KR100217463B1 - 암억제단백질인 p53을 생산하는 아데노바이러스 및 이를 항암치료에 사용하는 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암 억제 단백질인 p53 을 세포내에서 생산할 수 있는 아데노바이러스 및 이를 항암 치료에 사용하는 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 암 억제 유전자(tumor suppressor gene)로 알려진 p53 유전자를 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터, 이를 이용하여 얻은 세포내에서 p53 단백질을 생산할 수 있는 아데노바이러스 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 아데노바이러스 클론 Avp 53 은 난소암, 자궁암 및 폐암 등을 포함한 다양한 항암 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

암억제 단백질인 P53을 생산하는 아데노바이러스 및 이를 항암치료에 사용하는 용도

본 발명은 암 억제 단백질인 p53 을 세포내에서 생산할 수 있는 아데노바이러스 및 이를 항암 치료에 사용하는 용도에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 암 억제 유전자(tumor suppressor gene)로 알려진 p53 유전자를 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터, 이를 이용하여 얻은 세포내에서 p53 단백질을 생산할 수 있는 아데노바이러스 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 아데노바이러스 클론 Avp 53 은 난소암, 자궁암 및 폐암 등을 포함한 다양한 항암 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

유전자 요법(gene therapy)은 유전자 이상에 의하여 유발되는 각종 유전병과 암 등을 치료하기 위하여, 질병과 관련이 있는 유전자를 환자의 체내에 직접적으로 주입하고 상기 유전자를 세포내에서 발현시켜 그의 기능을 정상화시키는 방법이다. 이러한 유전자 요법은 특정 유전자를 체내에 주입하여 인체 내에 새로운 기능을 부여할 수 있으므로 치료이외에 각종 질병을 예방하거나 치료 효과를 강화하는데도 널리 이용될 수 있다.

항암 치료에 사용될 수 있는 유전자 요법은 크게 5가지 방식으로 나누어 볼 수 있다. 첫째, 사이토카인(cytokine) 유전자를 암세포에 주입하여 암에 대한 면역성과 관련이 있는 T 세포를 자극하는 방식으로 이 때 사이토카인 유전자로는 인터루킨-2, 인터루킨-4, 종양 사멸 인자, 과립구-대식구 콜로니-자극 인자 및 인터페론-γ 등이 유용하게 사용될 수 있다. 둘째, 인체 조직과 적합하지 않은 HLA 유전자를 발현할 수 있는 벡터를 암이 있는 부위에 직접 주입하여 생체에서 면역 반응이 유발되게 하는 방식이 있다. 셋째, 세포를 죽이는 자살 유전자(suicide)를 암세포에 직접 주입하여 발현시키는 방식으로, 헤르페스 심플렉스 바이러스 (herpes simplex virus)의 티미딘 키나제(thymidine kinase)와 뉴클레오타이드 아날로그인 갠사이클로비어(Gancyclovir)를 이용하여 왕성하게 증식하는 암세포의 DNA 합성을 정지시킴으로써 세포의 사멸을 유도할 수 있다. 넷째, 다제내성 (multidrug resistance, MDR) 유전자를 골수의 모세포에 주입하여 발현시킴으로써 화학치료법(chemotherapy)을 높은 농도로 사용하는 경우에도 골수를 효과적으로 보호할 수 있는 방식이 있다. 다섯째, 종양 억제 유전자(tumor suppressor gene)를 세포에 주입하여 발현시키는 방식으로, 이 때 p53 유전자 및 안티센스 k-ras 유전자 등이 사용될 수 있다. 상기의 유전자를 이용한 치료 방식들은 현재 체내에서의 안전성 및 효능 등이 입증되고 있는 단계에 있다.

유전자 요법으로 질병을 치료하는데 있어서 가장 중요한 요건은 주입된 유전자가 성공적으로 목표 세포의 핵에 전달되어 이로부터 유전자가 다량으로 발현되는 것이다. 이 때 사용된 유전자는 목표 세포에 도달하여 엔도사이토시스(endocytosis)라는 과정을 거쳐 세포 내부로 들어간 다음 핵내로 전달되어 발현된다. DNA 자체로 이루어진 유전자는 세포를 통과하는 효율이 극히 떨어지므로 리포좀(liposome)과 같은 운반체를 사용하여 유전자를 주입할 수도 있는데 이 경우에도 핵으로 전달되는 과정에 리포좀이 대부분 파괴되어 그 효율이 떨어진다.

하지만, 인체에 감염성이 있는 바이러스를 이용하면 세포내에 외래 유전자를 효과적으로 주입할 수 있으므로 바이러스를 유전자 요법에 응용하는 것이 매우 바람직하다. 구체적으로, 치료에 사용될 수 있는 유전자를 유전자 재조합 방법으로 바이러스 DNA 에 삽입하고 이를 자신의 게놈으로 하는 바이러스를 생체외에서 대량 생산하여 인체에 직접적으로 감염시킴으로써 세포내에 효율적으로 원하는 유전자를 전달하여 발현시킬 수 있다. 특히, 아데노바이러스는 세포의 핵내에 그의 유전자를 전달하는 특별한 기전을 가지고 있어 다른 바이러스 보다 그의 DNA 를 핵내에 전달하는 효율이 높으므로 유전자 치료 요법에 유용하게 사용될 수 있다.

p53 유전자는 암 억제 유전자(tumor suppressor gene)라고 불리는 유전자로서 50 - 60% 의 암 환자의 경우 이 유전자에 돌연변이 또는 결손이 일어나 p53 단백질이 활성을 나타내지 못한다고 보고되어 있다. 구체적으로 p53 단백질은 세포내에 DNA 손상이 유발된 경우 세포를 세포 주기 G1 기에 멈추게 하여 DNA 손상을 복구(repair)하는 과정이 이루어지게 함으로써 암세포가 생성되지 못하도록 작용한다. 또한 p53 단백질은 이미 암세포가 성장하여 급격히 커진 경우, 형질전환된 세포가 스스로 사멸되도록 하는 프로그램(programmed cell death, PCD)을 작동시켜 이상 세포를 조직내에서 제거하는 아폽토시스(apoptosis)가 유발되도록 작용하여 암이 진행되는 것을 막는다고 알려져 있다. 이외에도 세포 분열시 방추사의 작용에도 관여한다고 한다. 따라서 야생형의 p53 유전자를 이 유전자에 변이가 있는 암세포에 전달하여 발현시키면 암세포는 상기 PCD 기작 등에 의해 사멸될 수 있고, 이러한 p53 유전자의 작용 기작은 항암 유전자 요법에 유용하게 응용될 수 있다.

