ES2750305T3 - Mutantes de E1A y E1B de adenovirus selectivos de tumor - Google Patents

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Abstract

Un adenovirus recombinante que comprende una secuencia de ADN que se inserta en un sitio de inserción de E1b- 19K, en el que dicho sitio de inserción se ubica entre el sitio de inicio de Elb-19K y el sitio de inicio de E1b 55K y en el que dicho sitio de inserción E1b-19K comprende una eliminación de al menos 100 pares de bases, en el que además el gen Elb-55K no se altera, y en el que dicha secuencia de ADN es una secuencia que codifica un transgen, un gen canceroso o una secuencia de ADN mutada.

Description

DESCRIPCIÓN
Mutantes de E1A y E1B de adenovirus selectivos de tumor
Antecedentes de la invención
A pesar del amplio conocimiento en lo que se refiere a los mecanismos moleculares subyacentes que causan cáncer, la mayoría de los cánceres permanecen incurables con quimioterapia actual y protocolos de radiación. Los virus oncolíticos han emergido como plataforma tecnológica que tiene el potencial para mejorar el tratamiento convencional de una manera significativa para una diversidad de neoplasias. (Kumar, S. et al., Current opinion in molecular therapeutics 10(4):371-379 (2008); Kirn, D. Expert opinion on biological therapy 1(3):525-538 (2001); Kirn D. Oncogene 19(56):6660-6669 (2000)). ONy X-015 que tiene una eliminación del gen E1b-55k viral se postuló para conferir replicación selectiva de tumor en tumores con defectos en la ruta de p53 (Heise, C. et al., Nat Med 3(6):639-645 (1997); McCormick, F. Oncogene 19(56):6670-6672 (2000); Bischoff, J. R. et al., Science 274(5286):373-376 (1996)). E1b-55k se une e inactiva p53, permitiendo síntesis de ADN y replicación viral no programadas. La inactivación de p53 mediante E1b-55k, mientras que resulta crítica en lo que se refiere a replicación de adenovirus eficiente en células normales, se especuló como irrelevante en tumores que tienen mutaciones de inactivación en la ruta de p53. Los estudios preclínicos demostraron que un amplio rango de células tumorales humanas con secuencias de genes de p53 mutantes o normales sostenían la replicación de ONYX-015 en cultivo celular, demostrando que la replicación viral permisiva en células tumorales no dependía estrictamente de los efectos de unión a p53 de E1b-55k (Heise, C. et al., Nat Med 3(6):639-645 (1997); Heise, C. et al., Clin Cancer Res 6(12):4908-4914 (2000); Rogulski, K. R. et al. Cancer Res 60(5): 1193-1196 (2000); Harada, J. N. et al., J Virol 73(7):5333-5344 (1999); Goodrum, F. D. et al., Journal of virology 72(12):9479-9490 (1998)). Estudios anteriores han demostrado que E1b-55k es una proteína multifuncional que, además de unirse e inactivar p53 durante la fase de infección temprana, facilita el transporte de ARNm a través de la membrana nuclear durante fases de infección tardías (Babiss, L. E. et al., Mol Cell Biol 5(10):2552-2558 (1985); Leppard, K. N. et al., Embo J 8(8):2329-2336 (1989)). La falta de transporte de ARNm eficiente debido a la eliminación de E1b-55k dio como resultado una reducción de replicación viral incluso en células tumorales en comparación con Ad5 de tipo salvaje. El análisis detallado demostró que la pérdida de la función de transporte de ARNm que se proporciona por E1b-55k podía complementarse en líneas celulares tumorales, lo que sugiere un mecanismo nuevo de replicación viral selectiva de tumor (O'Shea, C. C. et al., Cancer Cell 8(1):61-74 (2005)). Sin embargo, la complementación de funciones perdidas debido a la eliminación de gen viral resultó incompleta en la mayoría de las células tumorales debido a que la titulación de ONYX-015 en células tumorales resultó frecuentemente de uno a dos logs más baja con respecto al Ad5 de tipo salvaje en las mismas células tumorales (Heise, C. et al., Clin Cancer Res 6(12):4908-4914 (2000); Goodrum, F. D. et al., Journal of virology 72(12):9479-9490 (1998)).
Los ensayos clínicos que usan ONYX-015 en una diversidad de neoplasias, incluyendo cáncer de cabeza, cuello, colon y recto, páncreas, pulmones y cerebro han demostrado que este virus oncolítico se toleró bien cuando se administró de manera individual o con quimioterapia (Heise, C. et al., Nat Med 3(6):639-645 (1997); Galanis, E. et al., Gene Ther 12(5):437-445 (2005); Chiocca, E. A. et al., Mol Ther 10(5):958-966 (2004); Hecht, J. R. et al., Clin Cancer Res 9(2):555-561 (2003); Reid, T. et al., Cancer Res 62(21):6070-6079 (2002); Vasey, P. A. et al., J Clin Oncol 20(6):1562-1569 (2002); Reid, T. et al., Gene Ther 8(21):1618-1626 (2001); Nemunaitis, J. et al., J Clin Oncol 19(2):289-298 (2001); Kirn, D. Gene Ther 8(2):89-98 (2001); Nemunaitis, J. et al., Gene Ther 8(10):746-759 (2001)). Sin embargo, las respuestas clínicas objetivas a continuación de la administración de ONYX-015 resultaron poco comunes dando lugar a preocupaciones en cuanto a que este virus, al tiempo que se tolera bien mediante administración intratumoral, intravenosa e incluso intraarterial, carecía de potencia suficiente para aplicarse de manera general como un agente terapéutico (Kirn, D. Gene Ther 8(2):89-98 (2001)). La titulación viral baja para ONYX-015 en diversas lineas celulares en comparación con Ad5 de tipo salvaje dio lugar a preocupaciones en cuanto a que la potencia de ONYX-O15 no resultaba suficiente para encontrarse clínicamente activo como un agente anticancerígeno. De manera adicional, E1a, la primera proteína producida por el virus, no se encontraba bajo control selectivo de tumor, permitiendo la expresión de esta proteína viral potente en células normales, así como células tumorales. Debido a que la función de E1a consiste en facilitar la entrada de células a la división celular, un virus oncolítico tendría de manera óptima ambas E1a y E1b bajo control selectivo de tumor.
El trabajo exhaustivo se ha dirigido al desarrollo de un virus selectivo de tumor con potencia antitumoral mejorada cuando se compara con ONYX-015. Un enfoque que se ha adoptado para fabricar virus oncolíticos ha consistido en insertar elementos promotores selectivos de tumor secuencia arriba de unidades de transcripción críticas incluyendo E1a, E1b y E4 (Li, Y. et al., Clin Cancer Res 11(24 Pt 1):8845-8855 (2005); Huang, T. G. et al., Gene Ther 10(15):1241-1247 (2003); Wirth, T. et al., Cancer Res 63(12):3181-3188 (2003); Gu, J. et al., Gene Ther 9(1):30-37 (2002); Johnson, L. et al., Cancer Cell 1(4):325-337 (2002); Li, X. et al., Cancer Res 65(5):1941-1951 (2005); Li, Y. et al., Mol Cancer Ther 2(10):1003-1009 (2003)). La incorporación de elementos promotores heterólogos, tales como el promotor para antígeno prostático específico (PSA), antígeno carcinoembrionario (CEA), E2F1 y telomerasa, ha alcanzado niveles de replicación selectiva de tumor variables. La utilidad clínica potencial de los virus que usan promotores heterólogos para proporcionar replicación selectiva de tumor se ha limitado por expresión génica no selectiva y permeable, capacidad disminuida de estos vectores para replicarse en comparación con el virus de tipo salvaje y eventos de recombinación debido a la secuencia de promotor heterólogo. Por ejemplo, ONYX-411 se desarrolló para mejorar la potencia de ONYX-015 mediante la inserción de la región promotora E2 F1 secuencia arriba de E1a y E4 (Johnson, L.
et al., Cáncer Cell 1(4):325-337 (2002)). Sin embargo, este virus no se ha desarrollado para uso clínico. En un esfuerzo para superar algunas de estas limitaciones de secuencias potenciadoras heterólogas, se ha evaluado la región de control transcripcional viral nativa para E1a para determinar si la replicación viral selectiva de tumor podía alcanzarse mediante ingeniería dirigida del potenciador de E1a nativo. La técnica anterior incluye WO0044922 que divulga adenovirus que se modifica para tener una eliminación en su región E1b, y una inserción de heterólogo en esta. Breve sumario de la invención
La invención a la que la presente memoria se refiere se presenta en las reivindicaciones anexas a esta descripción. Se proporciona en la presente secuencias modificadas que pueden usarse de manera individual, o en combinación unas con respecto a otras, para proporcionar expresión de proteínas selectivas de tumor.
En un aspecto, un virus recombinante comprende una secuencia reguladora de E1a modificada, en el que se elimina al menos un sitio de unión a Pea3, o una porción funcional de este. En un aspecto, se retiene al menos un nucleótido en el intervalo de -305 a -141.
En un aspecto, se elimina al menos uno de Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV, y Pea3 V, o una porción funcional de estos. En otro aspecto, se elimina al menos uno de Pea3 II y Pea3 III, o una porción funcional de este. En un aspecto, se elimina Pea3 II, o una porción funcional de este, y Pea3 III o una porción funcional de este. En otro aspecto, se elimina al menos uno de Pea3 IV y Pea3V, o una porción funcional de este. En otro aspecto, se retiene Pea3 I, o una porción funcional de este.
En un aspecto, se retiene al menos un sitio de unión a E2F, o una porción funcional de este.
En un aspecto, el vector es dl309-6, TAV-255, dl55, dl200, dl230, o dl200+230. En otro aspecto, el vector es TAV-255. En un aspecto, un virus recombinante expresa de manera selectiva al menos una isoforma de E1a, por ejemplo, Ela-12S o E1a-13S. En otro aspecto, el virus recombinante excluye de manera sustancial la expresión de una isoforma de E1a, por ejemplo, la otra de E1a-12S o E1a-13S que no se expresa de manera selectiva. En un aspecto, la secuencia que codifica la isoforma de E1a se une de manera operativa a una secuencia reguladora de E1a modificada, en el que se elimina al menos un sitio de unión a Pea3, o una porción funcional de este.
En un aspecto, un virus recombinante comprende una secuencia de ADN, por ejemplo, un transgen, que se inserta en un sitio de inserción de E1b-19K. En un aspecto, el sitio de inserción se ubica entre el sitio de inicio de E1b-19K y el sitio de inicio de E1b 55K. En otro aspecto, el sitio de inserción comprende una eliminación de 202 pares de bases a continuación del sitio de inicio de E1b-19K.
En un aspecto, el transgen es una secuencia que codifica factor de necrosis tumoral, o una porción funcional de este. En otro aspecto, el transgen es una secuencia que codifica kras, o una porción funcional de este. En otro aspecto, el transgen se une de manera operativa a una secuencia reguladora de E1a, en el que se elimina al menos un sitio de unión a Pea3, o una porción de este.
En cualquiera de estos aspectos, el virus recombinante puede ser un adenovirus. En otro aspecto, una célula se transforma con uno cualquiera de estos virus recombinantes.
En otro aspecto, un método que expresa un péptido de manera selectiva en una célula diana que comprende poner en contacto la célula diana con uno cualquiera de estos virus recombinantes. En un aspecto, el virus recombinante comprende una secuencia reguladora de E1a mutante por eliminación que se une de manera operativa a una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido, por ejemplo, un péptido que se asocia con replicación viral o con cáncer.
En un aspecto, la célula diana es una célula neoplásica. En otro aspecto, la célula diana es una célula normal.
El método puede ponerse en práctica in vivo o in vitro. En un aspecto, el virus se administra mediante inyección intramuscular, intravenosa, intraarterial, o intratumoral.
Breve descripción de las figuras
Eliminaciones de la región de control transcripcional de E1a
Figura 1. Expresión de proteína E1A de adenovirus en fibroblastos pulmonares y células cancerosas infectadas con Wt Ad5. Las líneas celulares de fibroblastos pulmonares primarios y células cancerosas en reposo se infectaron con Wt Ad5 a una multiplicidad de infección (MOI) de 5 y las proteínas se extrajeron a diversas horas después de las infecciones (h.p.i.) y se analizaron para expresión de E1A. (A) Expresión de proteína E1A en líneas celulares en reposo (MRC-5 e IMR-90) y líneas celulares cancerosas (A549 y PANC-1). (B) Expresión de E1A en diversas líneas celulares tumorales (AsPC-1, LNCaP, HeLa, y Calu-6. Diversas variantes de empalme de proteína E1A con residuos de aminoácidos (R): 289R, 243R, y 55R se muestran mediante flechas. La p-tubulina (control de carga) se indica al lado de las transferencias western. Los cursos de tiempo se indican en la parte superior del panel, y las líneas celulares se indican a la izquierda de cada transferencia.
Figura 2. Inducción de ARNm de E1A en células (a) MRC-5, (b) A549, y (c) PANC-1 infectadas (MOI 5) a diversas horas después de la infección. El aumento de veces en la expresión de E1A se calculó con respecto a la expresión de Wt Ad5 e 1a en líneas celulares de MRC5 a 6 h.p.i.
Figura 3. Expresión de luciferasa a partir de un plásmido reportero (pE1P/EGL3), que se conduce por promotor/potenciador de adenovirus de e 1a (+143 to 552). Se transfectaron las células con plásmido reportero, y se obtuvieron los valores de luminiscencia de cada una de las líneas celulares. Los resultados constituyen un promedio de muestras duplicadas y representan tres experimentos independientes. Los valores de luminiscencia (log) se indican en el eje Y, y las líneas celulares se indican en el eje X.
Figura 4. (A) Presentación esquemática de región de control secuencia arriba de unidades de transcripción E1A de Ad5. El sitio de inicio de la transcripción (+1), región potenciadora (-305 a -141), y región ITR (-498 a -395) se indican en la parte superior. Los sitios de unión a factores de transcripción para Pea3 y E2F1 se indican mediante flecha pequeña y estrella, respectivamente. Los virus mutantes por eliminación y su eliminación que integra nucléotidos se indican a la izquierda mediante barra sólida y la región se indica en su parte superior. El nombre de cada virus mutante se indica a la izquierda de su diagrama esquemático. (B) Expresión de la proteína E1A en MRC-5 y células A549 que se infectan con Wt Ad5 y virus mutantes. Las células se infectaron con virus individuales con un MOI de 5 y proteínas se cosecharon a las 24 h.p.i. Diversas variantes de empalme de EA1 con residuos de aminoácidos (R); 289R, 243R, y 55R se muestran mediante flecha. La p-tubulina (control de carga) se indica al lado de las transferencias western. Las líneas celulares se indican a la izquierda de cada transferencia. (C) Ensayo de curso de tiempo para expresión de E1A por Wt Ad5 y TAV-255 en células MRC-5 y A549. Las células se infectaron con MOI de 5 y las proteínas se cosecharon a las horas después de la infección que se indican. Los virus se indican en la parte superior de línea sólida, y las diversas variantes de empalme de proteína EA1 con residuos aminoácidos (R): 289r , 243R, y 55R se muestran mediante flecha. La p-tubulina (control de carga) se indica al lado de las transferencias western.
Figura 5. Inducción de ARNm de E1A en células (a) MRC-5 y (b) A549 infectadas (MOI 5) a las 24 h después de la infección se determinó mediante Q-PCR en tiempo real. La expresión de E1A, aumento o disminución de veces, se calculó con respecto a Wt Ad 5.
Figura 6. Análisis de transferencia western de proteínas E1A y E1b de adenovirus en líneas celulares que se infectan con diversos adenovirus. (a) se infectaron líneas celulares cancerosas (A549 y Panc-1) con virus con un MOI de 5 y se recolectaron proteínas 24 h.p.i. Pequeñas flechas indican expresión de variantes de empalme de E1A, los virus se indican en la parte superior de la transferencia, y las líneas celulares se indican en la parte superior de la barra sólida. (b) Análisis de transferencia western de proteína E1B-55kDa de adenovirus en células MCR-5 y A549 (MOI 5) que se infectan con Wt Ad5, Onyx-015 y TAV-255. Las muestras de proteínas se recolectaron 24 h.p.i. y se probaron con anticuerpo monoclonal de E1B. Una flecha pequeña indica el tamaño correcto de la proteína E1B 55kDa; otras bandas resultan no específicas. Los virus se indican en la parte superior de la transferencia.
Figura 7. Inhibición de crecimiento de células normales y células tumorales por mutantes de Ad 5. (a) línea celular normal MRC-5 y (b) líneas celulares tumorales (A549, HeLa y Calu-6) se infectaron con Wt Ad5/TAV-255/Onyx-015 a un MOI de 5, y el ensayo de viabilidad de células se llevó a cabo usando CCK-8 después de 6 días posteriores a la infección. Los resultados representan la media /- DS (barra de error) de experimentos por triplicado y que se expresan como células de control que se tratan con PBS. (c) células MRC-5 se infectaron con Wt Ad5 o TAV-255 con un MOI de 5, y las células que se trataron con PBS sirvieron como control. Los virus de células tratadas y sin tratar (control) se fotografiaron a los 6 días después de la infección.
Figura 8. Mutantes por eliminación de expresión de dl309 y E1a en células MRC-5. (A) Presentación esquemática de región de control secuencia arriba de unidad de transcripción E1a de HAd-5. El sitio de inicio de la transcripción (+1), la región potenciadora (-305 a -141) y la región ITR (-498 a -395) se indican en la parte superior. Cinco sitios de unión a Pea3 en el genoma de dl309 se indican mediante flecha, y dos sitios de unión a E2F se indican mediante estrella. Los virus mutantes por eliminación y sus nucleótidos que se integran se indican mediante barra sólida y los nucleótidos se indican en su parte superior. El nombre de los virus mutantes se indica a la izquierda con respecto al diagrama esquemático. (B) Análisis de transferencia blot de proteínas E1a que se extraen de células MRC-5 que se infectan con virus mutantes después de las 24 h.p.i.; la p-tubulina (control de carga) se muestra por debajo de la transferencia de E1a (C) Cuantificación relativa de ARNm de E1a que se produce por adenovirus mutantes en células MRC-5 a las 24 h.p.i.
Figura 9. Expresión de E1a en células A549 que se infectan con adenovirus mutantes. (A) se infectaron células con adenovirus mutantes y se recolectó proteína 8 y 24 h.p.i y se probó con antisueros específicos para E1a; la p-tubulina (control de carga) se muestra también. (B) Análisis mediante Q-PCR relativo de ARNm de E1A que se produce en células A549 que se infectan con mutantes Had-5 a las 8 h.p.i..
Figura 10. Adenovirus mutantes por eliminación en TAV-255 y expresión de E1a en células MRC-5. (A) Presentación esquemática de TAV-255 que integra un sitio E2F1 y dos sitios Pea3 II y III. La eliminación de seis pares de bases en TAV-255 se muestra mediante color negro sólido y sus nucleótidos que se integran se indican en la parte superior. El nombre de cada virus se indica a la izquierda con respecto al diagrama esquemático; dl200 retira sitio III de unión a Pea3, dl212 retira el sitio de unión a E2F, dl220 retira nucleótidos de 6 pb (como control), dl230 retira el sitio II de unión a Pea3, y dl200+230 retira el sitio II+III de unión a Pea3. (B) Análisis de transferencia western de proteína E1a que se expresa mediante diversos virus mutantes 48 h.p.i.; la p-tubulina (control de carga) se muestra por debajo de la transferencia de E1a (C) Análisis mediante Q-PCR relativo de ARNm de E1a en células que se infectan con diversos mutantes de adenovirus a las 24 h.p.i..
