JPH11503910A

JPH11503910A - アデノウイルスヘルパーウイルスシステム

Info

Publication number: JPH11503910A
Application number: JP8531882A
Authority: JP
Inventors: ザン，ウェイ−ウェイ; アレマニー，レイモン
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 1995-04-17
Filing date: 1996-04-17
Publication date: 1999-04-06
Also published as: AU5551996A; DE69628744D1; ATE243260T1; EP0821739A1; CA2218610A1; EP0821739B1; WO1996033280A1

Abstract

(57)【要約】複製欠損アデノウイルスベクター中の36kBまでの異種DNAを発現し得るアデノウイルスヘルパーウイルス系が開示される。この系はアデノウイルスベクター構築物、１つまたはそれ以上のヘルパーウイルス、およびヘルパー細胞株を含む。このベクター構築物は、欠損パッケージングシグナルを含むヘルパーウイルスと同時感染された場合、ヘルパー細胞中で、複製されそしてビリオン粒子中へパッケージングされる。特に、このヘルパー細胞は、アデノウイルス５ゲノム(Ad5)の１つまたはそれ以上の「初期」コード領域由来のDNAを発現し、そして１つまたはそれ以上のヘルパーウイルスは、Ad5ゲノムの１つまたはそれ以上の「初期」コード領域および後期コード領域の全て由来のDNAを発現し、これはベクターの相当する領域における変異を相補する。また異種DNA含有ベクターの哺乳動物細胞中への移入の方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】アデノウイルスヘルパーウイルスシステム発明の背景１．発明の分野本発明は概して、ウイルスベクター、ヘルパーウイルス、ならびに哺乳動物細胞において外来DNAを発現させるためのこのようなウイルスベクターおよびヘルパーウイルスの使用の分野に関する。本発明はまた、遺伝子治療、特定すると、遺伝物質を特定の組織にインビボで輸送するためのウイルスベクターを包含する遺伝子治療の分野に関する。より特定すると、本発明は、（i）大量のアデノウイルスゲノムを異種DNAで置換するためのアデノウイルスの遺伝子操作、（ii）ヘルパー細胞株およびベクター中の複製欠損を相補する１つ以上のヘルパーウイルスを用いるアデノウイルスベクターの増殖および(iii)いくつかの疾患のために治療的である異種、非アデノウイルス産物を発現させるためのこのようなベクターでの哺乳動物細胞の感染に関する。２．関連技術の説明遺伝子治療は、多くの疾患および障害の処置のための魅力的な代替物を提供する領域である。特に、ウイルスが細胞に入り、そしてその遺伝物質を宿主細胞中で発現する能力は、喪失したまたは欠損した遺伝子機能をインビボで置換する可能性を生じさせる。しかし、遺伝子治療が成功するためには、高い治療指数、大きな許容量、標的化された遺伝子送達および組織特異的遺伝子発現の特性を有する新たなベクターの必要性が存在する。しかし、ベクターが有する、それに伴われる細胞傷害性または遺伝子毒性のために、現在利用可能な遺伝子移入ベクターは、高い治療指数の必要性を満たし得ない（Mulligan，1993）。多重かつ標的化された遺伝子移入が、ガンのための遺伝子治療に特に関連する（Friedmann，1992）。最近の10年間を通して、オンコジーンおよび腫瘍抑制遺伝子の研究により、ガンが複数の細胞遺伝学的障害のプロセスを介して発達する疾患であるという、ますます多くの証拠が明らかとなった（Chiaoら、1990；Lev ine，1990；Weinberg，1991；Sugimuraら、1992）。この発ガンの概念に基づいて、新たなストラテジーが、従来のガン治療に対する代替物として、迅速に開発された（Renan，1990；Lotzeら、1992；Pardoll，1992）。これらの１つは、遺伝子治療である（Friedmann，1989）。この遺伝子治療において、腫瘍抑制遺伝子、アンチセンスオンコジーン、および他の関連遺伝子が治療的遺伝子として使用される。最大の治療効果を達成するために、単一のより高い許容量のベクターによる、ガン細胞への、これらの治療的遺伝子の組み合わせの標的化された送達が重要であると考えられている。不運なことに、現在利用可能なベクター技術のベクターは、この点において制限されている。アデノ随伴ウイルス（AAV）が、遺伝子移入系として最近開発された。野生型A AVは、高い感染性および宿主細胞ゲノム中への組み込みにおける高い特異性を有する（HermonatおよびMuzyczka，1984；Lebkowskiら、1988）。しかし、実験データにより、組換えAAVが低い力価を有し、そしてそれらの組み込みの特異性を失う傾向にあることが示された（Samulskiら、1989）。また、AAVについての最大遺伝子運搬許容量は、５kBより低い（Walshら、1992）。アデノウイルス（Ad）は、広範に研究されており、そして真核生物遺伝子発現のモデル系として十分に特徴付けされている。Adは増殖および操作が容易であり、そしてAdはインビトロおよびインビボにおいて広い宿主域を示す。この群のウイルスは、高い力価（例えば、10⁹〜I0¹¹プラーク形成単位（PFU）/ml）で得られ得、そしてこれらは高度に感染性である。しかし、アデノウイルスは、いかなる重大な病状とも関連していない。 Adの生活環は、宿主細胞ゲノムへの組み込みを必要としない。Adベクターにより送達される外来遺伝子は、エピソームで発現され、そしてそれゆえ、宿主細胞に対する低い遺伝子毒性を有する。Adは、比較的軽い疾患にのみ関連しているようである。なぜなら、ヒト悪性疾患のAd感染との既知の関連は存在しないからである。さらに、野生型Adを用いるワクチン接種の研究において、副作用は報告されなかった（Couchら、1963；Topら、1971）。このことは、インビボ遺伝子移入ベクターとしてのそれらの安全性および治療的潜在能を実証する。 Adベクターは、真核生物遺伝子発現（Levreroら、1991；Gomez-Foixら、1992 ）およびワクチン開発（GrunhausおよびHorwitz，1992；GrahamおよびPrevec，1 992）においてうまく使用された。最近、動物研究により、組換えAdが遺伝子治療のために使用され得ることが実証された（Stratford-PerricaudetおよびPrric audet，1991；Stratford-Perricaudetら、1990；Richら、1993）。組換えAdの異なる組織への投与における成功した実験は、気管点滴注入（Rosenfeldら、1991 ；Rosenfeldら、1992）、筋肉注射（Ragotら、1993）、末梢静脈内注射（HerzおよびGerard，1993）、および脳中への定位的接種（Le Gal La Salleら、1993）を包含する。現在のAdベクターの生成および増殖は、293と称する特有のヘルパー細胞株に依存する。この細胞は、ヒト胚腎臓細胞からアデノウイルス血清型５（Ad5）DNA フラグメントによりトランスフォームされ、そして構成的にE1タンパク質を発現する（Grahamら、1977）。E3領域はAdゲノムに必ずしも必要ではないので（Jone sおよびShenk,1978）、現在のAdベクター（293細胞の補助を伴う）は、E1、E3または両方の領域のいずれかにおいて外来DNAを有する（GrahamおよびPrevec，199 1；Bettら、1994）。事実、Adは野生型ゲノムの約105％をパッケージングし得（Ghosh-Choudhuryら、1987）、これは余分の約２kBのDNAのための許容量を提供する。E1およびE3領域における置換可能な約5.5 kBのDNAと合わせると、現在のAdベクターの最大許容量は、7.5 kB、またはベクターの全長の約15％より低い。異種DNAのさらなる挿入を妨げることに加えて、Adゲノムの残りの80％は、ベクターが有する細胞傷害性の供給源である。