KR101488395B1 - 암세포 특이적 유전자 발현을 위한 재조합 유전자발현 조절서열 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암세포 특이적 발현이 우수한 유전자발현 조절서열, 암세포 특이적 살상능이 우수한 재조합 아데노바이러스 및 암세포내 위치 추적이 용이한 재조합 아데노바이러스에 관한 것이다. 본 발명은 암세포 특이적 세포전달 효율 및 바이러스 복제능이 우수하고 저산조 조건에서도 유전자 전달 효율 및 바이러스 증식능이 저해되지 않는 유전자 전달 시스템과 감염경로에 무관하게 바이러스의 위치추적이 가능한 비침습적 분자영상 도구로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

암세포 특이적 유전자 발현을 위한 재조합 유전자발현 조절서열{Recombinant Expression Control Sequence for Cancer Cell-Specific Gene Expression}

본 발명은 암세포 특이적 유전자 발현을 위한 재조합 유전자발현 조절서열에 관한 것이다.

간암은 세계적으로 가장 흔히 발병하는 암 가운데 하나로서 아시아와 아프리카 지역에서 특히 높은 빈도로 나타나며, 우리나라의 경우, OECD 국가 중 간암 발생율 1위를 차지하며, 40-50대 남성 사망원인의 1위에 오를 만큼 만연한 질병이다. 이러한 필요에 의해 외과적 수술, 화학 약물 요법, 방사선 치료와 같은 기존의 치료 방법 외에도 새로운 치료 기술들이 개발되고 있으며 기존의 방법들과 병행하는 치료에 대해서도 활발한 연구가 진행되고 있으나 치유가 쉽지 않고, 많은 부작용들이 나타나므로 보다 효과적이고 안전한 치료 기술의 개발이 시급한 실정이다.

암에 대한 유전자 치료는 1990년대에 들어와서 본격적으로 소개되기 시작하였으며^{1 -3}, 여러 가지 유전자 치료에 이용되는 벡터들 중 아데노바이러스를 이용한 임상사례가 꾸준히 늘어나고 있는 추세이다^{1 ,4}. 그러나 암 치료용 재조합 아데노바이러스는 대부분이 증식 불가능한 일세대 바이러스로 이들을 유전자 전달체로 이용하는 경우는 일차 감염세포 또는 극히 일부의 주변세포들에만 항암효과를 유발할 수 있어, 임상적인 면에서 많은 제약이 있었다^5,6. 이를 극복할 수 있는 한 방안으로 암세포에서만 선택적으로 증식하여 암세포를 살상하는 종양세포 특이 증식 및 세포살상 재조합 아데노바이러스에 대한 연구가 다양하게 진행되고 있다. 이러한 종양 세포 특이적 세포 살상 아데노바이러스를 개발하기 위하여 크게 세 가지 전략이 사용되고 있다. 첫 번째는 아데노바이러스의 유전자 자체를 변형시켜 특정조직 또는 특정 세포(예를 들어, p53이 불활성화된 암세포^{7 ,8} 또는 Rb가 불활성화 된 암세포^{9 -11} 등)에서만 특이적으로 바이러스의 복제가 가능하도록 하는 방법이며, 두 번째는 종양세포 표면에 특이적으로 발현되는 항원과 결합하는 단백질을 바이러스 표면에 결합시켜 종양세포를 표적화 하는 방법(transductional targeting)^{12 -14}이다. 세 번째로는 전사조절에 의한 표적화(transcriptional targeting) 방법^{15 - 18}으로 대표적으로 종양세포에서 특이적으로 발현하는 유전자의 프로모터를 이용하여 치료 유전자의 발현을 조절하는 방법이다.

AFP는 난황낭과 태아 발생기동안 간에서 발현이 높은 혈청단백질로^{19 ,20}, 성인에서는 간암 환자를 제외하고는 거의 검출되지 않기 때문에 간암에 대한 유용한 표지자로 이용된다. 실제 임상에서 환자 개개인들마다 혈청 내 AFP의 발현정도가 매우 다양한데^{21 ,22}, 이는 인 비트로에서 여러 간암 세포주들 간의 AFP 발현정도가 1000배 이상 차이가 났던 것과 상관 관계를 보여주는 결과이다²³.

정상세포와 구별되는 암세포의 특징 중 하나는 종양의 중심부에 나타나는 산소부족 현상으로, 이는 암세포의 빠른 성장과 분열에 기인하여 나타나는 현상이다. 특히 간암의 경우, 암 세포의 과도한 증식과 간 혈관계(간문맥, 동맥)의 손상이 발생하면 간 내 혈류량의 감소로 저 산소 상태가 형성 되고 저 산소 상태가 급속히 악화되면 혈관 신생 인자의 분비로 혈관형성이 촉진되어 결국은 과도한 혈관 형성 현상이 나타난다. 이러한 저산소 상태에서는 아데노바이러스를 이루는 단백질의 발현이 저해되면서 바이러스의 복제가 감소된다는 것이 보고된 바 있다²⁴. 암세포 조직 발달을 위해 필요한 신생혈관 생성에 관여하는 VEGF의 인핸서 부분인 HRE는 산소 부족에 의해 조절되는 몇몇 유전자들(예. Epo, VEGF, GAPDH)의 코딩부위에 위치하며, 산소 농도가 낮을 때만 단백질의 생산을 시작하도록 스위치를 가동한다.

한편 아데노바이러스를 이용한 치료는 효율성과 안전성면에서 암을 치료할 수 있는 대체방법²⁵으로 생각될 만큼 많은 장점을 가졌음에도 불구하고, 복제가능 아데노바이러스가 단일 치료 수단으로 임상에 적용될 때 얼마나 효율적인지에 대해서는 밝혀진 바가 많지 않다²⁶. 또한 종양 선택적 복제 바이러스의 복제능, 확산능, 지속범위, 숙주면역계와의 상호작용에 대해서도 아직 규명되지 못했다. 복제가능 아데노바이러스에 대해서 규명된 바가 적은 이유 중 하나는 비침습적이며 복제도 가능한 아데노바이러스 탐지시스템이 없기 때문이다. 인 비보에서도 이 시스템을 이용하여 아데노바이러스의 복제를 확인할 수 있다면 임상에의 적용 가능성을 확인하는 수단으로 이용될 수 있을 것이다.

아데노바이러스의 캡시드단백질은 바이러스의 DNA를 보호하고 유전물질을 감염된 세포의 핵으로 전달하는 운반체로 작용한다. 인간 아데노바이러스 타입 5의 캡시드 단백질은 3개의 주요 단백질과 5개의 보조 단백질로 구성되어 있다. 이중 보조 캡시드 단백질인 IX 단백질(pIX)은 필수 단백질이 아닌 것으로 생각되었으나 다양한 연구를 통해 pIX이 아데노바이러스 유전자의 전사활성인자로 작용하며, 세포 특이적 리간드와 같이 사이즈가 큰 펩타이드를 수용할 수 있는 능력이 있음이 밝혀지고 있다. pIX은 아데노바이러스의 표면에 노출되어 있기 때문에 다양한 펩타이드를 결합시켜 바이러스 표면에 표출될 수 있도록 한다. 이러한 특성 때문에 pIX에 다양한 펩타이드를 결합시켜 표적화에 이용하려는 연구들이 많이 시도되고 있다. 드미드리예프(Dmitriev) 그룹은 8개의 라이신 잔기를 pIX의 C 말단에 결합시켜 아데노바이러스의 수용체인 CAR(coxakie-adenovirus receptor)는 부족하고, 대신 세포 표면에 헤파린 설페이트(heparan sulfate)가 많은 세포로의 감염을 높이고자 하였다²⁷. 유사한 시도로 Vellinga 그룹은 pIX에 Arg-Gly-Asp(RGD)를 결합시켜 αvβ 인테그린을 발현하는 세포로의 감염효율을 증가시키고자 하였다²⁸. 또한 pIX에 형광단백질을 융합시켜 바이러스 표면에 발현시키고자 하는 시도를 통해 소의 아데노바이러스 pIX에 EYFP(enhanced yellow fluorescent protein)를 융합시킨 바이러스가 제작되었다. 이와 유사한 방법으로 인간 아데노바이러스 캡시드의 pIX에 GFP(green fluorescent protein)가 융합된 바이러스를 제작하여 인 비트로 및 인 비보에서 바이러스의 감염경로를 추적할 수 있었다^{29 ,30}. Hidetaka 그룹은 복제를 탐지할 수 있는 수단으로써 아데노바이러스 E3 부위에 형광표지유전자가 발현되는 아데노바이러스를 제작하였다³¹. 복제가능한 아데노바이러스 표지벡터는 결실된 E3 부위에 아데노바이러스의 MLP(major late promoter)에 의해 조절되는 EGFP 유전자가 표지유전자로 삽입되었으며, 바이러스가 본래 가진 암세포 살상능을 유지하기 위하여 ADP(adenovirus death protein)가 발현되도록 제작되었다. 사용된 아데노바이러스의 프로모터는 바이러스가 복제하는 동안만 활성을 띈다^{3 2}. 결과적으로 바이러스가 복제됨에 따라 강력한 EGFP 발현이 감지되었으며 이는 바이러스 DNA 복제와 연관성이 있었다. 인 비보 형광영상은 바이러스가 복제하는 동안 형광신호를 비침습적으로 탐지할 수 있었으며 이는 바이러스 DNA 복제정도와 상관관계가 있었다. 현재 암세포 살상 아데노바이러스의 안전성이 알려져 있긴 하나 인 비보에서 이 바이러스의 기능은 아데노바이러스 복제를 비침습적으로 탐지할 수 있는 시스템의 부족으로 많이 밝혀지지 못한 상태이다. 아데노바이러스에 의해 영상 표지자 발현이 조절되는 방법은 전임상단계에서 아데노바이러스 복제를 비침습적으로 탐지하는데 실용적인 수단이 되며 임상관련 영상 표지자로써 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

이러한 사실을 바탕으로 본 연구에서는 미니멀 AFP 프로모터에 인핸서와 사일렌서의 주요부위만을 다양한 조합으로 결합시켜 사이즈를 줄이고, 여기에 6 카피의 HRE를 추가함으로써 간암 특이적으로 작용하는 재조합 프로모터를 제작하였다. 이를 E1B 19KDa 단백질의 기능이 소실된 아데노바이러스에 적용하여 세포 괴사 및 고사를 동시에 유도시킴으로써 항종양효과를 배가시키고자 하였다. 또한 아데노바이러스의 pIX에 GFP 또는 루시퍼라제가 융합된 아데노바이러스를 제작하여 인 비트로와 인 비보 상에서 바이러스의 단백질 발현양상을 관찰하고 세포내에서의 감염경로와 양상을 추적해보고자 하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 우수한 암세포 선택적 유전자 전달효율을 통해 더욱 향상된 암세포 특이적인 살상능을 가지면서 저산소 상태에서도 유전자 전달효율이 저해되지 않는 유전자 치료제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 AFP 프로모터 서열, AFP 프로모터의 인핸서 A 서열 및 AFP 프로모터의 인핸서 B 서열이 조합된 발현조절 서열을 포함하는 아데노바이러스를 이용할 경우 암세포 선택적 살상능이 크게 향상됨을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 암세포 특이적 발현이 우수한 유전자발현 조절서열을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 암세포 특이적 살상능이 우수한 재조합 아데노바이러스를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 암세포내 위치 추적이 용이한 재조합 아데노바이러스를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은(ⅰ) AFP(Alpha-Feto Protein) 프로모터 서열; (ⅱ) AFP 프로모터의 인핸서 A 서열; 및 (ⅲ) AFP 프로모터의 인핸서 B 서열을 포함하는 유전자발현 조절서열을 제공한다.

본 발명자들은 우수한 암세포 선택적 유전자 전달효율을 통해 더욱 향상된 간암세포 특이적인 살상능을 가지면서 저산소 상태에서도 유전자 전달효율 및 바이러스 복제능이 저해되지 않는 유전자 치료제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 AFP 프로모터 서열, AFP 프로모터의 인핸서 A 서열 및 AFP 프로모터의 인핸서 B 서열이 조합된 발현조절 서열을 포함하는 아데노바이러스를 이용할 경우 암세포 선택적 살상능이 크게 향상됨을 발견하였다.

본 명세서에서 용어“AFP 프로모터”는 난황낭과 태아 발생기동안 간에서 발현이 높은 혈청단백질인 AFP(Alpha-Feto Protein) 단백질의 발현을 촉진하는 프로모터를 말한다. AFP 단백질은 성인 간암 환자를 제외하고는 거의 검출되지 않기 때문에 간암에 대한 유용한 표지자로 이용되며, 개인들마다 혈청 내 AFP의 발현정도는 이들의 발현을 조절하는 인핸서의 활성의 차이로 인하여 매우 다양하다. 따라서 AFP 프로모터와 인핸서들의 특정한 조합으로 이루어진 발현조절서열을 이용할 경우 전달하고자 하는 유전자가 암세포 특이적으로 발현되도록 할 수 있다.

삭제

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 인핸서 A 서열은 2-10번 반복된다.