상기와 같은 작용을 갖는 p53 단백질은 G1-사이클린 의존성 키나제(G1-cyclin dependent kinases, cdks)를 억제하는 p21WAF1/CIP1 단백질을 포함한 몇몇 유전자의 발현을 조절하여 암을 억제하는 작용을 나타낸다고 알려져 있다. 이 때 세포가 세포 주기 S 기로 들어가는 것을 억제하는 인산화가 덜된(hypophosphorylated) 형태의 레티노브라스토마 민감 단백질(retinoblastoma susceptibility protein)이 축적되는 것이 관찰되고 있다. 그러나 p53 단백질이 관여하는 아폽토시스에 관한 자세한 기작에 대해서는 이것이 Bax 단백질 또는 BCl-2 단백질의 발현을 조절한다는 것이외에는 아직 밝혀지지 않았다.

상기에서 보는 바와 같이, p53 유전자 및 단백질의 유용성이 널리 알려져 전세계적으로 많은 연구자들에 의해 p53 단백질을 이용한 항암 유전자 요법의 개발이 시도되고 있다. 지금까지 대부분의 연구자들은 p53 유전자를 그대로 또는 이를 리포좀 운반체에 넣어서 전달하는 방법을 시도하였고, 최근에는 일부에서 아데노바이러스를 전달 매체로 이용하려는 연구들이 시도되고 있다. 아데노바이러스를 이용하면 외래 유전자를 인간 세포에 리소좀에 의해 분해되지 않으면서 효율적으로 주입할 수 있고, 그리고 이 바이러스는 안정하여 바이러스 스톡을 손쉽게 분리하여 농축할 수 있으며, 세포에 대한 감염도가 커서 유전자 요법에 유용하게 사용될 수 있다.

구체적으로 미국에서 임상적으로 아데노바이러스 p53 유전자를 이용하는 치료 요법은 로스(J. Roth) 등이 후두암을 치료하는데 시도하고 간지(Canji) 등은 간암을 치료하는데 시도하여 현재까지 유전자 요법의 안전성은 어느 정도 인정되고 있다. 그러나, 유전자 요법에 의해 후두암 및 다른 종류의 암이 치료된 효과 등에 대해서는 아직까지 뚜렷하게 보고된 바가 없었다. 바이러스의 안전성 측면에서 중요한 것은 감염된 세포내에서 바이러스가 증식하여 인체 전체가 감염되는 위험을 막는 것인데, 로스 및 간지 등이 개발한 아데노바이러스 발현 벡터 보다 재조합 아데노바이러스 게놈이 상대적으로 더 적게 포함된 아데노바이러스 벡터를 개발하면 동일 재조합(homologous recombination)에 의해 증식성 재조합 변이 바이러스(replcation competent recombinant virus, RCV)가 생성될 가능성이 감소하므로 더욱 안전성이 우수한 아데노바이러스를 개발할 수 있고 이는 항암 유전자 요법에 유용하게 사용될 수 있다.

유전자 요법을 임상적으로 사용하기 위해서는 FDA 및 NIH 의 허가를 받아야 하는데, 이러한 허가는 p53 유전자를 전달하는 바이러스의 안전성과 치료 효과를 세포와 동물을 대상으로 실험하여 입증하고 그의 상세한 자료 및 임상 실험 계획을 제출하여야 이루어질 수 있다. 현재 많은 연구자들이 기존에 제작된 p53 유전자가 포함된 아데노바이러스를 이용하여 자체적으로 임상 실험을 시도하거나 계획하고 있으며 국내에서도 일부 연구자들이 미국에서 개발된 바이러스를 도입하여 둥물 실험을 진행하고 있다. 그러나 미국에서 개발된 바이러스를 이용한 유전자 요법을 사용하여 임상 실험을 하려면 각 병원의 임상 연구 심사(IRB)를 통과하여야 하고 이전에 NIH 의 허가를 얻어 정식으로 수입하는 과정 등을 거쳐야 하므로 매우 번거롭다. 특히 이러한 바이러스들은 이미 자국내에서 특허화되어 있어 임상 치료를 본격적으로 실시하는 경우 반드시 높은 특허권 사용료를 지불하여야 한다.

이에 본 발명자들은 임상에서 용이하게 사용될 수 있는 암을 치료하는 유전자 요법을 개발하기 위하여, 암 억제 유전자로 알려진 p53 유전자를 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터를 제조하여 이를 패키징 세포에 형질전환시키고 이로부터 세포내에서 p53 단백질을 생산할 수 있고 증식성 변이 바이러스를 포함하지 않는 아데노바이러스 클론을 선별한 다음 본 아데노바이러스 클론이 암세포를 사멸시키거나 그의 성장을 억제시킴을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 암 억제 유전자(tumor suppressor gene)인 야생형 p53 유전자를 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터를 제공함에 그 목적이 있다. 본 발명은 바이러스 증식에 관여하는 E1 유전자 부위를 포함하지 않고 세포내에서 야생형 p53 단백질을 생산할 수 있는 아데노바이러스 발현 벡터를 제공한다.

구체적으로 본 발명은 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus)의 최전 프로모터, 다클로닝 부위 및 시미언바이러스 40(Simian virus 40, SV 40)의 후 아데닌다중화 신호로 구성되는 발현 카세트를 이용하여 p53 단백질을 생산할 수 있는 아데노바이러스 발현 벡터 p△ACMV-p53 를 제공한다.

또한, 본 발명은 세포내에서 p53 단백질을 생산하여 항암 유전자 요법에 사용될 수 있는 아데노바이러스 클론을 제공함에 그 목적이 있다. 구체적으로 본 발명은 상기 아데노바이러스 발현 벡터를 패키징 세포에서 증식시켜 증식성 재조합 변이 바이러스(RCV)가 포함되지 않은 아데노바이러스 클론을 제공한다.

본 발명에서 선별한 아데노바이러스 클론을 Avp 53 로 명명하고 이를 1996년 12월 27일에 한국 종균 협회에 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 0292 BP).

또한, 본 발명은 항암 유전자 요법에 사용될 수 있는 상기 아데노바이러스 클론을 제조하는 방법을 제공함에 그 목적이 있다. 구체적으로, 본 발명은 상기 아데노바이러스 발현 벡터를 아데노바이러스가 증식하는데 필요한 유전자를 포함하는 아데노바이러스 모체 벡터와 함께 패키징 세포에 형질전환시켜 얻은 아데노바이러스 클론 중 RCV 를 생산하지 않는 바이러스 클론을 선별하여 상기 아데노바이러스 클론 Avp 53 을 제조한다.

이 때, 아데노바이러스가 증식하는데 필요한 유전자를 포함하는 아데노바이러스 모체 벡터로는 아데노바이러스 벡터 pJM17 을 사용하는 것이 바람직하고, 패키징 세포로는 293 세포를 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 RCV 를 생산하지 않는 아데노바이러스 클론을 선별하기 위하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기 서열을 갖는 E1 유전자 부위의 E1A 시발체 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기 서열을 갖는 E1B 시발체를 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행한다.