Figura 11. Virus mutantes por eliminación de E2F y expresión de E1a en células MRC-5. (A) Presentación esquemática de sitios E2F que se muestran como estrella en la región potenciadora de E1a y sus nucleótidos que se integran se muestran en la parte superior. Los nombres de virus mutantes se indican a la izquierda con respecto al esquema; dl 212 y dl275 tienen eliminación de sitio E2F individual, dl212+275 tienen ambos eliminación de sitios E2F y dl220 se realiza como control. (B) Análisis de transferencia western de proteína E1a que se expresa en células que se infectan con diversos mutantes de adenovirus 24 h.p.i.; la p-tubulina se muestra como un control de carga (C) Q-PCR relativa para expresión de ARNm de E1a en células que se infectan con diversos mutantes de adenovirus a las 24 h.p.i..
Figura 12. Expresión de proteína E1a en diversas líneas celulares no transformadas y transformadas que se infectan con adenovirus. (A) Líneas celulares no transformadas; (a) MRC-5, (b) IMR-90, y (c) WI-38 y (B) Líneas celulares transformadas; (e) HeLa, (f) Panc-1, y (g) Calu-6 se infectaron con dl309/dl200+230 y la proteína se cosechó a la hora después de la infección que se indica y se analizó mediante transferencia western para expresión de E1a.
Figura 13. Actividad oncolítica in vitro (A) se infectaron líneas celulares transformadas (A549, HeLa, Panc-1 y Calu-6) y líneas celulares no transformadas (MRC-5) con virus; Wt HAd-5, y adenovirus dl200+230 y se evaluaron en cuanto a su viabilidad usando kit CCK-8 después de 4 días y 5 días posteriores a la infección, respectivamente. (B) se analizaron efectos citopáticos de diversos adenovirus mediante ensayo con violeta en células MRC-5 que se infectaron a MOI indicado y se tiñeron después de 5 días posteriores a la infección.
Figura 14. Se cultivaron células WI-38 no transformadas y se infectaron luego con Ad5 o TAV-255 a un MOI de 10. Se colocaron células de control sin infectar y células infectadas a los 7 días posteriores a la infección, se tiñeron con violeta cristal y se fotografiaron con aumento de 40x. Las imágenes demuestran una monocapa de células uniforme sin evidencia de citolisis viral en las células de control y células que se tratan con TAV-255. En cambio, se observa citolisis extensa para las células que se trataron con Ad5.
Figura 15. Las células A549 transformadas se cultivaron para converger e infectar luego con Ad5 o TAV-255 a un MOI de 10. Se colocaron células de control sin infectar y células infectadas en los 3 días posteriores a la infección, se tiñeron con violeta cristal y se fotografiaron con aumento de 40x. Las imágenes demostraron una monocapa de células uniforme sin evidencia de citolisis viral en las células de control. En contraste, se observa citolisis exhaustiva para las células que se trataron con Ad5 y con TAV-255.
Expresión selectiva de isoformas de E1a 12s y 13s
Figura 16. Curso de tiempo de expresión de E1a a continuación de infección con Ad5 de tipo salvaje (WT) y adenovirus PM975 en (A) WI-38 y (B) células MRC-5 (MOI=5).
Figura 17. Expresión de E1a en (A) A549 y (B) Panc 1.
Figura 18. A) Curso de tiempo de expresión de E1a en (a) células WI-38 y (b) células MRC-5 (MOI=5). B) Curso de tiempo de expresión de E1A en (c) células A549 y (d) células Panc-1 (MOI=5).
Figura 19. Curso de tiempo de expresión de E1A en A) células WI-38 y B) células A549 (MOI=5).
Figura 20. Expresión de E1a en células WI-38 de crecimiento detenido que se infectan con Ad5, TAV, y TAV-13s para E1a a las 48 y 72 horas (MOI=5).
Figura 21. Viabilidad de células a continuación de la infección con dl309, PM975, dl1520 o dl1520 en células WI-38 a los 7 días después de la infección a MOI de 30 y A549, Panc-1, LnCap y Hep3b a los 5 días después de la infección a MOI de 3.
Figura 22. Expresión de E1a en A549 a MOI de 2: se infectaron células A549 con Ad5, TAV, PM975 (13s) o 13sTAV a un MOI de 2. Se aisló la proteína a partir de células infectadas a las 24 y 48 horas después de la infección y se analizó para expresión de E1a mediante transferencia western. La expresión de ARNm de 13S E1a (289R) se observa en todos los carriles a aproximadamente igual nivel de abundancia y constituye la única forma que se observa en el virus que se restringe a la expresión de 13S (PM975) y 13S-TAV. Esto demuestra que la introducción de la eliminación del potenciador según se muestra (TAV y 13s-TAV) da como resultado una reducción no significativa en lo que se refiere a la expresión de E1a-289R.
Figura 23. Expresión de E1a en WI138 a MOI de 2: se infectaron células WI-38 de crecimiento detenido con Ad5, TAV-255 (TAV), PM975 (solo expresión de 13S), y 13S-TAV (eliminación del promotor de TAV-255 y restricción de expresión a 13S). Se extrajo la proteína de células a las 24 y 48 horas después de la infección y se analizó para expresión de E1a mediante transferencia western. La expresión de las formas 289R y 243R de E1a se observa a las 48 después de la infección en las células que se infectan con Ad5 y en menor grado (TAV). No se observa expresión de E1a detectable en células que se infectan con PM975 o 13S-TAV.
Inserción de clon E1b 19K
Figura 24. Organización de la región E1 de adenovirus tipo 5. E1b-19k y E1b-55k derivan de secuencias de solapamiento mediante variantes de empalme de ARNm. Los primeros 202 nucleótidos de E1b-19k se eliminaron después de que el sitio de inicio de E1b e inserciones de ADN se clonaran en este sitio dentro del marco sin alteración del sitio de inicio de E1b-55k.
Figura 25. Esquema de las regiones E1a y E1b con el sitio de inserción de E1b-19k que se muestra.
Figura 26a y b. Se demuestra la secuencia de TNF de membrana estabilizada que se inserta de manera selectiva en la región E1b-19k de Ad5.
Figura 27. Se demuestra la secuencia de la eliminación de 50 pares de bases en el promotor de E1a dando como resultado un vector con una eliminación en E1b-19k y la eliminación del promotor de t AV-255.
Figura 28. Expresión de TNF en superficie de células tumorales a continuación de la infección con AD19kTNF. Figura 29. Ensayo de citotoxicidad en MRC5 (A) 3 días después de la infección y (B) 5 días después de la infección. Figura 30. Ensayo de citotoxicidad en A549 (A) 3 días después la infección y (B) 5 días después de la infección. Figura 31. Ensayo de citotoxicidad en Panc1 (A) 3 días después la infección y (B) 5 días después de la infección. Figura 32a-c. Análisis de expresión de TNF en superficie mediante AdTAV19kmmTNF usando citometría de flujo. Figura 33. Ensayo con violeta cristal en SK-Mel-28 (melanoma) tres días después de la infección.
Figura 34. Activación de caspasa-3 en células Hep3b que se infectan con Ad19k o AdTAV19TNF a un MOI de 5, 48 horas después de la infección.
Figura 35. Expresión de E1b-55kD en AD-A19kD-kras/TAV a MOI de 2, 48 horas después de la infección.
Figura 36. Amplificación mediante PCR de GFP y promotor de E1A de lisado de transfección de Ad19kTAVhrGFP. Figura 37. Expresión de GFP en A549 que se infecta a MOI de 2 con Ad19kTAVGFP.
Descripción detallada
I. Abreviaciones y definiciones
Las abreviaciones que se usan en la presente tienen su significado convencional en las técnicas químicas y biológicas. Para facilitar la referencia, las abreviaciones que se usan en la presente son según se definen a continuación:
Wt Ad5: adenovirus tipo 5 de tipo salvaje
MOI: multiplicidad de infección
hpi: horas después de la infección
Las líneas celulares neoplásicas que se referencian en la presente incluyen:
A549: cáncer pulmonar
PANC-1: cáncer pancreático
AsPC-1: cáncer pancreático
LNCaP: cáncer de próstata
HeLa: cáncer de cuello uterino
Calu-6: cáncer de pulmón
SK-Mel-28: melanoma
Las líneas celulares no neoplásicas que se referencian en la presente incluyen líneas celulares de fibroblastos pulmonares respiratorios MRC-5, WI-38, e IMR-90. La línea celular HEK-293A comprende células de riñón embrionario humano que se transforman con E1 de adenovirus.
Los mutantes por eliminación que se usan en la presente se caracterizan por la eliminación de los nucleótidos que se indican a continuación. Los sitios de unión que se ven afectados por la eliminación se muestran en paréntesis. dl309: -498 a -395, -305 a -141
dl309-6: -393 a -304 (Pea3 V y Pea3 IV)
dl340-12: -145 a -44
TAV-255: -305 a -255 (Pea3 III, E2F II, Pea3 II)
dl87: -201 a -195 (Pea3 I)
dl55: -270 a -240 (Pea3 II)
dl275: -225 a -218 (E2F I)
dl200: -299 a -293 (Pea3 III)
dl212: -287 a -281 (E2F II)
dl220: -280 a -275
dl230: -270 a -265 (Pea3 II)
dl200+230: -299 a -293 (Pea3 III), -270 a -265 (Pea3 II)
dl212+275: -287 a -281 (E2F II), -225 a -218 (E2F I)
Los términos “un” o “una”, según se usan en la presente se refieren a uno o más, a menos que se indique de manera específica como singular.
II. Investigación de eliminaciones en la región de control transcripcional de E1a
E1a es el primer gen que se expresa después de la infección con HAd-5 y resulta esencialmente requerido para una replicación del virus exitosa (Gaynor, R. B., y Berk, A. J. (1983). Cis-acting induction of adenovirus transcription. Cell 33: 683-693). La región de control transcripcional de E1a de adenovirus tiene múltiples elementos reguladores que incluyen dos sitios de union para E2F1 y cinco sitios de unión para Pea3 (Bruder, J. T. et al., J Virol 65(9):5084-5087 (1991)). Estos factores de transcripción se expresan comúnmente de manera aberrante en células tumorales (de Launoit, Y. et al., Adv Exp Med Biol 480:107-116 (2000); Hanahan, D. et al., Cell 100(1):57-70 (2000)). Debido a que existen múltiples sitios de unión para estos factores de transcripción, se intenta determinar si algunos de estos sitios de unión resultaron críticos para expresión de E1a eficiente en células normales, pero no en células tumorales. Se observó que el ARNm de E1a y la proteína se expresan en tiempos más cortos y a mayores niveles en células tumorales en comparación con células no transformadas que se infectan con Adenovirus 5 humano (Ad5). Para comprender el mecanismo de este efecto, se evaluó el impacto de una serie de pequeñas eliminaciones a lo largo de la región de control transcripcional de E1a en la expresión de E1a en células tumorales y células epiteliales respiratorias transformadas. Diversas eliminaciones en la región secuencian arriba del sitio de iniciación de E1a redujeron la expresión de E1a en células epiteliales respiratorias no transformadas mientras que tuvieron impacto mínimo en la expresión de E1a en células tumorales. En particular, el TAV-255 que tiene una eliminación de una región de 50 pares de bases que se ubican de -305 a - 255 secuencia arriba del sitio de iniciación de E1a dio como resultado reducción marcada de expresión de ARNm de E1a y de proteína en células no transformadas, mientras que retuvo expresión de E1a similar a Wt Ad5 en células tumorales. De manera adicional, esta eliminación de 50 pb dio como resultado expresión de E1b marcadamente disminuida mientras que retuvo niveles de E1b cercanos a lo normal en células tumorales. A pesar de que se encuentran altamente atenuados en células no transformadas, TAV-255 resulta similar a Ad5 de tipo salvaje en cuanto a la expresión de E1a y E1b y actividad citolítica en líneas celulares tumorales.
El ARNm de E1a y la proteína se inducen más temprano y en mayor abundancia en células tumorales en comparación con células no transformadas. La región de control transcripcional nativa de Ad5 tiene sitios de unión para factores de transcripción que se sobreexpresan comúnmente en células tumorales que incluyen sitios de unión para E2F1, Sp1 y Pea3. Por consiguiente, la regulación de la expresión de E1a puede resultar diferente en células tumorales en comparación con células no transformadas. Para evaluar esta posibilidad, se usó Ad5 de tipo salvaje para infectar células tumorales y células no transformadas (MOI=5) y la expresión de la proteína E1a se evaluó en varios momentos después de la infección de las células. Los resultados (Fig. 1a) demuestran que la expresión de E1a se detecta en más temprano y en mayor abundancia en líneas celulares tumorales (A549 y PANC-1) en comparación con células epiteliales respiratorias no transformadas (MRC-5 y IMR-90). La expresión abundante de proteína E1a se observa de 6 a 8 horas después de la infección (h.p.i.) en las líneas celulares tumorales mientras que no se observa expresión detectable de E1a en estos tiempos en las líneas celulares epiteliales respiratorias no transformadas MRC-5 y IMR-90. A las 24 horas después de la infección de E1a (289R y 243R, que corresponden a las especies de ARNm 13s y 12s, respectivamente) se observa en ambas MRC-5 y IMR-90 en niveles comparables. Sin embargo, la cantidad de E1a (55R, 243R y 289R) que se detecta en las células tumorales mediante transferencia western excede la cantidad que se observa en las células no transformadas en gran cantidad. La abundancia de E1a que se observa en las células tumorales a las 8 horas después de la infección resulta comparable con la abundancia de E1a que se observa en las células no transformadas a las 24 horas después de la infección. Para evaluar este efecto de manera adicional, el comienzo y abundancia de la expresión de E1a se evaluaron en un panel de líneas celulares tumorales (Fig. 1b) incluyendo células AsPc-1 y PANC-1 (pancreáticas), Calu-6 (pulmonares), LNCaP (prostáticas) y HeLa (cervicales). En cada una de estas líneas celulares, la expresión de E1a se detecta de 6 a 8 horas después de la infección en las células transformas y la cantidad de E1a que se observa en las células transformadas a las 6 a 8 horas después de la infección resulta comparable con respecto a aquella de E1a que se observa en las células no transformadas a las 24 horas después de la infección (Fig. 1a).
La expresión de ARNm de E1a ocurre más temprano y resulta más abundante en células tumorales en comparación con células no transformadas mediante PCR cuantitativa. Ocurren aumentos detectables en ARNm de E1a en células A549 y PANC-1 en 2 a 4 horas de infección y se excede la expresión en células MRC-5 cerca de 6 veces (Fig. 2). Durante 8 a 24 horas, la expresión de E1a en las células transformadas excede la expresión de E1a en células MRC-5 en gran cantidad de (40 veces a 70 veces). Estos resultados demuestran de manera adicional que la transcripción de E1a resulta más eficiente en células tumorales en comparación con células no transformadas dando como resultado expresión temprana y abundante de E1a en células tumorales después de la infección con Ad5.
Para evaluar la transcripción del potenciador/promotor de E1a de manera adicional, se transfectó un reportero plasmídico con luciferasa en lugar de E1a en células transformadas y no transformadas. La luminiscencia se cuantificó a las 24 y 48 horas después de la transfección. Los ensayos que se llevaron a cabo después de 24 h de transfección dieron como resultado expresión de luciferasa no detectable en líneas celulares MRC5 mientras que líneas celulares cancerosas mostraron mejora de la expresión de luciferasa en 1000 veces en comparación con los valores de control (datos no se muestran). La expresión de luciferasa detectable se observó en células MRC-5 y IMR-90 (fibroblasto pulmonar) a las 48 horas después de la transfección, pero permaneció aproximadamente de 100-1000 veces menor con respecto a la expresión de luciferasa en las líneas celulares cancerosas (Fig. 3). La expresión de renilla se midió además y sirvió como un control para determinar la eficiencia de transfección entre líneas celulares.
Se prepararon mutantes por eliminación de la región de control de transcripción de E1A, y se analizó la expresión de E1A en células tumorales y no transformadas. Para determinar si existieron diferencias entre el control transcripcional de E1a entre células tumorales y no transformadas, se evaluó la expresión de E1a en células tumorales y no transformadas usando construcciones de adenovirus con diversas eliminaciones en la región de control secuencia arriba para E1a, Figura 4a. Los resultados de la expresión de E1a en células no transformadas (MRC-5) y células transformadas (A549) de cada uno de estos vectores de eliminación se muestran en la Figura 4b. Los resultados demuestran que ninguna de las eliminaciones tuvo un impacto de manera significativa en la expresión de E1a en células A549. Sin embargo, los virus mutantes por eliminación, dl309-6 y TAV-255, dieron como resultado reducciones de la expresión de E1a en células MRC-5. En particular, la eliminación que abarca la región de -305 a -255, dio como resultado una pérdida casi completa de la expresión de E1a de células MRC-5 pero no tuvo un impacto mensurable en la expresión de E1a de células A549. Esta eliminación proporcionó la mayor diferencia de expresión de E1a entre las células no transformadas y transformadas. Para evaluar este efecto de manera adicional, se comparó la expresión de la proteína E1a en el tiempo a continuación de la infección de células MRC-5 y A549 con Ad5 de tipo salvaje y TAV-255, Figura 4c. Estos resultados demuestran expresión de E1a abundante en líneas celulares A549 a continuación de la infección con ambos vectores. Sin embargo, la expresión de E1a se redujo de manera drástica en las células MRC-5 no transformadas a continuación de la infección con TAV-255.
La expresión de ARNm de E1A a partir de mutantes potenciadores se analizó mediante PCR cuantitativa. Se caracterizó la expresión de ARNm de E1A de manera adicional a continuación de la infección de células MRC-5 y A549 con Ad5 de tipo salvaje, TAV-255, y dl87, que tiene una eliminación que retira el sitio Pea3 individual que se ubica más proximal con respecto al sitio de inicio de E1a. La expresión de ARNm de E1a se redujo de 20-30 veces en células MRC-5 infectadas con TAV-255 en comparación con Ad5 de tipo salvaje y dl87. Sin embargo, la expresión del ARNm de E1a resulta aproximadamente equivalente en células A549 que se infectan con cada uno de estos virus (Fig. 5).
Onyx-015 y TAV-255 se compararon con respecto a la expresión de E1a y E1b. Onyx-015 tiene una eliminación del gen E1b-55k viral pero no tiene modificación para restringir la expresión de E1a en células no transformadas. La Figura 6a demuestra niveles comparables de expresión de E1a en células A549 y Panc-1 que se infectan con Ad5, TAV-255 y Onyx-015. Para determinar el impacto de TAV-255 en la expression de E1b, se evaluó la expresión de proteína en células MRC-5 y A549. Los resultados que se muestran en la Figura 6b demuestran que la expresión de E1b de TAV-255 se redujo en células MRC-5 en comparación con Ad5. Onyx-015 que tiene una eliminación de E1b-55k, tiene expression de E1b no detectable. En contraste, E1b-55k se expresa a niveles similares en células tumorales de ambos Ad5 y TAV-255 y se encuentra ausente en las líneas celulares tumorales que se infectan con Onyx-015. Estos resultados demuestran atenuación funcional de la expresión de E1b en células no transformadas mientras que la expresión de E1b se retiene aproximadamente en niveles de tipo salvaje en células tumorales.