바람직하게는, 본 발명의 인핸서 A 서열에 의해 전달 유전자의 발현효율을 향상시키기 위하여, 인핸서 A의 반복서열을 이용한다. 본 발명의 반복서열은 동일한 서열이 연속적으로 반복될 수도 있고(immediately adjacent), 또는 프로모터나 인핸서의 활성에 영향을 주지 않는 범위 내에서 적절한 길이의 링커 뉴클레오타이드를 사이에 두면서 불연속적으로 반복될(discontinuous repeated) 수도 있다.

보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용하는 인핸서 A 서열은 2-10번 반복된 서열, 보다 더 바람직하게는 2-6번 반복된 서열, 가장 바람직하게는 2번 반복된 서열을 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유전자 발현 조절서열은 HRE(hypoxia-response elements) 도메인 서열을 추가적으로 포함한다.

본 명세서에서 용어 “HRE 인핸서 서열”은 저산소-반응성 인핸서 서열을 의미한다. 저산소 조건에서 세포의 특정 유전자들의 발현이 조절된다(Bunn and Poyton Physiol. Rev. 76:839-885(1996); Dachs and Stratford Br. J. Cancer 74:5126-5132(1996); Guillemin and Krasnow Cell 89:9-12(1997)). 대부분의 종양세포는 불충분한 혈액공급을 받게 되는데, 이는 종양세포들이 일반적으로 혈관을 형성시키는 내피세포보다 빠르게 성장하기 때문이며, 이는 종양에서 저산소 상태를 유발하게 된다. 대부분의 고형 종양 내에서 야기되는 이러한 저산소 상태는 해당효소(glycolytic enzyme)나 혈관신생유발 전구인자(proangiogenic factor)와 같은 생존인자의 생산을 야기함으로써 방사선 치료나 화학 항암 치료에 저항성을 가지게 된다. 저산소 반응의 주요한 매개자는 전사 복합체 HIF(hypoxia inducible factor)-1α이고, 이는 다양한 유전자의 조절 부위에 있는 HRE와 상호작용 하며, 상기 유전자는 예컨대 혈관내피성장 인자(VEGF) 유전자, 그리고 에놀라아제-1과 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)와 같은 당분해 효소-코딩 유전자들을 포함한다. 본 발명은 이와 같이 저산소 조건에서 유전자들의 발현을 조절하며 HIF-1α와 상호작용하는 서열인 HRE를 이용한다. HRE는 유전자 전달체, 특히 재조합 아데노바이러스의 종양세포 선택성을 크게 향상시킬 수 있을 뿐 아니라 아데노바이러스의 증식능을 증가시키는 작용을 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, HRE 서열에 의한 전사 활성을 향상시키기 위하여, HRE 반복 서열을 이용한다. 보다 더바람직하게는, 본 발명에서 이용하는 HRE 서열은 2-10번 반복, 보다 더욱 더 바람직하게는, 3-8번 반복된 서열, 가장 바람직하게는 6번 반복된 서열을 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유전자 발현 조절서열은 5’에서 3’방향으로 HRE 서열, 인핸서 A 서열, 인핸서 B 서열 및 AFP 프로모터 서열을 포함한다.

가장 바람직하게는, 상기 HRE 서열은 6번 반복되며, 상기 인핸서 A 서열은 2번 반복된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 유전자발현 조절서열; 및 (b) 상기 유전자발현 조절서열에 작동적으로 연결된(operatively linked) 발현시키고자 하는 목적 유전자를 포함하는 암세포 특이적 발현이 개선된 유전자 전달체를 제공한다.

본 발명의 유전자발현 조절서열은 상술한 유전자발현 조절서열과 동일하므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생락한다.

본 명세서에서 용어 “작동적으로 결합된(operatively linked)”은 핵산 발현 조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명의 유전자발현 조절서열에 작동적으로 연결된 발현 대상의 유전자는 특별하게 제한되지 않는다. 예를 들어, 발현하고자 하는 유전자는 유전자 전달체의 지놈에서 유래된 유전자(예컨대, 아데노바이러스의 ElA 유전자) 또는 치료학적 트랜스 유전자(transgene)를 포함한다. 치료학적 트랜스 유전자는 아래에 상세하게 설명되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유전자 전달체는 플라스미드, 재조합 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스바이러스, 리오바이러스, 미즐스 바이러스, 샘리키 포리스터 바이러스, 폴리머, 리포좀 또는 니오좀이다.

본 발명의 유전자발현 조절서열과 상기 유전자발현 조절서열에 작동적으로 결합된 전달하고자 하는 유전자 서열은 통상적인 유전자 치료에 이용되는 모든 유전자 전달체에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 플라스미드, 아데노바이러스(Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련바이러스(Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager (1999)), 레트로바이러스 (Gunzburg WH, et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, (1999)), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl . Acad . Sci USA 92:1411-1415(1995)), 백시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 폭스바이러스 (GCE, NJL, Krupa M, Esteban M., The poxvirus vectors MVA and NYVAC as gene delivery systems for vaccination against infectious diseases and cancer Curr Gene Ther 8(2):97-120(2008)), 리오바이러스, 미즐스 바이러스, 샘리키 포리스터 바이러스, 폴리머 (Hwang et al., In vitro and In vivo Transfection Efficiency of Human Osteoprotegerin Gene using Non-Viral Polymer Carriers., Korean J. Bone Metab . 13(2):119-128(2006)), 리포좀 (Methods in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002) 또는 니오좀에 적용될 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 유전자 전달체는 재조합 아데노바이러스에 적용하여 제조된다.

ⅰ. 아데노바이러스

아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기, 조작의 편의성, 높은 타이터, 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200 bp의 ITR (inverted terminal repeat)를 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스 엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역(E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주 세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 코딩한다. E2 영역(E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 코딩한다. 현재 개발된 아데노바이러스 벡터 중에서, E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다. 한편, E3 영역은 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다 (Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551(1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073(1989)). 따라서, 본 발명의 유전자발현 조절서열은 E1A 유전자의 프로모터 서열 위치에 삽입되어 E1A 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 또한, 본 발명의 유전자발현 조절서열-발현 유전자 카세트는 결실된 E1 영역(E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 결실된 E1 영역에 삽입된다. 또한, 본 발명의 유전자발현 조절서열-발현 유전자 카세트는 결실된 E4 영역에도 삽입될 수 있다. 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어, “결실”은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다.

또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105%까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2 kb를 추가적으로 패키징할 수 있다(Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6:1733-1739(1987)). 따라서, 아데노바이러스에 삽입되는 상술한 외래 서열은 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.

아데노바이러스에 의해 운반되는 외래 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며, 이에 숙주세포에 대해 유전적독성이 매우 낮다. 따라서, 본 발명의 아데노바이러스 유전자 전달 시스템을 이용한 유전자 치료가 매우 안전할 것으로 판단된다.

ⅱ. 레트로바이러스

레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고, 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다.

레트로바이러스 벡터를 구축하기 위하여, 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열은 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 지놈에 삽입되어 복제불능의 바이러스를 생산한다. 바이리온을 생산하기 위하여, gag, pol 및 env 유전자를 포함하지만 LTR(long terminal repeat)와 Ψ서열은 없는 패키징 세포주를 구축한다(Mann et al., Cell, 33:153-159(1983)). 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열, LTR 및 Ψ서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포주에 이입하면, Ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며, 이 전사체는 바이러스로 패키징되고, 바이러스는 배지로 배출된다 (Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513(1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여 유전자 전달 시스템으로 이용한다.

2세대 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달이 발표되었다. Kasaharaet al. Science, 266:1373-1376(1994))는 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스의 변이체를 제조하였고, 여기에서 EPO(erythropoietin) 서열을 엔벨로프 부위에 삽입하여 새로운 결합 특성을 갖는 키메릭 단백질을 생산하였다. 본 발명의 유전자 전달 시스템도 이와 같은 2세대 레트로바이러스 벡터의 구축 전략에 따라 제조할 수 있다.

ⅲ. AAV 벡터

아데노-관련 바이러스 (AAV)는 비분열 세포을 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제5,139,941 호 및 제 4,797,368 호에 상세하게 개시되어 있다. 유전자 전달 시스템으로서의 AAV에 대한 연구는 LaFace et al, Viology, 162:483486(1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933(1993), Walsh et al, J. Clin . Invest ., 94:1440-1448(1994) 및 Flotte et al., Gene Therapy, 2:29-37(1995)에 개시되어 있다. 최근에, AAV 벡터는 낭포성 섬유증의 치료제로서 임상 I을 실시하고 있다.

전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열(릴랙신 유전자 및 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드 (McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963-1973(1988); 및 Samulski et al., J. Virol ., 63:3822-3828(1989)) 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드(McCarty et al., J. Virol., 65:2936-2945( 1991))를 동시 형질전환시켜 제조된다.

ⅳ. 다른 바이러스 벡터

다른 바이러스 벡터들도 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 이용할 수 있다. 배시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492(1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148( 1986) 및 Coupar et al., Gene, 68:1-10(1988)), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin . Invest. 104(11):R55-62(1999)) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995)), 폭스바이러스(GCE, NJL, Krupa M, Esteban M., The poxvirus vectors MVA and NYVAC as gene delivery systems for vaccination against infectious diseases and cancer Curr Gene Ther 8(2):97-120(2008), 리오바이러스, 미즐스 바이러스, 샘리키 포리스터 바이러스로부터 유래된 벡터들도, 목적 뉴클레오타이드 서열을 세포내로 운반할 수 있는 운반 시스템으로 이용할 수 있다.

ⅴ. 폴리머

비바이러스성 유전자 전달체로서 폭넓게 사용되는 폴리머계 전달체로는 젤라틴, 키토산(Carreno GB, Duncan R. Evaluation of the biological properties of soluble chitosan and chitosan microspheres. Int J Pharm 148:231-240(1997)) PLL(poly-LLysine)(Maruyama A, Ishihara T, Kim JS, Kim SW, Akaike T. Nanoparticle DNA carrier with poly (L-lysine) grafted polysaccharide copolymer and poly (D,Llactide). Bioconjugate Chem 8:735-742(1997)) 및 PEI(polyethyleneamine)(Abdallah B, Hassan A, Benoist C, Goula D, Behr JP, Demeneix BA. A powerful nonviral vector for in vivo gene transfer into the adult mammalian brain: Polyethyleneimine. Human Gene Ther 7:1947-1954(1996)) 등이 이용되고 있다. 폴리머계 유전자 전달체들의 장점은 면역반응과 급성독성의 발현율이 낮고 제조법이 간단하며 대량생산이 가능하다는 점이다.

ⅵ. 리포좀 및 니오좀

리포좀은 수상에 분산된 인지질에 의해 자동적으로 형성된다. 외래 DNA 분자를 리포좀으로 성공적으로 세포 내로 운반한 예는 Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982) 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)에 개시되어 있다. 한편, 리포좀을 이용한 동물세포의 형질전환에 가장 많이 이용되는 시약으로는 Lipofectamine(Gibco BRL)이 있다. 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 내포한 리포좀은 엔도사이토시스, 세포 표면에로의 흡착 또는 플라즈마 세포막과의 융합 등의 기전을 통해 세포와 상호작용하여 세포내로 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 운반한다.

리포좀이 인지질을 이용하여 만들어 지는 것에 반하여 니오좀(niosome)은 사용하고 비-이온성 계면활성제(non-ionic surfactant) 및 콜레스테롤(cholesterol)의 혼합으로 구성된 이중막 수송체로 극성 및 비극성 물질을 봉입할 수 있고, 삼투압적으로 활성이 있으며, 인지질 등에 의한 지질미립자의 운반체인 리포좀에 비하여 안정하고, 또한 제조시 사용되는 계면활성제가 보관 및 취급 시에 특별한 조건이 필요하지 않다는 장점을 가진다.

한편, 상술한 본 발명의 유전자 전달 시스템을 세포내로 도입하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다.

본 발명에서, 유전자 전달 시스템이 바이러스 벡터에 기초하여 제작된 경우에는, 당업계에 공지된 바이러스 감염 방법에 따라 실시된다. 바이러스 벡터를 이용한 숙주 세포의 감염은 상술한 인용문헌에 기재되어 있다.

본 발명에서 유전자 전달 시스템이 내이키드 (naked) 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드인 경우에는, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980); 및 Harland와 Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099(1985)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973); 및 Chen과 Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752(1987)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982); 및 Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980); Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982); 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 방법에 의해 유전자를 세포내로 이입시킬 수 있다.

보다 바람직하게는, 본 발명의 유전자 전달체는 재조합 아데노바이러스 벡터이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 암은 간암이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 암세포 특이적 살상능이 개선된 재조합 아데노바이러스를 제공한다:

(a) 아데노바이러스의 ITR(inverted terminal repeat) 서열;

(b) (ⅰ) AFP 프로모터 서열; (ⅱ) AFP 프로모터의 인핸서 A 서열; 및 (ⅲ) AFP 프로모터의 인핸서 B 서열을 포함하는 유전자발현 조절서열; 그리고,

(c) 상기 유전자발현 조절서열에 작동적으로 연결된(operatively linked) 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 면역 증진 유전자, 세포독성 유전자, 세포증식 억제 유전자, 세포사멸 유전자 및 항-신생 혈관 생성 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 치료학적 트랜스 유전자.