또한, 본 발명은 상기 아데노바이러스 클론을 암의 치료에 사용하는 용도를 제공함에 그 목적이 있다. 본 발명의 아데노바이러스 클론은 특히 난소암, 자궁암 및 폐암 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

구체적으로, 본 발명은 상기 아데노바이러스 클론을 인체내에 암이 생긴 부위에 감염시켜 암이 진행되는 것을 억제하거나 암세포를 사멸시켜 암을 치료하는 항암 유전자 요법을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터 p△ACMV-p53 의 유전자 지도를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터를 이용하여 얻은 아데노바이러스를 감염시킨 SKOV3 세포주에서 p53 단백질이 생산되고, p21WAF1/CIP1 단백질의 생산이 유도되는 양상을 웨스턴 블럿으로 분석하여 나타낸 것이다.

레인 1 : 변이 p53 단백질을 생산하는 2774 세포,

레인 2 - 10 : 각 아데노바이러스 클론으로 감염시킨 세포,

레인 11 : 감염되지 않은 세포,

도 3은 본 발명의 아데노바이러스 클론들에 증식성 재조합 변이 바이러스가 존재하는지 여부를 각 아데노바이러스 DNA 를 사용한 중합효소 연쇄반응으로 확인하여 나타낸 것이다.

레인 1-3 : 아데노바이러스 E1 유전자 부위에 해당하지 않는 시발체를 이용 한 경우,

레인 5-7 : E1A 유전자 부위에 해당하는 시발체를 이용한 경우,

레인 9-11 : E1B 유전자 부위에 해당하는 시발체를 이용한 경우

도 4는 본 발명의 아데노바이러스 클론들에 증식성 재조합 변이 바이러스가 존재하는지 여부를 이에 감염된 HeLa 세포에서 분리한 DNA 를 사용한 중합효소 연쇄반응으로 확인하여 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명의 아데노바이러스 Avp 53 로부터 생산되는 p53 단백질이 다양한 세포주들을 사멸시키는 양상을 그래프로 나타낸 것이다.

○ : Avp 53 처리군 ; ◇ : AdRSVβGal 처리군 ; ◆ : 인산완충용액 처리군

도 6은 본 발명의 아데노바이러스 Avp 53 로 감염시킨 SKOV3 세포주 및 2774 세포주의 모양을 위상차 현미경으로 관찰한 것이다.

도 7은 본 발명의 아데노바이러스 Avp 53 을 처리한 PA-1 세포주 및 2774 세포주에서 핵 DNA 를 세포조직화학방법으로 처리하여 아폽토시스가 유발됨을 나타낸 것이다.

도 8은 본 발명의 아데노바이러스 Avp 53 으로 처리하여 아폽토시스가 유발된 상기 2774 세포주를 투과 전자현미경으로 관찰한 것이다.

도 9는 본 발명의 아데노바이러스 Avp 53 으로 처리한 각 세포주에서 p53 단백질이 생산되는 양상을 웨스턴 블럿으로 나타낸 것이다.

도 10는 본 발명의 아데노바이러스 Avp 53 으로 처리한 각 세포주에서 p21WAF1/CIP1 단백질의 생산이 유도되는 양상을 웨스턴 블럿으로 나타낸 것이다.

도 11는 본 발명의 아데노바이러스 Avp 53 으로 처리한 각 세포주에서 pRb 단백질이 활성화되는 양상을 웨스턴 블럿으로 나타낸 것이다.

도 12는 본 발명의 아데노바이러스 Avp 53 으로 처리한 각 세포주에서 E1B 단백질이 생산되지 않음을 역전사효소를 이용한 중합효소 연쇄반응으로 나타낸 것이다.

본 발명은 암 억제 유전자(tumor suppressor gene)인 야생형 p53 유전자를 포함하고 있는 아데노바이러스 발현 벡터를 제공한다.

아데노바이러스(Adenovirus)는 DNA 바이러스로서, 게놈 DNA 의 크기는 약 36kbp 이며 그 게놈에 바이러스가 증식하는데 필수적인 유전자인 E1a 유전자 부위와 바이러스가 패키징되는데 필수적인 유전자 등이 포함되어 있다. 이러한 아데노바이러스가 유전자 요법에 이용되기 위해서는 바이러스가 체내에서 스스로 증식하여 온몸에 감염됨으로써 또 다른 질병이 유발되지 않도록 바이러스 증식에 사용되는 유전자를 제거하여야 한다. 따라서, 아데노바이러스 게놈 중에 바이러스가 증식하는데 관여하는 E1a 유전자 부위를 제거하면 바이러스가 스스로 정상 세포에서 증식할 수 없어 아데노바이러스를 유전자 요법에 이용할 수 있다.

본 발명은 세포내에서 암 억제 단백질인 야생형 p53 단백질을 생산할 수 있는 아데노바이러스를 제조하기 위하여, 아데노바이러스의 게놈 DNA 에서 E1 유전자 부위를 제거하고 그 자리에 야생형 p53 유전자를 포함하는 발현 카세트를 대신 삽입함으로써 p53 단백질을 생산할 수 있는 발현 벡터를 제조한다.

구체적으로, 본 발명은 아데노바이러스 타입 5 에서 E1 유전자 부위를 제거한 나머지 유전자를 포함하고 인간 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)의 최전 프로모터(immediate early promoter), 다클로닝 부위(multiple cloning site) 및 시미언바이러스 40(simian virus, SV40)의 후 아데닌다중화(late polyadenylation) 신호로 구성되는 발현 카세트를 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터 p△ACMVp(A)를 이용한다. 야생형 인간 p53 cDNA 는 보겔스타인 (B. Vogelstein)으로부터 얻어 상기 발현 벡터 p△ACMVp(A)의 다클로닝 부위의 Bam HI 제한효소 부위에 삽입하고 p53 유전자를 발현할 수 있는 발현 벡터 p△ACMV-p53 를 제조한다 (도 1 참조).

본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터를 이용하여 아데노바이러스를 대량으로 얻기 위하여, 아데노바이러스가 패키징될 수 있는 세포주를 상기 발현 벡터로 형질전환시킨다(transfection). 구체적으로 패키징 세포주로 293 세포를 이용하는데, 293 세포는 그의 염색체 DNA 에 아데노바이러스의 E1 유전자 부위를 포함하고 있어 E1a 유전자를 계속적으로 발현하고 세포에 E1a 단백질을 제공한다.