また、E1欠損ウイルスにおける複製欠損は不完全であり、そしてウイルス遺伝子発現の漏出が、高感染多重度において、現在利用可能なAd ベクターについて観察された（Mulligan，1993）。現在利用可能なアデノウイルスベクターについての別の問題は、組換えによる野生型ウイルスの生成の潜在性である。これは、現在のAdベクターの左末端が29 3細胞中のE1フラグメントと重複する約1.5 kBの配列（9.8〜14マップ単位）を含むので生じ得る（Grahamら、1977）。野生型ウイルスを生成する相同組換えが、 E1置換ベクターが293細胞において大規模に増幅された場合に、検出可能であった（私信、Richard Gregory博士、CANJI，Inc.，San Diego，CA）。それゆえ、高い治療指数、異種DNAのための大きな運搬許容量、ならびに標的化された遺伝予送達および組織特異的発現の能力を有するアデノウイルスベクター系についての当面の必要性がなお存在する。このようなベクター系は、広範な種々のインビボおよびインビトロ適用（例えば、遺伝子治療プロトコル、哺乳動物細胞培養物における有用タンパク質産物の産生、遺伝子移入マーカーとして、または特定の細胞株における遺伝的欠損の診断のために）における有用性を有する。発明の要旨本発明は、先行技術に固有のこれらおよび他の欠点を、アデノウイルスの領域がベクターから除去され、そしてトランスでヘルパーウイルスにより提供される、アデノウイルス「ヘルパーウイルス」系を提供することにより、克服しようと努める。多遺伝子欠失を有するベクターは、組換え遺伝物質を運搬する極めて大きな能力を有する。本発明の１つの目的は、ヘルパー細胞株とともに、全ての重要なアデノウイルス機能をトランスで提供し得るヘルパーウイルスの開発である。95％より多くのアデノウイルスゲノムの置換を支持することにより、細胞株およびヘルパーウイルスは、アデノウイルス逆方向末端反復（ITR）およびパッケージングシグナル以外の全てを欠いたベクターの構築および増殖を可能する。次に、このことは、ベクター中への35 kBまでの異種DNAの取り込みを可能にし、そしてアデノウイルス遺伝子産物の発現から細胞傷害性を減少させる。これらの目的を満足させるにおいて、単離されたアデノウイルスベクターが提供される。ここで、このベクターはアデノウイルス逆方向末端反復およびアデノウイルスパッケージングシグナルを含むが、（i）アデノウイルス産物E1A、E1B およびE3；および(ii)E2、E4、L1、L2、L3、L4およびL5からなる群から選択される少なくとも１つのアデノウイルス産物に対するコード領域の少なくとも一部を欠いている。好ましい実施態様において、ベクターは全てのアデノウイルスコード領域を欠いている。このようなベクターは約10、15、20、30または35 kBの外来DNAを運搬し得る。別の実施態様において、単離されたアデノウイルスベクターが提供される。ここで、このベクターはアデノウイルス逆方向末端反復およびアデノウイルスパッケージングシグナル、ならびに非機能的、非免疫原性形態の(i)アデノウイルス産物E1A、E1BおよびE3；ならびに(ii)E2、E4、L1、L2、L3、L4およびL5からなる群から選択される少なくとも１つのアデノウイルス産物を含む。また単離されたアデノウイルスヘルパーウイルスが提供される。ここで、このウイルスは、（i）アデノウイルス末端反復；（ii）アデノウイルスパッケージング配列；および(iii)アデノウイルス産物E1A、E1B、E2、E3、E4、L1、L2、L3 、L4およびL5の少なくとも１つに対するコード領域を含む。別の実施態様において、単離されたアデノウイルスヘルパーウイルスが提供される。ここで、このウイルスは、（i）アデノウイルス末端反復；（ii）野生型アデノウイルスパッケージング配列よりも低い効率で利用される変異したアデノウイルスパッケージング配列；および(iii) アデノウイルス産物E1A、E1B、E2、E3、E4、L1、L2、L3 、L4およびL5の少なくとも１つに対するコード領域を含む。さらに別の実施態様において、（a）アデノウイルス産物E1A、E1BおよびE3ならびに(b)E2、E4、L1、L2、L3、L4およびL5からなる群から選択される少なくとも１つのアデノウイルス産物に対するコード領域の少なくとも一部を欠いているアデノウイルスベクターの増殖方法であって、以下の工程： (i) E1AおよびE1Bのアデノウイルス産物により提供される機能が欠損したアデノウイルスの増殖について許容性の細胞を提供する工程； (ii) 上記パート(b)に記載のアデノウイルス産物（単数または複数）の非存在を相補するアデノウイルスヘルパーウイルスを提供する工程； (iii)上記ベクターおよび上記ヘルパーウイルスを上記細胞に運搬する工程；および (iv) 上記細胞を上記ベクターの複製を許容する条件下でインキュベートする工程、を包含する、方法が提供される。なおさらに別の実施態様において、哺乳動物細胞における遺伝子の発現方法であって、以下の工程： (i) (a)アデノウイルス産物E1A、E1BおよびE3ならびに(b)E2、E4、L1、L2、L3、 L4およびL5からなる群から選択される少なくとも１つのアデノウイルス産物に対するコード領域の少なくとも一部を欠いているアデノウイルスベクターを提供する工程であって、ここで欠失したコード領域がこの遺伝子をコードする異種DNA により置換されている工程； (ii) 上記ベクターを上記ベクターの感染性形態での複製およびパッケージングに対して許容性である条件下で増殖させる工程； (iii)感染性形態で増殖されたベクターを単離する工程； (iv) 上記感染性形態の上記ベクターを上記哺乳動物細胞と接触させる工程；および (v) 上記哺乳動物細胞を上記外来遺伝子が発現されるような条件下でインキュベートする工程、を包含する方法が提供される。さらなる実施態様において、哺乳動物細胞における遺伝子の発現の阻害方法であって、以下の工程： (i) (a)アデノウイルス産物E1A、E1BおよびE3ならびに(b)E2、E4、L1、L2、L3、 L4およびL5からなる群から選択される少なくとも１つのアデノウイルス産物に対するコード領域の少なくとも一部を欠いているアデノウイルスベクターを提供する工程であって、ここで欠失したコード領域がこの遺伝子のアンチセンス形態をコードする異種DNAにより置換されている工程； (ii) 上記ベクターを上記ベクターの感染性形態での複製およびパッケージングに対して許容性である条件下で増殖させる工程； (iii)感染性形態で増殖されたベクターを単離する工程； (iv) 上記感染性形態の上記ベクターを上記哺乳動物細胞と接触させる工程；および (v) 上記哺乳動物細胞を上記遺伝子の上記アンチセンス転写物が合成されるような条件下でインキュベートする工程、を包含する方法が提供される。図面の簡単な説明以下の図面は、本明細書の一部を形成し、そして本発明の特定の局面をさらに示すことが含まれる。本発明は、本明細書中に示される特定の実施態様の詳細な説明と組合わせてこれらの図面の１つ以上を参照してより良く理解され得る。図１．この図は、Ad5ゲノムの構造を示す。ゲノムは100マップ単位(mu)に分けられる。白矢印は、初期(Ｅ)転写を示し、そして黒矢印は後期(Ｌ)転写を示す。転写方向は矢印により示される。矢印内のギャップは介在配列を示す。線影付けの四角は、主要後期プロモーターおよび三部分リーダー配列(MLP/TL)の位置を示す。括弧内の数字はマップ単位を示す。図２．この図は、異種の発現カセットを含む欠損アデノウイルスベクターを産生するための一般的な模式図を示す。簡単には、E3-アデノウイルスの左由来の大きなフラグメントを、E4-アデノウイルスの右末端と共に、E4発現細胞株にコトランスフェクトする。得られたウイルスdlE3E4を、ClaIで消化し、E3およびE4 欠失を有するゲノムの右末端を含むフラグメントを産生する。E1シャトルベクターは、左ITRおよびパッケージングシグナル(0〜1.25マップ単位)、発現カセットの挿入のための複数のクローニング部位、ならびに相同組換えを可能にするためのマップ単位11.2〜16を含む。E4ミニウイルスは、左ITR、パッケージングシグナルおよび右ITRを有する完全なE4領域（90〜100マップ単位）を含む。