JP2002506651A - 多重遺伝子ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、遺伝子療法における特定の遺伝子組合せの使用に関する。複数の遺伝子を標的細胞に同時に送達することにより、一方または両方の遺伝子の作用は増大する。これは、過形成または新生物組織を作る細胞などの疾病細胞の攻撃に特に効果的である。組合せて使用され得るクラスの遺伝子は、腫瘍サプレッサー、サイトカインおよびリンホカイン、毒素、アポトーシスの誘導物質、アンチセンス発癌遺伝子、単鎖抗体、リボザイム、転写因子および調節因子、細胞周期調節因子および酵素である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） 本出願は、１９９８年３月１６日に提出された米国仮出願番号第６０／０７８
，２０５号の内容の優先権を主張し、引用することにより特に本明細書の一部を
なすものとする。各上記関連開示の全本文を、特許権を一部放棄することなく、
本明細書に引用することにより特に本明細書の一部をなすものとするものである
。

【０００２】 （１．技術分野） 本発明は、一般に、遺伝子移行および遺伝子療法の分野に関する。より具体的
には、それは、インビトロまたはインビボで標的細胞に特定の組合せの遺伝子を
送達する、ウイルスベクター、特にアデノウイルスベクターの開発に関する。

【０００３】 （２．関連技術の記載） 遺伝子の置換または補強は、今では、様々な疾病の治療介入における、特に癌
における強力な手段と考えられている。遺伝子療法による疾病および疾患の治療
的処置は、細胞への新規な遺伝情報の移行並びに安定または一過性の挿入を含む
。所望の機能をコードする正常な対立遺伝子の再導入による遺伝子欠陥の修正は
、この概念が臨床的に可能であることを実証した（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９
９０））。実際、広範囲の遺伝子疾患を網羅する前臨床および臨床試験が、遺伝
子移行効率、遺伝子発現の調節、およびウイルスベクター使用のあり得る危険性
を扱う基本的な問題を解決するために現在実施されている。ウイルスベクターを
使用する大半の臨床的遺伝子移行試験は、生体外で標的細胞への遺伝子移行を実
施し、その後インビボに投与する。ウイルスベクターはインビボで投与してもよ
いが、反復投与により中和抗体が誘導されることがある。

【０００４】 遺伝子移行の媒介を試みた様々なウイルスベクターの中で、レトロウイルスお
よびアデノウイルスを基本としたベクター系が広範に調査されている。近年、ア
デノ随伴ウイルス（adeno-associated virus: ＡＡＶ）が、より一般的に使用さ
れているレトロウイルスおよびアデノウイルスベクターへの可能な代替物として
出現した（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、１９９２；Ｃａｒｔｅｒ、１９９２；Ｆｌｏｔｔ
ｅおよびＣａｒｔｅｒ、１９９５；Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、１９９５；Ｃｈａ
ｔｔｅｒｊｅｅおよびＷｏｎｇ、１９９６）。レトロウイルスおよびアデノウイ
ルス媒介遺伝子移行の研究は、前者のあり得る発癌特性および後者に関連した免
疫原性問題に関する懸念を生じるが、ＡＡＶは、全くかかる病理徴候には関連し
ていない（ＢｅｒｎｓおよびＢｏｈｅｎｚｋｙ、１９８７；ＢｅｒｎｓおよびＧ
ｉｒａｕｄ、１９９６）。しかし、ＡＡＶゲノムの一本鎖性は、形質導入効率に
有意に影響を及ぼす。なぜなら二本鎖ウイルスＤＮＡ合成が律速段階であるから
である。それにも関わらず、これらのベクターは、遺伝子療法適用に広範に使用
され続けている。

【０００５】 それ故、遺伝子移行療法において、できるだけ少量であるが、多くの細胞をで
きるだけ速く効果的に殺滅するウイルスベクターを使用することが重要である。
これは、遺伝子療法と、他の伝統的な療法並びに他の遺伝子療法との組合せを使
用して達成できる。追加の遺伝子療法は、各治療構築体(construct)について別 々のベクターの使用を必要とし、これは、上記した免疫原性、発癌性および最小
形質導入効率を含む様々な問題を提示する。さらに、別々の送達ベクターの使用
により、同標的細胞における両方の遺伝子の一貫した再現性のある発現は得られ
ない。

【０００６】 ２つ以上の治療遺伝子を標的細胞に同時送達可能なベクター系を開発すること
は有用であろう。一旦かかるベクター系が解明されれば、例えば過増殖疾患にお
ける、遺伝子を基にした治療介入の効率および有効性を増加させることが可能で
あろう。

【０００７】 （発明の要約） それ故、本発明は、遺伝子療法における特定の遺伝子の組合せの使用に関する
。複数の遺伝子を標的細胞に同時に送達することにより、一方または両方の遺伝
子の作用は増大する。これは、過形成または新生物組織を作る細胞などの疾病細
胞の攻撃に特に効果的である。かかる同時送達を達成する方法および組成物は、
本明細書で詳細に下記する。

【０００８】 好ましい実施形態において、本発明は、腫瘍サプレッサーおよびサイトカイン
、腫瘍サプレッサーおよび酵素、腫瘍サプレッサーおよびアンチセンス発癌遺伝
子、腫瘍サプレッサーおよび毒素、サイトカインおよび毒素、サイトカインおよ
びアンチセンス発癌遺伝子、アンチセンス発癌遺伝子、毒素および酵素および毒
素、腫瘍サプレッサーおよびアポトーシスの誘導物質、サイトカインおよびアポ
トーシスの誘導物質、アンチセンス発癌遺伝子およびアポトーシスの誘導物質、
酵素およびアポトーシスの誘導物質、および毒素およびアポトーシスの誘導物質
からなる群から選択された少なくとも２つの異なる遺伝子、および異なる遺伝子
の５'に位置する真核細胞で活性な第一プロモーターを含む発現構築体(expressi on construct)を提供する。

【０００９】 別の実施形態において、発現構築体は、さらに、内部リボソーム侵入部位（Ｉ
ＲＥＳ）を含み得、ここで、ＩＲＥＳは、上流遺伝子の３'および下流遺伝子の ５'に位置する。別の実施形態において、発現構築体は、さらに、第二プロモー ターを含み得、ここで、第二プロモーターは、上流遺伝子の３'および下流遺伝 子の５'に位置する。特に好ましい実施形態において、発現構築体は、腫瘍サプ レッサーおよびサイトカインを含む。別の好ましい実施形態において、発現構築
体は、腫瘍サプレッサーおよび酵素を含む。さらに別の好ましい実施形態におい
て、発現構築体は、腫瘍サプレッサーおよびアンチセンス発癌遺伝子を含む。さ
らに別の代代替の実施形態において、発現構築体は、腫瘍サプレッサーおよび毒
素を含む。別の実施形態において、発現構築体は、サイトカインおよび毒素を含
む。さらに別の実施形態において、発現構築体は、サイトカインおよびアンチセ
ンス発癌遺伝子を含む。さらに別の実施形態において、発現構築体は、アンチセ
ンス発癌遺伝子および毒素を含む。別の代替物は、酵素および毒素を含む発現構
築体を提供する。また、腫瘍サプレッサーおよびアポトーシスの誘導物質を含む
発現構築体が好ましい。さらに別の好ましい実施形態において、サイトカインお
よびアポトーシスの誘導物質を含む発現構築体が提供される。さらに別の代替物
において、発現構築体は、アンチセンス発癌遺伝子およびアポトーシスの誘導物
質を含む。また、酵素およびアポトーシスの誘導物質を含む発現構築体も考えら
れる。さらに別の実施形態において、発現構築体は、毒素およびアポトーシスの
誘導物質を含む。

【００１０】 発現構築体の一部として腫瘍サプレッサーを使用する実施形態において、腫瘍
サプレッサーは、当業者には公知の任意の腫瘍サプレッサーであり得る。特に好
ましい実施形態において、腫瘍サプレッサーは、ｐ５３、ｐ１６、ｐ２１、Ｒｂ
、ｐ１５、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｚａｃ１、ｐ７３、ＭＭＡＣ１、ＡＴＭ、
ＨＩＣ−１、ＤＰＣ−４、ＦＨＩＴ、ＮＦ２、ＡＰＣ、ＤＣＣ、ＩＮＧ１、ＮＯ
ＥＹ１、ＮＯＥＹ２、ＰＭＬ、ＯＶＣＡ１、ＭＡＤＲ２、ＷＴ１、ＰＴＥＮ、５
３ＢＰ２、ＩＲＦ−１およびＣ−ＣＡＭからなる群から選択され得る。

【００１１】 発現構築体の一部としてサイトカインを使用する実施形態において、サイトカ
インは当業者に公知の任意のサイトカインであり得る。特に好ましい実施形態に
おいて、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６
、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ
−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、β−イ
ンターフェロンおよびγ−インターフェロンからなる群から選択され得る。

【００１２】 同様に、発現構築体の一部として酵素を使用する実施形態は、シトシンデアミ
ナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルト
ランスフェラーゼ、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、フ
ェニルアラニンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、コラゲナーゼ、ス
フィンゴミエリナーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ、ＨＳＶチミジンキナーゼおよびヒトチミジンキナーゼからなる群
から選択される酵素を使用し得る。

【００１３】 特定の実施形態は、発現構築体の一部として発癌遺伝子を使用し、当業者に公
知の任意の発癌遺伝子をここで使用し得る。特に好ましい実施形態において、発
癌遺伝子は、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｓｒｃ、ｆｍｓ、ｊｕ ｎ 、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｈｓｔ、ｇｓｐ、ｂｃｌ−２およびａｂｌからなる群から
選択され得る。特定の実施形態において、発現構築体は、毒素を含み得、特に好
ましい実施形態において、毒素は、リシンＡ鎖、ジフテリア毒素、百日咳毒素、
シュードモナス毒素、Ｅ．コリエンテロトキシン、およびコレラ毒素からなる群
から選択され得る。アポトーシスの誘導物質を使用する実施形態において、特に
好ましいアポトーシスの誘導物質は、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ−Ｘ_s、Ｂｉｋ、 Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｈａｒａｋｉｒｉ、ＴＲＡＩＬ、ＳＡＲＰ−２、ＡｄＥ１ｂお
よびＩＣＥ−ＣＥＤ３プロテアーゼからなる群から選択され得る。特に好ましい
遺伝子組合せの例は、本明細書の下記の表１に列挙する。勿論、これらは単に例
示的な組合せであり、本発明の教義を与えれば、当業者は、２、３、４、５また
はそれ以上の遺伝子または核酸構築体の組合せを含むがこれに限定されない、任
意の考え得る組合せの多重遺伝子構築体を製造できるだろう。「核酸構築体」に
より、本発明は、特定の遺伝子の限定部分または全体をコードできる核酸を意味
する。

【００１４】 特に好ましい実施形態において、本発明に使用されるプロモーターは、ＣＭＶ
ＩＥ、ＳＶ４０ ＩＥ、ＲＳＶ、ヒトユビキチンＣ、β−アクチン、テトラサ
イクリン調節物およびエクジソン調節物からなる群から選択され得る。これらの
プロモーターは、独立して、第一プロモーターとして、または第二または置換プ
ロモーターとして使用され得る。

【００１５】 本発明の特定の態様において、発現構築体は、さらに、下流遺伝子の３'に位 置するポリアデニル化シグナルを含み得る。特に好ましい実施形態において、発
現構築体は、上流遺伝子の３'および下流遺伝子の５'に位置する第一ポリアデニ
ル化シグナルおよび下流遺伝子の３'に位置する第二ポリアデニル化シグナルを 含み得る。特に好ましい実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ＢＧＨ
、チミジンキナーゼまたはＳＶ４０由来であり得る。より限定された実施形態に
おいて、第一ポリアデニル化シグナルはＢＧＨまたはＳＶ４０由来であり、第二
ポリアデニル化シグナルは、第一ポリアデニル化シグナルがＳＶ４０由来である
場合、ＢＧＨ由来であり、第二ポリアデニル化シグナルは、第一ポリアデニル化
シグナルがＢＧＨ由来である場合、ＳＶ４０由来であると考えられる。

【００１６】 本発明の別の態様において、発現構築体は、ウイルスベクターであり得る。好
ましい実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイル
ス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルスからなる
群から選択され得る。

【００１７】 アデノウイルスベクターを使用する実施形態において、アデノウイルスベクタ
ーは複製欠損であると考えられる。特に好ましい態様において、アデノウイルス
ベクターは、Ｅ１領域の少なくとも一部を欠失している。別の特に好ましい態様
において、アデノウイルスは、Ｅ１Ｂ領域の少なくとも一部を欠失している。別
の実施形態において、アデノウイルスは全Ｅ１領域を欠失している。

【００１８】 また本発明により考えられるものは、サイトカイン遺伝子および酵素遺伝子、
および遺伝子の５'に位置する真核細胞で活性な第一プロモーターを含む発現構 築体であり、ここで、（ｉ）サイトカイン遺伝子はＩＬ−２遺伝子ではないか、
または（ｉｉ）酵素はヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子ではない。

【００１９】 さらに、本発明は、腫瘍サプレッサーおよびサイトカイン、腫瘍サプレッサー
および酵素、腫瘍サプレッサーおよびアンチセンス発癌遺伝子、腫瘍サプレッサ
ーおよび毒素、サイトカインおよび毒素、サイトカインおよびアンチセンス発癌
遺伝子、アンチセンス発癌遺伝子、毒素および酵素および毒素、腫瘍サプレッサ
ーおよびアポトーシスの誘導物質、サイトカインおよびアポトーシスの誘導物質
、アンチセンス発癌遺伝子およびアポトーシスの誘導物質、酵素およびアポトー
シスの誘導物質、毒素およびアポトーシスの誘導物質からなる群から選択された
少なくとも２つの異なる遺伝子、および異なる遺伝子の５'に位置する真核細胞 で活性な第一プロモーターを含む発現構築体を提供し、および発現構築体を該細
胞に移行し、よって該遺伝子の発現を行うことを含む、細胞において２つのポリ
ペプチドを同時発現する方法を提供する。

【００２０】 特に好ましい実施形態において、発現構築体はウイルスベクターであり、移行
はウイルス感染により達成される。別の実施形態において、発現構築体は、リポ
ソームで製剤化され、移行はリポソームの細胞取り込みにより達成される。特定
の実施形態において、細胞は腫瘍細胞であり、細胞は異なる遺伝子の発現により
殺滅される。より特定の実施形態において、腫瘍細胞は、前立腺癌細胞、肺癌細
胞、脳癌細胞、皮膚癌細胞、肝臓癌細胞、乳癌細胞、リンパ癌細胞、胃癌細胞、
精巣癌細胞、卵巣癌細胞、膵臓癌細胞、骨癌細胞、骨髄癌細胞、頭頸癌細胞、子
宮頸癌細胞、結腸癌細胞、直腸癌細胞、血液癌細胞、食道癌細胞、眼癌細胞、胆
嚢癌細胞、腎臓癌細胞、副腎癌細胞および心臓癌細胞からなる群から選択される
。

【００２１】 本発明の別の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかである。
しかし、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示して
いるが、例示のためだけに与えられることを理解されたい。なぜなら、本発明の
精神および範囲内での様々な変更および修飾がこの詳細な説明から当業者には明
らかであるからである。

【００２２】 （例示的実施形態の説明） （１．本発明） 遺伝子療法は、現在、特に癌処置の領域において、様々な従来の療法の存続可
能な代替物となりつつある。導入遺伝子の長期発現、およびベクター産物の発現
による標的細胞の免疫破壊などの制限は、遺伝子療法の実行を制限すると言われ
てきたが、癌細胞の破壊を望む癌療法においては懸念ではない。

【００２３】 遺伝子移行療法、特に癌処置を含む療法においては、多くの細胞をできるだけ
速く死滅させることが重要である。従って、「組合せ」療法の使用が好ましくあ
り得る。かかる組合せは、遺伝子療法および放射線療法または化学療法を含み得
る。Ｒｏｔｈら（１９９６）は、ＤＮＡ傷害剤とｐ５３遺伝子療法の組合せによ
り、インビボで腫瘍細胞の殺滅の増加が得られることを実証した。

【００２４】 さらに別の型の組合せ療法は、多重遺伝子療法の使用を含む。この状況では、
１つ以上の治療遺伝子を、標的細胞に移行する。該遺伝子は、同一の官能基（例
えば、両方共腫瘍サプレッサー、両方共サイトカイン、ら）または異なる官能基
（例えば、腫瘍サプレッサーとサイトカイン）でもよい。標的細胞に特定の組合
せの治療遺伝子を提示することにより、一方または両方の遺伝子の、標的細胞の
生理機能に対する全体的な効果を増大させることが可能であり得る。

【００２５】 本発明は、それ故、独特かつ有利な治療用遺伝子の組合せを、標的細胞の破壊
が特に望ましい場所に提供することを探求する。かかる状態は、過形成および良
性および悪性新形成などの過増殖を含む。この努力で最初の考慮は、遺伝子の組
合せである。第二の考慮は、単一細胞においてどのように両方の治療遺伝子を同
時に発現させるかである。本発明者は、両方の遺伝子を有する単一のウイルスベ
クターの使用により、この第二の問題にアプローチすることを選択した。従って
、ベクターによる細胞の感染は、両方の遺伝子の取り込みおよび発現を確実にす
る。

【００２６】 （ＩＩ．ウイルスベクター） 本明細書で記載した方法および組成物は、多重遺伝子アデノウイルス構築体に
関するが、記載された方法および組成物は、レトロウイルス、ヘルペスウイルス
、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスを含むがこれに限定されない、他の
ウイルスベクターを使用した多重遺伝子構築体の作成にも適用可能であり得る。
下記の議論は、治療組成物におけるその適用に関連したこれらの各ウイルスの特
徴に関する詳細を提供する。

【００２７】 （Ａ．アデノウイルス） インビボ送達に好ましい方法の１つは、アデノウイルス発現ベクターの使用を
含む。「アデノウイルス発現ベクター」は、（ａ）構築体のパッケージングを支
持し、（ｂ）そこでクローン化されたアンチセンスポリヌクレオチド、タンパク
質、ポリヌクレオチド（例えばリボザイム、またはｍＲＮＡ）を発現するに十分
なアデノウイルス配列を含む構築体を含むことを意味する。この内容において、
発現は、遺伝子産物が合成されることを必要としない。

