포 주기 도중에 세포 주기를 정지시키는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 세포증식 억제 유전자의 예에는 p21, 망막아세포종 유전자, E2F-Rb 융합 단백질 유전자, 사이클린-종속성 카이네이즈 억제인자를 코딩하는 유전자(예를 들면, p16, p15, p18 및 p19), 성장 중지 특이성 호메오박스(growth arrest specific homeobox: GAX) 유전자(국제특허출원공개 WO 97/16459호 및 WO96/30385호) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 명세서에서 용어"친-세포사멸 유전자(pro-apoptotic gene)"는 발현되어 프로그램된 세포 소멸을 유도하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 친-세포사멸 유전자의 예에는 p53, 아데노바이러스 E3-11.6K (Ad2 및 Ad5에서 유래) 또는 아데노바이러스 E3-10.5K (Ad에서 유래), 아데노바이러스 E4 유전자, p53 경로 유전자 및 카스파제를 코딩하는 유전자가 포함된다.

본 발명의 명세서에서 용어 "항-신생혈관생성 유전자(anti-angiogenic gene)"는 발현되어 항-신생혈관 생성 인자를 세포밖으로 방출하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 항-신생혈관 생성 인자에는, 안지오스타틴, Tie2 (PNAS, 95:8795-800 (1998))와 같은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 억제 인자, 엔도스타틴 등이 포함된다.

본 발명의 명세서에서 용어 본 발명의 명세서에서 용어 "전이 억제 유전자(metastasis-suppressing gene)"는 암세포의 이동, 침윤에 의한 전이를 억제하는 유전자로서, 예를 들어 BRMS1, CRSP3, DRG1, KAI1, KISS1, NM23 및 다양한 TIMP(Tissue inhibitor of metalloproteinase)들을 포함한다.

본 발명의 명세서에서 용어 "면역 조절 유전자(immune-related gene)"는 면역 관련 인자들의 발현을 조절하는 모든 유전자를 의미하는 것으로서, 예를 들어 사이토카인(예, 인터페론-알파, -베타, -델타 및 -감마), 인터루킨(예, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20 및 IL-23) 및 콜로니 자극 인자(예, GM-CSF 및 G-CSF)를 암호화하는 유전자, 케모카인 그룹(단핵구 화학 주성단백질 1(MCP-1), 단핵구 화학 주성 단백질 2(MCP-2), 단핵구 화학 주성단백질 3(MCP-3), 단핵구 화학 주성 단백질 4(MCP-4), 대식구 염증성 단백질 1α(MIP-1α), 대식구 염증성 단백질 1β(MIP-1β), 대식구 염증성 단백질 1γ(MIP-1γ), 대식구 염증성 단백질 3α(MIP-3α), 대식구 염증성 단백질 3β(MIP-3β), 케모카인(ELC), 대식구 염증성 단백질 4(MIP-4), 대식구 염증성 단백질 5(MIP-5), LD78β, RANTES, SIS-엡실론(p500), 흉선 활성화-조절되는 케모카인(TARC), 에오탁신, I-309, 인간 단백질 HCC-1/NCC-2, 인간 단백질 HCC-3, 마우스 단백질 C10 등) 및 보조자극 인자(costimulatory factor: B7.1과 B7.2와 같은 T 세포 활성에 필요한 보조 분자)등이 있다. 상기에서 기술한 면역 조절 유전자 관련 정보를 찾아볼 수 있다.

본 발명의 명세서에서 용어 "싸이토카인 유전자(cytokine gene)"는 종래 알려진 면역 조절과 관련된 다양한 싸이토카인들의 발현을 조절하는 모든 유전자를 의미한다.

