JPH11513251A - 抗腫瘍ベクター構築物及び方法 - Google Patents

抗腫瘍ベクター構築物及び方法

Info

Publication number
JPH11513251A
JPH11513251A JP9514070A JP51407097A JPH11513251A JP H11513251 A JPH11513251 A JP H11513251A JP 9514070 A JP9514070 A JP 9514070A JP 51407097 A JP51407097 A JP 51407097A JP H11513251 A JPH11513251 A JP H11513251A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
promoter
gene
nucleic acid
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP9514070A
Other languages
English (en)
Inventor
バルマン，アラン
ズュ，ジンジ
Original Assignee
サイクラセル リミテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9520079.6A external-priority patent/GB9520079D0/en
Application filed by サイクラセル リミテッド filed Critical サイクラセル リミテッド
Publication of JPH11513251A publication Critical patent/JPH11513251A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/005—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination repressible enhancer/promoter combination, e.g. KRAB
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/005—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination repressible enhancer/promoter combination, e.g. KRAB
    • C12N2830/006—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination repressible enhancer/promoter combination, e.g. KRAB tet repressible
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/40—Vector systems having a special element relevant for transcription being an insulator
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

(57)【要約】 非腫瘍遺伝子のような遺伝子の発現をターゲット化する組成物は、第一の遺伝子(1)の発現が非腫瘍細胞においてその機能が抑制される第一のプロモーター(2,3)によってコントロールされる第一の核酸構築物、及び非腫瘍細胞において第一の遺伝子を下流調節するために第二の遺伝子(4)の発現が、非腫瘍細胞において上流調節される第二のプロモーター(5,6)によってコントロールされる第二の核酸構築物を含む。第二のプロモーターはp53結合によって調節され、例えばp53がミューテートされている細胞のような、発現のp53下流調節が破壊されている細胞に対して第一の遺伝子の発現をターゲット化し得る。第一のプロモーターは腫瘍細胞において上流調節されるものであり、例えばミュータントp53腫瘍細胞において上流調節されるHsp70プロモーターである。適した非腫瘍試薬はチミジンキナーゼであり、非腫瘍細胞とは反対に腫瘍細胞に対して特異的に細胞殺傷機能を提供するために該組成物を使用することが示されている。