【００２８】 発現ベクターは、遺伝子工学された形のアデノウイルスを含む。３６ｋｂ、直
線状、二本鎖ＤＮＡウイルスという、アデノウイルスの遺伝子構成の知識により
、７ｋｂまでの外来配列を用いた大片のアデノウイルスＤＮＡの置換が可能とな
る（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２）。レトロウイルスとは
対照的に、宿主細胞をアデノウイルスで感染しても、染色体組込みは生じない。
なぜなら、アデノウイルスＤＮＡは、あり得る遺伝毒性を伴わず、エピソーム様
に複製できるからである。本明細書で使用した「遺伝毒性」なる語は、永久的な
遺伝性の宿主細胞の遺伝子変化を意味する。また、アデノウイルスは構造的に安
定であり、正常な誘導体を大量に増殖した後でも、ゲノムの再編成は全く検出さ
れなかった。アデノウイルスは、その細胞周期段階に関係なく実質的に全ての上
皮細胞に感染できる。

【００２９】 アデノウイルスは、そのゲノムサイズが中間であること、操作の簡易さ、高い
力価、広範な標的細胞範囲、および高い感染力から、遺伝子移行ベクターとして
の使用に特に適している。ウイルスゲノムの両端が、ウイルスＤＮＡ複製および
パッケージングに必要なシスエレメントである、１００−２００塩基対の逆方向
反復（ＩＴＲ）を含む。ゲノムの初期（Ｅ）および後期（Ｌ）領域は、ウイルス
ＤＮＡ複製の開始により分けられる異なる転写単位を含む。Ｅ１領域（Ｅ１Ａお
よびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよび数個の細胞性遺伝子の転写の調節に関与
するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現により、
ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質が合成される。これらのタンパク質は、
ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現および宿主細胞遮断に関与する（Ｒｅｎａｎ、１９
９０）。大半のウイルスキャプシドタンパク質を含む後期遺伝子産物は、主要な
後期プロモーター（ＭＬＰ）により出される１つの一時転写物の有意なプロセシ
ング後にのみ発現される。ＭＬＰ（１６．８ｍ．ｕ．に位置）は、感染の後期相
中では特に効率的であり、このプロモーターから出された全てのｍＲＮＡは、５
'−三部分リーダー（ＴＰＬ）配列を有し、これによりこれは翻訳に好ましいｍ ＲＮＡとなる。

【００３０】 Ｅ３領域は、Ａｄ感染細胞の効率的な溶解、並びに、ＴＮＦ媒介細胞溶解およ
び感染細胞のＣＴＬ媒介溶解の予防に必要であるように思われるタンパク質をコ
ードする。一般に、Ｅ４領域は、７つのタンパク質をコードすると信じられてお
り、そのいくつかはＥ２プロモーターを活性化する。宿主ｍＲＮＡ輸送を遮断し
、ウイルスＲＮＡの細胞質への輸送を増強することが示された。さらに、Ｅ４産
物は、感染の後期に見られる初期遺伝子発現の減少に一部関与する。Ｅ４はまた
、溶解増殖中に、Ｅ１ＡおよびＥ４（しかしＥ１Ｂではない）発現を阻害する。
いくつかのＥ４タンパク質が、効率的なＤＮＡ複製のために必要であるが、この
関与の機序は不明である。Ｅ４はまた、ウイルス後期遺伝子発現の転写後事象、
すなわち、溶解増殖における三部分リーダーの選択的スプライシングにも関与す
る。それにもかかわらず、Ｅ４機能は、ＤＮＡ複製に必ずしも必要ではない。し
かし、その欠失により複製は遅延する。他の機能は、ウイルスＤＮＡ合成の負の
調節、アデノウイルス感染中に通常見られる亜核再構成の誘導、およびウイルス
複製、後期ウイルスｍＲＮＡ蓄積、および宿主細胞遮断に必要な他の機能を含む
。

【００３１】 現在の系では、組換えアデノウイルスは、シャトルベクターないしプロウイル
スベクターの相同的組換えから産生される。２９３細胞におけるプロウイルスベ
クターないしＡｄ配列の可能な組換え、またはｐＪＭ１７プラスミドの場合での
、挿入されたｐＢＲ３２２配列の自発的な欠失により、全長野生型Ａｄ５アデノ
ウイルスが産生され得る。それ故、個々のプラークから単一のウイルスのクロー
ンを単離し、そのゲノム構造を調べることが大変重要である。

【００３２】 複製欠損である、現在のアデノウイルスベクターの産生および増殖は、Ａｄ５
ＤＮＡ断片によりヒト胚腎臓細胞から形質転換された、２９３と称される独特な
ヘルパー細胞系に依存し、Ｅ１タンパク質を構成的に発現する（Ｇｒａｈａｍら
、１９９７）。Ｅ３領域は、アデノウイルスゲノムに不必要であるので（Ｊｏｎ
ｅｓおよびＳｈｅｎｋ、１９７８）、現在のアデノウイルスベクターは、２９３
細胞の助けで、Ｅ１、Ｅ３または両方の領域に外来ＤＮＡを有する（Ｇｒａｈａ
ｍおよびＰｒｅｖｅｃ、１９９１）。自然には、アデノウイルスは、約１０５％
の野生型ゲノムをパッケージングでき（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら、１
９８７）、約２ｋｂ超過したＤＮＡ容量を提供する。Ｅ１およびＥ３領域で置換
可能な約５．５ｋｂのＤＮＡと併せて、現在のアデノウイルスベクターの最大容
量は、７．５ｋｂ以下であるか、または全長ベクターの約１５％である。８０％
以上のアデノウイルスのウイルスゲノムが、ベクター骨格に維持され、ベクター
由来細胞毒性の源である。また、Ｅ１欠失ウイルスの複製欠損は、不完全である
。例えば、ウイルス遺伝子発現の漏出が、高い感染多重度（ＭＯＩ）で現在利用
可能なベクターで観察された（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、１９９３；Ｓｈｅｎｋ、１９
７８）。

【００３３】 ヘルパー細胞系は、ヒト胚腎臓細胞、筋肉細胞、造血細胞または他のヒト胚間
葉または上皮細胞などのヒト細胞から得られ得る。別に、ヘルパー細胞は、ヒト
アデノウイルスに許容的な他の哺乳動物種の細胞から得られ得る。該細胞は、例
えば、Ｖｅｒｏ細胞または他のサル胚間葉または上皮細胞を含む。上記したよう
に、好ましいヘルパー細胞系は２９３である。

【００３４】 Ｒａｃｈｅｒら（１９９５）は、改善された２９３細胞培養法およびアデノウ
イルス増殖法を開示した。１つの型式において、天然細胞凝集物は、個々の細胞
を、１００−２００ｍｌの培地を含む１リットルのシリコン処理スピナフラスコ
（Ｔｅｃｈｎｅ、ケンブリッジ、英国）に接種することにより増殖する。４０ｒ
ｐｍで撹拌した後、細胞生存率を、トリパンブルーで推定する。別の型式におい
て、フィブラ−セルマイクロキャリア（Ｂｉｂｂｙ Ｓｔｅｒｌｉｎ、ストーン
、英国）（５０ｇ／ｌ）を以下の通り使用する。５ｍｌの培地に再度懸濁した細
胞種菌を、２５０ｍｌのエーレンマイヤーフラスコ中のキャリア（５０ｍｌ）に
加え、時々撹拌しながら１−４時間静置した。その後、培地を、５０ｍｌの新し
い培地と交換し、振盪を開始した。ウイルス産生のために、細胞を約８０％の集
密度まで増殖させ、その後、培地を交換し（最終容量の２５％まで）、アデノウ
イルスをＭＯＩ（ｐｆｕ／ｍＬ）０．０５で加えた。培養物を一晩静置し、その
後、容量を１００％まで増加させ、振盪をさらに７２時間開始した。

【００３５】 アデノウイルスベクターは、複製欠陥であるか、または少なくとも協調的に欠
陥であるという要求以外に、アデノウイルスベクターの性質は、本発明の実践の
成功に重大であると信じられていない。アデノウイルスは、４２の異なる既知の
血清型または亜群Ａ−Ｆのいずれかであり得る。亜群Ｃのアデノウイルス５型は
、本発明に使用する協調的に複製欠陥アデノウイルスベクターを得るために好ま
しい出発物質である。これは、アデノウイルス５型は、多くの生化学的、医学的
および遺伝学的情報が既知であるヒトアデノウイルスであり、ベクターとしてア
デノウイルスを使用するほとんどの構築体に歴史的に使用されてきたからである
。

【００３６】 上記したように、本発明に記載の典型的なベクターは、複製欠陥であり、アデ
ノウイルスＥ１領域を有さない。従って、Ｅ１コード配列を除去した位置に、目
的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入することが最も簡便である。し
かし、アデノウイルス配列内での構築体の挿入位置は、本発明には重要ではない
。目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドはまた、Ｋａｒｌｓｓｏｎら（１
９８６）により記載のＥ３置換ベクターに欠失Ｅ３領域の代わりに、またはヘル
パー細胞系またはヘルパーウイルスがＥ４欠陥を補完するＥ４領域に挿入され得
る。

【００３７】 アデノウイルスは、増殖および操作し易く、インビトロおよびインビボで広範
な宿主範囲を示す。このウイルス群は、高い力価で、例えば、１０⁹−１０¹¹プ ラーク形成単位／ｍｌで得ることができ、それらは感染性が高い。アデノウイル
スの生活環は、宿主細胞ゲノムへの組込みを必要としない。アデノウイルスベク
ターにより運ばれる外来遺伝子はエピソームであり、それ故、宿主細胞への遺伝
毒性は低い。野生型アデノウイルスを用いたワクチン接種の研究において、副作
用は全く報告されておらず（Ｃｏｕｃｈら、１９６３；Ｔｏｐら、１９７１）、
インビボ遺伝子移行ベクターとしてのその安全性および治療有効性を実証してい
る。

【００３８】 アデノウイルスベクターは、真核遺伝子発現調査（Ｌｅｖｒｅｒｏら、１９９
１；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘら、１９９２）およびワクチン開発（Ｇｒｕｎｈａｕ
ｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２；ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ、１９９
２）に使用されてきた。近年、動物研究により、組換えアデノウイルスは、遺伝
子療法に使用できることが示唆された（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕ
ｄｅｔおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、１９９１；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒ
ｒｉｃａｕｄｅｔら、１９９０；Ｒｉｃｈら、１９９３）。組換えアデノウイル
スの異なる組織への投与の研究は、気管滴下注入（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９
９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２）、筋肉内注射（Ｒａｇｏｔら、１９９
３）、末梢静脈内注射（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、１９９３）、鼻腔内接種
（Ｇｉｎｓｂｅｒｇら、１９９１）、肺へのエアゾール投与（Ｂｅｌｌｏｎ、１
９９６）、腹腔内投与（Ｓｏｎｇら、１９９７）、胸膜内注射（Ｅｌｓｈａｍｉ
ら、１９９６）、膀胱内投与を使用した膀胱への投与（Ｗｅｒｔｈｍａｎら、１
９９６）、皮下注射（Ｏｇａｗａ、１９８９）、心筋への心室注射（心臓、Ｆｒ
ｅｎｃｈら、１９９４）、肝臓灌流（肝動脈または門脈、Ｓｈｉｒａｉｓｈｉら
、１９９７）および脳への定位的接種（Ｌｅ Ｇａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅら、１
９９３）を含む。

【００３９】 Ｂ．レトロウイルス レトロウイルスは、感染細胞において、逆転写プロセスにより、そのＲＮＡを
二本鎖ＤＮＡに変換する能力により特徴づけられる、一本鎖ＲＮＡウイルスの一
群である（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。その後、得られたＤＮＡは、安定に、プ
ロウイルスとして細胞染色体に組込まれ、ウイルスタンパク質の合成を指示する
。組込みにより、レシピエント細胞およびその派生物においてウイルス遺伝子配
列の保持が起こる。レトロウイルスゲノムは、キャプシドタンパク質、ポリメラ
ーゼ酵素、およびエンベロープ成分をそれぞれコードする、３つの遺伝子、ｇａ ｇ 、ｐｏｌ、およびｅｎｖを含む。ｇａｇ遺伝子の上流に見られる配列は、ゲノ
ムのビリオンへのパッケージングのためのシグナルを含む。２つの末端反復配列
（ＬＴＲ）は、ウイルスゲノムの５'および３'末端に存在する。これらは、強力
なプロモーターおよびエンハンサー配列を含み、宿主細胞ゲノムにおける組込み
にも必要とされる（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。

【００４０】 レトロウイルスベクターを作成するために、目的の遺伝子をコードする核酸を
、あるウイルス配列の代わりに、ウイルスゲノムに挿入し、複製欠陥のウイルス
を産生する。ビリオンを産生するために、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子
を含むがＬＴＲおよびパッケージング成分は含まないパッケージング細胞系を作
成する（Ｍａｎｎら、１９８３）。ｃＤＮＡを、レトロウイルスＬＴＲおよびパ
ッケージング配列と共に含む組換えプラスミドがこの細胞系に導入されると（例
えばリン酸カルシウム沈降により）、パッケージング配列により、組換えプラス
ミドのＲＮＡ転写物の、ウイルス粒子へのパッケージングが可能となり、これは
その後、培養培地に分泌される（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、
１９８８；Ｔｅｍｉｎ、１９８６；Ｍａｎｎら、１９８３）。その後、組換えレ
トロウイルスを含む培地を集め、任意選択により濃縮し、遺伝子移行に使用する
。レトロウイルスベクターは、広範囲の細胞型を感染できる。しかし、組込みお
よび安定な発現には宿主細胞の分裂が必要である（Ｐａｓｋｉｎｄら、１９７５
）。

【００４１】 レトロウイルスベクターの特異的な標的化を可能とするために設計された新規
なアプローチが、近年、ラクトース残基のウイルスエンベロープへの化学的付加
による、レトロウイルスの化学的修飾に基づき開発された。この修飾は、シアロ
糖タンパク質受容体を介した肝細胞の特異的感染を可能とし得る。

【００４２】 組換えレトロウイルスの標的化への異なるアプローチが設計され、ここでは、
レトロウイルスエンベロープタンパク質に対する、および特異的な細胞受容体に
対するビオチニル化効果を使用した。抗体を、ストレプトアビジンを使用してビ
オチン成分を介して結合させた（Ｒｏｕｘら、１９８９）。主要な組織適合複合
体クラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体を使用して、インビトロで同種志
向性ウイルスによる、表面抗原を有する様々なヒト細胞の感染を実証した。

【００４３】 本発明の全態様において、レトロウイルスベクターの使用にはある制限がある
。例えば、レトロウイルスベクターは、通常、細胞ゲノムのランダムな部位に組
込まれる。これにより、宿主遺伝子の中断により、またはフランキング遺伝子の
機能に干渉できるウイルス調節配列の挿入により、挿入的突然変異が生じ得る（
Ｖａｒｍｕｓら、１９８１）。欠陥レトロウイルスベクターの使用についての別
の懸念は、パッケージング細胞における野生型複製コンピテントウイルスの出現
の可能性である。これは、組換えウイルス由来の無傷配列が、宿主細胞ゲノムに
組込まれたｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ配列の上流に挿入される組換え事象か
ら生じ得る。しかし、組換えの可能性を大きく減少させる新規なパッケージング
細胞系が、現在入手可能である（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、１９８８；Ｈｅｒｓｄ
ｏｒｆｆｅｒら、１９９０）。

【００４４】 Ｃ．ヘルペスウイルス 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は向神経性であるので、神経系疾患の処置に
かなりの興味を引き起こした。さらに、ＨＳＶの、潜伏中に活性なプロモーター
の存在下で、宿主細胞染色体への組込みを起こすことなく、または別様には宿主
細胞の代謝を変化させることなく、非分裂神経細胞における潜伏感染を確立する
能力から、ＨＳＶは魅力的なベクターである。多くの注目がＨＳＶの向神経性適
用に集中しているが、このベクターはまた、その広範な宿主範囲から他の組織に
も活用できる。

【００４５】 ＨＳＶを魅力的なベクターとしている別の要因は、ゲノムのサイズおよび構成
である。ＨＳＶは大きいので、複数の遺伝子または発現カセットの取り込みは、
他のより小さなウイルス系よりも問題は少ない。さらに、様々な性能（時間的、
強度、ら）をもつ異なるウイルス調節配列が利用できることにより、他の系より
も広い範囲で発現を調節できる。ウイルスが、比較的少ないスプライスされたメ
ッセージを有することも利点であり、これにより遺伝子操作はさらに簡単になる
。

【００４６】 ＨＳＶはまた、比較的操作し易く、高い力価まで増殖できる。従って、十分な
ＭＯＩを得るに必要な容量および反復投与の必要性が少ないという両方の点から
、送達に関する問題は少ない。遺伝子療法ベクターとしてのＨＳＶの論評につい
ては、Ｇｌｏｒｉｏｓｏら（１９９５）参照。

【００４７】 サブタイプ１および２で称されるＨＳＶは、世界中の何百万人のヒト概体を感
染している、ヒトが遭遇する最も一般的な感染性物質の１つである外被ウイルス
である。大きく複雑で二本鎖のＤＮＡゲノムは、多くの異なる遺伝子産物をコー
ドし、そのいくつかはスプライスされた転写物から得られる。ビリオンおよびエ
ンベロープ構造成分に加えて、ウイルスは、プロテアーゼ、リボヌクレオチドレ
ダクターゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ｓｓＤＮＡ結合タンパク質、ヘリカーゼ／プ
ライマーゼ、ＤＮＡ依存性ＡＴＰアーゼ、ｄＵＴＰアーゼおよびその他を含む、
多くの他のタンパク質をコードする。

【００４８】 ＨＳＶ遺伝子は、その発現が、協調的に調節され、カスケード様に経時的に順
序づけられる、数個の群を形成する（ＨｏｎｅｓｓおよびＲｏｉｚｍａｎ、１９
７４；ＨｏｎｅｓｓおよびＲｏｉｚｍａｎ １９７５；ＲｏｉｚｍａｎおよびＳ
ｅａｒｓ、１９９５）。感染後に発現される最初のセットの遺伝子であるα遺伝
子の発現は、ビリオンタンパク質１６番、またはα−トランス誘導因子により増
強される（Ｐｏｓｔら、１９８１；ＢａｔｔｅｒｓｏｎおよびＲｏｉｚｍａｎ、
１９８３；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９８３）。β遺伝子の発現は、機能的α遺伝
子産物、最も顕著には、α４遺伝子によりコードされるＩＣＰ４を必要とする（
ＤｅＬｕｃａら、１９８５）。主にビリオン構造タンパク質をコードする異種遺
伝子群であるγ遺伝子は、最適な発現のためにウイルスＤＮＡ合成の開始を必要
とする（Ｈｏｌｌａｎｄら、１９８０）。