재조합 아데노바이러스에 삽입되는 트랜스 유전자는 프로모터-트랜스 유전자-[0064] 폴리 A 서열의 발현 카세트로 삽입되는 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 프로모터로서, 본 발명의 유전자발현 조절서열(HRE-TERT, HRE-E2F, HRE-TERT-E2F 또는 HRE-E2F-TERT) 또는 통상적인 프로모터를 이용할 수 있다. 트랜스 유전자에 결합되는 통상적인 프로모터는, 바람직하게는 동물세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포에서 작동하여 트랜스 유전자의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, U6 프로모터, H1 프로모터, CMV (cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, inducible 프로모터, 암세포 특이적 프로모터 (예컨대, TERT 프로모터, PSA 프로모터, PSMA 프로모터, CEA프로모터, E2F 프로모터 및 AFP 프로모터) 및 조직 특이적 프로모터 (예컨대, 알부민 프로모터)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 트랜스 유전자를 발현시키기 위한 발현 컨스트럭트에서 트랜스 유전자의 다운스트림에 폴리아데닐화 서열이 결합되어 있는 것이 바람직하다. 상기 폴리아네닐화 서열은, 소성장 호르몬 터미네이터(Gimmi, E. R., et al., Nucleic Acids Res. 17:6983-6998(1989)), SV40 유래 폴리 아데닐화 서열(Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12:5386-5393(1992)), HIV-1 polyA(Klasens, B. I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26:1870-1876(1998)), β-글로빈 polyA(Gil, A., et al, Cell 49:399-406(1987)), HSV TK polyA(Cole, C. N. and T. P. Stacy, Mol. Cell. Biol. 5:2104-2113(1985)) 또는 폴리오마바이러스 polyA(Batt, D. B and G. G. Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15:4783-4790(1995))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 암세포 및 암 줄기세포 특이적 억제용 항종양 조성물을 제공한다:

(a) 제 7 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 아데노바이러스의 치료학적 유효량; 및

(b) 약제학적으로 허용되는 담체.

본 발명의 조성물에 포함되는 재조합 아데노바이러스는, 암 줄기세포에 대한 특이적 살상 효능을 나타내고, 본 발명의 약제학적 조성물은 다양한 고형암, 예컨대 폐암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 난소암, 자궁암, 직장암, 위암, 항 문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 음문암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계(central nervous system, CNS) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 간암, 기관지암, 비인두암, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종 등의 암세포 및 암 줄기세포 사멸에 이용될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "치료"는 (ⅰ) 암세포 및 암 줄기세포 형성의 예방; (ⅱ) 암세포 및 암 줄기세포의 제거에 따른 다양한 고형암 질환의 억제 또는 경감; 및 (ⅲ) 암세포 및 암 줄기세포의 제거에 따른 다양한 고형암의 치료, 전이 및 재발 억제를 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 용어"치료학적 유효량"은 상술한 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다. 난소암에서 복강내로 투여하는 경우 및 간암에서 문맥으로 투여하는 경우에는 주입 방법으로 투여할 수 있고, 유방암의 경우에는 종양 매스에 직접 주사하여 투여할 수 있으며, 결장암의 경우에는 관장으로 직접 주사하여 투여할 수 있고, 방광암의 경우에는 카테테르 내로 직접 주사하여 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 1×10⁵-1×10¹⁵ pfu/㎖의 재조합 아데노바이러스를 포함하며, 통상적으로 1×10¹⁰ pfu를 이틀에 한번씩 2주 동안 주사한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법, 방사 요법, 항체 요법, 또는 재조합 단백질 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜팔(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아(nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen), 택솔(taxol), 트랜스라티눔(transplatinum), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 포함한다. 항체 요법, 또는 재조합 단백질 요법에 관한 것 추가 필요. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 암세포 및 암 줄기세포 특이적 유전자 발현 조절서열을 제공한다.

(b) 본 발명의 다른 목적은 상술한 유전자 발현 조절서열을 포함하는 암세포 및 암 줄기세포 특이적 발현이 개선된 유전자 전달체를 제공한다.

(c) 본 발명의 또 다른 목적은 상술한 암세포 및 암 줄기세포 특이적 유전자 발현 조절서열을 포함하는 암세포 및 암 줄기세포 특이적 살상용 재조합 아데노바이러스를 제공한다.

(d) 본 발명의 또 다른 목적은 상술한 재조합 아데노바이러스를 포함하는 암세포 및 암 줄기세포 특이적 억제용 항종양 조성물을 제공한다.

(e) 본 발명의 유전자 전달체를 이용하는 경우, 목적 유전자를 암세포 및 암 줄기세포 특이적으로 전달하여 발현시킴으로서, 암세포 및 암 줄기세포 타겟팅 효과를 극대화 시킬 수 있다.