Se evaluó el efecto de TAV-255 en la viabilidad de células. Las células MRC-5, A549, HeLa y CaLu-6 se infectaron con Ad5 de tipo salvaje, Onyx-015, y TAV-255. El Ad5 de tipo salvaje eliminó células MRC-5 de manera efectiva en este ensayo; donde ambos Onyx-015 y TAV-255 demostraron citotoxicidad mínima hacia células MRC-5 (Figura 7a). En contraste, la citotoxicidad de TAV-255 resultó comparable con respecto a Ad5 de tipo salvaje en tres líneas celulares tumorales (A549, HeLa y CaLu-6) y resultó mejor de manera significativa en comparación con la de Onyx-015 en ambas células A549 y HeLa (Fig. 7b). Una microfotografía de células MRC-5 que se infectan con virus de tipo salvaje y TAV-255 (Figura 7c) demuestra eliminación celular esencialmente completa de células MRC-5 con Ad5 de tipo salvaje mientras que se observa citotoxicidad mínima con TAV-255, 6 días después de la infección. Se observó citotoxicidad completa para células A549 que se infecta con ya sea Wt Ad5 O tav-255 (datos no se muestran).
ONYX-015 constituye el prototipo de un virus oncolítico y se ha sometido a pruebas clínicas en una diversidad de neoplasias que incluyen cánceres de cabeza y cuello, pulmón, colon y recto, ovario, páncreas y cerebro. Más de 1000 inyecciones intratumorales de ONYX-015 se administraron a pacientes con tumores de cabeza y cuello y más de 200 infusiones se administraron en la arteria hepática de pacientes con cáncer colorrectal metastásico sin tratamiento serio con respecto a eventos adversos (Reid, T. et al., Cancer Res 62(21):6070-6079 (2002); Nemunaitis, J. et al., Gene Ther 8(10):746-759 (2001); Khuri, F. R. et al., Nat Med 6(8):879-885 (2000); Nemunaitis, J. et al., Cancer Gene Ther 10(5):341-352 (2003); Nemunaitis, J. et al., Cancer Gene Ther 14(11):885-893 (2007) Reid, T. R. et al., Cancer Gene Ther 12(8):673-681 (2005)). Los efectos secundarios primarios son síntomas similares a los de la gripe grado I/II incluyendo fiebres y escalofríos. Mientras que se tolera bien, las tasas de respuesta objetiva a ONYX-015 se restringieron a una minoridad de pacientes. Debido a que las tasas de respuesta objetiva a ONYX-015 resultaron modestas, se han dirigido esfuerzos para desarrollar un vector oncolítico con potencia mejorada (Kirn D. Oncogene 19(56):6660-6669 (2000); Li, Y. et al., Clin Cancer Res 11(24 Pt 1):8845-8855 (2005); Johnson, L. et al., Cancer Cell 1(4):325-337 (2002); Hermiston, T. Current opinion in molecular therapeutics 8(4):322-330 (2006)). Se han usado diversos enfoques para mejorar la selectividad de tumor y potencia de virus oncolíticos, incluyendo esfuerzos para colocar E1a y E1b bajo el control de diferentes promotores heterólogos específicos de tumor. Sin embargo, estos vectores han sufrido transcripción permeable de E1a y E1b en células no transformadas, recombinación y potencial de replicación bajo en comparación con Ad5 de tipo salvaje.
Para superar algunas de las limitaciones inherentes en el uso de promotores heterólogos para controlar la expresión de E1a y E1b, se centra la atención en el análisis del promotor de adenovirus endógeno y potenciador para E1a. Se encontró que el comienzo de la expresión de ARNm de E1a y de proteína ocurría más temprano y resultaba más abundante en líneas celulares tumorales en comparación con células epiteliales respiratorias. Se observó expresión temprana y abundante de E1a en una diversidad de líneas celulares tumorales incluyendo líneas celulares de cáncer de pulmón, páncreas, cuello uterino y próstata. La proteína E1a podía detectarse mediante transferencia western a las 6 a 8 horas después de la infección en el panel de células tumorales que se sometieron a prueba. La abundancia de expresión de E1a a las 6 a 8 horas después de la infección resultó similar a la expresión de E1a que se observó en dos líneas celulares epiteliales respiratorias no transformadas a las 24 horas después de la infección.
Para evaluar la expresión temprana y abundante de E1a en células tumorales de manera adicional, se estudió la expresión de E1a de virus con diversas eliminaciones en la secuencia de ADN secuencia arriba del sitio de inicio de E1a. Secuencias potenciadoras potencian la transcripción de manera independiente de la posición u orientación y se han descrito en una diversidad de sistemas incluyendo adenovirus (Hearing, P. et al., Cell 33(3):695-703 (1983)). Se identificaron secuencias de núcleo de 200 a 300 nucleótidos corriente arriba del sitio de inicio E1a que podrían potenciar la expresión de E1a independientemente de la posición u orientación (Hearing, P. et al., Cell 33(3):695-703 (1983)). Estudios anteriores han demostrado que eliminaciones de esta secuencia potenciadora de núcleo dio como resultado una reducción de 2 a 5 veces en la expresión de ARNm en células HeLa a las 5 horas después de la infección; sin embargo, estas eliminaciones tuvieron poco impacto en la expresión de ARNm a las 24 horas después de la infección y no tuvieron impacto en la replicación viral (Hearing, P. et al., Cell 33(3):695-703 (1983)). Sin embargo, los análisis anteriores del potenciador de E1a se llevó a cabo en células tumorales, principalmente células HeLa, en lugar de en células epiteliales respiratorias, las células huésped naturales para infecciones por adenovirus tipo 5. Los sitios de unión al factor de transcripción específico en la región potenciadora de Ad5 incluyen 2 sitios de unión para E2F1 y 5 sitios de unión para Pea3. Debido a que estos factores de transcripción sobreexpresan comúnmente en células tumorales funciones importantes del potenciador de E1a pueden encontrarse oscurecidas por el análisis del potenciador en el contexto de células tumorales en lugar de células epiteliales respiratorias.
Se ha extendido el análisis de la región potenciadora de adenovirus mediante la comparación del impacto de eliminaciones en la región secuencia arriba del sitio de inicio de E1a en la expresión de E1a en células tumorales y en células epiteliales respiratorias no transformadas. En consistencia con las publicaciones anteriores, se encontró que las eliminaciones de regiones grandes de la región potenciadora de E1a tienen poco impacto en la expresión de E1a y replicación viral en líneas celulares tumorales (Hearing, P. et al., Cell 33(3):695-703 (1983)). Sin embargo, se demuestra ahora que diversas eliminaciones, incluyendo eliminaciones por fuera de la región potenciadora que se define previamente tienen un impacto significativo en la expresión de E1a y replicación viral en células epiteliales respiratorias no transformadas. En particular, se encontró que la eliminación de una secuencia de 50 pares de bases del potenciador de Ad5 nativo que retira un sitio E2f1 y dos sitios Pea3 dio como resultado una supresión marcada de ARNm de E1a y E1b y expresión de proteína en células epiteliales respiratorias; sin embargo, esta eliminación tuvo poco impacto en la expresión de E1a en un panel de líneas celulares tumorales. Se demostró de manera adicional que la eliminación de una secuencia de 99 nucleótidos secuencia arriba del potenciador de E1a propuesto reduce de manera sustancial la expresión de E1a en células epiteliales respiratorias no transformadas mientras que tiene un impacto mínimo en la expresión de E1a de las líneas celulares tumorales que se someten a prueba. Esta región integra los dos sitios Pea3 secuencia arriba lo más alejada del sitio de inicio E1a. En contraste, una pequeña eliminación que retira el sitio Pea-3 lo más proximal con respecto al sitio de inicio de E1a no tuvo impacto significativo en la expresión de E1a en las células tumorales o en las células epiteliales respiratorias. Además, una eliminación de 101 nucleótidos de las regiones entre el potenciador y el sitio de inicio de E1a da como resultado un aumento del 22 al 30% en la expresión de E1a en células epiteliales respiratorias sin impactar de manera significativa en la expresión de E1a de células tumorales. Estos resultados demuestran que las eliminaciones que incluyen la región potenciadora tienen efectos profundos en la expresión de E1a en células epiteliales respiratorias que no se observan en células tumorales. De este modo, la región potenciadora de E1a de adenovirus resulta más compleja y abarca una región más grande cuando se analiza en células epiteliales respiratorias en lugar de células tumorales.
La eliminación de 50 nucleótidos de lo que abarca la región de -255 a -305 integra dos sitios de unión para Pea3 y un sitio de unión para E2f1 (Bruder, J. T. et al., J Virol 65(9):5084-5087 (1991)). Estos factores de transcripción se sobreexpresan comúnmente en una amplia variedad de tumores. E2f es un factor de transcripción específico de secuencia que forma un complejo con Rb y cumple roles críticos en la regulación de la progresión del ciclo celular y diferenciación celular. La fosforilación de RB mediante cinasas dependientes de ciclina da como resultado la liberación de EDF1 y activación transcripcional de genes que se involucran en replicación, reparación y recombinación de ADN (Johnson, D. G. et al., Front Biosci 3:d447-448 (1998); Muller, H. et al., Biochimica et biophysica acta 1470(1):M1-12 (2000)). La desregulación de la ruta de RB ocurre comúnmente en neoplasias y se aproxima al 100% en diversos tumores incluyendo cáncer de pulmón (Hanahan, D. et al., Cell 100(1):57-70 (2000)). Dos sitios de unión para E2F1 ocurren en la región de control para E1a. La eliminación que integra los dos sitios Pea3 más alejados del sitio de inicio de E1a tuvo solo un impacto moderado en la expresión de E1a. Sin embargo, la eliminación del sitio E2F distal junto con los dos sitios Pea3 que flanquean de inmediato el sitio E2F1 da como resultado reducción significativa de la expresión de E1a y replicación viral en las células no transformadas. Estos resultados sugieren que los sitios E2F1 y/o los Pea3 que se ubican en este fragmento de 50 pares de bases constituyen los sitios dominantes para el control de E1a en células respiratorias o que factores adicionales que han sido impactados por esta eliminación determinan la expresión de E1a.
Pea3 es un miembro de la familia de factores de transcripción Ets altamente conservados (de Launoit, Y. et al., Biochimica et biophysica acta 1766(1):79-87 (2006)). Pea3 se expresa normalmente durante embriogénesis y se involucra en eventos de remodelación de tejido, diferenciación y proliferación celular. Pea3 activa de manera transcripcional una variedad de genes que incluyen metaloproteinasas de matriz (MMPs), que funcionan para degradar la matriz extracelular durante eventos de remodelación normales. Pea3 se sobreexpresa comúnmente en una diversidad de cánceres incluyendo cáncer de mama, pulmón, colon, ovario e hígado donde se considera que la sobreexpresión de MMPs promueve metástasis (de Launoit, Y. et al., Adv Exp Med Biol 480:107-116 (2000); Hakuma, N. et al., Cancer Res 65(23):10776-10782 (2005); Boedefeld, W. M., 2nd et al., Mol Carcinog 43(1):13-17 (2005); Cowden, D. et al., Mol Cancer Res 5(5):413-421 (2007)). Estudios anteriores han demostrado que la unión cooperativa entre los sitios Pea3 aumenta la expresión de E1a (Bruder, J. T. et al., J Virol 65(9):5084-5087 (1991)). Por consiguiente, el impacto de sitios de unión al factor de transcripción específico y la cooperación entre estos sitios de unión puede resultar más evidente en células no transformadas donde los factores de transcripción son limitantes en comparación con células tumorales donde la expresión abundante de factores de transcripción puede anular la necesidad de unión cooperativa para potenciar la transcripción de E1a. La importancia relativa de los diversos sitios de unión a factores de transcripción, por sí solos y como un complejo, se encuentra bajo investigación adicional.
Nuestros resultados demuestran además que la expresión selectiva de tumor de la unidad de transcripción E1 b puede alcanzarse mediante modificación del potenciador de E1a. El promotor de E1b es un promotor relativamente simple que comprende una caja TATA y una caja GC, que se une al factor de transcripción específico de secuencia SP-1. Ambos dominios resultan necesarios para expresión eficiente de E1b (Wu, L. et al., Nature 326(6112):512-515 (1987)). Estudios anteriores han demostrado que E1b se expresa como una transcripción por translectura de E1a (Montell, C.
et al., Mol Cell Biol 4(5):966-972 (1984)). La terminación de la transcripción por translectura de E1b a partir de E1a mediante inserción de la secuencia de terminación de beta-globina dio como resultado expresión marcadamente reducida de E1b (Maxfield, L. F. et al., J Virol 71(11):8321-8329 (1997); Falck-Pedersen, E. et al., Cell 40(4):897-905 (1985)) mientras que la inserción de un promotor fuerte tal como el promotor CMV evita la necesidad de transcripción por translectura. Nuestros resultados demuestran que la expresión de E1b puede atenuarse de manera coordinada en las células epiteliales respiratorias no transformadas junto con E1a debido a la pequeña eliminación en el potenciador de E1a. Estos resultados son consistentes con transcripción de translectura de E1b ineficiente en células no transformadas. En contraste, ambos E1a y E1b se expresan en niveles cercanos al tipo salvaje en células A549, lo que indica transcripción de translectura de E1a eficiente en las células tumorales.
Debido a que E1b 55k es una proteína multifuncional crítica para replicación viral, la atenuación selectiva de tumor de la expresión de esta proteína en lugar de la eliminación de este gen puede mejorar la potencia de este virus en células tumorales mientras que retiene un alto grado de atenuación en células no transformadas debido a la expresión reducida de ambos E1a y E1b. Se comparó la actividad oncolítica de TAV-255 con respecto a ONYX-015 en células tumorales y normales y se encontró que TAV-255 resulta más potente en cuanto a la inducción de lisis celular en células tumorales en comparación con ONYX-015 mientras que retiene un nivel de atenuación similar con respecto a ONYX-015 en células no transformadas.
La eliminación de sitios E2F que se presenta en -225 y -287, con respecto al sitio de inicio de transcripción de E1a que se designa como 1, no tuvieron impacto en la expresión de E1a en células transformadas (Bruder, J. T., y Hearing, P. (1989). Nuclear factor EF-1A binds to the adenovirus E1A core enhancer element and to other transcriptional control regions. Mol Cell Biol 9: 5143-5153). Los sitios de union para Pea3 se ubican en -200, -270, -300, -344, -386 y la eliminación de sitios de unión a Pea3 I, II, y III por si sola tuvo impacto mínimo en la expresión de E1a en células HeLa (Hearing, P., y Shenk, T. (1983). The adenovirus type 5 E1A transcriptional control region contains a duplicated enhancer element. Cell 33: 695-703). Estudios anteriores definieron la importancia de la región de control transcripcional de E1a en líneas celulares transformadas. Sin embargo, las células tumorales difieren significativamente de las células no transformadas, el huésped natural para el virus. Las células tumorales se encuentran en proliferación de manera activa y tienen expresión anormal de muchas rutas de transducción de señales, de regulación celular y de apoptosis. Diversos factores de transcripción incluyendo E2F y Pea3, que se unen a la región de control de transcripción de E1a se expresan de manera aberrante en células tumorales (de Launoit, Y., et al. (2000). The PEA3 group of ETS-related transcription factors. Role in breast cancer metastasis. Adv Exp Med Biol 480:107-116; Hanahan, D., y Weinberg, R. A. (2000). The hallmarks of cancer. Cell 100: 57-70). Por lo tanto, el control de la expresión de E1a del estudio de transcripción de E1a podría afectarse en células tumorales mediante la expresión alterada de estos factores de transcripción.
El entendimiento de la función del potenciador de E1a in vitro en células tumorales puede ser revelador cuando se compara la regulación de E1a en células tumorales con respecto a la regulación de E1a en células humanas no transformadas. Los fibroblastos diploides humanos (MRC-5, WI-38 e IMR-90) se han usado de manera exhaustiva durante varias décadas como líneas celulares de laboratorio convencionales en el desarrollo de vacunas, la virología de diagnóstico, y los laboratorios de investigación para cultivar y estudiar un amplio intervalo de virus incluyendo adenovirus, virus del herpes, citomegalovirus, y muchos otros (Friedman, H. M., y Koropchak, C. (1978). Comparison of WI-38, MRC-5, and IMR-90 cell strains for isolation of viruses from clinical specimens. J Clin Microbiol 7: 368-371). Se realizaron una serie de eliminaciones en la región de control transcripcional de E1a Had-5 para determinar el rol del elemento de ADN que se une a Pea3 y E2F, y se comparó la expresión de E1a en un panel de líneas celulares transformadas y no transformadas. Se propone que la secuencia potenciadora de E1a, cuando se evalúa en el contexto de células no transformadas, resulta mayor y más compleja que la que se informó anteriormente. Se analizó el potencial de virus mutante HAd-5 como un agente oncolítico potente.
III. Investigación de eliminaciones de sitios de unión
Se prepararon los mutantes por eliminación de la región de control transcripcional de E1a HAd-5, y se investigó la expresión de E1a en células no transformadas y transformadas. La región de control de transcripción HAd-5 contiene sitios de unión para factores de transcripción múltiples, muchos de los cuales se sobreexpresan en células cancerosas. Por consiguiente, el uso de células transformadas para estudiar la transcripción de E1a se verá afectado por expresión aberrante de diversos factores de transcripción que influyen estas secuencias reguladoras críticas. Para superar esta limitación, se han utilizado líneas celulares epiteliales de pulmón humano de crecimiento detenido para estudiar la expresión génica de E1a y se compararon estos resultados con la expresión de E1a en un panel de líneas celulares tumorales. Diversos mutantes por eliminación se generaron dirigidos de manera específica a sitios de unión a Pea3 y E2F. La Figura 8a demuestra los sitios de unión para Pea3 y E2F y mutantes por eliminación abarcando estos sitios de factores de transcripción. Estos mutantes por eliminación se confeccionaron en los plásmidos y se introdujeron en el genoma de HAd-5 a través de recombinación homóloga. Los virus mutantes Had-5 que transportan estas mutaciones se usaron para infectar células MRC-5 (pulmonares no transformadas) y A549 (pulmonares transformadas) y se analizaron luego para expresión génica de E1a mediante transferencia western (Figura 8b) y Q-PCR (Figura 8c). En células no transformadas, dl309-6, que retira los sitios Pea3 número IV y V, demostró expresión de proteína E1a reducida en comparación con Wt HAd-5 (dl309). El mutante por eliminación, dl87, que retira el sitio Pea3 número I y dl275 que retira el sitio de unión a E2F no mostró diferencias en la expresión de E1a en comparación con Wt HAd-5. TAV-255, que retira los sitios Pea3 número II y III junto con el E2F que se ubica entre los dos sitios Pea3, y dl55, que retira el sitio Pea3 número II, no demostraron expresión detectable de proteína E1a a las 24 horas después de la infección (h.p.i.). Una banda menor que se presenta en carriles correspondientes a TAV-255 y dl55 resulta similar a la banda que se presenta en el carril de control, lo que sugiere reacción no específica con antisueros de E1a. Q-PCR relativa que se llevó a cabo de ARNm que se extrajo a las 24 h.p.i. sugirió que el ARNm de E1a se expresa en una proporción 2,5 veces menor en dl309-6 en comparación con Wt HAd5 mientras que la eliminación de dl87 no tuvo efecto significativo en la expresión génica de E1a. El mutante dl275 mostró reducción del 20 por ciento en ARNm de E1a en comparación con Wt HAd-5. El mutante por eliminación, dl55, mostró reducción de 10 veces en la expresión de ARNm de E1a mientras que TAV-255 mostró reducción de 33 veces en la expresión de ARNm de E1a en comparación con Wt HAd-5.