E4ミニウイルスとdlE3E4との間の相同組換えを妨げるために、これらの構築物を、E4領域（90マップ単位）の起点でオーバーラップ配列を有さないように設計する。E1シャトルベクター、dlE3E4のClaIフラグメントおよびE4ミニウイルスを、E1発現細胞にトランスフェクトし、相同組換えはClaIフラグメントとE1シャトルベクターとの間に起こり、そしてE4ミニウイルスは組換え体中のE4欠損を相補するE4産物を提供する。図３．この図は、pRApac^-の産生を示す。Ad5の左末端(0〜450bp)を、Bluescri ptにクローニングした。4021bp(ClaIリンカー添加）から5788(Xhol部位)のAd5配列を、このフラグメントの下流にクローニングし、E1欠失（dlE1 450〜4021bp; プラスミド３）を産生した。この欠失は、以前に報告されたE1欠失より長い700 塩基対であり、293細胞においてE1領域との組換えの可能性を低下させる；タンパク質IXの完全な配列は取り除かれる。タンパク質IX変異体は、パッケージングし得るウイルスDNAの大きさにおいて制限を有するので、E1欠失を有するヘルパーウイルスのみがパッケージされる。このプラスミドに存在するAd5パッケージングシグナル(Ad5左末端の194〜358bp)を、プラスミドpE1A^-10/28から得られた変異シグナルにより置換された。得られたプラスミドを使用し、E1およびパッケージングシグナルにおいて２重に欠損したヘルパーウイルスを産生し得る。図４．パッケージ弱毒ヘルパーウイルスを産生するために、pac^-pRAシャトルベクターを、Ad組換えベクター(例えば、pJM17)と共にE1発現細胞にコトランスフェクトする。pac^-シャトルベクターは、パッケージングシグナルの部分的な欠失およびE1領域の完全な欠失を含む。組換えベクターは、E1領域においてITRとp BR322プラスミドの挿入物との融合により円形にされた完全なAd5ゲノムを含む。相同組換えは、pRApac^-と円形にされたAd5ゲノムとの間に起こり、pac^-ヘルパーウイルスを産生する。このE1^-、pac^-ヘルパーウイルスを、E1発現細胞において増殖させ、ウイルスのストックを作製し得る。図５．この図は、アデノウイルスベクターまたは「ミニウイルス」の構築を示す。Ad5の融合されたITRを含む0.5kB(BsaAI-SacII)のフラグメントを、pREP9(In vitrogen,San Diego,CA)のXbaI部位にクローニングした。プラスミド２（ミニウイルスゲノム）は、アデノウイルス複製起点（ITR中）およびアデノウイルスパッケージング(pac⁺)のための配列を含むミニウイルスベクターである。このプラスミドを、ヘルパーウイルスの存在下で複製させそしてキャプシド形成させるように設計する。β-ガラクトシダーゼをレポーターとしてNotI部位にクローニングした（プラスミド３）。図６．アデノウイルスベクターをキャプシド形成させるために、ミニベクター DNAを、リン酸カルシウム沈澱と共にまたはリポソーム媒介遺伝子移入により、E 1発現細胞にトランスフェクトする。24時間後、トランスフェクトされた細胞を、pac^-ヘルパー細胞でさらに感染する。トランスフェクションおよび感染の後、ヘルパーウイルスゲノムは、初めにDNA結合タンパク質、末端タンパク質およびポリメラーゼを産生し、ミニウイルスとヘルパーウイルスゲノムの両方の効率的な複製を可能にする。続いて、キャプシド形成のための構造タンパク質を産生する。制限されたパッケージング因子についての競合において、pac⁺ミニウイルスのみがパッケージングされる。図７．図６に記載された方法に対する別の方法として、ミニベクターDNAを、ポリリジンによりpac^-ヘルパーウイルスに結合させ、そしてE1発現細胞に直接形質導入する。この方法は、図６の方法よりさらに効率的であり得る。なぜなら、形質導入効率はより高く、かつミニベクターDNAとヘルパーウイルスDNAとの間の DNA化学量論をインビトロで最適化し得るからである。E1発現細胞へのミニベクターおよびヘルパーウイルスDNAの送達の後、トランス相補性のプロセスは、図６に記載のものと同一であるはずである。好ましい実施態様の詳細な説明遺伝子治療は、一般的に３つの主要な要素を含む：治療遺伝子、送達系および標的細胞。遺伝子治療技術における緊急の技術的挑戦の１つは、インビボで標的細胞において治療遺伝子を特異的に送達し、そして制御可能に発現することである。現在利用可能な送達系は、これらの目的を達成する能力に限定され(Mulliga n,1993)、これらの能力を有する新しい系に対する需要が多い。本発明は、アデノウイルスベクターの遺伝子操作および哺乳動物細胞への異質 DNAの移入におけるアデノウイルスベクターの使用（特に遺伝子治療に関して）における顕著な進歩を示すために提示される。この新しい系は、アデノウイルスベクターの遺伝子送達能を実質的に増大させるのみでなく、その治療の可能性をも大いに改善させる。なぜなら、ウイルスゲノムの置換は、ベクターから生じた細胞傷害性および現在のAdベクター系に関連する野生型組換え事象の可能性を排除するからである。ヘルパー細胞/ヘルパーウイルス系は広範な種々の変異を支持し得るので、この系の潜在的な用途は広範である。ウイルスゲノムの異なる領域において欠失を有するAd変異体の複製は、トランスで欠失遺伝子産物を提供するヘルパーウイルスにより支持され得る。この現象の１つの例は、アデノウイルス/SV40ハイブリッド組換え体の場合を含む。Gluzm anおよびVan Doren(1983)は、Ad5ウイルスゲノムの左末端由来の約3500塩基対、およびそれに続く2.7コピーのSV40ゲノムを含む組換え体を同定した。この構造は、反対方向方向に反復され、従って２つのAd5逆方向末端反復および適切なパッケージングシグナルを含んだ。宿主細胞DNAとAd12との間の他の類似のハイブリッドが報告されている(Deuringら、1981)。アデノウイルス配列の欠失が小さい場合、ハイブリッドは複製可能であり得る。さもなくば、ヘルパー（野生型）アデノウイルスとの同時感染が複製には必要とされる。アデノウイルスヘルパーウイルスの別の例は、ChallbergおよびKetner(1981) により報告されている。彼等は、大きな欠失を有するAd2変異体が条件的欠損ウイルスにより相補され得ることを示した。これらの条件的欠損ヘルパーは、Ad2 変異体が欠失した領域の外側に温度感受性変異を有する。Ad2変異体と共に増殖させた場合、ヘルパーは、変異体が欠失した機能を提供する。ChallbergおよびK etnerの全結論は、「相補するヘルパーウイルスは一般的に有用であることを証明するようには思われない」ということであり、組換えおよび単離問題を取り上げた。ヘルパーウイルスが欠損ウイルスベクターの増殖を支持するのに首尾良く使用されたモデル系は、アルファウイルス発現系である。Bredenbeekら(1993)は、異種遺伝子を運びそして発現するシンドビスウイルスの自己複製レプリコンの使用について報告する。これらのRNAは、裸の核酸分子として導入した後、宿主細胞内で複製可能であるが、ビリオン構造配列のトランス相補性は、感染粒子のパッケージングおよび放出を達成するために必要とされる。これらの欠失を相補するために、著者は、レプリコンが欠失したビリオン構造遺伝子を提供する一連の複製欠損ヘルパーを提供した。種々のこれらのヘルパーは、パッケージング可能またはパッケージング不可能であり、後者はウイルス拡散が所望されない適用において有用であった。この系はタンパク質の高レベルの発現に非常に有用であるが、宿主細胞タンパク質合成の阻害による高い細胞病原性のため、遺伝子治療に有用ではない。Ａ．アデノウイルスアデノウイルスは、その中程度の大きさのDNAゲノム、操作の容易性、高力価、広い標的細胞範囲および高い感染性のため、遺伝子移入ベクターとしての使用に特に適切である。およそ36kBウイルスゲノムが、100〜200塩基対(bp)逆方向末端反復(ITR)により結合され、そこにウイルスDNA複製およびパッケージングに必要なシス作用エレメントが含まれる。異なる転写単位を含むこのゲノムの初期（Ｅ）および後期（Ｌ）領域は、ウイルスDNA複製の開始により分けられる。 E1領域(E1AおよびE1B)は、ウイルスゲノムおよび少量の細胞遺伝子の転写の調節を担うタンパク質をコードする。