본 발명의 유전자발현 조절서열은 상술한 유전자 전달체에서 이용되는 유전자발현 조절서열과 동일하므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생락한다.

본 발명의 유전자발현 조절서열은 예를 들어 재조합 아데노바이러스의 E1 유전자의 업스트림, 결실된 E3 유전자 영역 또는 E1 유전자의 업스트림과 결실된 E3 유전자 영역 모두에 위치할 수 있다.

본 발명의 유전자발현 조절서열이 E1A 유전자의 업스트림에 위치하는 경우, 즉 E1A 유전자에 본 발명의 유전자발현 조절서열이 작동적으로 연결된 경우(HRE-Ea-Eb-AFPm-E1A), 재조합 아데노바이러스의 복제가 본 발명의 유전자발현 조절서열에 의해 조절된다. 본 발명의 유전자발현 조절서열이 결실된 E3 유전자 영역에 위치하는 경우에는, “유전자발현 조절서열-트랜스 유전자-폴리 A”발현카세트 형태로 결실된 E3유전자 영역에 삽입될 수 있다. 본 발명의 유전자발현 조절서열이 결실된 E4 유전자 영역에 위치하는 경우에는, “유전자발현 조절서열-트랜스 유전자-폴리 A”발현카세트 형태로 결실된 E3유전자 영역에 삽입될 수 있다.

본 발명의 명세서에서 용어 “치료학적 트랜스 유전자(therapeutic transgene)”는 암세포 내에서 발현되어 치료학적 효과를 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

본 발명의 명세서에서 용어“종양 억제인자 유전자(tumor suppressor gene)”는 표적 세포내에서 발현되어 종양 표현형을 억제할 수 있거나 세포사멸을 유도할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 본 발명의 실시에 유용한 종양 억제 인자 유전자에는, p53 유전자, APC 유전자, DPC-4/Smad4 유전자, BRCA-1 유전자, BRCA-2 유전자, WT-1 유전자, 망막아세포종 유전자(Lee et al., Nature, 1987, 329,642), MMAC-1 유전자, 선종양 폴립증 코일 단백질(adenomatouspolyposis coil protein)(미국특허공보 5,783,666호), 결손된 결장 종양(DCC) 유전자, MMSC-2 유전자, NF-1 유전자, 염색체 3p21.3에 위치한 비인후 종양 억제인자 유전자 (Cheng et al. Proc.Nat.Acad.Sci, 95:3042-3047 (1998)), MTS1 유전자, CDK4 유전자, NF-1 유전자, NF-2 유전자 및 VHL 유전자가 포함된다.

본 발명의 명세서에서 용어“항원성 유전자(antigenic gene)”는 표적 세포 내에서 발현되어 면역 시스템에서 인식할 수 있는 세포 표면 항원성 단백질을 생산하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 항원성 유전자의 예에는 암태아성항원 (carcinoembryonic antigen, CEA), HER-2, PSA(prostate specific antigen) 및 p53(Levine, A., 국제특허출원공개 WO94/02167호)이 포함된다. 면역 시스템이 용이하게 인식하도록 하기 위해, 상기 항원성 유전자를 MHC 제I형 항원에 결합시킬 수 있다.

본 발명의 명세서에서 용어 “세포독성 유전자(cytotoxic gene)”는 세포내에서 발현되어 독성 효과를 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 세포독성 유전자의 예에는 슈도모나스 외독소(exotoxin), 리신 독소, 디프테리아 독소, CD(cytosine deaminase), TK(thymidine kinase) 등을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 포함된다.

본 발명의 명세서에서 용어 “세포증식 억제 유전자(cytostatic gene)” 세포 내에서 발현되어 세포 주기 도중에 세포 주기를 정지시키는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 세포증식 억제 유전자의 예에는 p21, 망막아세포종 유전자, E2F-Rb 융합 단백질 유전자, 사이클린-종속성 카이네이즈 억제인자를 코딩하는 유전자(예를 들면, p16, p15, p18 및 p19), 성장 중지 특이성 호메오박스(growth arrest specific homeobox: GAX) 유전자(국제특허출원공개 WO 97/16459호 및 WO96/30385호) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 명세서에서 용어“세포사멸 유전자(apoptotic gene)”는 발현되어 프로그램된 세포 소멸을 유도하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 친-세포사멸 유전자의 예에는 p53, TRAIL, MDA-7 (IL-24), 아데노바이러스 E3-11.6K (Ad2 및 Ad5에서 유래) 또는 아데노바이러스 E3-10.5K (Ad에서 유래), 아데노바이러스 E4 유전자, p53 경로 유전자 및 카스파제를 코딩하는 유전자가 포함된다.

본 발명의 명세서에서 용어“항-신생혈관생성 유전자(anti-angiogenic gene)”는 발현되어 항-신생혈관 생성 인자를 세포밖으로 방출하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 항-신생혈관 생성 인자에는, 안지오스타틴, Tie 2 (PNAS, 95:8795-800 (1998))와 같은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 억제 인자, 엔도스타틴 등이 포함된다.

재조합 아데노바이러스에 삽입되는 트랜스 유전자는 프로모터-트랜스 유전자-폴리 A 서열의 발현 카세트로 삽입되는 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 프로모터로서, 본 발명의 유전자발현 조절서열(Ea-Eb-AFPm, Ea₂-Eb-AFPm 또는 HRE₆-Ea₂-Eb-AFPm) 또는 통상적인 프로모터를 이용할 수 있다. 트랜스 유전자에 결합되는 통상적인 프로모터는, 바람직하게는 동물세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포에서 작동하여 트랜스 유전자의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, U6 프로모터, H1 프로모터, CMV (cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, inducible 프로모터, 암세포 특이적 프로모터 (예컨대, TERT 프로모터, PSA 프로모터, PSMA 프로모터, CEA프로모터, E2F 프로모터 및 AFP 프로모터) 및 조직 특이적 프로모터 (예컨대, 알부민 프로모터)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

트랜스 유전자를 발현시키기 위한 발현 컨스트럭트에서 트랜스 유전자의 다운스트림에 폴리아데닐화 서열이 결합되어 있는 것이 바람직하다. 상기 폴리아네닐화 서열은, 소성장 호르몬 터미네이터(Gimmi, E. R., et al., Nucleic Acids Res. 17:6983-6998(1989)), SV40 유래 폴리 아데닐화 서열(Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12:5386-5393(1992)), HIV-1 polyA(Klasens, B. I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26:1870-1876(1998)), β-글로빈 polyA(Gil, A., et al, Cell 49:399-406(1987)), HSV TK polyA(Cole, C. N. and T. P. Stacy, Mol. Cell. Biol. 5:2104-2113(1985)) 또는 폴리오마바이러스 polyA(Batt, D. B and G. G. Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15:4783-4790(1995))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 캡시드 단백질 인코딩 뉴클레오타이드에 형광성 단백질 인코딩 뉴클레오타이드가 삽입된 세포내 위치 추적이 용이한 재조합 아데노바이러스를 제공한다.

본 발명에 따르면, 아데노바이러스의 캡시드를 구성하는 단백질에 형광 표지자 단백질을 삽입할 경우 실시간으로 바이러스의 경로 및 분포를 추적할 수 있다. 바이러스의 유전자 내에 표지 유전자가 삽입된 경우 DNA가 단백질로 전환된 후에야 단백질의 발현이 확인된 반면, IX 단백질에 표지 단백질이 결합된 바이러스의 경우 바이러스의 감염 경로에 관계없이 바이러스의 감염 초기부터 단백질의 발현 및 바이러스의 위치추적이 가능하다. 따라서 본 발명은 유용한 비침습적 분자영상 도구로 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 캡시드 단백질은 pIX이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 형광성 단백질은 GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein), CFP(cyan fluorescent protein), YFP(yellow fluorescent protein), BFP(blue fluorescent protein), EGFP(enhanced green fluorescent protein), ECFP(enhanced cyan fluorescent protein), EYFP(enhanced yellow fluorescent protein), ERFP(enhanced red fluorescent protein), EBFP(enhanced blue fluorescent protein) 또는 루시퍼라제(luciferase)이다. 보다 바람직하게는 본 발명의 형광성 단백질은 EGFP 또는 루시퍼라제(luciferase)이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 암세포 특이적 발현이 우수한 유전자발현 조절서열, 암세포 특이적 살상능이 우수한 재조합 아데노바이러스 및 세포내 위치 추적이 용이한 재조합 아데노바이러스를 제공한다.

(b) 본 발명은 암세포 특이적 세포전달 효율 및 아데노바이러스 증식능이 우수하고 저산조 조건에서도 전달 효율 및 아데노바이러스 증식능이 저해되지 않는 유전자 전달 시스템 및 감염경로에 무관하게 바이러스의 위치추적이 가능한 비침습적 분자영상 도구로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 재조합 AFP 프로모터들 간의 프로모터 활성을 비교한 결과를 나타낸 그림이다. 재배열된 AFP 프로모터로 발현이 조절되는 루시퍼라제 발현벡터를 구축하였다(도 1a). 각각의 엘리먼트들은 PCR을 이용하여 phAFP5.1로부터 수득하였다. HCC 및 non-HCC 세포주에서의 상대적인 루시퍼라제 활성을 비교하였다(도 1b). 루시퍼라제 활성은 제조자의 지시에 따라 측정하였다.
도 2는 변형된 AFP 프로모터에 의해 조절되는 복제불능 아데노바이러스의 구축 및 이의 GFP 발현양상을 나타낸 그림이다. 도 2a는 본 발명에서 사용되는 복제불능 아데노바이러스의 모식도를 나타낸 그림이다. 도 2b는 변형된 AFP 프로모터에 의해 조절되는 GFP 발현수준을 FACS를 이용하여 정량화한 결과를 나타낸 그림이다. 세포들은 각각 다른 MOI로 감염시켰다 ; Huh7 및 A549는 40 MOI, HepG2는 30 MOI, Hep3B 및 HepI는 20 MOI, HaCaT는 80 MOI.
도 3은 변형된 AFP 프로모터에 의해 조절되는 복제불능 아데노바이러스를 처리한 Hep3B 종양조직에서의 GFP 발현량을 나타낸 그림이다. PBS 또는 5x10⁹ VP의 a2bm-dE1/GFP 또는 Ha2bm-dE1/GFP를 2일에 한번씩 총 3번을 종양 내 투여하였다. 조직을 항-피모니다졸(pimonidazole) 항체(붉은색) 및 항-GFP 항체(녹색)으로 염색하고, DAPI로 대조염색 하였다. 배율: x 400
도 4는 변형된 AFP 프로모터에 의해 조절되는 복제불능 아데노바이러스의 구축 및 이에 의한 세포사 효과를 나타낸 그림이다. 도 4a는 본 발명에서 사용되는 복제불능 아데노바이러스의 모식도를 나타낸 그림이다. 도 4b는 HCC-특이적 복제 아데노바이러스의 세포사 효과를 MTT 분석을 통해 측정한 결과를 나타낸 그림이다. 세포를 특정의 MOI로 감염시키고 3-5일 후에 상등액을 제거하고 200μL의 MTT (2mg/mL) 용액을 각각의 웰에 첨가하였다. 배양 4시간 후에, 용액을 제거하고 포르마잔 결정을 DMSO로 용해시켰다.
도 5 는 HCC-특이적 복제 아데노바이러스로 감염된 Hep3B에서의 바이러스 생산량을 측정한 결과를 나타낸 그림이다. 세포들을 특정 MOI의 a2bm-d19 또는 Ha2bm-d19로 감염시키고 4일 후에 3순환의 동결-융해(freezing-thawing)를 통해 수득한 상등액 및 세포 파쇄물을 채집한 뒤 감염입자(infectious particle)의 측정을 위하여 한계희석(limiting dilution) 분석을 수행하였다.
도 6은 HCC-특이적 복제 아데노바이러스로 감염된 스페로이드(spheroid) Hep3B에서의 바이러스 생산을 나타낸 그림이다. Hep3B 종양조직을 1mm 편구형으로 절개하고 PBS 또는 1x10⁸ VP의 a2bm-dE1/GFP 또는 Ha2bm-dE1/GFP를 처리하였다. 감염 3일 후에 각각의 편구를 채집하였다. 조직은 항-아데노바이러스 E1A 항체(갈색) 또는 헤마톡실린-에오신으로 염색하였다. 배율 : x 100, x 400.
도 7은 HCC-특이적 복제 아데노바이러스를 주입한 Hep3B 이종이식 종양에서의 바이러스 생산 및 아폽토시스를 나타낸 그림이다. Hep3B 종양조직은 PBS 또는 1x10¹⁰ VP의 d19, a2bm-d19 또는 Ha2bm-d19를 2일에 한번씩 총 3회 투여하였다. 투여 3일 후에 마우스로부터 종양조직을 채집하였다. 도 7a는 PBS 또는 HCC-특이적 복제 아데노바이러스를 처리한 Hep3B 종양에서의 바이러스 복제를 나타낸 그림이다. 조직은 항-아데노바이러스 E1A 항체(갈색)으로 염색하고, 헤마톡실린으로 반전염색하였다. 도 7b는 HCC-특이적 복제 아데노바이러스를 주입한 Hep3B 종양조직에서의 사멸 세포수(apoptotic population)를 나타낸 그림이다. 제조자의 지시에 따라 TUNEL 분석을 실시하였다. 사멸 세포는 녹색 점으로 표시하였다. 배율 : x 100, x 400.
도 8은 정위성(orthotopic) 모델 HCC-특이적 복제 아데노바이러스에 의한 항종양 효과를 나타낸 그림이다. 정위성 모델을 확립하기 위하여, 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 Hep3B 세포를 마우스 간의 좌엽(left lobe)에 직접 주입하였다. 세포주입 2주 후, 2.5 x 10¹⁰ VP의 a2bm-d19 또는 Ha2bm-d19 2.5 x 10¹⁰ VP를 2일에 한번씩 총 3회 정맥내 주사하였다. 종양의 성장은 광학 이미징을 이용하여 매주 확인하였다.
도 9는 Hep3B 정위성 모델에서의 HCC-특이적 복제 아데노바이러스에 의해 인비보에서 종양이 억제됨을 나타낸 그림이다. 도 9a는 광학 영상신호를 정량화한 결과를 나타낸 그림이다. 평균 광학신호 강도는 측정하고자 하는 부위에서 초당 수득하는 광자에 의하여 정량화하였다. 도 9b는 마지막 바이러스 감염 후 5주 경과 시점에서의 혈청 AFP 수준을 나타낸 그림이다. 혈청 AFP 수준은 ELISA로 측정하였다.
도 10은 HCC-특이적 복제 아데노바이러스 처리 후 5주 경과 시점에서 남아있는 종양의 질량을 측정한 결과를 나타낸 그림이다. 종양은 간으로부터 절개하여 무게를 측정하였다. 도 10a는 종양덩어리의 사진이며, 도 10b는 종양의 무게를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 캡시드 단백질 pIX에 GFP 또는 루시퍼라제가 융합된 아데노바이러스의 발달을 나타낸 그림이다. 도 11a는 아데노바이러스 캡시드 단백질의 구조를 나타낸 그림이다. 도 11b는 pIX에 GFP 또는 루시퍼라제가 융합된 아데노바이러스의 모식도를 나타낸 그림이다. 사진은 원심분리 후 CsCl 농도구배에 의하여 분리되고 농축된 dE1/IXGFP를 나타낸 그림이다(오른쪽 흰색). pIX와 GFP의 융합은 아데노바이러스가 UV 필터를 통과할 때 확인할 수 있다(오른쪽 녹색).
도 12는 pIX에 GFP가 융합된 아데노바이러스로 감염시킨 세포에서의 초기 GFP 발현양상을 나타낸 그림이다. U251N 세포들을 세포당 10⁶ VP의 dE1/GFP 또는 dE1/IXGFP로 감염시키고, 1시간 후에 세포들을 고정시킨 후 DAPI로 염색하였다. 공초점 현미경으로 형광을 관찰하였다.
도 13은 투과전자현미경을 이용하여 아데노바이러스로 감염된 후 U251N의 형태분석을 한 결과를 나타낸 그림이다. 각 패널의 마지막 그림(번호‘6’)은 바이러스 복제를 관찰하기 위하여 dE1/GFP 또는 dE1/IXGFP로 감염된 HEK293 세포에 대한 결과이다. 배율 : x 50,000
도 14는 pIX에 루시퍼라제가 융합된 아데노바이러스의 특성을 나타낸 그림이다. pIX와 루시퍼라제의 융합을 확인하기 위하여, 1x10¹⁰ VP의 dE1, dE1/luc 및 dE1/IXluc를 이용한 인 비트로 루시퍼라제 활성 분석을 수행하였다
도 15는 dE1/IXluc의 인 비보 트래피킹 결과를 나타낸 그림이다. dE1/luc(도 15a) 또는 dE1/IXGFP(도 15b)를 마우스당 1x10¹⁰ VP로 정맥주사하고, 광학신호를 주사 후 각각 1, 3, 6, 12, 24, 48 시간 및 6일 후 측정하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