(f) 본 발명의 재조합 아데노바이러스를 이용하는 경우, 암세포 및 암 줄기세포 특이적으로 재조합 아데노바이러스를 전달시켜 증식시킴으로써, 암세포 및 암 줄기세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있다.

(g) 본 발명의 암세포 및 암 줄기세포 특이적 억제용 항종양 조성물을 이용하는 경우, 다양한 고형암을 효과적으로 치료할 수 있고, 전이 및 재발을 방지할 수 있다.

도 1은 암 세포의 재발 원리의 모식도를 나타낸다.
도 2는 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 암세포 특이적 살상능 모식도를 나타낸다.
도 3은 Nanog, Oct4, 또는 Sox2의 프로모터를 발현하는 아데노바이러스 E1 셔틀벡터 제작 과정의 모식도를 나타낸다.
도 4는 HRE-Nanog-Rd19-k35, HRE-Oct4-Rd19-k35, HRE-Sox2-Rd19-k35 암 줄기세포 선택적 살상 아데노바이러스 제작 과정을 나타낸다.
도 5는 레닐라 루시퍼라아제(Renilla luciferase)를 발현하는 암 줄기세포 선택적 살상 아데노바이러스 제작 과정을 나타낸다.
도 6은 아데노바이러스 생산 및 정제 과정을 나타낸다.
도 7은 다양한 암세포 및 암 줄기세포에 대한 암 줄기세포 선택적 살상 아데노바이러스에 의해 증대된 살상능을 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 암 줄기세포 선택적 살상 아데노바이러스에 의한 저 산소 조건(Hypoxia)에서의 증대된 살상능 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 암 줄기세포 선택적 살상 아데노바이러스의 증식능 확인 결과를 나타낸다.
도 10은 Nanog 발현에 따른 암 줄기세포 선택적 살상 아데노바이러스의 E1A의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 Nanog 발현에 따른 암 줄기세포 선택적 살상 아데노바이러스의 살상능 변화 확인 결과를 나타낸다.
도 12는 Nanog 발현에 따른 암 줄기세포 선택적 살상 아데노바이러스의 증식능 변화 확인 결과를 나타낸다.
도 13은 Oct4 발현에 따른 암 줄기세포 선택적 살상 아데노바이러스의 살상능 변화를 확인한 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 암 줄기세포 선택적 살상 아데노바이러스의 개발

야생형 아데노바이러스 타입 5 파이버를 35 파이버로 변형하여 암 줄기세포 선택적 살상 아데노바이러스를 제작하였다. 먼저, 암 줄기세포에서 과 발현되는 전사인자인 Nanog, Oct4, Sox2의 프로모터를 종양의 저산소 상태에서도 특이적으로 활성화될 수 있는 인핸서인 HRE와 연결시켜 아데노바이러스 E1 셔틀벡터를 제작하였다(참조: 도 3). 제작된 pΔE1sp1B(φ)-HRE-Nanog-Rd19, pΔE1sp1B(φ)-HRE-Oct4-Rd19, pΔE1sp1B(φ)-HRE-Sox2-Rd19 E1 셔틀벡터를 dE1-K35와 상동재조합을 통해 HRE-Nanog-Rd19-k35, HRE-Oct4-Rd19-k35, HRE-Sox2-Rd19-k35 바이러스를 제작하였다(참조: 도 4). 또한, 이미징이 가능하도록 레닐라 루시퍼라아제(renilla luciferase)가 삽입된 E3 셔틀벡터를 HRE-Nanog-Rd19-k35, HRE-Oct4-Rd19-k35, HRE-Sox2-Rd19-k35와 상동재조합을 통해 HRE-Nanog-Rd19-k35/Rluc, HRE-Oct4-Rd19-k35/Rluc, HRE-Sox2-Rd19-k35/Rluc 바이러스를 제작하였다(참조: 도 5). 제작 된 아데노바이러스는 HEK293 세포주에 형질 전환 시켜 아데노바이러스를 생산한 뒤, A549 세포주에서 대량 증식시켜 생산하고, 바이러스성 지놈(viral genome)의 흡광도에 의한 광학 밀도(optical density)로 아데노바이러의 역가를 결정하였다(참조: 도 6, 표 1).