Se comparó la expresión del ARNm de E1a y de la proteína en células A549 que se infectaron con estos virus mutantes (según se describe en la Figura 8a) a las 8 y 24 h.p.i.. Estos resultados, que se muestran en la Figura 9a, demuestran una pequeña reducción de la expresión de la proteína E1a a las 8 h.p.i., mientras que estos virus no mostraron ninguna diferencia significativa en la expresión de E1a después de 24 h.p.i.. Usando análisis mediante Q-PCR dl87, TAV-255, dl55, y dl275 mostraron aproximadamente reducción doble en la expresión génica de E1a, mientras que el virus mutante dl309-6 mostró aumento del 20 por ciento en la expresión de E1a en comparación con Wt HAd-5 después de 8 h.p.i. (Figura 9b).
La Q-PCR que se llevó a cabo después de 24 h.p.i. no mostró diferencias en la expresión génica de E1a en comparación con Wt HAd-5 (datos no se muestran). De estos resultados resulta evidente que el mutante por eliminación del potenciador de E1a tuvo mayor impacto en la expresión génica de E1a cuando se estudió en el contexto de células MRC-5 en comparación con células A549. Para entender el rol de nucléotidos que se presentan en TAV-255 de manera adicional, se realizaron varias eliminaciones de 6 pb en TAV-255 y se reconstruyeron estas mutaciones en el genoma de HAd-5 y se estudió la expresión de E1a en líneas celulares no transformadas.
El mutante por eliminación, TAV-255, integra dos sitios de unión a un factor de transcripción E2F y dos pea3. Para caracterizar el rol de cada elemento regulador, se realizó la eliminación de los elementos Pea3 y E2F por separado y se reconstruyeron estas mutaciones en el genoma de HAd-5 (Figura 10a). Una eliminación de 6 pb al azar (dl220) entre dos sitios Pea3 se generó también como un control. La expresión de proteína E1a se determinó para los virus mutantes y Wt HAd-5 a las 48 h.p.i. en células MRC-5 (Figura 10b). Perfiles de expresión de E1a similares se observaron para TAV-255 y dl200+230, que tienen eliminación de sitios de unión a Pea3 número II y III. El mutante por eliminación de E2F (dl212) y el mutante por eliminación del control (dl220) no tuvieron efecto significativo en la expresión de E1a en comparación con Wt HAd-5. Las células infectadas con virus mutante dl200+230 mostraron reducción de 50 veces en ARNm de E1a en comparación con Wt HAd-524 h.p.i. en análisis mediante Q-PCR (Figura 10c). TAV-255, que tuvo eliminación de sitios Pea3 números II III junto con el sitio E2F tuvo una reducción de 33 veces en la expresión de E1a. El mutante por eliminación, dl212, que retiró el sitio EF2, tuvo una reducción del 20 por ciento en la expresión génica de E1a, dl220 no tuvo diferencia significativa en la expresión de E1a en comparación con Wt HAd-5.
Para evaluar de manera adicional el rol de los sitios E2F que se presentan en el elemento potenciador de E1a y su impacto en la expresión de E1a, se generó mutación única y doble de sitios E2F y se estudió el impacto de estas mutaciones en la expresión de E1a. El elemento potenciador de adenovirus contiene dos sitios de unión para el factor de transcripción E2F en -225, y -287 (Figura 11A). El sitio de unión a E2F por separado, así como también ambos sitios en conjunto se mutaron y se reconstruyeron en el genoma de Had-5 mediante recombinación homóloga. La expresión de la proteína E1a se estudió en células MRC-5 que se infectaron con virus mutantes a las 24 h.p.i. (Figura 11B). Estos virus mutantes no mostraron ninguna diferencia significativa en la expresión génica de E1a en comparación con Wt Had-5, lo que sugirió que E2F no cumple un rol significativo en la expresión génica de E1a en las células MRC-5 de crecimiento detenido. El análisis mediante Q-PCR que se llevó a cabo a las 24 h.p.i. mostró reducción del 20 al 30 por ciento con dl212, así como virus mutantes dl212+275 mientras que el virus mutante dl275 no mostró ninguna reducción en la expresión génica de E1a en comparación con Wt Had-5 (Figura 11C). Los estudios que se llevaron a cabo con estos virus mutantes en línea celular transformada (A549) no dieron como resultado ningún impacto significativo en la expresión de E1a (datos no se muestran).
Se analizó la expresión de E1a y citotoxicidad exhibida por virus mutante dl200+230 en diversas células transformadas y no transformadas. El virus mutante dl200+230, que mostró la reducción más alta en la expresión de E1a en línea celular MRC-5 sin ninguna reducción significativa en líneas celulares A549 24 h.p.i. se evaluó en diversas líneas celulares no transformadas para evaluar el impacto de eliminación de sitios de unión a Pea3 II & III. Los estudios que se llevaron a cabo en líneas celulares IMR-90 y WI-38 mostraron resultados similares según se obtuvieron de células MRC-5 lo que sugirió que la reducción de la expresión de E1a no se limitó a las células MRC-5 sino que fue similar en otras líneas celulares pulmonares no transformadas. En la línea celular no transformada, el virus dl200+230 no mostró nivel detectable de expresión de proteína E1A a las 24 h.p.i.. Después de 48 h.p.i., el virus mutante mostró niveles bajos de expresión génica de E1a en células MRC-5 e IMR-90 pero no lo hizo en células WI-38. En contraste con el virus mutante, virus, la expresión de E1a en Wt HAd-5 pudo detectarse a las 24 h.p.i. y excedió de manera significativa la expresión de E1a de los virus mutantes a las 48 h.p.i. (Figura 12a). Se sometió a prueba además la expresión del virus mutante en diversas líneas celulares transformadas (HeLa, Panc-1 y Calu-6) y no se encontró diferencia significativa en la expresión de proteína E1a entre dl200+230 y Wt HAd-5 a las 24 h.p.i. (Figura 12b). Se comparó el impacto de citotoxicidad de virus Wt HAd-5, ONYX-015 y dl200+230 en diversas líneas celulares transformadas (HeLa, Panc-1, Calu-6, y A549) 4 días después de la infección y en líneas celulares no transformadas (MRC-5) después de 5 días posteriores a la infección. El virus mutante, dl200+230, mostró nivel de citotoxicidad similar en comparación con Wt Had-5 y mostró mayor eficacia en comparación con ONYX-015 en líneas celulares de A549 y Calu-6. En líneas celulares no transformadas, dl200+230 mostró muy baja citotoxicidad en comparación con HAd-5 y exhibió nivel de seguridad muy similar en comparación con ONYX-015 (Figura 13 A&B).
La región de control de transcripción de E1a en Had-5 contiene sitios de unión para varios factores de transcripción que se expresan de manera aberrante en células tumorales incluyendo dos sitios de unión para E2F y cinco sitios de unión para Pea3 [19, 20]. Estudios anteriores han intentado definir el dominio potenciador para E1a; sin embargo, estos estudios se llevaron a cabo en células neoplásicas en lugar de en células no transformadas, el huésped natural para infecciones con adenovirus. Para definir el potenciador de E1a de manera más precisa, los mutantes por eliminación de E2F y Pea3 se generaron y su impacto en la expresión de E1a se evaluó en células no transformadas.
Pea3 es un factor de transcripción que se sobreexpresa comúnmente en muchas líneas celulares tumorales y se asocia con un fenotipo metastásico, invasivo (de Launoit, Y., et al. (2000). The PEA3 group of ETS-related transcription factors. Role in breast cancer metastasis. Adv Exp Med Biol 480: 107-116). Los mutantes por eliminación, TAV-255, que retira los sitios de unión a Pea3 II & III, así como el sitio E2F distal demostraron una reducción de 33 veces en la expresión de ARNm de E1a a las 24 horas después de la infección. En contraste, el mutante por eliminación, dl200+230, que elimina los sitios de unión a Pea3 II y III, pero retiene el sitio E2F distal, demostró una reducción de 50 veces en la expresión de ARNm de E1a en células no transformadas a las 24 horas después de la infección. Estos resultados demuestran que los sitios de unión al factor de transcripción Pea3 número II y III cumplen un rol importante en la modulación de la expresión de E1a en células no transformadas. La expresión de proteína E1a a las 24 horas igualó los resultados para ARNm de E1a. De manera interesante, dl200+230, que tiene eliminaciones de sitios de unión Pea3 número II y III pero que retiene el sitio EF2, mostró la mayor reducción en la expresión de E1a. Estos resultados sugieren que el sitio EF2 tiene mínima expresión de E1a y se sugiere la posibilidad de que el sitio E2f puede actuar como un represor durante el período temprano de expresión de E1a. De hecho, en los ensayos de transfección, se ha encontrado que la inactivación de mutaciones puntuales de los sitios E2F dio como resultado expresión de E1a aumentada favoreciendo una función de represión para E2F en lugar de una activación transcripcional de E1a por E2F (datos no se muestran). La posibilidad de que E2F funcione como un represor transcripcional en condiciones específicas se ha sugerido con anterioridad (Weintraub, S. J., Prater, C. A., y Dean, D. C. (1992). Retinoblastoma protein switches the E2F site from positive to negative element. Nature 358: 259-261).
Se evaluó la importancia relativa de cada uno de los sitios Pea3 en la transcripción de E1a en células no transformadas y transformadas. La eliminación del sitio Pea3 I (dl87) tiene impacto mínimo en la expresión de E1a en células no transformadas. En contraste, la eliminación de sitios Pea3 II y III dio como resultado una reducción de aproximadamente 10 y 20 veces en la expresión de ARNm de E1a en células no transformadas, respectivamente. La eliminación de ambos sitios Pea3 II y III dio como resultado una reducción de 50 veces en la expresión de ARNm de E1a en células no transformadas. De manera adicional, para disminuir la expresión de ARNm de E1a, la expresión de proteína E1a se disminuye también de manera significativa debido a la eliminación de estos sitios de unión a Pea3. La proteína E1a se encuentra por debajo del nivel de detección en un panel de 3 líneas celulares no transformadas a las 24 horas después de la infección y resulta detectable, pero disminuye de manera severa a las 48 horas después de la infección. Estos resultados sugieren que estos sitios Pea3 son de importancia crítica para la expresión eficiente de E1a en células no transformadas. Sin embargo, estos sitios Pea3 no constituyen los determinantes exclusivos de la expresión E1a debido a que puede ocurrir expresión tardía de niveles bajos de E1a en células no transformadas. Nuestros resultados indican además que la eliminación de ambos sitios Pea3 II y III tienen impacto mínimo en la expresión de E1a en un panel de líneas celulares tumorales a las 24 horas después de la infección. Nuestros resultados en las líneas celulares tumorales son consistentes con estudios anteriores que demuestran que la eliminación del sitio Pea3 número I o III por si sola reduce la transcripción génica de E1a 2-3 veces solamente a las 5 horas después de la infección (Hearing, P., and Shenk, T. (1983). The adenovirus type 5 E1A transcriptional control region contains a duplicated enhancer element. Cell 33: 695-703). En estos estudios anteriores, la expresión de la proteína E1a en momentos más tardíos no se determinó.
E2F es un factor de transcripción que se sobreexpresa comúnmente en células tumorales debido a la desregulación de la ruta de Rb. La fosforilación de Rb mediante cinasas dependientes de ciclina da como resultado la liberación de E2F, que se une luego a unidades reguladoras transcripcionales e induce genes que median la entrada en fase S. Nuestros resultados demuestran que la eliminación de cualquiera o ambos de los sitios de unión a E2F que se ubican secuencia arriba del sitio de tapón de E1a tuvo un impacto mínimo en la expresión de E1a en líneas celulares no transformadas. De manera específica, la eliminación del sitio E2F más proximal al sitio de tapón, -218 a -225, no tuvo impacto en la expresión de ARNm de E1a o de proteína. La eliminación del sitio E2F más distal con respecto al sitio de tapón, -281 a -287, dio como resultado una reducción del 30% en la expresión del ARNm, pero no tuvo impacto significativo en la expresión de la proteína E1a según se determina mediante análisis por transferencia western. La eliminación de ambos sitios dio como resultado una reducción del 20% en la expresión de ARNm de E1a, pero no se detectó diferencia en los niveles de proteína E1a en comparación con el control. Estos resultados demuestran que la eliminación de los dos sitios de unión al factor de transcripción E2F que se ubican secuencia arriba del sitio de tapón de E1a cumple solo un rol mínimo en la expresión de E1a en células no transformadas. En consistencia con estudios anteriores, se encontró que la eliminación de ambos sitios E2F demostró impacto mínimo en la expresión de E1a en un panel de líneas celulares tumorales (datos no se muestran) (Bruder, J. T., y Hearing, P. (1989). Nuclear factor EF-1A binds to the adenovirus E1A core enhancer element and to other transcriptional control regions. Mol Cell Biol 9: 5143-5153).
E1a regula la expresión génica temprana de adenovirus y resulta esencial para multiplicación viral eficiente (Hearing, P., y Shenk, T. (1983). The adenovirus type 5 E1A transcriptional control region contains a duplicated enhancer element. Cell 33: 695-703). Debido a que a eliminación de los sitios Pea3 II y III dan como resultado expresión de E1a severamente atenuada en un panel de células no transformadas, pero tiene poco impacto en la expresión de E1a en un panel de células tumorales, estos mutantes por eliminación potenciadores pueden resultar útiles como virus oncolíticos. Se evaluó la actividad citolítica de dl200+300 (eliminación doble de sitios Pea3 II y III) en células tumorales y no transformadas. La actividad citolítica de dl200+300 resulta similar al virus de control en un panel de líneas celulares tumorales mientras que se demuestra citotoxicidad mínima en las células no transformadas (Figura 13a y b). Estudios anteriores han demostrado que dl1520 (ONYX-015) resulta significativamente atenuado cuando se compara con el virus de tipo salvaje en una diversidad de líneas celulares tumorales. La capacidad disminuida para dl1520 para replica células tumorales se ha vinculado al hecho de que E1b-55k es una proteína multifuncional. De manera adicional a la unión e inactivación de p53, E1b-55k se involucra en el transporte de ARNm a través de la membrana nuclear. En la ausencia de transporte de ARNm eficiente, dl150 se replica de manera ineficiente en una diversidad de líneas celulares tumorales. Estudios clínicos entre pacientes con una diversidad de cánceres, principalmente cáncer de cabeza y cuello y de colon y recto han demostrado respuestas clínicas significativas en una minoridad de pacientes y el desarrollo clínico de ONYX-015 se detuvo. La falta de potencia del virus debido a la eliminación de una proteína multifuncional crítica puede haber limitado la eficacia clínica de ese virus oncolítico. Se ha hecho foco al desarrollo de un virus oncolítico mediante la determinación de los sitios de unión a factor de transcripción específico que resultan críticos para expresión eficiente de E1a y replicación de Had5 en células respiratorias no transformadas. La eliminación de los sitios Pea3 a partir del potenciador de E1 endógeno tiene varias ventajas cuando se desarrolla un virus oncolítico. En primer lugar, no se han introducido secuencias de ADN heterólogas para alcanzar expresión de E1a selectiva de tumor. En segundo lugar, E1a es el primer gen que se expresa a continuación de la infección de células con adenovirus y este gen, que regula la expresión génica temprana del virus posterior, se expresa en aproximadamente los niveles que se observan para controlar infecciones por adenovirus. En tercer lugar, el gen E1b-55k multifuncional se deja intacto.
Las figuras 14 y 15 muestran microfotografías de células normales (WI-38) y células tumorales (A549) que se infectan con Ad5 o con el virus por eliminación del promotor (TAV-255). En células normales, no existe evidencia de efectos citolíticos mediados por virus para hasta 7 días a continuación de la infección con TAV-255. En contraste, la muerte celular exhaustiva se observa para células normales que se infectan con Ad5. En las células tumorales (A549), la muerte celular exhaustiva se observa para células normales que se infectan con Ad5. En las células tumorales (A549), la muerte de células tumorales exhaustiva se observa con ambos Ad5 y TAV-255 a los 3 días después de la infección. De este modo, TAV-255 resulta selectivo para lisis de células tumorales, ahorrando células normales.
En resumen, se ha determinado que el mecanismo de transcripción de E1a difiere claramente entre células no transformadas y transformadas. De manera adicional, se demuestra que, cuando se estudian células no transformadas, el potenciador de E1a abarca una mayor región y resulta más complejo que el que se reconoce con anterioridad. Estos resultados demuestran que los sitios de unión al factor de transcripción Pea3 II y III, pero no así los sitios de unión a E2F, resultan críticos para expresión eficiente de E1a en un panel de células no transformadas, pero no así de células transformadas. Estos resultados sugieren que los virus con eliminaciones selectivas de los dominios de unión al factor de transcripción Pea3 II y III pueden tener potente actividad oncolítica.
IV. Secuencia reguladora modificada
En una realización, la secuencia reguladora de E1a se modifica. La “secuencia reguladora modificada” tiene una eliminación, sustitución, o adición de uno o más nucleótidos en comparación con la secuencia de tipo salvaje. En una realización, la secuencia de un sitio de unión al factor de transcripción puede modificarse para reducir la afinidad al factor de transcripción, por ejemplo, mediante eliminación de una porción de esta, o mediante la inserción de una mutación puntal única en el sitio de unión. Los mutantes por eliminación pueden exhibir estabilidad potenciada en comparación con otras formas mutantes. Preferiblemente, la secuencia reguladora modificada permite expresión en células neoplásicas, pero atenúa la expresión en células normales. Dichas secuencias reguladoras modificadas pueden emplearse en un vector viral o célula transformada según se describe de manera adicional a continuación.
A. Mutantes por eliminación
En una realización, la secuencia reguladora de E1a modificada (Región de Control Transcripcional de E1a) consiste en un mutante por eliminación. Esto es, uno o más nucleótidos se han eliminado en comparación con la secuencia reguladora de tipo salvaje.
Los nucleótidos eliminados pueden ser contiguos, formando así una región eliminada única. En este caso, la eliminación total es la misma que la región eliminada. En otra realización, la eliminación no es contigua. En una realización, la eliminación total comprende uno, dos, tres, cuatro, o más regiones eliminadas. En una realización, la eliminación total comprende tres regiones eliminadas. En otra realización, la eliminación total comprende dos regiones eliminadas. A menos que se indique lo contrario, el término genérico “eliminación” se usa para describir características de la “eliminación total” y/o una cualquiera o más “regiones eliminadas”.