E2領域(E2AおよびE2B)の発現は、ウイルスDN A複製のためのタンパク質の合成をもたらす。これらのタンパク質は、DNA複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞遮断(shut off)に関与する(Renan,1990)。ウイルスキャプシドタンパク質の大部分を含む、後期遺伝子(L1、L2、L3、L4およびL 5)産物は、主要後期プロモーター(MLP)により発せられる単一の一次転写物の著しいプロセシングの後にのみ発現される。MLP（16.8マップ単位に位置する）は、感染の後期相の間、特に有効であり、そしてこのプロモーターから発せられる全てのmRNAは、それらを翻訳のために好ましいmRNAにする5'三部リーダー(TL)配列を有する。アデノウイルスを遺伝子治療のために最適化するために、DNAの大きなセグメントが含まれ得るように運ぶ能力を最大にすることは必要である。特定のアデノウイルス産物に関連する毒性および免疫反応を減少させることもまた非常に所望される。この２つの目的は、ある適度まで、アデノウイルス遺伝子の脱離が両方の目的に役立つ点で完全に重なり合う。本発明の実施により、比較的容易に治療構築物を操作する能力を保持しながら、これらの目的の両方を達成することは可能である。ウイルスDNA複製に必要とされるシスエレメントは全て、直線ウイルスゲノムのいずれかの末端の逆方向末端反復(ITR)(100〜200bp)に位置するからであるので、DNAの大きな置換は可能である。ITRを含むプラスミドは、非欠損アデノウイルスの存在下で複製し得る(Hayら、1984)。従って、アデノウイルスベクター内のこれらのエレメントの封入は、複製を許容するはずである。さらに、ウイルスのキャプシド形成のためのパッケージングシグナルは、ウイルスゲノムの左末端の194〜385bp（0.5〜1.1マップ単位）の間に位置する(Heari ngら、1987)。このシグナルは、バクテリオファージλDNA中のタンパク質認識部位を模倣する。ここで、左末端に近いが、付着末端配列の外側にある特異的な配列は、頭部構造へのDNAの挿入に必要とされるタンパク質への結合を媒介する。A dのE1置換ベクターは、ウイルスゲノムの左末端の450bp(０〜1.25マップ単位)フラグメントは、293細胞においてパッケージングを指向し得ることを示した(L evreroら、1991)。以前、アデノウイルスゲノムの特定の領域は哺乳動物細胞のゲノムに取り込まれ得、そしてこれによりコードされた遺伝子が発現され得ることが示されている。これらの細胞株は、細胞株によりコードされるアデノウイルス機能を欠損したアデノウイルスベクターの複製を支持し得る。「補助」ベクター（例えば、野生型ウイルスまたは条件的欠損変異体）による複製欠損アデノウイルスベクターの相補性の報告も存在している。以前は、ヘルパーウイルスから複製欠損ウイルスのストックを精製することは不可能であり、そして野生型ウイルスの「レスキュー」に対する関心が多い。Ｂ．アデノウイルスヘルパーシステム本発明は、複製欠損アデノウイルスベクターが、ヘルパーウイルスにより、トランスで、補足され得るという観察に一部基づいている。しかし、この観察のみでは、複製欠損ベクターの単離は許容されなかった。なぜなら、複製機能を提供するために必要とされるヘルパーウイルスの存在が全ての調製物に混入するからである。従って、複製欠損ベクターの複製および／またはパッケージングに対する特異性を付加する、さらなるエレメントが必要とされた。本発明において提供されるそのエレメントは、アデノウイルスのパッケージング機能に由来する。アデノウイルスについてパッケージングシグナルが、従来のアデノウイルスマップの左端に存在することが示されている（Tibbetts、1977）。後の研究において、ゲノムのE1A（194〜358bp）領域において、欠失を有する変異体は、初期（E 1A）機能を補足した細胞株においてさえも、十分に増殖しなかったことが示された（HearingおよびShenk、1983）。補足（compensating）アデノウイルスDNA（０〜353bp）を変異体の右端に組換えた場合、ウイルスは正常にパッケージングされた。さらなる変異分析により、短い、反復性の、部位依存性エレメントが、 Ad5ゲノムの左端において同定された。１コピーの反復が、ゲノムのいずれかの末端に存在する場合、効率の良いパッケージングに十分であるが、Ad5 DNA分子の内側に移動した場合は、効率の良いパッケージングに十分ではないことが見出された（Hearingら、1987）。パッケージングシグナルの変異バージョンを用いることにより、様々な効率でパッケージングされるヘルパーウイルスを作製することが可能である。典型的に、変異は点変異または欠失である。低い効率のパッケージングを伴って、ヘルパーウイルスがヘルパー細胞中で増殖する場合、野生型ウイルスに比べて割合は減少するが、ウイルスはパッケージングされ、それによりヘルパーの増殖が許容される。しかし、これらのヘルパーウイルスが、野生型パッケージングシグナルを含むウイルスとともに細胞中で増殖する場合、野生型パッケージングシグナルは変異バージョンより優先的に認識される。制限量のパッケージング因子を仮定すると、野生型シグナルを含有するウイルスは、ヘルパーと比べる場合、選択的にパッケージングされる。選択物が非常に十分である場合、均質性に近づくストックが達成されるはずである。Ｃ．細胞株本発明の第一の局面は、アデノウイルスゲノムの一部を発現する組換え細胞株である。これらの細胞株は、特定のアデノウイルス遺伝子の欠損を有するアデノウイルス組換えベクターおよびヘルパーウイルスの複製を支持し得る。すなわち、これらの細胞株は、これらのウイルスおよびベクターの増殖を「許容」する。組換え細胞はまた、複製不能アデノウイルスベクターにおける欠損を補足する能力およびこのベクターの複製を支持する能力のために、ヘルパー細胞と呼ばれる。アデノウイルスヘルパー細胞のプロトタイプは、293細胞株であり、これはアデノウイルスのE1領域を含む。293細胞は、トランスで、複製に必要なE1活性エレメントを提供することにより、E1機能を欠損するアデノウイルスベクターの複製を支持する。本発明によるヘルパー細胞は、哺乳動物細胞、好ましくは霊長類細胞（例えば、ヒト胎児腎細胞）に由来する。種々の霊長類細胞が好ましく、そしてヒト細胞またはさらにはヒト胎児腎細胞が最も好ましいが、ウイルスの複製を支持し得る、任意のタイプの細胞が、本発明の実施に受容可能である。他の細胞のタイプとしては、細胞がアデノウイルス許容性である限り、Vero細胞、CHO細胞、または組織培養技術が確立されている任意の真核生物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。用語「アデノウイルス許容性」は、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターが、細胞環境内で、完全な細胞内ウイルス生活環を完了し得ることを意味する。ヘルパー細胞は、既存の細胞株（例えば、293細胞株）に由来し得るか、または新たに開発され得る。このようなヘルパー細胞は、アデノウイルスゲノムにまける欠失をトランスで補足するために必要であるか、または他の点で欠損性であるアデノウイルスベクターの複製を支持する、アデノウイルス遺伝子（例えば、 E1、E2、E4、E5、および後期機能）を発現する。アデノウイルスゲノムの特定の部分である、E1領域は、補足細胞株を作製するために既に使用されている。細胞株に導入された場合、組込みまたはエピソームのいずれにせよ、ウイルスの複製起点を欠損するアデノウイルスゲノムの部分は、細胞が野生型アデノウイルスで重感染（superinfect）される場合であっても、複製しない。さらに、主要後期ユニットの転写はウイルスDNA複製の後であるので、アデノウイルスの後期機能は細胞株から十分には発現され得ない。従って、E2領域（この領域は、後期機能（L1-5）と重複する）は、ヘルパーウイルスによって提供され、そして細胞株によっては提供されない。典型的に、本発明による細胞株は、E1および／またはE4 を発現する。本明細書中で使用する用語「組換え」細胞は、遺伝子（例えば、アデノウイルスゲノムまたは他の細胞由来の遺伝子）が導入されている細胞をいうことが意図される。