아데노바이러스의 게놈 DNA 은 크기가 약 36kbp 정도로 매우 커서 이의 유전자를 조작하는데 큰 어려움이 있으므로 아데노바이러스 발현 벡터에는 아데노바이러스 전체 DNA 가 아닌 일부 DNA 만을 포함시킨 다음 아데노바이러스 모체 벡터를 사용하여 이들이 증식하는데 필요한 유전자 및 단백질을 공급한다. 따라서, 본 발명은 아데노바이러스 발현 벡터로부터 세포내에서 p53 단백질을 생산할 수 있는 아데노바이러스 클론를 제조하기 위하여 캐나다의 프랭크 그라함이 제공하는 아데노바이러스 모체 벡터 pJM17 (Microbix Biosystems 사) 등을 이용한다.

본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터를 패키징 세포에 상기 아데노바이러스 모체 벡터와 함께 주입하면 상기 아데노바이러스 발현 벡터가 대량으로 증식되고 동시에 아데노바이러스가 패키징되는데 필요한 유전자도 발현된다. 보통 한 개의 293 세포에서 약 1만개의 아데노바이러스 입자가 만들어지며 이렇게 세포내에 축적된 바이러스는 세포를 물리적으로 파쇄하고 원심 분리함으로써 순수하고 용이하게 정제될 수 있다.

유전자 요법에 사용되는 아데노바이러스 클론을 제조하기 위해서는 상기 과정에서 돌발적으로 생성되는 증식성 재조합 변이 바이러스(RCV)를 해결하는 것이 중요하다. 본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터 p△ACMV-p53 는 E1 유전자 부위가 p53 유전자를 발현하는 발현 카세트로 대체되어 이로부터 만들어진 바이러스는 293 세포가 아닌 정상 세포에서는 스스로 증식할 수 없다. 그러나 상기 293 세포에서 패키징 과정 중에 적지 않은 빈도로 RCV 가 생성되게 되는데 이는 293 세포가 갖고 있는 아데노바이러스 DNA [0-11 맵 유니트(map unit)]와 본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터 간에 동일한 염기 서열이 존재하여 동일 재조합(homologous recombination)이라는 기전에 의하여 서로 그 내부 부위가 교환되기 때문이다.

구체적으로 상기 아데노바이러스 발현 벡터로 형질전환된 293 세포의 경우에서 상기 동일 재조합에 의하여 발현 벡터의 p53 유전자가 포함된 발현 카세트 부위가 293 세포내의 아데노바이러스 DNA 인 E1 유전자 부위로 치환되어 결과적으로 E1 유전자를 포함하는 새로운 바이러스 DNA 가 만들어지며 이로부터 패키징되는 바이러스는 E1a 단백질이 없는 정상 세포에서도 증식하게 된다. 이렇게 생성된 RCV 가 포함된 바이러스는 바이러스에 의한 감염증을 유발하므로 임상적으로 유전자 요법에 절대로 사용될 수 없고 임상에 사용되는 바이러스는 반드시 RCV 실험에서 음성 결과가 나와야 한다.

따라서 본 발명의 발현 벡터를 이용하여 제조한 아데노바이러스 클론이 세포 사멸에 효과가 있고 세포내에서 바이러스 감염증을 유발하지 않아 항암 유전자 요법으로 사용될 수 있는가를 조사하기 위하여, 상기에서 얻은 바이러스 클론이 세포내에 감염되어 활성이 있는 p53 단백질을 발현하는가 그리고 RCV 가 오염되어 있는가를 조사한다.

본 발명은 p53 단백질의 활성을 조사하기 위하여, 상기에서 9개의 아데노바이러스 클론을 분리하여 세포내(endogenous) p53 유전자가 없어 p53 단백질이 발현되지 않는 난소암 세포주 SKOV3 에 감염시켜 p53 단백질이 생산되고 이에 의해 조절되는 p21WAF1/CIP1 단백질이 유도되는 것을 확인한다. 그 결과, 본 발명은 #5 아데노바이러스 클론을 제외한 모든 바이러스 클론이 p21WAF1/CIP1 단백질을 발현함을 확인한다 (도 2 참조).

또한 상기 아데노바이러스 클론에 존재하는 RCV 를 분석하기 위하여, RCV 가 아데노바이러스 발현 벡터에는 없는 E1 유전자 부위를 포함한다는 사실에 기초하여 본 발명의 아데노바이러스 타입 5 의 E1A 유전자 부위 및 E1B 유전자 부위가 존재하는가를 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 확인한다 (도 3 및 도 4 참조). 이 때 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기 서열을 갖는 한 쌍의 E1A 시발체 그리고 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기 서열을 갖는 한 쌍의 E1B 시발체를 이용한다 (서열표 1, 서열표 2, 서열표 3 및 서열표 4 참조). 그 결과, 각각 752bp 및 1818bp 크기의 DNA 절편을 얻어 주형으로 사용한 바이러스 DNA 에 존재하는 E1 유전자 부위를 확인한다. 또한 증식하지 않는 다수의 바이러스에서 소수로 존재할 수 있는 RCV 를 더욱 민감하게 찾아내기 위하여, HeLa 세포를 사용하여 바이러스를 계대 배양하는 짱 등의 방법을 변형하여 사용한다.

그 결과, 활성이 있는 p53 단백질을 세포내에서 생산할 수 있고 RCV 를 생산하지 않는 아데노바이러스 클론을 선별하여 이를 Avp 53 로 명명하였다. 본 발명의 아데노바이러스 클론을 1996년 12월 27일에 한국 종균 협회에 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 0292 BP).

또한 본 발명의 아데노바이러스 클론 Avp53 에 포함되는 p53 유전자의 전체 염기 서열을 분석하고, 히데유키(일본 구마모토 대학)가 개발한 효모 색 분석(yeast color assay) 방법을 수행하여 상기 p53 유전자가 야생형인 것을 확인한다.

본 발명은 상기 아데노바이러스 클론을 항암 유전자 요법에 사용할 수 있는지 조사하기 위하여, 본 바이러스 클론 Avp 53 을 각종 암 세포주에 감염시켜 세포를 사멸시키거나 세포 성장을 억제하는 효과를 확인한다 (도 5 참조). 구체적으로 본 발명은 암 세포주로 난소암에서 유래한 SKOV3, 2774 및 PA-1 세포주 등을 사용하고, 자궁암에서 유래한 HeLa 및 HT-3 세포주 등을 사용한다. 이들 세포주들은 세포내에 p53 유전자 및 그의 발현이 다양한 특성을 나타내는데, 구체적으로 2774 및 HT-3 세포주는 변이 p53 유전자를, PA-1 는 야생형 p53 유전자를 포함하고 SVOK3 세포주는 넌센스 돌연변이(nonsense mutation) 및 염색체 재배열(rearrangement) 등에 의해 전혀 활성이 없는 p53 단백질을 발현하고 HeLa 세포는 야생형 p53 유전자를 가지고 있으나 세포내의 E6 단백질과 반응하여 빨리 분해되는 특성이 있다.