Description

【発明の詳細な説明】 抗腫瘍ベクター構築物及び方法 本発明は腫瘍細胞の増殖のコントロール、好ましくは該細胞を殺すことによる コントロールに関する。より特定すると細胞毒性試薬または抗増殖試薬(ここで 一般的には抗腫瘍試薬という)を用いて腫瘍細胞を選択的に攻撃する方法及び手 段に関する。 抗腫瘍試薬を腫瘍細胞にターゲット化する概念は、多くの年月をかけて考えら れ研究されている。該アプローチには例えば細胞毒性試薬のキャリアーとして想 像上の腫瘍特異的抗体またはリガンドの使用が含まれるが、これには全ての腫瘍 細胞で存在し、実質的には通常の細胞には全く存在しない抗原またはリガンド受 容体の発見といった問題がある;またターゲット腫瘍細胞への接合を物理的にな すという問題もある。 様々な遺伝子治療ストラテジーが提案され、そのいくつかは現在では臨床上の 実施に入っている。これらには、免疫系により腫瘍の認識及び除去を刺激すると いう期待を持って、外殖された腫瘍細胞内にまたは腫瘍湿潤リンパ球(TIL)内に サイトカインをex vivoで導入し、引き続きこれらの細胞を患者内に再導入する ことが含まれる[1]。 補足的なアプローチとしてプロドラッグ活性化酵素を導入することがあり、該 酵素のもっとも一般的なものは、プロドラッグ、ガンシクロビルをホスト細胞を 殺傷可能な細胞毒性代謝物に代謝し得る単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ 遺伝子(HSVTK)である[2]。本ストラテジーの主要な利点は「バイスタンダー効果」 と呼ばれるものが、全ての腫瘍細胞に対する遺伝子のターゲット化の必要性を制 限することである。TK遺伝子を用いると、生産される細胞毒性ドラッグが周辺細 胞内にギャップ結合チャンネルを通って通過し得[3]、結果として腫瘍内のわず か10-20%の細胞にのみのターゲット化が完全な腫瘍抑制を導き得る。全ての提案 されたガンの治療に対して同様な一連の問題は、いかなる新規なドラッグの発見 の手段、その取り込みと安定化の最適化、通常細胞に対する腫瘍細胞のターゲッ ト 化にとっての特異性及び全ての腫瘍細胞がドラッグにさらされることを確実にす る必要性を含み、それらに答えなければならないのである。 遺伝子治療の発展は正確に同様の困難性に直面しているが、克服するのが最も 困難なチャレンジはおそらくターゲット化された遺伝子の腫瘍特異的発現を操作 する能力であろう。この問題に挑戦し回避するもっとも一般的に用いられる方法 は、特定の腫瘍タイプにおいて治療上の遺伝子の発現を導く組織特異的遺伝子プ ロモーターの使用である。例えばチロシナーゼプロモーターは現在ではメラノー マ細胞においてTKを発現するために用いられている[4]。しかしながら該プロモ ーターは通常のメラノサイトで活性であるのと同様にニューロンにおいてもそう である。一つの改変は胸部ガンにおけるerbB2遺伝子のような、腫瘍において上 流調節する遺伝子のプロモーターを利用することである[5]。しかしながらこの 遺伝子はまた通常細胞でも発現しており、いかなる場合でもその脱調節だけがヒ ト胸部腫瘍、脾臓腫瘍及び胃腫瘍の比較的小部分(20-30%)で生じる。それゆえ現 在利用可能な系の全てが腫瘍細胞に対する通常細胞にとっての特異性が弱く、応 用可能性は大変特異的な腫瘍タイプに制限されているという欠点に苦しんでいる 。 それゆえ本発明の一つの目的は、腫瘍細胞と通常細胞の間で抗腫瘍試薬の機能 における改良された区別を得ることである。 広義の意味で本発明にしたがった抗腫瘍試薬の腫瘍内での発現に対する選択性 は、2のアプローチの組み合わせによって達成されるであろう:(i)腫瘍細胞にお ける介在遺伝子の上流調節及び(ii)通常細胞における介在遺伝子の下流調節であ る。効果(i)は腫瘍細胞内及びその周辺で望ましい活性を介在し、一方で効果(ii )は通常細胞における該活性の「漏れた」発現の範囲を減少するであろう。 このアプローチの好ましい主成分はp53遺伝子周辺に集中する。p53タンパク質 は通常細胞における転写アクチベーターであるが、ヒト腫瘍の実質的な部分(40- 80%)ではミューテーション形態で存在する。しかしながらp53のミューテーショ ン頻度は、腫瘍におけるp53腫瘍抑制機能の不活性化の現実の発生を過小評価し そうである。p53配列が野生型である腫瘍においてでさえ、DNA修復、分化、ゲノ ム可塑性またはアポトーシス[43-45]といった細胞周期コントロールにおけるそ の通常の機能は、細胞タンパク質(例えばmdm2)またはオンコウイルスタンパク質 (例えば SV40 T抗原、ヒトパピローマウイルスE6タンパク質、アデノウイルスE1Bタンパ ク質、B型肝炎ウイルスXタンパク質及びエプスタインバーBZLF-1タンパク質)と の相互作用によって、またはp53タンパク質が非機能的である細胞質へ隔離され ることによって排除されるであろう。 該ストラテジーは通常細胞と腫瘍細胞の間のp53タンパク質の転写活性化機能 及び安定性機能における差異を利用している。より特定するとそれは通常細胞に おいて抗腫瘍遺伝子の発現を除去しまたは最小化し、腫瘍細胞においてその発現 を増大する野生型p53(wtp53)の二重転写調節機能を利用している。この目的のた め該ストラテジーは2の遺伝学的ユニットの組み合わせを提案する。遺伝学的ユ ニット1においては、抗腫瘍遺伝子はその機能がwtp53によって抑制されるが、ミ ュータントp53(mp53)によって抑制されず、実際mp53によって上流調節さえされ 得るプロモーターによってコントロールされる。遺伝学的ユニット2においては 、通常細胞において抗腫瘍遺伝子を下流調節するための遺伝子が、p53結合部位 を含むプロモーターによってコントロールされ、それゆえそれはwtp53によって 強力に上流調節されるがmp53によってはされない。言い換えると通常細胞におけ るwtp53は、該通常細胞において抗腫瘍試薬の発現を下流調節する遺伝子を上流 調節するために用いられる。該下流調節遺伝子は例えば抗腫瘍遺伝子に対するア ンチセンスRNA、または抗腫瘍遺伝子に対する特異的転写サプレッサーを発現し てもよい。 例としてこの系は腫瘍細胞におけるHSVTKのようなプロドラッグ活性化酵素の 発現を操作するために用いられ得るが、IL-2及びGMCSFのようなホスト抗腫瘍応 答を増大する遺伝子、サイトカイン、baxのような腫瘍特異的アポトーシスを誘 発するであろう遺伝子または他の毒素、あるいは例えば腫瘍細胞においてのみ複 製可能な機能の腫瘍細胞に対するターゲット化のためにも有用である。 本発明にしたがった二重遺伝学的ユニット構築物の例示的な実施態様が、参考 として抗腫瘍遺伝子としてHSVTKの発現及びp53ベース調節を用いて図1A及び1Bに 概略的に示されており、さらに以下に記述されていよう。 本発明は、腫瘍抑制におけるその中枢の役割及び通常細胞と腫瘍細胞における その機能の差異のため、好ましくはp53遺伝子に基づいている。しかしながら本 発明の一般的な概念は、腫瘍細胞において抗腫瘍試薬を上流調節し、通常細胞に お いてそれを下流調節する他の遺伝子を用いて応用可能であろう。天然の腫瘍サプ レッサー経路は複雑であり多くの遺伝子を含むため、少なくともそれらのいくつ かが同様な方式で用いられるであろう。 p53に関する本発明のさらに詳細な説明 事実上すべての悪性腫瘍細胞の最も共通の性質は染色体が異数性であることで ある。おそらくp53のようなゲノムの安定性及び完全性をコントロールする遺伝 子におけるミューテーションの蓄積のため、腫瘍細胞は一般的に不安定であると いうことを示す非常にたくさんの証拠が存在する[6]。該遺伝学的変化の重要性 は腫瘍細胞がDNA損傷を示すシグナルを実質的に産するであろうことである。本 発明の面においてp53の主要な目的は、スイッチをオンにするための腫瘍細胞に おける内因性「DNA損傷」応答を利用し、プロドラッグ活性化酵素のような抗腫瘍 試薬を安定化するであろう遺伝子構築物を操作することである。 我々は抗腫瘍試薬の遺伝子発現の特異的なターゲット化が達成されるであろう 数多くの手段を考える。現在好ましい提案の中枢は、p53腫瘍抑制遺伝子が発達 中の腫瘍細胞におけるDNA損傷または染色体異数性のセンサーとして機能し得る という観察である[6]。通常細胞においては、p53は外因性試薬によって誘発され るDNA損傷に、最初にタンパク質自体の安定性を増大することによって及び/また はそのmRMAの翻訳活性を増大することによって応答する[7]。重要なことには内 因性p53遺伝子の異なる発現レベルを示す腫瘍細胞系内へのp53由来の同じミュー タントの導入は、外因性p53がその内因性カウンターパートとして同様の方法で 安定化されることを示している[8]。言い換えると、タンパク質の安定性及び発 現のレベルは単純にコード配列内のミューテーションの結果とは言えないが、腫 瘍細胞微環境によって決定される。 通常細胞におけるp53の安定化は直接的にアポトーシスを導き得、またはp21/W af-1のような遺伝子の誘導を通じてG1休止を引き起こし得る[9]。多くの腫瘍細 胞においては、p53野生型配列の欠失のためまたはこれらの応答を誘導しない他 の構造的な形態によって、これらの応答は排除される。興味深いことに、これら のミューテーションの大部分はp21/Waf-1のような遺伝子に見出される認識配列 を通じ て転写を活性化しないが、それにもかかわらずこれらのいくつかは、MDR1遺伝子 [10]、またはHsp70遺伝子[11]プロモーターのような特定の腫瘍細胞で上流調節 されることが知られている他の遺伝子プロモーターからの転写を刺激し得る。 例えばTK発現を促すような単一の組織特異的または腫瘍選択的遺伝子プロモー ターの使用が、通常細胞と腫瘍細胞の間の十分な区別を与えることは極めてあり えそうもないので、本発明は遺伝子治療の目的のため例えばHSVTKの発現をコン トロールするため、野生型及びミュータントp53によって改変された転写コント ロール及びp53タンパク質の改変された翻訳または安定性の両者の使用を提案す る。該転写コントロール及び該翻訳または安定性コントロBcl1、個々的にまたは 組み合わせて用いられるであろう。構築物は初めにin vitroで試験されるが、究 極的にはヌードマウス及びトランスジェニックマウスにおいてヒト腫瘍異種移植 を用いてin vivoで腫瘍特異性のため精密に試験されるであろう。 便宜には最初の研究はルシフェラーゼのようなマーカー遺伝子を用いて実施さ れ、同様にHSVTK(プロドラッグ活性化酵素)も用いられるが、それからこれらは 他の系に拡大されるであろう。提案した系の利点には、腫瘍細胞タイプの範囲の 広い応用可能性、及びプロドラッグ活性化酵素に加えて例えばIL-2のようなホス ト抗腫瘍応答を増大する遺伝子、GMCSF、サイトカイン、baxのような腫瘍特異的 アポトーシスを誘導するであろう遺伝子、毒素または例えば腫瘍細胞においての み複製可能なウイルスといったウイルス複製能力をコントロールする遺伝子など の他の潜在的な治療上の遺伝子の腫瘍特異的発現を含むために、系を拡大する能 力を含む。 p53介在性転写コントロール 野生型p53タンパク質は少なくとも4の機能的ドメインを含み、その一つ(102-2 90残基)は2コピーのコンセンサス配列5'-PuPuPuC(A/T)(A/T)GpyPyPy-3'と結合す る[12-15]。以下で記述されるようにGCCC+というコンセンサス配列の二量体がこ こで用いられており、GC3p53(該配列はGC3(GGACTTGCCT)2を用いて増幅される)と して知られている。該配列を通じたトランス活性化は数多くの細胞の遺伝子の転 写レベルを増大し、そのいくつかは細胞増殖のネガティブ調節においてまたはプ ログラムされた細胞死(アポトーシス)を誘導することにおいて主要な役割を演じ ている。 p53コンセンサス配列はp21/Waf-1 cdkインヒビターをコードする遺伝子の5'領 域に存在し、それは後期G1期で細胞サイクルを休止させ得、DNAポリメラーゼデ ルタの調節サブユニットである増殖細胞核抗原(PCNA)の機能を阻害する[17]。 Bcl-2の阻害によってアポトーシスを促進するBaxタンパク質をコードする遺伝 子の上流調節もまた、野生型p53によって誘発されることが報告されている[18] 。 トランス活性化のこの形態はp53コンセンサス結合部位を含むプロモーターに 限定されているようであり、そこではBcl-2[19]、PCNA[20,21]、多剤耐性遺伝子 MDR1[10]及びHSP70遺伝子[11]を含む数多くの他の細胞遺伝子のプロモーターを 野生型p53がネガティブに調節する。おそらく後者の効果は基本となる転写装置 の構成要素と野生型p53の複雑な構造を含むであろう[22-25]。 p53遺伝子におけるミューテーションのほとんどが配列特異的転写活性化機能 の排除を導き、in vitroで腫瘍細胞増殖の抑制を妨げる。これはヘテロ接合体細 胞において野生型p53機能のドミナントネガティブな抑制に貢献するが、ある場 合には機能的性質の増大がいくつかのミュータント形態で得られている[26]。該 機能の増大は、通常野生型p53によって抑制されているトランス活性化プロモー ターに対するいくつかのミュータントp53アリルの報告された能力のためであろ う[11]。例えばHSP70プロモーターに加えて、PCNA及びHDR1プロモーターの両者 は、いくつかのミュータントp53遺伝子によってトランス活性化されることが報 告されている[20,27]。 野生型及びミュータントp53に対するこれらの反対の転写応答を示す遺伝子プ ロモーターは、腫瘍特異的遺伝子ターゲット化に極めて有用であろう。MDR1また はHSP70プロモーターのそれぞれによって得られる構築物は、ミュータントp53遺 伝子を運ぶ腫瘍細胞において高レベルで発現されるが、野生型p53を発現してい る通常細胞においては抑制されることが期待されるであろう。しかしながらこれ らのプロモーターの使用においては選択的な活性が存在し得るが、通常細胞と腫 瘍細胞の間の完全な区別は期待できないであろう。それゆえ我々は(図1における 例として示したような)通常細胞において特異的に発現を抑制するようにデザイ ンされ た付加的なコントロールエレメントを取り込む。その全体の強度が比較的穏やか であるため、HSP70プロモーターはＩ型ユニットに対するプロモーターの適した 選択肢であり、それは完全な抑制が野生型p53を用いて通常細胞において達成さ れ得ることがより生じ得そうである。 最初の構築物は2の別々の遺伝学的ユニットを含む。HSVTK遺伝子はミュータン トp53によって抑制されず、それによって刺激さえされ得るが、野生型p53によっ て抑制されるプロモーター(Ｉ型プロモーター)によって発現される。第二の遺伝 学的ユニットは通常細胞においてTK遺伝子のいかなる漏れた発現をも抑制するよ うにデサインされている。このユニットのプロモーター(II型プロモーター)は、 転写開始部位及びTATAボックスを含む最小プロモーターの存在を条件として、野 生型p53によってのみ活性化されるp53コンセンサス結合配列を含む。p53結合配 列は最小プロモーターの上流または下流に含まれるかもしれない。ここで関係す る実験結果は、一つの実験系においてよりよい結果が遺伝学的ユニットIIにおけ るプロモーターから下流でp53結合配列を持つと達成されることを示す。 p53から離れて腫瘍抑制経路に関連する他の遺伝子が本発明で利用されよう。 例えばp16 INK4A遺伝子は腫瘍抑制機能を持つ。それは、p16プロモーターを順番 にネガティブに調節するRbタンパク質の脱リン酸化を阻害する。Rbネガティブ腫 瘍は高p16レベルを持つ傾向にあるため、多くの腫瘍はRbまたはp16の欠失を持つ が両者の欠失は持たない。それゆえp16プロモーターはRbネガティブ腫瘍におい て強く上流調節されるはずであり、我々の二重構築物においてＩ型プロモーター として用い得るであろう。 通常細胞において漏れた転写を抑制する様々な手段が用いられ得、3の異なる アプローチが実験的に考えられている(結果は以下に提供される)。 (i)第一のアプローチはII型プロモーター（例えばp53反応性）から由来するア ンチセンス構築物(例えばHSVTKに対する)を用いる。それゆえアンチセンス転写 産物はミュータントp53のみをもつ腫瘍においては生産されないが、この構築物 は通常細胞内で転写的に活性化されるはずであり、Ｉ型プロモーターから由来す るいかなる機能的TK転写産物の下流調節をも導くはずである。たとえ通常細胞が 野生型p53の大変低レベルのみを発現するとしても、トランスフェクションによ る遺伝子 構築物の導入は検出可能な野生型p53の発現を誘導することが示されている[28] 。それゆえ該誘導は図1に示された構築物を用いて通常細胞と腫瘍細胞の間の区 別を改良するのに役立つであろう。低投与量放射線照射は通常細胞においてwtp5 3を誘導することが期待されるであろうが、腫瘍細胞においてはそうではなく、 区別もまた改良するであろう。 (ii)通常細胞においてTKのようなポリペプチドの活性レベルを抑制する第二の アプローチは、ターゲット(例えばTK)mRNAと複合体を形成し及び切断するように デザインされた特異的リボザイム[29]の使用を含む。 (iii)第三のアプローチは配列特異的転写サプレッサーを用いる。いくつかの 該転写サプレッサーが特性指摘されている。実験には、Ｉ型プロモーター内にク ローン化されたGal-4ターゲット配列[31]のタンデム繰り返しを用いて発現を抑 制するために、II型プロモーターのコントロールの下で酵母Gal-4転写因子の結 合ドメイン及びDrosophilaイーブンスキップトタンパク質[30]の抑制ドメインを 使用することが含まれる。さらなる実験は以下に記述されており、例えばlacＩ およびtet受容体系が含まれる。 2以上の該アプローチの組み合わせが利用され得る。しかしながら最も適した アプローチは発現される抗腫瘍遺伝子にしたがって変化するであろう。 もしアンチセンスまたはリホザイム法が用いられたならば、II型ユニットによ って発現される配列はＩ型ユニットによって発現される配列につながれるに違い なく、実験に複雑性のレベルを加える。対照的に、転写サプレッサーの使用は異 なるコード配列、例えば抗腫瘍配列またはマーカー配列がその中でII型ユニット につなぐ必要なくＩ型プロモーターのコントロールの下で挿入されるであろう「 ユニバーサルカセット」の構築を許容するという利点を持つ。 本発明の抗腫瘍系の実験的な最適化においては、生産され得る効果の大きさを 評価するために、最初にＩ型及びII型プロモーター構築物を個々的に試験するで あろう。それから野生型またはミュータントp53の存在下でルシフェラーゼのよ うなレポーター遺伝子の全体の発現レベルを測定して両構築物の組み合わせた効 果を評価するために、コトランスフェクトを実施するであろう。最後に、両遺伝 学的ユニットを、ヘッド-トゥー-ヘッド(図1のような)、テール-トゥー-テール また はヘッド-トゥー-テール配列のいずれかで単一の構築物内に取り込ませ、後者の 場合にはＩ型プロモーターの上流にII型プロモーターをもち、逆もまた然りであ る。もし2の構築物の間で転写またはエンハンサー抵触があったならば、これは 相対的なユニット間の距離及び/またはユニットの配向を改変することにより、 及び/または構築物の直線化により、及び/または(図1参照)インターラプター(イ ンスレーター)配列と呼ばれるものを取り込ませることにより克服し得、該配列 は例えばDrosophila[32,33]及びチキン[34,42]の系で特性指摘されており、近接 転写ユニットにおけるエンハンサーエレメントの間の相互作用を妨げることが示 されている。 p53介在性安定化 本発明の一面として、発現産物が腫瘍細胞において安定化されることが望まれ る第一の遺伝子が、腫瘍細胞において安定化されるp53タンパク質またはp53タン パク質の断片をコードする配列との融合物として提供される組成物が提供される 。それゆえ核酸構築物は興味あるポリペプチドと、腫瘍細胞において安定化させ るp53タンパク質またはp53タンパク質の断片の融合物であるポリペプチドをコー ドする遺伝子を含む。 ここで提供される実験的証拠は、該融合タンパク質の安定性が野生型p53と同 様の方式で調節されることを示す。該融合物は野生型p53を安定化するコンディ ションの下で細胞において安定化される。ミュータントp53または野生型p53のい ずれかを発現するが、細胞内での異常な配置のため(ここで他の箇所で議論され ているように、細胞質においてのような)、除去された機能のない腫瘍細胞に、 抗腫瘍試薬のようなポリペプチドの機能的な発現をターゲット化するために該構 築物は有用であろう。 非腫瘍細胞では反対のように腫瘍細胞内で機能的な発現をターゲット化する場 合にp53介在性安定化を使用することは、上記及び以下で議論される転写コント ロールアプローチと組み合わせ得る。 本発明にしたがった組成物、細胞及び方法は、非腫瘍細胞に対しては反対であ るような望ましい遺伝子の発現を腫瘍細胞にターゲット化する方法において用い られ得る。該方法はin vivo(例えば治療上の目的に対してヒトまたは動物の体の 治療のために)、ex vivo(例えばヒトまたは動物の体から摘出された細胞に対し て、体に細胞を戻す前に)、またはin vitroで実施されるであろう。組成物及び 細胞は望ましい遺伝子の発現が腫瘍細胞にターゲット化される治療に対する薬剤 の製造において用いられ得る。核酸構築物はウイルスベクターの一部を形成し、 例えばウイルスベクターはヒトのような個体への投与、好ましくは付加的に腫瘍 ターゲット化に適したように操作される。 適したベクターは、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化 配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び適当な他の配列を含む適した調節 配列を含むように選択されまたは構築され得る。ベクターはプラスミド、ウイル ス等適したようなものであろう。さらなる詳細に対しては、例えばMolecular Cl oning:a Laboratory Manual:第二版,Sambrook等,1989,Cold Spring Laboratory Press参照。例えば核酸構築物の調製、ミュータジェネシス、シークエンス、細 胞内へのDNAの導入及び遺伝子発現などの核酸操作、そしてタンパク質の分析に 対する多くの既知の方法及びプロトコールが、Short Protocols in Molecular B iology,第二版,Ausubel等,編,John Wiley & Sons,1992に詳細に記述されている 。ここで引用される他の文書の全てと共に、Sambrook等及びAusubel等の開示は 参考として取り込まれる。 本発明にしたがって、提供される組成物は個体に投与されるであろう。投与は 好ましくは「治療上の有効量」でなされ、これは患者にとって利益を示すのに十分 なものである。該利益は少なくとも一つの徴候の少なくとも改善であろう。投与 される現実の量及び投与の割合そしてタイムコースは、治療されるものの性質と ひどさに依存しよう。例えば投与量等の決定などの治療の処方は、一般的な実施 者及び他の医療の医者の責任内にある。 組成物は治療される病気に依存して、単独でまたは他の治療と同時にあるいは 連続的にのいずれでも投与されよう。 本発明にしたがった製薬学的組成物、及び本発明にしたがった使用のための該 組成物は、活性成分に加えて製薬学的に許容できる賦形剤、キャリアー、バッフ アー、安定剤または当業者に既知の他の物質を含むであろう。該物質は非毒性で あるべきであり、活性成分の効力を妨げないものであるべきである。キャリアー または他の物質の正確な性質は投与経路に依存するであろう。 本発明に対する実験的サポートが説明のためここで記述されよう。本発明の様 々な付加的な面及び実施態様が当業者に明白であろう。以下に図の説明をする: 図1は本発明にしたがった構築物の例示的実施態様を示す。Ｉ型ユニット(1)( 右側)は、プロモーター(3)の下流にサプレッサー結合部位(2)をもつ;代わりの構 築物においてはＩ型ユニットにおけるサプレッサー結合部位がプロモーターの上 流に存在する。もしII型ユニット(4)がアンチセンスRNAまたはリボザイムを発現 するならば、該サプレッサー結合部位は不存在であろう。II型プロモーター(5) においては、p53結合部位(GC3p53)(6)は最小プロモーターエレメントのの上流ま たは下流に存在するであろう。Ｉ型ユニットとII型ユニットの間に存在するよう に示されているインスレーター(8)は必ずしも必要ではないであろう。 図2はHSVtkプロモーター(-109から+52)及びGC3p53配列のコントロールの下で 配列をコードするルシフェラーゼを含む2の構築物(図2A)の概略を示す。GC3p53t k-luc(図の右側)においては、GC3p53配列はtkプロモーターエレメントの上流に 存在する;tkGC3p53-luc(図の左側)では、それは下流に存在する。トランスフェ クションアッセイの結果が表1に示されている:1μg tkGC3p53-luc(レーン1-4)ま たはGC3p53tk-luc(レーン5-8)が、1μgのpCI(CMVプロモーターをもつ空のベクタ ー)、p53遺伝子がK562細胞内でCMVプロモーターのコントロールの下にある0.5及 び1.5μgのwtp53及び1μgミュータントp53(mt3:143ala-val)構築物と共にコトラ ンスフェクトされた。図2BはpCIを用いたものに対するwtp53またはmtp53のそれ ぞれを用いてトランスフェクトされた細胞由来の抽出物におけるルシフェラーゼ 活性の割合を示す(表１の「割合」欄に示されている)。図2Cは現実のルシフェラー ゼ活性を示す。結論は、tkGC3p53エレメントはGC3p53tk構築物より野生型p53の 不存在下で高いバックグランド活性を示すが、後者はp53コトランスフェクショ ンによってずっと強い相対的誘発性を示すというものである。 図3はCMVプロモーター(pCMV-aluc-polyA+構築物)またはGC3p53-Tkプロモータ ー (GC3p53pt109-aluc-polyA+構築物)のコントロールの下でフルレングスアンチセ ンスルシフェラーゼコーディング配列を含む構築物の該略図を示し(図3A)、GC3p 53-Tkプロモーターのコントロールの下でルシフェラーゼコード配列(+582から+1 )のアンチセンス配向部分で含むGC3p53pt109-aluc(-)polyA+構築物の該略図(図3 B)を示す。表2は野生型及びミュータントp53の存在下及び不存在下でのトランス フェクションアッセイの結果を示す。1μg HSp70-lucをコントロールベクターpC I(レーン1,4及び7)、wtp53(レーン2,5及び8)またはmt143(レーン3,6及び9)と共 にコトランスフェクトした。GC3p53pt109-aluc-polyA+、GC3p53pt109-aluc-(-)p olyA+及びpCI-alucもまたK562細胞内にトランスフェクトした(それぞれレーン4- 6,7-9及び10)。2日の培養後、ルシフェラーゼ活性を測定し、レーン1(レーン1-3 ,10に対して)、レーン4(レーン4-6に対して)及びレーン7(レーン7-9に対して)に 対する割合を、wtp53単独で及びアンチセンスと組み合わせた抑制効果を説明す るために用いた。これはまたプロットの形態で図3Cでも説明されている。 図4は以下のことを示す:図4A−ルシフェラーゼ遺伝子内に15ベースペア基質配 列をターゲット化するようにデザインされたリボザイムの配列、及び基質配列(p GL3-ベースのluc遺伝子の716-731由来);図4B−2の相補的オリゴヌクレオチドの 配列(lucRa及びlucRb)。再アニール化したオリゴを発現ベクターpCIのSal I/Sma I部位内にクローン化した。図4C−CMVプロモーターのコントロールの下にある リボザイムを含み、イントロン配列を含むpCI-luc-ribo(9)(図の左側)構築物の 該略図、及びPstＩ/KpnＩ切断により欠失させ、引き続き細菌内に自己ライゲー ション/トランスフェクションをした、前者の構築物のイントロン欠失誘導体で あるpCI-luc-ribo*(2)(図の右側)構築物;表3は該構築物を用いたトランスフェク ションアッセイの結果を示す:ルシフェラーゼ遺伝子がヒトHsp70プロモーター(- 117から+26まで)のコントロールの下にある1μg Hsp70-lucを、1または2μg pCI (レーン1及び4)、1または2μg pCI-luc-ribo(9)(レーン2及び5)、及び1または2 μg pCI-luc-ribo*(2)(レーン3及び6)と共にコトランスフェクトした。ルシフェ ラーゼ活性を2日の培養後測定した。ルシフェラーゼの発現に対するリボザイム の効果は、pCI DNAを用いたトランスフェクト物に対する各トランスフェクト物 のルシフェラーゼ活性の割合として存在する(上部に「割合」とある欄)。この割合 はまた図4Dにおい てプロット形態で示されている。リボザイムに対するバックグランドリファレン スは、Kashani-SabetとScanlon,1995,Cancer Gene Therapy,2(3):213-223、及び MercolaとCohen,1995,Cancer Gene Therapy,2(1),47-59を含む。 図5:図5AはHSP70プロモーターのコントロールの下でルシフェラーゼコード配 列を含むＩ型遺伝学的ユニット構築物を示す。Hsp-LacO-luc(1)においては、Lac オペレーター配列の3コピーが、プロモーターとコード配列の間に存在する。Hsp -TetO-luc(2)においては、TetOオペレーター配列の7コピーが、プロモーターと コード配列の間に存在する。図5BはII型遺伝学的ユニット構築物を示し、該ユニ ットはコード配列と実施可能に結合したGC3p53配列及びHSVtkプロモーターを含 み、該コード配列はLacリプレッサーに対してGC3p53tk-LacR(1)内に存在し及び 融合タンパク質に対してGC3p53tk-TetR-KRAB(2)内に存在し、該融合タンパク質 はDrosophilaのTetリプレッサーのDNA結合ドメイン及びKRABリプレッサーの抑制 ドメインを含む。表4は図5A及び図5BのＩ型及びII型遺伝学的ユニットを用いた コトランスフェクション実験の結果を示す:Hsp70-lacO-lucをpCI(レーン1)、F9- 1ポリオーマウイルスプロモーターのコントロールの下でlacリプレッサーをコー ドするp3'ss(レーン2)、wtp53(レーン3)、wtp53+GC3p53tklacR(レーン4)、mtp53 143(レーン5)及びmtp53(143ala>val)+GC3p53tklacR(レーン6)を用いてK562細胞 内にトランスフェクトした。Hsp70-tetO-lucをpCI(レーン7)、CMV-tetR-KRAB(レ ーン8)、wtp53(レーン9)、wtp53+GC3p53tk-tetR-KRAB(レーン10)、mtp53 143(レ ーン11)及びmtp53+GC3p53tk-tetR-KRAB(レーン12)を用いてK562細胞内にトラン スフェクトした。ルシフェラーゼ活性をオーバーナイトで培養後測定し、抑制効 果をそれぞれレーン1及びレーン7のトランスフェクト物のものに対して各トラン スフェクト物(レーン2-6及び8-12)のルシフェラーゼ活性の割合として表した。 図5Cは表4で「割合」と示された欄で与えられた結果をグラフで示す。 図6:図6AはＩ型遺伝学的ユニット構築物を示し、該構築物はコード配列とプロ モーターの間に酵母転写因子GAL-4の認識部位のタンデム繰り返しと共に、Hsp70 プロモーターのコントロールの下でルシフェラーゼコード配列を含む。図6BはII 型遺伝学的ユニットを示し、該ユニットはGAL4DNA結合ドメイン及び(1)Dorosoph ilaイーブンスキップト転写因子のBCDEFドメイン、(2)Dorosophilaイーブンス キップト転写因子のCDEFドメインを含む融合タンパク質の発現をコントロールす るアクチンプロモーター(参考文献30)を含む。表5は1μg Hsp70-GAL4-lucを1μg pCI(レーン1)、wtp53(レーン2)、BCDEF(レーン3)及びCDEF(レーン4)と共にK562 細胞内にトランスフェクトした結果を示す。それぞれ由来のルシフェラーゼ活性 をオーバーナイト培養後測定し、抑制効果をレーン1のものに対するレーン2-4の luc活性の割合として表した。図6Cはグラフ形態での該割合を示す。GAL4認識部 位を含む配列の挿入後でさえ、Hsp70プロモーターはp53プロモーターに対するも ともとの応答を維持する。Drosophilaイーブンスキップトタンパク質による特異 的抑制は約40%である。 図7はCMVプロモーターのコントロールの下でGUSを含む遺伝学的ユニットＩ(pC I-GUS)、及びtkプロモーター及びGC3p53エレメントのコントロールの下でルシフ ェラーゼを含むII型遺伝学的ユニット(GC3p53tk-Iuc)を、野生型p53を発現する 構築物のコトランスフェクションの存在下または不存在下で細胞内にトランスフ ェクトした実験の結果を示す(欄1及び3はlucシリーズ1;欄2及び4はGUSシリーズ2 である)。結果は表6に示されている。 図8はSaos-2細胞におけるHsp70-lacO-tk系を用いたTK-GCV細胞殺傷アッセイの 結果である。図8Aにおいては(1)tk-lucまたは(2)GC3p53tk-lucを用いたトランス フェクション後の日に測定されたSaos-2細胞抽出物のルシフェラーゼ活性の割合 がプロットされている(tk-lucによるものに対するGC3p53tk-lucによる抽出物の ルシフェラーゼ活性)。