En una realización, la eliminación (la eliminación total y/o cualquier región eliminada) es de aproximadamente 1 a aproximadamente 400, de aproximadamente 1 a aproximadamente 300, de aproximadamente 1 a aproximadamente 200, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100, de aproximadamente 50 a aproximadamente 100, de aproximadamente 25 a aproximadamente 75, de aproximadamente 5 a aproximadamente 50, de aproximadamente 5 a aproximadamente 25, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 nucleótidos. En otra realización, la eliminación es de aproximadamente 100, de aproximadamente 90, de aproximadamente 50, de aproximadamente 30, de aproximadamente 10, o de aproximadamente 5 nucleótidos. En otra realización, la eliminación es de 250 o menos, 150 o menos, 100 o menos, 90 o menos, 50 o menos, 30 o menos, 20 o menos, 15 o menos, 12 o menos, 11 o menos, 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, o 5 o menos nucleótidos.
En una realización, al menos un nucleótido se elimina en la región de -255 a -393, -304 a -393, -255 a -305, -265 a -270, o -293 a -299 de la secuencia reguladora de E1a.
En una realización, se retiene al menos un nucleótido en la región potenciadora (-141 a -305) (a saber, no se elimina). En otra realización, se retiene al menos un nucleótido proximal al sitio Pea3 II (-1 a -255). En incluso otra realización, se retiene al menos un nucleótido distal con respecto al sitio Pea3 V (-395 a -498). En otra realización, se retiene al menos un nucleótido en uno de los siguientes intervalos: -1 a -255, -141 a -305, y -395 a -498.
Según se describe anteriormente, Pea3 y E2F son factores de transcripción que se une a la secuencia promotora. La secuencia reguladora de E1a contiene cinco sitios de unión a Pea3, que se designan Pea3 I, Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV, y Pea3 V, donde Pea3 I es el sitio de unión a Pea3 más proximal con respecto al sitio de inicio de E1a, y Pea3 V es el más distal. La secuencia reguladora de E1a contiene además dos sitios de unión a E2F, que se designan en la presente E2F I y E2F II, donde E2F I es el sitio de unión a E2F más proximal con respecto al sitio de inicio de E1a, y E2F II es el más distal. A partir del sitio de inicio de E1a, los sitios de unión se disponen: Pea3 I, E2F I, Pea3 II, E2F II, Pea3 III, Pea3 IV, y Pea3 V.
En una realización, se elimina al menos uno de estos siete sitios de unión, o una porción funcional de estos. Una “porción funcional” es una porción del sitio de unión que, cuando se elimina, disminuye la funcionalidad del sitio de unión, por ejemplo, la afinidad de unión, con respecto a su factor de transcripción respectivo (Pea3 o E2F). En una realización, se eliminan uno o más sitios de unión enteros. En otra realización, se elimina una porción funcional de uno o más sitios de unión. Un “sitio de unión eliminado” integra tanto la eliminación de un sitio de unión entero y la eliminación de una porción funcional. Cuando dos o más sitios de unión se eliminan, puede usarse cualquier combinación de eliminación de sitio de unión entero y eliminación de porción funcional.
Por otra parte, en algunas realizaciones, se retiene al menos uno de los sitios de unión, o una porción funcional de estos, (por ejemplo, no se elimina de) en la secuencia reguladora de E1a. Al retener al menos una porción funcional del sitio de unión, la afinidad de unión con respecto al factor de transcripción respectivo se mantiene de manera sustancial. Un “sitio de unión retenido” integra la acción de retener un sitio de unión entero y de retener una porción funcional de este. Cuando dos o más sitios de unión se retienen, puede usarse cualquier combinación de retener sitios de unión enteros y retener porciones funcionales.
En una realización, se elimina al menos un sitio de unión a Pea3, o una porción de este. El sitio de unión a Pea3 que se elimina puede ser Pea3 I, Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV, y/o Pea3 V. En una realización, el sitio de unión a Pea3 que se elimina es Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV, y/o Pea3 V. En otra realización, el sitio de unión a Pea3 que se elimina es Pea3 IV y/o Pea3 V. En otra realización, el sitio de unión a Pea3 que se elimina es Pea3II y/o Pea3 III. En otra realización, los sitios de unión a Pea3 que se eliminan son ambos Pea3 II y Pea3 III.
En otra realización, se retiene el sitio de unión a Pea3 I, o una porción funcional de este.
En una realización, se elimina al menos un sitio de unión a E2F, o una porción funcional de este.
En otra realización, se retiene al menos un sitio de unión a E2F, o una porción funcional de este. En una realización, el sitio de unión a E2F que se retiene es E2F I y/o E2F II. En otra realización, el sitio de unión a E2F que se retiene es E2F II.
En otra realización, la eliminación total consiste esencialmente en uno o más de Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV, y/o Pea3 V, o porciones funcionales de estos. En otras palabras, se retienen otros sitios de unión-los sitios Pea3 restantes y ambos sitios de unión a E2F.
En una realización, el mutante por eliminación es dl309-6, dl340-12, TAV-255, dl87, dl55, dl275, dl200, dl212, dl220, dl230, dl200+230, o dl212+275. En una realización, el mutante por eliminación es dl309-6, TAV-255, dl55, dl200, dl230, o dl200+230. En otra realización, el mutante por eliminación es TAV-255, dl55, dl200, dl230, o dl200+230. En una realización, el mutante por eliminación es TAV-255.
V. Expresión selective de isoformas de E1a 12S y 13S
Según se describe anteriormente, las eliminaciones del potenciador de adenovirus que retiran la región de -305 a -255 (TAV-255) dan como resultado expresión selectiva de tumor de E1a y replicación preferencial de este virus en células tumorales. Estudios anteriores han demostrado que E1a tiene actividad proapoptótica (Flinterman, Gaken et al. 2003) dando lugar a la posibilidad de que la expresión selectiva de tumor de E1a podía potenciar la eliminación celular. La proteína E1a de adenovirus es un complejo de proteínas que se modifica mediante empalme de ARN dando como resultado principalmente ARNm 13s, 12s, y 9s.
Se evaluó la expresión, replicación viral, y actividad lítica de adenovirus que se modifica para expresar de manera selectiva el producto génico E1a-13s en células no transformadas y transformadas cuando se expresa a partir del promotor de E1a nativo y de vectores que albergan la eliminación del potenciador (TAV-255) que facilita la expresión de E1a preferencial en células tumorales. Se demuestra que los virus que expresan de manera selectiva el producto génico 13s expresan de manera eficiente la proteína 289R en un panel de células tumorales y que la replicación viral y actividad lítica de este virus resulta similar con respecto a Ad5 de tipo salvaje. En contraste, se encontró que la expresión de E1a 13s se demora de manera marcada y disminuye en células no transformadas de crecimiento detenido en comparación con células tumorales. La actividad oncolítica del virus con 13s restringido se comparó con dl1520 (Onyx-015). El virus con 13s restringido se atenuó tanto como dl1520 en las células no transformadas y resultó marcadamente más potente en comparación con dl1520 en algunas líneas celulares tumorales que se sometieron a prueba. Estos resultados demuestran que los vectores virales oncolíticos basados en expresión selectiva de virus con 13s restringidos resultan viables y pueden proporcionar replicación viral eficiente en células tumorales mientras que restringen de manera severa la replicación viral en células no transformadas.
La expresión de las proteínas E1a se evaluó en células WI-38 de crecimiento detenido que son fibroblastos pulmonares diploides, no transformados (Hayflick y Moorhead 1961). Los resultados que se muestran en la Figura 16a-b, demuestran que la infección con adenovirus de tipo salvaje da como resultado expresión de dos proteínas. La proteína de 289 aminoácidos deriva de ARNm 13s mientras que la proteína de 243 aminoácidos deriva del ARNm 12s. El ARNm 12s es un producto de empalme de ARNm que difiere del ARNm 13s debido a la remoción de un dominio interno que funciona para transactivar otros genes virales tempranos. En células WI-38, la proteína de 243 aminoácidos constituye la especie dominante. La abundancia de ambas especies aumenta entre 24 y 48 horas, continuando con una reducción significativa de la abundancia relativa del producto de 289 aminoácidos a las 72 horas después de la infección. En contraste con respecto al virus de tipo salvaje, el virus PM975, que se encuentra restringido a la expresión de la forma de 289 aminoácidos de E1a, demuestra un retraso marcado en el comienzo de expresión de E1a y no se observa hasta las 48 horas después de la infección. De manera adicional, la abundancia de la isoforma 289R de E1a, se reduce sustancialmente en comparación con el virus de tipo salvaje a las 24 y 28 horas después de la infección. A las 72 horas después de la infección, la abundancia de la isoforma 289R resulta similar entre el virus de tipo salvaje y PM975; sin embargo, la expresión de la proteína E1a total se reduce de manera significativa en PM975 debido a que no se produce 243R, que constituye la especie dominante. Resultados similares se observan para otra línea celular no transformada, MRC-5, Figura 16b.
El comienzo de la expresión de E1a de adenovirus del tipo salvaje y PM975 se evaluó en dos líneas celulares tumorales A549 (pulmón) y Panc-1 (páncreas), y los resultados se muestran en la Figura 17a-b. En contraste con respecto a las células no transformadas donde la expresión detectable de la forma grande de E1a no se observó hasta 48 horas después de la infección, la expresión de 289R resultó detectable en las líneas celulares tumorales durante 8 a 24 horas después de la infección en las líneas celulares tumorales. Mientras que la especie 243R de E1a resultó la forma más abundante en las células WI-38, incluso en los momentos más tempranos, la abundancia de la especie 289R y de la 243R resultó similar en los momentos tempranos en las células tumorales, con expresión principalmente de la isoforma 289R excediendo la isoforma 243R en los tiempos más tempranos después de la infección. A lo largo del curso de la infección, la acumulación preferencial de la especie 243R se observó durante 48 a 72 horas después de la infección en las líneas celulares tumorales. La expresión de la forma 289R de E1a de PM975 igualó la expresión que se observó para el virus de tipo salvaje en cada línea celular, con expresión pico que ocurre a las aproximadamente 24 horas después de la infección, pero con expresión abundante continua a las 48 y 72 horas después de la infección. La abundancia de la especie 289R de PM975 tuvo lugar a las 72 horas después de la infección e igualó o excedió la abundancia de 289R que se expresó en células infectadas con virus de tipo salvaje.
Se evaluó el comienzo de expresión de la isoforma 243R de E1a de dl1500, un virus que expresa de manera exclusiva la isoforma 243R de E1a en células no transformadas de crecimiento detenido (WI-38 y MRC-5) y en células tumorales (A549 y Panel). La expresión de la isoforma 243R se demora en células que se infectan con dl1500 cuando se compara con células que se infectan con el virus de tipo salvaje. La demora en expresión de la isoforma 243R se observó para ambas líneas celulares no transformadas (WI-38 y MRC-5) Figura 18a (paneles a y b). La expresión de la isoforma 243R resulta claramente evidente a las 24 horas después de la infección con virus de tipo salvaje; sin embargo, 243R se encuentra en o por debajo del nivel de detección a las 24 horas después de la infección con dl1500. La expresión de la isoterma 243R resulta evidente a las 48 horas a continuación de la infección con dl1500 en ambas líneas celulares y a las 72 horas después de la infección resulta aproximadamente igual con respecto a la abundancia que se observa a continuación de infección con virus de tipo salvaje. En contraste con respecto a las líneas celulares no transformadas, la expresión de la isoterma 243R resulta claramente evidente durante 16 a 24 horas después de la infección con dl1500 en las líneas celulares tumorales, Figura 18b (paneles a y b). A efectos comparativos, la expresión de la E1a se muestra en el tiempo en células WI-38 y A549 (Figura 19, paneles A y B, respectivamente). El comienzo de la expresión de E1a de células WI-38 que se infectan se encuentra claramente demorado, en particular en las células que se infectan con dl1500.
Se ha demostrado anteriormente el comienzo demorado de la expresión de E1a de virus con una eliminación del promotor de E1a que retira dos sitios Pea3 y un sitio E2f (TAV-255). Se ha introducido esta eliminación de 50 pb en un vector que expresa de manera selectiva la forma 289R de E1a y compara el comienzo de la expresión de E1a en células WI-38 y A549.
Se evaluó el comienzo de la expresión de E1a en células WI-38 de crecimiento detenido que se infectan con 1) Ad5, PM975 y TAV-13s para E1a a las 24, 48 y 72 horas (MOI=5). Estos resultados demuestran que la expresión de E1a se encuentra en o por debajo del nivel de detección para TAV-13S hasta 72 horas después de la infección. (Véase Figura 20).
Una transferencia Western de células A549 que se infectan con 1) Ad5, PM975, TAV-13s para E1a a las 24, 48 y 72 horas (MOI=5) no muestra demora significativa en lo que se refiere a la expresión de E1a de la TAV-13s en comparación con el virus de tipo salvaje o PM975 en células A549.
La Figura 21 muestra la viabilidad de células a continuación de la infección con dl309, PM975, dl1520 o dl1520 en células WI38 en los 7 días después de la infección a MOI de 30 y A549, Panc-1, LnCap, y Hep3b a los 5 días después de la infección a MOI de 3. Estos resultados demuestran que los virus que expresan de manera exclusiva la isoforma 289R de E1a (PM975) y la isoforma 243R de E1a (dl1500) tienen impacto mínimo en lo que se refiere a supervivencia de células más allá de los 7 días después de la infección incluso a MOIs muy altos (30). La toxicidad celular para estos dos virus con E1a restringido resultó significativamente menor en comparación con ya sea el virus de tipo salvaje (dl309) o el virus con E1b-55k eliminado (dl1520). Las líneas celulares tumorales se evaluaron para supervivencia de células 5 días después de la infección con y MOI de 3 (1 log más bajo que el virus de entrada para el experimento con células WI-38). Estos resultados demuestran que la infección de estas líneas celulares tumorales con el virus que expresa la forma 289R de E1a (PM975) ha aumentado la actividad citolítica en comparación con ya sea dl1520 o dl1500 y que el nivel de actividad citolítica para PM975 resulta similar en comparación con el virus de tipo salvaje en estas líneas celulares.
El gen E1a de Ad5 se procesa mediante empalme de ARNm para rendir cinco formas distintas; 13S, 12S, 11S, 10S y 9S. Las formas principales 13S y 12S codifican para dos proteínas E1a, 289R y 234R, respectivamente, regulan la transcripción de ambos genes virales y celulares en células que se infectan con adenovirus y resultan esenciales para replicación de adenovirus. La forma 289R incluye un dominio de transactivación crítico que activa la transcripción de los genes de adenovirus tempranos: E2, E3, y E4 (Berk, Lee et al. 1979; Jones y Shenk 1979). Este dominio se empalma para generar la isoforma 243R de E1a y los virus que expresan solamente la forma 243R resultan incapaces para transactivar la expresión a partir de genes virales tempranos (Montell, Courtois et al. 1984). E1a induce la expresión de genes celulares que incluyen c-Fos, c-Jun, y c-Myc y reprime la transcripción de c-erbB2 y del receptor de factor de crecimiento epitelial. Las proteínas E1a pueden conducir células en reposo hacia división celular mediante interacción con proteínas de ciclo celular críticas incluyendo pRB, p27, ciclina A, ciclina E, CtBP, y p300/CBP.
Estudios anteriores han demostrado que el adenovirus diseñado para expresar de manera selectiva la forma 289R de E1a tiene aproximadamente expresión normal de proteínas virales tempranas y tardías, pero ha disminuido la síntesis de ADN viral en células WI-38 de crecimiento detenido (Spindler, Eng et al. 1985). Las células WI-38 de crecimiento detenido se usaron como un modelo de una infección viral natural, y estos autores demostraron que la síntesis de ADN viral se reduce al 20-30% con respeto a los niveles de control a las 24 a 36 horas después de la infección en células de crecimiento detenido, pero no lo hace en células WI-38 de proliferación (subconfluentes) o células HeLa. Mientras que se observó síntesis de ADN viral disminuida en células que se infectaron con el virus que se restringe a la expresión de la forma 289R de E1a, no se encontraron diferencias significativas en la expresión de ARNm viral temprana y ninguna diferencia en ya sea síntesis de proteína viral temprana o tardía. Sin embargo, la expresión de proteína viral temprana se determinó mediante el análisis de proteínas E1b y E2 en lugar de mediante análisis de expresión E1a. En contraste con el trabajo que se publicó anteriormente, se demostró que el comienzo de la expresión de E1a se demora significativamente, y la abundancia disminuye en células no transformadas de crecimiento detenido (WI-38 y MRC-5) cuando se infectan con adenovirus que se restringe a la expresión de la isoforma 289R para E1a (PM975) solamente cuando se hace la comparación con las mismas células que se infectan con virus de tipo salvaje (dl309). En las células no transformadas, la expresión de 289R no se observó hasta 48 horas después de la infección mientras que la expresión de E1a de Ad5 de tipo salvaje se observa en 24 horas en las células no transformadas. Incluso cuando se observa, la abundancia de E1a resulta considerablemente más baja en comparación con los niveles de control. Se extienden los estudios anteriores y se demuestra que la expresión de la forma 243R de E1a se demora en células WI-38 de crecimiento detenido cuando se infectan con dl1500 en comparación con el virus de tipo salvaje. Estos resultados demuestran que en la ausencia de procesamiento de E1a normal, la expresión de ambas las formas 289R y 243R de E1a se demora y se reduce en abundancia en células no transformadas de crecimiento detenido.
El requisito para el procesamiento de E1a para alternar las formas de empalme para expresión eficiente de la forma 289R en estas células no transformadas resulta menos estricto en células tumorales. Se evaluó la expresión de E1a de células tumorales que se infectaron con PM975 y dl309. Los resultados de estos estudios demostraron que las líneas celulares tumorales expresan la forma 289 de E1a tan temprano como 8 horas después de la infección y que el procesamiento de E1a para alternar formas de empalme no se requiere para alcanzar expresión eficiente de la forma 289R en líneas celulares tumorales. En contraste con respecto a las líneas celulares no transformadas, la abundancia de 289R que se expresa en líneas celulares tumorales que se infectan con el virus que se restringe a expresión de 289R (PM975) puede igualar o incluso exceder la abundancia de 289R que se expresa de células que se infectan con virus de tipo salvaje (dl309).
Se determinó la viabilidad de células que se infectan con virus de tipo salvaje (dl309), virus con una eliminación en el gen E1b-55k (dl1520/Onyx-015), y virus que expresan de manera selectiva la forma 298R (PM975) y la forma 243R (dl1500) de E1a. No se observó reducción significativa de la viabilidad de células en células WI-38 de crecimiento detenido más allá de los 7 días posteriores a la infección con ya sea PM975 o dl1500 hasta MOIs tan altos como 30. Estos resultados demuestran que la restricción de productos de empalme de E1a con respecto a cualquier isoforma de E1a puede reducir de manera severa la actividad lítica de estos virus en células no transformadas, de crecimiento detenido. En contraste, PM975 tiene actividad lítica potente, de aproximadamente el nivel de virus de tipo salvaje, en las líneas celulares tumorales que se sometieron a prueba. De manera adicional, este análisis muestra que PM975 tiene actividad lítica cuando se compara con dl1520 (Onyx-015) en las líneas celulares que se sometieron a prueba. Debido a que E1a constituye la primera proteína que se produce por adenovirus, la restricción selectiva de esta proteína con respecto a la forma 289R tiene potencial significativo como un virus oncolítico.