본 발명의 아데노바이러스 클론 Avp 53 가 세포 성장에 미치는 효과는 MTT 색소 분석(colorimetric assay)으로 측정한다. 이 때 대조군으로 아데노바이러스 AdRSVβGal 로 세포를 감염시킨다. 그 결과, 2774, PA-1, HeLa, HT-3 세포에서 세포수가 감소하는 현상을, SKOV3 세포에서 세포 성장이 억제되는 현상을 관찰하고, 정상 피브로브라스트(fibroblast) 세포는 거의 영향을 받지 않음을 확인한다. 또한 본 발명의 아데노바이러스 클론 Avp 53 을 낮은 농도로 가하면 세포 사멸(cytopathy)가 천천히 진행되어 세포의 성장이 억제되고 아데노바이러스 Avp 53 을 높은 농도로 가하면 SKOV3 세포(160 pfu/ 세포)에서도 세포수가 감소되는 사멸 현상이 나타남을 확인한다. 따라서, 본 발명의 아데노바이러스 Avp 53 은 거의 모든 암 세포주에서 세포를 사멸시키고 성장을 억제하는 효과를 나타낸다 (도 6 참조).

본 발명은 아데노바이러스 Avp 53 으로 감염된 세포에서 p53 단백질의 발현을 조사하기 위하여 면역조직화학적으로 이의 분석을 수행한다. 또한 Avp 53 으로 감염된 세포에서 유발되는 아폽토시스를 뉴클레오좀 DNA 가 파괴되는 현상을 Apop Tag 아폽토시스 탐지 키트(Oncor사 제품)를 사용하여 세포 조직화학적으로 분석한다 (도 7 참조). 구체적으로 아데노바이러스 Avp 53 또는 AdRSVβGal 을 세포에 처리하여 아폽토시스의 세포 마커인 뉴클레오좀 사이의 조각화(internucleosomal fragmentation)에 의해 성성된 유리 3'-OH 기를 말단 디옥시뉴클레오타이드 전이효소(terminal deoxynucleotide transferase) 및 딕옥시제닌-표지 뉴클레오타이드(digoxigenin-labelled nucleotide)를 이용하여 표지하여 분석한다.

그 결과, 2774 및 PA-1 세포주 등에서 아폽토시스가 유발되는 현상을 갈색화된 핵 및 막이 수포화(membrane blebbing)된 세포를 광학현미경으로 관찰하고, 투사 전자현미경으로 크로마틴이 응축되고(condensation) 응축 염색체가 핵막 주위에 위치하며 핵이 조각화되는 것을 관찰하여 확인한다 (도 8 참조).

또한, 본 발명의 아데노바이러스로 형질전환시킨 세포주에서 p53 단백질, p21WAF1/CIP1 단백질 및 레티노브라스토마 민감 단백질 (retinoblastoma susceptibility gene protein, pRb)의 발현을 면역블럿팅으로 조사하여 p53 단백질의 세포 내에서의 작용을 확인한다 (도 9, 도 10 및 도 11 참조).

본 발명의 아데노바이러스 클론으로 형질전환된 각 세포주에서 E1B 단백질이 발현되는지 확인하기 위하여, 역전사효소-중합효소 연쇄반응을 수행한다 (도 12 참조). 그 결과, 본 발명의 아데노바이러스 Avp 53은 E1B 단백질을 발현하지 않음을 확인한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.

하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> p53 유전자를 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터의 제조

본 발명은 야생형 p53 유전자를 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터를 제조하기 위하여, 아데노바이러스 타입 5 에서 E1 유전자 부위를 제거하고 이에 인간 사이토메갈로바이러스의 최전 프로모터(immediate early promoter), 다클로닝 부위 및 시미언 바이러스 40의 후 아데닌다중화 (late polyadenylation) 신호로 구성되는 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터 p△ACMVp(A) (Chinghai Cao 제조)를 이용하였다.

본 발명의 p53 단백질을 세포 내에서 생산할 수 있는 아데노바이러스 발현 벡터를 제조하기 위하여, 1.8kb 크기의 야생형 인간 p53 cDNA 를 발현 벡터 pMEMneo-p53 (B. 보겔스타인 제조)에서 Xba I 제한효소로 절단하여 얻고 그의 양 말단을 Bam HI 접합자를 사용하여 변형시킨 다음 이를 상기 발현 벡터 p△ACMVp(A)의 다클로닝 부위에 존재하는 Bam HI 제한효소 부위에 삽입하였다 (도 1 참조). 그 결과, 아데노바이러스 발현 벡터 p△ACMV-p53 를 제조하였다.

<실시예 2> p53 단백질을 세포내에서 생산할 수 있는 아데노바이러스 클론의 제조

세포에 감염되어 p53 단백질을 생산할 수 있는 아데노바이러스 클론을 제조하기 위하여, 본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터 p△ACMV-p53 를 아데노바이러스 모체 벡터 pJM17(그라함 박사가 제공, 맥마스터 대학, 온타리오, 캐나다)와 함께 패키징 세포주인 293 세포에 인산칼슘 방법으로 형질전환시켰다. 이 때 형질전환(transfection)은 24-웰 플레이트를 사용하여 수행하였고 그 결과 9개의 웰에서 바이러스에 의한 플라크(#1 - #9)가 생성됨을 확인하였다.

본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터를 이용하여 제조된 아데노바이러스 클론이 p53 단백질을 생산하고, 이에 의해 세포가 사멸(cytopathic)됨으로써 본 발명의 발현 벡터가 항암 유전자 요법에 사용될 수 있음을 알아보기 위하여, 각 아데노바이러스 클론에 대하여 세포에 감염된 경우에 활성이 있는 p53 단백질을 발현하는가 그리고 바이러스 클론에 증식성 재조합 변이 바이러스(replication competent recombinant virus, RCV)가 오염되어 있는가를 조사하였다.

구체적으로, p53 단백질의 활성은 세포내(endogenous) p53 유전자에 이상이 있어 p53 단백질이 발현되지 않는 난소암 세포주 SKOV3 에 상기 바이러스 클론을 감염시켜 p21WAF1/CIP1 단백질이 유도되는 것으로 확인할 수 있다. #5 아데노바이러스 클론을 제외한 모든 바이러스에서 감염된지 48시간 이내에 p21WAF1/CIP1 단백질이 발현됨을 확인하였다. 흥미롭게도 #5 아데노바이러스 클론은 p53 단백질을 다량으로 발현하지만 p21WAF1/CIP1 단백질의 발현은 유도하지 않았다 (도 2 참조).