대상 세포주 및 세포 배양

실험에 사용된 세포주들은 인체 간암 세포주로 AFP 발현량이 높은 Huh7, Hep3B, HepG2와 AFP를 발현하지 않는 간암 세포주인 HepI이 이용되었으며, 그 외 암 세포주로는 뇌암 세포주인 U343, 폐암 세포주인 A549를 이용하였다. 또한 정상 섬유아세포주인 BJ, WI38, CBHEL, IMR90과 정상 각질세포인 HaCaT를 실험에 이용하였으며, 아데노바이러스의 생산을 위하여 아데노바이러스 초기 발현유전자인 E1 부위가 숙주 유전체 내에 내재되어 있는 HEK293 세포주를 이용하였다. Hep3B를 제외한 모든 세포주들은 10%의 우태아 혈청(GIBCO, Grand Island, NY), L-글루타민 (2 mM), 페니실린 (100 IU/ml), 스트렙토마이신 (50 mg/mL)을 모두 포함하는 DMEM 배양액으로 5% CO₂가 공급되는 37^oC 항온 배양기에서 배양하였다. Hep3B는 같은 조건하에 MEM (GIBCO, Grand Island, NY)으로 배양하였다.

저산소 상태에서의 실험에 필요한 세포들은 5% CO₂, 1% O₂ 및 94% N₂가 공급되는 37℃ 항온 배양기에서 배양하였으며, GFP 발현량을 알아보기 위해서는 세포들을 정상 산소와 저 산소 상태로 각각의 조건에서 12시간씩 2번 옮겨 배양하였고, 세포 살상능을 알아보기 위한 실험은 각각의 조건에서 24시간씩 2번 옮겨 배양 후 실험을 수행하였다.

실험동물

동물 실험은 6-8주령의 수컷 누드 생쥐(BALB/c-nu)를 오리엔트(Orient Inc., Korea)에서 구입하여 시행하였다. 동물 사육실의 온도는 22±2℃, 습도는 55-60%로 유지되었으며, 명암 순환이 12시간 단위로 조절되게 하였고, 방사선 조사로 멸균한 고형사료(중앙 실험동물, Seoul, Korea)와 멸균된 급수를 자유로이 섭취하게 하였다.

AFP 프로모터의 enhancer 와 silencer 부위를 재조합한 간암 특이적 프로모터의 제작 및 프로모터 활성 비교

간암 특이적으로 유전자의 발현이 조절되는 프로모터를 제작하기 위하여 AFP 유전자의 프로모터 부위가 포함된 phAFP5.1 플라즈미드(Tamaoki T., University of Calgary, Canada)를 주형으로 PCR을 수행하여 미니멀 AFP 프로모터(300 bp), 인핸서 A(365 bp), 인핸서 B(193 bp), 말단 사일런서(90 bp), 인접 사일런서(156 bp), 전체 인핸서(1150 bp) 조각들을 각각 얻었다.

우선 미니멀 AFP 프로모터 부위를 루시퍼라제 유전자가 삽입된 pGL3-basic 벡터(Promega, Madison, WI, USA)에 클로닝하여 pGL3-AFPm를 제작하였다. 여기에 인핸서 B 부위를 삽입한 뒤 인핸서 A 부위를 1 카피 또는 2 카피 삽입하여 pGL3-EabAFPm와 pGL3-Ea₂bAFPm를 제작하였다. 또한 이미 제작된 pGL3-Ea₂bAFPm에 2 카피의 말단 사일런서와 1 카피의 인접 사일런서 부분이 삽입된 pGL3-Ea₂bSAFPm를, 인핸서 부위 전체를 PCR로 증폭하고 사일런서 부위와 결합시킨 pEfSAFPm을 각각 제작하였다(도 1).

제작된 재조합 AFP 프로모터들에 의한 조직 특이적인 루시퍼라제의 활성 정도를 확인하기 위하여 간암 세포주 중 AFP 발현이 높은 Huh7, 중간 정도 레벨의 Hep3B와 HepG2, AFP를 발현하지 않는 HepI, 간암 외의 다른 조직의 암 세포로 뇌암 세포주인 U343, 폐암 세포주인 A549, 인체 정상세포주인 BJ, WI38, CBHEL, IMR90, 인체 각질세포인 HaCaT에 각각 DNA 0.5 μg 씩 리포펙타민(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 형질전환하고 48시간 후 세포를 파쇄하여 루시퍼라제 활성 분석(Promega, Madison, WI, USA)을 진행하였다.

재조합된 AFP 프로모터에 의해 유전자의 발현이 조절되는 아데노바이러스의 제작

루시퍼라제 분석(luciferase assay)을 통해 프로모터의 활성이 검증된 프로모터인 Ea₂bAFPm과 Ea₂bSAFPm, 이들의 음성 대조군으로 AFPm을 각각 복제불능 아데노바이러스의 유전자에 삽입하여 바이러스를 제작하였다.

복제불능 아데노바이러스를 개발하기 위하여 우선 아데노바이러스의 E1 셔틀벡터인 p△E1sp1A에 HindIII와 EcoRI 제한 효소를 이용하여 GFP 유전자를 삽입하여 p△E1sp1A/GFP 셔틀벡터를 제작하였다. 제작된 벡터를 XhoI과 BglII로 자른 부위에 AFPm 프로모터가 삽입된 p△E1sp1A/AFPm/GFP, Ea₂bmAFPm 프로모터가 삽입된 p△E1sp1A/Ea₂bAFPm/GFP, Ea₂bmSAFPm 프로모터가 삽입된 p△E1sp1A/Ea₂bSAFPm/GFP 벡터를 각각 제작하였다. 또한 저산소 상태에서도 바이러스의 활성이 저해되지 않도록 하기 위하여 혈관신생인자인 VEGF의 HRE 도메인을 6 카피 반복하여 재조합 AFP 프로모터의 상위 MluI 부위에 삽입한 p△E1sp1A/HRE6/Ea₂bAFPm/ GFP와 p△E1sp1A/HRE6/Ea₂bSAFPm/GFP 셔틀벡터 또한 제작하였다. 제작된 5종류의 E1 셔틀벡터를 아데노바이러스 토탈벡터인 dl324BstBI과 함께 대장균 BJ5183에서 상동 재조합시켜 최종적으로 아데노바이러스 토탈벡터인 AFPm-dE1/GFP, Ea₂bm-dE1/GFP, Ea₂bSm-dE1/GFP, HRE₆/Ea₂bm/GFP와 HRE₆/Ea₂bSm/GFP을 제작하였다. 완성된 모든 플라즈미드들은 PacI 제한효소로 절단하여 선형화시킨 후, 아데노바이러스 생산세포주인 HEK293에 리포펙타민을 이용하여 형질 전환하여 아데노바이러스를 생산하였다. 생산된 아데노바이러스들은 HEK293 세포주에 재감염시켜 CsCl 농도구배 방법으로 농축하여 순수 분리한 후 제한희석 분석(limiting dilution assay)과 바이러스 지놈의 흡광도에 의한 O.D(optical density)로 아데노바이러스의 역가를 결정하였다.

재조합된 AFP 프로모터에 의한 간암 특이적 유전자 발현 조절 검증

재조합된 AFP 프로모터가 탑재되어 간암 특이적으로 유전자의 발현이 조절되는 아데노바이러스에 의한 GFP 유전자의 발현조절 정도를 알아보기 위하여 AFP 발현정도가 다른 간암 세포주 및 다른 조직의 암 세포주, 인체 정상 세포주에 각각의 복제불능 아데노바이러스를 감염시키고 48시간 후 FACS를 이용하여 GFP를 발현하는 세포의 숫자를 확인해 보았다. 저산소 상태에서의 프로모터 활성을 알아보기 위한 실험군들은 각각의 아데노바이러스 감염 후 바로 저산소배양기로 옮겨져 12시간 동안 배양하고, 다시 정상 산소 농도에서 12시간 배양하는 것을 2 사이클을 반복하였으며, 저산소 상태는 1% O₂, 5% CO₂, 94% N₂ 농도가 유지되는 37℃ 항온 배양기에서 배양함으로써 조성되었다.

또한 간암 조직에서 재조합된 AFP 프로모터에 의한 간암 특이적 유전자의 발현 조절 여부를 확인하기 위하여 6주령의 누드마우스 피하에 1x10⁷ 개의 Hep3B를 주입하여 종양을 형성하고 종양의 크기가 200 mm³ 정도 되었을 때 5x10⁹ VP의 a₂bm-dE1 또는 Ha₂bm-dE1을 각각 이틀 간격으로 3회 종양에 직접 주입하였다. 3일 후 종양을 적출하여 파라핀 블록을 제작하고, 이를 3 ㎛ 두께로 절단하여 슬라이드에 부착한 후 자일렌(xylene), 100%, 95%, 80%, 70% ethanol 용액에 차례로 담가 파라핀을 제거(deparafinization)하였다. 이를 0.5% NP40 용액에 담가 조직의 투과율(permeability)을 높여준 후 저산소 상태를 표지하는 항-피모니다졸(anti-pimonidazole) 항체(HP1-100, Chemicon, Temecula, CA, USA)와 4℃에서 밤새 반응시켰다. 다음 날, alexa 568이 결합된 이차 항체로 상온에서 2시간 혼성화 시키고, 항-GFP 항체(MAB3580, Chemicon, Temecula, CA, USA)와 다시 4℃에서 밤새 반응시켰다. 다음 날, alexa 488이 결합된 이차 항체와 상온에서 2시간 반응시킨 후 DAPI로 염색하고 형광 전용 마운팅 용액으로 마운팅하여 공초점 현미경으로 관찰하였다.