【００４９】 ゲノムの複雑性と調和して、ＨＳＶの生活環が極めて関与している。ウイルス
粒子が合成され最終的に細胞死がもたらされる溶解環に加えて、ウイルスは、潜
伏状態に侵入でき、依然として定義されていないシグナルが溶解環の再発を引き
起こすまで、ゲノムは神経節に維持される。ＨＳＶの非病原性変異体が開発され
、遺伝子療法状況における使用にすぐに利用できる（米国特許第５，６７２，３
４４号）。

【００５０】 Ｄ．アデノ随伴ウイルス 近年、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、より一般的に使用されているレトロ
ウイルスおよびアデノウイルスベクターへの可能な代替物として出現した。レト
ロウイルスおよびアデノウイルス媒介遺伝子移行の研究は、前者のあり得る発癌
特性、および後者に関連した免疫原性問題に関する懸念を生じるが、ＡＡＶは全
くかかる病理徴候には関連していない。

【００５１】 さらに、ＡＡＶは、他のベクターよりもより望ましくする、数個の独特な特徴
を有する。レトロウイルスと異なり、ＡＡＶは、非分裂細胞を感染でき、野生型
ＡＡＶは、部位特異的なヒト細胞の染色体１９への組込みを特徴とし（Ｋｏｔｉ
ｎおよびＢｅｒｎｓ、１９８９；Ｋｏｔｉｎら、１９９０；Ｋｏｔｉｎら、１９
９１；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９９１）；ＡＡＶはまた、抗発癌性特性も有する
（Ｏｓｔｒｏｖｅら、１９８１；ＢｅｒｎｓおよびＧｉｒａｕｄ、１９９６）。
組換えＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ ＩＴＲ間の目的のＤＮＡ配列を分子クローニン
グすることにより作成され、野生型ＡＡＶゲノムのいずれのコード配列も削除さ
れる。かくして産生されたＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶゲノムの全コード配
列を欠失するが、インビトロおよびインビボの両方の形質導入時における組換え
遺伝子の安定な染色体組込みおよび発現の特性を保持する（Ｂｅｒｎｓ、１９９
０；ＢｅｒｎｓおよびＢｏｈｅｎｓｋｙ、１９８７；Ｂｅｒｔｒａｎら、１９９
６；Ｋｅａｒｎｓら、１９９６；Ｐｏｎｎａｚｈａｇａｎら、１９９７ａ）。近
年まで、ＡＡＶは、ほとんど全ての細胞型、および交雑種バリアさえ感染すると
信じられていた。しかし、今では、ＡＡＶ感染は、受容体媒介性であることが決
定された（Ｐｏｎｎａｚｈａｇａｎら、１９９６；Ｍｉｚｕｋａｍｉら、１９９
６）。

【００５２】 ＡＡＶは、約４７００塩基対の直鎖状一本鎖ＤＮＡを使用する。逆方向末端反
復配列は、ゲノムをフランキングする。２つの遺伝子が、ゲノム内に存在し、多
くの異なる遺伝子産物を与える。最初のｃａｐ遺伝子は、ＶＰ−１、ＶＰ−２お
よびＶＰ−３と称される３つの異なるビリオンタンパク質（ＶＰ）を産生する。
第二のｒｅｐ遺伝子は、４つの非構造的タンパク質（ＮＳ）をコードする。１つ
以上のこれらのｒｅｐ遺伝子産物が、ＡＡＶ転写のトランス活性化に関与する。
ＡＡＶ配列は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら（１９８３）、および米国特許第５，２
５２，４７９号（その全文を引用することにより本明細書に特に組込む）により
提供される。

【００５３】 ＡＡＶの３つのプロモーターが、ゲノムの地図単位のその位置により示される
。左から右に、ｐ５、ｐ１９およびｐ４０がある。転写により、６つの転写物が
生じ、２つは各３つのプロモーターで開始し、各対の１つがスプライスされる。
地図単位４２−４６から得られるスプライス部位は、各転写物について同一であ
る。４つの非構造的タンパク質は、見かけ上、長いほうの転写物から得られ、３
つのビリオンタンパク質は全て、最も小さい転写物から生じる。

【００５４】 ＡＡＶは、ヒトのどの病的状態にも関連していない。興味深いことに、効率的
な複製のために、ＡＡＶは、単純ヘルペスウイルスＩおよびＩＩ、サイトメガロ
ウイルス、オーエスキー病ウイルス、および勿論アデノウイルスなどのウイルス
由来の「ヘルプ」機能を必要とする。最もよく特徴づけられたヘルパーはアデノ
ウイルスであり、このウイルスの多くの「初期」機能が、ＡＡＶ複製を支援する
ことが示された。ＡＡＶｒｅｐタンパク質の低レベル発現は、ＡＡＶ構造的発現
を抑えると信じられており、ヘルパーウイルス感染はこの遮断を除去すると考え
られている。

【００５５】 Ｅ．ワクシニアウイルス ワクシニアウイルスベクターは、その作成し易さ、得られる発現レベルの比較
的高いこと、広範な宿主範囲およびＤＮＡを保有する容量が大きいことから、広
範に使用されてきた。ワクシニアは、顕著な「Ａ−Ｔ」優先を示す、約１８６ｋ
ｂの直鎖状二本鎖ＤＮＡゲノムを含む。約１０．５ｋｂの逆方向末端反復配列が
ゲノムをフランキングする。大半の必須遺伝子が、中心領域内に位置しているよ
うであり、これはポックスウイルス間で最も高度に保存されている。ワクシニア
ウイルスの推定されるオープンリーディングフレーム数は、１５０−２００であ
る。両方の鎖がコード鎖であるが、読み枠の広範な重複は一般的ではない。

【００５６】 少なくとも２５ｋｂを、ワクシニアウイルスゲノムに挿入できる（Ｓｍｉｔｈ
およびＭｏｓｓ、１９８３）。原型ワクシニアベクターは、相同的組換えにより
ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子に挿入された導入遺伝子を含む。ベクターは、
ｔｋ−表現型に基づき選択する。脳心筋炎ウイルスの非翻訳リーダー配列の封入
、すなわち発現レベルは従来のベクターよりも高く、導入遺伝子は、２４時間で
感染細胞タンパク質の１０％以上で蓄積する（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎら、１９
８９）。

【００５７】 ＩＩＩ．非ウイルス性移行 本発明は、アデノウイルス多重遺伝子構築体の使用を記載するが、本発明はま
た、非ウイルス性遺伝子移行も使用し得る。この章は、非ウイルス性遺伝子移行
の方法および組成物の議論を提供する。

【００５８】 本発明のＤＮＡ構築体は、一般に細胞に送達され、ある状況で、送達される核
酸は、非ウイルス法を使用して移行され得る。

【００５９】 培養した哺乳動物細胞への発現構築体の移行のための数個の非ウイルス法が、
本発明により考えられる。これらは、リン酸カルシウム沈降（Ｇｒａｈａｍおよ
びＶａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、１９８７
；Ｒｉｐｐｅら、１９９０）、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｇｏｐａｌ、１９８５
）、電気穿孔（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６；Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４）
、直接的マイクロインジェクション（ＨａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ
、１９８５）、ＤＮＡ添加リポソーム（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、１９８
２；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９）、細胞超音波（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９
８７）、高速微粒子銃を使用した遺伝子衝撃（Ｙａｎｇら、１９９０）、および
受容体媒介トランスフェクション（ＷｕおよびＷｕ、１９８７；ＷｕおよびＷｕ
、１９８８）を含む。

【００６０】 一旦構築体が細胞に送達されると、治療遺伝子をコードする核酸は、異なる部
位に位置および発現され得る。ある実施形態において、治療遺伝子をコードする
核酸は、細胞のゲノムに安定に組込まれ得る。この組込みは、相同的組換え（遺
伝子置換）により同族の位置および配向にあり得るか、またはそれはランダムで
非特異的な位置に組込まれ得る（遺伝子増大）。さらに別の実施形態において、
核酸は、ＤＮＡの別々のエピソームセグメントとして細胞中に安定に維持され得
る。かかる核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期とは独立して
、または同調して、維持および複製を維持するに十分な配列をコードする。発現
構築体が、どのように細胞に送達され、細胞中のどこに核酸が残存するのかは、
使用した発現構築体の型に依存する。

【００６１】 本発明の特定の実施形態において、発現構築体は、リポソームにトラップされ
得る。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部水性媒体を特徴とする小胞構
造である。多重膜リポソームは、水性媒体により分離される多重脂質層を有する
。それらはリン脂質が過剰の水溶液に懸濁されると自発的に形成する。脂質成分
は、閉じた構造の形成前に自己再編成を受け、脂質二重層の間に水および溶解し
た溶質をトラップする（ＧｈｏｓｈおよびＢａｃｈｈａｗａｔ、１９９１）。Ｄ
ＮＡをカチオン性リポソームに添加することにより、リポソームから光学的に複
屈折な液体−結晶凝縮小球の位相幾何学的な遷移が引き起こされる（Ｒａｄｌｅ
ｒら、１９９７）。これらのＤＮＡ−液体複合体は、遺伝子療法の使用における
可能性ある非ウイルス性ベクターである。

【００６２】 リポソーム媒介核酸送達および外来ＤＮＡのインビトロ発現は、非常に成功し
た。β−ラクタマーゼ遺伝子を使用して、Ｗｏｎｇら（１９８０）は、培養した
ヒヨコ胚、ＨｅＬａ、および肝細胞における、リポソーム媒介送達および外来Ｄ
ＮＡの発現の実行可能性を実証した。Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）は、静脈内
注射後に、ラットにおいて、リポソーム媒介遺伝子移行を成功裡に達成した。ま
た、「リポフェクション」技術を含む様々な市販のアプローチが含まれる。

【００６３】 本発明のある実施形態において、リポソームは、センダイウイルス（ＨＶＪ）
と複合体を形成し得る。これは、細胞膜との融合を容易にし、リポソームカプセ
ル化ＤＮＡの細胞侵入を促進する（Ｋａｎｅｄａら、１９８９）。別の実施形態
において、リポソームは、核の非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と複
合体を形成し得るか、またはこれと共に使用され得る（Ｋａｔｏら、１９９１）
。さらに別の実施形態において、リポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１と複合
体を形成し得るか、またはこれと共に使用され得る。そこで該発現構築体は、イ
ンビトロおよびインビボで核酸の移行および発現に成功裡に使用されてきたので
、本発明に適用可能である。

【００６４】 治療遺伝子をコードする核酸を細胞に送達するために使用できる他のベクター
送達系は、受容体媒介送達ベヒクルである。これらは、ほとんど全ての真核細胞
で受容体媒介エンドサイトーシスによる巨大分子の選択的取り込みを利用する。
様々な受容体の細胞型特異的分布から、送達は高度に特異的であり得る（Ｗｕお
よびＷｕ、１９９３）。

【００６５】 受容体媒介遺伝子標的ベヒクルは、一般に、２つの成分からなる：細胞受容体
特異的リガンドおよびＤＮＡ結合剤。数個のリガンドが、受容体媒介遺伝子移行
に使用されてきた。最も広範に特徴づけられているリガンドは、アシアロオロソ
ムコイド（ＡＳＯＲ）（ＷｕおよびＷｕ、１９８７）およびトランスフェリン（
Ｗａｇｎｅｒら、１９９０）である。近年、ＡＳＯＲと同じ受容体を認識する合
成ネオ糖タンパク質が、遺伝子送達ベヒクルとして使用され（Ｆｅｒｋｏｌら、
１９９３；Ｐｅｒａｌｅｓら、１９９４）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）もまた、遺
伝子の扁平上皮癌細胞への送達に使用されてきた（Ｍｙｅｒｓ、ＥＰＯ ０２７
３０８５）。

【００６６】 別の実施形態において、送達ベヒクルは、リガンドおよびリポソームを含み得
る。例えば、Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）は、ラクトシル−セラミド、ガラク
トース−末端アシアロガングリオシドを使用し、リポソームに取り込み、肝細胞
によるインシュリン遺伝子取り込みの増加を観察した。従って、治療遺伝子をコ
ードする核酸もまた、任意の数の受容体−リガンド系により、リポソームを用い
てまたは用いずに、前立腺、上皮または腫瘍細胞などの細胞型に特異的に送達さ
れ得ることが可能である。例えば、ヒト前立腺特異的抗原（Ｗａｔｔら、１９８
６）は、前立腺組織における核酸の媒介送達の受容体として使用され得る。

【００６７】 本発明の別の実施形態において、発現構築体は、単に、裸組換えＤＮＡまたは
プラスミドからなり得る。構築体の移行は、細胞膜を物理的または化学的に透過
性にする、上記の任意の方法により実施され得る。これは、特にインビボでの移
行に適用可能であるが、同様にインビボの使用にも適用され得る。Ｄｕｂｅｎｓ
ｋｙら（１９８４）は、ＣａＰＯ₄沈降物の形で、ポリオーマウイルスＤＮＡを 、成体および新生仔マウスの肝臓および脾臓に成功裡に注射し、活発なウイルス
複製および急性感染を実証した。ＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙおよびＮｅｓｈｉｆ（１
９８６）はまた、ＣａＰＯ₄沈降プラスミドの直接的な腹腔内注射により、トラ ンスフェクトされた遺伝子が発現されることを実証した。ＣＡＭをコードするＤ
ＮＡはまた、インビボで同様な様式で移行され、ＣＡＭを発現し得ると考えられ
る。

【００６８】 裸ＤＮＡ発現構築体を細胞に移行するための本発明の別の実施形態は、粒子衝
撃を含み得る。この方法は、ＤＮＡ被膜微粒子銃を高速に加速させ、細胞膜を貫
通し、細胞を死滅させることなく細胞に侵入できる能力に依存する（Ｋｌｅｉｎ
ら、１９８７）。小粒子を加速する数個の装置が開発されている。１つの該装置
は、電流を発生させる高電圧放電に依拠し、これは次々に輸送力を提供する（Ｙ
ａｎｇら、１９９０）。使用された微粒子銃は、タングステンまたは金ビーズな
どの生物学的に不活性な物質からなる。

【００６９】 ＩＶ．遺伝子組合せ Ａ．腫瘍サプレッサー ｐ５３（表１で１と称する）は、現在、腫瘍サプレッサー遺伝子として認識さ
れている。高レベルの変異ｐ５３が、化学的発癌、紫外線照射、および数個のウ
イルスにより形質転換された多くの細胞で見出されている。ｐ５３遺伝子は、多
種多様なヒト腫瘍における変異不活性化の高頻度の標的であり、一般的なヒト癌
において最も頻繁に変異した遺伝子であるとすでに実証されている。それは、５
０％以上のヒトＮＳＣＬＣ（Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎら、１９９１）および広域の他
の腫瘍で変異している。

【００７０】 ｐ５３遺伝子は、ＳＶ４０大Ｔ抗原およびアデノウイルスＥ１Ｂなどの宿主タ
ンパク質と複合体を形成できる、３９３アミノ酸リンタンパク質をコードする。
タンパク質は、正常組織および細胞に見出されるが、形質転換した細胞または腫
瘍組織と比べると僅かな濃度である。興味深いことに、野生型ｐ５３は、細胞増
殖および分裂の調節に重要であるようである。野生型ｐ５３の過剰発現は、ある
場合には、ヒト腫瘍細胞系において抗増殖的であることが示された。従って、ｐ
５３は、細胞増殖の負の調節剤として作用でき（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、１９９１）
、直接的に非制御細胞増殖を抑制し得るか、またはこの増殖を抑制する遺伝子を
間接的に活性化し得る。従って、野生型ｐ５３の不在または不活性化は、形質転
換に寄与し得る。しかし、ある研究により、変異ｐ５３の存在は、遺伝子の形質
転換能の完全な発現に必要であり得ることが示される。

【００７１】 野生型ｐ５３は、多くの細胞型において重要な増殖調節因子として認識される
。ミスセンス変異は、ｐ５３遺伝子には一般的であり、発癌遺伝子の形質転換能
には必須である。点変異により促進される１つの遺伝子変化により、発癌性ｐ５
３を創製でき、ｐ５３における多くの変異が、野生型ｐ５３の腫瘍サプレッサー
能を抑止することが知られている。しかし、他の発癌遺伝子と異なり、ｐ５３点
変異は、少なくとも３０の別個のコドンで生じることが知られ、ホモ接合性の減
少なく、細胞表現型の変動を生じる優勢対立遺伝子をしばしば創製する。さらに
、多くのこれらのドミナントネガティブな対立遺伝子は、生物において耐容性で
あり、生殖系列に通り過ぎるようである。様々な変異対立遺伝子の範囲は、最小
限の機能障害性から強力な貫通性ドミナントネガティブな対立遺伝子までのよう
である（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、１９９１）。

【００７２】 Ｃａｓｅｙおよび同僚は、野生型ｐ５３をコードするＤＮＡの、２つのヒト乳
癌細胞系へのトンランスフェクションにより、該細胞における増殖抑制制御は回
復すると報告した（Ｃａｓｅｙら、１９９１）。類似の効果がまた、変異ｐ５３
ではなく野生型の、ヒト肺癌細胞系へのトランスフェクション時に実証された（
Ｔａｋａｈａｓｉら、１９９２）。ｐ５３は、変異遺伝子よりも優勢であるよう
であり、変異遺伝子と共に細胞にトランスフェクトした場合に、増殖に対抗して
選択する。トランスフェクトｐ５３の正常な発現は、内因性ｐ５３をもつ正常ま
たは非悪性細胞の増殖には影響を及ぼさない。従って、該構築体は、副作用なく
正常細胞により取り込まれ得る。従って、野生型ｐ５３を用いたｐ５３関連癌の
処置により、悪性細胞数またはその増殖速度は減少すると提唱する。

【００７３】 真核細胞周期の主要な遷移は、サイクリン依存性キナーゼまたはＣＤＫにより
引き起こされる。サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）である１つのＣＤＫ
が、Ｇ₁を介して増殖を調節する。この酵素の活性は、後期Ｇ₁でＲｂをリン酸化
することであり得る。ＣＤＫ４の活性は、活性化サブユニット、Ｄ型サイクリン
、および阻害性サブユニットｐ１６^INK4により制御される。ｐ１６^INK4は、ＣＤ
Ｋ４に特異的に結合して阻害するタンパク質として生化学的に特徴づけられ、従
って、Ｒｂリン酸化を調節し得る（Ｓｅｒｒａｎｏら、１９９３；Ｓｅｒｒａｎ
ｏら、１９９５）。ｐ１６^INK4タンパク質は、ＣＤＫ４阻害剤であり（Ｓｅｒｒ
ａｎｏ、１９９３）、この遺伝子の欠失は、ＣＤＫ４の活性を増加させ得、その
結果、Ｒｂタンパク質は過リン酸化される。ｐ１６はまた、ＣＤＫ６の機能を調
節することが知られている。