또한, 상기에서 얻은 아데노바이러스를 HeLa 세포에서 증폭시켜 RCV 가 생성되는지를 확인하였다. 그의 상세한 방법은 실시예 3에서 나타냈다. RCV 가 없는 #8 아데노바이러스 클론(이하 " Avp53 " 라고 약칭함) 및 RCV 가 있는 #5 아데노바이러스 클론을 10개의 150mm 디쉬에서 자란 293 세포를 이용하여 증식시키고 세슘크로라이드 농도구배를 이용하여 2번 원심분리한 다음 10% 글리세롤, 1mM 마그네슘 크로라이드가 포함된 인산완충용액(PBS)으로 투석시켜 유전자 요법에 사용할 아데노바이러스 클론을 제조하였다.

상기 바이러스 클론에 존재하는 p53 유전자의 전체 염기 서열을 분석하고, 이에 히데유키(일본 구마모토 대학)가 개발한 효모 색 분석(yeast color assay) 방법을 수행한 결과 상기에서 얻은 아데노바이러스 클론에 포함되는 p53 유전자는 야생형인 것으로 확인하고, 본 아데노바이러스 클론의 타이터는 상기 293 세포의 플라크 수를 측정하여 결정하였다.

<실시예 3> 증식성 재조합 변이 바이러스의 분석

실시예 2에서 얻은 아데노바이러스 클론에 존재할 수 있는 증식성 재조합 변이 바이러스(RCV)를 분석하기 위하여, RCV 는 293 세포내에 존재하는 아데노바이러스 유전자와 아데노바이러스 발현 벡터의 유전자 중복 부위가 재조합(recombination)에 의해 E1A 유전자 서열이 아데노바이러스 발현 벡터에 삽입되어 발생한다는 사실을 기초로 하여 다음과 같이 조사하였다.

구체적으로 아데노바이러스 클론에서 분리한 DNA 에 아데노바이러스 타입 5 의 E1A 유전자 부위 및 E1B 유전자 부위가 존재하는가를 확인하기 위하여, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기 서열을 갖는 한 쌍의 E1A 시발체 (서열표 1 및 서열표 2 참조) 그리고 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기 서열을 갖는 한 쌍의 E1B 시발체(서열표 3 및 서열표 4 참조)를 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 이 때 아데노바이러스 DNA 는 프로티나제 K(proteinase K, 2mg/ml)를 0.5% SDS 존재하에 처리한 다음 페놀 추출 및 에탄올 침전 등을 수행하여 분리하였다. 상기 E1A 시발체 및 E1B 시발체를 이용한 중합효소 연쇄반응을 통해 주형으로 사용한 바이러스 DNA 에 존재하는 E1 유전자 부위를 각각 752bp 및 1818bp 크기의 DNA 절편으로 아가로스 겔 상에서 확인하였다 (도 3 참조). 대조군으로 E1 유전자 부위에 해당하지 않는 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기 서열을 갖는 아데노바이러스 시발체(서열표 5 및 서열표 6 참조)로 중합효소 연쇄반응을 수행하면 E1 유전자의 유무에 상관없는 861bp 크기의 DNA 절편을 확인할 수 있다.

또한, RCV 의 수 및 세포에서 잠재하는 바이러스 증식을 더욱 민감하게 찾아내기 위하여 짱 등의 방법을 약간 변형하여 사용하였다. 증식하지 않는 다수의 바이러스에서 소수의 RCV 를 증폭시키기 위하여 HeLa 세포를 사용하여 바이러스를 3번 계대 배양하였다. 구체적으로 HeLa 세포를 바이러스 클론으로 감염시키고 48시간이 경과한 다음 얼리고 녹이는 과정을 통해 이를 파쇄시켜 그 파쇄액의 상층액을 얻고 이를 다시 새로운 HeLa 세포에 가하여 배양하는 과정을 반복하였다. 중합효소 연쇄반응을 수행하는데 필요한 바이러스 DNA 를 얻기 위하여 계대 배양한 세포에서 맑은 세포 파쇄액을 얻어 프로티나제 K 를 처리한 다음 페놀 추출 및 에탄올 침전을 수행하였다. 이 때 얻은 DNA 펠렛을 증류수에 녹여 상기와 같이 E1A 시발체를 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행하였다 (도 4 참조).

그 결과, 본 발명에서 선별한 아데노바이러스 클론 Avp 53 는 HeLa 세포주에서 계대 배양했을 때 적절한 숙주가 아니므로 증식하지 않아 752bp 및 1818bp에 해당하는 DNA 절편이 발견되지 않았다. 그러나 #5 아데노바이러스 클론은 HeLa 세포주에서도 증식하므로 RCV 가 혼합되어 있음을 알 수 있었다.

<실시예 4> 각종 세포주의 배양

본 발명의 아데노바이러스 클론이 암 세포에 작용하여 항암 효과를 나타내는지 조사하기 위하여, 세포내 p53 유전자의 상태가 각기 다른 난소암 세포주 SKOV3, 2774 및 PA-1, 자궁경부암 세포주 HeLa 및 HT-3 그리고 인간 정상피부 피브로브라스트 세포(normal human skin fibroblast primary cells, NHF) 등을 10% 소태아 혈청을 포함하는 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 배양하여 사용하였다. 이 때 피브로브라스트 세포는 삼성 생명과학연구소에서 펀치-생검을 통해 얻고 나머지 세포주들은 ATCC 사에서 구입하였다.

이 때 SKOV3 세포는 넌센스 돌연변이(nonsense mutation) 및 염색체 재배열(rearrangement) 등에 의해 p53 단백질이 생산되지 않고, HT-3 및 2774 세포는 변이 p53 유전자를 가지고 있으며, PA-1 및 HeLa 세포는 야생형 p53 유전자를 가지고 있으나 HeLa 세포에서 발현된 p53 단백질은 세포내의 E6 단백질과 반응하여 빨리 분해되는 특성이 있다.

<실시예 5> 아데노바이러스 Avp 53 의 항암 효과

본 발명의 아데노바이러스 클론을 항암 유전자 요법에 효과적으로 사용할 수 있는지 확인하기 위하여, 실시예 4 에 나열한 각 암 세포주에 아데노바이러스 클론 Avp 53 을 처리하여 이로부터 발현된 야생형 p53 단백질이 암의 진행에 미치는 영향을 조사하였다.