재조합된 AFP 프로모터에 의해 아데노바이러스의 복제가 조절되는 간암세포 특이적 세포살상 아데노바이러스의 제작

간암세포 특이적 프로모터를 탑재한 복제 가능 아데노바이러스를 제작하기 위하여 d19 아데노바이러스의 셔틀벡터인 p△E1sp1A/E1A/E1B19/E1B55 벡터를 이용하였으며 이 벡터의 E1B19 KDa 유전자의 경우 개시 코돈을 종결 코돈으로 변형시켜 유전자는 존재하되 단백질로 발현되지 않도록 변형되었다. 이러한 벡터를 XhoI과 BglII로 자른 후 a2bm과 Ha2bm 프로모터를 각각 삽입하여 pa2bm-d19과 pHa2bm-d19 벡터를 제작하였으며, 제작된 2종류의 E1 셔틀벡터를 아데노바이러스 토탈벡터인 dl324BstBI과 함께 대장균 BJ5183에서 상동 재조합시켜 a2bm-d19 또는 Ha2bm-d19 아데노바이러스 토탈벡터를 제작하였다. 완성된 토탈벡터들은 PacI 제한효소로 절단하여 선형화시킨 후, 아데노바이러스 생산세포주인 HEK293에 리포펙타민을 이용하여 형질 전환하여 바이러스를 생산하였다. 생산된 아데노바이러스들은 HEK293 세포주에 재감염시켜 CsCl 농도구배 방법으로 아데노바이러스를 농축하여 순수 분리한 후 제한희석 분석과 바이러스 지놈의 흡광도에 의한 O.D로 아데노바이러스의 역가를 결정하였다.

재조합된 AFP 프로모터에 의해 복제가 조절되는 간암 특이적 세포 살상 아데노바이러스의 세포 살상능 및 복제능 검증

재조합된 AFP 프로모터가 탑재되어 간암 특이적으로 바이러스의 복제가 조절되는 종양 선택적 세포 살상 아데노바이러스에 의한 세포 살상능을 알아보기 위하여 루시퍼라제 분석시의 조건과 마찬가지로 AFP 발현정도가 다른 간암 세포주 및 다른 조직의 암 세포주, 인체 정상 세포주에 각각의 아데노바이러스를 감염시킨 후 세포살상정도를 관찰하고 이를 정량화하기 위하여 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2- yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, a tetrazole) 분석을 수행하였다. 또한 재조합된 AFP 프로모터에 의해 간암 특이적으로 바이러스의 복제가 조절되는 종양 선택적 세포 살상 아데노바이러스에 의한 복제능을 관찰하기 위하여 아데노바이러스의 감염능이 우수한 간암 세포주인 Hep3B에 각각의 아데노바이러스를 감염시켰다. 4일 후 세포배양액을 수거하고, 남은 세포들은 동결-융해를 3번 반복하여 세포내의 바이러스까지 함께 수거하여 이를 HEK293 세포주에 감염시키고 10일 후 제한희석 분석을 통하여 바이러스의 역가를 결정하였다.

저산소 상태에 대한 실험군들은 각각의 아데노바이러스 감염 후 바로 저산소배양기로 옮겨져 24시간 배양하고, 다시 정상산소 농도에서 24시간 배양하는 것을 2 사이클을 반복하였으며, 여기서 적용된 저산소 상태는 이전 실험과 동일하다.

스페로이드 ( Spheroid ) 내에서 재조합된 AFP 프로모터에 의해 복제가 조절되는 간암 특이적 세포 살상 아데노바이러스의 복제능 검증

생체 외에서 생체내 환경 조성이 가능한 스페로이드 배양을 이용하여 간암 특이적 세포 살상 아데노바이러스의 복제능을 검증하기 위하여 6주령의 수컷 누드 생쥐의 피하에 Hep3B 세포주를 주입하여 종양을 형성하고 이를 적출하여 10%의 우태아 혈청이 포함된 IMDM 배지가 담겨진 접시에서 1 mm의 크기로 각각 잘랐다. 이를 스페로이드로 배양하기 위하여 5% 우태아 혈청, 10 μM 인슐린, 1 μM 하이드로코티존(hydrocortison)이 포함된 IMDM 배지가 담긴 12 웰 하이드로셀(hydrocell) 플레이트에 각각의 스페로이드들을 넣고, 여기에 a₂bm-d19 또는 Ha₂bm-d19 아데노바이러스를 각각 1x10⁸ VP씩 처리하고 37℃ 항온 배양기에서 쉐이킹하면서 배양하였다. 3일 후 각각의 스페로이드들을 수거하여 파라핀 블록을 제작하고 아데노바이러스의 E1A 단백질에 대한 조직면역염색법을 시행하여 간암 특이적 복제가능 아데노바이러스들의 복제능을 검증하였다.

스페로이드 조직 내에서 아데노바이러스의 복제능을 검증하기 위하여 제작된 파라핀 블락을 3 ㎛ 두께로 절단하여 슬라이드에 부착한 후, 이를 자일렌, 100%, 95%, 80%, 70% 에탄올 용액에 차례로 담가 파라핀을 제거(deparafinization)하였다. 이를 0.5% NP40 용액에 담가 조직의 투과율을 높여준 후 3% H₂O₂ 용액에 10분간 반응시켜 내인성 과산화 효소의 작용을 차단시킨 후 아데노바이러스의 E1A 단백질을 특이적으로 인지하는 항-아데노바이러스 E1A(sc-430, santacruz biotechnology) 항체와 4℃에서 밤새 반응시켰다. 다음 날, HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 이차 항체로 상온에서 2시간 다시 혼성화시키고, DAB( 3,3'-Diaminobenzidine)를 첨가하여 발색 정도를 지켜본 후 헤마톡실린 용액으로 대조염색(counterstaining) 하였다. 이후 슬라이드를 70%, 80%, 95%, 100% 에탄올 용액에 순차적으로 담그고, 최종적으로 자일렌 용액에 담근 후 마운팅하여 현미경으로 관찰하였다.

조직면역염색법을 이용한 생체내 간암 특이적 복제가능 아데노바이러스의 복제능과 세포 살상능 검증

재조합 AFP 프로모터가 탑재된 아데노바이러스의 생체 내 복제능과 세포 살상능을 검증하기 위하여 생후 6주령의 누드 마우스 피하에 마리당 1x10⁷개의 Hep3B 세포주를 100 μl의 HBSS에 부유시켜 주입하여 종양을 형성하였다. 종양의 크기가 100-150 mm³ 정도 되었을 때 a₂bm-d19 또는 Ha₂bm-d19 아데노바이러스를 각각 1x10¹⁰ vp씩 이틀 간격으로 3회 종양 내로 주입하고 2일 후 종양을 적출하여 파라핀 블록을 제작하였다.

종양 조직 내에서 아데노바이러스의 복제와 관련된 E1A 단백질의 발현 양상을 알아보기 위하여 스페로이드에서 아데노바이러스의 복제능 검증을 위한 조직면역 염색법과 동일한 방법을 시행한 후 현미경으로 관찰하였다.

종양 조직 내에서 아데노바이러스의 세포 살상능을 검증하기 위한 방법으로는 DeadEnd fluorometric TUNEL system(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하였다. 제작된 파라핀 블락을 3 ㎛ 두께로 절단하여 슬라이드에 부착한 후, 자일렌, 100%, 95%, 80%, 70% 에탄올 용액에 차례로 담가 파라핀을 제거하고, 4% 파라포름알데히드 용액에 담가 고정시켰다. 이를 20 μg/ml의 프로티네이즈 K 용액에 담가 투과율을 높여준 후 TdT 배양 완충액과 37℃ 습식 챔버에서 1시간 반응시키고 스톱 버퍼로 반응을 정지시켰다. 반응이 끝난 슬라이드는 DAPI 용액에서 5분간 대조염색 한 후 형광전용 마운팅 용액을 이용하여 마운팅하고 형광현미경으로 관찰하였다.

동소이식 모델을 이용한 생체내 간암 특이적 복제가능 아데노바이러스의 항종양 효과 검증

실제 종양형성 모델에 가장 가까운 동소이식 모델을 확립하기 위하여 6주령 수컷 누드마우스의 복부 피하를 절개하여 20 μl의 HBSS로 부유시킨 1x10⁶ 개의 luciferase를 안정적으로 발현하는 Hep3B 세포를 마트리젤(matrigel, BD Bioscience, San Jose, CA, USA) 20 μl와 섞어 좌측 간엽에 직접 주입하고 다시 봉하였다. 세포 주입 2주 후 마우스들에게서 혈액을 채취하여 혈청을 분리한 후 AFP ELISA kit(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 혈액 내 AFP 발현량을 측정하고, AFP 발현량이 300 ng/ml 이상인 마우스들을 네 그룹으로 나눠 실험에 이용하였다. PBS 또는 세 종류의 아데노바이러스(d19, a2bm-d19, Ha2bm-d19)를 2.5x10¹⁰ VP씩 이틀 간격으로 세 번 꼬리를 통해 정맥주사 하고 1주일 간격으로 IVIS 100 (Xenogen, Alameda, CA, USA)을 이용하여 광학 이미징을 실시하였다. 이미징을 통해 얻은 신호는 IGOR-PRO Living Image software(Xenogen, Alameda, CA, USA)를 이용하여 정량 분석하였다. 바이러스 주입한 지 5주 후 혈액을 채취하고 혈청을 분리하여 혈액 내 AFP 발현량을 ELISA를 이용하여 측정하고, 간암 조직은 적출하여 무게를 잰 후 파라핀 블록으로 제작하였다.

아데노바이러스의 캡시드 단백질인 pIX 에 GFP 또는 luciferase 가 삽입된 아데노바이러스의 제작

아데노바이러스의 비침습적 분자영상을 통한 바이러스의 위치 추적이 가능하도록 하기 위하여 아데노바이러스의 캡시드 단백질인 pIX에 GFP 또는 루시퍼라제가 삽입된 아데노바이러스를 제작하였다. 우선 pIX의 종결코돈 앞에 유전자의 삽입이 용이하도록 특정위치 변이(site-directed mutagenesis)를 이용하여 NheI과 BamHI 부위를 임의로 추가하였다. 사용된 primer는 다음과 같다 : 1) Sense : 5'-CCTCCCAATGCG GTTGATTACAAGGATGACGACGATAAAGCTAGCGGCGGATCC TAAAACATAAATAAA-3', 2) Antisense : 5'-TTTATTTATGTTTTA GGATCCGCCGCTAGCTTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCAACCGCATTGGGAGG-3'(NheI과 BamHI은 이탤릭체로 표기). EGFP 유전자는 pEGFP-N1을 주형으로, 루시퍼라제 유전자는 pGL3-Basic을 주형으로 PCR을 수행하여 얻고 pIX의 종결코돈 바로 앞부분에 생성된 NheI/BamHI 부위에 삽입하여 E1 셔틀벡터인 pCA14Ψ/IXGFP 또는 pCA14Ψ/IXluc를 제작하였다. 제작된 2종류의 E1 셔틀벡터를 아데노바이러스 토탈벡터인 dl324BstBI과 함께 대장균 BJ5183에서 상동 재조합시켜 dE1/IXGFP 또는 dE1/IXluc 아데노바이러스 토탈벡터를 제작하였다. 완성된 토탈벡터들은 PacI 제한효소로 절단하여 선형화시킨 후, 아데노바이러스 생산 세포주인 HEK293에 리포펙타민을 이용하여 형질 전환하여 바이러스를 생산하였다. 생산된 아데노바이러스들은 HEK293 세포주에 재감염시켜 CsCl 농조구배 방법으로 아데노바이러스를 농축하여 순수 분리한 후 제한희석 분석과 바이러스 지놈의 흡광도에 의한 O.D로 아데노바이러스의 역가를 결정하였다.

공초점 현미경을 통한 아데노바이러스의 pIX 에 GFP 가 삽입된 바이러스의 세포내 위치 추적

아데노바이러스의 캡시드 단백질인 pIX에 GFP가 삽입된 아데노바이러스를 이용한 세포내 위치 추적 가능 여부를 확인하기 위하여 인체 뇌암 세포주인 U251N에 세포당 1x10⁶ vp의 dE1/GFP 또는 dE1/IXGFP 아데노바이러스를 각각 감염시키고 공초점 현미경을 이용하여 지속적으로 관찰하였다. 감염 1시간 후 1% 포름알데히드로 고정하고, 0.5% triton X-100으로 투과화시킨 후 DAPI 염색하고 형광 전용 마운팅 용액(DAKO, Carpinteria, CA, USA)을 이용하여 마운팅하여 관찰하였다.