【００７４】 ｐ１６^INK4は、ｐ１５^INK4B、ｐ２１^WAF1、およびｐ２７^KIP1も含む、ＣＤＫ 阻害タンパク質の新規に記載されたクラスに属する。ｐ１６^INK4遺伝子は、多く
の腫瘍型で頻繁に欠失している染色体領域である、９ｐ２１に遺伝子座が決定さ
れる。ｐ１６^INK4遺伝子のホモ接合性欠失および変異は、ヒト腫瘍細胞系で頻繁
である。この証拠により、ｐ１６^INK4遺伝子は、腫瘍サプレッサー遺伝子である
ことが示唆される。しかし、この解釈は、ｐ１６^INK4遺伝子変化の頻度は、培養
細胞系よりも一次非培養腫瘍においてはるかに低いという観察により攻撃を受け
ている（Ｃａｌｄａｓら、１９９４；Ｃｈｅｎｇら、１９９４；Ｈｕｓｓｕｓｓ
ｉａｎら、１９９４；Ｋａｍｂら、１９９４；Ｋａｍｂら、１９９４；Ｍｏｒｉ
ら、１９９４；Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９４；Ｎｏｂｏｒｉら、１９９５；Ｏｒ
ｌｏｗら、１９９４；Ａｒａｐら、１９９５）。しかし、ｐ１６遺伝子は、多く
の原発腫瘍で無傷であるが、高い割合のいくつかの腫瘍型でｐ１６タンパク質発
現を予防する他の機序があることが後に示された。ｐ１６プロモーター過メチル
化は、これらの機序の１つである（Ｍｅｒｌｏら、１９９５；Ｈｅｒｍａｎ、１
９９５；Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｚｕｌｕｅｔａ、１９９５）。プラスミド発現ベク
ターを用いたトランスフェクションによる野生型ｐ１６^INK4機能の回復は、いく
つかのヒト癌細胞系によるコロニー形成を減少させた（Ｏｋａｍｏｔｏ、１９９
４；Ａｒａｐ、１９９５）。アデノウイルスベクターと共にｐ１６を送達するこ
とにより、いくつかのヒト癌系の増殖が阻止され、ヒト腫瘍異種移植片の増殖は
減少する。

【００７５】 Ｃ−ＣＡＭ（表１で２と称する）は、実質上、全ての上皮細胞で発現される（
ＯｄｉｎおよびＯｂｒｉｎｋ、１９８７）。見かけの分子量が１０５ｋＤのＣ−
ＣＡＭは、細胞凝集を中和する特異的抗体との反応により、ラット肝細胞の原形
質膜から初めて単離された（Ｏｂｒｉｎｋ、１９９１）。近年の研究により、構
造的に、Ｃ−ＣＡＭは、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属し、そ
の配列は、癌胎児抗原（ＣＥＡ；表１で３と称する）に高度に相同的である（Ｌ
ｉｎおよびＧｕｉｄｏｔｔｉ、１９８９）。バキュロウイルス発現系を使用して
、Ｃｈｅｕｎｇら（１９９３）は、Ｃ−ＣＡＭの最初のＩｇドメインは、細胞接
着活性にとって重要であることを実証した。

【００７６】 細胞接着分子、またはＣＡＭは、器官発達および細胞分化を調節する分子相互
作用の複雑なネットワークに関与することが知られている（Ｅｄｅｌｍａｎ、１
９８５）。近年のデータにより、ＣＡＭの異常発現は、数個の新生物の腫瘍形成
に関与し得、例えば、上皮細胞に主に発現されるＥ−カドヘリンの発現減少は、
数個の種類の新生物の進行に関連していることが示される（Ｅｄｅｌｍａｎおよ
びＣｒｏｓｓｉｎ、１９９１；Ｆｒｉｘｅｎら、１９９１；Ｂｕｓｓｅｍａｋｅ
ｒｓら、１９９２；Ｍａｔｓｕｒａら、１９９２；Ｕｍｂａｓら、１９９２）。
また、ＧｉａｎｃｏｔｔｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ（１９９０）は、遺伝子移
行によるα₅β₁インテグリンの発現増加は、インビボでのチャイニーズハムスタ
ー卵巣細胞の腫瘍原性を減少できることを実証した。ここでＣ−ＣＡＭは、イン
ビトロおよびインビボで腫瘍増殖を抑制することが示された。

【００７７】 本発明に従って使用され得る他の腫瘍サプレッサーは、ｐ２１（表１で４と称
する）、ｐ１５（表１で５と称する）、ＢＲＣＡ１（表１で６と称する）、ＢＲ
ＣＡ２（表１で７と称する）、ＩＲＦ−１（表１で８と称する）、ＰＴＥＮ（Ｍ
ＭＡＣ１、表１で９と称する）、ＲＢ（表１で１１と称する）、ＡＰＣ（表１で
１２と称する）、ＤＣＣ（表１で１３と称する）、ＮＦ−１（表１で１４と称す
る）、ＮＦ−２（表１で１５と称する）、ＷＴ−１（表１で１６と称する）、Ｍ
ＥＮ−１（表１で１７と称する）、ＭＥＮ−ＩＩ（表１で１８と称する）、ｚａ
ｃ１（表１で１９と称する）、ｐ７３（表１で２０と称する）、ＶＨＬ（表１で
２１と称する）、ＦＣＣ（表１で２３と称する）、ＭＣＣ（表１で２４と称する
）、ＤＢＣＣＲ１（表１で１３３と称する）、ＤＣＰ４（表１で１３７と称する
）およびｐ５７（表１で１３８と称する）を含む。

【００７８】 Ｂ．アポトーシスの誘導物質 アポトーシスの誘導物質、例えば、Ｂａｘ（表１で２５と称する）、Ｂａｋ（
表１で２６と称する）、Ｂｃｌ−Ｘ_s（表１で２７と称する）、Ｂａｄ（表１で ２８と称する）、Ｂｉｍ（表１で２９と称する）、Ｂｉｋ（表１で３０と称する
）、Ｂｉｄ（表１で３１と称する）、Ｈａｒａｋｉｒｉ（表１で３２と称する）
、Ａｄ Ｅ１Ｂ（表１で３３と称する）、Ｂａｄ（表１で３４と称する）、ＩＣ
Ｅ−ＣＥＤ３プロテアーゼ（表１で３５と称する）、ＴＲＡＩＬ（表１で１２５
と称する）、ＳＡＲＰ−２（表１で１２６と称する）およびアポプチン（表１で
１３２と称する）は、同様に、本発明に記載の使用を見出し得る。さらに、細胞
毒性遺伝子の送達および調節発現は、１９９９年３月１１日に提出された、「ア
デノウイルス媒介遺伝子共送達によるアポトーシス的または細胞毒性的遺伝子発
現の誘導」と題した米国特許出願に記載されている（引用することにより本明細
書に特に組込む）。

【００７９】 Ｃ．酵素 本発明では、様々な酵素遺伝子を目的とする。該酵素は、シトシンデアミナー
ゼ（表１で３６と称する）、アデノシンデアミナーゼ（表１で３７と称する）、
ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（表１で３８と称
する）、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（表１で３９と
称する）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（表１で４０と称する）、グルコ
セレブロシダーゼ（表１で４１と称する）、スフィンゴミエリナーゼ（表１で４
２と称する）、α−Ｌ−イズロニダーゼ（表１で４３と称する）、グルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼ（表１で４４と称する）、ＨＳＶチミジンキナーゼ
（表１で４５と称する）およびヒトチミジンキナーゼ（表１で４６と称する）お
よび細胞外タンパク質、例えば、コラゲナーゼ（表１で１１８と称する）、マト
リックス金属プロテアーゼ（表１で１１９と称する）、ＲＳＫＢ（表１で１２８
と称する）、ＲＳＫ１（表１で１２９と称する）、ＲＳＫ２（表１で１３０と称
する）、ＲＳＫ３（表１で１３１と称する）、トロンボスポンジン（表１で１３
４と称する）、フィブロネクチン（表１で１３５と称する）およびプラスミノー
ゲン（表１で１３６と称する）を含む。本発明の他の実施形態において、抗血管
形成因子の使用を考える。

【００８０】 Ｄ．サイトカイン 本発明のアデノウイルスベクターへの挿入が考えられる別のクラスの遺伝子は
、インターロイキンおよびサイトカインを含む。インターロイキン１（ＩＬ−１
；表１で４７と称する）、ＩＬ−２（表１で４８と称する）、ＩＬ−３（表１で
４９と称する）、ＩＬ−４（表１で５０と称する）、ＩＬ−５（表１で５１と称
する）、ＩＬ−６（表１で５２と称する）、ＩＬ−７（表１で５３と称する）、
ＩＬ−８（表１で５４と称する）、ＩＬ−９（表１で５５と称する）、ＩＬ−１
０（表１で５６と称する）、ＩＬ−１１（表１で５７と称する）、ＩＬ−１２（
表１で５８と称する）、ＩＬ−１３（表１で５９と称する）、ＩＬ−１４（表１
で６０と称する）、ＩＬ−１５（表１で６１と称する）、β−インターフェロン
（表１で６２と称する）、α−インターフェロン（表１で６３と称する）、γ−
インターフェロン（表１で１２２と称する）、アンギオスタチン（表１で６４と
称する）、トロンボスポンジン（表１で６５と称する）、エンドスタチン（表１
で６８と称する）、ＭＥＴＨ−１（表１で６７と称する）、ＭＥＴＨ−２（表１
で６８と称する）、ＧＭ−ＣＳＦ（表１で６９と称する）、Ｇ−ＣＳＦ（表１で
７０と称する）、Ｍ−ＣＳＦ（表１で１２３と称する）および腫瘍壊死因子（表
１で１２４と称する）を含む。

【００８１】 Ｅ．毒素 様々な毒素もまた、本発明の発現ベクターの一部として有用であると考えられ
、これらの毒素は、細菌毒素、例えば、レシンＡ鎖（Ｂｕｒｂａｇｅ、１９９７
；表１で７１と称する）、ジフテリア毒素Ａ（Ｍａｓｓｕｄａら、１９９７；Ｌ
ｉｄｏｒ、１９９７；表１で７２と称する）、百日咳毒素Ａサブユニット（表１
で７３と称する）、Ｅ．コリエンテロトキシン毒素Ａサブユニット（表１で７４
と称する）、コレラ毒素Ａサブユニット（表１で７５と称する）およびシュード
モナス毒素ｃ末端（表１で７６と称する）を含む。近年、融合タンパク質調節可
能ジフテリア毒素Ａ鎖遺伝子を含むプラスミドのトランスフェクションは、癌細
胞に細胞毒性であることが実証された。従って、調節された毒素遺伝子の遺伝子
移行もまた、癌の処置に適用され得る（Ｍａｓｓｕｄａら、１９９７）。

【００８２】 Ｆ．アンチセンス構築体 アンチセンス法は、核酸が「相補的」配列と対を形成する傾向があるという事
実を利用する。相補性により、ポリヌクレオチドは、標準的なワトソン−クリッ
ク相補性法則に従って、塩基対形成できるものであることを意味する。すなわち
、より大きなプリンは、より小さなピリミジンと塩基対を形成して、グアニン対
シトシン（Ｇ：Ｃ）およびＤＮＡの場合ではアデニン対チミン（Ａ：Ｔ）、また
はＲＮＡの場合ではアデニン対ウラシル（Ａ：Ｕ）の組合せを形成する。イノシ
ン、５−メチルシトシン、６−メチルアデニン、ヒポキサンチンおよびその他な
どの一般性の低い塩基のハイブリッド形成配列への封入は、塩基対形成を干渉し
ない。

【００８３】 二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡをポリヌクレオチドを用いて標的化することにより、三
重ヘリックスが形成され、ＲＮＡを標的化することにより二重ヘリックスが形成
される。アンチセンスポリヌクレオチドは、標的細胞に導入されると、特異的に
その標的ポリヌクレオチドに結合し、転写、ＲＮＡプロセシング、輸送、翻訳お
よび／または安定性を干渉する。アンチセンスＲＮＡ構築体、または該アンチセ
ンスＲＮＡをコードするＤＮＡを使用して、インビトロまたはヒト概体を含む宿
主動物内などのインビボでの宿主細胞内で、遺伝子転写または翻訳またはその両
方を阻止し得る。

【００８４】 アンチセンス構築体は、遺伝子のプロモーターおよび他の制御領域、エキソン
、イントロン、またはさらにはエキソン−イントロン境界に結合するように設計
され得る。最も効力のあるアンチセンス構築体は、イントロン／エキソンスプラ
イス接合部に相補的な領域を含むと考えられる。従って、好ましい実施形態は、
イントロン−エキソンスプライス接合部位の５０−２００塩基内の領域に相補性
を有するアンチセンス構築体を含むことが提唱される。いくつかのエキソン配列
が、その標的選択性に重大な影響を及ぼすことなく、構築体に含めることができ
ることが観察された。含めるエキソン材料の量は、使用する特定のエキソンおよ
びイントロン配列により変化する。あまりに多くのエキソンＤＮＡが含められた
かは、単にインビトロで構築体を試験し、正常な細胞機能が影響を受けたか、ま
たは相補配列を有する関連遺伝子の発現が影響を受けたかを決定することにより
容易に試験できる。

【００８５】 上記したように、「相補的」または「アンチセンス」は、その全長にわたり実
質的に相補的であり、塩基ミスマッチが非常に少ない、ポリヌクレオチド配列を
意味する。例えば、１５塩基長の配列は、１３または１４位で相補的ヌクレオチ
ドを有する場合、相補的であると称され得る。自然には、完全に相補的な配列は
、その全長にわたり完全に相補的であり、全く塩基ミスマッチがない配列である
。相同性度の低い他の配列もまた、考えられる。例えば、高い相同性領域が限定
されているが、非相同性領域も含むアンチセンス構築体（例えば、リボザイム、
下記参照）を設計できる。これらの分子は、相同性が５０％以下であるが、適切
な条件下で標的配列に結合する。

【００８６】 ゲノムＤＮＡの一部をｃＤＮＡまたは合成配列と合わせて、特異的構築体を製
造することが有利であり得る。例えば、イントロンを最終構築体に望む場合、ゲ
ノムクローンを使用する必要がある。ｃＤＮＡまたは合成ポリヌクレオチドは、
構築体の残りの部分により簡便な制限部位を提供し得、それ故、残りの配列に使
用される。

【００８７】 アンチセンス構築体の標的である特定の発癌遺伝子は、ｒａｓ（表１で７７と
称する）、ｍｙｃ（表１で７８と称する）、ｎｅｕ（表１で７９と称する）、ｒ ａｆ （表１で８０と称する）、ｅｒｂ（表１で８１と称する）、ｓｒｃ（表１で
８２と称する）、ｆｍｓ（表１で８３と称する）、ｊｕｎ（表１で８４と称する
）、ｔｒｋ（表１で８５と称する）、ｒｅｔ（表１で８６と称する）、ｈｓｔ（
表１で８７と称する）、ｇｓｐ（表１で８８と称する）、ｂｃｌ−２（表１で８
９と称する）およびａｂｌ（表１で９０と称する）である。その他に有用である
と考えられるものは、抗アポトーシス遺伝子および血管形成プロモーターである
。

【００８８】 Ｇ．リボザイム タンパク質は、伝統的には、核酸の触媒に使用されてきたが、別のクラスの巨
大分子が、この努力で有用なものとして出現した。リボザイムは、核酸を部位特
異的に切断するＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレ
アーゼ活性を有する特異的な触媒ドメインを有する（ＫｉｍおよびＣｏｏｋ、１
９８７；Ｇｅｒｌａｃｈら、１９８７；ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｏｎｓ、１
９８７）。例えば、多くのリボザイムが、高度の特異性をもって、リン酸エステ
ル転移反応を加速し、しばしば、オリゴヌクレオチド基質の数個のリン酸エステ
ルの唯１つを切断する（Ｃｏｏｋら、１９８１；ＭｉｃｈｅｌおよびＷｅｓｔｈ
ｏｆ、１９９０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−ＨｕｒｅｋおよびＳｈｕｂ、１９９２）。
この特異性は、基質が、特異的塩基対形成相互作用を介して、化学反応前にリボ
ザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）に結合するという要求に起因する。

【００８９】 リボザイム触媒は、主に、核酸の関与する配列特異的開裂／ライゲーション反
応の一部として観察された（Ｊｏｙｃｅ、１９８９；Ｃｏｏｋら、１９８１）。
例えば、米国特許第５，３５４，８５５号は、あるリボザイムは、既知のリボヌ
クレアーゼの特異性よりも高く、ＤＮＡ制限酵素の特異性に近い配列特異性をも
つエンドヌクレアーゼとして作用できると報告する。従って、配列特異的リボザ
イム媒介遺伝子発現阻害は、治療適用に特に適切であり得る（Ｓｃａｎｌｏｎら
、１９９１；Ｓａｒｖｅｒら、１９９０）。近年、リボザイムは、適用されたい
くつかの細胞系において遺伝子変化を顕現することが報告され、変化した遺伝子
は、発癌遺伝子Ｈ−ｒａｓ、ｃ−ｆｏｓおよびＨＩＶ遺伝子を含んだ。ほとんど
のこの研究は、特異的リボザイムにより切断される特異的変異コドンを基にした
、標的ｍＲＮＡの修飾を含んだ。この実施形態の標的は、ＶＥＧＦｓおよびアン
ギオポエチン（ａｎｇｉｏｐｏｅｉｔｅｉｎ）などの血管形成遺伝子並びに発癌
遺伝子（例えば、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｓｒｃ、ｆｍｓ、 ｊｕｎ 、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｈｓｔ、ｇｓｐ、ｂｃｌ−２、ＥＧＦＲ、ｇｒｂ２お
よびａｂｌ）を含む。

【００９０】 Ｈ．単鎖抗体 さらに別の実施形態において、１つの遺伝子は、単鎖抗体を含み得る。単鎖抗
体の産生法は、当業者には公知である。当業者は、該方法について米国特許第５
，３５９，０４６号（引用することにより本明細書に組込む）を参考にする。単
鎖抗体は、短いペプチドリンカーを使用して、重鎖および軽鎖の可変ドメインを
共に融合し、よって単一分子上に抗原結合部位を再構成することにより創製する
。

【００９１】 一方の可変ドメインのＣ末端を、１５−２５アミノ酸ペプチドまたはリンカー
を介して、他方のＮ末端に繋げた、単鎖抗体可変断片（ｓｃＦｖｓ）は、抗原結
合または結合の特異性を有意に乱すことなく開発された（Ｂｅｄｚｙｋら、１９
９０；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９９０）。これらのＦｖｓは、自然抗体の重鎖
および軽鎖に存在する定常領域（Ｆｃ）を欠失する。