본 발명의 아데노바이러스 Avp 53 의 감염이 세포 성장에 미치는 효과는 MTT 색소 분석 (colorimetric assay)으로 측정하였다. 대략 3 ×10³개의 세포를 96-웰 플레이트상의 각 웰에 심어 30시간 동안 배양한 다음 아데노바이러스 Avp 53 또는 AdRSVβGal 을 20 - 80 pfu/세포의 농도로 처리하였다. 다음 매 24시간 마다 5mg/ml 농도의 MTT(시그마사 제품)가 50μl 포함된 인산완충용액으로 배지를 바꾸고 웰 플레이트를 37℃에서 방치하였다. 4시간이 경과한 다음 MTT 를 제거하고 MTT-포르마잔 결정을 50μl DMSO 에 녹인 용액을 가하여 540nm 에서의 흡광도를 각 시간대별로 나누어 측정하였다. 이 때 대조군으로 650nm 에서의 흡광도를 측정하여 참조하였다 (도 5 참조).

그 결과, 2774, PA-1, HeLa, HT-3 세포에서 세포수가 감소되는 현상을 SKOV3 세포에서 세포 성장이 억제되는 현상을 측정하였고 정상 피브로브라스트 세포는 거의 영향을 받지 않음을 확인하였다. 또한 아데노바이러스 Avp 53 을 낮은 농도로 가하면 세포 사멸(cytopathy)이 천천히 진행되어 세포의 성장이 억제되고, 높은 농도로 가하면 SKOV3 세포(160 pfu/ 세포)에서도 세포수가 감소되는 사멸 현상이 나타남을 확인한다. 따라서, 본 발명의 아데노바이러스 Avp 53 은 거의 모든 암 세포주에서 세포를 사멸시키고 세포 성장을 억제하는 효과를 나타냈다.

또한 각 세포가 아데노바이러스에 의해 감염된 정도가 비슷함을 확인하기 위하여, 각 세포주를 아데노바이러스 AdRSVβGal 으로 감염시킨 다음 β-갈락토시다제 활성을 o-니트로페닐-β-갈락토피라노시드 (o-nitrophenyl-β-galactopyrano side)를 사용하여 측정하였다. 그 결과, 각 세포가 사멸되는 효과에 차이가 나는 것은 감염 정도의 차이가 아님을 알 수 있었고, PA-1 세포의 경우는 아데노바이러스 AdRSVβGal 의 감염에 의해 영향을 받으므로 세포 사멸가 전적으로 아데노바이러스 Avp 53 의 감염에 의한 것으로 보이지 않는다.

<실시예 6> 아데노바이러스 Avp 53 에 의해 발현된 p53 단백질의 면역조직화학 분석

아데노바이러스 Avp 53 으로 감염된 세포에서 발현된 p53 단백질을 면역조직화학적으로 분석하기 위하여, 각종 세포주를 4-체임버 슬라이드(Nunc 사 제품)에 배양하여 아데노바이러스 Avp 53 을 처리(20 또는 80 pfu/세포)한 다음 메탄올로 고정시켰다. 각 체임버는 3% 과산화수소수에 20분 동안 방치한 다음 항-인간 p53 마우스 항체(Zymed 사, 샌프랜시스코, USA)로 처리하였다. 면역 염색은 LSABR 키트 및 알칼라인 포스파타제 K682(DAKO사, 캘리포니아, USA)를 이용하여 제조자의 방법에 따라 수행되었다.

<실시예 7> 세포 아폽토시스 분석

아데노바이러스 Avp 53 으로 감염된 세포에서 유발되는 아폽토시스를 조사하기 위하여, 4-체임버 슬라이드에서 세포를 배양하여 80 pfu/세포 농도의 아데노바이러스 Avp 53 또는 AdRSVβGal 으로 처리한 다음 4% 포르말린으로 고정하였다. 아폽토시스에 의해 유발되는 뉴클레오좀 DNA 의 파괴를 세포 조직화학적으로 Apop Tag 아폽토시스 탐지 키트(Oncor사 제품)를 사용하여 제조자의 방법에 따라 분석하였다. 구체적으로 아데노바이러스 Avp 53 또는 AdRSVβGal을 세포에 2일 동안 처리하여 아폽토시스의 세포 마커인 뉴클레오좀 사이의 조각화(internucleosomal fragmentation)에 의해 성성된 유리 3'-OH 기를 말단 디옥시뉴클레오타이드 전이효소(terminal deoxynucleotide transferase) 및 딕옥시제닌-표지 뉴클레오타이드(digoxigenin-labelled nucleotide)를 이용하여 표지하였다.

그 결과, 아폽토시스가 유발되는 대표적인 세포주 2774 및 PA-1 세포주가 아데노바이러스 Avp 53 의 감염에 의해 DNA 가 조각화되어 상기 염색에 양성으로 반응함을 확인하였다. 구체적으로 2774 세포는 0.2% 에서 5-10% 로, PA-1 세포는 1% 에서 10- 20% 로 양성으로 반응하는 세포의 수가 증가됨을 확인하였다. 또한 크로마틴이 응축되고(condensation) 응축 염색체가 핵막 주위에 위치하며 핵이 조각화됨을 투사 전자현미경으로 관찰할 수 있었고 막이 수포화(membrane blebbing)됨도 광학현미경으로 잘 관찰할 수 있다 (도 6 및 도 7 참조).

<실시예 8> 투과 전자현미경 관찰

본 발명의 아데노바이러스 Avp 53 으로 감염된 세포를 투과 전자현미경으로 관찰하기 위하여, 본 발명에 사용한 암세포를 보통의 방법으로 트립신을 처리하여 현탁시켰다. 트립신을 처리한 세포는 3% 글루타알데히드를 사용하여 1시간 동안 고정시키고, 2% 오스미움 테트라옥사이드에 다시 고정하여 에틸 알콜의 농도를 증가시키면서 탈수시켰다. 상기에서 처리한 세포 시료는 프로필렌 옥사이드를 15분 동안 두 번 처리하고 프로필렌 옥사이드 및 에폭시 레진의 1 : 1 혼합용액에 밤새도록 담궈두었다. 다음 시료를 50nm 두께로 자르고 우라실 아세테이트 및 시트르산 납으로 염색하여 히타치 7100 투과 전자현미경으로 관찰하였다 (도 8 참조).