従って、組換え細胞は、組換え的に導入された遺伝子を含まない天然に存在する細胞と区別され得る。従って、組換え細胞は、「人の手」を介して導入された遺伝子（単数または複数）を有する細胞である。複製は、非感染細胞、または１つ以上のヘルパーウイルスに感染した細胞の層を、ウイルス粒子と接触させた後、細胞をインキュベートすることにより、測定され得る。ウイルスプラークの形成または細胞層における細胞フリーの領域は、特定のウイルス産物の発現により生じる細胞溶解の結果である。細胞溶解はウイルス複製の指標である。Ｄ．ベクター本発明の別の実施態様は、E4および／またはE2領域の少なくとも一部分とともに、ウイルスのE1およびE3領域の少なくとも一部分が、欠失されたアデノウイルスベクター構築物である。別の実施態様において、E1およびE3領域における欠損は、欠失でなくてもよいが、「初期」遺伝子産物を不活性化するか、またはその合成を完全に妨げる点変異であり得る。本明細書中に提供される好ましい実施態様の例は、アデノウイルス５血清型（Ad5）ゲノムを使用する。しかし、例えば、他の血清型（例えば、アデノウイルス２型（Ad2）ゲノム）はまた、本発明の実施において機能することが理解される。３つの利点が、種々の形態のアデノウイルス変異体から生じる。変異がタンパク質を非機能性にのみする場合、ウイルスは、一旦患者に投与されると、その複製能力を消失し、従って、病原性効果についての機会が減少する。タンパク質変異がまた、タンパク質産物の非存在を生じる場合、低い毒性に関するさらなる利点が理解される。最後に、アデノウイルス変異体が、タンパク質をコードする遺伝子セグメントのいくつかまたは全てを欠損する場合、非病原性かつ非毒性の表現型が、外来遺伝子を有する能力の増加とともに、達成される。従って、コード配列の少なくとも一部を欠損するアデノウイルス変異体が好ましい。本発明はまた、アデノウイルスベクター構築物として記載され得る。この構築物は、Ad5ゲノムの左のITR領域の少なくとも約350塩基対、異種DNAの約35kBまで、およびAd5ゲノムの右のITR領域の少なくとも約100塩基対を含有する。図１を参照のこと。他の血清型の対応の領域（例えば、アデノウイルス２型ゲノム）もまた使用され得る。その最も好ましい実施態様において、左および右のITR領域は、異種DNAに隣接し、かつそれらの間にこの異種DNAを含有する。しかし、複製およびカプシド形成を許容する、ウイルスDNAおよび異種DNAの任意の配置が受容可能であり、そして本発明の一部分として包含される。本発明の前に、ベクターに含有され得る最も大きなインサートは、5.5kBであった。これは、E1およびE3領域の代わりに挿入され、そしてウイルスがパッケージし得るさらなる２kBを含んだ。本発明のために、36kBを超える異種DNAはベクター中に含有され得る。これは、欠失の大きさに依存する。10、15、20、30、および35kBのアデノウイルス配列を欠損する異なるベクターが意図される。本発明は、例えば、E1、E2、E3、E4、L1、L2、L3、L4、およびL5領域の欠失、またはこれらの領域の任意の組み合わせの欠失、ならびに欠失された領域の異種DNAでの置換を可能にする。それゆえ、アデノウイルスベクター構築物は、１つ以上のヘルパーウイルスの補助を伴ってヘルパー細胞中で複製しなければならない。複製が生じるためには、ベクターは、残りのトランスエレメントがヘルパー細胞およびヘルパーウイルスにより供給されるという条件で、ベクターDNAの複製に必要とされる必須のシス作用エレメントをすべて(ゲノム複製の開始のために要求されるエレメントおよび複製DNAをウイルスカプシド中にパッケージングするために要求されるエレメントを含む)をコードしていなければならない。アデノウイルスベクターの場合、用語異種DNAは、ベクターの骨格を提供するアデノウイルスゲノム以外の供給源由来のDNAを含むことが意図される。この異種DNAは、原核細胞性供給源または真核細胞性供給源(例えば、細菌、ウイルス、酵母、植物、あるいはさらに動物)に由来し得る。異種DNAはまた、１より多くの供給源に由来し得る。例えば、調節配列はウイルス由来であり得、そして異なる供給源(例えば、哺乳動物)由来の構造遺伝子の発現を制御し得る。調節エレメントにはプロモーターが含まれる。好ましいプロモーターはウイルスプロモーター(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター、シミアンウイルス40由来のSV40後期プロモーター、バキュロウイルスポリヘドロンエンハンサー/プロモーターエレメント、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV tk) 、サイトメガロウイルス(CMV)由来の即時初期プロモーター、およびLTRエレメントを含む種々のレトロウイルスプロモーター)である。エレメントは、その発現が所望される遺伝子に作動可能に連結される。「作動可能に連結される」とは、調節エレメントが、コード配列に対して、そのコード配列の発現がこのエレメントによりもたらされるかまたは増大されるように配置されることを意味する。好ましく用いられるプロモーターおよびエンハンサーは、哺乳動物細胞において、タンパク質をコードする遺伝子の転写を制御するプロモーターおよびエンハンサーであり、そして複数の遺伝子エレメントから構成され得る。用語プロモーターは、RNAポリメラーゼIIの開始部位の周囲にクラスター化される転写制御モジュールの群を包含する。プロモーターは、別々の機能モジュールからなると考えられる。それぞれは、約７〜20bpのDNAを含有し、そして転写活性化タンパク質の１つ以上の認識部位を含む。各プロモーター中の少なくとも１つのモジュールは、RNA合成の開始部位を位置づけるために機能する。この最もよく知られている例は、TATAボックスであるが、TATAボックスを欠損しているいくつかのプロモーター（例えば、哺乳動物ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター、およびSV40後期遺伝子のプロモーター）において、それ自身の開始部位を覆う別々のエレメントは、開始位置の確定を補助する。さらなるプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは、開始部位の30〜110bp上流の領域に位置するが、多くのプロモーターは、開始部位の下流にも機能的エレメントを含有することが、最近示されている。いくつかのエレメント間の間隔は厳密ではなく、その結果エレメントが互いに関して逆方向になるか、または移動される場合、プロモーター機能は保持される。プロモーターに依存して、個々のエレメントは、協同してまたは独立してのいずれかで転写を活性化するために機能し得るようである。プロモーターは、誘導性プロモーターとしてさらに特徴づけられ得る。誘導性プロモーターは、誘導物質の存在下以外は、不活性であるかまたは低い活性を示すプロモータである。本発明の一部として潜在的に含まれ得る、誘導性プロモータのいくつかの例としては、MT II、MMTV（マウス乳腫瘍ウイルス）、コラゲナーゼ、ストロメライシン、SV40、マウスMX遺伝子、α-2-マクログロブリン、MHC クラスI遺伝子H-2kb、HSP70、プロリフェリン（Proliferin）、腫瘍壊死因子、または甲状腺刺激ホルモンα遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。任意の誘導性プロモーターが、本発明の実施に使用され得、そして全てのこのようなプロモーターは、本発明の精神および範囲内にあることが理解される。異種DNA中に含まれ得る別のタイプのプロモータは、組織特異的プロモーターである。組織特異的プロモーターは特定の型の細胞（例えば、肝臓、筋肉、内皮など）において選択的に活性であるプロモーターである。本発明の実施に使用され得る組織特異的プロモーターのいくつかの例としては、アルブミンプロモーター（肝臓において発現される）、サーファクチンプロモーター（肺において発現される）が挙げられる。例えば、ヒトサイトメガロウイルス即時型初期プロモーターと組み合わせた、筋肉特異的クレアチンキナーゼエンハンサーは、筋肉組織における発現のための好ましい構築物である。