【００９２】 発癌遺伝子、増殖因子、ホルモン、酵素、転写因子または受容体などの多種多
様な分子に対する抗体が考えられる。また、血清に、血管形成因子（ＶＥＧＦ／
ＶＳＰ、表１で９１と称される、βＦＧＦ、表１で９２と称される、αＦＧＦ、
表１で９３と称される、その他）および血管形成に必要な内皮抗原（すなわち、
Ｖ３インテグリン、表１で９４と称される）に対して標的化した分泌抗体が考え
られる。特に考えられるものは、トランスフォーミング増殖因子（表１で１２０
と称される）および血小板由来増殖因子（表１で１２１と称される）などの増殖
因子である。

【００９３】 Ｉ．転写因子および調節因子 有利な組合せに適用できる別のクラスの遺伝子は、転写因子である。例は、Ｃ
／ＥＢＰα（表１で９５と称される）、ＩκＢ（表１で９６と称される）、Ｎｆ
κＢ（表１で９７と称される）、Ｐａｒ−４（表１で９８と称される）およびＣ
／ＥＢＰα（表１で１２７と称される）を含む。

【００９４】 Ｊ．細胞周期調節因子 細胞周期調節因子は、他の遺伝子と合わせた場合に、あり得る利点を提供する
。該細胞周期調節因子は、ｐ２７（表１で９９と称される）、ｐ１６（表１で１
００と称される）、ｐ２１（表１で４と称される）、ｐ５７（表１で１０１と称
される）、ｐ１８（表１で１０２と称される）、ｐ７３（表１で１０３と称され
る）、ｐ１９（表１で１０４と称される）、ｐ１５（表１で５と称される）、Ｅ
２Ｆ−１（表１で１０５と称される）、Ｅ２Ｆ−２（表１で１０６と称される）
、Ｅ２Ｆ−３（表１で１０７と称される）、ｐ１０７（表１で１０９と称される
）、ｐ１３０（表１で１１０と称される）およびＥ２Ｆ−４（表１で１１１と称
される）を含む。他の細胞周期調節因子は、抗血管形成タンパク質、例えば、可
溶性Ｆｌｔ１（ドミナントネガティブ可溶性ＶＥＧＦ受容体、表１で１１２と称
される）、可溶性Ｗｎｔ受容体（表１で１１３と称される）、可溶性Ｔｉｅ２／
Ｔｅｋ受容体（表１で１１４と称される）、マトリックス金属プロテアーゼ２の
可溶性ヘモペキシンドメイン（表１で１１５と称される）および他の血管形成サ
イトカインの可溶性受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ１／ＫＤＲ（表１で１１６と称
される）、ＶＥＧＦＲ３／Ｆｌｔ４（表１で１１７と称される）、両方のＶＥＧ
Ｆ受容体）を含む。

【００９５】 Ｋ．ケモカイン ケモカインをコードする遺伝子もまた本発明で使用し得る。ケモカインは、一
般に、免疫効果細胞をケモカイン発現部位に補充するための化学誘引物質として
作用する。それは、特定のケモカイン遺伝子を、例えば、サイトカイン遺伝子と
組合せて発現させて、他の免疫系成分の、処置部位への補充を増強するのに有利
であり得る。該ケモカインは、ＲＡＮＴＥＳ（表１で１０と称される）、ＭＣＡ
Ｆ、ＭＩＰ１−α（表１で１０８と称される）、ＭＩＰ１−β（表１で２２と称
される）、およびＩＰ−１０を含む。当業者は、あるサイトカインは、化学誘引
効果を有することが知られており、ケモカインなる語の下に分類できることを認
識する。

【００９６】 Ｌ．遺伝子組合せ 本明細書に記載したように、任意の１つの特定の遺伝子を、任意の他の特定の
遺伝子と組合せ得ることが考えられる。特に好ましい遺伝子組合せの例は、ここ
で下記の表１に列挙する。従って、表１の最初の縦列の任意の遺伝子を、表１の
最初の横列に示した任意の他の遺伝子と有利に組合せ得る。勿論、これらは単に
例示的な組合せであり、本発明の教義を与えれば、当業者は、２、３、４、５ま
たはそれ以上の遺伝子または核酸構築体を含むがこれに限定されない、任意の考
えられる組合せの多重遺伝子構築体を産生できるだろう。以下のグラフは、表１
を見る当業者の助けとなり得る。この表は、連続的に、ａリーフ(leaf a)、ｂリ
ーフ(leaf b, 以下同じ）、ｃリーフ、ｄリーフ、ｅリーフ、ｆリーフ、ｇリー フ、ｈリーフ、ｉリーフ、ｊリーフ、ｋリーフ、ｌリーフ、ｍリーフ、ｎリーフ
、ｏリーフ、ｐリーフ、ｑリーフ、ｒリーフ、ｓリーフ、ｔリーフ、ｕリーフ、
ｖリーフ、ｗリーフ、ｘリーフ、ｙリーフ、ｚリーフ、ａａリーフ、ｂｂリーフ
、ｃｃリーフ、ｄｄリーフ、ｅｅリーフ、ｆｆリーフ、ｇｇリーフ、ｈｈリーフ
、ｉｉリーフおよびｊｊリーフと呼ぶ３６リーフに分割し、全体として表を見る
ために、リーフを、以下の空間順序で並べる。

【００９７】 ａ ｂ ｃ ｄ ｅ ｆ ｇ ｈ ｈｈ ｉ ｋ ｍ ｏ ｑ ｓ ｕ ｗ ｉｉ ｊ ｌ ｎ ｐ ｒ ｔ ｖ ｘ ｊｊ ｙ ｚ ａａ ｂｂ ｃｃ ｄｄ ｅｅ ｆｆ ｇｇ

【００９８】 このように、表１は、明細書の形式に準拠するように別々のページに分割した
が、表１の横列１は、１−１４０（含む）までの個々の数を含み、表１の縦列１
は、１−１４０（含む）までの個々の数を含むと理解する。これらの数字は、明
細書を通じて称される個々の遺伝子を意味し、例えば、数字１は、ｐ５３を意味
し、数字２はＣ−ＣＡＭを意味し、数字３はＣＥＡを意味し、数字４はｐ２１を
意味し、数字５はｐ１５を意味し、数字６はＢＲＣＡ１を意味する。「Ｘ」で印
をつけた各ボックスは、その横列に位置する遺伝子および縦列に位置する遺伝子
を含む組合せを示す。この表の型式が得られれば、当業者には、この表にさらな
る遺伝子を加え、考えられる可能な組合せを解明することは容易であろう。

【００９９】

【表１】

【０１００】 表１に関する脚注：アデノウイルスベクターにおけるＩＬ−２とＨＳＶ−ｔｋの
組合せは、Ｏ'Ｍａｌｌｅｙらにより記載された（１９９７および１９９６の両 方を引用することにより本明細書に組込む）。＃は、ＷＯ９７／３２４８１（引
用することにより組込む）に記載のＧＭ−ＣＳＦとＩＦＮαの組合せを示す。＃
＃は、ＷＯ９７／３２４８１（引用することにより本明細書に組込む）に記載の
ＧＭ−ＣＳＦとＩＦＮβの組合せを示す。Ψは、ＷＯ９７／３２４８１（引用す
ることにより本明細書に組込む）に記載のＦＭ−ＣＳＦとＴＧＦの組合せを示す
。φは、ＷＯ９７／３２４８１（引用することにより本明細書に組込む）に記載
のＰＤＧＦとＧＭ−ＣＳＦの組合せを示す。φは、ＷＯ９７／３２４８１（引用
することにより本明細書に組込む）に記載のＩＦＮγとＧＭ−ＣＳＦの組合せを
示す。θは、ＷＯ９７／３２４８１（引用することにより本明細書に組込む）に
記載のＭ−ＣＳＦとＧＭ−ＣＳＦの組合せを示す。ρは、ＷＯ９７／３２４８１
（引用することにより本明細書に組込む）に記載の腫瘍壊死因子とＧＭ−ＣＳＦ
の組合せを示す。

【０１０１】 Ｖ．調節エレメント Ａ．プロモーター 本出願を通して、「発現構築体」(expression construct)なる語は、遺伝子産
物をコードする核酸を含む、任意のタイプの遺伝的構築体(genetic construct) を含むことを意味し、ここで、核酸コード配列の一部または全部が転写できる。
転写物は、タンパク質に翻訳され得るが、その必要性はない。ある実施形態にお
いて、発現は、遺伝子の転写およびｍＲＮＡの遺伝子産物への翻訳の両方を含む
。別の実施形態において、発現のみが、目的の遺伝子をコードする核酸の転写を
含む。

【０１０２】 遺伝子産物をコードする核酸は、プロモーターの転写制御下にある。「プロモ
ーター」は、遺伝子の特定の転写を開始するに必要な、細胞の合成機械または導
入された合成機械により認識されるＤＮＡ配列を意味する。「転写制御下」なる
語は、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ開始および遺伝子の発現を調節する
ために、核酸に関して正しい位置および配向にあることを意味する。

【０１０３】 プロモーターなる語は、ここで、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位近くにク
ラスターを形成する一群の転写制御モジュールを意味するために使用される。ど
のようにプロモーターが構成されるかに関する多くの考察は、ＨＳＶチミジンキ
ナーゼ（ｔｋ）およびＳＶ４０初期転写単位のプロモーターを含む、数個のウイ
ルスプロモーターの解析から得られる。より近年の研究により増大されたこれら
の研究により、プロモーターは、別個の機能モジュールからなり、各々は、約７
−２０ｂｐのＤＮＡからなり、転写アクチベーターまたはリプレッサータンパク
質の１つ以上の認識部位を含むことが示された。

【０１０４】 各プロモーターにおける少なくとも１つのモジュールが、ＲＮＡ合成の開始部
位に位置するように機能する。これの最良の既知の例は、ＴＡＴＡボックスであ
るが、哺乳動物末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモ
ーターおよびＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターなどの、ＴＡＴＡボックスの欠
失したあるプロモーターでは、開始部位自体に存在する別個のエレメントが、開
始位置の固定を助ける。

【０１０５】 追加のプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、
これらは、開始部位の３０−１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、多くのプロモ
ーターが、近年、同様に開始部位の下流に機能的エレメントを含むことが示され
た。プロモーターエレメント間のスペーシングは頻繁に可動性であるので、プロ
モーター機能は、エレメントが逆位であるか、または互いに相対的に移動する場
合、保存される。ｔｋプロモーターにおいて、プロモーターエレメント間のスペ
ーシングは、活性が下降する前に、５０ｂｐまで離れるように増加することがで
きる。プロモーターに応じて、個々のエレメントは、共操作的にまたは独立的に
機能して、転写を活性化できるようである。

【０１０６】 目的の核酸配列の発現を制御するために使用した特定のプロモーターは、標的
細胞における核酸の発現を指示できる限り、重要であると信じられている。従っ
て、ヒト細胞を標的化する場合、ヒト細胞で発現できるプロモーターの近くに、
およびその制御下に、核酸コード領域を位置することが好ましい。一般的に言え
ば、該プロモーターは、ヒトまたはウイルスプロモーターを含み得る。

【０１０７】 様々な実施形態において、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子
プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列、
β−アクチン、ラットインシュリンプロモーター、ヒトユビキチンＣプロモータ
ーおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを使用して、高レベ
ルの目的のコード配列の発現を得ることができる。目的のコード配列の発現を達
成するための当業者には公知である、他のウイルスまたは哺乳動物細胞性または
細菌性ファージプロモーターの使用が、発現レベルがある目的に十分であるなら
ば、同様に考えられる。公知の特性を有するプロモーターを使用して、トランス
フェクションおよび形質転換後に、目的のタンパク質の発現のレベルおよびパタ
ーンを、最適化できる。

【０１０８】 特異的生理学的または合成シグナルに応答して調節されるプロモーターの選択
により、遺伝子産物の誘導性発現が可能となる。例えば、導入遺伝子または導入
遺伝子群の発現が、多シストロン性ベクターを使用する場合に、ベクターを産生
する細胞に対して毒性がある場合、１つ以上の導入遺伝子の発現を禁止または減
少させることが望ましくあり得る。産生細胞系に毒性であり得る導入遺伝子の例
は、プロアポトーシスおよびサイトカイン遺伝子である。数個の誘導性プロモー
ター系が、導入遺伝子産物が毒性であり得る、ウイルスベクターの産生に利用可
能である。

【０１０９】 エクジソン系（インビトロゲン、カールズバッド、カリフォルニア）は１つの
かかる系である。この系は、哺乳動物細胞において目的の遺伝子の調節された発
現を可能とするように設計される。それは、全く基礎レベルの導入遺伝子の発現
をもたらさないが、２００倍以上の誘導性を可能とする、しっかりと調節された
発現機序からなる。この系は、ショウジョウバエのヘテロダイマーエクジソン受
容体に基づき、エクジソンまたはムリステロンＡなどの類似体が受容体に結合す
ると、受容体はプロモーターを活性化し、下流導入遺伝子の発現を引き起こし、
高レベルのｍＲＮＡ転写物が得られる。この系において、両方のヘテロダイマー
受容体のモノマーが、１つのベクターから構成的に発現されるが、目的の遺伝子
の発現を駆動するエクジソン応答性プロモーターは、別のプラスミド上にある。
それ故、この型の系の、目的の遺伝子移行ベクターへの工学が有用である。その
後、産生細胞系において目的の遺伝子および受容体モノマーを含むプラスミドの
同時トランスフェクションにより、毒性の可能性のある導入遺伝子が発現される
ことなく、遺伝子移行ベクターの産生が可能となる。適切な時期に、導入遺伝子
の発現を、エクジソンまたはムリステロンＡを用いて活性化できる。

【０１１０】 有用であろう別の誘導系は、最初にＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（Ｇｏｓ
ｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ、１９９２；Ｇｏｓｓｅｎら、１９９５）により開発
された、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ（登録商標）またはＴｅｔ−Ｏｎ（登録商標）系（Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ、パロアルト、カリフォルニア）である。またこの系により、高レ
ベルの遺伝子発現の、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどのテトラサ
イクリン誘導体に応答した調節が可能となる。Ｔｅｔ−Ｏｎ（登録商標）系にお
いて、遺伝子発現は、ドキシサイクリンの存在下で開始されるが、Ｔｅｔ−Ｏｆ
ｆ（登録商標）系においては、遺伝子発現は、ドキシサイクリンの非存在下で開
始される。これらの系は、Ｅ．コリのテトラサイクリン耐性オペロンから得られ
た２つの調節エレメントに基づく。テトラサイクリンリプレッサーが結合するテ
トラサイクリンオペレーター配列、およびテトラサイクリンリプレッサータンパ
ク質。目的の遺伝子は、それに存在するテトラサイクリン応答性エレメントを有
するプロモーターの後のプラスミドにクローン化される。第二プラスミドは、テ
トラサイクリン制御トランスアクチベーターと呼ばれる調節エレメントを含み、
これは、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ（登録商標）系において、単純ヘルペスウイルス由来の
ＶＰ１６ドメインおよび野生型テトラサイクリンリプレッサーからなる。従って
、ドキシサイクリンの非存在下で、転写は構成的に存在する。Ｔｅｔ−Ｏｎ（登
録商標）系において、テトラサイクリンリプレッサーは野生型ではなく、ドキシ
サイクリンの存在下で転写を活性化する。遺伝子療法ベクター産生のために、Ｔ
ｅｔ−Ｏｆｆ（登録商標）系は、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンの存
在下で産生細胞を増殖でき、可能性ある毒性導入遺伝子の発現を予防するために
好ましいが、ベクターを患者に導入すれば、遺伝子発現は構成的に存在するだろ
う。

【０１１１】 ある環境において、遺伝子療法ベクターにおいて導入遺伝子の発現を調節する
ことが望ましくあり得る。例えば、様々な活性強度を有する異なるウイルスプロ
モーターは、所望する発現レベルに応じて利用され得る。哺乳動物細胞において
、ＣＭＶ最初期プロモーターは、しばしば使用すれば、強力な転写活性化を提供
する。より強度が低い修飾型のＣＭＶプロモーターもまた、低い導入遺伝子発現
レベルを所望する場合には使用される。造血細胞における導入遺伝子の発現を所
望する場合、ＭＬＶまたはＭＭＴＶ由来のＬＴＲなどのレトロウイルスプロモー
ターをしばしば使用する。所望の効果に応じて使用され得る他のウイルスプロモ
ーターは、ＳＶ４０、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ ＬＴＲ、
Ｅ１Ａ、Ｅ２ＡまたはＭＬＰ領域由来などのアデノウイルスプロモーター、ＡＡ
Ｖ ＬＴＲ、カリフラワーモザイクウイルス、ＨＳＶ−ＴＫ、およびトリ肉腫ウ
イルスを含む。

【０１１２】 同様に、組織特異的プロモーターは、特異的組織または細胞で転写を起こすた
めに使用され得、よって、非標的化組織へのあり得る毒性または望ましくない効
果を減少させ得る。例えば、ＰＳＡ、プロバシン、前立腺酸ホスファターゼまた
は前立腺特異的腺性カリクレイン（ｈＫ２）などのプロモーターを、前立腺にお
ける遺伝子発現の標的化に使用し得る。同様に、以下のプロモーターを使用して
、他の組織における遺伝子発現を標的化し得る（表２）。

【０１１３】

【表２】

【０１１４】 ある適応症においては、遺伝子療法ベクターの投与後、特定の時間に転写を活
性化することが望ましくあり得る。これは、ホルモンまたはサイトカインを調節
物であるものなどの該プロモーターを用いて実施し得る。例えば、適応症が、特
異的なステロイドが産生または経由する性腺組織である遺伝子療法適用において
、アンドロゲンまたはエストロゲン調節プロモーターの使用が有利であり得る。
ホルモン調節物である該プロモーターは、ＭＭＴＶ、ＭＴ−１、エクジソンおよ
びＲｕＢｉｓｃｏを含む。甲状腺、下垂体および副腎ホルモンに応答性のものな
どの他のホルモン調節プロモーターは、本発明に有用であることが期待される。
使用できるサイトカインおよび炎症性タンパク質応答性プロモーターは、Ｋおよ
びＴキニノーゲン（Ｋａｇｅｙａｍａら、１９８７）、ｃ−ｆｏｓ、ＴＮＦ−α
、Ｃ−反応性タンパク質（Ａｒｃｏｎｅら、１９８８）、ハプトグロビン（Ｏｌ
ｉｖｉｅｒｏら、１９８７）、血清アミロイドＡ２、Ｃ／ＥＢＰα、ＩＬ−１、
ＩＬ−６（ＰｏｌｉおよびＣｏｒｔｅｓｅ、１９８９）、補体Ｃ３（Ｗｉｌｓｏ
ｎら、１９９０）、ＩＬ−８、α−１酸糖タンパク質（ＰｒｏｗｓｅおよびＢａ
ｕｍａｎｎ、１９８８）、α−１アンチトリプシン、リポタンパク質リパーゼ（
Ｚｅｃｈｎｅｒら、１９８８）、アンギオテンシノーゲン（Ｒｏｎら、１９９１
）、フィブリノーゲン、ｃ−ｊｕｎ（ホルボールエステル、ＴＮＦ−α、ＵＶ照
射、レチノイン酸および過酸化水素により誘導可能）、コラゲナーゼ（ホルボー
ルエステルおよびレチノイン酸により誘導）、メタロチオネイン（重金属および
糖質コルチコイドにより誘導可能）、ストロメライシン（ホルボールエステル、
インターロイキン−１およびＥＧＦにより誘導可能）、α−２マクログロブリン
およびα−１抗キモトリプシンを含む。