	광학 밀도(Optical density) (260 nm)	바이러스 역가 (VP/mL)
HRE-Nanog-Rd19-k35/Rluc	0.231	5.08 x 1011
HRE-Oct4-Rd19-k35/Rluc	0.877	1.93 x 1012
HRE-Sox2-Rd19-k35/Rluc	0.537	2.95 x 1012

실시예 2: 암 줄기세포 선택적 살상 아데노바이러스에 의한 우수한 암세포 특이적 살상능 효과 확인

암 줄기세포에서 과 발현되는 전사인자인 Nanog, Oct4, Sox2의 프로모터에 의해서 바이러스의 복제가 조절되는 암 줄기세포 선택적 살상 아데노바이러스에 의한 세포 살상능을 비교하기 위하여, 인간 폐암 세포주(A549, H460), 뇌암 세포주(U343, U251N), 간암 세포주(Hep1)와 그 외 정상 세포주(HDF, BJ)에 HRE-Nanog-Rd19-k35/Rluc, HRE-Oct4-Rd19-k35/Rluc, HRE-Sox2-Rd19-k35/Rluc를 감염시킨 후, 세포 살상 정도를 비교 관찰하였다. 도 7에서 볼 수 있듯이, 본 연구에 사용된 모든 암 세포주들에서 암 줄기세포 선택적 살상 아데노바이러스 중 HRE-Sox2-Rd19-k35/Rluc가 가장 우수한 세포 살상능을 확인할 수 있었다. 반면, 정상 세포주에서는 증식 및 살상능이 나타나지 않음을 확인하였으며, 이는 HRE-Sox2-Rd19-k35/Rluc 아데노바이러스가 암세포 특이적 세포 살상능이 있다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 암 줄기세포 선택적 살상 아데노바이러스에 의한 저 산소 조건에서의 증대된 살상능 효과 확인

본 연구에서 제작한 암 줄기세포에서 과 발현되는 전사인자인 Nanog, Oct4, Sox2의 프로모터에 의해 바이러스 복제가 조절되는 암 줄기세포 선택적 살상 아데노바이러스가 정상 산소 조건과 저 산소 조건에서 세포 살상 정도를 비교하기 위하여 인간 뇌암 세포주 U251N과 정상 세포주 BJ에 d55, HRE-Nanog-Rd19-k35/Rluc, HRE-Oct4-Rd19-k35/Rluc, HRE-Sox2-Rd19-k35/Rluc를 감염시킨 후 확인하였다(참조: 도 8). Sox2 프로모터에 의해 복제가 조절되는 HRE-Sox2-Rd19-k35/Rluc 암 줄기세포 선택적 살상 아데노바이러스의 암세포 살상능이 HRE-Nanog-Rd19-k35/Rluc, HRE-Oct4-Rd19-k35/Rluc 보다 정상 산소 조건과 저 산소 조건에 관계없이 우수한 것을 확인하였다. 또한, 저 산소 조건에서 HRE의 삽입에 따른 복제능이 증대됨에 따라 정상 산소 조건과 비교하였을 때 세포 살상능이 2배 증가된 것을 확인할 수 있었다. 이에 따라 암 줄기세포 선택적 살상 아데노바이러스 중 HRE-Sox2-Rd19-k35/Rluc의 암 세포 살상능이 가장 우수함을 확인하였다. 뿐만 아니라 대조군으로 사용된 중국에서 상용화되어 시판되고 있는 종양 살상 아데노바이러스인 ONYX-o15 (d55) 바이러스와 비교하였을 때, HRE-Sox2-Rd19-k35/Rluc 세포 살상능이 좋은 것을 확인할 수 있었다. 반면, 정상 세포주 BJ에서는 어떠한 바이러스도 처리하지 않은 음성대조군과 비교하였을 때 세포 살상능이 없는 것을 확인하였고, 이는 암세포 특이적으로 세포 살상능이 있다는 것을 의미한다.