전자현미경을 통해 살펴본 캡시드에 GFP 가 삽입된 아데노바이러스의 증식

아데노바이러스의 캡시드 단백질인 pIX에 GFP가 삽입된 아데노바이러스의 감염시 바이러스의 복제에 문제가 없음을 검증하기 위하여 인체 뇌암 세포주 U251N에 바이러스의 유전자 내부에 GFP가 삽입된 dE1/GFP 또는 바이러스의 캡시드에 GFP가 삽입된 dE1/IXGFP 바이러스를 각각 감염시킨 후 30분 간격으로 감염된 세포들을 회수하여 2% 글루타르알데히드에 2시간 고정한 뒤 0.1 M cacodylate-HCl(pH 7.4)에 용해시킨 1% OsO₄에 1시간 고정하였다. 표본을 에탄올로 탈수한 뒤 Epon에 포매하고 절편을 만들어 전자현미경으로 관찰하였다.

아데노바이러스의 pIX 에 루시퍼라제가 삽입된 아데노바이러스의 단백질 발현 검증

아데노바이러스의 캡시드 단백질인 pIX에 루시퍼라제가 삽입된 아데노바이러스의 단백질 발현 여부를 검증하기 위하여 아데노바이러스의 유전자 내에 루시퍼라제가 삽입된 dE1/luc 또는 캡시드에 루시퍼라제가 삽입된 dE1/IXluc 바이러스를 각각 1x10¹⁰ VP씩 준비하고 루시퍼라제 기질을 첨가하여 인 비트로 루시퍼라제 활성분석을 수행하였다.

아데노바이러스의 pIX 에 루시퍼라제가 삽입된 아데노바이러스를 이용한 인 비보 이미징

아데노바이러스의 캡시드 단백질인 pIX에 루시퍼라제가 삽입된 아데노바이러스를 이용한 인 비보 이미징을 위하여 6주령의 누드 마우스에 아데노바이러스의 유전자 내에 루시퍼라제가 삽입된 dE1/luc 또는 캡시드에 루시퍼라제가 삽입된 dE1/IXluc 1x10¹⁰ vp를 각각 꼬리로 정맥주사하고 1, 3, 6, 12, 24, 48, 96 시간 후 IVIS 100을 이용하여 이미지를 얻었다.

실험결과

AFP 프로모터의 인핸서와 사일런서 부위를 재조합한 간암 특이적 프로모터의 제작 및 프로모터 활성 비교

간암 특이적 아데노바이러스를 개발하기 위하여 먼저 간암 환자들에게서 발현이 높은 AFP 단백질의 프로모터 부위를 재조합하여 각각의 재조합 프로모터 활성을 비교하였다. 따라서 본 발명에서는 5.1 kb의 AFP 프로모터 부위가 삽입된 phAFP5.1 로부터 인핸서 A(365 bp), 인핸서 B(193 bp), 말단 사일런서(90 bp), 인접 사일런서(156 bp), AFP 미니멀 프로모터(300 bp) 부위를 각각 PCR로 증폭하여 DNA 조각을 얻고 표지유전자로서 루시퍼라제가 삽입된 벡터인 pGL3-Basic 벡터에 각각의 조각들을 순차적으로 삽입하여 재조합 프로모터를 제작하였다. 제작된 재조합 프로모터는 다음과 같다. 1) 인핸서와 사일런서 모두 포함되지 않고 미니멀 프로모터만 삽입된 AFPm, 미니멀 프로모터 앞에 2) 인핸서 A와 B 각각 1 카피씩 삽입된 Eabm, 3) 2 카피의 인핸서 A와 1 카피의 인핸서 B가 삽입된 Ea₂bm, 4) Ea₂bm의 인핸서와 미니멀 프로모터 사이에 말단 사일런서 2 카피와 인접 사일런서 1 카피가 삽입된 Ea₂bSm, 5) AFP 프로모터 상위의 -4120 ∼ -3300 bp에 위치한 인핸서 A와 B가 모두 포함된 부위 뒤로 말단 사일런서 2 카피와 인접 사일런서 1 카피가 결합된 EfSm(도 1a).

제작된 재조합 AFP 프로모터들에 의한 간암세포 특이적인 루시퍼라제의 활성 정도를 확인하기 위하여 HCC 세포주 중 AFP 발현이 높은 Huh7, 중간 정도 레벨의 Hep3B와 HepG2, AFP를 발현하지 않는 HepI, 간암 외의 다른 조직의 암 세포로 뇌암 세포주인 U343, 폐암 세포주인 A549, 인체 정상 세포주인 BJ, WI38, CBHEL, IMR90에 각각의 DNA를 형질전환하고 48시간 후 세포를 파쇄시켜 루시퍼라제 활성분석을 진행하였다(도 1b). 그 결과, AFP를 발현하는 HCC 세포주인 Huh7, Hep3B, HepG2 세포주에서 루시퍼라제 활성이 높게 나타났으며, AFP를 발현하지 않는 HepI 및 다른 조직의 암 세포, 정상 세포 모두에서 거의 루시퍼라제 활성이 나타나지 않았다. 실험에 이용된 재조합 프로모터 중 2 카피의 인핸서 A와 1 카피의 인핸서 B가 미니멀 프로모터와 결합된 Ea₂bm에 의한 루시퍼라제 활성이 가장 높았으며, 간암세포 특이성 또한 확인할 수 있었다. 이를 통하여, 제작된 재조합 프로모터에 의한 루시퍼라제 활성은 AFP를 발현하는 간암세포 특이적이었으며, AFP 발현정도와 높은 상관관계를 보였다.

재조합된 AFP 프로모터에 의해 유전자의 발현이 조절되는 아데노바이러스의 제작 및 간암 특이적 유전자 발현 조절 검증

재조합된 AFP 프로모터 자체의 간암 특이적 활성이 아데노바이러스에 적용되었을 때도 유지되는지 검증하기 위하여 프로모터 활성 비교실험에서 활성이 낮은 Eabm과 EfSm을 제외한 나머지 재조합 프로모터들을 복제불능 아데노바이러스에 삽입하여 표지 유전자인 GFP의 발현 조절 정도를 비교해 보았다. 또한 대부분의 암 조직에 조성되는 저산소 상태에서 아데노바이러스의 복제 감소 현상을 극복하기 위한 방안으로 혈관 신생 인자인 VEGF의 HRE 도메인을 6 카피 반복하여 재조합 AFP 프로모터의 상위에 삽입한 복제불능 아데노바이러스도 추가로 제작되었다(도 2a).

AFP 발현정도가 다른 HCC 세포주 및 다른 조직의 암 세포주, 인체 정상 세포주에 재조합 AFP 프로모터에 의해 EGFP의 발현이 조절되는 복제불능 아데노바이러스를 각각 감염시키고 48시간 후 FACS를 이용하여 GFP를 발현하는 세포의 숫자를 확인하였다(도 2b). 저산소 상태에서의 프로모터 활성을 알아보기 위한 실험군들은 각각의 아데노바이러스 감염 후 바로 저산소(hypoxia) 챔버(1% O₂, 5% CO₂, 37℃)로 옮겨져 12시간 동안 배양하고, 다시 정상산소 조건에서 12시간 배양하는 것을 2 사이클 반복하였다. 그 결과 실험에 이용된 세포주의 AFP 발현 정도에 따라 재조합 AFP 프로모터에 의한 GFP 발현 정도도 달라 AFP의 발현이 높은 Huh7 세포주에서는 GFP의 발현률이 높았으나 AFP가 발현되지 않는 다른 조직의 암 세포주나 정상 세포주에서는 GFP 발현률도 낮았다. 특히 6 카피의 HRE를 추가로 삽입한 AFP 프로모터의 경우 저산소 상태에서 HRE가 없는 프로모터에 비해 GFP 발현정도가 현저히 증가하였다. 이를 통하여 재조합 AFP 프로모터에 의해 간암 특이적으로 유전자의 발현이 조절됨을 확인할 수 있었으며, 특히 HRE의 삽입에 따른 저산소 상태에서의 유전자 발현효율 증가 또한 확인할 수 있었다.

또한 암 조직 내에서 간암 특이적 AFP 프로모터에 의한 유전자의 발현 조절 여부를 검증하기 위하여 간암 세포주인 Hep3B를 이용하여 종양을 형성하고 a2bm-dE1/GFP 또는 Ha2bm-dE1/GFP 아데노바이러스를 종양내로 주입하여 GFP의 발현을 관찰하였다(도 3). 그 결과 HRE가 포함되지 않은 프로모터에 비해 HRE가 포함된 프로모터에 의한 유전자의 발현률이 높았으며, HRE의 삽입으로 정상산소 지역 뿐만 아니라 종양 내 저 산소 지역에서도 GFP의 발현이 유지됨을 확인할 수 있었다.

재조합된 AFP 프로모터에 의해 바이러스의 복제가 조절되는 간암세포 특이적 세포살상 아데노바이러스의 제작 및 세포살상능 검증

앞서 플라즈미드와 복제불능 아데노바이러스를 이용하여 진행된 연구 결과들을 토대로 여러 종류의 재조합 AFP 프로모터들 중 가장 효율성과 특이성이 높은 a₂bm과 Ha₂bm 프로모터 만을 선택하여 E1B 19KDa이 제거되어 세포살상능이 우수한 아데노바이러스에 삽입함으로써 간암 특이적으로 바이러스의 복제가 조절되는 복제 가능 아데노바이러스를 제작하였다(도 4a).

제작된 아데노바이러스에 의한 간암 특이적 세포 살상능을 비교하기 위하여 다양한 세포주에 d19, a₂bm-d19, 또는 Ha₂bm-d19 아데노바이러스를 각각 감염시킨 후 MTT 분석을 수행하였다(도 4b). 결과적으로 실험에 이용된 간암세포와 정상세포 모두에서 d19 아데노바이러스의 세포살상능이 가장 높았다. 그에 반해 a₂bm-d19 아데노바이러스를 감염시킨 경우 세포주의 AFP 발현 정도가 높은 세포에서만 살상능을 보였으며, 특히 정상세포인 IMR90과 MRC5에서의 세포 생존률은 아무런 처리도 하지 않은 세포군과 거의 비슷하였다. 또한 HRE가 추가로 삽입된 Ha₂bm-d19 아데노바이러스를 감염시켰을 때 저산소 조건에서 AFP를 발현하는 세포의 세포살상능이 눈에 띄게 증가하였으며 특히 Hep3B 세포주에서는 강력한 세포 살상능을 지닌 d19 아데노바이러스와 비슷한 세포 살상능을 나타냈으나 IMR90과 MRC5와 같은 정상 세포주에서는 바이러스를 처리하지 않은 실험군과 비슷한 세포 생존률을 보여 재조합 AFP 프로모터를 탑재한 아데노바이러스의 우수한 간암 특이적 세포 살상능을 확인할 수 있었다. AFP를 발현하지 않는 HepI 세포주의 경우 Ha₂bm-d19 아데노바이러스를 감염시켰을 때 저산소 상태에서 세포살상능이 약 60% 증가한 것으로 보아 이질성(heterogeneity)이 높은 간암 조직 내에서 AFP를 발현하는 암세포 뿐만 아니라 AFP를 발현하지 않는 암세포 또한 제거할 수 있으므로 Ha2bm-d19 아데노바이러스의 간암 특이성과 효율성 모두를 증명할 수 있었다.

간암세포 특이적 세포살상 아데노바이러스의 복제능 검증

앞서 도 4에서 Hep3B 세포에 Ha₂bm-d19 아데노바이러스를 감염시킨 경우 저산소 상태에서도 세포 살상능이 현격히 증가된 현상이 바이러스의 복제능 증가와 관련이 있는지 검증하기 위하여 Hep3B 세포주에 a₂bm-d19 또는 Ha₂bm-d19 아데노바이러스를 각각 감염시킨 후 세포 배양액과 살아 있는 세포 모두를 수거하여 HEK293 세포주에 재감염시켜 제한희석 분석을 수행하였다(도 5). 그 결과 Ha₂bm-d19 아데노바이러스가 감염된 Hep3B 세포에서는 저 산소 상태에서도 바이러스의 복제가 저해되지 않고 오히려 정상산소 조건과 비교했을 때와 a₂bm-d19 바이러스가 감염된 세포와 비교했을 때 모두 40배 이상 복제가 증가됨을 확인하였다. 이를 통하여 간암 특이적 복제 가능 아데노바이러스에 HRE를 삽입함으로써 저산소 조건에서도 아데노바이러스의 복제능이 감소되지 않으므로 세포 살상 효과가 증가하였음을 간접적으로 확인할 수 있었다.