【０１１５】 細胞周期を調節可能なプロモーターは本発明で有用であり得ると考えられる。
例えば、二シストロン性遺伝子療法ベクターにおいて、Ｇ１期に細胞を停止する
ｐ１６などの第一遺伝子の発現を駆動する強力なＣＭＶプロモーターの使用によ
り、細胞周期のＧ１期で活性なプロモーターの制御下でｐ５３などの第二遺伝子
の発現が生じ得、従って、細胞をアポトーシスへと押す「第二ヒット」を提供す
る。様々なサイクリン、ＰＣＮＡ、ガレクチン−３、Ｅ２Ｆ１、ｐ５３およびＢ
ＲＣＡ１などの他のプロモーターを使用できる。

【０１１６】 オステオカルシン、低酸素応答性エレメント（ＨＲＥ）、ＭＡＧＥ−４、ＣＥ
Ａ、α−胎児タンパク質、ＧＲＰ７８／ＢｉＰおよびチロシナーゼなどの腫瘍特
異的プロモーターはまた、腫瘍細胞の遺伝子発現の調節に使用され得る。本発明
に従って使用できる他のプロモーターは、Ｌａｃ調節性、化学療法誘導性（例え
ばＭＤＲ）、および熱（温熱療法）誘導性プロモーター、照射誘導性（例えばＥ
ＧＲ（Ｊｏｋｉら、１９９５））、α−インヒビン、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩｔＲＮ
Ａｍｅｔおよび他のアミノ酸プロモーター、Ｕ１ ｓｎＲＮＡ（Ｂａｒｔｌｅｔ
ｔら、１９９６）、ＭＣ−１、ＰＧＫ、β−アクチンおよびα−グロビンを含む
。有用であり得る多くの他のプロモーターは、ＷａｌｔｈｅｒおよびＳｔｅｉｎ
（１９９６）に列挙される。 任意の上記プロモーターを単独で、または他と組合せたものが、所望の作用に
応じて本発明に有用であり得ると考えられる。さらに、このプロモーターのリス
トは、徹底的または制限的なものと捉えるべきではなく、当業者は、本明細書で
開示したプロモーターおよび方法と共に使用され得る他のプロモーターを知って
いるだろう。

【０１１７】 Ｂ．エンハンサー エンハンサーは、同ＤＮＡ分子上の離れた位置に位置するプロモーターからの
転写を増加させる遺伝エレメントである。エンハンサーは、プロモーターと同じ
ように構成される。すなわち、多くの個々のエレメントからなり、その各々は、
１つ以上の転写タンパク質に結合している。エンハンサーないしプロモーターの
基本的な差は、操作上のものである。全体としてエンハンサー領域は、遠い転写
を刺激できなくてはならず、これはプロモーター領域またはその成分エレメント
についてはその必要はない。一方、プロモーターは、特定の部位および特定の配
向でＲＮＡ合成の開始を指示する１つ以上のエレメントを有さなければならない
が、エンハンサーはこれらの特異性がない。プロモーターおよびエンハンサーは
、しばしば重複かつ近接し、しばしば、非常に類似したモジュラー構成を有する
ようである。

【０１１８】 以下は、発現構築体中で目的の遺伝子をコードする核酸と組合せて使用できる
、上記に列挙した組織特異的プロモーター、細胞性プロモーター／エンハンサー
および誘導性プロモーター／エンハンサーに追加したプロモーターのリストであ
る（表３および４）。さらに、任意のプロモーター／エンハンサー組合せ（真核
プロモーターデータベースＥＰＤＢにより）もまた、遺伝子の発現を駆動するた
めに使用できる。真核細胞は、適切な細菌ポリメラーゼが、送達複合体の一部と
してまたは追加の遺伝子発現産物構築体として提供される場合、ある細菌プロモ
ーターからの細胞質転写を支持できる。

【０１１９】

【表３】

【０１２０】

【表４】

【０１２１】 Ｃ．ポリアデニル化シグナル ｃＤＮＡ挿入断片を使用する場合、典型的には、遺伝子転写物の適切なポリア
デニル化を行うためのポリアデニル化シグナルを含めることを所望する。ポリア
デニル化シグナルの性質は、本発明の成功裡の実行には重要であるとは信じられ
ておらず、ヒトまたはウシ増殖ホルモンおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル
などの任意の該配列を使用し得る。発現カセットのエレメントとして、ターミネ
ーターも考えられる。これらのエレメントは、メッセージレベルを増強し、カセ
ットから他の配列への解読を最小限にするのに役立つことができる。

【０１２２】 Ｄ．ＩＲＥＳ 本発明のある実施形態において、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメ
ントの使用は、多重遺伝子、またはポリシストロン性メッセージを創製すると考
えられている。ＩＲＥＳエレメントはまた、５'メチル化Ｃａｐ依存性翻訳のリ ボソーム走査モデルを迂回し、内部部位で翻訳を開始することができる（Ｐｅｌ
ｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８）。ピコルナウイルスファミ
リーの２つのメンバー（ポリオウイルスおよび脳心筋炎）からのＩＲＥＳエレメ
ントが（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８）、哺乳動物
メッセージからのＩＲＥＳと同様に記載されている（ＭａｃｅｊａｋおよびＳａ
ｒｎｏｗ、１９９１）。ＩＲＥＳエレメントは、異種オープンリーディングフレ
ームに連結できる。複数のオープンリーディングフレームが共に転写され得、各
々はＩＲＥＳにより分離され、ポリシストロン性メッセージを創製する。ＩＲＥ
Ｓエレメントにより、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のため
にリボソームに近づくことができる。複数の遺伝子は、単一のプロモーター／エ
ンハンサーを使用して効率的に発現され、単一のメッセージを転写することがで
きる。

【０１２３】 任意の異種オープンリーディングフレームがＩＲＥＳエレメントに連結できる
。これは、独立した遺伝子によりコードされる、分泌タンパク質、マルチサブユ
ニットタンパク質、細胞内または膜結合タンパク質および選択マーカーの遺伝子
を含む。このように、数個のタンパク質の発現は、単一の構築体および単一の選
択マーカーと共に細胞中に同時に工学できる。

【０１２４】 ＶＩ．ウイルス粒子を産生する方法 アデノウイルス粒子を産生する伝統的な方法は、同時トランスフェクションし
、続いて、シャトルプラスミド（通常、小サブセットのアデノウイルスゲノムお
よび目的の遺伝子を発現カセットに含む）およびアデノウイルスヘルパープラス
ミド（全アデノウイルスゲノムのほとんどを含む）の、２９３または９１１細胞
（Ｉｎｔｒｏｇｅｎｅから得る、オランダ）へのインビボ組換えである。トラン
スフェクション後、アデノウイルスプラークを、アガロースにある細胞から単離
し、ウイルス粒子を分析するために増殖した。詳細なプロトコルについては、当
業者はＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖａｃ（１９９１）を参考にする。

【０１２５】 新規アデノウイルスベクター（すなわち、２９３細胞依存性ウイルス複製に必
要なアデノウイルス遺伝子、並びに目的の遺伝子（群）を含む発現カセット（群
）を含むベクター）の産生のための別の技術は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）系、
ｒｅｃＡ＋細菌株における、相補的アデノウイルス配列および発現カセットを含
む２つのプラスミドを使用したインビボ細菌組換え、および酵母人工染色体（Ｙ
ＡＣ）系の使用を含む。引用することにより本明細書に組込むものは、ＰＣＴ公
開公報９５／２７０７１および９６／３３２８０であり、これは、アデノウイル
ス産生法の詳細を提供する。改善されたアデノウイルスベクターの産生および精
製法は、１９９７年１１月２０日に提出された、米国特許出願第０８／９７５，
５１９号（引用することにより本明細書に特に組込む）に記載されている。

【０１２６】 以下のプロトコルは、本発明に使用するウイルス産生および増殖の例を提供す
る。勿論、これは、単に例示的なプロトコルであり、当業者は、個々の要求に従
ってその段階を修飾できる。

【０１２７】 Ａ．アデノウイルスを製造するためのアデノウイルスプラスミドの同時トランス
フェクション １日目： 朝に、ＡＴＣＣ２９３細胞を、１×１０⁶細胞／６０ｍｍ皿に播く。 ２日目： リン酸カルシウムトランスフェクションのプロトコルを使用して、２９３細胞
を１プレートあたり５μｇのＤＮＡを用いてトランスフェクトする（２．５μｇ
の各プラスミド、すなわち、ｐＪＭ１７およびシャトルベクター）。 −対照（ＤＮＡなし）のために各々２−３プレートをトランスフェクトし、プ
ラスミドを試験する： −β−ｇａｌで１−２プレートをトランスフェクトし、効率を調べる。 ３日目： 朝に細胞上の培地を交換する。 午後に、トランスフェクトしたプレートをトリプシン処理し、細胞を計数し、
６ウェル皿の１ウェルあたり１．５−１．７５×１０⁶細胞を播く。 ４日目： Ｘ−ｇａｌでβ−ｇａｌプレートを染色し、効率を調べる。 ５日目： ＳＯＰ＃ＴＭ００１−０４の方法を使用してトランスフェクトした細胞を重層
する。 待ってプラークを観察する（多分４−７日間、しかし、ＹＡＣ ＤＮＡを使用
した場合は３−４週間であり得る）。

【０１２８】 Ｂ．プラーク精製後のアデノウイルスの増殖 １日目： 感染の２日前に、２４ウェルプレートに、２−２．５×１０⁵ＡＴＣＣ２９３ 細胞／ウェルで播く。 ３日目： ５日目に、６０ｍｍ皿に、２×１０⁶ＡＴＣＣ２９３細胞／皿で播く。 無菌キャピラリーピペットを使用してプラークを拾い、血清非含有培地１５０
μｌに入れる。 簡潔にボルテックスをかけてアガロースを破壊する。 ２４ウェルプレートから培地を吸引する。 １００μｌのウイルス含有培地／ウェルを１時間感染させ、１５および４５分
後に振る。 １００μｌの血清非含有培地で対照を偽感染する。 １ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを加える。 待ってＣＰＥ活性を観察する（約４８時間） ５日目： ７日目に、感染のために１．２×１０⁷ＡＴＣＣ２９３細胞／皿で（または８ 日目に感染のために〜６×１０⁶細胞／皿）、２×１５０ｍｍ皿（単離した各プ レートについて）に播く。 ＣＰＥが２４ウェル皿に出現した後、細胞および上清を１５ｍｌのコーニング
チューブに収集する。 液体窒素および３７Ｃ Ｈ２Ｏ浴で３回凍結／解凍する。 〜２０００ｒｐｍで５分間臨床遠心機で遠心する。 上清を０．２２μｍフィルターを通して濾過する。 培地を６０ｍｍ皿から吸引する。 ５５０μｌのウイルス含有培地／６０ｍｍ皿で１時間感染し、１５および４５
分後に振る。 ５５０μｌの血清非含有培地で対照を偽感染させる。 ５ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを加える。 待ってＣＰＥを観察する。 ７日目： ＣＰＥが６０ｍｍ皿に出現した後、細胞および上清を５０ｍｌのコーニングチ
ューブに収集する。 液体窒素および３７Ｃ Ｈ２Ｏ浴に３回冷凍／解凍する。 〜２０００ｒｐｍで５分間臨床遠心機で遠心する。 上清を０．２２μｍフィルターを通して濾過する（ＤＮＡ単離およびＰＣＲ（
登録商標）のために、５−１ｍｌを保存する）。 培地を１５０ｍｍ皿から吸引除去する。 ２ｍｌのウイルス含有培地＋２ｍｌの血清非含有培地／１５０ｍｍ皿で１時間
感染し、１５および４５分後に振る。 ４ｍｌの血清非含有培地で対照を偽感染させる。 ２０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを加える。 待ってＣＰＥを観察する。 ９日目： ＣＰＥが１５０ｍｍ皿に出現した後、細胞および上清を３×５０ｍｌのコーニ
ングチューブに収集する。 液体窒素および３７Ｃ Ｈ２Ｏ浴に３回冷凍／解凍する。 〜２０００ｒｐｍで５分間臨床遠心機で遠心する。 上清を０．２２μｍフィルターを通して濾過し、無菌５０ｍｌのコーニングチ
ューブに入れる。 ウイルス溶解液を、滴下する準備をする。

【０１２９】 ＶＩＩ．疾病状態 本発明は、良性および悪性新形成を含む過増殖疾患を含む、疾病状態の処置を
扱う。該疾患は、網膜症、癌、多剤耐性癌、原発性、乾癬、炎症性腸疾患、慢性
関節リウマチ、変形性関節炎および転移性腫瘍を含む。

【０１３０】 特に、本発明は、前立腺、肺、脳、皮膚、肝臓、乳房、リンパ系、胃、精巣、
卵巣、膵臓、骨、骨髄、頭頸、頚部、食道、眼、膀胱、腎臓、副腎、心臓、結腸
、直腸および血液を含むヒト癌の処置に関する。

【０１３１】 ＶＩＩＩ．動物モデルを使用した多重遺伝子アデノウイルス構築体における抗腫
瘍活性のスクリーニング 動物モデルを、遺伝子または遺伝子組合せの腫瘍抑制効果についてのスクリー
ンとして使用し得る。好ましくは、正所性動物モデルを使用して、研究する特定
の疾病型に近似させ、もっとも関連性のある結果を提供する。

【０１３２】 １つの型の正所性モデルは、頭頸癌のものであり、微視的残留癌および体腔の
微視的接種の分析のための動物モデルの開発を含む。本明細書で使用した「癌」
は、単一の細胞または多細胞腫瘍塊を意味し得る。微視的疾病において、「腫瘍
」は、裸眼では観察できない１つまたは数個の癌細胞からなる。本明細書で記載
した動物モデルは、（ｉ）特に進行段階の疾病における、頭頸癌患者の手術後環
境、および（ｉｉ）微視的癌が確立された罹患患者の体腔の模倣に、特に有利で
ある。癌の他の動物モデルと類似したこのモデルは、腫瘍細胞の動物への接種か
ら得られる。しかし、自然体腔の生理学的ら価体または腫瘍塊切除により創製さ
れた手術後腔である嚢の皮下での創製に違いがある。

【０１３３】 本発明は、好ましくは、モデル生物としてヌードマウスを使用する。しかし、
本発明の使用には、実質上、任意の動物を使用し得る。特に好ましい動物は、実
験プロトコルで日常的に使用される小動物である。さらにより好ましい動物は、
マウス、ラット、モルモットおよびハムスターなどのげっ歯類群の動物である。
ウサギもまた好ましい種である。動物を選択する基準は、研究者の特定の好みに
大きく依存する。

【０１３４】 第一段階は、実験動物に組織フラップを創製することである。「組織フラップ
」なる語は、標的組織を曝露する動物の肉体の切開を意味する。一般に、切開は
、容易に近づける部位なので、動物の背側腹部にすることが好ましい。しかし、
切開は、動物の他の点でもなし得、組織部位の選択は、調査する特定の型の治療
薬などの様々な因子に依存し得ることが理解される。

【０１３５】 一旦標的組織部位が曝露されれば、癌細胞を、個々にまたは微視的腫瘍におい
て、組織部位と接触させる。癌細胞を組織部位に播く最も簡便な方法は、細胞を
含む組織培養培地の懸濁液を、曝露した組織に適用することである。癌細胞適用
は、無菌ピペットまたは任意の簡便な塗布器を使用して、簡単に達成され得る。
自然には、この方法は無菌条件下で実施する。

【０１３６】 特定の例において、２．５×１０⁶細胞を、ヌードマウスの曝露組織フラップ に接種する。当業者は、ある目的のために、適切な細胞数がどれぐらいであるか
を容易に決定できるだろう。細胞数は、動物のサイズ、切開部位、腫瘍細胞自体
の複製能、腫瘍増殖に意図される時間、試験すべき可能性ある抗腫瘍薬らの様々
な因子に依存する。任意の特定の型の腫瘍の最適のモデル系の確立には、投与す
る細胞数のある調整が必要とされ得るが、不当な量の実験を示すものではない。
動物試験の分野の熟練者は、かかる最適化が必要であることを理解するだろう。

【０１３７】 これは、例えば、異なる数の細胞を動物に送達し、組織フラップを再度封じた
後に細胞増殖を監視する予備試験を実施することにより達成できる。自然には、
大量の細胞を投与することにより、大量の微視的な残留腫瘍細胞の個体群が得ら
れる。

【０１３８】 本研究において、フラップは、刺し縫い縫合を使用して効果的に封した。しか
し、当業者は、考える特定の使用に応じて、接着剤、クランプ、一本縫合、縫合
糸らの使用などの切開を封するために日常的に使用される任意の様々な方法を使
用し得ると考えられる。

【０１３９】 他の正所性モデルは当分野で公知である。例えば、正所性肺癌モデルが文献に
記載されている。このプロトコルは、マウスの気管支に腫瘍細胞を注射すること
を含み、ここで、腫瘍が、気管支および細気管支で形成され、非小細胞肺癌患者
に一般的に見られる腫瘍を模倣する。当業者は、過度の実験をすることなく、意
図する目的の各特定のモデルに容易に適応または修飾することができる。

【０１４０】 ＩＸ．処置プロトコル 臨床プロトコルは、ここおよび上記で議論した多重遺伝子構築体を使用して疾
病の処置を容易にするために開発され得る。患者は、前以て化学、放射線または
遺伝子療法を受けてもよいが、必要性はない。最適には、患者は、適切な骨髄機
能（末梢絶対顆粒球数は＞２，０００／ｍｍ³であり、血小板数は１００，００ ０／ｍｍ³と定義）、適切な肝臓機能（ビリルビン(１．５ｍｇ／ｄｌ）および適
切な腎機能（クレアチニン＜１．５ｍｇ／ｄｌ）を有する。