실시예 4: 암 줄기세포 선택적 살상 아데노바이러스의 증식능 확인

암 줄기세포 선택적 살상 아데노바이러스의 증식능을 확인하기 위하여, A549와 H460에 HRE-Nanog-Rd19-k35/Rluc, HRE-Oct4-Rd19-k35/Rluc, HRE-Sox2-Rd19-k35/Rluc를 감염시켰다. 정상 산소 조건과 저 산소 조건에서 바이러스 감염시킨 후, 48시간에 배양액을 획득하여 아데노바이러스의 파티클(particle) 수를 Q-PCR을 통하여 확인하였다. 도 9에서 보는 바와 같이, 암 세포 살상능이 가장 우수하였던 HRE-Sox2-Rd19-k35/Rluc가 본 연구에서 사용된 A549와 H460 세포주에서 바이러스 증식능이 HRE-Nanog-Rd19-k35/Rluc, HRE-Oct4-Rd19-k35/Rluc에 비하여 효율이 높은 것을 확인하였다. 특히, 정상 산소 조건에서 HRE-Sox2-Rd19-k35/Rluc 감염시킨 그룹은 HRE-Oct4-Rd19-k35/Rluc를 감염시킨 그룹보다 8.8배에서 10.5배, HRE-Nanog-Rd19-k35/Rluc를 감염시킨 그룹보다는 5.8배에서 133.2배 더 증가된 바이러스 생산량을 확인하였다. 또한, 저 산소 조건에서도 HRE-Sox2-Rd19-k35/Rluc 바이러스의 복제가 저해되지 않고 오히려 정상 산소 조건과 비교하였을 때 2.5배에서 31.6배 이상 복제가 증가됨을 확인하였다. 이를 통하여 HRE를 삽입함으로써 저산소 조건에서도 아데노바이러스의 복제능이 감소되지 않아 세포 살상 효과가 증가하였음을 확인할 수 있었다.

실시예 5: Nanog 발현에 따른 암 줄기세포 선택적 살상 아데노바이러스의 E1A의 발현 변화 확인

암 줄기세포에서 과 발현되는 전사인자인 Nanog를 발현하는 복제 불가능 아데노바이러스 dE1-K35/Nanog에 의해 인위적으로 Nanog을 과 발현시킨 Hela와 U251N 세포주에 HRE-Nanog-Rd19-k35/Rluc, HRE-Oct4-Rd19-k35/Rluc, HRE-Sox2-Rd19-k35/Rluc를 감염시킨 후, Nanog와 아데노바이러스 E1A의 발현 변화를 확인하였다. 도 10에서 보는 바와 같이, Hela, U251N 두 가지 세포에서 dE1-K35/Nanog 감염시킨 그룹에서 Nanog의 발현을 확인하였을 뿐만 아니라, dE1-K35/Nanog 단독으로 감염시킨 그룹보다 복제 가능 바이러스를 동시에 감염시킨 그룹에서 모두 Nanog의 발현이 증가됨을 확인하였다. 또한, HRE-Oct4-Rd19-k35/Rluc 바이러스를 감염시킨 그룹은 dE1-K35/Nanog 감염의 상관없이 E1A 발현의 변화가 확인되지 않았지만, HRE-Sox2-Rd19-k35/Rluc 바이러스를 감염시킨 그룹은 dE1-K35/Nanog와 동시에 감염시킨 그룹에서 E1A의 발현이 단독으로 감염시킨 그룹보다 감소되는 것을 확인하였다. 반면, HRE-Nanog-Rd19-k35/Rluc 바이러스를 감염시킨 그룹은 dE1-K35/Nanog와 동시에 감염시킨 그룹에서 E1A의 발현이 단독으로 감염시켰을 때 보다 증가되는 것을 확인하였다. 이 결과를 통해 Nanog 과 발현에 따른 HRE-Nanog-Rd19-k35/Rluc 바이러스의 복제능이 증가될 수 있음을 간접적으로 확인할 수 있었다.