図8Bは様々な構築物でトランスフェクトされ、様々な濃 度のGCVを用いて処理された細胞の570nmの平均の吸光度の、非GCVコントロール に対する割合が、GCV濃度(M)に対して計算されプロットされたことを示す(この 図に示されているように)。 図9はMCF-7細胞におけるHsp70-lacO-tk系を用いたTK-GCV細胞殺傷アッセイを 示す。図9Aにおいては(1)tk-lucまたは(2)GC3p53tk-lucを用いたトランスフェク ション後の日に測定されたMCF-7細胞抽出物のルシフェラーゼ活性の割合がプロ ットされている(tk-lucによるものに対するGC3p53tk-lucによる抽出物のルシフ ェラーゼ活性)。図9Bは様々な構築物でトランスフェクトされ、様々な濃度のGCV を用いて処理された細胞の570nmの平均の吸光度の、非GCVコントロールに対する 割合 が、GCV濃度(M)に対して計算されプロットされたことを示す(この図に示されて いるように)。 図10はMHG-U1細胞におけるHsp70-lacO-tk系を用いたTK-GCV細胞殺傷アッセイ を示す。図10Aにおいては(1)tk-lucまたは(2)GC3p53tk-lucを用いたトランスフ ェクション後の日に測定されたMHG-U1細胞抽出物のルシフェラーゼ活性の割合が プロットされている(tk-lucによるものに対するGC3p53tk-lucによる抽出物のル シフェラーゼ活性)。図10Bは様々な構築物でトランスフェクトされ、様々な濃度 のGCVを用いて処理された細胞の570nmの平均の吸光度の、非GCVコントロールに 対する割合が、GCV濃度(M)に対して計算されプロットされたことを示す(この図 に示されているように)。 図11は遺伝学的ユニットＩ及びIIと結合して用いるアッセイに用いられる構築 物を説明する。図11AはHsp70-lacO-rl構築物を説明する。図11Bはln/tkGC3p53-l uc/ln構築物を説明する。図11CはtkGC3p53-luc構築物を説明する。図11DはA/B(+ ),A/B(-),A/C(+)及びA/C(-)構築物を説明する。 図12は図11に示された構築物、すなわち遺伝学的ユニットＩおよびIIの両者を 含む二重コントロール構築物を用いた実験における情報を提供する。図12Aはそ の結果が図12B及び12Cに示されている実験において用いられる構築物に対して鍵 を提供する。図12B及び12Cにおけるx軸の数は図12Aの縦軸に与えられており、ベ クター1-9(図12Aの上段横軸)の組み合わせがその結果が図12B及び12Cに示されて いる実験に用いられることを示す。ベクターは以下のようなものであった:1−A/ B(＋):2μg/2μl;2-A/B(-):2μg/1.97μl;3−A/C(+):2μg/2.19μl;4−A/C(-):2 μg/3.6μl;5−Hsp70-lacO-rl:1μg/0.7μl;6−tkGC3p53-luc:1μg/1.1μl;7−p CI:1μg/0.4μl;8−pCMVwtp53:1μg/1.1μl;9−In/tkGC3p53-luc/In:1μg/0.517 μl。 図12Bはp53-ベクターpCIを用いてコトランスフェクトされたものに対するwtp5 3を用いてコトランスフェクトされた細胞の抽出物のサンゴルシフェラーゼ活性 を示す。図12CはpCIを用いてコトランスフェクトされたものに対するwtp53を用 いてコトランスフェクトされた細胞の抽出物のホタルルシフェラーゼ活性の割合 を示す。 図13は以下のような構築物を用いて実施された実験における情報を提供する:1 −tkGC3p53-luc:1μg/1.76μ1;2−In/tkGC3p53-luc/In(3)+:1μg/0.74μl;3−GC3 p53tk-luc:1μg/1.1μl;4−In/GC3p53tk-luc/In(4)+:1μg/0.517μl;5−pCMVwt p53:1μg/1.1μl;6−pCI:1μg/0.4μl;7−Hsp70-lacO-rl(2):1μg/0.73μl。結 果が図13B,13C及び13Dで与えられている実験において用いられる構築物1-7の組 み合わせ1-8の詳細は図13Aで与えられている。K562細胞を構築物の組み合わせを 用いてトランスフェクトし、ホタルとサンゴの両者のルシフェラーゼ活性を測定 した。図13Bは各トランスフェクションペアの間のホタルルシフェラーゼ活性の 割合を示す。相当する抽出物の現実のホタルルシフェラーゼ活性が図13Cに示さ れている。図13DはHsp70-lacO-rl系においてHsp70プロモーターに対するwtp53の 下流調節効果を示す。 図14は腫瘍細胞におけるp53安定化に対する実験の結果を示す。 図14Aはマウスおよびヒトp53タンパク質を特異的に検出するポリクローナルウ サギ血清を用いた細胞溶解物のウエスタンブロットを示す。もし細胞にUVライト を照射しないと、MCF7腫瘍細胞系の内因性p53タンパク質は不安定でありわずか に検出可能であり(ケルの第一レーン)、照射するとp53は安定になる(第二レーン )。MCF7細胞の新たな系を単離し、それもまたマウスp53を発現する(プラスミドM op53His169から)。もし細胞をUVライトで照射しないと、内因性ヒトp53タンパク 質及び導入されたマウスp53タンパク質(それはゲル上でのわずかに高い移動度に よってヒトp53から区別し得る)は再びわずかに検出可能であり、照射すると両タ ンパク質とも安定になる。 図14Bはヒトp53タンパク質を特異的に検出するポリクローナルウサギ血清を用 いた細胞溶解物のウエスタンブロットを示す。pCDNA3 Hup53-tkを含むMCF7細胞 の新たな系を単離した。プラスミドpCDNA3 Hup53-tkは、フルレングスチミジン キナーゼのN末端に融合されたフルレングスp53から成る融合タンパク質を発現す る。もし細胞にUVライトを照射しないと、内因性通常ヒトp53及び融合タンパク 質は再びわずかに検出可能であり、照射すると通常p53及び融合タンパク質の両 者は安定になる。それゆえ安定性の調節はp53タンパク質を用いた融合タンパク 質としてtkタンパク質を発現することにより、それに対して与えられる。 本書類で言及されている全ての文書は参考として取り込まれる。 転写コントロールに対する結果 予備的実験 一連の構築物を調製し、提案されたアプローチの実行可能性を試験するために ルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いてトランスフェクションアッセイにおい て用いた。 i．第一に、p53マイナスヒト白血病細胞系、K562内で一過性コトランスフェクシ ョンアッセイを用いて、我々は4の異なるプロモーター:SV40早期プロモーター、 HSV-チミジンキナーゼ(tk)プロモーター(-109から+52)または(-81から+52)、CMV プロモーターおよびヒトHSP70プロモーターのプロモーター機能に対するwtp53の 下流調節機能を再生産した。試験された3のミュータントp53遺伝子(143,248及び 216)はこの抑制(下流調節)機能を失った。 例えばHSP70プロモーター構築物を用いて、1μgのベクターから得られたルシ フェラーゼレポーター遺伝子発現のレベルを1と考えると、0.25μgのwtp53投与 量は発現を0.708に減少し、その一方で0.8μgの投与量は0.302にそれを減少した 。それとはは反対に、1μgのミュータントp53(mt143)は発現レベルを1.11に増大 した。 ii．第二にヒトRbプロモーター[35]におけるp53認識配列エレメントのGCエレメ ント(GC3p53)を、HSV-tkプロモーター(-109から+52)または(-81から+52)の上流 にクローン化し、同様にマウスfos最小プロモーター(-56から+166)でもクローン 化した。wtp53を用いたコトランスフェクションにより、それぞれおよそ350倍,9 0倍及び30倍の力価による劇的なレポーター遺伝子発現の増大が見出された。3の ミュータント遺伝子の全てで劇的な増大効果はなかった。 wtp53のトランス活性化機能に対する投与量効果を、HSV-tkプロモーター(-109 から+52)を用いたGC3p53構築物を用いて試験した。1μgのベクター単独を用いた 発現のベースラインレベルを1と考えて(すなわちゼロのwtp53投与量)、0.03μg, 0.1μg,0.3μg及び1μgのwtp53投与量を用いたルシフェラーゼレポーターの相対 的発現レベルは、それぞれ1.75,32,142.7及び393.5であった。もう一つの実験に おいては、0.25μgwtp53は発現レベルを40.41の増大し、0.8μgでは104.5にそれ を増大した。一方で1μgのミュータントp53(mt143)は発現を0.54に減少した。 ヒトRbプロモーターにおけるGC3エレメントは、Shiio等[35]に記述されている ようにp53介在性トランス活性化を増大し得る。CATプロモーター遺伝子をSV40早 期プロモーターから発現している構築物を用いて、これらの著者はプロモーター にRbプロモーター由来のp53結合部位、主に(GGACTTGCCT)2が先行していると、p5 3結合部位の不存在下では0.81のレベルであるのに対してCAT発現を22に増大する ことが見出された。もう一つの構築物においては、p53結合部位にGC3エレメント が先行しており、CAT発現は122に増大した。一方でGC3エレメントのペアを用い ることは(すなわちp53結合部位は存在しない)コントロールに対して発現を増大 しなかった。 我々は改変した配向、tkプロモーターの上流(-81)及び(-109)のそれぞれでGC3 p53応答エレメントの機能を試験した。発現レベルはいくらか変化するが(0.25μ gwtp53投与量に対して)、差異は一貫して他方に対する一方の配向を好むという ことはなかった((-81)プロモーターに対しては正の配向では30,負の配向では93 であり、一方で(-109)プロモーターに対しては正の配向では41、負の配向では27 であった)。それゆえ我々は本エレメントはおそらく配向独立性であろうと結論 づけた。 iii．第三にHSVTKプロモーター及びGC3p53応答エレメントによって由来するルシ フェラーゼ及びチミジンキナーゼ遺伝子のアンチセンス断片を発現するようデザ インされた構築物を作製し、一過性コトランスフェクションアッセイで試験した 。本質的に我々は3の構築物を用いた:(1)ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発 現するHSP70プロモーターをもつ;(2)逆方向でルシフェラーゼ遺伝子を転写するG C3p53認識配列を用いたHSV-tk(-109)プロモーターをもち、引き続きpolyAシグナ ルをもつ;(3)ルシフェラーゼ遺伝子の5'部分(Bcl2部位で終結する)のみ用いられ ていることを覗き(2)と同様である。 3の構築物のそれぞれを(a)1μgの投与量のベクター単独を用いて、(b)0.25μg のWtp53を添加して、(c)1μgの投与量のミュータントp53(mt143)を添加して、ル シフェラーゼ発現に対して試験した。その結果は、このアンチセンスアプローチ を用いてルシフェラーゼ発現の下流調節を達成することは実際に可能であること が示唆された。 さらなる実験 a．通常の及びミュータントp53アリルの転写活性 一連の異なるp53ミュータントを調製し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を 用いて遺伝学的ユニットＩ及びIIを用いた活性に対して試験した。以前に試験し たミュータント143ala-val，216val-gly及び248arg-trpに加えて、以下のものを 試験した:175arg-his,245gly-ser,248arg-gln,249arg-ser及び273arg-his、これ らは共にヒト腫瘍においてp53に対して文献で報告された3870ミューテーション の全てのおよそ30%を代表する。これらのミュータントを用いた拡大したトラン スフェクション分析を実施し、その結果はミュータントは遺伝学的ユニットIIに おけるGC3p53コンセンサス配列を通じて転写を刺激することができないことが示 された。これは構築物はp53ミュータントを運ぶヒト腫瘍の少なくとも30%で、及 びおそらく有意により高い部分で十分に機能的であるはずであるという示唆を提 供する。 b．遺伝学的ユニットIIにおけるGC3p53エレメントの配置 GC3p53エレメントは配向独立的な方式で機能し得ることが示されたので、ユニ ットＩとIIの両者を一つの分子内に一緒に置いた場合、エレメントをII型プロモ ーターの上流に置くという配置は場合により機能しないであろうという可能性が ある。 構築物GC3p53tk-lucをルシフェラーゼコード配列に接合した最小tkプロモータ ーの上流にp53コンセンサス結合部位を用いて作製した。ルシフェラーゼアッセ イを記述されているように野生型p53の存在下及び不存在下で実施した。該結果 を、GC3p53エレメントがtkプロモーターの下流に置かれ、遺伝学的エレメントII にお けるGC3p53エレメントによる遺伝学的ユニットＩの機能化を用いて潜在的妨害を 最小化するために作製されたさらなる構築物(tkGC3p53-luc)を用いて得た結果と 比較した。 トランスフェクションアッセイの結果は図2に示されている。最小tkプロモー ターの下流にGC3p53エレメントを含む構築物は、他方の構築物より野生型p53の 不存在下で高いバックグランドレベルを示した。しかしながら野生型p53の存在 下で誘導されたレベル(530×104ルシフェラーゼユニット)もまたかなりより高か った。これは遺伝学的ユニットＩ由来のより効果的な発現の抑制が、遺伝学的ユ ニットIIにおけるtkプロモーターから下流にGC3p53をもつことにより達成され得 るという示唆を提供する。付加的な実験はライゲートされた二重構築物における 最適な配置を決定するであろう。 c．ユニットIIにおける抑制系の選択 本分野で有用な様々なアプローチから可能な3のタイプの抑制ユニットを試験 した−アンチセンス、リボザイム及び転写サプレッサー−及びそれぞれが遺伝学 的ユニットＩからの転写を抑制するのに効果的であることが示されている。 c(i) アンチセンスアプローチ 2のアンチセンスルシフェラーゼ遺伝子構築物(「II型遺伝学的ユニット」)を作 製し、試験した(図2参照)。これらにはフルレングス構築物(A)または+582から+1 位の遺伝子の5'末端のみ含むもの(B)のいずれかが含まれる。図3に示されている ように、Hsp70プロモーター(「Ｉ型遺伝学的ユニット」)のコントロールの下にあ るルシフェラーゼ遺伝子を、野生型p53がコントロールの50%に相当するレベルま で抑制した(欄1と2の比較)。Ｉ型構築物と共なるアンチセンスAまたはBのコトラ ンスフェクションは、それぞれコントロールレベルの40%または25%にルシフェラ ーゼ活性を減少した(それぞれ欄5と8)。さらにコントロールはCMVプロモーター 由来のフルレングスアンチセンス構築物が、コントロールレベルの約37%に遺伝 学的ユニットＩ由来の転写を抑制することを示した(欄10)。ミュータントp53は アンチセンス構築物の転写を活性化せず、またはルシフェラーゼ活性の抑制を導 かなかった (それぞれ欄5と8を用いて欄6と9の比較)。それゆえこれらの結果は遺伝学的ユニ ットII由来のアンチセンスルシフェラーセ構築物の発現が遺伝学的ユニットＩの 活性を抑制し得ることを示した。 c(ii) リボザイムアプローチ ルシフェラーゼ遺伝子内の731から716由来の15ベースペア配列をターゲット化 するようにデザインされたリボザイムを、イントロン配列の存在下または不存在 下でCMVプロモーターのコントロールの下に置いた(図4に示されている構築物)(「 II型遺伝学的ユニット」)。イントロンを用いた構築物は、HSP70プロモーター(「 Ｉ型遺伝学的ユニット」)由来のルシフェラーゼ活性のレベルをコントロールレベ ル(欄1)の75%(1μg、欄2)または68%(2μg、欄5)に減少するコトランスフェクシ ョン実験に示されている一方で、イントロンを用いない構築物はほとんど全く効 果がなかった。予備的実験はこの減少効果はルシフェラーゼアッセイを実施する 前にリボザイムを用いて細胞をより長期にインキュベーションすることによって 増大するであろうことを示唆している。 c(iii)．転写サプレッサーアプローチ 3の広く用いられている転写サプレッサーエレメントを、レポーター遺伝子構 築物を用いて試験した。 lacオペレーターサプレッサー 3コピーのlacオペレーター配列をユニットＩにおけるHsp70プロモーターの下 流に挿入し、野生型p53に対する感受性及びlacオペレーターの共発現に対する感 受性の両者に対して試験した。