Para restringir de manera adicional la expresión de E1a con respecto a células tumorales y limitar la expresión de E1a en células no transformadas, se introdujo la eliminación de una región corta del promotor de E1a que integra los dos sitios Pea3 y un sitio E2F (TAV-255) en un virus que expresa de manera selectiva la forma 298R de E1a. Se demuestra que este virus tiene expresión de E1a en células WI-38 de crecimiento detenido marcadamente disminuida pero que la expresión de 289R en células A549 resulta similar con respecto al virus de tipo salvaje en células A549. La introducción de esta eliminación de promotor puede minimizar la expresión de E1a en células no transformadas.
Múltiples mARNs que se expresan de manera diferencial de la misma secuencia de codificación permiten la expresión compleja de genes de adenovirus de un genoma compacto y mARNs distintos se acumulan en diferentes puntos durante la infección. El pre-ARNm de E1a se empalma de manera diferente en mARNs 13S, 12S, y 9S predominando el ARNm 13S durante la fase de infección temprana y predominando 12S/9S durante puntos de infección tardíos. Estos mARNs se generan usando diferentes sitios 5' de empalme que se unen a un sitio 3' de empalme común (Imperiale, Akusjnarvi et al. 1995). El proceso de empalme de ARNm viral depende de factores de empalme celulares y se considera que el cambio de expresión de ARNm 13S a 12S y 9S se debe a una titulación de factores de empalme específicos durante el curso de infección viral (Gattoni, Chebli et al. 1991; Larsson, Kreivi et al. 1991; Himmelspach, Cavaloc et al. 1995). La alteración de empalme de E1a normal mediante sobreexpresión de factores de control de empalme para E1a 13s puede reducir la acumulación de ARNm tardío y disminuir el rendimiento viral (Molin y Akusjarvi 2000). Se demuestra que el empalme restringido de E1a con respecto a la forma 289R disminuye la expresión de 289R en células no transformadas, pero tiene solo un impacto modesto en el comienzo de la expresión de 289R en células tumorales y puede dar como resultado una acumulación de 289R a niveles que resultan mayores que los que se alcanzan durante infección con virus de tipo salvaje. Una explicación potencial para este efecto consiste en que el comienzo de síntesis de ADN viral se demora en células WI-38 que se infectan con PM975 (Spindler, Eng et al. 1985). Debido a que la síntesis de ADN viral nueva puede impactar en el procesamiento de ARNm (Larsson, Kreivi et al.
1991), la demora de síntesis de ADN viral nuevo puede impactar en el procesamiento de E1a en células WI-38 de crecimiento detenido. En contraste, debido a que las células tumorales tienen proliferación desregulada, el comienzo de síntesis de ADN viral puede no demorarse y puede facilitar la expresión de 289R incluso en la ausencia de expresión de 243R.
En resumen, la replicación selectiva de tumor de virus y lisis de células tumorales preferencial mediada por virus constituye la base del concepto de virus oncolíticos. El prototipo de un virus oncolítico es Onyx-015 (dl1520). Este virus tiene una eliminación del gen E1b-55k que se postuló para conferir replicación selectiva de tumor del virus y por consiguiente lisis selectiva del tumor mientras se ahorran células normales. Se comparó la actividad oncolítica del virus que se restringe a la expresión de E1a-289R con respecto a dl1520 en un panel de células no transformadas y transformadas. Se demuestra que la restricción de la expresión de E1a con respecto a la forma 289R de E1a da como resultado un virus que resulta más atenuado en comparación con dl1520 en ambas líneas celulares no transformadas que se sometieron a prueba. Además, se demuestra que la restricción de expresión de E1a con respecto a la forma 289R da como resultado un virus oncolítico altamente potente en las líneas celulares tumorales que se sometieron a prueba. El virus que se restringe a 289R resultó más potente que dl1520 en las líneas celulares que se sometieron a prueba y se aproximó al nivel de actividad citolítica que se observó para Ad5 de tipo salvaje en estas líneas celulares tumorales. La expresión de E1a restringida, que se acopla posiblemente con la eliminación del promotor de E1a que se describe, puede rendir un vector viral oncolítico con actividad lítica cercana al tipo salvaje en células tumorales mientras que presenta actividad lítica muy limitada en células no transformadas.
De acuerdo con esto, en una realización, se proporciona un virus recombinante que expresa de manera selectiva al menos una isoforma de E1a. La “expresión selectiva” de una isoforma se refiere a que la isoforma que se selecciona se expresa más que una o más de las otras isoformas (según se mide mediante expresión de ARNm). En una realización, una isoforma se expresa a niveles que se aproximan a la expresión de tipo salvaje, mientras que la expresión de una o más de otras isoformas se atenúa. En una realización, la expresión de la isoforma que se selecciona es de al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 99% de la expresión de tipo salvaje. En otra realización, la expresión de la única o más de las otras isoformas se atenúa a no más del 25%, no más del 15%, no más del 10%, no más del 5%, no más del 3%, o no más del 1% de la expresión de tipo salvaje.
En algunas realizaciones, el virus recombinante excluye de manera sustancial la expresión de al menos una isoforma. En este caso, la expresión de una isoforma se atenúa a no más del 25%, no más del 15%, no más del 10%, no más del 5%, no más del 3%, o no más del 1% de la expresión de tipo salvaje.
En una realización, el virus recombinante expresa E1a-12S de manera selectiva. En una realización, el virus recombinante expresa E1a-12S de manera selectiva en comparación con E1a-13S. En incluso otra realización, el virus recombinante expresa E1a-12S de manera selectiva y excluye la expresión de E1a-13S de manera sustancial.
En una realización, el virus recombinante expresa E1a-13S de manera selectiva. En una realización, el virus recombinante expresa E1a-13S de manera selectiva en comparación con E1a-12S. En incluso otra realización, el virus recombinante expresa E1a-13S de manera selectiva y excluye la expresión de E1a-12S de manera sustancial.
VI. Inserción de clon de E1b 19K
La modificación del promotor de E1 da como resultado expresión preferencial de proteínas E1a y E1b en un panel de líneas celulares tumorales. Mientras que ocurre expresión temprana y abundante de proteínas E1 en células tumorales que se infectan con la modificación promotora de E1, los niveles bajos de expresión de proteína ocurren en momentos más tardíos en células no transformadas. Sin embargo, este nivel bajo de expresión de proteína no resultó suficiente para dar como resultado lisis celular significativa durante hasta siete días después de la infección en las células no transformadas que se sometieron a prueba. En contraste, se observa expresión de E1a y E1b abundante en células tumorales tan temprano como 8 a 12 horas después de la infección en células tumorales y se observa muerte celular exhaustiva entre un panel de líneas celulares tumorales a los 3 días después de la infección. Estos resultados indican que el vector de eliminación del promotor de E1a podría usarse como una plataforma efectiva para la expresión de proteínas de manera preferencial en células tumorales. De manera adicional, este vector podría usarse para suministrar niveles bajos de proteínas a células normales a su vez. Por consiguiente, el vector de eliminación del promotor de E1a podría constituir un vector de expresión de función dual efectivo con 1) actividad oncolítica potente cuando infecta células tumorales y 2) activación inmune o propiedades de vacuna potentes cuando infecta células no transformadas. Se describe este vector como una vacuna oncolítica. Se describe además el uso nuevo de la región E1b-19k como un sitio para clonar secuencia de ADN de interés. El uso de E1b-19k como un sitio de clonación permite la conservación de proteínas virales E1a y E1b-55k intactas. La conservación de estas proteínas virales críticas permite la replicación viral que se aproxima a niveles virales de tipo salvaje en un panel de líneas celulares tumorales.
Según se describe anteriormente, la expresión selectiva de tumor de E1a puede alcanzarse mediante la modificación del promotor de E1 endógeno. Por consiguiente, la expresión selectiva de transgenes puede alcanzarse usando el potenciador de E1a modificado. Anteriormente, la clonación de genes en adenovirus involucraba comúnmente la eliminación genética del casete de E1a entero con reemplazo del transgen de interés, normalmente bajo el control de un promotor fuerte tal como el promotor CMV. Sin embargo, este enfoque no permite la expresión selectiva de tumor de estos transgenes. Se describe el uso de E1b-19k como un sitio de clonación en adenovirus. No existen publicaciones anteriores que usan esta región como un sitio de clonación. La unidad E1 se compone de dos genes principales, E1a y E1b, ambos con múltiples productos de empalme que generan diversas proteínas. Las proteínas E1a principales se designan 289R y 243R, y las proteínas E1b principales se designan E1b-19k y E1b-55k.
El locus de E1b 19k puede usarse como un sitio de clonación por varias razones. En primer lugar, E1a resulta esencial para replicación viral eficiente y la alteración de este gen puede restringir la replicación viral eficiente de manera severa. Por consiguiente, esto no constituyó un sitio ideal para clonación de transgenes. En segundo lugar, el gen E1b-55k es una proteína multifuncional que se involucra en la unión e inactivación de p53, así como del transporte de ARNm a través de la membrana nuclear. La eliminación del gen E1b-55k constituyó la base de la selectividad de Onyx-015 que se propuso para tumores con mutaciones en p53. Sin embargo, la eliminación de E1b-55k altera también el transporte eficiente del transporte de ARNm del núcleo al citoplasma. Por consiguiente, la eliminación del gen E1b-55k viral dio como resultado un virus incapacitado que se replica mal en muchas líneas celulares cancerosas. Por consiguiente, este no constituyó un sitio ideal para clonación de transgenes. Y, en tercer lugar, el gen E1b-19k funciona principalmente como un gen antiapoptótico y resulta un homólogo del gen antiapoptótico celular, BCL-2. Debido a que la muerte celular del huésped con anterioridad a la maduración de las partículas virales de progenie restringiría la replicación viral, E1b-19k se expresa como parte del casete de E1 para impedir la muerte celular prematura permitiendo así la infección para proceder y rendir viriones maduros. Debido a que muchas células han adquirido la capacidad de superar señales apoptóticas, por ejemplo, mediante sobreexpresión de BCL-2, E1b-19k es potencialmente redundante en el tumor y podría alterarse para proporcionar un sitio para insertar genes y secuencias de ADN. Sin embargo, debido a que E1b-19k es un producto de empalme del gen E1b-55, la clonación en la región E1b-19k, sin la alteración de E1b-55k constituye un desafío desde el punto de vista técnico. No existen publicaciones que describen el uso de la región E1b-19k para clonación de genes. Se demuestra que la clonación de genes selectiva en el gen E1b-19k puede alcanzarse sin alteración del gen E1b-55k.
Se demuestra que los genes exógenos que incluyen TNF y péptidos kras mutados pueden clonarse en la región E1b-19k, y que estos genes se expresan de manera eficiente. Se demuestra de manera adicional un efecto antitumoral potente para virus con expresión de transgenes de E1b-19k y de virus con la eliminación del promotor de E1a que se combina con la inserción de genes en la región E1b-19k.
Según se muestra en la Figura 24, la región E1b codifica varias proteínas que se definen mediante sitios de inicio de ARNm distinto y producciones de empalme. E1b-19 y E1b-55k tienen secuencias de solapamiento, pero diferentes sitios de inicio de ARNm. Una región de 202 pares de bases a continuación del sitio de inicio para E1b-19k se eliminó para proporcionar un sitio de clonación en la región E1b-19k. El sitio de inicio de E1b-55k no se alteró de manera tal que la expresión de E1b-55k pudo retenerse.
Análisis de expresión superficial de TNF que se expresa de E1b-19k mediante citometría de flujo se muestra en la Figura 28. Esto da como resultado expresión de TNF abundante de Ad19k TNF en a) cáncer pancreático de ratón R-40 y b) líneas celulares de cáncer pancreático MiaPaca. Como un control, se insertó TNF en un vector de expresión de adenovirus que se usa comúnmente con eliminación de la región E1 de los virus e inserción de TNF. La expresión de TNF se encuentra bajo el control del promotor CMV, un promotor fuerte que se usa comúnmente en vectores de expresión de adenovirus. Este vector se designa como dE1a-TNF. Se ha demostrado anteriormente que se necesitan titulaciones muy altas de este vector para alcanzar expresión de TNF detectable en un intervalo de tipos de células tumorales. En este estudio, se usa dE1a-TNF en 750 unidades formadoras de placas (pfu) por célula. Al usar 750 pfu por célula, aproximadamente el 30% de las células R40 y el 85% de las células Mia-PaCa tuvieron expresión superficial detectable de TNF. Los lisados celulares del vector Ad19kTNF se agregaron a las células para determinar la expresión de TNF en la superficie de las células. La concentración precisa de partículas virales no se determinó en este experimento; sin embargo, se ha demostrado en estudios posteriores que el uso de Ad19kTNF a 2 pfu/célula tiene tanta o más expresión de TNF como el vector dE1a-TNF que se usa a 750 pfu/célula. Los resultados del estudio actual demuestran que el 70-80% de las células R-40 expresan TNF en su superficie a continuación de la infección con el vector Ad19kTNF en comparación con solo el 30% de células cuando se infectan con el vector dE1a-TNF. En células Mia-PaCa, la infección con el vector dE1a-TNF que se usa a 750 pfu/célula da como resultado expresión de TNF detectable en aproximadamente el 80% de las células mientras que la infección con lisados con el vector Ad19kTNF expresa TNF en aproximadamente 15-25% de las células. El análisis detallado que muestra los datos de citometría de flujo se muestra en las Figuras 5b y 5c. En resumen, estos datos muestran que la expresión de TNF biológicamente activo puede alcanzarse del vector Ad19kTNF.
Los ensayos de viabilidad de células se llevaron a cabo en células no transformadas a los 3 y 5 días después de la infección (Figura 29). Estos resultados demuestran muerte celular mínima con todos los virus que se sometieron a prueba a excepción de muerte celular moderada con Ad5 al MOI más alto. La muerte celular significativa para virus Ad5 y Ad19k TNF se observa a los 5 días después de la infección. En particular, no existe muerte celular detectable con el virus de eliminación del promotor, TAV-255, al MOI más alto más allá de los 5 días después de la infección. El virus que no se replica que expresa TNF no demuestra muerte celular al MOI más alto más allá de los 5 días después de la infección.
Los ensayos de viabilidad de células se llevaron a cabo en células transformadas (A549) a los 3 y 5 días después de la infección (Figura 30). Estos resultados demuestran muerte celular exhaustiva con virus Ad5, TAV y Ad19k TNF a MOIs bajos y muerte celular moderada con dl1520 al MOI más alto. A los 5 días después de la infección, muerte celular significativa para virus Ad19k TNF a un MOI de 0,1, significativamente mejor en comparación con la que se observa para Ad5 por sí solo. El virus que no se replica que expresa TNF no demuestra muerte celular al MOI más alto más allá de los 5 días después de la infección y se señala actividad modesta para dl1520 al MOI más alto.
Los ensayos de viabilidad de células se llevaron a cabo en células transformadas (Panc1) a los 3 y 5 días después de la infección (Figura 31). Estos resultados demuestran muerte celular exhaustiva con virus Ad5, TAV y Ad19k TNF a MOIs bajos y muerte celular moderada con dl1520 al MOI más alto. A los 5 días después de la infección, muerte celular significativa para virus Ad5, TAV yAd19k TNF a un MOI de 0,1, significativamente mejor en comparación con la que se observa para el virus que no se replica que expresa TNF que no demuestra muerte celular al MOI más alto más allá de los 5 días después de la infección. Se señala actividad citolítica para dl1520, pero se necesitan MOIs más altos que para TAV y Ad19k TNF para similar actividad citolítica.
Análisis de expresión superficial de TNF mediante AdTAV19kmmTNF usando citometría de flujo (Figura 32): este análisis demuestra expresión abundante de expresión de TNF de AdTAV19k TNF en líneas celulares cancerosas a) CaLu-6, b) LnCap y c) Hep3b. La expresión de TNF abundante, que se aproxima al 100% de las células tumorales se alcanza con una multiplicidad de infección (MOI) de 2, lo que equivale a 2 pfu/célula. Como un control, se muestran dE1a-TNF y un MOI de 750. En este MOI alto, más del 90% de las células en estas líneas celulares presentan expresión de TNF detectable. En contraste, Ad19kTNF que se usa a 2-5 pfu/célula tiene expression de TNF detectable en 80-00% de células. El análisis detallado que muestra los datos de citometría de flujo se muestra en las Figuras 9ce. En resumen, estos datos muestran que la expresión de TNF biológicamente activo puede alcanzarse del vector Ad19kTNF a MOIs de 2 a 5, similar a los resultados que se alcanzaron con el vector dE1a-TNF a un MOI de 750. Estos resultados demuestran de manera adicional que la expresión de TNF efectiva puede alcanzarse con la eliminación de 50 pares de bases de TAV-255 en el promotor de E1a. Se ha demostrado que esta eliminación del promotor restringe la expresión de E1a y E1b en células no transformadas mientras retiene la expresión de E1a y e1b en líneas celulares tumorales. Estos resultados confirman expresión eficiente de TNF del vector que contiene la eliminación de TAV-255 y con TNF que se clona en la región E1b-19k del virus.
La supervivencia de SK-Mel-28 (célula tumoral de melanoma) se evaluó a continuación de la infección con AdTAV19TNF, dE1a-TNF y Ad19k (Figura 33). La línea celular SK-Mel-28 se resiste a la eliminación por vectores de adenovirus. No se observa citotoxicidad significativa con dE1a-TNF al MOI más alto y se observa citotoxicidad modesta solamente con Ad19k. En cambio, se observa citotoxicidad completa con AdTAV19TNF a un MOI de 10, el MOI más bajo sometido a prueba.
TNF induce muerte celular a través de la inducción de caspasas (véase Figura 34). La activación del receptor de TNF mediante unión de TNF da como resultado el reclutamiento de proteínas de dominio de muerte y activación posterior de caspasa-8 y la activación luego de caspasa-3 disparando la inducción de muerte celular apoptótica. Se determinó la activación de caspasa-3 en células Hep3b que se infectan con Ad19k o AdTAV19TNF a un MOI de 5. Los resultados demuestran inducción marcada de caspasa-3 en células que se infectan con AdTAV19TNF. No se observó aumento significativo en la actividad de caspasa-3 en células que se infectan con Ad19k.
Determinación de la expresión de E1b-55k en vectores con eliminaciones E1b-19k (Figura 35): el sitio de inserción en los vectores de E1b-19k eliminado se designó de manera tal que el sitio de inicio de E1b-55k no se alteraría. Para determinar si la expresión génica de E1b-55k se retenía, la expresión de E1b-55k se evaluó en vectores con TNF o Kras que se insertó en la región E1b-19k. Los resultados demuestran expresión normal de E1b-55k para el virus con Kras que se insertó en E1b-19k. El nivel de expresión de E1b-55k resulta equivalente con respecto al nivel de expresión de E1b-55k que se observa en células que se infectan con Ad5 de tipo salvaje. Esto confirma que la expresión de E1b-55k puede retenerse a pesar de las inserciones de ADN en la región E1b-19k. De manera interesante, no existe expresión de E1b-55k detectable del vector que expresa TNF. A este punto, no se conoce la causa de este efecto. TNF puede inhibir directamente la expresión de E1b-55 o la naturaleza de la inserción puede disminuir la expresión de E1b-55k. Esto se encuentra en evaluación.