실시예 6: Nanog 발현에 따른 암 줄기세포 선택적 살상 아데노바이러스의 살상능 변화 확인

암 줄기세포에서 과 발현되는 전사인자인 Nanog를 발현하는 복제 불가능 아데노바이러스 dE1-K35/Nanog에 의해 인위적으로 Nanog을 과 발현시킨 Hela와 U251N 세포주에 HRE-Nanog-Rd19-k35/Rluc, HRE-Oct4-Rd19-k35/Rluc, HRE-Sox2-Rd19-k35/Rluc를 감염시킨 후, 암 세포 살상능의 변화를 확인하였다(참조: 도 11). Hela 세포주에서는 HRE-Sox2-Rd19-k35/Rluc 바이러스를 단독으로 감염시킨 그룹과 dE1-K35/Nanog를 동시에 감염시킨 그룹의 암 세포 살상능은 크게 차이가 나지 않았지만, HRE-Nanog-Rd19-k35/Rluc와 HRE-Oct4-Rd19-k35/Rluc 바이러스를 단독으로 감염시킨 그룹보다 dE1-K35/Nanog를 동시에 감염시킨 그룹에서 각각 3.4배, 11배 암 세포 살상능이 증가한 것을 확인하였다. U251N 세포주에서는 암 줄기세포 선택적 살상 아데노바이러스를 단독으로 감염시킨 그룹보다 dE1-K35/Nanog를 동시에 감염시켰을 때, HRE-Nanog-Rd19-k35/Rluc 18배, HRE-Oct4-Rd19-k35/Rluc 14.2배, HRE-Sox2-Rd19-k35/Rluc 1.4배 증가된 암 세포 살상능을 확인하였다.

실시예 7: Nanog 발현에 따른 암 줄기세포 선택적 살상 아데노바이러스의 증식능 변화 확인

암 줄기세포에서 과 발현되는 전사인자인 Nanog를 발현하는 복제 불가능 아데노바이러스 dE1-K35/Nanog에 의해 인위적으로 Nanog을 과 발현시킨 U251N 세포주에 HRE-Nanog-Rd19-k35/Rluc, HRE-Oct4-Rd19-k35/Rluc, HRE-Sox2-Rd19-k35/Rluc를 감염시킨 후, 암 줄기세포 선택적 살상 아데노바이러스의 증식능의 변화를 확인하였다(참조: 도 12). U251N 세포주에 HRE-Oct4-Rd19-k35/Rluc, HRE-Sox2-Rd19-k35/Rluc 바이러스를 단독으로 감염시킨 그룹보다 dE1-K35/Nanog을 동시에 감염시킨 그룹이 5.6배, 20.4배 증가된 바이러스 증식능을 확인하였으며, 특히 HRE-Nanog-Rd19-k35/Rluc 바이러스의 경우는 dE1-K35/Nanog 동시에 감염시켰을 때 단독으로 감염시킨 그룹보다 45.5배 증가된 바이러스 증식능을 확인할 수 있었다.

실시예 8: Oct4 발현에 따른 암 줄기세포 선택적 살상 아데노바이러스의 살상능 변화 확인

암 줄기세포에서 과 발현되는 또 다른 전사인자로 Oct4를 발현하는 복제 불가능 아데노바이러스 dE1-K35/Oct4에 의해 인위적으로 Oct4를 과 발현시킨 Hela, U251N, A549 세포주에 HRE-Nanog-Rd19-k35/Rluc, HRE-Oct4-Rd19-k35/Rluc, HRE-Sox2-Rd19-k35/Rluc를 감염시킨 후, 암 세포 살상능의 변화를 확인하였다(참조: 도 13). 본 연구에서 사용된 모든 암 세포주에서 복제 가능 바이러스를 단독으로 감염시킨 그룹에 비하여 dE1-K35/Oct4를 동시에 감염시킨 그룹에서 증가된 암 세포 살상능을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> Gene Expression System for Targeting Cancer Stem Cell and Cancer Cell <130> PN160010 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 246 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tcgagccaca gtgcatacgt gggctccaac aggtcctctt gtcgagccac agtgcatacg 60 tgggctccaa caggtcctct tgtcgagcca cagtgcatac gtgggctcca acaggtcctc 120 ttgtcgagcc acagtgcata cgtgggctcc aacaggtcct cttgtcgagc cacagtgcat 180 acgtgggctc caacaggtcc tcttgtcgag ccacagtgca tacgtgggct ccaacaggtc 240 ctcttg 246 <210> 2 <211> 1308 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 caaaagccac ctccatacag tgccgtggga tgccaggaag ttgaaatcac cctcccccat 60 cgcctgcact tttgagcgcc cttccgtctg tgtctttccc cagcccccat ttgaaagccg 120 cacgaccgaa acccttctta cggggaggca tgggatggga atggggagtg ggggcagaca 180 gtagaagcat cccctttgct acggttgaat gaagacagtc tagtgggaga tgtggctggg 240 gctaagagga agagctgcag tttcctgggc caaagagctg agttggacag ggagatggca 300 gcttaccaag gcctgctggt tctcagctct agagtctgcc 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ag 872