스페로이드 내에서 간암 특이적 세포 살상 아데노바이러스의 복제능 검증

생체 외에서 자연적으로 암 조직 내부에 저산소 구역이 형성되도록 하기 위하여 누드마우스에 간암 세포주인 Hep3B를 주입하여 형성된 종양을 적출하여 스페로이드 배양을 수행하였다(도 6). 스페로이드 배양시 두 종류의 아데노바이러스 a₂bm-d19 또는 Ha₂bm-d19를 각각 감염시킨 스페로이드를 섹션하여 아데바이러스의 복제와 관련된 E1A 단백질에 대한 항체를 이용한 조직면역염색법을 수행한 결과, a₂bm-d19를 감염시킨 조직에서는 바이러스의 접근이 용이한 정상산소 구역일 것으로 예상되는 스페로이드 가장자리(spheroid margin) 부분에서만 E1A가 관찰된 반면, Ha₂bm-d19를 감염시킨 조직에서는 스페로이드 가장자리 뿐만 아니라 자연적으로 저산소 조건이 형성되었을 것으로 예상되는 조직 내부에서도 E1A 단백질이 관찰되었다. 이를 통하여 간암 특이적 세포 살상 아데노바이러스인 Ha₂bm-d19가 생체 외 뿐만 아니라 생체 내 저산소 조건에서도 복제능이 저해되지 않음을 확인할 수 있었다.

생체내 간암 특이적 세포살상 아데노바이러스의 복제능과 세포 살상능 검증

생체외 실험 결과를 바탕으로 생체 내에서 간암 특이적 세포 살상 아데노바이러스의 세포 살상능과 복제능을 검증하기 위하여 누드 마우스의 피하에 Hep3B 세포주를 주입하여 형성된 종양에 PBS 또는 세 종류의 아데노바이러스 d19, a₂bm-d19, Ha₂bm-d19를 각각 투여하였다. 이를 이용하여 종양 조직 내에서 아데노바이러스의 복제와 관련된 E1A 단백질의 발현양상을 알아보고 TUNEL 분석을 통하여 세포살상 정도를 비교하였다(도 7). 아데노바이러스의 E1A 단백질에 대한 항체를 이용하여 면역염색법을 시행한 결과 d19 또는 Ha₂bm-d19 바이러스를 처리한 실험군에서 E1A 단백질의 발현이 높았으며, 특히 HRE가 삽입된 Ha₂bm-d19를 처리한 실험군의 경우 E1A 단백질이 종양 조직 내에 고르게 분포되어 있는 것을 관찰할 수 있었다. TUNEL 분석 결과에서도 E1A와 마찬가지로 HRE가 탑재된 Ha₂bm-d19를 처리한 실험군에서 TUNEL 염색 양성인 세포고사가 진행된 세포들이 종양 조직 내에 고르게 분포되어 있음을 관찰할 수 있었다. 이를 통하여 종양조직내의 저산소 조건에서도 HRE가 포함된 Ha₂bm-d19의 경우 HRE가 없는 a₂bm-d19에 비해 바이러스 복제능의 저해 없이 우수한 세포살상 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

동소이식 모델을 이용한 생체내 간암 특이적 복제가능 아데노바이러스의 항종양 효과 검증

실제 종양생성 환경과 가장 유사한 동소이식 모델을 구축하여 생체 내에서의 간암 특이적 세포살상 아데노바이러스에 의한 항종양 효과를 검증하고자 마우스의 간엽에 루시퍼라제를 발현하는 Hep3B 세포주를 주입하여 종양을 형성하고 PBS 또는 두 종류의 아데노바이러스 a₂bm-d19, Ha₂bm-d19를 정맥 주사한 후 일주일마다 optical imaging을 이용하여 항종양 효과를 검증하였다(도 8). 아데노바이러스를 주입한 지 5주가 지난 후 두 그룹간의 항종양 효과가 가장 현저한 차이를 보였다. a2bm-d19 바이러스를 투여한 그룹의 경우 6마리 모두에서 종양의 크기가 지속적으로 크게 증가하였음을 확인할 수 있었다. 반면 Ha2bm-d19를 투여한 그룹의 경우 대부분의 마우스에서 종양의 성장 속도가 둔화됨을 확인할 수 있었고, 결과적으로 바이러스를 투여하고 5주가 지났을 때 Ha2bm-d19를 투여한 그룹이 a2bm-d19를 투여한 그룹에 비해 종양의 크기가 작았다.

이를 total flux 수치를 이용하여 정량화 해보면, 바이러스 투여 5주 후 Ha2bm-d19를 투여한 그룹은 a2bm-d19를 투여한 그룹에 비해 5배 낮은 수치를 나타냈으며 이는 약 82%의 종양 성장 억제효과를 의미한다(도 9a).

또한 이 실험에서는 간암 특이적 세포 살상 아데노바이러스에 의한 항종양 효과를 이미징과 동시에 혈청내 AFP 발현량으로 점검하였다(도 9b). 바이러스의 투여 5주 후 마우스들의 혈청 내 AFP 발현량을 비교해 보면, total influx 수치와 마찬가지로 Ha2bm-d19를 투여한 그룹이 a2bm-d19를 투여한 그룹에 비해 5배 낮은 농도의 AFP를 발현하였다.

구축된 동소이식 모델에 간암 특이적 세포살상 아데노바이러스의 투여 5주 후 최종적으로 마우스의 간에 형성된 종양을 적출한 결과 Ha2bm-d19를 투여한 그룹이 a2bm-d19를 투여한 그룹에 비해 종양의 크기가 작았고 이를 정량화하기 위해 무게를 잰 결과 Ha2bm-d19를 투여한 그룹이 a2bm-d19를 투여한 그룹에 비해 종양의 크기가 약 9배 작았다(도 10).

Total influx 수치, 혈청 내 AFP 발현량 및 치료 후 간에 남아있는 종양의 크기 등을 종합해 볼 때 루시퍼라제를 발현하는 Hep3B 세포주를 이용한 동소이식 모델에서 Ha2bm-d19를 투여한 그룹이 a2bm-d19를 투여한 그룹에 비해 우수한 항종양 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

비침습적 분자영상을 통한 캡시드에 GFP 가 삽입된 아데노바이러스의 위치 추적

아데노바이러스의 위치 및 분포를 실시간으로 추적할 수 있는 비침습적 분자영상 시스템을 개발하기 위하여 아데노바이러스 캡시드의 구성성분인 IX 단백질의 C-말단에 표지단백질인 GFP 또는 루시퍼라제를 융합시킨 복제불능 아데노바이러스인 dE1/IXGFP 및 dE1/IXluc를 제작하였다(도 11a 및 11b).

제작된 아데노바이러스의 감염 후 분포추적 가능 여부를 확인하기 위하여 먼저 뇌암 세포주인 U251N에 바이러스 유전자 내에 GFP 유전자가 삽입된 dE1/GFP 또는 캡시드 단백질 pIX에 GFP가 삽입된 dE1/IXGFP 바이러스를 각각 감염시킨 후 공초점 현미경을 이용하여 실시간으로 GFP의 발현여부를 관찰하였다(도 12). 실험에 이용된 dE1/GFP 바이러스의 경우 GFP 유전자가 바이러스의 유전자에 삽입되어 있어 DNA가 단백질로 전환된 후에만 단백질의 발현여부를 관찰할 수 있는 반면, 캡시드 단백질인 IX에 GFP가 삽입된 경우 바이러스 감염 후 1시간 이내에 GFP 단백질의 발현을 관찰할 수 있었다.

또한 캡시드를 구성하는 IX 단백질에 외부 단백질이 융합됨으로써 생기는 구조적 변화에 의해 바이러스의 감염 경로에 변화가 있는지를 확인하기 위하여 dE1/GFP와 dE1/IXGFP 바이러스를 각각 감염시킨 후 지속적으로 전자현미경을 이용하여 관찰하였다(도 13). 그 결과 dE1/GFP 또는 dE1/IXGFP를 감염시킨 두 그룹간에 바이러스의 감염 경로에 차이가 없는 것으로 보아 아데노바이러스의 구조적 변화가 감염경로에 영향을 미치지 않는다는 것을 알 수 있었다.

비침습적 분자영상을 통한 캡시드에 루시퍼라제가 삽입된 아데노바이러스의 위치 추적

GFP 단백질과 동일한 방법으로 아데노바이러스의 IX 단백질에 루시퍼라제 단백질이 결합된 아데노바이러스를 제작한 후 바이러스 자체의 루시퍼라제 활성을 측정하였다(도 14). 루시퍼라제 유전자가 바이러스의 유전자에 삽입된 dE1/luc 바이러스의 경우 DNA에서 단백질로의 전환이 이루어지지 않아 루시퍼라제 활성이 없는 반면, IX 단백질에 루시퍼라제가 결합된 dE1/IXluc 바이러스의 경우 캡시드에 단백질이 이미 발현되어 있어 바이러스 자체만으로도 루시퍼라제 활성을 지니고 있음을 알 수 있었다.

실제로 인 비보에서도 바이러스의 캡시드에 루시퍼라제가 발현되는 아데노바이러스의 분포를 추적할 수 있는지 알아보기 위하여 마우스에 dE1/luc 또는 dE1/IXluc 바이러스를 각각 꼬리로 주입한 후 광학 이미징 방법을 이용하여 시간별로 루시퍼라제의 활성을 관찰해 보았다(도 15). dE1/luc를 주입한 마우스의 경우 강력한 CMV 프로모터에 의해 루시퍼라제의 발현이 높게, 오랫동안 지속되어 바이러스 주입 후 6일이 지나도 여전히 단백질의 발현이 높게 유지됨을 관찰할 수 있었다. 반면 dE1/IXluc를 주입한 마우스의 경우 비교적 강도가 약한 아데노바이러스 자체의 pIX 프로모터에 의해 루시퍼라제가 발현되기 때문에 발현정도는 낮지만 바이러스 투여 후 3시간부터 루시퍼라제 단백질의 발현을 관찰할 수 있었고 빠른 시간 안에 단백질의 발현이 감소됨을 볼 수 있었다.

고찰

AFP는 태아의 간 및 위장 관에서 높이 발현되다가 성인이 되면서 발현이 억제되나 HCC와 같은 암이 발생하면 다시 발현량이 현저히 증가하기 때문에 간암 진단에 있어 유용한 종양 표지자로 이용되고 있다. 따라서 간암을 치료하기 위하여 AFP 프로모터에 의한 치료 유전자의 전사조절 방법을 이용하는 연구가 지속적으로 진행되어 오고 있다^{33 -35}. Mawatari 그룹은 AFP 프로모터에 의해 HSV-TK(herpes simplex virus-thymidine kinase)의 발현을 조절하며 동시에 GCV(ganciclovir)를 처리해 줌으로써 AFP를 발현하는 간암세포의 살상 효과가 조절될 수 있음을 보고하였다³⁶. 본 발명자들도 AFP 프로모터에 의해 아데노바이러스의 복제를 조절함으로써 간암 특이적인 세포살상 효과를 얻을 수 있음이 이미 보고한 바 있다¹⁶.