【０１４１】 プロトコルは、腫瘍内注射を介した、１０⁶ないし１０⁹の発現構築体の感染性
粒子を含む医薬組成物の、１回量の投与を要求する。(４ｃｍの腫瘍では、投与 した容量は、４−１０ｍｌ（好ましくは１０ｍｌ）であるが、＜４ｃｍの腫瘍で
は、１−３ｍｌ（好ましくは３ｍｌ）の容量を使用する。複数回の注射を、約１
ｃｍ以上の空間をおいて、０．１−０．５ｍｌの容量の１回量で送達する。

【０１４２】 処置クールは、２週間かけて送達する、約６投与量からなる。臨床家による選
出時に、療法は、６投与量を各２週間で、またはより少ない頻度（１ヶ月毎、２
ヶ月毎、３ヶ月毎ら）を基礎にして続け得る。

【０１４３】 患者が外科切除に好適である場合、腫瘍は、少なくとも２つの連続した２週間
の処置クールで上記したように処置する。第二（またはそれ以上、例えば、第三
、第四、第五、第六、第七、第八ら）クールの完了の１週間以内に、患者は外科
切除を受ける。切開が閉じる前に、発現構築体（１０⁶−１０⁹感染性粒子）を含
む１０ｍｌの医薬組成物を、外科部位（手術床）に送達し、少なくとも６０分間
接触させ続ける。創傷が閉じ、排液またはカテーテルをそこに配置した。手術後
３日目に、追加の１０ｍｌの医薬組成物を、排液を介して投与し、少なくとも２
時間手術床に接触させ続けた。その後、吸引による除去を行い、排液を臨床的に
適切な時間に除去した。

【０１４４】 Ａ．人工および自然体腔の処置 再発性腫瘍増殖の主な起源の１つは、腫瘍切除後に、原発性腫瘍部位並びに局
所的および局在的に残存する残留性微視的疾病である。さらに、自然体腔に、微
視的腫瘍細胞を接種する場合に類似の状況が見られる。かかる微視的疾病の効果
的な処置は、治療法を優位に進展させるだろう。

【０１４５】 従って、ある実施形態において、癌は、外科切除により除去され得、「腔」を
創製する。手術時およびその後（周期的にまたは連続的に）の両方の時点で、本
発明の治療組成物を体腔に投与する。これは、本質的に、腔の表面の「局所」処
置である。組成物の容量は、腔の全表面が発現構築体により接触されるに十分な
ものである。

【０１４６】 １つの実施形態において、投与は単純に、腫瘍切除により形成された腔への治
療組成物の投与を包含する。別の実施形態において、ガーゼ、綿棒または他の器
具を介した機械的な適用が望ましくあり得る。これらのアプローチのいずれかを
、腫瘍除去後、並びに最初の手術中に使用できる。さらに別の実施形態において
、カテーテルを手術侵入部位の閉鎖前に腔に挿入する。その後、腔は、所望の期
間連続的に灌流し得る。

【０１４７】 別の形のこの処置において、治療組成物の「局所」適用は、口腔、咽頭、食道
、喉頭、気管、胸膜腔、腹腔、または膀胱、結腸または他の内臓器官を含む凹器
官腔などの自然体腔を標的化する。この状況において、腔に有意な原発性腫瘍が
あってもなくてもよい。処置は、腔の微視的疾病を標的化するが、原発性腫瘍塊
（以前に除去されていない場合）、またはこの腔内に存在し得る腫瘍発生前の病
変にも偶発的に影響を及ぼし得る。ここでも、様々な方法を使用して、これらの
内臓器官または腔表面への「局所」適用を引き起こし得る。例えば、咽頭の口腔
は、単に口でヒュッと音をたてたり、溶液で含嗽することにより影響を受け得る
。しかし、喉頭および気管内の局所的処置は、内視鏡的な可視化および治療組成
物の局所的送達を必要とし得る。膀胱または結腸粘膜などの内臓器官は、注入と
留置カテーテルを必要とし得るか、またはここでも、膀胱鏡または他の内視鏡装
置を用いた直接的可視化を指示し得る。胸膜腔および腹腔などの腔は、留置カテ
ーテルまたはそれらの領域に近づける外科的アプローチにより近づき得る。

【０１４８】 Ｂ．投与後の遺伝子発現の監視 本発明の別の態様は、治療組成物投与後の遺伝子発現の監視を含む。微視的腫
瘍細胞の破壊は観察できないので、標的部位が、効果的に発現構築体に接触する
かを決定することは重要である。これは、発現構築体が活発に遺伝子産物を産生
している細胞を同定することにより達成され得る。しかし、外因性遺伝子産物な
いし処置領域の腫瘍および非腫瘍細胞に存在するものを区別できることが重要で
ある。外因性タンパク質を、トレーサーエレメントで標識することにより、その
分子の発現の決定的な証拠が提供され、その内因性相当物ではない。

【０１４９】 １つの該トレーサーは、ＦＬＡＧバイオシステム（Ｈｏｐｐら、１９８８）に
より提供される。ＦＬＡＧポリペプチドは、オクタペプチド（ＡｓｐＴｙｒＬｙ
ｓＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓ）であり、その小サイズは、送達された遺伝
子療法タンパク質の発現を乱さなかった。ＦＬＡＧと目的のタンパク質の共発現
は、ＦＬＡＧタンパク質に対して生じる抗体の使用により追跡される。

【０１５０】 ６ＸＨｉｓ系（Ｑｉａｇｅｎ）などの他の免疫マーカー系も使用してよい。そ
のために、任意の直鎖状エピトープを、（ｉ）エピトープの免疫学的完全性が、
融合により損なわれず、および（ｉｉ）機能的完全性が、融合により損なわれな
い限り、融合タンパク質の製造に使用できる。

【０１５１】 Ｘ．治療製剤および投与経路 臨床的適用を考える場合、本発明のウイルス発現ベクターを、医薬組成物とし
て、すなわち、インビボ適用に適切な形で調製することが必要である。一般に、
これは、発熱物質並びにヒトまたは動物に有害であり得る他の不純物を実質的に
含まない組成物の調製を包含する。

【０１５２】 一般に、送達ベクターを安定にし、標的細胞による取り込みを可能とするため
に、適切な塩および緩衝液を使用することを望む。本発明の水性組成物は、医薬
的に許容される担体または水性媒体に溶解または分散させた、有効量のベクター
を含む。該組成物はまた、接種材料とも呼ばれる。「医薬的または薬理学的に許
容される」は、動物またはヒトに投与した場合に、副作用、アレルギー反応、ま
たは他の有害反応を起こさない分子実体および組成物を意味する。本明細書で使
用した「医薬的に許容される担体」は、任意および全ての溶媒、分散媒体、コー
ティング、抗菌剤および抗真菌剤、ら張化および吸収遅延剤らを含む。該媒体お
よび医薬的に活性な物質の薬剤の使用は、当分野で公知である。どの慣用的な媒
体または薬剤も本発明のベクターと不適合性でない限り、治療組成物におけるそ
の使用が考えられる。補充活性成分もまた組成物に取り込むことができる。

【０１５３】 本発明の活性組成物は、古典的な医薬製剤を含む。本発明に記載のこれらの組
成物の投与は、標的組織がその経路を介して可能である限り、任意の一般的な経
路を介する。これは、経口、鼻腔、頬側、直腸、膣、または局所を含む。別に、
投与は、正所、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射であり得る。該組
成物は、普通、上記した医薬的に許容される組成物として投与される。

【０１５４】 活性組成物は、非経口または注射を含む、任意の適切な経路を介して投与され
得る。遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒ
ドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水中で調製でき
る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混
合物および油中で調製できる。貯蔵および使用の普通の条件下で、これらの製剤
は、微生物の増殖を予防するために保存剤を含む。

【０１５５】 注射使用に適切な医薬形は、無菌水溶液または分散液並びに無菌注射溶液また
は分散液の即時調製のための無菌粉末を含む。全ての場合において、形は無菌で
なければならず、シリンジの易動性が存する程度まで液体でなければならない。
製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物
の汚染作用から保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、
ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエ
チレングリコールら）、適切なその混合物、および植物油を含む、溶媒または分
散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使
用により、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤
の使用により維持できる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌抗真菌剤、例えば
、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールらによ
りもたらすことができる。多くの場合、糖または塩化ナトリウムなどのら張化剤
を含めることが好ましい。注射組成物の延長吸収は、組成物における、モノステ
アリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの薬剤遅延物質の使用によりもたらす
ことができる。

【０１５６】 無菌注射溶液は、必要な量の活性化合物を、必要であれば、上記に列挙した様
々な他の成分と共に、適切な溶媒に取り込み、続いて濾過で滅菌することにより
調製される。一般に、分散液は、様々な無菌活性成分を、基本的な分散媒体およ
び上記に列挙したものからの必要な他の成分を含む無菌ベヒクルに取り込むこと
により調製される。無菌注射溶液調製用の無菌粉末の場合、好ましい調製法は、
活性成分と以前に無菌濾過したその溶液からの追加の所望の成分の粉末が得られ
る、真空乾燥および凍結乾燥技術である。

【０１５７】 経口投与のために、本発明のポリペプチドは、賦形剤と共に取り込まれ得、非
摂取うがい薬および歯磨剤の形で使用し得る。うがい薬は、必要量の活性成分を
、ホウ酸ナトリウム溶液（Ｄｏｂｅｌｌ'ｓ溶液）などの適切な溶媒に取り込ん で調製し得る。別に、活性成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび重炭酸
カリウムを含む、消毒洗浄液に取り込み得る。活性成分はまた、ゲル、ペースト
、粉末およびスラリーを含む、歯磨剤に分散し得る。活性成分は、治療有効量で
、水、結合剤、研磨剤、香味剤、起泡剤、湿潤剤を含み得る、ペースト状歯磨剤
に加え得る。

【０１５８】 本発明の組成物は、中性または塩形で製剤化され得る。医薬的に許容される塩
は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）を含み、これは
、塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸
らの有機酸を用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩はま
た、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または
鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン
、プロカインらの有機塩基から得ることができる。

【０１５９】 製剤化時に、溶液は、投与製剤に適合性の様式および治療的に有効な量で投与
する。製剤は、注射溶液、薬物放出カプセルらの様々な投与形で容易に投与され
る。水溶液の非経口投与のために、例えば、溶液は、必要であれば適切に緩衝化
し、液体希釈液は、最初に十分な食塩水またはグルコースを用いてら張性とする
。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適し
ている。

【０１６０】 「単位用量」は、適切な担体に分散された治療組成物の別個の量として定義さ
れる。例えば、本発明に従って、ウイルス用量は、特定数のウイルス粒子または
プラーク形成単位（ｐｆｕ）を含む。アデノウイルスに関与する実施形態につい
ては、特定の単位用量は、１０³、１０⁴、１０⁵、１０⁶、１０⁷、１０⁸、１０⁹ 、１０¹⁰、１０¹¹、１０¹²、１０¹³、または１０¹⁴ｐｆｕを含む。粒子用量は、
感染欠陥粒子の存在のために幾分高くあり得る（１０−１００倍）。

【０１６１】 これに関連して、使用できる無菌水性媒体は、本開示に照らして当業者には公
知である。例えば、単位用量は、１ｍｌのら張ＮａＣｌ溶液に溶解でき、１００
０ｍｌの大量皮下注射液体に加えるか、または提案された注入部位に注射できる
（例えば、「レミングトンの医薬科学」第１５版、ｐ．１０３５−１０３８およ
び１５７０−１５８０参照）。投与量の変動は、処置する被検者の状態に応じて
必然的に生じるだろう。投与に関与する人は、少なくとも、個体被検者のための
適切な用量を決定する。さらに、ヒト投与のために、製剤は、生物物質標準のＦ
ＤＡ局により必要とされる、無菌性、発熱物質性、一般的安全性および純度標準
を満たす。

【０１６２】 好ましい実施形態において、本発明は、ヒト悪性腫瘍の処置に関する。様々な
異なる投与経路が考えられる。例えば、古典的および典型的な療法は、個別の腫
瘍塊の直接的な腫瘍内注射を含む。注射は、単回または複数回であり得、複数回
注射は、近づける腫瘍表面に約１ｃｍの空間で行う。別に、直接的、局所的また
は局在的動脈内注射による腫瘍脈管構造の標的化が考えられる。局在的リンパ節
を含むリンパ系は、この経路に沿って転移の可能性があれば、別のあり得る標的
を提示する。さらに、全身注射は、特異的に第二（すなわち転移性）腫瘍を標的
化する場合には好ましくあり得る。

【０１６３】 別の実施形態において、ウイルス遺伝子療法は、腫瘍切除の前または後になし
得る。前以て、遺伝子療法は、事実、以前には不可能であった腫瘍切除を可能に
し得る。別に、特に有利な実施形態は、事前の腫瘍の切除（前以てウイルス遺伝
子療法を実施するまたは実施しない）、続く、切除した腫瘍床の処置を含む。こ
の続く処置は、微視的な残留疾病の削除に効果的であり、これは非処置であれば
、腫瘍の再増殖をもたらし得る。これは、腫瘍床を、ウイルスベクターの１回量
を含むウイルス製剤と共に漬けることにより、極めて簡単に達成され得る。続く
処置を達成する別の好ましい方法は、切除した腫瘍床のカテーテル法を介し、よ
って、手術後の長期間におよび、ウイルスと床を連続的に灌流することが可能と
なる。

【０１６４】 ＸＩ．実施例 以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含められる。以
下の実施例で開示した技術は、本発明の実践を十分に機能させるために本発明者
により発見された技術を提示し、従って、その実践に好ましい形態を構成すると
考えることができることを当業者は理解する。しかし、当業者は、本開示に照ら
して、多くの変化を、開示された特定の実施形態において実施でき、依然として
、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、同じまたは類似した結果を得
ることができることを理解する。

【０１６５】 実施例１：多重遺伝子アデノウイルス構築体の作成 数個の異なる遺伝子ベクターを、本発明に従って作成する。第一発現カセット
は、ｐＩＮ１４７にサブクローニングする前にプラスミドベクターに作成する（
図２）。プラスミドｐＩＮ１４７は、Ａｄ５の塩基１−４５６および３３３３−
５７８８およびＣＭＶ ＩＥプロモーターを含む。第一カセットは、第一遺伝子
、続いて、ＢＧＨポリＡシグナル、続いて次々と、ＳＶ４０プロモーター、第二
遺伝子および任意選択によりＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの順で含む。図１
Ａは、ベクター由来のＣＭＶ ＩＥプロモーターを有する得られた発現カセット
を示す。

【０１６６】 第二発現カセットは、ｐＩＮ１４７から得られた、唯１つのプロモーターであ
るＣＭＶ ＩＥプロモーターを使用する。このカセットでは、ＩＲＥＳは、第一
遺伝子および合成イントロン（ＩＶＳ）の下流および第二遺伝子およびポリＡの
上流に含まれる。図１Ｂは上流ｐＩＮ１４７プロモーターを含むカセットを示す
。ＩＲＥＳは、第二遺伝子の効率的翻訳を可能とし、ＩＶＳは、ｍＲＮＡの安定
性を向上させる。ＩＲＥＳおよびＩＶＳは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、パロアルト、カ
リフォルニアから入手可能なプラスミドから得られる。

【０１６７】 カセットを、ｐＩＮ１４７の多目的クローニング部位に挿入した後、組換えベ
クターを、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（トロント、オンタリオ
、カナダ）から入手可能な、ｐＢＧＨ１０またはｐＢＧＨ１１のいずれかを用い
て同時トランスフェクトする。これらのプラスミドは、Ａｄ５の塩基１−１８７
および１３４０−３５９３５、Ｅ３領域の少ない欠失（２８１３３−３０８１８
および２７８６５−３０９９５およびそれぞれ）を含む。組換えにより、Ｅ１領
域の多重遺伝子カセットを含み、Ｅ３欠失を有する、アデノウイルスベクターが
製造される。

【０１６８】 追加の構築体は異なるアプローチを使用する。図１Ａおよび図１Ｂに示した全
エレメントを含むカセットを使用して、構築体を、カセットを、多目的クローニ
ング部位にフランキングする、Ａｄ５の塩基２２−３４２および３５２３−５７
９０を含む、ｐΔＥ１ｓｐ１ＡおよびｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）（図３）に挿入することにより製造する。ｐＢＧＨ１０
またはｐＢＧＨ１１を用いた同時トランスフェクションにより、Ｅ１挿入カセッ
トおよびＥ３欠失を有するアデノウイルスベクターの組換えおよび製造が可能と
なる。

【０１６９】 ２つの発現カセットを含むアデノウイルスベクターを製造する別の作成スキー
ムにおいて、発現カセットを、プラスミドｐＡＢ２６（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ社）（図４）のアデノウイルスＥ３領域にクローン化し、Ｅ１
領域にクローン化した発現カセット（Ａｄ５発現カセット１番と呼ぶ）を含むＳ ｒｆＩ 消化アデノウイルスＤＮＡを、２９３細胞に同時トランスフェクトし、ウ
イルス粒子をインビボ組換えの結果として製造する。

【０１７０】 この作成スキームを開始するために、Ａｄ５発現カセット１番ベクターを、Ｅ
１領域にクローン化した発現カセット１番を含むｐＩＮ１４７、および、Ｅ１領
域の挿入断片を含む全アデノウイルスゲノムを含むｐＪＭ１７の、２９３細胞へ
の同時トランスフェクションにより作成する。プラーク精製後、ウイルス増殖お
よび続くアデノウイルスＤＮＡ精製、Ａｄ５発現カセット１番ＤＮＡを、制限酵
素ＳｒｆＩで消化し、制限断片を、アガロースゲル電気泳動により分離し、約２
８ｋｂ（またはアデノウイルスゲノムのほぼ７８％）に対応するバンドをアガロ
ースゲルで精製する。プラスミドｐＡＢ２６は、塩基１−３５３、３８２５−５
７８７、および２４７９７−３５９３５に対応するＡｄ５配列からなる。

【０１７１】 発現カセットを、ｐＡＢ２６内に存在するアデノウイルスＥ３マルチクローニ
ングサイトにクローン化し、よって、ｐＡＢ２６発現カセット２番と呼ぶ。２８
ｋｂのＳｒｆＩ消化Ａｄ５発現カセット１番ＤＮＡとｐＡＢ２６発現カセット２
番プラスミドの２９３細胞への同時トランスフェクション、並びに続くインビボ
組換えにより、一方はアデノウイルスゲノムのＥ１領域に、他方はＥ３にある、
２つの発現カセットを含む、アデノウイルスベクターを製造する。