Claims (16)

1. (a) HRE(hypoxia-response elements) 인헨서 서열; 및 (b) 상기 인헨서 서열의 다운스트림 영역에 위치한 Sox2, Oct4, 및 Nanog 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프로모터를 포함하는 암세포 및 암 줄기세포 특이적 유전자 발현 조절서열.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 프로모터는 Sox2로 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절서열.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 조절서열은 E2F 프로모터를 추가적으로 포함하고, 상기 E2F 프로모터는 상기 HRE 인헨서 서열의 다운스트림 영역에 위치하는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절서열.
   
4. 제 3 항에 있어서, 상기 E2F 프로모터는 2회 내지 6회 포함되는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절서열.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 조절서열은 ESEe_n 핵산 서열을 추가적으로 포함하고, 상기 ESEe_n 핵산 서열은 상기 HRE 프로모터의 다운스트림 영역에 위치하며, 상기 n은 1 내지 10의 정수인 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절서열.
   
6. 제 5 항에 있어서, 상기 유전자 발현 조절 서열은 ESEe_n 서열에 결합된 5Myc 핵산 서열을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절서열.
   
7. 제 6 항에 있어서, 상기 유전자 발현 조절 서열은 상기 ESEe_n 서열의 다운스트림 영역에 BIRC5(baculoviral IAP repeat-containing 5, survivin) 프로모터 및 변형된 hTERT(modifed human telomerase reverse transcriptase, mTERT) 프로모터 중에서 선택되는 하나 이상의 프로모터를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절서열.
   
8. 제 1 항에 있어서, 상기 유전자 발현 조절 서열은 상기 HRE 인헨서 다운스트림 영역에 Survivin 프로모터, Sox2 프로모터 및 mTERT 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프로모터를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절서열.
   
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 유전자 발현 조절서열을 포함하는 암 줄기세포 특이적 발현이 개선된 유전자 전달체.
   
10. 제 9 항에 있어서, 상기 유전자 전달체는 플라스미드, 재조합 아데노바이러스, 아데노-관련바이러스(Adeno associated viruses), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 백시니아 바이러스, 리오바이러스, 폭스바이러스, 셈리키 포리스터 바이러스, 폴리머, 리포좀, 나노물질 또는 니오좀인 것을 특징으로 하는 유전자 전달체.
    
11. 제 10 항에 있어서, 상기 유전자 전달체는 재조합 아데노바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 유전자 전달체.
    
12. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 유전자 발현 조절서열을 포함하는 암세포 및 암 줄기세포 특이적 살상용 재조합 아데노바이러스.
    
13. 제 12 항에 있어서, 상기 프로모터는 Sox2로 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
    
14. 제 12 항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 ITR(inverted termanal repaet) 서열을 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
    
15. 제 12 항에 있어서, 상기 아데노바이러스는 상기 유전자 발현 조절서열에 작동적으로 연결된(operatively linked) 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 세포독성 유전자, 항체 유전자, 세포증식 억제 유전자, 세포사멸 유전자, 항-신생 혈관 생성 유전자, 전이 억제 유전자, 항종양 항체 및 항체 유래 단편(fragment), 사이토카인 유전자 및 면역 조절 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 치료학적 트랜스 유전자를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
    
16. 다음을 포함하는 암 줄기세포 특이적 억제용 항종양 조성물:
    (a) 제 12 항에 따른 재조합 아데노바이러스의 치료학적 유효량; 및
    (b) 약제학적으로 허용되는 담체.

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