構成的プロモーター由来のlacリプレッサーの発 現は、Hsp70-IacO-luc構築物由来のルシフェラーゼ活性をコントロール値の約60 %に減少した(図5、欄1と2の比較)。wtp53及びlacリプレッサーを含む遺伝学的ユ ニットII構築物のコトランスフェクションは、ルシフェラーゼ活性を約35%に減 少した(欄4)。 KRABサプレッサー 7コピーのテトラサイクリンオペレーター配列を遺伝学的ユニットＩにおけるH sp70プロモーターの下流に挿入した。このプロモーターエレメントは、ルシフェ ラーゼ発現のコントロール値の46%への減少を引き起こす野生型p53タンパク質の 抑制効果に対する感受性を維持している。テトラサイクリン応答エレメント/KRA B転写サプレッサーと接合したtk最小プロモーターと共にGC3p53エレメントを含 む構築物が調製された。該構築物はDrosophila KRAB転写因子の抑制ドメインと 融合されたtetリプレッサーのDNA結合ドメインを含む。本リプレッサー系の活性 を、強いCMVプロモーターのコントロールの下でtet/KRABリプレッサーと共にHsp 70 tetO7ルシフェラーゼ構築物のコトランスフェクションにおいて示した(図5) 。これはHspプロモーター由来のルシフェラーゼ活性をコントロール値のおよそ2 4%に減少した(欄7と8の比較)。野生型p53はHsp70 tetO7ルシフェラーゼ構築物を コントロール値の46%まで抑制し(欄9)、さらにこれはGC3p53tkプロモーターエレ メント由来のtet/KRAB融合タンパク質のコトランスフェクションにより抑制され た(33%まで−欄10)。一方ミュータントp53はtet/KRAB融合構築物の含有のあるな しに関わらず、Hspプロモーターに対して何の効果もなかった(欄11と12)。これ らの研究はKRABの遺伝学的ユニットＩにおけるHspプロモーターのトランスでの 転写サプレッサーとして機能する能力を明白に示す。 Gal-4サプレッサー系 Hsp70プロモーターとルシフェラーゼリポーター遺伝子の間に挿入されたGal-4 認識配列のタンデムな繰り返しを含む構築物を調製した。図6に示されているよ うに、該構築物におけるプロモーターは野生型p53によって抑制される性質を維 持している。プロモーター活性もまた、アクチンプロモーターのコントロールの 下でDrosophilaイーブンスキップト転写因子の抑制ドメインと融合されたGal-4D NA結合ドメインを含む構築物とのコトランスフェクションにより、コントロール 値の40%に抑制される。 これらの結果は様々な異なる転写サプレッサーエレメントを用いて、Hsp70プ ロ モーターを含む遺伝学的ユニットＩの抑制を示す。 d．wtp53による二重転写コントロール 我々は最終的に、同じトランスフェクトされた細胞内で、遺伝学的ユニットＩ とIIが野生型p53に応答して、すなわち遺伝学的ユニットＩからの発現は抑制さ れ、遺伝学的ユニットIIからの発現は上流調節されるように、独立に予想可能に 機能できることを示している。 異なるレポーター遺伝子のコトランスフェクションをこの応答の特異性をさら に研究するために用いた。ルシフェラーゼ(上述の実験において用いられた)に加 えて、4のレポーター遺伝子:β-ガラクトシダーゼ、分泌アルカリホスファター ゼ、β-グルコロニダーゼ(GUS)(Clontech)及びサンゴルシフェラーゼ(RL)(Prome ga)を特性指摘した。拡張された一連のトランスフェクション実験は最高のレポ ーター遺伝子がGUS(図7)及びRL(図11-13)であることを示し、4のうちの他の2は 高レベルのバックグランド活性を与えた。 図7は野生型p53の不存在下で、K562細胞におけるGUSレポーター活性がCMVプロ モーター由来で高いことを示し(>2×106ユニット、欄2)、一方でGC3p53tkプロモ ーター由来のルシフェラーゼ活性は本質的にバックグランドレベルであることを 示す(0.019×106ユニット、欄1)。野生型p53の発現はGC3p53tkプロモーター(欄3 )由来のルシフェラーゼ活性のおよそ145倍の上流調節を導き、CMVプロモーター( Ｉ型プロモーター、欄4)由来のGUS活性の同様の下流調節(コントロールレベルに 対して0.44の)をも導く(図7参照)。本結果は遺伝学的ユニットＩとIIは、同じ細 胞内にコトランスフェクトされた場合、wtp53の発現に異なって応答することを 示す。遺伝学的ユニットＩは抑制され、一方遺伝学的ユニットIIはp53によって 強力に刺激される。 プロドラッグ活性化によるp53依存性細胞殺傷の説明 上述した実験は遺伝学的ユニットＩとIIのコントロールの下にあるレポーター 構築物が、野生型またはミュータントp53の存在下で予想可能な方式で行動する ことを示す。さらに、チミジンキナーゼ(TK)遺伝子がHSP-70プロモーターのコン ト ロールの下で遺伝学的ユニットＩ内に置かれている一連の構築物を調製した。la cリプレッサーに対する認識配列をプロモーターとコード配列の間に挿入した。 遺伝学的ユニットIIはGC3p53tkまたはtkGC3p53プロモーターエレメントによって 由来するlacリプレッサーに対するコード配列を含む。 これらの構築物をp53が存在しないと報告されているSAOS-2細胞内にトランス フェクトした。コントロールトランスフェクションはこれらの細胞に対するトラ ンスフェクション効率がおよそ20%であり、GC3p53tkルシフェラーゼレポーター 構築物を用いて検出可能な野生型p53活性が存在しないことを示した(図8A)。細 胞殺傷アッセイを、様々な構築物の組み合わせを用いてコトランスフェクトされ たSAOS-2細胞に対するガンシクロビル処理の効果を測定するために用いた。遺伝 学的ユニットＩ由来のTKの発現は、1.25×10-5から6.26×10-5Mのガンシクロビ ル濃度で細胞の40-60%を死に導く(図8B)。細胞殺傷のレベルがトランスフェクシ ョンのこの効率から予想されるレベルを超えるという観察は、予想されるバイス タンダー効果のため細胞のいくつかが殺傷されるようになることを示す。GC3p53 tk-lacRまたはtkGC3p53-lacR構築物を含むことは、明らかにこの結果に影響しな いが、wtp53の存在下では特にtkGC3p53-lacR構築物は、約10-20%に細胞殺傷のレ ベルを減少することが可能である。ガンシクロビル自体はこれらの濃度では細胞 生存性に何の影響もなかった。この結果はwtp53の存在下で、遺伝学的ユニット Ｉの影響のかなりの抑制がGC3p53エレメントによるlac転写リプレッサーの上流 調節を通じて達成され得ることを示す。 これらの構築物の更なる試験を、内因性通常(MCF-7細胞)またはミュータント( MHG-U1)p53タンパク質を発現する細胞を用いて実施した。MCF-7細胞に対するト ランスフェクション効率はSAOS-2細胞に対して観察されるものより高く、これら の細胞は野生型p53活性を明白に持っていた(図9A)。遺伝学的ユニットＩとIIを 用いてコトランスフェクトされたMCF-7細胞の処理は、6.25×10-5Mのガンシクロ ビルの濃度で観察されるいかなる細胞殺傷をも導かなかった(図9B)。これは遺伝 学的ユニットＩにおけるHSP-70プロモーターが、MCF-7細胞において野生型内因 性p53によって強力に下流調節されることを示す。ガンシクロビルのこの濃度で は、wtp53の存在しないSAOS-2細胞は遺伝学的ユニットＩにより少なくとも50%の レベ ルで殺傷される(20%の一過性アッセイにおけるバックグランドトランスフェクシ ョン効率に対して)一方で、機能的なwtp53の存在下でのMCF-7細胞は、たとえト ランスフェクション効率は2倍以上高くとも影響されない。 MHG-U1細胞を用いてさらなる実験を実施した。これらの細胞のトランスフェク ション効率はわずかに1-3%だが、25%以上の細胞が6.25×10-5Mのガンシクロビル の濃度で遺伝学的ユニットＩにより殺傷された(図10B)。予期したように遺伝学 的ユニットIIを含んだ場合でさえ何の影響もなく、ユニットIIはこれらの細胞に おいてミュータントp53により上流調節されない(図10A)。 実験及び結果はより詳細にここで記述されよう。 細胞殺傷アッセイ Saos-2細胞における細胞殺傷アッセイ Saos-2細胞(0.3ml中に0.5-1.5×106細胞)をエレクトロポレーションにより1μ gのpSV-β-galを用いてトランスフェクトした(320ボルト/1050μC)。オーバーナ イトでインキュベーション後、細胞を固定し、β-galの発現に対して染色した[G ossler,1994]。400細胞をカウントし、青色細胞のパーセンテージを測定し、ト ランスフェクション効率の測定に用いた。この測定によりSaos-2細胞のトランス フェクション効率はおよそ20%である。 Saos-2細胞を1μgのtk-lucまたはGC3p53tk-lucを用いてトランスフェクトし、 細胞抽出物のルシフェラーゼ活性を翌日測定した。tk-lucによるものに対するGC 3p53tk-lucによる抽出物のルシフェラーゼ活性の割合を計算しプロットした。図 8Aに示されているように、tk-lucまたはGC3p53tk-lucのそれぞれによってトラン スフェクトされた細胞抽出物間で有意な差異はない。p53タンパク質はp53抗体(D O-1またはCMV-1)を用いた免疫ブロッティング分析によっては検出されなかった が、この結果はSaos-2細胞のp53状態がp53-/-であることを確認する。 Saos-2細胞(3×106細胞/0.3ml)を、1μgのFG-1ポリオーマウイルスプロモータ ーのコントロールの下でlacRをコードするp3'SS、GC3p53tk-lacRまたはtkGC3p53 -lacRと共に、1μgのHsp70-lacO-tkを用いてトランスフェクトした。pCI(CMVプ ロモーターベクターコントロール)またはpCMV-wtp53(CMVプロモーターのコント ロー ルの下にあるwtp53遺伝子)のそれぞれもまた、この分析において含まれる。MTT 染色変換アッセイ(Promega,[Promega,1995])を実施し、非GCVコントロールに対 する様々な濃度のGCVを用いて処理された細胞の570nmの吸光度の平均の割合を計 算し、GCV濃度に対してプロットした(図8Bに示されているように)。 Saos-2細胞のGCVトレランスプロフィールを様々な濃度のGCV(0.1μモルから2m Mの範囲)を用いて細胞をターゲット化することによって同時に測定した。 MCF-7細胞を用いた細胞殺傷アッセイ MCF-7細胞(0.3ml内に0.5-1.5×106細胞)をエレクトロポレーションにより1μg のpSV-β-galを用いてトランスフェクトした(320ボルト/1050μC)。オーバーナ イトでインキュベーション後、細胞を固定し、β-galの発現に対して染色した[G ossler,1994]。400細胞をカウントし、青色細胞のパーセンテージを測定し、ト ランスフェクション効率の測定に用いた。この測定によりMCF-7細胞のトランス フェクション効率はおよそ48%である。 MCF-7細胞を1μgのtk-lucまたはGC3p53tk-lucをそれぞれ用いてトランスフェ クトし、細胞抽出物のルシフェラーゼ活性を翌日測定した。tk-lucによるものに 対するGC3p53tk-lucによる抽出物のルシフェラーゼ活性の割合を計算しプロット した。図9Aに示されているように、tk-lucによるものと比較したGC3p53tk-lucに よりトランスフェクトされた抽出物におけるルシフェラーゼ活性で19倍の増大が あり、MCF-7細胞のp53状態が野生型であることを示す。 MCF-7細胞(3×106細胞/0.3ml)を、1μgのp3'SS、GC3p53tk-lacRまたはtkGC3p5 3-lacRと共に、1μgのHsp70-lacO-tkを用いてトランスフェクトした。MTT染色変 換アッセイ(Promega,[Promega,1995])を実施し、非GCVコントロールに対する様 々な濃度のGCVを用いて処理された細胞の570nmの吸光度の平均の割合を計算し、 GCV濃度に対してプロットした(図9Bに示されているように)。 MCF-7細胞のGCVトレランスプロフィールを様々な濃度のGCV(0.1μモルから2mM の範囲)を用いて細胞をターゲット化することによって同時に測定した。 MHG-U1細胞を用いた細胞殺傷アッセイ MHG-U1細胞(0.4ml中に0.5-1.5×106細胞)をエレクトロポレーションにより1μ gのpSV-β-galを用いてトランスフェクトした(290ボルト/1050μC)。オーバーナ イトでインキュベーション後、細胞を固定し、β-galの発現に対して染色した[G ossler,1994]。400細胞をカウントし、青色細胞のパーセンテージを測定し、ト ランスフェクション効率の測定に用いた。この測定によりMHG-U1細胞のトランス フェクション効率はおよそ3%である。 MHG-U1細胞を1μgのtk-lucまたはGC3p53tk-lucを用いてトランスフェクトし、 細胞抽出物のルシフェラーゼ活性を翌日測定した。tk-lucによるものに対するGC3 p53tk-lucによる抽出物のルシフェラーゼ活性の割合を計算しプロットした。図 10Aに示されているように、tk-lucまたはGC3p53tk-lucのそれぞれによってトラ ンスフェクトされた細胞抽出物間で有意な差異はない。p53タンパク質はp53抗体 (DO-1またはCMV-1)を用いた免疫ブロッティング分析によっては検出されるので 、この結果はMHG-U1細胞のp53状態がミュータント型であることを示す。 MHG-U1細胞(3×106細胞/0.3ml)を、それぞれ1μgのp3'SS、GC3p53tk-lacRまた はtkGC3p53-lacRと共に、1μgのHsp70-lacO-tkを用いてトランスフェクトした。 染色変換アッセイ(Promega,[Promega,1995])を実施し、非GCVコントロールに対 する様々な濃度のGCVを用いて処理された細胞の570nmの吸光度の平均の割合を計 算し、GCV濃度に対してプロットした(図10Bに示されているように)。 MHG-U1細胞のGCVトレランスプロフィールを様々な濃度のGCV(0.1μモルから2m Mの範囲)を用いて細胞をターゲット化することによって同時に測定した。 細胞殺傷アッセイに対する物質及び方法 細胞カルチャーとDNAトランスフェクション: 細胞系:Saos-2(p53-/-、ヒト骨肉腫細胞系、ATCC HTB-85)、MCF-7(p53+/+、ヒ ト乳腺ガン)、及びMHG-U1(EJ細胞、ヒト嚢ガン腫細胞系、[1977]mtp53)。細胞を 集団を形成するまで増殖に必要とされる培地+10%子ウシ胎児血清で培養した。細 胞をトリプシン切断により回収し、5×106から1.5×107細胞/mlの濃度で単一細 胞懸濁液に再懸濁した。各細胞系に対するエレクトロポレーションによるDNAト ランスフェクションに対する最適のコンディションを、pGL3コントロールを用い たボ ルト数と容量を変化させた一連のパイロット実験で同定した(Promega、該実験で はホタルルシフェラーゼをSV-40プロモーター及びエンハンサーのコントロール の下に置いた)。細胞抽出物が最も高いルシフェラーゼ活性をもつエレクトロポ レーションコンディションを、さらにpSV-β-gal(Promega)を用いてトランスフ ェクトされた細胞のβ-gal染色[Gossler,1994]により確かめた。各細胞系のトラ ンスフェクション効率は、400の個々の細胞カウント中の青色細胞のパーセンテ ージとして存在した。代表的な視野をポジフィルムを用いて写真にとり、コンピ ューターでスキャンし加工した。 構築物: A，Hsp70-lacO-tk ヒト熱ショック遺伝子プロモーター(-117から+26)[Tsutsmi-Ishii,1995]を、p fuポリメラーゼ(Stratagen)を用いてヒトHL-60細胞のゲノムDNAから増幅し、sk においてHsp70を作製するためにPCR-scriptTMSK(+)(Cam)(Stratagen)のSrfＩ部 位にクローン化する。Lacオペレーター配列がイントロンで位置しているpOP13CA T(Stratagen)由来の467bp HindIII断片を、skにおいてHsp70-lacOを作製するた めにsk中のHsp70のHindIII部位にクローン化した。 HSVチミジンキナーゼ遺伝子のコード領域を、pTKO(Heinから贈呈)由来のpfuポ リメラーゼを用いて増幅し、pSItkを作製するためにpSI発現ベクター(Promega) でクローン化する。tk遺伝子と、同様にpolyA+付加的シグナルを含む1.5kbBgl I I/BamHＩ断片を、Hsp70-lacO-tkを作製するためにskにおいてHsp70-lacOのSalＩ 部位にクローン化する。 