Determinación de inserción de GFP en E1b-19k. La inserción de GFP en E1b-19k se demostró mediante PCR (Figura 36).
Células tumorales expresan GFP a continuación de la infección con Ad19kTAVhrGFP (Figura 37).
El concepto de un vector de función dual: modulación de potenciador de E1a puede dar como resultado un vector de expresión que expresa proteínas E1 de manera abundante y resulta lítico en células tumorales. Sin embargo, este virus expresa proteínas E1 a niveles bajos y tiene actividad lítica limitada en células no transformadas. Por lo tanto, el vector viral podría ser oncolítico en células tumorales, pero se usó para expresar transgenes terapéuticos y proteínas mutadas (vacuna) en células no transformadas. Se ha demostrado con anterioridad expresión de proteínas E1 abundante en células tumorales después de la infección con el vector de eliminación del promotor de E1. En contraste, la expresión de proteínas E1 se demora y resulta significativamente menor en células no transformadas. Véase Figura 4c.
El concepto de una Vacuna Tumoral Oncolítica dirigida a Kras mutado: Kras se encuentra secuencia abajo del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Las mutaciones en Kras dan como resultado activación constitutiva de la ruta de Ras. Debido a que kras mutado es activo de manera constitutiva, las terapias dirigidas al receptor EGFR tales como Erbitux y Vectivix resultan inefectivas. Kras muta comúnmente en una variedad de neoplasias que ocurren en aproximadamente el 50% de cánceres de colon y más del 90% de cánceres pancreáticos. Diversas mutaciones puntuales de Kras se han descrito y resulta común secuenciar mutaciones de Kras para determinar si pacientes responderán a terapias de cáncer dirigidas a EGFR. Se han clonado las mutaciones de Kras más comúnmente descritas en el vector de expresión 19K.
Vectores de expresión de E1b-19k para potenciar inmunidad a antígenos tumorales: proteínas de Kras mutado se han clonado en el vector de expresión E1b-19k de tres maneras distintas para proporcionar una plataforma robusta para la expresión de antígenos tumorales. En primer lugar, el ADN que codifica las secuencias de Kras mutado se insertaron en la región E1b-19k. En segundo lugar, el gen de flagelina bacteriana se clonó en la región E1b-19k. Un sitio de clonación se introdujo en la secuencia de ADN de flagelina y secuencias específicas de Kras se introdujeron en el medio del gen de flagelina. La flagelina es una proteína altamente inmunogénica y puede contribuir a potenciar una respuesta inmune a las secuencias de Kras mutado. En tercer lugar, se eliminó t NF del dominio de transmembrana de la construcción E1b-19K CD154-TNF y las secuencias de ADN de Kras mutado se ligaron a CD154. Esto proporciona expresión abundante de péptidos de Kras mutados en la superficie de la célula. Dependiendo de la construcción que se usa, Kras podría restringirse a expresión en la superficie de la célula tumoral o se podría permitir que sea proteolíticamente escindido permitiendo la liberación del péptido de Kras mutado en las células inmunes y ganglios linfáticos para reconocimiento inmune y procesamiento.
Se proporciona un virus recombinante que incluye un sitio de inserción de E1b-19K. El sitio de inserción de E1b-19K se usa para la inserción de una secuencia de ADN. La secuencia de ADN que se inserta codifica un transgen, gen canceroso, o secuencia de ADN mutado. En una realización, el transgen es TNF. En otra realización, el transgen es kras. En incluso otra realización, el transgen es una secuencia de p53 mutado.
La secuencia de E1b-55K se mantiene. La secuencia del sitio de inicio de E1b-55K se mantiene. El sitio de inserción comprende la eliminación de al menos 100, por ejemplo, 100 a aproximadamente 200, pares de bases entre el sitio de inicio de E1b-19K y el sitio de inicio de E1b 55K. En una realización, el sitio de inicio comprende la eliminación de 202 pares de bases a continuación del sitio de inicio de E1b-19K.
VII. Vectores virales
Los genes modificados y secuencias que se describen en la presente se emplean en un vector viral. Las expresiones “vector viral” y “virus” se usan de manera indistinta en la presente para hacer referencia a cualquiera de los parásitos intracelulares obligados que no tienen mecanismo sintetizador de proteínas o generador de energía. El genoma viral puede ser ARN o ADN que se contiene con una estructura de proteína recubierta con una membrana lipídica. Los virus que resultan útiles en la puesta en práctica de la presente invención incluyen virus de ADN o ARN modificado de manera recombinante envueltos o no envueltos, que se seleccionan preferiblemente a partir de baculoviridiae, parvoviridiae, picornoviridiae, herpesviridiae, poxviridae, o adenoviridiae. Los virus pueden ser virus que ocurren de manera natural o sus genomas virales pueden modificarse mediante técnicas de ADN recombinante para incluir expresión de transgenes exógenos y pueden diseñarse para ser deficientes en replicación, de replicación condicional, o competentes en replicación. Los vectores virales quiméricos que aprovechan elementos ventajosos de cada una de las propiedades de los vectores originales (véase, por ejemplo, Feng, et al.(1997) Nature Biotechnology 15:866-870) pueden resultar útiles también en la puesta en práctica de la presente invención. Los sistemas de vectores mínimos en los que la columna vertebral viral contiene solo las secuencias que se necesitan para empaquetamiento del vector viral y pueden incluir, de manera opcional, un casete de expresión de transgen pueden producirse además de acuerdo con la puesta en práctica de la presente invención. A pesar de que se favorece de manera general el empleo de un virus de la especie para tratar, en algunas instancias, puede resultar ventajoso el uso de vectores que derivan de especies diferentes que poseen características patogénicas favorables. Por ejemplo, los vectores del virus del herpes equino para terapia génica para humanos se describen en WO98/27216. Los vectores se describen como útiles para el tratamiento de humanos ya que el virus equino no resulta patogénico para humanos. De manera similar, los vectores de adenovirus de ovinos pueden usarse en terapia génica para humanos ya que estos se reivindican para evitar anticuerpos contra los vectores de adenovirus de humanos. Tales vectores se describen en WO 97/06826.
Preferiblemente, el vector viral es un adenovirus. Los adenovirus son virus icosaédricos, no envueltos (desnudos) de tamaño medio (90-100 nm) que se componen de una nucelocápsida y un genoma de ADN lineal de cadena doble. Los adenovirus se replican en el núcleo de células de mamíferos usando la maquinaria de replicación del huésped. El término “adenovirus” se refiere a cualquier virus del género Adenoviridiae incluyendo, pero sin limitación, a subgéneros de adenovirus humano, bovino, ovino, equino, canino, porcino, murino, y símico. En particular, los adenovirus de humano incluyen los subgéneros A-F así como los serotipos individuales de este, serotipos individuales y subgéneros A-F incluyendo pero sin limitación a adenovirus humanos tipo 1,2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 (Ad11A y Ad 11P), 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 19a, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34a, 35, 35p, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, y 91. Se prefieren los vectores que derivan de adenovirus humanos tipos 2 y 5.
En una realización, la secuencia reguladora modificada se une de manera operativa a una secuencia que codifica una proteína. En una realización, al menos uno de los genes E1a y E1b (regiones de codificación) se une de manera operativa a la secuencia reguladora modificada. En una realización, al menos uno de los genes E1a y E1b se presenta en la forma de tipo salvaje.
En una realización, el gen E1a se une de manera operativa a la secuencia reguladora modificada. En otra realización, el gen E1a es el tipo salvaje. En otra realización, el gen E1a se modifica para expresar de manera selectiva una isoforma de E1a.
En incluso otra realización, y/o un gen E1b modificado se une de manera operativa a la región promotora de tipo salvaje. En otra realización, el gen E1a modificado y/o el gen E1b modificado se une de manera operativa a una secuencia reguladora modificada.
La expresión “se une de manera operativa” se refiere a una unión de elementos de polinucleótidos en una relación funcional. Una secuencia de ácido nucleico se “une de manera operativa” cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador se une de manera operativa a una secuencia de codificación si este afecta la transcripción de la secuencia de codificación. Se une de manera operativa se refiere a que las secuencias de nucleótidos que se unen se encuentran normalmente en posición contigua. Sin embargo, como los potenciadores funcionan de manera general cuando se separan del promotor por varias kilobases y secuencias intrónicas pueden ser de longitudes variables, algunos elementos de polinucleótidos pueden unirse de manera operativa pero no flanquearse de manera directa y pueden funcionar incluso en trans a partir de un alelo o cromosoma diferente.
En otra realización, la secuencia reguladora modificada se une de manera operativa a un transgen citotóxico. La expresión “transgen citotóxico” se refiere a una secuencia de nucleótidos cuya expresión en la célula diana induce lisis o apoptosis de la célula. La expresión transgen citotóxico incluye, pero sin limitación, genes supresores de tumor, genes de toxina, genes citostáticos, genes activadores de profármacos, o genes apoptóticos.
En una realización, cualquiera de estos transgenes citotóxicos puede insertarse en un sitio de inserción de E1b-19K según se describe anteriormente.
La expresión “gen supresor de tumor” se refiere a una secuencia de nucleótidos, cuya expresión en la célula diana resulta capaz de suprimir el fenotipo neoplásico y/o inducir apoptosis. Ejemplos de genes supresores de tumor que resultan útiles en la puesta en práctica de la presente invención incluyen el gen p53, el gen APC, el gen DPC-4, el gen BRCA-1, el gen Br Ca -2, el gen WT-1, el gel de retinoblastoma (Lee, et al. (1987) Nature 329:642), the MMAC-1 gene, the adenomatous polyposis coli protein (Albertsen, et al., patente de Estados Unidos 5,783,666 expedida el 21 de julio, 1998), el eliminado en el gen de carcinoma de colon (DCC), el gen MMSC-2, el gen NF-1, el gen supresor de tumor de carcinoma nasofaríngeo que mapea en el cromosoma 3p21.3. (Cheng, et al. 1998. Proc. Nat. Acad. Sci. 95:3042-3047), el gen MTS 1, el gen CDK4, el gel NF-1, el gen NF2 y el gen VHL.
La expresión “gen de toxinas” se refiere a una secuencia de nucleótidos, cuya expresión en una célula produce un efecto tóxico. Ejemplos de tales genes de toxinas incluyen secuencias de nucleótidos que codifican exotoxinas de pseudomonas, toxina de ricino, toxina de difteria, y similares.
La expresión “gen proapoptótico” se refiere a una secuencia de nucleótidos, cuya expresión de secuencia da como resultado la muerte celular programada de la célula. Ejemplos de genes proapoptóticos incluyen p53, adenovirus E3-11.6K, el gen E4orf4 de adenovirus, genes de la ruta p53, y genes que codifican las caspasas.
La expresión “genes que activan profármacos” se refieren a secuencias de nucleótidos, cuya expresión da como resultado la producción de proteína capaz de convertir un compuesto no terapéutico en un compuesto terapéutico, que vuelve a la célula susceptible para eliminación mediante factores externos u origina una condición tóxica en la célula. Un ejemplo de un gen activador de profármaco es el gen de citosina desaminasa. La citosina desaminasa convierte 5-fluorocitosina a 5-fluorouracilo (un agente antitumoral potente). La lisis de la célula tumoral proporciona un estallido de citosina desaminasa localizado que resulta capaz de convertir 5FC a 5FU en el punto del tumor localizado dando como resultado la eliminación de muchas células tumorales circundantes. Esto da como resultado la eliminación de un gran número de células tumorales sin la necesidad de infectar estas células con un adenovirus (el así denominado “efecto espectador”). De manera adicional, el gen de timidina quinasa (TK) (véase, por ejemplo, Woo, et al. patente de Estados Unidos 5,631,236 expedida el 20 de mayo, 1997 y Freeman, et al. patente de Estados Unidos nro. 5,601,818 expedida el 11 de febrero, 1997) en las que pueden emplearse las células que expresan el producto génico de TK que son susceptibles para eliminación selectiva mediante la administración de ganciclovir.
La expresión “gen de citosina” se refiere a una secuencia de nucleótidos, cuya expresión en una célula produce una citosina. Ejemplos de tales citosinas incluyen GM-CSF, las interleucinas, especialmente IL-1, IL-2, EL-4, IL-12, IL-10, IL-19, EL-20, interferones de los subtipos a, p y gama especialmente, interferón a-2b y fusiones tales como interferón a-2a-1.
VIII. Células transformadas
Los vectores pueden usarse para transformar células in vitro o in vivo. Las células pueden ser células neoplásicas y/o células normales.
Una “célula neoplásica” es una célula que muestra un fenotipo de crecimiento aberrante que se caracteriza por independencia de controles del crecimiento celular normal. Como las células neoplásicas no se replican necesariamente en cualquier momento dado, la expresión células neoplásicas comprende células que pueden replicarse de manera activa o en un estado de reposo de no replicación temporal (G1 o G0). Las poblaciones de células neoplásicas localizadas se denominan neoplasias. Las neoplasias pueden ser malignas o benignas. Las neoplasias malignas se denominan además cánceres. La transformación neoplásica se refiere a la conversión de una célula normal en una célula neoplásica. Las células que no son neoplásicas se denominan “normales” o “no neoplásicas”.
IX. Métodos de expresión selectiva de tumor
En una realización, el virus recombinante exhibe expresión selectiva. En particular, el virus recombinante permite la expresión en células neoplásicas, pero atenúa la expresión en células normales.
De acuerdo con esto, en una realización, un método de expresión de un péptido de manera selectiva (por ejemplo, una proteína) en una célula diana que comprende poner en contacto una célula con un virus recombinante que comprende una secuencia reguladora de E1a mutante por eliminación que se une de manera operativa a una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido. En este contexto, el péptido puede ser de cualquier longitud, incluyendo proteínas y porciones de estas. En una realización, el péptido se asocia con replicación viral, tal como E1a y/o E1b. En otra realización, el péptido se asocia con cáncer.
En otra realización, un método de expresión de un péptido de manera selectiva en una célula diana comprende poner en contacto una célula con un virus recombinante que expresa de manera selectiva una isoforma de E1a única, por ejemplo, E1a-12S o E1a-13S.
En incluso otra realización, un método de expresión de un péptido de manera selectiva en una célula diana comprende poner en contacto una célula con un virus recombinante que comprende un transgen que se inserta en un sitio de inserción de E1b-19K.
En una realización, la célula diana es una célula neoplásica tal como una célula cancerosa. En este caso, el péptido se expresa, preferiblemente a niveles que se aproximan a la expresión de tipo salvaje. En una realización, la expresión (según se mide mediante expresión de ARNm o transferencia Western) es de al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 99% de la expresión de tipo salvaje.
En otra realización, la célula diana es una célula normal. En este caso, la expresión del péptido se atenúa de manera selectiva en comparación con la expresión de tipo salvaje. En una realización, la expresión (según se mide mediante expresión de ARNm o transferencia western) se reduce a no más del 25%, no más del 15%, no más del 10%, no más del 5%, no más del 3%, o no más del 1% de la expresión de tipo salvaje. En una realización, se alcanza atenuación de aproximadamente 0% a aproximadamente 5%.
Estos métodos de expresión selectiva pueden ponerse en práctica in vitro o in vivo.
X. Métodos de tratamiento que se describen en la presente
“Métodos de tratamiento de una enfermedad”, según se usa en la presente, se refiere a métodos de tratamiento de un estado de enfermedad, una condición causada por un estado de enfermedad o síntomas de enfermedad. “Tratamiento” de la enfermedad incluye uno o más de: dirigirse a una causa fisiológica de la enfermedad, dirigirse a una causa fisiológica de un síntoma de enfermedad, reducir la severidad de la enfermedad, demorar la progresión de la enfermedad, mejorar un síntoma de la enfermedad, y acortar la duración de la enfermedad (por ejemplo, acelerando la remisión).
El “sujeto” según se usa en la presente es un sujeto que necesita tratamiento para cáncer. El sujeto es preferiblemente un humano, pero puede incluir también animales de laboratorio, mascotas, domésticos, o ganado. En una realización, el sujeto es un mamífero.
Un método de tratamiento de cáncer que se describe en la presente puede comprender la administración de una formulación farmacéutica que comprende un virus recombinante según se describe anteriormente. La formulación farmacéutica puede administrarse de manera sistémica o local para tratar un amplio intervalo de etapas y tipos de cánceres incluyendo, pero sin imitación, cánceres de pulmón, páncreas, próstata, cuello uterino, ovario, hígado, cabeza y cuello, vejiga, mama, colon y recto, endometrio, riñón, leucemia, cánceres de piel (melanoma y no melanoma), linfoma no Hodgkin, y de tiroides.
Se proporcionan además formulaciones farmacéuticas que comprenden los vectores. Los vectores pueden formularse para administración de métodos que se conocen en la técnica. Los sistemas de suministro particulares pueden formularse para inyección intramuscular, intravenosa, intraarterial, o intratumoral.
Las formulaciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requieran para aproximarse a condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste de pH y reguladores, agentes de ajuste de tonicidad, agentes de humectación y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, etc.
La concentración del agente activo en las formulaciones farmacéuticas puede variar ampliamente, por ejemplo, de menos de aproximadamente 0,1%, generalmente en o al menos aproximadamente 2% hasta tanto como 20% a 50% o más en peso, y se seleccionarán principalmente por volúmenes de fluidos, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración que se selecciona.
Las formulaciones y métodos que se describen en la presente pueden ponerse en práctica por sí solos o en combinación con agentes quimioterapéuticos convencionales o regímenes de tratamiento.
XI. Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan y no se limitan al alcance de la invención.
A. Eliminaciones de región de control transcripcional de E1a
Líneas celulares, virus y plásmidos: las células de HEK-293A (células de riñón embrionario humano transformadas con adenovirus E1), HeLa (cáncer de cuello uterino), A549 (cáncer de pulmón), LNCaP (cáncer de próstata), Calu-6 (cáncer de pulmón), PANC-1 (cáncer de páncreas), AsPc-1 (cáncer de páncreas), y MRC-5, WI-38 e IMR-90 (fibroblastos de pulmón) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC), y se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco que se complementó con suero fetal bovino al 10% en presencia de CO2 al 5%. Las células primarias se inhibieron por contacto al cultivarlas al 100 por ciento de confluencia y continuando con incubación prolongada en medio completo.