<실시예 9> 면역블럿팅 분석

본 발명의 아데노바이러스 클론으로 형질전환된 세포주에서 p53 단백질, p21WAF1/CIP1 단백질 및 pRb 단백질의 발현을 조사하기 위하여, 면역블럿팅을 수행하였다. 20 pfu/세포 농도의 아데노바이러스 Avp 53 또는 AdRSVβGal을 처리한 세포를 RIPA 완충용액[50mM 트리스-염산(pH8.0), 150mM 염화나트륨, 1% NP40, 0.1% SDS, 10mM 소듐데옥시콜레이트]으로 파쇄하였다. 10μg 세포내 단백질을 12% (p53 단백질 및 p21WAF1/CIP1 단백질의 경우) 또는 6% (pRb 단백질의 경우) SDS-폴리아크릴아미드 전기영동을 수행하여 분리하고 이를 Hybond-ECL 나이트로셀룰로스 필터 종이(에머샴 사)에 이동시켰다. 상기 필터는 125mM 염화나트륨, 0.1% 트윈20 및 5% 분유가 포함된 25mM 트리스-염산으로 블록킹하였다. 단백질은 항-p53 항체(BP-1; 노보캐스트라, UK), 항-p21WAF1/CIP1 다클론항체(파마젠사) 또는 항-pRb 항체(G3-245; 파마젠사)로 탐지하고 호스래디쉬 퍼옥시다제 결합 항-마우스 또는 항 -토끼 항체(에머샴사)를 사용하여 표지하였다. 단백질 밴드는 ECL 키트(에머샴사)를 사용하여 증가된 화학발광(enhanced chemoluminescence)에 의하여 확인하였다 (도 9, 도 10 및 도 11 참조).

<실시예 10> 역전사효소-중합효소 연쇄반응으로 E1B 단백질의 발현 확인

본 발명의 아데노바이러스 클론으로 형질전환된 각 세포주에서 E1B 단백질의 발현을 확인하기 위하여, 역전사효소-중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 5 ×10⁵개의 세포에 아데노바이러스 Avp 53(80 pfu/ 세포)을 감염시켜 36시간이 경과한 다음 이를 모았다. 이 때 세포는 전혀 죽지 않은 상태이며 이로부터 전체 세포 RNA 를 TRIZol 반응용액(GIBCO사)으로 분리하였다. 다음 0.6μg RNA 를 9mM 염화망간, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기 서열을 갖는 E1B 시발체 또는 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기 서열을 갖는 인간 글리세알데히드-3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) 시발체와 함께 가하여 Tth DNA 중합효소(베링거 맨하임사)를 이용한 역전사효소 반응(20μl)을 수행하였다. 30분 동안 역전사반응을 수행한 다음 7.5mM EGTA 및 중합효소 연쇄반응 완충용액을 제조자의 방법에 따라 첨가하고 중합효소 연쇄반응을 35 사이클 동안 95℃, 55℃ 및 75℃에서 각각 1분 동안 수행하였다. 그 결과, E1B 시발체 또는 GAPDH 시발체를 이용하여 각각 562bp 또는 201bp DNA 절편이 생산되었다 (도 12 참조).

본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터 및 이로부터 얻은 바이러스 클론 Avp 53 은 암세포를 사멸시키거나 성장을 억제시키는데 탁월한 효과를 나타냄을 확인할 수 있다. 또한 상기 아데노바이러스 클론은 다양한 중합효소 연쇄반응 등을 수행한 결과 증식성 변이 바이러스를 전혀 만들어내지 않으므로 인체에 직접 사용하는 것이 용이하여 앞으로 암환자에게 직접 사용되는 항암 유전자 요법으로 기대가 매우 크다.

본 발명의 아데노바이러스 Avp 53 는 지금까지 연구된 p53 유전자를 포함하는 아데노바이러스에 비하여 아데노바이러스의 게놈 DNA 부위를 적게 포함하고 있어 동일 재조합이 일어날 확률이 적어지므로 증식성 변이 바이러스(RCV)를 거의 만들지 않으며 그 결과 항암 유전자 요법에 사용하는 경우 매우 우수한 안전성을 나타내게 된다.

또한, 본 발명자들이 개발한 아데노바이러스 클론은 NIH 허가 등을 얻어 수입되어야 하는 번거러움이 없이 본 의료원의 임상 연구 심사만을 거치면 항암 유전자 요법을 임상적으로 실험할 수 있어 향후 새로운 암의 치료 방법으로 사용이 매우 기대된다.

〔서 열 목 록〕

서열번호 : 1

서열의 길이 : 20

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산(올리고 뉴클레오타이드)

[서열표 1]

AGCTGATCGA AGAGGTACTG

〔서 열 목 록〕

서열번호 : 2

서열의 길이 : 19

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산(올리고 뉴클레오타이드)

[서열표 2]

GAGTCACAGC TATCCGTAC

〔서 열 목 록〕

서열번호 : 3

서열의 길이 : 22

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산(올리고 뉴클레오타이드)

[서열표 3]

GGTTACATCT GACCTCATGG AG

〔서 열 목 록〕

서열번호 : 4

서열의 길이 : 22

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산(올리고 뉴클레오타이드)

[서열표 4]

CAGTACCTCA ATCTGTATCT TC

〔서 열 목 록〕

서열번호 : 5

서열의 길이 : 20

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산(올리고 뉴클레오타이드)

[서열표 5]

TCGTTTCTCA GCAGCTGTTG

〔서 열 목 록〕

서열번호 : 6

서열의 길이 : 20

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산(올리고 뉴클레오타이드)

[서열표 6]

CATCTGAACT CAAAGCGTGG

〔서 열 목 록〕

서열번호 : 7

서열의 길이 : 19

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산(올리고 뉴클레오타이드)

[서열표 7]

GTGGATATTG TTGCCATCA

〔서 열 목 록〕

서열번호 : 8

서열의 길이 : 18

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산(올리고 뉴클레오타이드)

[서열표 8]

GACTCCACGA CGTACTCA

Claims (8)

1. p53 단백질이 사이토메갈로바이러스의 최전 프로모터 및 시미언바이러스 40의 후 아데닌다중화 신호로 구성되는 발현 카세트를 이용하여 생산되는 아데노바이러스 발현 벡터 p△ACMV-p53.
2. 증식성 변이 바이러스가 포함되지 않은 아데노바이러스 클론 Avp 53 (수탁번호 : KCTC 0292 BP).
3. 아데노바이러스 발현 벡터p△ACMV-p53를 아데노바이러스 모체 벡터와 함께 패키징 세포에 감염시켜 얻은 아데노바이러스 클론 중 증식성 변이 바이러스를 생산하지 않는 클론을 선별하는 제 3항의 아데노바이러스 클론의 제조방법.
4. 제 3항에 있어서, 서열번호 1 및 서열번호 2 의 염기 서열을 갖는 E1 유전자 부위의 E1A 시발체를 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행하여 선별하는 제 3항의 아데노바이러스 클론의 제조방법.
5. 제 3항에 있어서, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기 서열을 갖는 E1 유전자 부위의 E1B 시발체를 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행하여 선별하는 제 3항의 아데노바이러스 클론의 제조방법.
6. 제 2항의 아데노바이러스 클론을 암을 치료하는데 사용하는 용도.
7. 제 6항에 있어서, 암은 난소암인 것을 특징으로 하는 용도.
8. 제 6항에 있어서, 암은 자궁암인 것을 특징으로 하는 용도.

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