B，Gc3p53tk-lacR及びtkGC3p53-lacR pT-109[Nordeen,1988]のHSVtkプロモーター(-109から+52)を含む180bpのSacＩ /Bgl II断片を、tk-skを作製するためにpCR-scriptTMSK(+)(Cam)(Stratagen)のB amHＩにクローン化する。ヒトRb遺伝子プロモーター[Shiio,1993]由来のGC3p53 エレメントを、tkGC3p53-skを作製するためにtk-skのEcoRＶ部位にクローン化す る。GC3p53pT-109を作製するためにGC3p53エレメントをpT-109[Nordeen,1988]の SmaＩ部位にクローン化する。そしてGC3p53tk-skを作製するためにGC3p53pT-109 のSal Ｉ/Bgl II断片をpCR-scriptTMSK(-)(Cam)(Stratagen)のXhoＩ/Bgl II部位にクロ ーン化する。 lacI遺伝子を含むp3'SS(Stratagen)の1667bpのXbaＩ/HindIII断片を、GC3p53t k-lacRを作製するためにGC3p53tk-skのEcoRＶ及びHindIII部位にクローン化した 。GC3p53tk-lacRの1.7kbのEcoRＩ/SalＩ断片を、tkGC3p53-lacRを作製するため にtkGC3p53-skのHindIII/SalＩ部位にクローン化する。 細胞におけるp53の機能的状態の測定 細胞をHSVtkプロモーター(-109から+52)[Nordeen]をpGL3basic(Promaga)のSac Ｉ/HindIII部位でクローン化したtk-luc;またはGC3p53エレメントをtk-lucのtk プロモーターの上流にクローン化したGC3p53tk-lucのそれぞれを用いて細胞をト ランスフェクトした。GC3p53tk-lucでトランスフェクトされた細胞の抽出物のル シフェラーゼ活性を、tk-lucでされたものと比較した。tk-lucに対するGC3p53tk -lucによるルシフェラーゼ活性の有意な増大を、wtp53状態に対する基準として 用いた。別な方法では、細胞系のp53状態はp53特異的抗体(D,Lane由来のDO-1)を 用いた免疫ブロッティングによって区別されるであろうp53-/-またはmtp53であ る。 TK-GCVアッセイ 以下の構築物の一つ:p3'SS(Stratagen)、GC3p53tk-lacR及びtkGC3p53-lacRの1 μgと共に、1μgのHsp70-lacO-tkをエレクトロポレーションによりMCF-7またはM HG-U1のそれぞれ3×106内にトランスフェクトした。Soas2細胞に対しては、付加 的な2の構築部の一つ:1，pCI(Promega,CNVプロモーターを持つ真核生物発現ベク ター)及び2，pCMVwtp53(B.Volgesteinから贈呈された、wtp53がCMVプロモーター のコントロールの下にあるpCIと同様の構築物)もまたトランスフェクションに含 まれる。オーバーナイトでインキュベーション後、トランスフェクトされた細胞 をトリプシン切断によって集め、105細胞/mlの濃度で単一細胞葱濁液を作製した 。96穴カルチャープレートに各ウェル(全部で24)内に104細胞/100μl懸濁液に分 配した。6時間培養後、ガンシクロビル(GCV)の不存在下の100μlの培地、または 0.2,1,5,25または125μモルのGCVを含む培地をそれぞれ相当するウェル内に加え た。 各アッセイを四重に実施した。3-4日培養後、細胞増殖に対するGCVの効果をHTT 染色保存アッセイにより測定した(Promega,CellTitre96TM非放射線活性細胞増殖 アッセイ、[Promega,1995])。略記すると15μgの染色混合物を各ウェルに加え、 さらに細胞を4時間37℃で培養した。それから各ウェルに対して100μlの可溶化 溶液を加えた。室温でオーバーナイトでインキュベーション後、570nmの波長で 各ウェルの吸光度をELISAリーダー(Emas,Molecular Device)を用いて記録し、4 の同一のウェル由来の吸光度の平均値を計算した。細胞増殖に対するGCVの効果 は、GCV濃度に対してGCVの存在しないものに対する様々な濃度のGCVを用いて処 理された細胞の平均吸光度の割合のプロットによって表された。 細胞に対するGCVの毒性を、様々な濃度のGCV(37℃で0.1μモルから2mMGCVの範 囲)に細胞をさらすことによって分析した。処理の残りの工程はtk-GCVアッセイ のように実施した。 e．遺伝学的ユニットＩ及びIIの結合 上述の"d"で用いられたような遺伝学的ユニットＩ及びII、すなわちそれぞれG US及びルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子を含むものを、単一のベクター 構築物において結合させ、細胞内にトランスフェクトさせ、"d"で実施された試 験を繰り返した。該ユニットを「ヘッド-トゥー-ヘッド」、「ヘッド-トゥー-テー ル」、または「テール-トゥー-テール」で置き、間隔を変化させた。インターラプ ター配列が2のユニット間で用いられ得る。 野生型p53の存在下で最高の(例えば)GUSの下流調節及びルシフェラーゼの上流 調節御与えることが見出された配置である、最も成功したベクター構築物配置を 、KRAB/tet融合リプレッサーまたはLACＩリプレッサーのようなリプレッサーを 用いたルシフェラーゼの置換、及びtkを用いたレポーター(例えばGUS)の置換を 用いて、ヌードマウス腫瘍におけるin vitro及びin vivoでの腫瘍特異的細胞殺 傷に対して試験した。 数多くの異なるレポーター遺伝子を用いた一連の実験は、同じトランスフェク ションアッセイにおける発現に対する最高のレポーターの組み合わせは、ホタル ルシフェラーゼ(luc)とサンゴルシフェラーゼ(rl)であることを示した。 二重コントロールユニットの最も単純な試験は、rlレポーター由来のlacオペ レーターと共にHSP70プロモーターを含む遺伝学的ユニットＩを、luc発現をコン トロールするtkGC3p53プロモーターを含む遺伝学的ユニットIIを用いて直接に結 合することである(構築物A/C(+)及びA/C(-)、図11)。遺伝学的ユニットＩはこの 二重構築物ユニットにおいて通常機能し、wtp53の共発現に応答して増大したル シフェラーゼ活性を示した(図12C：それぞれ欄6と8を用いて欄5と7を比較)。一 方遺伝学的ユニットIIにおけるHSPプロモーター由来のサンゴルシフェラーゼ活 性もまた刺激された(図12B:それぞれ欄6と8を用いて欄5と7を比較)。これは遺伝 学的ユニットIIにおけるp53コンセンサス配列が二重構築物における両プロモー ターに対する強力な促進効果を持っていることを示し、インスレーターまたはイ ンターラプター配列が必要であろうことを示す。 チキンβ-グロビンローカス[42]由来のインスレーター配列を、遺伝学的ユニ ットII(tkGC3p53-lucまたはGC3p53tk-lucのそれぞれに)の両末端に挿入し(図11 参照)、これらをrlレポーター遺伝子由来の遺伝学的ユニットＩの存在下または 不存在下で、wtp53を用いてコトランスフェクションアッセイで試験した。その 結果が図13に示されている。 ユニットににおけるインスレーター配列の存在は、wtp53の不存在下及び存在 下の両者でtk最小プロモーターを阻害する効果を持った。しかしながらこの効果 はp53の不存在下でより強く、結論としてp53によるルシフェラーゼ活性の刺激の 程度はインスレーターなしのコントロール構築物より大きかった(図13B及び13C) 。図13Dは、インスレーター構築物がトランスフェクションに含まれていようと なかろうと、遺伝学的ユニットＩ由来のrl活性をwtp53が通常の方法で抑制する ことを示す結果を示している。 それから側面に位置するインスレーター配列を含む遺伝学的ユニットIIを、rl レポーター由来の遺伝学的ユニットＩに、ヘッド-ヘッド(構築物A/B(+)、図11) またはヘッド-テール(構築物A/B(-)、図11)配向のそれぞれで直接につないだ。 これらの構築物をwtp53の存在下または不存在下でK562細胞内にコトランスフェ クトし、両ルシフェラーゼレポーターの活性を測定した。図12Cの結果は二重コ ントロール構築物内の遺伝学的ユニットIIは、wtp53により強力に刺激されるこ とを示す(そ れぞれ欄2と4を用いて欄1と3の比較)。この実験において遺伝学的ユニットＩに おけるHSP-70プロモーターの刺激は全く見ることができず、ユニットIIにおける p53エンハンサー配列の活性はインスレーター配列により成功して単離されたこ とを示唆した。 実験的作業はより詳細にここで記述される。 つながれたベクター構築物を用いたアッセイ−二重コントロールユニット 物質と方法 つながれた遺伝学的ユニットＩ及びII基本的構築物に対する構築物とアッセイ： 図11A、Hsp70-lacO-tk及びHsp70-1acO-rl ヒト熱ショック遺伝子プロモーター(-117から+26)[Tsutsmi-Ishii,1995]を、p fuポリメラーゼ(Stratagen)を用いてヒトHL-60細胞のゲノムDNAから増幅し、sk においてHsp70を作製するためにPCR-scriptTMSK(+)(Cam)(Stratagen)のSrfＩ部 位にクローン化する。Lacオペレーター配列がイントロンで位置しているpOP13CA T(Stratagen)由来の467bp HindIII断片を、skにおいてHsp70-lacOを作製するた めにsk中のHsp70のHindIII部位にクローン化した。 HSVチミジンキナーゼ遺伝子のコード領域を、pTKO由来のpfuポリメラーゼを用 いて増幅し、pSItkを作製するためにpSI発現ベクター(Promega)でクローン化し た。tk遺伝子と、同様にpolyA+付加的シグナルを含む1.5kbBgl II/BamHＩ断片を 、Hsp70-lacO-tkを作製するためにskにおいてHsp70-lacOのSalＩ部位にクローン 化した。 サンゴルシフェラーゼ遺伝子、同様にpolyA+シグナルを含むpRL-nulＩ(Promeg a)由来の1.2kbのNheＩ/BamHＩ断片を、Hsp70-lacO-rlを作製するために、Hsp70- lacO-tkのClaＩ部位でクローン化した(tk遺伝子をHsp70-lacO-tk由来のClaＩ切 断により検出する)。 図11B、tkGC3p53-luc Hsvtkプロモーター(-109から+52)を含む180bpのSacＩ/Bgl II断片を、tk-skを 作製するためにpCR-scriptTMSK(+)(Cam)(Stratagen)のBamＩにクローン化した。 ヒトRb遺伝子プロモーター[Shiio,1993]由来のGC3p53エレメントを、tkGC3p53-s kを作製するためにtk-skのEcoRＶ部位にクローン化した。pGL3Basicのホタルル シフェラーゼ遺伝子及びpolyA+シグナルを含む2.0kbのHindIII/SaiＩ断片を、tk GC3p53-lucを作製するために、tjGC3p53-sk内にクローン化した。 図11C、In/tkGC3p53-luc/In チキンβ-グロビンローカス由来の2のインスレーター、同様に局所的コントロ ール領域及びneo遺伝子を含む構築物(pJC5-4)[Chung,1993]が、G.Felsenfeldに よって提供された。局所的コントロール領域及びneo遺伝子の両者の欠失により 、pJC-4-2を作製した。両GC3p53tkエレメントのコントロールの下でルシフェラ ーゼ遺伝子を含むtkGC3p53-lucの2.2kbのXhoＩ/SalＩ断片を、In/tkGC3p53-luc/ Inを作製するためにpJC-4-2のBamHＩ部位にクローン化した。 図11D、二重構築物 Hsp70-lacO-rl(=A)及びIn/tkGC3p53-luc/In(=B)またはtkGC3p53-luc(=C)より 成る構築物の詳細については図11Dを参照。Hsp70プロモーターのコントロールの 下にあるサンゴルシフェラーゼ遺伝子及びHsp70-lacO-rl(=A)のlacオペレーター を含む2kbのBssHＩ断片を、A/B+(2のユニットのヘッド-ヘッド配置を指す)及びA /B-(2のユニットのヘッド-テール配置を指す)を作製するために、In/tkGC3p53-l uc/In(=C)のSalＩ部位にクローン化した。tkGC3p53-luc(=C)の2.2kbのXhoＩ/Sal Ｉ断片を、A/C+(2のユニットのヘッド-テール配置を指す)及びA/C-(2のユニット のヘッド-テール配置を指す)を作製するために、Hsp70-lacO-rl(=A)のBstXＩ部 位にクローン化した。 結果 図12に示されているようにインスレーター配列を含む場合、ユニットＩ及びユ ニットIIに対するwtp53の異なる効果を、つないだ二重コントロール系において 維持した。wtp53に応答するユニットIIに対するインスレーターの影響は図13に 示されている。 結果が図12に示されている実験において、K562細胞(0.5から1.5×106細胞/0.4 ml)を、図12に対して上述した簡単な記述に挙げられた構築物及び図12Aに示され たような構築物を用いて、エレクトロポレーション(260ボルト、1050μC)によっ てトランスフェクトした。ホタルとサンゴのルシフェラーゼ活性の両者を測定し 、pCI(p53-)を用いたものに対するwtp53を用いてトランスフェクトされた抽出物 のルシフェラーゼ活性を計算しプロットした。図12Bはサンゴルシフェラーゼに 対する結果を示し、その遺伝子はHspプロモーターのコントロールの下にあり、 一方図12Cはホタルルシフェラーゼに対する結果を示し、その遺伝子はHSVtkプロ モーター及びGC3p53エレメントのコントロールの下にある。 結果が図12に示されている実験においては、図13Aに与えられた組み合わせで 上記図面の簡単の説明に挙げられている構築物によってK562細胞をトランスフェ クトした。ホタルとサンゴのルシフェラーゼ活性の両者を翌日細胞抽出物におい て測定した。図13B,13C及び13Dに示されている結果は、インスレーター配列が遺 伝学的ユニットIIのHSVtkプロモーターに対してある阻害効果をもつことを示す 。この効果はp53タンパク質が存在する場合より不存在である場合でより影響が 大きいので、インスレーターエレメントはwtp53が存在または不存在である状況 の間でユニットIIの効力の差異を広げるであろう。 p53介在性タンパク質安定性の結果 通常細胞におけるDNA損傷に対する早期の応答の一つは、p53タンパク質の発現 レベルが増大することである。これはおそらくDNA損傷認識プロセス[36,37]によ って誘導される脱リン酸化のため、上昇したタンパク質安定性の組み合わせ、ま たはp53mRNAの増大した転写活性に帰せられる[7]。いかなる理由に対しても、最 終結果はmRNAの与えられたレベルのため、p53は相当する通常細胞においてより も腫瘍細胞においてより高いレベルで生産される[8]。 p53転写コントロールを用いた上述の平行した一連の実験において、通常細胞 と腫瘍細胞におけるp53の異なる安定性が、腫瘍細胞環境でTKタンパク質を安定 化するために用いられ得る。増大したp53タンパク質レベルを得る正確なメカニ ズムは未だ明白ではないが、我々は異なる細胞系におけるp53自体と同様な方法 で、野生 型p53の全てまたは様々なドメインと共にTKタンパク質を含む融合タンパク質の 安定化を試験するようにデザインされた一連の構築物を調製した。 いくつかの構築物を調製し、in vitroで適した融合タンパク質を発現すること が示された。これらの構築物を異なるレベルのp53発現を示す細胞内にトランス フェクトし得るが、レベルが異なるのはそれらの細胞が生産するDNA損傷シグナ ルのレベルが異なるためであろう[8]。野生型p53と同様の細胞系における発現レ ベルでの差異を示す修飾TK遺伝子融合構築物を、通常細胞と腫瘍細胞の間で全体 のTK発現のレベルにおける最大の区別を確認するために用い得る。 細胞系MCF-7は例えばUV照射といったDNA損傷によって誘導可能なwtp53を発現 することが以前に示されている(8)。MCF-7細胞をフルレングスwtp53と融合したT Kをコードする融合構築物を用いてトランスフェクトし、安定なトランスフェク ト物をG418を用いて選択した。抗p53抗体を用いたウエスタンブロッティングに より、トランスフェクト物において予想した分子量の融合タンパク質が存在する ことが示された(図14)。さらにこれらの細胞をUVライトを用いて照射にさらした 場合、p53-TK融合タンパク質は安定であり、内因性p53タンパク質と同様の方式 で増大した安定状態レベルで発現された(図14)。 これが示唆するものは、このタイプの融合構築物は安定であり、通常細胞のも のよりミュータントp53を発現する腫瘍細胞においてより高いレベルで発現され 、上述したような転写コントロールを用いる腫瘍特異的遺伝子発現構築物の存在 下であれ不存在下であれ、腫瘍特異的細胞殺傷のために用い得ることである。