本発明の異種DNAはまた、エンハンサーを含み得、また目的の遺伝子に作動可能に連結され得る。エンハンサーとプロモーターとの間の基本的な区別は、作用の性質上にある（operational）。全体として、エンハンサー領域は、離れて転写を剌激し得なければならない；エンハンサーは、プロモーター領域またはその構成成分のエレメントに該当する必要はない。他方、プロモーターは、特定の部位で、および特定の方向でRNA合成の開始を指示する１つ以上のエレメントを有さなくてはならないが、エンハンサーは、これらの特異性を欠く。この作用の性質上の区別を除いて、エンハンサーとプロモーターとは非常に類似する。これらは、細胞における転写の活性化の同じ一般的な機能を有し、そして、しばしば、重複し、連続的で、そして見かけ上類似するモジュール構成を有する。総合すれば、これらの考察から、エンハンサーおよびプロモーターは相同なものであること、そしてこれらの配列に結合する転写活性化タンパク質は、基本的に同じ方法で、細胞転写機構と相互作用し得ることが示唆される。このような任意のプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーの組み合わせが、異種遺伝子領域の発現を制御するためにアデノウイルスベクターの異種DNA中に含まれ得ることが理解される。異種DNAは、同じまたは異なるプロモーターの制御下で１つより多くの構造遺伝子を含み得る。異種DNAはまた、リボソーム結合部位およびポリアデニル化部位、または真核生物細胞もしくは哺乳動物細胞におけるDNAの発現に必要な任意の他のエレメントを含み得る。適切なプロモーターおよびエンハンサーエレメントとともに、これらのエレメントは、当該分野において周知のおよび日常的に実施されている方法（例えば、制限酵素消化後、DNAリガーゼで、種々の遺伝子エレメントのスプライシングを指向する）により、ベクター構築物中に組み込まれる。異種DNAは、構築物に対して特定の特性（例えば、種々の他のウイルスの存在下における組込み能力または複製能力）を付与し得る、他のウイルス由来の領域を含み得る。Ｅ．標的化本発明の別の実施態様は、パッケージングされたアデノウイルスベクター構築物を含有するビリオン粒子である。このビリオン粒子は、異種DNAが発現する細胞中へベクターDNAを導入する手段として細胞を感染し得る。当該分野において、アデノウイルスベクターの複製および標的細胞の感染に対する技術は周知であり、そして日常的に行われている。ビリオンカプシドは、野生型Ad5カプシドに構造が同一であり得るか、または改変され得る。このような改変は、特定の細胞に対してビリオンを標的化する抗体または細胞レセプター認識ペプチドのような細胞標的化因子の組込みを含み得る。このような標的因子は、粒子に酵素的にまたは化学的に結合され得るか、またはベクターDNAまたはヘルパーウイルスあるいは細胞により発現され得る。より詳細には、標的化機構としては、ウイルスカプシド遺伝子、特定の型の細胞またはある表面タンパク質を発現している細胞に対してビリオンを標的とするように作用する結合部位ペプチドまたはリガンドペプチドをコードするDNAフラグメントへの挿入をが挙げられる。ある特定の例は、カプシド表面におけるプロテインＡ由来のFc結合領域の発現である。このように改変されたウイルスは、次いで、ある細胞または組織型に対して特異的な抗体で処理される。このウイルスカプシドは、抗体に結合し、そして抗体により認識される抗原を有する細胞に指向される。細胞標的化の別の例は、ウイルスの表面上でのリガンド結合部位の発現である。この例において、ウイルスは、標的化細胞または組織表面上のリガンドに直接結合する。標的化の別の例は、ウイルスカプシドにおける細胞特異的エピトープの発現である。この技術において、ウイルス粒子はエピトープに対するモノクローナル抗体で処理される。モノクローナル抗体は二価であるので、この抗体は標的細胞または組織に対するウイルス粒子の標的化のための遊離結合アームを保持している。標的化の前述の考察は、標的領域に対するウイルスの直接接種を排除するようには理解されるべきではない。ウイルス粒子を含有する調製は、器官のような局所的領域または腫瘍内へ注入され得るか、または外科的曝露後にそれらに適用され得る。Ｆ．へルパーウイルス本発明の別の局面はヘルパーウイルスである。ヘルパーウイルスは、アデノウイルスベクター構築物の複製およびパッケージングを捕足し得るアデノウイルスとして定義される。ヘルパーベクターは、アデノウイルスベクターと同じシス作用性配列、すなわち、複製起点およびパッケージングシグナルを必要とする。好ましくは、本発明のヘルパーウイルスはまた、野生型パッケージングシグナルよりも非効率的に利用されるような、アデノウイルスパッケージングシグナル中の変異を含むが、パッケージングが野生型シグナルと競合しないで生じる程度まで利用される。アデノウイルスベクターのように、ヘルパーウイルスは、その欠損を補うヘルパー細胞株上で増殖されることが必要である。通常、この欠損は、ヘルパーウイルスゲノムのE1および／またはE2領域における欠損を含む。また、非必須E3領域は除去され得る。いくつかの可能な組み合わせのリストを、以下の表中に提供する。本発明のシステムにより提供された利点の一つは、異種DNA配列を排除する代償として、相同組換えにより、アデノウイルスベクターが野生型ゲノムを再獲得する（すなわち、救助される）可能性を大いに減少することである。２つの異なる遺伝学的実体（ヘルパー細胞およびアデノウイルスベクター；ヘルパーウイルスおよびアデノウイルスベクター）よりも３つの異なる遺伝学的実体（ヘルパー細胞、ヘルパーウイルス、およびアデノウイルスベクター）を用いることによって、野生型ウイルスを救助するための単一の組換え事象が不可能になる。Ｇ．異種遺伝子の発現の方法ある実施態様において、本発明は、哺乳動物細胞中の外来遺伝子を発現するための方法をさらに包含する。本発明により提供されたベクターは遺伝子治療において特に有用であるが、これらはまた他の情況の遺伝子操作および遺伝子発現のためのインビトロ法においても極めて有用である。このような方法は、外来遺伝子をコードする異種DNAを含有するアデノウイルスベクター構築物の使用およびその発現、適切なヘルパーウイルスを用いる適切なヘルパー細胞中のアデノウイルスベクター構築物の複製、そこから産生されたビリオン粒子の獲得およびそのビリオン粒子での哺乳動物細胞の感染のための手段を包含する。外来遺伝子は、例えば、嚢胞性の線維形成遺伝子のような、インターロイキンまたは抗ウイルス産物であり得る。この遺伝子は、毒素をコードし得るか、または細胞を薬剤でのさらなる処置に対して感受性にする遺伝子であり得ることがまた意図される。大きな能力を有するベクターが有効であり得る疾患の別の例は、致死の、Ｘ染色体連鎖性の筋肉の退行性の疾患であり、約35,000の新生男子につき約１人が冒されるDuchenne筋ジストロフィー(DMD)である。DMDは、14kBの転写産物によりコードされる427kDタンパク質である(Koenigら、1987)、ジストロフィンの欠損により生じる(Zubrzycka-Gaarnら、1988)。この疾患に対する可能な治療は、患者の筋肉中でのジストロフィン遺伝子の挿入および発現によるジストロフィン機能の回復である(Blau,1993;Coxら、1993)。この治療は筋肉細胞内へ14kBのcDNAを効率よく送達し得、そして特に筋肉細胞中でDMDタンパク質を特異的に発現するベクターを必要とする。残念なことに、この開示の時点では、特定の組織中で発現される7.5kBを超えるDNAを送達し得る利用可能なベクター系は存在しない。前述の節において記載したように、発現される外来遺伝子は、例えば、細菌、酵母、植物、動物またはヒトの遺伝子のような任意の起源のものであり得る。好ましくは、外来遺伝子は相補性のDNA(cDNA)として形成される。しかし、いくつかの例において、ゲノムDNAクローンを使用する利点（例えば、そこに含まれるイントロンはいくつかのさらなる利点を提供する）が示され得る。特定の遺伝子の発現を阻害するように特異的に設計されたアンチセンス構築物が有用であるということもまた意図される。上述のように、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化部位などを含む種々の調節エレメントが外来遺伝子中に含まれ得る。