Reconstrucción de mutación en el genoma Ad5: Ad5 de tipo salvaje (D1309), eliminación parcial de la región E3, y diversos mutantes por eliminación del promotor/potenciador de E1A de Ad5; D1309-6, D1340-12 y D187 se proporcionaron gentilmente por Patrick Hearing (Stony Brook University, USA). Para construir el virus TAV-255, se eliminó la región potenciadora del promotor E1a usando el plásmido vector de adenovirus pXC1 (Microbix Biosystem Inc.) usando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange II XL (Stratagene, La Jolla, CA) de acuerdo con su manual recomendado. Cebador d194_243_F 5' - AAA GTG ACG TTT TTG GTG TGC GCC GGT GTT TTG GGC GTA ACC GAG TAA GAT TTG GCC A - 3' (SEQ ID NO:1) y d194_243_R 5' - TGG CCA AAT CTT ACT CGG TTA CGC CCA AAA CAC CGG CGC ACA CCA Aa A ACG TCA CTT T - 3' (SEQ ID NO:2) se usaron para esta eliminación. Los plásmidos que se obtuvieron denominados pXC1_TAV-255 se amplificaron en E-coli, se secuenciaron, y se purificaron usando el kit Midiprep de filtro de plásmido HiPur (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para obtener adenovirus TAV-255, los plásmidos pXC1_TAV se cotransfectaron con pJM17 en células HEK-293 (ATCC, Manassas, VA) usando el reactivo de transfección Fugene®6 (Roche, Suiza). Las células se recubrieron con agarosa de placa marina al 1,0% en medio de cultivo para obtener plagas individuales en 12 días. Después de dos rondas de purificación de la plaga, los virus de una placa individual se amplificaron en células HEK-293. El ADN viral se extrajo del sobrenadante de cultivo usando el kit de extracción de ADN genómico AccuPrep (Bioneer Inc., Alameda, CA) y se secuenció para confirmar las mutaciones esperadas.
Reconstrucción de mutación por eliminación en el genoma dl309: todas las eliminaciones se realizaron inicialmente en pXC1 utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio (Quick change II XL) que se obtuvo de Stratagene, CA, de acuerdo con la recomendación del fabricante. Todos los cebadores que se usan para realizar eliminación específica son los siguientes (SEQ ID NOs: 3-12, respectivamente): para dl212 (dl212S- c Gg TGT ACA CAG GAA GTG ACA ATC GGT TTT AGG CG y dl212 As-CGC CTA AAA CCG ATT GTC ACT TCC TGT GTA CAC CG), dl220 (dl220S AGT GAC AAT TTT CGC GCA GGC GGA TGT TGT AGT A y dl220AS: AGT GAC AAT TTT CGC GCA GGC GGA TGT TGT AGT A), dl275 (dl275S: GTA ACC GAG TAA GAT TTG GCC ATG GAA AAC TGA ATA AGA GG y dl275AS: CCT CTT ATT CAG TTT TCC ATG GCC AAA TCT TAC TCG GTT AC), dl200 (dl200S: GCG CCG GTG TAC ACA GAC AAT TTT CGC GCG y dl200AS: CGC GCG AAA ATT GTC TGT GTA CAC CGG CGC), dl230 (dl230S: TTC GCG CGG TTT TAG GCT GTA GTA AAT TTG GGC G y dl230AS: CGC CCA AAT TTA CTA CAG CCT AAA ACC GCG CGA A). Los plásmidos mutados se secuenciaron en primer lugar para verificar la mutación conveniente y letra amplificada usando el kit HiPur Plasmid Midiprep (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para crear la mutación conveniente en el genoma dl309, el pXC1 mutado que contiene la mutación conveniente se cotransfectó con pJM17 en células HEK-293 (ATCC, Manassas, VA) utilizando el reactivo de transfección Fugene6 (Roche, Suiza). Las células se recubrieron con placa de agarosa marina al 1,0% en medio de cultivo para obtener plagas individuales en 10 días. Después de purificar la plaga dos veces, los virus de una placa individual se amplificaron en células HEK-293. El ADN viral se extrajo de las células de cultivo que se infectaron con virus mutante usando el kit de extracción de ADN genómico AccuPrep (Bioneer INc, Alameda, CA) y PCR amplificado y este último se secuenció para confirmar las mutaciones esperadas.
Infección, multiplicación y cuantificación del virus: todos los virus se multiplicaron en células HEK-293A. Las células se infectaron con MOI de 5 (para genoma Ad5) o 10 (para genoma dl309) y después de 3 días posteriores a la infección, se recolectaron células y se resuspendieron en medio completo y se lisaron durante 3 ciclos de congelamiento/descongelamiento. Los lisados se aclararon al hacerlos pasar a través de filtro de 0,4 pm (Millipore, EE.UU.). Se añadió glicerol a las muestras a una concentración final del 10% (v/v) y se congeló a -80°C. Para cuantificar la titulación del virus, se realizó un ensayo en placa según se describe por Clontech, EE.UU.
Preparación de lisados celulares y análisis de inmunotransferencia: para análisis de transferencia Western, se prepararon extractos celulares de diversas líneas celulares mediante infección de células con adenovirus con MOI de 5 y se prepararon lisados de células enteras usando reactivo de extracción de proteínas de mamíferos MPER® (Pierce, EE.UU.) en diversos momentos después de la infección. Se estimó la proteína usando el reactivo Bradford (Bio-Rad, EE.UU.), y 25 pg de muestras de proteínas se hirvieron durante 5 minutos en un regulador de muestra que contenía SDS al 2%, ditiotreitol 100 mM, Tris-HCl 0,05 M (pH 6,8), glicerol al 10% y azul de bromofenol al 0,1%. Se analizaron las proteínas en geles de bis-Tris del 4 al 12% de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, CA). Las muestras de proteínas se separaron mediante SDS-PAGE, se corrieron en un gel Bis-Tris al 4-12% (para genoma Ad5) y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF), Immobilon-Psq (Millipore, EE.UU.) según se describe por el fabricante. Se detectaron las proteínas E1a y/o E1b, por ejemplo, usando anticuerpos policlonales contra la proteína Ad2 E1A (Santa Cruz, EE.UU.) y antisueros monoclonales contra la proteína E1b-55k, que se recibió del Dr. A.J. Levine (Nueva Jersey, EE.UU.).
Análisis de PCR cuantitativa en tiempo real: el ARN se extrajo utilizando el mini kit RNase Easy plus (Qiagen, EE.UU.) y 1,5 |jg de ARN total se transcribieron inversamente en ADNc utilizando la transcriptasa inversa de AMV (Invitrogen, EE.UU.). La PCR-cuantitativa (Q-PCR) se llevó a cabo por triplicado usando el reactivo verde Power Cyber de Applied Biosystems, y la reacción se llevó a cabo en un sistema de detección de secuencia AB Prism 7900 HT. Se utilizaron muestras de ARN sin transcripciones inversas como control. Los datos se analizaron usando el software SDS 2.2.1 provisto por Applied Biosystems, EE.UU.
Construcción del plásmido: la secuencia de ADN del promotor/potenciador de adenovirus (Ad5) E1A (+52 a -357) se amplificó mediante PCR usando los cebadores Ad143F y Ad552R (directo 5'GGGGTa Cc a C ATG TAAG CGAC GGATG TGGC3' (SEQ ID NO: 13) e inverso 5'AAACTCGAGCCCGGTGTCGG AGCGGCT3' (SEQ ID NO: 14)) que tienen sitios de restricción 5' BamHI y XhoI, respectivamente, y se insertó en el vector reportero de luciferasa pGL3-Basic, un vector sin promotor y sin potenciador (Promega, EE.UU.) y se denominó pE1AP/EGL3. El plásmido se secuenció (Eton Biosciences, EE.UU.) para verificar la precisión del promotor/potenciador de E1A.
Transfección transitoria y actividad de luciferasa: para experimentos de transfección transitoria, las células se colocaron en placas de 6 pozos (5x105 células/pozo) el día anterior a la transfección. Las células se transfectaron mediante el método de trasferencia de genes mediada por PolyFect® según se describe en el manual de Qiagen. Brevemente, se mezclaron 25 microlitros de reactivo polyFect con 125 microlitros de DMEM (Highclone) que contiene 1 microgramo de plásmido reportero de luciferasa (pE1AEG13) o el vector de control de luciferasa pGL3 (Promega, Madison, EE.UU.), y 20 ng (proporción 50:1) del vector de expresión de luciferasa Renilla pRLCMV (Promega) como un control interno para normalizar los valores que se obtienen con la construcción de luciferasa. La mezcla se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación de complejos. La mezcla se diluyó luego en 1,0 ml de DMEM y se agregó a los cultivos celulares. Las células se cultivaron durante 24 a 48 h, y se lisaron con regulador de lisis pasivo (Promega). La actividad de luciferasa Firefly y Renilla se midió mediante el kit de ensayo Dual luciferase (Promega, EE.UU.), según lo especificado por el fabricante, en un luminómetro, Veritas (Turner Biosystems, CA, EE.UU.). Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces y representan la actividad relativa de luciferasa como un promedio.
Ensayo de viabilidad de células: los ensayos de viabilidad de células se llevaron a cabo por triplicado usando Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Rockville, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células (MRC-5, A549, PANC-1 o AsPC-1) se sembraron en placas de cultivo celular de 96 pozos a una densidad de 1x104 por pozo. Al día siguiente, las células se infectaron con virus (Wt Ad5, TAV-255, On Yx -015, dl309 o dl200+230) con un MOI de 5. Posteriormente, se aspiraron los virus, se agregó medio nuevo a cada pozo y se incubó durante 4-6 días. A cada pozo se agregaron 10 j l de reactivo y se incubaron en una incubadora de CO2 durante 4 h, y luego la placa se leyó a 450 nm en un lector de placas de 96 pozos GENious pro (Tecan, EE.UU.). Se registró la absorbancia y se calculó la viabilidad de células como sigue a continuación:
medias de células infectadas a A450
Viabilidad de células = X 100%
medias de células no infectadas a A450
El efecto citopático se visualizó además bajo el microscopio óptico y se fotografió con un aumento de 100x. Se llevaron a cabo además experimentos con violeta cristal para cuantificar la viabilidad celular en algunos casos (Fueyo, J., et al. (2003). Preclinical characterization of the antiglioma activity of a tropism-enhanced adenovirus targeted to the retinoblastoma pathway. Journal of the National Cancer Institute 95: 652-660).
B. Expresión selectiva de las isoformas de E1a 12S y 13S
Virus y células: se obtuvieron células A549 (carcinoma de pulmón), Calu-6 (carcinoma de pulmón), Panc-1 (carcinoma pancreático), LnCaP (adenocarcinoma de próstata), Hep-3b (carcinoma hepatocelular) y MRC-5 y WI-38 (fibroblastos de pulmón) de la American Type Culture Collection (ATCc ), y se cultivaron en el medio Eagle modificado de Dulbecco que se complementa con suero fetal bovino al 10% en la presencia de CO2 al 5%, a excepción de LnCap, que se mantuvo en RPMI que se complementó con suero fetal bovino al 10%, carbonato de sodio al 1%, piruvato de sodio al 1% y aminoácidos no esenciales al 1%. Los cultivos de MRC5 y WI-38 se inhibieron por contacto al cultivarlos al 100% de confluencia continuando con una incubación de 5 días con inhibición por contacto antes de la infección. Los virus PM975 y d11500 se proporcionaron por el Dr. Arnold Berk en UCLA.
Análisis de transferencia Western: se prepararon lisados de células enteras de muestra usando reactivo de extracción de proteína de mamífero M-PER (Pierce) con 1 pl/ml de inhibidor de proteasa HALT (Pierce) en diversos momentos después de la infección. Se estimó la proteína usando el reactivo Bradford (Bio-Rad, EE.UU.), y se hirvieron 20 mg de muestras de proteínas. Las muestras se sometieron a electroforesis en 1,5 mm, 4-12% de geles Bis-Tris (Invitrogen, CA) en regulador de corrida NuPAGE MOPS SDS durante 60 min a 190V. Las muestras se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF), Immobilon-Psq (Millipore, EE.UU.) durante 60 min a 100V. Después de la transferencia, las membranas se bloquearon durante 60 min en regulador de bloqueo T20 (TBS) (Thermo Scientific) con agitación suave. Después del bloqueo, las membranas se incubaron en una dilución 1:250 de anticuerpo policlonal de adenovirus E1A (# sc-430, Santa Cruz Biotechnology) que se diluyó en regulador de bloqueo durante la noche (12-18 h) a 4°C. Las membranas se lavaron con TBST, se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos con IgG anti-conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (# sc 2357, Santa Cruz Biotechnology) a una dilución 1:2000 en TBST, se enjuagó tres veces con TBST durante 5 min, y se lavó luego en TBS por 5 min. Las membranas se secaron, se incubaron en 2 ml de sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Pico (Pierce, Rockford, IL), y se secaron. Las transferencias se colocaron en una carpeta de revelado y se transfirieron a un casete de película. Las membranas se expusieron en película (Denville Scientific, Metuchen, NJ). Se obtuvieron exposiciones de 2 y 5 segundos.
Ensayo de citotoxicidad: el ensayo de viabilidad de células se llevó a cabo por triplicado usando Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Rockville, EE.UU.). Las células se sembraron en placas de cultivo celular de 96 pozos a una densidad de 1000 por pozo. Las placas se trataron 16 horas después de colocarse los virus WT, Onyx-015, PM975 o d11500 en placas a diversos MOls con 10 pl de una solución de medio viral/de cultivo. Las placas se incubaron durante el período de tiempo conveniente a 37°C y CO2 al 5%. Después de la incubación, las muestras se trataron con 10 pl de solución Dojindo CCK-8 en cada pozo. Las placas se leyeron a 450 nm usando un lector de placas de 96 pozos GENious pro (Tecan, EE.UU.) después de 4 horas de incubación.
C. Inserción de clon de E1b 19K
Construcción del virus: Ad TAV-255/dl 19kCD154-TNF se construyó como sigue a continuación: se usó el plásmido pXC1 (Microbix, Ontario, Canadá) para eliminar 50 pb del elemento potenciador/promotor de E1A de 194-254 con respecto al brazo izquierdo de repetición de terminal invertida de Ad5 por mutagénesis dirigida al sitio. El plásmido resultante se modificó para contener una Sal I en bp1716 y Xhol en 1916, lo que da como resultado la eliminación de la proteína E1b-19KD tras la restricción de estas enzimas. CD154-TNF se amplificó mediante PCR usando el plásmido pCDNA3CD154-TNF y se clonó en Sal I y Xho I emplazados en el plásmido que se describe. El virus recombinante se confeccionó por recombinación homóloga entre el plásmido JM17 y el plásmido de expresión pXC1 que contiene el casete TNF estabilizado por membrana en 293 células. Brevemente, 293 células se cultivaron al 60-70% de confluencia en el día de la transfección. Se recolectaron células y el sobrenadante 10 días después de la infección. Después de tres ciclos de congelamiento-descongelamiento, se realizó un ensayo de placa, se purificaron placas individuales y se aisló y caracterizó el ADN de virus recombinantes para la expresión de moléculas de TNF.
La divulgación que se realiza incluye además lo siguiente:
Párrafo 1. Un virus recombinante que comprende una secuencia reguladora de E1a modificada, en el que se elimina al menos un sitio de unión a Pea3, o una porción funcional de este.
Párrafo 2. El virus recombinante del párrafo 1, en el que se retiene al menos un nucleótido en el intervalo de -305 a -141.
Párrafo 3. El virus recombinante de los párrafos 1 o 2, en el que se elimina al menos uno de Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV, y Pea3 V, o una parte funcional de estos.
Párrafo 4. El virus recombinante de uno cualquiera de los párrafos 1-3, en el que se elimina al menos uno de Pea3 II y Pea3 III, o una porción funcional de estos.
Párrafo 5. El virus recombinante de uno cualquiera de los párrafos 1-4, en el que se elimina Pea3 II o una porción funcional de este, y Pea3 III o una porción funcional de este.
Párrafo 6. El virus recombinante de uno cualquiera de los párrafos 1-5, en el que se elimina al menos uno de Pea3 IV y Pea3 V, o una porción funcional de estos.
Párrafo 7. El virus recombinante de uno cualquiera de los párrafos 1-6, en el que se retiene Pea3 I, o una porción funcional de este.
Párrafo 8. El virus recombinante de uno cualquiera de los párrafos 1-7, en el que se retiene al menos un sitio de unión a E2F, o un parte funcional de este.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un adenovirus recombinante que comprende una secuencia de ADN que se inserta en un sitio de inserción de E1b-19K, en el que dicho sitio de inserción se ubica entre el sitio de inicio de Elb-19K y el sitio de inicio de E1b 55K y en el que dicho sitio de inserción E1b-19K comprende una eliminación de al menos 100 pares de bases, en el que además el gen Elb-55K no se altera, y en el que dicha secuencia de ADN es una secuencia que codifica un transgen, un gen canceroso o una secuencia de ADN mutada.
2. El adenovirus recombinante de la reivindicación 1, en el que dicho sitio de inserción comprende una eliminación de 202 pares de bases a continuación de dicho sitio de inicio de Elb-19K.
3. El adenovirus recombinante de la reivindicación 1 o 2, en el que dicho transgen es un gen supresor de tumor, un gen de toxina, un gen de citocina, un gen activador de profármacos o un gen apoptótico.
4. El adenovirus recombinante de la reivindicación 1 o 2, en el que dicho transgen es un factor de necrosis tumoral, kras, o una porción funcional de este.
5. El adenovirus recombinante de la reivindicación 1 o 2, en el que dicho transgen es una secuencia de p53 mutada.
6. El adenovirus recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el adenovirus recombinante comprende además una secuencia reguladora de E1a modificada, en el que se elimina al menos un sitio de unión a Pea3, o una porción funcional de este, en el que la porción funcional del al menos un sitio de unión a Pea3 es una porción del sitio de unión que, cuando se elimina, disminuye la afinidad de unión del sitio de unión a Pea3.
7. El adenovirus recombinante de la reivindicación 6, en el que se retiene al menos un nucleótido en el intervalo de -305 a -141.
8. El adenovirus recombinante de las reivindicaciones 6 o 7, en el que se elimina al menos un Pea3 II, Pea3 III, Pea4 IV y Pea3 V, o una porción funcional de estos, de manera opcional, en el que se elimina el objeto que se selecciona a partir de a), b) y c):
a) al menos uno de Pea3 II y Pea3 III, o una porción funcional de estos;
b) Pea3II o una porción funcional de este, y Pea3 III o una porción funcional de este; y
c) al menos uno de Pea3 IV y Pea3 V, o una porción funcional de estos.
9. El adenovirus recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en el que se retiene Pea3 I, o una porción funcional de este, de manera opcional, en el que se retiene al menos un sitio de unión a E2F, o una porción funcional de este, en el que la porción funcional del al menos un sitio de unión a E2F es una porción del sitio de unión que, cuando se elimina, disminuye la afinidad de unión del sitio de unión a E2F.
10. El adenovirus recombinante de la reivindicación 6, en el que dicho adenovirus recombinante comprende la eliminación de nucleótidos que se ubican secuencia arriba de un sitio de iniciación de E1a, en el que la eliminación se selecciona a partir de:
a) nucleótido -393 a -304;
b) nucleótido -305 a -255;
c) nucleótido -270 a -240;
d) nucleótido -299 a -293;
e) nucleótido -270 a -265; o
f) nucleótido -299 a -293 y nucleótido -270 a -265.
11. Una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y un adenovirus recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10.
12. Una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y un adenovirus recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para uso en el tratamiento del cáncer.
13. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la composición farmacéutica es para ponerse en contacto con una célula diana.
14. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicha célula diana es una célula neoplásica o una célula normal.
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