融 合タンパク質は内因性p53タンパク質と同様の方法で安定化し得るため、該構築 物はまた上昇したレベルのwtp53を発現する腫瘍細胞の殺傷のためにも用い得る 。ある腫瘍では、野生型p53を発現するが、その通常の機能が議論したように他 のタンパク質との相互作用により、またはそれが安定であるところの細胞質に不 正確に局在することにより破壊される。例としては、胸部ガンのある腫瘍(Moll 等,PNAS USA 89:7262-7266,1992)及び神経芽細胞種(Moll等,PNAS USA 92:4407-4 411,1995)が含まれる。p53融合分子がwtp53の方式において安定化するという証 拠は、該腫瘍細胞における興味ある遺伝子産物の発現をターゲット化することで のその使用を指す、すなわち非腫瘍細胞とは反対のように該腫瘍細胞において区 別された発 現を提供する。 in vitro及びin vivoでの活性に対する構築物の試験 上述概略したアプローチは、最適な構築物が通常細胞に対して腫瘍細胞におけ る高発現レベルの実現に対して到達させることを可能にする。腫瘍細胞を殺傷す ることにおけるこれらのTK構築物の効力は、腫瘍形成性及びp53状態に関して特 性指摘されているヒト及びマウス細胞系の範囲で試験し得る。これらの研究はjn vitoで及びヌードマウス腫瘍での両細胞で実施し得る。 原始的な不朽化通常細胞に対する最小の効果を持った、in vitro及びin vivo での腫瘍細胞を殺傷する最高の能力を示す構築物は、トランスジェニックマウス を生産するために受精したマウス卵内に注射可能である。生殖細胞系においてこ れらの構築物を運ぶ大人の動物は、通常細胞においては大変低いかまたは全くTK mRNAまたはタンパク質を発現しないはずであるが、様々な方法によってトランス ジェニックマウスに誘導された腫瘍においては上昇してレベルが検出されるはず である。腫瘍細胞環境においてスイッチをオンにする構築物の能力は、発ガンの イニシエーターとプロモーターを用いた連続的な処理により、これらのマウスに おいて皮膚腫瘍を誘導することで試験され得る。該動物を腫瘍を形成するトラン スジェニックマウスの他の株と掛け合わせ、結果として生殖細胞系における活性 化した腫瘍形成遺伝子を運ばせることもでき[38]、または非機能的p53及びRb遺 伝子を運ぶ動物と掛け合わせることもでき、それは自然発生的に高頻度でリンパ 腫及び肉腫を含む様々なタイプの腫瘍を形成する。我々が採用しているストラテ ジーのため、高レベルのTKタンパク質の発現と安定性を最も高く悪性の腫瘍にお いて期待することを注意すべきである。 さらなる考察 RNAレベルまたはタンパク質レベルのそれぞれで、分解に対する安定性または 感受性を与えるエレメントに取り込まれる様々な遺伝子が知られており、いかな る特性が必要とされるかにしたがって、我々の構築物における安定性または分解 を増大するためにこれらを使用し得る。 発現される非腫瘍遺伝子に関しては、プロドラッグガンシクロビルを細胞毒性 カウンターパートに変換することが知られているため、HSVTKが得に上記されて いる。しかしながら多くの他の可能性も存在しまたは見出され得、改変するプロ ドラッグ活性化酵素または腫瘍の免疫認識を増大するIL-2またはGM-CSFのような サイトカインを含む、我々の構築物において利用できよう。 ウイルス関連性アプローチは本発明と組み合わせることが特に興味が持たれる ように思われる。腫瘍転移は体の広範な異なる部分に生じ、ウイルスベクターに よる全身の感染に基づく治療は体の全部分に現実に到達する可能性を有している 。治療目的で使用されるウイルスベクターは通常複製不能であるが、我々は複製 可能ウイルスベクターの使用を目的とし[39]、それは全細胞に感染し得るが腫瘍 細胞のみでしか複製できない。 我々は腫瘍細胞に対するウイルス複製をコントロールする遺伝子の直接的な発 現に向けた二重コントロールエレメントの使用を想定している。例えばウイルス ポリメラーゼ遺伝子(レトロウイルスまたはアデノウイルス)を、二重プロモータ ーのコントロールの下に置き、または複製に対して必要とされるタンパク質の発 現を生じさせるウイルスプロモーターの機能を、図1のように野生型p53によって コントロールされるリプレッサーエレメントに対する結合部位の挿入によって通 常細胞において破壊し得る。腫瘍細胞殺傷はウイルス(アデノウイルスに対して) の溶解性質を用いて、またはHSV-TK構築物(またはプロドラッグ活性化酵素をコ ードするもう一つの構築物)の取り込み及びガンシクロビル処理によって達成し 得るであろう。通常細胞と腫瘍細胞の区別は、通常細胞においてDNA腫瘍ウイル スを用いた感染に対して生じるwtp53の誘導によって増大しよう。 大変低い放射線照射が通常細胞においてwtp53を誘導することもまた知られて いる。それゆえ該放射線照射を通常細胞における非腫瘍遺伝子の抑制(またはウ イルス複製)を局所的または一般的に増大するために用いられ得る。 G:pCIを用いたものに対するwtp53構築物を用いてコトランスフェクションされた 抽出物のルシフェラーゼ活性の割合。 I:pCIを用いたものに対するwtp53構築物を用いてコトランスフェクションされた 抽出物のGUS活性の割合。 参考文献 １． Core，M.E．and M.K．Collins，European Journal of Cancer，1994．30A (8)：p．1047-1049． ２． Blaese，R.M.，et al.，European Jocurnal of Cancer，1994．30A(8)：p ．1190-1193． ３． Pitts，J.，Molecular Carcinogenesis，1994．11: p．127-130． ４． Vile，R．and I.R．Hart，Cancer Research，1993．53: p．962-967． ５． Sikora，K.，et al.，Annals of the New York Academy of Sciences，19 94．716: p．115-124． ６． Lane，D.，Nature，1992．358: p．15-16． ７． Mosner，et al(1995)．EMBO J.，14:4442-4449． ８． Vojtesek，B．and D.P．Lane，105，1993: p．607-612． ９． El-Deiry，W.S.，et al.，Cell，1993．75: p．817-825． 10． Zastawny，R.L.，et al.，Oncogene，1993．8: p．1529-1535． 11． Tsutsumi-Ishii，Y.，et al.，Cell growth and Differentiation，1995 ．6: p．1-8． 12． Pavletich，N.P.，K.A．Chambers，and C.O．Pabo，Genes and Developme nt，1993．7: p．2556-2564． 13． El-Deiry，W.，et al.，Nature Genetics，1992．1: p．45-49． 14． Bargonetti，J.，et al.，Genes and Development，1993．7: p．2565-25 74． 15． Wang，Y.，et al.，Genes and Devlopment，1993．7: p．2575-2586． 16． Hunter，T.，Cell，1993(839-841)． 17． Waga，S.，et al.，1994．Nature 369: p．574-578． 18． Selvakumaran，M.，et al.，Oncogene，1994．9: p．1791-1798． 19． Haldar，S.，et al.，Cancer Research，1994．54: p．2095-2097． 20． Deb，A.，et al.，Molecular and Cellular Biology，1992．66(10)：p． 6164-6170． 21． Morris，G.F．and M.B．Mathews，Journal of Biological Chemistry，19 90．265(27)：p．16116-16125． 22． Chen，X.，et al.，Genes and Devlopment，1993．7: p．1837-1849． 23． Pietenpol，J.A．and B．Vogelstein，Nature，1993．365: p．17-18． 24． Ragmov，N.，et al.，Oncogene，1993．8: p．1183-1193． 25． Liu，X.，et al.，Molecular and Cellular Biology，1993．13: p．3291 -3300． 26． Dittmer，D.，et al.，Nature genetics，1993．4: p．42-45． 27． Chin，k.V.，et al.，Science，1992．255: p．459-462． 28． Lu，X．and D.P．Lane，Cell，1993．75(4)：p．765-778． 29． Marschall，et al．Cellular and Molecular Neurobiology，1994．14(5) ：p．523-538． 30． Han，K．and J.L．Manley，Genes and Devlopment，1993．7: p．491-503 ． 31． Ma，J．and M．Ptashne，Cell，1992．48: p．847-853． 32． Dorsett，D.，Genetics，1993．134(4)：p．1135-44． 33． Vazqez，J．and P．Schedl，EMBO Journal，1994．13(24)：p．5984-5993 ． 34． Bonifer，et al．EMBO J．1990，9: p．2843-2848． 35． Shiio，et al．Oncogene，1993．8: p．2059-2065． 36． Meek，D.W.，Seminars in Cancer Biology，1994．5(3)：p．203-210． 37． Maxwell，S.A．and J.A．Roth，Critical Reviews in Oncogenesis，1994 ．5(1)：p．23-57． 38． Bailleul，B.，et al.，Cell，1990．62: p．697-708． 39． Russell，S.J．Eur．J．Cancer 1994，30A: p．1165-1171． 40． Kanshani-Sabet，M．and Scanlon，K.J．1995，Cancer Gene Therapy，2( 3)，213-223; 41． Mercola，D.，and Choen，J.S.，1995，Cancer Gene Therapy．2(1)，47- 59． 42． Chung，et al(1993)．Cell，74:505-514． 43． Greenblatt，et al（1994）Cancer Res．54: 4855-4878 44． Lane and Bedchimol（1990）Genes Dev．4: 1-8 45． Levine，et al（1991）Nature 351: 453-456 46． Gossler and Zachgo（1994）“Gene and enhancer screens in ES cells. ”in Gene Targeting - A Practical Approach，ed．Joyner 1995 181-220 47． Nordeen（1988）Biotechniques 6: 454-457 48． Promega，1995，Cell Tire 96TM non-radioactive cell proliferation a ssay Technical Bulletin TB112
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/82 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/48 Ｃ１２Ｑ 1/68 37/52 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｆ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．第一の遺伝子の発現が、非腫瘍細胞において機能が抑制される第一のプロモ ーターによってコントロールされる第一の核酸構築物、および非腫瘍細胞におい て第一の遺伝子を下流調節するための第二の遺伝子の発現が、非腫瘍細胞におい て上流調節される第二のプロモーターによってコントロールされる第二の核酸構 築物を含む組成物。 ２．上記第二の遺伝子の発現が、上記第一の遺伝子の転写を生じさせるmRNA内の 配列に相補的なアンチセンスRNA転写産物を生産する請求項1にしたがった組成物 。 ３．上記第二の遺伝子の発現が、上記第一の遺伝子の転写を生じさせるmRNA内の 配列に対して特異的なリボザイムを生産する請求項1にしたがった組成物。 ４．上記第二の遺伝子の発現が配列特異的転写サプレッサーを生産し、上記第一 の核酸構築物が該サプレッサーに対する結合部位配列を含む請求項1にしたがっ た組成物。 ５．上記配列特異的転写サプレッサーがlacオペレーターサプレッサーである請 求項4にしたがった組成物。 ６．上記配列特異的転写サプレッサーがtetリプレッサーDNA結合ドメイン、及び Drosophila KRAB転写因子の抑制ドメインを含む請求項4にしたがった組成物。 ７．上記配列特異的転写サプレッサーがGal-4DNA結合ドメイン、及びDrosophila イーブンスキップト転写因子の抑制ドメインを含む請求項4にしたがった組成物 。 ８．上記第一の核酸構築物と上記第二の核酸構築物がそれぞれ別の核酸ベクター 上に存在する請求項1から7のいずれか一項にしたがった組成物。 ９．上記第一の核酸構築物と上記第二の核酸構築物が同一の核酸ベクター上に存 在する請求項1から8のいずれか一項にしたがった組成物。 10．上記第一の核酸構築物と上記第二の核酸構築物の間にインスレーター配列を 含む請求項9にしたがった組成物。 11．上記核酸ベクターがウイルスベクターである請求項9または請求項10にした がった組成物。 12．上記第二の核酸構築物がp53結合部位配列またはCMVプロモーターを含む請求 項1から11のいずれか一項にしたがった組成物。 13．上記第二の核酸構築物が、第二のプロモーターのTATAボックス及び転写開始 部位の下流に上記p53結合部位を含む請求項12にしたがった組成物。 14．上記第一のプロモーターが腫瘍細胞において上流調節される請求項1から13 のいずれか一項にしたがった組成物。 15．上記第一のプロモーターがHSP70プロモーターである請求項14にしたがった 組成物。 16．上記第一の遺伝子がレポーター遺伝子である請求項1から15のいずれか一項 にしたがった組成物。 17．上記第一の遺伝子が非腫瘍試薬をコードする請求項1から15のいずれか一項 にしたがった組成物。 18．上記非腫瘍試薬がプロドラッグ活性化酵素である請求項17にしたがった組成 物。 19．上記プロドラッグ活性化酵素がチミジンキナーゼである請求項18にしたがっ た組成物。 20．請求項1から19のいずれか一項にしたがった組成物の第一の核酸構築物と第 二の核酸構築物を含む細胞。 21．腫瘍細胞である請求項20にしたがった細胞。 22．細胞内に請求項1から19のいずれか一項にしたがった組成物の第一の核酸構 築物と第二の核酸構築物を導入することを含む方法。 23．上記細胞が腫瘍細胞である請求項22にしたがった方法。 24．上記導入がin virtoで実施される請求項22または請求項23にしたがった方法 。
JP9514070A 1995-10-02 1996-10-02 抗腫瘍ベクター構築物及び方法 Pending JPH11513251A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9520079.6A GB9520079D0 (en) 1995-10-02 1995-10-02 Antitumour vector constructs and methods
GB9520079.6 1995-10-02
GBGB9616685.5A GB9616685D0 (en) 1995-10-02 1996-08-08 Antitumour vector constructs and methods
GB9616685.5 1996-08-08
PCT/GB1996/002416 WO1997012970A1 (en) 1995-10-02 1996-10-02 Antitumour vector constructs and methods