好ましくは、アデノウイルスベクター構築物は、ゲノムのE1およびE3領域中の欠失、および少なくとも１つの別のアデノウイルス「初期」または「後期」領域を含み、そしてこの外来遺伝子は、アデノウイルス配列を失う(missing)場所に挿入される。ヘルパーウイルスとともにヘルパー細胞中の複製ウイルスベクターにより産生されたウイルス粒子は、任意の受容可能な手段により得ることができる。このような手段は、濾過、遠心分離が挙げられる。溶解した細胞からウイルスを直接単離することによるプラーク精製もまた可能である。ビリオン粒子を得る、およびこのような粒子で哺乳動物細胞を感染する、このようなすべての方法は当業者に周知である。外来遺伝子を発現する第１の工程は、アデノウイルスヘルパーウイルスの開発である。ヘルパーウイルスを作製するための一般的なスキームは以下のようである。第１に、アデノウイルスゲノムの一部を、標準的なクローニングベクターに挿入する。次いで、この領域の欠失を遺伝子操作する。欠失構築物の増幅後、このアデノウイルスフラグメントを切り出し、そしてアデノウイルスフラグメントから欠失した「初期」機能を発現する細胞株中で、アデノウイルスゲノムDNAとともに同時トランスフェクトする。組換え後、欠失した配列を欠損しているアデノウイルスゲノムDNAを単離する。このプロセスは、漸増数の欠損機能を補足し得る細胞株が利用可能である限り、さらなる欠失を組み込むために繰り返され得る。前述の好ましい実施態様において、欠失フラグメントを受けるアデノウイルスゲノムDNAは、パッケージングシグナル(pac^-)中に変異を含む。なぜなら、アデノウイルスゲノム中への欠失物(deletious)の組換えは他のアデノウイルスの非存在下で達成されるが、変異したパッケージングシグナルはカプセル化を許容するのに十分であるからである。野生型のパッケージングシグナルを含有するベクターを有するこのウイルスの連続的な増殖は、ベクターの好ましいカプセル化をもたらす。 Adヘルパー細胞株の開発もまた重要である。これらの細胞株は安定してトランスフェクトされるか、またはアデノウイルス由来のDNAで「形質転換」される。このDNAは、Ad配列のエピソーマルフラグメントとして組み込まれるか、または維持され得る。これらの細胞株は、Adタンパク質の異なるセットを発現するように設計され、そして異なるAdベクターを作製および増殖するために用いられ得る。ヘルパーウイルス系における別の工程は、アデノウイルスベクターの構築である。Adベクターは、２つの基本的な様式において作製され得る。第１に、アデノウイルスゲノムの領域を、標準的なクローニングベクター中へ挿入し得る。次に、欠失をアデノウイルスインサート中へ遺伝子操作し、そして欠失配列を異種DN Aに置き換える。Ad-hetDNA-AdインサートとアデノウイルスゲノムDNAとの同時トランスフェクションは、隣接のAd配列の効力によって、同時トランスフェクトされたアデノウイルスゲノムDNA中への異種DNAの組換えを生じる。宿主細胞が新たな組換えにより失われたアデノウイルスの機能を補足しない場合は、この細胞はヘルパーウイルスで重感染され得る。 Adベクターを作製するための別の方法は、インビトロでの完全なAd配列の作製である。制限酵素およびDNAリガーゼを用いて、アデノウイルスから異種DNAへ必要なシス作用性配列を直接クローン化することが可能である。次いで、この構築物はヘルパー細胞へトランスフェクトされ得、複製およびカプセル化の目的のために、必要に応じてヘルパーウイルスで感染され得る。この情況において、パッケージングシグナル、複製起源および異種DNAの挿入のための多目的のクローニング部位のみを含有するアデノウイルスベクターを作製することは有用であり得る。好ましい実施態様において、開始ベクターはまた、摘出可能なマーカー遺伝子を含有する。前出のまたは後述のいかなる考察においても、用語トランスフェクトする(tra nsfecting)は、リン酸カルシウム沈殿、プロトプラスト融合、リポフェクション、カチオン促進性DNA(例えば、ポリリジン)形質導入、または任意の他の等価な方法を含むある型の遺伝子移入方法論を包含することが理解されるべきである。ならびに、これらの用語は、句「核酸を輸送する」と等価であると考えられる。例えば、技術が、裸の核酸をポリカチオンに結合するために利用される。この結合体は、このような結合体との接触をもたらす細胞により保護される。ある実施態様において、この結合体が取り込まれるリソソームを破壊し得る薬剤を含むことがまた所望される。好ましいリソソーム破壊剤は、アデノウイルス自身である。アデノウイルスは、野生型アデノウイルス、欠損ゲノムまたは空のアデノウイルス粒子を含有するアデノウイルスであり得る。アプローチの例を図７に例示する。実施例以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様を実証するために挙げられる。以下の実施例において開示される技術は、本発明の実施において良好に機能するために、発明者によって発見された技術を示すことが当業者により認識されるべきである。従って、その実施のために好ましい態様を構成するために考慮され得る。しかし、当業者は、本開示を考慮すれば、多くの改変が開示される特定の実施態様においてなされ得、そして本発明の精神および範囲を逸脱することなく、なお同様のまたは類似の結果をもたらすものであるることを認識すべきである。実施例１：パッケージング欠損アデノ-ヘルパーウイルスの構築ヘルパーウイルスを、シャトルベクターの重複配列の組換えにより作製し、そしてアデノウイルスゲノムのフラグメントをクローン化した。pXCJ.2(Spessotら、1989)由来のEcoRI-ClaI小フラグメントを、pBSKS(Stratagene)の代表的な部位へサブクローン化してpBSleft-endを生成した。Ad5のヌクレオチド4021〜5785由来の1.7kBフラグメントを、pJM17(McGroryら、1988)をテンプレートとして用い、プライマー5'-CCATCGATGCGGTTTAAAACATAAAT-3'(ClaI部位に下線)および5'-CCG CGGAACACCGCTCGAGGAC-3'を用いて、PCRにより合成した。pRAを、PCR-生成フラグメントをpBSleft-endのClaI-XhoI部位に挿入することにより生成した。続いて、 SgraI(ヌクレオチド188)およびClaI(ヌクレオチド450)でのpRAの切断により、野生型パッケージングシグナルを効率的に除去した。Ad5パッケージングシグナル( GrablおよびHearing,1990)中の二重欠失を含有するpE1A-10/28由来の対応するSg raI-ClaIフラグメントを、pRA中へ挿入した。pJM17およびpRApac^-を、293細胞中へ同時トランスフェクトした。次いで、ウイルスを複製し、そしてpac^-ヘルパーを同定した後に、293細胞上で限界希釈することによりクローン化した。実施例２：複製欠損アデノウイルスベクターの構築原核生物の複製起点を有するアデノウイルスの逆方向末端反復(ITR)を融合することにより、細菌中でも増殖し得る、複製可能なアデノウイルスベクターを構築し得る。このようなベクターは、pAB17のITR融合領域(35,771のBsaAI部位から 358のSacII部位(Ad5由来のヌクレオチド番号))を、pREP9（Invitrogen）のXbaI 部位へ挿入することにより作製されている。このインサートは、ヌクレオチド19 4〜358に野生型パッケージングシグナルを含有する。レポーターのように、β-g al遺伝子を、pKTβ(Clontech)由来のNotI-NotIフラグメントとしてpREP9のラウス肉腫ウイルスプロモーターの後ろのNotI部位にサブクローン化した。実施例３：哺乳動物細胞中での異種ペプチドの発現 p53をpEC53(Zhangら、1994)から切り出し、そして実施例中に記載のベクターのNotI部位中へ挿入する。このプラスミドを、Dotap-媒介性トランスフェクションにより293細胞中へ導入する。同上。24時間後、完全培地中で実施例１に記載のヘルパーウイルスで細胞を感染する。細胞変性効果が現れた後、ウイルスを３回の凍結溶解サイクルにより採集し、そしてウイルスを、CsCl密度勾配により精製する。