【０１７２】 実施例２：増殖阻害およびアポトーシスのインビトロ監視 アポトーシスアッセイ ＤＮＡ断片化分析：細胞を遺伝子療法構築体と共にインキュベートした後、細
胞を収集し、３ｍｌの抽出緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、０．１Ｍ Ｅ
ＤＴＡ、２０μｇ／ｍｌＲＮＡアーゼ、０．５％ＳＤＳ）を加えた３００μｌの
ＰＢＳ中に再度懸濁し、３７℃で１−２時間インキュベートした。インキュベー
ト終了時に、プロテイナーゼＫを、最終濃度１００μｇ／ｍｌまで加え、溶液を
、少なくとも３時間５０℃の水浴に置いた。ＤＮＡを、フェノールで飽和させた
ら量の０．５Ｍトリス（ｐＨ８．０）で１回抽出し、その後、抽出物を、フェノ
ール／クロロホルムで反復した。沈降ＤＮＡを１％アガロースゲルで分析する。

【０１７３】 細胞固定。ＴＵＮＥＬ法のために、細胞を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１％ホル
ムアルデヒドに３０分間氷上で固定する。その後、細胞を３ｍｌのＰＢＳで洗浄
し、７０％の氷冷エタノールに再度懸濁し、使用するまで−２０℃で貯蔵する。
細胞周期分析のために、細胞を７０％氷冷エタノールのみに固定する。

【０１７４】 末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼアッセイ。アッセイは、Ｇｏ
ｒｃｚｙｃａらの方法（Ｇｏｒｃｚｙｃａら、１９９３）に従って実施する。簡
潔には、固定および洗浄後、細胞を、０．２Ｍカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．
０）、２．５ｍＭトリス−ＨＣｌ、２．５ｍＭ Ｃ₀Ｃｌ₂（シグマケミカル社、
セントルイス、ミズーリ）、０．１ｍＭ ＤＴＴ（シグマケミカル社）、０．２
５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（シグマケミカル社）、５単位の末端トランスフェラーゼ
（ベーリンガーマンハイムバイオケミカルズ、インディアナポリス、インディア
ナ）、および０．５ｎｍｏｌのビオチン−１６−ｄＵＴＰを、２０μＭの濃度の
ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰと共に含む、５０μｌのＴｄＴ緩衝液に再度
懸濁する。対照を、ｄ−ＵＴＰの非存在下で、各試験サンプルの別々のアリコー
トをインキュベートすることにより調製する。細胞を、３７℃で３０分間インキ
ュベートし、ＰＢＳ中で濯ぎ、４×ＳＳＣ、０．１％トリトンＸ−１００および
２．５μｇ／ｍｌ蛍光化アビジン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ．社、バーリンゲー
ム、カリフォルニア）を含む染色溶液のＦＩＴＣ１００μｌ中に再度懸濁する。
チューブを、室温で暗闇で３０分間インキュベートする。細胞を０．１％トリト
ンＸ−１００を含むＰＢＳ中で濯ぎ、ヨウ化プロピジウム（５μｇ／ｍｌ）およ
び７０μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）ＲＮＡアーゼを含む０．５ｍｌＰＢＳに再度懸濁す
る。チューブを、フローサイトメトリー分析前に、暗闇で氷上で３０分間インキ
ュベートする。

【０１７５】 フローサイトメトリー分析。サンプルを、標準的な光学配置を用いてＥＰＩＣ
ＳプロフィルＩＩフローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ社、ハイアリーア、フ
ロリダ）を使用して分析する。各サンプルについて少なくとも５，０００事象を
集める。ＴｄＴ末端標識陽性を、エリートワークステーションソフトウェア（Ｃ
ｏｕｌｔｅｒ社、ハイアリーア、フロリダ）の免疫−４プログラムを使用して試
験ヒストグラムから対照ヒストグラムを差し引くことにより決定する。

【０１７６】細胞増殖アッセイ 細胞増殖は、細胞計測またはトリチウム化チミジン取り込みアッセイにより測
定できる。

【０１７７】 細胞計測による増殖アッセイ 細胞増殖測定のために、細胞を、一般に、１２ウェルプレートで１×１０⁴細 胞の密度で接種する。細胞をトリチウム化し、血球計を使用して計測する。

【０１７８】 トリチウム化チミジン取り込みアッセイ 細胞の増殖は、ＤＮＡ合成の分析により測定できる。簡潔には、１００μＣｉ
／ｍｌの³Ｈ−チミジン（アマシャム）の原液を、高グルコースＤＭＥＭに希釈 することにより調製する。最終濃度１μＣｉ／ｍｌまでの³Ｈ−チミジンを、２ ０μｌ中の各ウェルに加える。反応を、レシピエント細胞から上清を除去するこ
とにより、６または１５時間後に停止する。細胞を１００×トリプシン／ＥＤＴ
Ａを、各ウェルに５分間室温で添加することにより収集する。細胞を、製造業者
のプロトコルに従って、パッカードフィルターメート細胞収集器を使用して集め
、蒸留脱イオン水およびメタノール中で洗浄する。別に、反応はまた、レシピエ
ント細胞から上清を除去することにより停止でき、細胞を、ＰＢＳ＋０．５ｍＭ
ＭｇＣｌ₂／１ｍＭ ＣａＣｌ₂で１回洗浄し、３０μｌ溶解緩衝液（０．０５
％ＳＤＳ／１ｍＭ ＭｇＣｌ₂／１ｍＭ ＣａＣｌ₂）を加える。細胞を断片化し
、ワットマンろ紙に吸収させ、非特異的放射活性をＴＣＡで洗浄して除去する。
フィルターを５ｍｌシンチラントに入れ、ガンマカウンターで計測する。ＤＮＡ
への活性取り込み率は、細胞増殖の指標である。

【０１７９】 本明細書で開示および請求した全ての組成物および／または方法は、本開示に
照らして過度の実験を行うことなく、実施および実行できる。本発明の組成物お
よび方法は、好ましい実施形態について記載したが、当業者には、変更が、組成
物および本明細書に記載の段階または段階系列に、本発明の概念、精神および範
囲から逸脱することなく適用され得ることは明らかであろう。より具体的には、
化学的および生理学的の両方に関連したある薬剤を、本明細書で記載した薬剤と
置換し得、同じまたは類似の結果が得られることは明らかであろう。当業者には
明らかである全てのかかる類似の置換および修飾は、添付の特許請求の範囲によ
り定義される本発明の精神、範囲および概念内にあると判断される。

【０１８０】 （参考文献） 以下の参照文献は、本明細書に示される方法及び詳記を補足する例示的な方法
及び詳記の程度で、引用することにより、本明細書に特に組み込まれるものとす
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【図面の簡単な説明】

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある態様をさらに実証するた
めに含まれる。本発明は、本明細書に提示した特定の実施形態の詳細な説明と組
合せて、１つ以上のこれらの図面を参考にすることによりより良く理解され得る
。

【図１】 図１Ａおよび図１Ｂ−多重遺伝子構築体。図１Ａ：単一カセット、複数のプロ
モーター構築体；図１Ｂ：単一、カセット、単一プロモーター構築体。

【図２】 クローニングベクターｐＩＮ１４７。

【図３】 クローニングベクター（群）ｐΔＥ１ｓｐ１Ａ／Ｂ。

【図４】 多重カセット構築体ｐＡＢ２６。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 チャダ，スニル アメリカ合衆国テキサス州77459，ミズー リ・シティ，ウォーターヴュー・コート 4007 (72)発明者 ザムスタイン，ルイス・エイ アメリカ合衆国テキサス州77019，ヒュー ストン，ヴァーモント・ストリート 1912 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA08 BA10 BA11 BA14 BA24 BA25 BA26 BA27 BA28 BA30 BA38 BA80 CA02 DA03 EA02 EA04 FA02 GA13 HA17 4C084 AA13 ZB262

Claims (45)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）腫瘍サプレッサーおよびサイトカイン、腫瘍サプレッ
   サーおよび酵素、腫瘍サプレッサーおよびアンチセンス発癌遺伝子、腫瘍サプレ
   ッサーおよび毒素、サイトカインおよび毒素、サイトカインおよびアンチセンス
   発癌遺伝子、アンチセンス発癌遺伝子、毒素および酵素および毒素、腫瘍サプレ
   ッサーおよびアポトーシスの誘導物質、サイトカインおよびアポトーシスの誘導
   物質、アンチセンス発癌遺伝子およびアポトーシスの誘導物質、酵素およびアポ
   トーシスの誘導物質、および毒素およびアポトーシスの誘導物質からなる群から
   選択された少なくとも２つの異なる遺伝子と、 （ｂ）上記の異なる遺伝子の５'に位置する、真核細胞において活性な第一プロ モーターと を含む発現構築体。
2. 【請求項２】 上記構築体はさらに内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を
   含み、ここで該ＩＲＥＳは、上流遺伝子の３'および下流遺伝子の５'に位置する
   、請求項１の構築体。
3. 【請求項３】 上記構築体はさらに第二プロモーターを含み、ここで該第二
   プロモーターは、上流遺伝子の３'および下流遺伝子の５'に位置する、請求項１
   の構築体。
4. 【請求項４】 上記構築体は、腫瘍サプレッサーおよびサイトカインを含む
   、請求項１の構築体。
5. 【請求項５】 上記構築体は、腫瘍サプレッサーおよび酵素を含む、請求項
   １の構築体。
6. 【請求項６】 上記構築体は、腫瘍サプレッサーおよびアンチセンス発癌伝
   子を含む、請求項１の構築体。
7. 【請求項７】 上記構築体は、腫瘍サプレッサーおよび毒素を含む、請求項
   １の構築体。
8. 【請求項８】 上記構築体は、サイトカインおよび毒素を含む、請求項１の
   構築体。
9. 【請求項９】 上記構築体は、サイトカインおよびアンチセンス発癌遺伝子
   を含む、請求項１の構築体。
10. 【請求項１０】 上記構築体は、アンチセンス発癌遺伝子および毒素を含む
    、請求項１の構築体。
11. 【請求項１１】 上記構築体は、酵素および毒素を含む、請求項１の構築体
    。
12. 【請求項１２】 上記構築体は、腫瘍サプレッサーおよびアポトーシスの誘
    導物質を含む、請求項１の構築体。
13. 【請求項１３】 上記構築体は、サイトカインおよびアポトーシスの誘導物
    質を含む、請求項１の構築体。
14. 【請求項１４】 上記構築体は、アンチセンス発癌遺伝子およびアポトーシ
    スの誘導物質を含む、請求項１の構築体。
15. 【請求項１５】 上記構築体は、酵素およびアポトーシスの誘導物質を含む
    、請求項１の構築体。
16. 【請求項１６】 上記構築体は、毒素およびアポトーシスの誘導物質を含む
    、請求項１の構築体。
17. 【請求項１７】 上記腫瘍サプレッサーは、ｐ５３、ｐ１６、ｐ２１、Ｒｂ
    、ｐ１５、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｚａｃ１、ｐ７３、ＭＭＡＣ１、ＡＴＭ、
    ＨＩＣ−１、ＤＰＣ−４、ＦＨＩＴ、ＮＦ２、ＡＰＣ、ＤＣＣ、ＰＴＥＮ、ＩＮ
    Ｇ１、ＮＯＥＹ１、ＮＯＥＹ２、ＰＭＬ、ＯＶＣＡ１、ＭＡＤＲ２、ＷＴ１、５
    ３ＢＰ２、ＩＲＦ−１およびＣ−ＣＡＭからなる群から選択される、請求項１の
    構築体。
18. 【請求項１８】 上記サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、Ｉ
    Ｌ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、
    ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＴＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ
    −ＣＳＦ、β−インターフェロンおよびγ−インターフェロンからなる群から選
    択される、請求項１の構築体。
19. 【請求項１９】 上記酵素は、シトシンデアミナーゼ、アデノシンデアミナ
    ーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ガラクト
    ース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラ
    ーゼ、グルコセレブロシダーゼ、コラゲナーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、α−
    Ｌ−イズロニダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＨＳＶチミジ
    ンキナーゼおよびヒトチミジンキナーゼからなる群から選択される、請求項１の
    構築体。
20. 【請求項２０】 上記発癌遺伝子は、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅ ｒｂ 、ｓｒｃ、ｆｍｓ、ｊｕｎ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｈｓｔ、ｇｓｐ、ｂｃｌ−２ およびａｂｌからなる群から選択される、請求項１の構築体。
21. 【請求項２１】 上記毒素は、リシンＡ鎖、ジフテリア毒素、百日咳、シュ
    ードモナス、Ｅ．コリエンテロトキシン、およびコレラ毒素からなる群から選択
    される、請求項１の構築体。
22. 【請求項２２】 上記アポトーシスの誘導物質は、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ
    −Ｘ_s、Ｂｉｋ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｈａｒａｋｉｒｉ、ＴＲＡＩＬ、ＳＡＲＰ− ２、ＡｄＥ１ｂおよびＩＣＥ−ＣＥＤ３プロテアーゼからなる群から選択される
    、請求項１の構築体。
23. 【請求項２３】 上記第一プロモーターは、ＣＭＶ ＩＥ、ＳＶ４０ ＩＥ
    、ＲＳＶ、β−アクチン、ヒトユビキチンＣ、テトラサイクリン調節物およびエ
    クジソン調節物からなる群から選択される、請求項２の構築体。
24. 【請求項２４】 上記第二プロモーターは、ＣＭＶ ＩＥ、ＳＶ４０ ＩＥ
    、ＲＳＶ、β−アクチン、ヒトユビキチンＣ、テトラサイクリン調節物およびエ
    クジソン調節物からなる群から選択される、請求項２の構築体。
25. 【請求項２５】 下流遺伝子の３'に位置するポリアデニル化シグナルを含 む、請求項２の構築体。
26. 【請求項２６】 （ｉ）上流遺伝子の３'および下流遺伝子の５'に位置する
    第一ポリアデニル化シグナルおよび（ｉｉ）下流遺伝子の３'に位置する第二ポ リアデニル化シグナルを含む、請求項２５の構築体。
27. 【請求項２７】 上記ポリアデニル化シグナルは、ＢＧＨ、チミジンキナー
    ゼまたはＳＶ４０由来である、請求項２５の構築体。
28. 【請求項２８】 上記第一ポリアデニル化シグナルは、ＢＧＨまたはＳＶ４
    ０由来であり、上記第二ポリアデニル化シグナルは、上記第一ポリアデニル化シ
    グナルがＳＶ４０由来である場合、ＢＧＨ由来であり、上記第二ポリアデニル化
    シグナルは、上記第一ポリアデニル化シグナルがＢＧＨ由来である場合、ＳＶ４
    ０由来である、請求項２６の構築体。
29. 【請求項２９】 上記発現構築体は、ウイルスベクターである、請求項１の
    構築体。
30. 【請求項３０】 上記ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイル
    ス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴
    ウイルスからなる群から選択される、請求項２９の構築体。
31. 【請求項３１】 上記ウイルスベクターはレトロウイルスである、請求項３
    ０の構築体。
32. 【請求項３２】 上記ウイルスベクターはアデノウイルスである、請求項３
    ０の構築体。
33. 【請求項３３】 上記ウイルスベクターはワクシニアウイルスである、請求
    項３０の構築体。
34. 【請求項３４】 上記ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスである、請求
    項３０の構築体。
35. 【請求項３５】 上記ウイルスベクターはヘルペスウイルスである、請求項
    ３０の構築体。
36. 【請求項３６】 上記アデノウイルスベクターは複製欠損である、請求項３
    ２の構築体。
37. 【請求項３７】 上記アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域の少なくとも一
    部を欠失している、請求項３６の構築体。
38. 【請求項３８】 上記アデノウイルスは、Ｅ１Ｂ領域の少なくとも一部を欠
    失している、請求項３７の構築体。
39. 【請求項３９】 上記アデノウイルスは、全Ｅ１領域を欠失している、請求
    項３８の構築体。
40. 【請求項４０】 （ａ）サイトカイン遺伝子および酵素遺伝子、および （ｂ）上記遺伝子の５'に位置する真核細胞で活性な第一プロモーターを含む発 現構築体であって、 （ｉ）上記サイトカイン遺伝子はＩＬ−２遺伝子ではないか、または（ｉｉ）上
    記酵素はヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子ではない、上記構築体。
41. 【請求項４１】 細胞において２つのポリペプチドを同時発現させる方法で
    あって、 （ａ）（ｉ）腫瘍サプレッサーおよびサイトカイン、腫瘍サプレッサーおよび酵
    素、腫瘍サプレッサーおよびアンチセンス発癌遺伝子、腫瘍サプレッサーおよび
    毒素、サイトカインおよび毒素、サイトカインおよびアンチセンス発癌遺伝子、
    アンチセンス発癌遺伝子、毒素および酵素および毒素、腫瘍サプレッサーおよび
    アポトーシスの誘導物質、サイトカインおよびアポトーシスの誘導物質、アンチ
    センス発癌遺伝子およびアポトーシスの誘導物質、酵素およびアポトーシスの誘
    導物質、毒素およびアポトーシスの誘導物質からなる群から選択された少なくと
    も２つの異なる遺伝子と、 （ｉｉ）上記の異なる遺伝子の５'に位置する真核細胞で活性な第一プロモータ ーと を含む発現構築体を提供し、 （ｂ）上記発現構築体を上記細胞に移行し、よって上記遺伝子の発現を行うこと
    を含む上記方法。
42. 【請求項４２】 上記発現構築体はウイルスベクターであり、上記移行は、
    ウイルス感染により達成される、請求項４１の方法。
43. 【請求項４３】 上記発現構築体は、リポソームで製剤化され、上記移行は
    、上記リポソームの細胞取り込みにより達成される、請求項４１の方法。
44. 【請求項４４】 上記細胞は腫瘍細胞であり、上記細胞は上記異なる遺伝子
    の発現により殺滅される、請求項４１の方法。
45. 【請求項４５】 上記腫瘍細胞は、前立腺癌細胞、肺癌細胞、脳癌細胞、皮
    膚癌細胞、肝臓癌細胞、乳癌細胞、リンパ癌細胞、胃癌細胞、精巣癌細胞、卵巣
    癌細胞、膵臓癌細胞、骨癌細胞、骨髄癌細胞、頭頸癌細胞、子宮頸癌細胞、結腸
    癌細胞、血液癌細胞、食道癌細胞、眼癌細胞、胆嚢癌細胞、腎臓癌細胞、直腸癌
    細胞、副腎癌細胞および心臓癌細胞からなる群から選択される、請求項４４の方
    法。