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH11513251A true JPH11513251A (ja) 1999-11-16

Family

ID=26307853

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP9514070A Pending JPH11513251A (ja) 1995-10-02 1996-10-02 抗腫瘍ベクター構築物及び方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US6943026B1 (ja)
EP (1) EP0870018B1 (ja)
JP (1) JPH11513251A (ja)
AU (1) AU7138696A (ja)
DE (1) DE69620235T2 (ja)
GB (2) GB9616685D0 (ja)
WO (1) WO1997012970A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005123918A1 (ja) * 2004-06-22 2005-12-29 Tokai University Educational System 外来遺伝子の誘導発現の制御が可能な発現ベクター
JP2006280304A (ja) * 2005-04-01 2006-10-19 Kitakyushu Foundation For The Advancement Of Industry Science & Technology 変異原性検出用組換えベクター、ヒト細胞、及び変異原性検出方法

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9703633D0 (en) * 1997-02-21 1997-04-09 Imp Cancer Res Tech Cancer therapy
CA2303201A1 (en) * 1997-08-20 1999-02-25 Dnavec Research Inc. Vectors for treating cancer
DE19751587A1 (de) * 1997-11-21 1999-07-29 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Onkogen- oder virusgesteuerte Expressionssysteme
KR100636578B1 (ko) 1999-04-02 2006-10-19 히사미쓰 세이야꾸 가부시키가이샤 치료용 유전자 발현 염기서열 및 유전자 치료용 약제
GB0012528D0 (en) * 2000-05-23 2000-07-12 Univ Palackeho Triterpenoid derivatives
GB0014820D0 (en) * 2000-06-16 2000-08-09 Medical Res Council Methods and materials relating to plasmid vectors
WO2002041922A1 (fr) * 2000-11-24 2002-05-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Procede servant a reguler l'activite de l'expression d'un produit genetique transfere dans un organisme vivant
CA2349506C (en) 2001-06-14 2009-12-08 Duke University A method for selective expression of therapeutic genes by hyperthermia

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0671955A4 (en) * 1992-02-14 1997-04-09 Stratagene Inc MUTAGENESE TEST USING NON-HUMAN BEINGS CONTAINING TEST DNA SEQUENCES.
AU6498294A (en) 1993-04-07 1994-10-24 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Dna sequence which acts as a chromatin insulator element to protect expressed genes from (cis)-acting regulatory sequences in mammalian cells
EP0705334A1 (en) * 1993-06-14 1996-04-10 Basf Aktiengesellschaft Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters
US6004941A (en) * 1993-06-14 1999-12-21 Basf Aktiengesellschaft Methods for regulating gene expression
US5700657A (en) 1993-12-13 1997-12-23 Genzyme Corporation Vectors and vector systems including genes encoding tumor suppressor proteins and producer cells transformed thereby
US5659024A (en) * 1994-01-14 1997-08-19 The Burnham Institute Promotors that regulate the expression of genes involved in cell death
AU1662595A (en) * 1994-01-28 1995-08-15 Herbert Altmann Method of determining the activity of a regulatory factor, and use of the method
GB9506466D0 (en) * 1994-08-26 1995-05-17 Prolifix Ltd Cell cycle regulated repressor and dna element
AU4994596A (en) * 1995-03-01 1996-09-18 Cornell Research Foundation Inc. Interdependent adenoviral vectors and methods of using same

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005123918A1 (ja) * 2004-06-22 2005-12-29 Tokai University Educational System 外来遺伝子の誘導発現の制御が可能な発現ベクター
JP2006280304A (ja) * 2005-04-01 2006-10-19 Kitakyushu Foundation For The Advancement Of Industry Science & Technology 変異原性検出用組換えベクター、ヒト細胞、及び変異原性検出方法

Also Published As

Publication number Publication date
DE69620235D1 (de) 2002-05-02
EP0870018A1 (en) 1998-10-14
GB9616685D0 (en) 1996-09-25
AU7138696A (en) 1997-04-28
GB9620549D0 (en) 1996-11-20
US6943026B1 (en) 2005-09-13
DE69620235T2 (de) 2002-11-14
GB2305920B (en) 1999-10-27
GB2305920A (en) 1997-04-23
EP0870018B1 (en) 2002-03-27
WO1997012970A1 (en) 1997-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69534791T2 (de) Vektoren zur gewebsspezifischen replikation
KR100812631B1 (ko) 재조합 ｐ５３ 아데노바이러스 제조방법 및 조성물
US6737523B1 (en) Nucleic acids comprising regions of the rat PEG-3 promoter that display elevated expression in human cancer cells and uses thereof
US20070244064A1 (en) Methods and compositions to induce antitumor response
JP2002507382A (ja) 組織特異的複製および遺伝子発現のためのベクター
JPH10503476A (ja) ＤＮＡ損傷剤およびр５３を含有する組成物
JP2007511216A (ja) 変異ウイルス
JPH11513251A (ja) 抗腫瘍ベクター構築物及び方法
US7179646B2 (en) Gene expression using T cell factor responsive element
US20060019922A1 (en) Selective killing of cancerous cells
Illenye et al. Functional analysis of bacterial artificial chromosomes in mammalian cells: mouse Cdc6 is associated with the mitotic spindle apparatus
Annab et al. Isolation of a functional copy of the human BRCA1 gene by transformation-associated recombination in yeast
US6110702A (en) PSA positive regulating (PSAR) sequences and uses thereof
Asselbergs et al. Analysis of expression of adenovirus DNA (fragments) by microinjection in Xenopus oocytes: Independent synthesis of minor early region 2 proteins
JP2002507384A (ja) アデノウイルスベクターの製造方法、それによって製造したベクターおよびその使用
WO2000022124A2 (en) Methods and compositions to induce antitumor response
JP4426757B2 (ja) 核酸移送のための糖類と組み合わせたデキストリンポリマーを含む製剤
WO1997035993A9 (en) Psa positive regulating (psar) sequences and uses thereof
JP2004520006A (ja) ラットｐｅｇ−３プロモーターの領域を含んでなる核酸とその利用
WO1999009191A1 (fr) Vecteurs de traitement du cancer
KR102471898B1 (ko) 면역관문 억제제를 발현하는 암 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도
US20230390320A1 (en) Cancer-specific trans-splicing ribozyme expressing immune checkpoint inhibitor, and use thereor
Sengupta et al. Tumour regression in a ligand inducible manner mediated by a chimeric tumour suppressor derived from p53
AU2002212486A1 (en) Formulations comprising dextrin polymers in combination with sugars for the delivery of nucleic acids
KR100217463B1 (ko) 암억제단백질인 p53을 생산하는 아데노바이러스 및 이를 항암치료에 사용하는 용도