同上。精製ベクターを緩衝化10％グリセロール中で−80℃にて保存する。実施例４：インビボでの患者への治療ベクターの投与実施例３に記載のウイルスベクターの大規模産生を行い、そして各バッチを精度および均一性について評価する。ウイルスストックは、10¹¹pfu/mlの力価で− 80℃で保存され得る。進行性の(ステージIII)手術不可能な腺ガンを有する患者を、治療可能性について選択し、そしてその腫瘍をp53の状態についてスクリーニングする。欠失または変異p53を伴い腫瘍を持つ患者を、処置のためにさらに選択する。ファイブロスコープ(fibroscopy)により、可能な限り大きく腫瘍塊を除去し、そしてファイブロスコープガイド針を用いて、残る腫瘍塊中の４〜６ヶ所に0.1ml容量(10¹⁰pfu)でベクターを注入する。患者を全身性の炎症について、毎日モニターする。約１週間後、腫瘍をバイオプシーし、p53の発現およびベクターの存在について評価する。アデノウイルス流出の可能性について評価するために、咽頭粘膜、尿、および便サンプルを採取する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．単離されたアデノウイルスベクターであって、ここで該ベクターがアデノイウイルス逆方向末端反復およびアデノイウイルスパッケージングシグナルを含むが、 (i) アデノイウイルス産物E1A、E1B、およびE3；ならびに (ii) E2、E4、L1、L2、L3、L4、およびL5からなる群から選択されるアデノイウイルス産物の少なくとも１つ、に対するコード領域の少なくとも一部を欠く、単離されたアデノウイルスベクター。２．前記ベクターがアデノイウイルス産物E1A、E1B、E2、およびE3に対するコード領域を欠く、請求項１に記載のベクター。３．前記ベクターがアデノイウイルス産物E1A、E1B，E3、およびE4に対するコード領域を欠く、請求項１に記載のベクター。４．前記ベクターがアデノイウイルス産物E1A、E1B、E2、およびE4に対するコード領域を欠く、請求項１に記載のベクター。５．前記ベクターがアデノイウイルス産物E1A、E1B、E2、E3、およびE4に対するコード領域を欠く、請求項１に記載のベクター。６．前記ベクターがアデノイウイルス産物E1A、E1B、E2、E3、およびL1〜5に対するコード領域を欠く、請求項１に記載のベクター。７．前記ベクターがアデノイウイルス産物E1A、E1B、E2、E3、E4、L1、L2、L3、 L4、およびL5に対するコード領域を欠く、請求項１に記載のベクター。８．前記ベクターが全てのアデノイウイルスコード領域を欠く、請求項７に記載のベクター。９．単離されたアデノウイルスベクターであって、ここで該ベクターがアデノイウイルス逆方向末端反復およびアデノイウイルスパッケージングシグナルならびに非機能的、非免疫原性形態の、 (i) アデノイウイルス産物E1A、E1B、およびE3；ならびに (ii) E2、E4、L1、L2、L3、L4、およびL5からなる群から選択されるアデノイウイルス産物の少なくとも１つ、を含む、単離されたアデノウイルスベクター。１０．前記ベクターが、少なくとも10kBの異種DNAをさらに含む、請求項１に記載のベクター。１１．前記ベクターが、少なくとも15kBの異種DNAをさらに含む、請求項１に記載のベクター。１２．前記ベクターが、少なくとも20kBの異種DNAをさらに含む、請求項１１に記載のベクター。１３．前記ベクターが、少なくとも30kBの異種DNAをさらに含む、請求項１２に記載のベクター。１４．前記ベクターが、約35kBの異種DNAをさらに含む、請求項１３に記載のベクター。１５．前記ベクターがプロモーターをさらに含み、ここで前記異種DNAが該プロモーターに作動可能に連結される、請求項１０に記載のベクター。１６．前記異種DNAが腫瘍抑制因子をコードする、請求項１に記載のベクター。１７．前記異種DNAが嚢胞性線維症に関連した産物をコードする、請求項１に記載のベクター。１８．前記異種DNAがデュシェーヌ筋ジストロフィーに関連した産物をコードする、請求項１に記載のベクター。１９．前記異種DNAがアンチセンス構築物をコードする、請求項１に記載のベクター。２０．前記プロモーターがアデノウイルス主要後期プロモーターである、請求項１５に記載のベクター。２１．前記プロモーターが異種、細胞特異的プロモーターである、請求項１５に記載のベクター。２２．単離されたアデノウイルスヘルパーウイルスであって、該ウイルスが、 (i) アデノウイルス末端反復； (ii) アデノウイルスパッケージング配列；および (iii)アデノウイルス産物E1A，E1B、E2、E3、E4、L1、L2、L3、L4、およびL5 の少なくとも１つに対するコード領域、を含む、単離されたアデノウイルスヘルパーウイルス。２３．単離されたアデノウイルスヘルパーウイルスであって、該ウイルスが、 (i) アデノウイルス末端反復； (ii) 野生型アデノウイルスパッケージング配列より低い効率で利用される、変異されたアデノウイルスパッケージング配列；および (iii)アデノウイルス産物E1A、E1B、E2、E3、E4、L1、L2、L3、L4、およびL5 の少なくとも１つに対するコード領域、を含む、単離されたアデノウイルスヘルパーウイルス。２４．(a)アデノウイルス産物E1A、E1B、およびE3、ならびに(b)E2、E4、L1、L2 、L3、L4、およびL5からなる群から選択されるアデノウイルス産物の少なくとも１つに対するコード領域の少なくとも一部を欠くアデノウイルスベクターを増殖させるための方法であって、以下の工程： (i) E1AおよびE1Bのアデノウイルス産物により提供される機能が欠損したアデノウイルスの増殖に許容性の細胞を提供する工程； (ii) 前記パート(b)に記載のアデノウイルス産物（単数または複数）の非存在を相補するアデノウイルスヘルパーウイルスを提供する工程； (iii)該ベクターおよび該ヘルパーウイルスを該細胞に輸送する工程；および (iv) 該ベクターの複製を許容する条件下で該細胞をインキュベートする工程、を包含する、方法。２５．哺乳動物細胞中で遺伝子を発現させる方法であって、以下の工程： (i) アデノウイルス産物E1A、E1B、およびE3、ならびに(b)E2、E4、L1、L2、 L3、L4、およびL5からなる群から選択されるアデノウイルス産物の少なくとも１つに対するコード領域の少なくとも一部を欠損したアデノウイルスベクターを提供する工程であって、ここで該欠損したコード領域が該遺伝子をコードする異種 DNAにより置換される工程； (ii) 感染性形態での該ベクターの複製およびパッケージングに許容性の条件下で該ベクターを増殖させる工程； (iii)感染形態で増殖されたベクターを単離する工程； (iv) 該感染形態の該ベクターと該哺乳動物細胞とを接触させる工程；および (v) 該外来遺伝子が発現されるような条件下で該哺乳動物細胞をインキュベートする工程、を包含する、方法。２６．前記遺伝子が腫瘍抑制因子をコードする、請求項２５に記載の方法。２７．前記遺伝子が嚢胞性線維症に関連した産物をコードする、請求項２５に記載の方法。２８．前記遺伝子がデュシェーヌ筋ジストロフィーに関連した産物をコードする、請求項２５に記載の方法。２９．哺乳動物細胞中での遺伝子の発現を阻害する方法であって、以下の工程： (i) アデノウイルス産物E1A、E1B、およびE3、ならびに(b)E2、E4、L1、L2、 L3、L4、およびL5からなる群から選択されるアデノウイルス産物の少なくとも１つに対するコード領域の少なくとも一部を欠損したアデノウイルスベクターを提供する工程であって、ここで該欠損したコード領域が該遺伝子のアンチセンス形態をコードする異種DNAにより置換される工程； (ii) 感染形態での該ベクターの複製およびパッケージングに許容性の条件下で該ベクターを増殖させる工程； (iii)感染形態で増殖されたベクターを単離する工程； (iv) 該感染形態の該ベクターと該哺乳動物細胞とを接触させる工程；および (v) 該遺伝子の該アンチセンス転写物が合成されるような条件下で該哺乳動物細胞をインキュベートする工程、を包含する、方法。３０．前記遺伝子がオンコジーンである、請求項２９に記載の方法。３１．前記遺伝子がウイルス遺伝子である、請求項３０に記載の方法。