본 연구에서는 AFP 프로모터의 인핸서와 사일런서의 주요 부위를 미니멀 AFP 프로모터와 재조합하여 프로모터의 크기를 줄임으로써, 치료 유전자의 삽입이 용이하고 프로모터 고유의 간암 선택성 및 효율성은 유지되는 새로운 재조합 AFP 프로모터를 제작하였다. 플라즈미드 상에서 루시퍼라제 활성 분석을 이용하여 재조합 AFP 프로모터의 선택성 및 효율성을 검증하였으며 여러 종류의 프로모터들 중 미니멀 AFP 프로모터에 2 카피의 인핸서 A와 1 카피의 인핸서 B가 결합된 형태의 프로모터인 Ea2bAFPm의 활성이 가장 우수하였다. 제작된 여러 종류의 AFP 프로모터들에 의해 GFP의 발현이 조절되는 복제 불능 아데노바이러스를 제작하여 유전자의 발현 양상을 관찰하였을 때에도 플라즈미드를 이용한 실험에서 확인된 프로모터들의 활성 정도와 일치되는 양상을 보였다. 특히 Ea2bAFPm에 HRE가 추가된 AFP 프로모터가 삽입된 아데노바이러스인 Ha2bm-dE1/GFP를 감염시킨 경우 정상 산소 상태에 비해 저 산소 상태에서 간암 세포 특이적인 GFP의 발현이 눈에 띄게 증가하였고, 이러한 바이러스를 투여한 Hep3B 간암 조직에서도 정상 산소 부위 뿐만 아니라 저 산소 부위까지도 GFP가 높이 발현됨을 관찰하였다. 또한 복제 불능 아데노바이러스를 이용한 연구에서 효율성과 선택성이 우수했던 a2bm 또는 Ha2bm 프로모터에 의해 바이러스의 복제가 조절되는 간암 특이적 세포 살상 아데노바이러스를 제작하였다. 이 바이러스의 골격(backbone)으로 이용된 d19 아데노바이러스는 숙주 세포 내에서 바이러스의 복제를 위해 세포 고사를 차단하는 역할을 하는 E1B 19KDa 단백질의 기능이 소실되어 있어 강력한 세포 살상능을 나타냄이 보고된 바 있다³⁷. 결과적으로 간암 특이적 세포 살상 아데노바이러스인 Ha2bm-d19는 정상 세포주의 세포 생존에는 영향을 주지 않고 간암 세포주에서만 선택적으로 매우 우수한 살상효과를 나타내었다. 특히 AFP를 발현하지 않는 HepI 세포주에서도 저 산소 상태에서 바이러스의 세포 살상 효과가 급격히 증가한 현상은 AFP를 발현하는 간암 뿐만 아니라 AFP를 발현하지 않는 간암까지 치료할 수 있으므로 암 조직 내부 세포들간의 이질성(heterogeneity)이 높아 암 치료의 효율성이 떨어지는 한계점을 보완할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 Hep3B 세포주에 Ha2bm-d19 바이러스를 감염 시켰을 때 정상 산소 조건에 비해 저 산소 조건에서 오히려 바이러스의 복제가 40배 이상 증가되었다. 이는 재조합 프로모터에 HRE를 삽입함으로써 저 산소 조건에서 아데노바이러스의 복제가 저해되는 현상을 극복하였으며 이는 Ha2bm-d19 아데노바이러스가 고형암에서 흔히 발견되는 저산소 조건에서도 효율적인 유전자 전달체로 이용될 수 있는 가능성을 보여주었다. 다음으로 생체 내에서와 마찬가지로 생체 외에서 자연적인 저산소 부위를 형성하기 위하여 Hep3B 종양 조직을 이용하여 스페로이드를 형성하고 a2mb-d19 또는 Ha2bm-d19를 감염시킨 후 아데노바이러스의 복제능을 조직면역 염색법을 수행하여 확인하였다. 그 결과 Ha2bm-d19 아데노바이러스를 감염시킨 경우 배지와의 접근이 용이하여 정상 산소 농도를 유지할 것으로 예상되는 스페로이드 가장자리 뿐만 아니라 영양분의 전달이 어려워 저 산소 지역이 형성되었을 것으로 예상되는 스페로이드 내부까지 아데노바이러스의 E1A 단백질이 검출된 것으로 보아 생체 외에서와 마찬가지로 종양 조직의 저 산소 조건에서도 Ha2bm-d19의 복제가 활발히 이루어짐을 확인할 수 있었다. 본 연구에서는 실제 인체 종양과 동일한 환경을 조성하고자 광학 이미징을 위해 루시퍼라제가 안정적으로 발현되도록 형질전환된 Hep3B/luc 세포주를 마우스의 간엽에 직접적으로 주입하여 동소이식 모델을 구축하고 치료제로 작용할 a2bm-d19 또는 Ha2bm-d19 바이러스는 정맥 주사하여 종양의 크기 변화를 지속적으로 관찰하였다. 또한 항종양 효과는 다양한 접근 방법- 광학 이미징, ELISA를 이용한 혈청 내 AFP 발현량 측정, 조직 내 종양 무게 측정-을 이용하여 관찰하였다. 아데노바이러스 투여 후 5주간 광학 이미징을 이용하여 종양의 성장 정도를 지속적으로 관찰한 결과 Ha2bm-d19를 투여한 그룹에서 가장 높은 항종양 효과를 관찰하였으며 이는 혈청 내 AFP 발현량 및 조직 내 종양 무게 측정으로 얻은 결과와 모두 일치하는 것을 확인하였다.

최종적으로 본 연구를 통하여 개발된 재조합 AFP 프로모터에 의해 바이러스의 복제가 조절되는 간암 특이적 세포 살상 아데노바이러스는 간암을 치료하는데 있어 간암 세포 살살능과 간암 세포 특이성을 모두 지닌 도구이며, 암 조직내의 저산소 상태로 인해 발생하는 치료 내성 또한 극복될 수 있을 것으로 기대된다. 또한 개발된 바이러스 벡터에 다양한 치료 유전자를 삽입함으로써 치료효과를 증대시킬 수 있을 뿐만 아니라 간암 이외에도 다른 조직 특이성 또는 암 특이성 프로모터로 대체한다면 다양한 암을 대상으로 치료하는데 이용될 수 있을 것이라 기대된다.

생물 의학 연구에서 비침습적 분자영상의 역할은 점차 증가하고 있다³⁸. 현재 바이러스의 감염 경로를 추적하고, 비침습적 영상으로 탐지하는 방법들 - 생물발광 표지자^{39 , 40}와 형광 표지자⁴¹를 이용한 광학적 방법, PET(positron emission tomography) 방법⁴², 활성은 없으면서 용해 가능한 표지 펩타이드를 이용한 방법⁴³ - 이 계속적으로 보고 되고 있다. Yoshmitsu 그룹은 루시퍼라제 유전자가 삽입된 렌티바이러스 벡터를 갓 태어난 쥐에 정맥주사한 후 유전자 발현을 관찰하였고⁴⁴, Christophe 그룹도 반딧불의 루시퍼라제 유전자에 IRES로 GFP 유전자를 연결시킨 렌티바이러스 벡터를 이용하여 뇌에서 유전자 발현을 관찰하였다⁴⁵. 또한 Michelle 그룹은 루시퍼라제를 이용하여 정량이 어려운 난소 이식암에 대한 종양 선택적 아데노바이러스의 반응을 정량화하였다⁴⁶.

아데노바이러스 단백질인 pIX은 보조적인 역할을 하는 구조단백질로 이십면체인 아데노바이러스의 캡시드를 구성하는 헥손(hexon)과 결합되어 있으며, 바이러스 형성에 필수적이지는 않으나 pIX이 결실된 캡시드는 약 37.3 kb의 바이러스 DNA를 수용할 수 있으나 플라크(plaque)를 생성하지 못한다는 것이 보고 되었다⁴⁷. pIX은 구조단백질의 역할 외에도 아데노바이러스 유전자의 전사 활성 인자로 작용하며, 바이러스의 표면에 노출되어 있기 때문에 다양한 펩타이드를 결합시켜 벡터 표적화에 이용하려는 연구들이 활발히 진행되고 있다. Dmitriev 그룹은 pIX의 C 말단에 FLAG 에피토프와 여러 개의 라이신 잔기를 융합시켜 아데노바이러스의 캡시드에 성공적으로 삽입하였다³². 변형된 pIX의 폴리라이신 잔기들은 헤파린 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan)과 상호작용함으로써 CAR의 발현이 부족한 세포에도 아데노바이러스가 결합할 수 있는 능력을 부여하였다. 유사한 시도로 Vellinga 그룹은 pIX에 Arg-Gly-Asp(RGD)를 결합시켜 αvβ 인테그린을 발현하는 세포로의 감염효율을 증가시켰다²⁸. 또한 여러 그룹들에서 사이즈가 큰 융합단백질을 아데노바이러스 캡시드 바깥쪽에 표출시키려는 연구도 진행되고 있으며 그 중에서도 pIX에 형광 단백질을 융합시켜 바이러스 표면에 발현시킨 연구가 많이 보고되었다. 소의 아데노바이러스 pIX에 EYFP(enhanced yellow fluorescent protein)를 융합시킨 바이러스가 제작되었으며, 이와 유사한 방법으로 인간 아데노바이러스 캡시드의 pIX에 GFP(green fluorescent protein)가 융합된 바이러스를 제작하여 인 비트로 및 인 비보에서 바이러스의 감염경로 및 근육 조직 내 바이러스의 위치를 추적하였다^{34 ,35}. 현재 종양 세포 살상 아데노바이러스의 안전성이 알려져 있긴 하나 in vivo에서 이 바이러스의 기능은 아데노바이러스 복제를 비침습적으로 탐지할 수 있는 시스템의 부족으로 많이 밝혀지지 못한 상태다.

따라서 본 연구에서는 아데노바이러스의 pIX에 GFP 또는 루시퍼라제가 융합된 아데노바이러스를 제작하여 인 비트로와 인 비보 상에서 바이러스 단백질의 발현 양상을 관찰하고 세포 내에서의 감염경로와 양상을 추적해 보았다. 먼저 아데노바이러스의 유전자 내부에 GFP가 삽입된 dE1/GFP 또는 pIX에 GFP가 삽입된 dE1/IXGFP를 뇌암 세포주인 U251N에 감염시킨 후 GFP 단백질의 발현양상을 관찰해 본 결과 DNA가 단백질로 전환된 후에야 GFP 발현을 관찰할 수 있는 dE1/GFP와 달리 dE1/IXGFP의 경우 캡시드에 GFP 단백질이 결합되어 있어 바이러스가 세포 내로 감염된 후부터 GFP의 발현이 관찰되었다. 캡시드에 외부 단백질이 삽입됨으로써 발생하는 구조적 변화에 의해 바이러스의 감염 경로에 이상을 초래할 수 있다는 가정 하에 dE1/GFP 또는 dE1/IXGFP가 감염된 암 세포주를 전자 현미경으로 관찰하였으나 두 그룹 간 바이러스의 감염 경로 뿐만 아니라 복제능에도 별다른 문제가 관찰되지 않았다. 또한 아데노바이러스의 유전자 내부에 루시퍼라제 유전자가 삽입된 dE1/luc 또는 pIX에 루시퍼라제 단백질이 삽입된 dE1/IXluc를 누드 마우스에 정맥 주사하고 광학 이미징을 통하여 루시퍼라제 단백질의 발현양상을 지속적으로 관찰 하였다. dE1/luc를 주입한 마우스의 경우 DNA가 단백질로 전환된 후에야 루시퍼라제의 발현을 관찰할 수 있었으며 강력한 CMV 프로모터에 의해 루시퍼라제의 발현이 높게, 오랫동안 지속되어 바이러스 주입 후 6일이 지나도 여전히 발현된 단백질이 체내에 지속적으로 유지됨을 관찰할 수 있었다. 반면 dE1/IXluc를 주입한 마우스의 경우 비교적 강도가 약한 아데노바이러스 자체의 pIX 프로모터에 의해 루시퍼라제가 발현되기 때문에 발현정도는 낮지만 바이러스 투여 후 3시간부터 루시퍼라제 단백질의 발현을 관찰할 수 있었고 빠른 시간안에 생성된 단백질이 제거됨을 알 수 있었다. 아데노바이러스를 치료 및 진단에 이용할 때 장시간 바이러스 및 외부 단백질이 체내에 남아있을 경우 인체의 면역반응에 의한 부작용을 초래할 수 있으므로 IX 단백질에 표지단백질이 결합된 아데노바이러스는 바이러스의 위치 및 분포 추적에 유용하며 인체에 안전한 도구가 될 것으로 여겨진다.

최종적으로 아데노바이러스의 캡시드 단백질에 표지단백질이 결합된 아데노바이러스는 바이러스의 감염 후 분포가 실시간으로 추적 가능하므로 비침습적 분자영상 도구로써 이용될 수 있으며, 앞서 논의된 간암 특이적 세포살상 아데노바이러스의 IX 단백질에 표지단백질을 결합하게 되면 간암 세포 내에서 바이러스의 복제 기간 동안만 강력한 표지 단백질의 발현이 지속되므로 암의 치료 및 진행여부를 확인하는데 유용한 도구가 될 수 있을 것으로 기대된다.

결론

본 연구를 통하여 개발된 재조합 AFP 프로모터에 의해 바이러스의 복제가 조절되는 간암 특이적 세포 살상 아데노바이러스는 생체 내외 모든 조건에서 간암 특이적인 세포 살상 효과를 보였으며, HRE의 삽입으로 암 조직 내의 저 산소 상태에서도 바이러스의 복제능 및 세포 살상능에 영향을 받지 않았다. 따라서 이러한 바이러스가 다른 종래의 치료법과 함께 암 치료에 이용된다면 치료 효과 면에서는 상승효과를 얻을 수 있으며, 안전성 면에서는 각 치료법에서 현재 이용되는 적용량을 낮춤으로써 부작용을 줄일 수 있고, 암 조직 내의 저산소 상태로 인해 발생하는 치료 내성 또한 극복될 수 있을 것으로 생각된다. 또한, 아데노바이러스의 캡시드 단백질에 GFP 또는 루시퍼라제와 같은 표지 단백질을 결합시킴으로써 바이러스의 감염 후 분포가 실시간으로 추적 가능하였다. 따라서 이러한 바이러스는 비침습적 분자영상 도구로써 아데노바이러스의 기초연구에 이용될 수 있으며, 최종적으로 간암 특이적 세포살상 아데노바이러스의 IX 단백질에 표지단백질을 결합하면 간암 세포 내에서 바이러스의 복제 기간 동안만 강력한 표지 단백질의 발현이 지속되므로 간암의 치료 및 진행여부를 추적하는데 유용한 도구가 될 수 있을 것으로 기대된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims (21)

1. (a) 5’에서 3’방향으로 (ⅰ) HRE(hypoxia-response elements) 도메인 서열; (ⅱ) AFP(Alpha-Feto Protein) 프로모터의 인핸서 A 서열; (ⅲ) AFP 프로모터의 인핸서 B 서열; 및 (ⅳ) AFP 프로모터 서열을 포함하며, 상기 HRE 도메인 서열은 6번 반복되고, 상기 인핸서 A 서열은 2번 반복되는 유전자발현 조절서열; 및
   (b) 상기 유전자발현 조절서열에 작동적으로 연결된(operatively linked) 발현시키고자 하는 목적 유전자를 포함하는 암세포 특이적 발현이 개선된 유전자 전달체.
   
2. 삭제
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9. 제 1 항에 있어서, 상기 유전자 전달체는 재조합 아데노바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 유전자 전달체.
   
10. 제 1 항에 있어서, 상기 암은 간암인 것을 특징으로 하는 유전자 전달체.
    
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